ES2238979T3 - Procedimiento para atrapar y confinar microorganismos en aire usando polimeros solubles en agua. - Google Patents
Procedimiento para atrapar y confinar microorganismos en aire usando polimeros solubles en agua.Info
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Abstract
Un procedimiento para atrapar y confinar microorganismos para su análisis futuro, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) extender un polímero soluble en agua, en el que dicho polímero soluble en agua tiene un contenido de agua en equilibrio entre el 1% y el 50%; y (b) someter dicho polímero soluble en agua a un microorganismo presente en el aire.
Description
Procedimiento para atrapar y confinar
microorganismos en aire usando polímeros solubles en agua.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para atrapar y confinar microorganismos en aire
usando polímeros solubles en agua. Más específicamente, los
polímeros solubles en agua se pueden usar como un vehículo para el
mantenimiento de microorganismos viables y no viables para un
análisis posterior. También se describe un procedimiento rápido y
sensible para suministrar el número de microorganismos presentes en
aire para pruebas de esterilidad.
Los polímeros consisten en cadenas de unidades
químicas repetidas que se producen naturalmente o, en virtud de su
química, se pueden adaptar para formar polímeros sintéticos
mediante el control de la estructura química y del peso.
Los polímeros sintéticos se preparan mediante la
reacción química de monómeros para formar cadenas poliméricas
largas. Las dos variables principales que afectan a las propiedades
físicas de los polímeros sintéticos son la naturaleza química de
las unidades de repetición monoméricas y el peso molecular del
polímero, que se puede controlar exactamente. Así, se sabe que
polímeros con pesos moleculares superiores poseen una resistencia
mecánica superior, pero son mucho más viscosos en disolución.
Variando la relación de los grupos químicos en el
polímero, uno puede ajustar las propiedades físicas del polímero
para aplicaciones particulares. Por ejemplo, la resistencia
mecánica y la solubilidad de los polímeros se pueden ajustar de
esta manera.
Mezclando diferentes tipos de polímeros, las
características del copolímero final pueden presentar
características optimizadas. Mediante el diseño y la síntesis de
polímeros específicos, se pueden generar materiales con las
propiedades exactas necesarias para una función específica. Por
ejemplo, mediante el tratamiento específico, el área superficial de
una placa polimérica (90 mm) se puede incrementar de 1 metro
cuadrado a 1500 metros cuadrados. Este único procedimiento
incrementará las características físicas y biológicas del polímero
a un mecanismo para la recuperación de organismos del entorno más
eficiente.
Los polímeros solubles en agua son conocidos en
la técnica y están descritos por Prokop y col. en "Water Soluble
Polymers for Immunoisolation I: Complex Coacervation and
Cytotoxicity" en Advances in Polymer Science, 136: págs:
53 a 73 (1998). Estos polímeros tienen múltiples usos tales como
corazones artificiales, como barreras de inmunoaislamiento, para el
control del dolor en pacientes terminales de cáncer y en el
encapsulamiento de las isletas pancreáticas.
Aparte de su uso médico, el material polimérico
también se usa en muchos de los suministros de laboratorio tales
como tubos de ensayo, pocillos de muestras, puntas de pipeta,
pipetas desechables y similares.
Por ejemplo, como soporte sólido, se usan
diversos polímeros en un procedimiento de detección de ADN en una
célula, mientras se preserva la morfología del núcleo como se
describe en la patente de EE.UU. Nº 5.501.954. En este
procedimiento, el ADN se depositó en un filtro de membrana
polimérica, se incuba con una muestra marcada con fluorescencia y se
detecta usando una sonda marcada. Las membranas poliméricas
utilizadas están hechas de policarbonato, fluoruro de
polivinilideno, polisulfona, nilón, ésteres celulósicos,
nitrocelulosa y Teflon® (PTFE). Las membranas poliméricas descritas
en esta patente son polímeros insolubles en agua, ya que uno de los
requerimientos para este procedimiento es que las membranas
poliméricas deben retener el material celular tras una serie de
tratamientos y lavados y aún permanecer intacto.
El documento EP 546 032 describe un procedimiento
para la inmovilización de moléculas, polímeros o microorganismos
mezclando una disolución acuosa con una dispersión de un polímero y
aplicando la mezcla a una película coherente. Las membranas
formadas son insolubles en agua y se pueden almacenar secas.
La patente de EE.UU. 5.855.652 describe un
aparato para recoger rápidamente aerosoles que contienen partículas
sólidas y microorganismos a partir de grandes volúmenes de aire.
Esta patente de EE.UU. no describe el uso de polímeros solubles en
agua para recoger microorganismos a partir de muestras de aire.
"Monitoring Airborne Microorganisms during Food
and Beverage Processing" en el Resumen técnico de Millipore
Corporation, "New Brunswick Slit-to Agar
Biological Air Sampler" en el sitio web de New Brunswick
Scientific Corporation y el documento de GB 1 441 576 describen el
uso de agar en dispositivos particulares para obtener muestras de
microorganismos del aire. Estas referencias fallan en describir el
uso de polímeros solubles en agua con un contenido de agua en
equilibrio entre el 1% y el 50%.
El documento EP A 0 845 480 describe hidrogeles
de polivinil pirrolidona, que están reticulados y por tanto son
resistentes al agua.
El análisis de microorganismos es importante en
muchas áreas diferentes, por ejemplo, en la preparación de
alimentos, agua de consumo, para aplicaciones farmacéuticas en la
producción de fármacos, para análisis cosmético, en las industrias
electrónicas y en el análisis de aplicaciones médicas.
Las muestras para las pruebas de diversos
microorganismos generalmente se recogen usando algodón, por
ejemplo, y se envían a un laboratorio para su análisis. El proceso
de análisis requiere que primero se cultiven las muestras.
Alternativamente, son conocidos en la técnica
procedimientos rápidos para el análisis de microorganismos usando
biosensores. Por ejemplo, el documento WO 9931486 describe
biosensores que tienen una película polimérica recubierta con un
metal y una capa receptora grabada impresa sobre el metal
recubierto sobre el cuál hay un material receptor que se une
específicamente al analito. La cantidad de microorganismo que se une
al biosensor se midió mediante una imagen de difracción tras la
irradiación con un láser.
Otro tipo de biosensor se describe en el
documento WO 982747 que comprende una película polimérica
recubierta con un metal y una monocapa
auto-ensamblada que tiene un material receptor
específico para el analito sobre ella, impresa sobre la película. La
monocapa auto-ensamblada está impresa con un
patrón, de manera que, cuando el biosensor se une al analito y el
biosensor difracta la luz transmitida, forma un patrón.
Se debería apreciar que aunque los biosensores
puede detectar diversos microorganismos en el entorno, la medida de
un patrón de difracción a menudo es inexacta, imprecisa y carece de
sensibilidad.
Además, la determinación de una serie de
microorganismos activos en lugar de las cuentas totales es de gran
importancia en numerosas áreas de la microbiología.
Desafortunadamente, está ampliamente admitido que las técnicas de
cultivo convencionales subestiman la fracción de los
microorganismos viables reales y que las cuentas totales, que
muestran todas las partículas de microorganismos, sobreestiman esta
fracción.
Aparte de los problemas asociados a la obtención
del número exacto de microorganismos presentes en una muestra,
también se sabe que las técnicas de cultivo en un medio de
crecimiento consumen tiempo y generalmente requieren entre 18 horas
y 20 días aproximadamente para obtener un resultado. El uso de
medios de crecimiento tradicionales es no-específico
y natural, y por tanto variable y no controlado.
Un procedimiento que supera los requerimientos
para el cultivo de microorganismos después de que se obtenga la
muestra se describe en el documento EP 0 816 513 Al. Esta
referencia describe el uso de una lámina adhesiva sensible a la
presión para la recogida de microorganismos sobre superficies que
pueden contener el microorganismo. La lámina adhesiva está
compuesta de una lámina de una capa adhesiva compuesta
principalmente por un polímero soluble en agua y una membrana
permeable al agua que no permite el paso de microorganismos. Por
tanto, el documento EP 0 816 513A1 requiere que al menos se unan
juntas dos capas de láminas adhesivas, una de cuyas capas actúa
para capturar los microorganismos en un proceso después de la
obtención de las muestras.
Además, la obtención de muestras de
microorganismos con la lámina adhesiva sensible a la presión
requiere que la lámina adhesiva se ponga en contacto con la
superficie de un objeto de prueba de manera que se consiga la
acumulación de microorganismos sobre la lámina. Por tanto, incluso
se consigue la observación visual de microorganismos usando un
agente cromogénico que está presente en la capa adhesiva o en el
agua, procedimiento que no puede ser muy sensible.
El documento EP 0 816 513 Al no describe ni
sugiere que alguno de sus dispositivos para muestras requieran al
menos dos capas laminadas, y/o su procedimiento para detectar
microorganismos se pueda usar para pruebas de esterilidad de
muestras de aire en las cuales se requiera una sensibilidad de
detección muy alta.
De hecho, es muy conocido en la técnica que la
monitorización específica y el control de entomos asépticos son
necesarios para el procesamiento de fármacos, formas de
dosificación y en ciertos casos dispositivos médicos. Una gran
fracción de productos estériles se fabrican mediante el
procesamiento aséptico, ya que este procedimiento depende de la
exclusión de los microorganismos de la corriente de procesamiento y
de la prevención de que los microorganismos entren en los
contenedores durante el relleno. El procesamiento aséptico
generalmente se realiza en salas limpias y siempre se monitoriza el
entorno cuidadosamente.
Aparte del uso de condiciones asépticas en la
industria farmacéutica, la industria electrónica también usa y
monitoriza salas limpias para la fabricación de componentes
electrónicos, microchips, componentes de ordenador y
simila-
res.
res.
La diferencia entre estas dos industrias en la
monitorización del entorno es que en la industria electrónica se
mide de manera general los particulados o microorganismos no
viables y hay menos énfasis en el número de microorganismos o
particulados viables. En contraste, en la industria farmacéutica
hay un interés mucho mayor con respecto al punto de microorganismos
viables.
Un procedimiento de monitorización en condiciones
asépticas es determinar las cuentas particuladas totales. Este
procedimiento no proporciona información con respecto al contenido
microbiológico del entorno. La limitación básica de los contadores
particulados es que sólo miden partículas de 0,5 \mum o mayores.
Aunque las partículas en suspensión no son células únicas o de
flotación libre, frecuentemente se asocian a partículas de 10 \mum
a 20 \mum y por tanto únicamente se rechazan las pruebas para
cuentas particuladas sin cuentas de microbios.
Es conocido en la técnica que las salas limpias
deben cumplir patrones particulares. De hecho, las especificaciones
para los cambios de aire por hora y velocidades, aunque no están
incluidos en los patrones federales, son habituales. Así, por
ejemplo, las salas de dase 100.000 en entomos de procesamiento
aséptico están diseñadas para proporcionar un mínimo de 20 cambios
de aire por hora, mientras que las salas limpias de clase 100
proporcionan más de 100 cambios de aire por hora. Diluyendo y
eliminando los contaminantes, es probable que grandes volúmenes de
aire reduzcan la contaminación en suspensión en la producción
aséptica.
Hay ciertas directrices en la limpieza del aire
que se deben cumplir para los diferentes grados de una sala limpia.
Así, por ejemplo, para la clase 100, la media móvil de todos los
puntos debe ser < 1 unidad de formación de colonias (cfu) por
metro cúbico de aire y al menos el 85% de todas las muestras
tomadas debe ser 0. Para la clase 10.000 de salas limpias, al menos
el 65% de todas las muestras tomadas debe ser 0 y para la clase
100.000 al menos el 50% de las muestras debe ser 0. Así, estos
valores son críticos para proporcionar entornos de monitorización
seguros.
Hay muchos procedimientos conocidos en la técnica
para obtener muestras de microorganismos en suspensión viables
tales como el aparato de obtención de muestras de corte en agar, el
impactador de tamices, el aparato de obtención de muestras
centrífugo, el aparato de obtención de muestras de sistema de aire
superficial y el aparato de obtención de muestras de filtro de
gelatina. Todos estos aparatos de obtención de muestras requieren
una bomba, un motor o vacío que absorba o expulse el aire a través
de la unidad de obtención de muestras. El uso de estos dispositivos
de obtención de muestras "activos" puede ser inconveniente
cuando hay una limitación espacial en la sala limpia ya que pueden
ocupar un espacio necesario. Además, estos dispositivos también
pueden ser un riesgo para las condiciones asépticas seguras, ya que
pueden alterar el flujo de aire direccional como resultado del
tamaño y la localización del instrumento o de la manera en la cual
el equipo fuerza al aire hacia el filtro o medio de obtención de
muestras.
Otro tipo de dispositivos de obtención de
muestras "no activos" son las placas de sedimentación. Las
placas de sedimentación son una manera fácil y barata de asegurar
cualitativamente el aire del entorno durante periodos prolongados
de tiempo. Las placas de sedimentación consisten en agar que se
coloca en placas Petri y son útiles en áreas críticas en las que el
uso de un dispositivo de obtención de muestras activo es
obstructivo. De hecho las placas de sedimentación, cuando se
exponen durante periodos de 4 a 5 horas, pueden proporcionar un
límite de detección similar a aquel observado con dispositivos de
obtención de muestras activos.
No obstante, en muchos de estos procedimientos,
el agar se usa como medio para capturar a los microorganismos y es
sabido que la escasez de agar, así como la variabilidad del
producto ha conducido a una búsqueda de sustitutos adecuados para
el agar.
Además, es muy conocido en la técnica que la
monitorización de microorganismos en condiciones asépticas no se ha
perfeccionado hasta ahora. Las variaciones en los límites de
detección y la sensibilidad en la obtención de muestras se puede
atribuir no sólo a las características inherentes del procedimiento
de obtención de muestras por sí mismo, sino también a la
variabilidad del medio, las temperaturas de incubación, la
manipulación de las muestras y la contaminación accidental de las
muestras.
Además, la valoración de microbios de salas
limpias se realiza usando procedimientos que no dan como resultado
una valoración cuantitativa. Más correctamente, los procedimientos
usados se pueden definir mejor como semicuantitativos. De hecho
muchos procedimientos sólo son adecuados para medir la presencia de
niveles atípicamente altos de contaminación microbiana y su
exactitud y precisión es muy pobre.
Por tanto, hay una necesidad en la técnica del
análisis ambiental de microorganismos de proporcionar no sólo un
procedimiento de análisis rápido para muestras de aire, sino
también un medio para conseguir este análisis con una precisión
mayor, especialmente en el área de pruebas de esterilidad.
Así, es un objeto de la presente invención
superar los problemas asociados a la técnica anterior.
Es un objeto de la presente invención el uso de
polímeros solubles en agua para atrapar y confinar microorganismos
en el aire.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un medio sensible para el análisis de esterilidad de
muestras de aire.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un polímero que tenga una resistencia mecánica
suficiente de manera que se pueda transportar, sea soluble en agua
u otros diluyentes fisiológicos, retenga agua hasta cierto grado
mientras mantiene a los microorganismos vivos en estado viable y
pueda capturar microorganismos del aire.
Es todavía otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la detección rápida de
microorganismos en una muestra de aire desconocida.
\newpage
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar un procedimiento para detectar microorganismos en una
muestra de aire desconocida que no requiera que los microorganismos
se sometan a un crecimiento adicional.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento en el cual se evite el uso de medios
de crecimiento de sistema variable e incontrolado.
Estos y otros objetos se consiguen mediante la
presente invención como se demuestra mediante el resumen de la
invención, la descripción de las formas de realización preferidas y
las reivindicaciones.
La invención se refiere a un procedimiento para
atrapar y confinar microorganismos en aire para su análisis,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- (a)
- extender un polímero soluble en agua; y
- (b)
- someter dicho polímero soluble en agua a un microorganismo presente en el aire.
Otro aspecto de la invención proporciona un
procedimiento para la detección y el contaje hasta uno del número de
microorganismos en el aire que está en un entorno aséptico,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- (a)
- atrapar y confinar dichos microorganismos presentes en el aire con un polímero soluble en agua;
- (b)
- disolver dicho polímero soluble en agua en un diluyente para formar una disolución;
- (c)
- separar dichos microorganismos a partir de dicha disolución; y
- (d)
- detectar dichos microorganismos por fluorescencia usando un analizador Scan RDI® o un analizador D-Count®.
La Fig. 1 es una gráfica que ilustra la variación
del tiempo de filtración con la concentración del polímero
poli(vinil alcohol) (PVA) (K30) usando una membrana de una
porosidad de 0,4 \mum (CB04).
Como se usa en esta invención, el término
"microorganismo" abarca algas, bacterias, hongos (levaduras,
mohos y esporas de moho) (incluyendo líquenes), rickettsias,
protozoos, polen, parásitos, ácaros, virus y agentes
subvíricos.
Como se usa en esta invención, el término
"bacteria" abarca bacterias formadoras de esporas e incluye,
pero no está limitado a, Escherichia coli, Brucella, Shigella,
Clostridia, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Staphylococcus
epidennidis, Treponema, Leptospira, Bomelia, Vibrio fetus, Spiriium
minus, Staphlococci, Streptococci, Gonococci, Salmonella,
Meningococci y similares, así como Staphylococus aureus,
Listeria monocytogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,
Aspergillus niger, Mycobacterium phlei, Shigella sonnei, Zymomonas
sp, Edwardsiella ictaluri y similares.
Tal como se usa en esta invención, el término
"polímeros solubles en agua" significa que los polímeros son
solubles en agua y/o diluyentes fisiológicos, tienen una
resistencia mecánica suficiente de manera que el polímero se pueda
transportar, retenga agua hasta un cierto grado y se adhiera a
microorganismos.
Por "microorganismos viables" se quiere
decir que los microorganismos son capaces de vivir bajo condiciones
apropiadas.
Por "condiciones apropiadas" se quiere decir
que los microorganismos no se desecan o no se estresan.
Por "atrapar" se quiere decir que los
microorganismos se secuestran del entorno mediante polímeros
solubles en agua.
Por "confinamiento" se quiere decir que los
microorganismos se adhieren o se atrapan de otra forma mediante
polímeros solubles en agua.
Por "el entorno" se quiere decir lo que
rodea ya sea aire, objetos físicos, superficies, y similares.
Tal como se usa en esta invención los términos
"Scan RDI®" y "ChemScan RDI®" se usan indistintamente y
son el mismo instrumento. Es muy conocido en la técnica que en
Estados Unidos el instrumento se denomina "Scan RDI®",
mientras que en Europa se denomina "ChemScan RDI®".
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un procedimiento para atrapar y confinar microorganismos
que están presentes en el aire mediante el uso de un polímero
soluble en agua. Preferentemente la presente invención implica el
análisis ambiental de microorganismos presentes en, por ejemplo,
una sala limpia en la cual se tienen que mantener las condiciones
asépticas. Después de que los microorganismos se atrapen y se
confinen se pueden transportar adicionalmente a un laboratorio para
análisis posteriores.
Los microorganismos atrapados y confinados pueden
ser microorganismos viables, microorganismos no viables y sus
mezclas. En una forma de realización preferida de la presente
invención, los microorganismos viables se atrapan y confinan en el
aire usando polímeros solubles en agua. En una forma de realización
preferida de la presente invención, los microorganismos viables se
atrapan y confinan en el aire usando polímeros solubles en agua. A
continuación los microorganismos viables se transportan y se
someten a análisis.
Después de que los microorganismos se recojan
sobre el polímero soluble en agua se analizan usando un analizador
Scan RDI® o D-Count®. El uso de estos analizadores
particulares proporciona un contaje de los microorganismos en 90
minutos aproximadamente desde la recepción de la muestra y puede
medir la presencia de hasta un microorganismo presente en el aire
con el analizador Scan RDI®. La sensibilidad de este tipo de
análisis es extremadamente importante para la monitorización de
microorganismos que pueden estar presentes en procesamientos
asépticos tales como en salas limpias. Además, no hay necesidad de
cultivar los microorganismos antes de su análisis, ahorrando por
tanto tiempo y dinero.
Los polímeros solubles en agua usados en la
presente invención se deberían adaptar al análisis del entorno y se
deberían preparar con propiedades físicas reproducibles y bien
definidas. Además, los polímeros solubles en agua usados en la
presente invención deberían ser fácilmente solubles en agua y/o un
diluyente fisiológico, tener una resistencia mecánica razonable de
manera que se puedan transportar sin romperse, retener agua hasta
un cierto grado en que los microorganismos que estén atrapados y
confinados puedan ser viables tras su análisis y adherir
microorganismos en el aire.
Se prefiere que los polímeros solubles en agua
tengan una morfología de área superficial alta para una captura de
microorganismos suficiente, sean no tóxicos, tengan unas buenas
propiedades de formación de películas o propiedades de moldeo,
procesabilidad, filtrables después de disolución, sean no
bactericidas y preferentemente esterilizables, si se desea.
Los polímeros solubles en agua usados en la
presente invención pueden ser naturales o sintéticos. Si se usan
polímeros naturales, se pueden modificar para conseguir las
características específicas expuestas anteriormente mediante, por
ejemplo, oxidación o injerto de polímeros. Se prefiere el uso en el
procedimiento de polímeros solubles en agua bien definidos
estructuralmente para atrapar y confinar a los microorganismos.
Los polímeros usados en la presente invención
pueden ser homopolímeros solubles en agua, copolímeros solubles en
agua, mezclas de más de un homopolímero/copolímero, polímeros
porosos y similares. Estos polímeros se pueden diseñar y sintetizar
para generar las propiedades específicas descritas
anteriormente.
Más específicamente, los polímeros solubles en
agua de la presente invención se caracterizan por su resistencia
mecánica, es decir, se pueden transportar sin romperse y así tienen
un peso molecular particular que está dentro del intervalo de 500 a
500.000 g/mol, preferentemente de 2000 a 250.000 g/mol, más
preferentemente de 1000 a 100.000 g/mol.
Además, los polímeros solubles en agua deben ser
solubles en agua y/o otros diluyentes fisiológicos, característica
que depende del peso molecular y el grado de hidrólisis, si fuese
aplicable. Los pesos moleculares particulares que están englobados
por estos criterios de solubilidad se exponen anteriormente. Hasta
el grado de hidrólisis es de interés, si fuese aplicable, los
polímeros solubles en agua de la presente invención tienen un grado
de hidrólisis entre el 70% y el 90%, preferentemente entre el 75% y
el 90% y lo más preferentemente entre el 80% del 89%.
Además, los polímeros solubles en agua de la
presente invención deben retener agua hasta un cierto grado. Esta
característica se puede medir por el contenido de agua en
equilibrio cuando estos polímeros se extienden y se secan al aire.
Más particularmente, el contenido de agua en equilibrio debería
estar entre el 1% y el 50% en p/p, más preferentemente entre el 2% y
el 40% en p/p y lo más preferentemente entre el 4% y el 30% en
p/p.
Debido a las propiedades de resistencia mecánica,
hidrofilicidad y retención de agua anteriores, los polímeros
solubles en agua de la presente invención, se adhieren a los
microorganismos, como se ejemplifica en los ejemplos. Así, los
microorganismos presentes en el aire se pueden atrapar y confinar
fácilmente con los polímeros solubles en agua expuestos en la
presente invención.
En una forma de realización preferida, los
polímeros usados en la presente invención también pueden tener las
siguientes propiedades:
- (1)
- el polímero en polvo debería ser fácilmente soluble en un diluyente apropiado a temperatura ambiente;
\newpage
- (2)
- deberían tener propiedades de moldeo o formación de películas y se pueden extender como una película uniforme o en un molde;
- (3)
- deberían tener buenas propiedades mecánicas e idealmente extraerse fácilmente del contenedor en el que se extienden sin rotura;
- (4)
- las películas, moldes, cuentas o microesferas poliméricas se deberían disolver completamente en agua a temperatura ambiente en una escala de tiempo razonable;
- (5)
- las películas, moldes, cuentas o microesferas poliméricas se deberían disolver para formar disoluciones claras y homogéneas en agua que sean filtrables a través de membranas;
- (6)
- después de la filtración no deberían quedar sobre la membrana residuos de polímeros que interfieran;
- (7)
- el polímero debería ser no bactericida;
- (8)
- las películas, moldes, cuentas o microesferas poliméricas deberían ser adhesivas a los microorganismos;
- (9)
- preferentemente, el polímero debería ser térmicamente estable hasta 120ºC; es decir, estable en condiciones de autociavado o inerte a la radiación;
- (10)
- el polímero debe retener agua; y
- (11)
- el polímero no debería estar químicamente reticulado para formar un gel insoluble tras su esterilización.
Ejemplos de polímeros que se pueden usar en la
presente invención pueden ser polímeros sintéticos solubles en agua
o porosos. Los polímeros porosos se pueden preparar, por ejemplo,
usando el procedimiento de Yang y Zhang, Journal of Membrane
Science, 114, pgs. 149-155 (1996). Los
polímeros sintéticos solubles en agua incluyen, pero no están
limitados a, óxido de polietileno (PEO), polietilen glicol (PEG),
poli(vinil pirrolidona) (PVP), poli(vinil alcohol)
(PVA), poli(ácido acrílico) (PAA), sal sódica del poli(ácido
acrílico) (PAMPSA), poli(estiren sulfonato sódico) (PSSS),
poliacrilamida, agarosa, poli(hidroxi etil metacrilato)
(PHEMA), poli(hidroxi etil acrilato) (PHEA) y similares.
También se pueden utilizar dos copolímeros o
mezclas de más de un homopolímero/copolímero. El polímero también
se puede hacer a medida o modificar para cambiar las diversas
propiedades del polímero según se desee; es decir, por ejemplo para
incrementar o disminuir su resistencia mecánica, sus
características de solubilidad en agua, su calidad de retención de
microorganismos, su calidad de retención de agua y sus
combinaciones.
En una forma de realización más preferida de la
invención, es preferible usar como polímero soluble en agua entre
1000 y 250.000 g/mol, más preferentemente entre 5000 y 100.000
g/mol, lo más preferentemente entre 7500 g/mol y 25.000 g/mol de
poli(vinil alcohol) (PVA); entre 5000 y 500.000 g/mol; más
preferentemente entre 10.000 y 100.000 g/mol y lo más
preferentemente entre 20.000 y 75.000 g/mol de poli(vinil
pirrolidona) (PVP); entre 500 y 100.000 g/mol, más preferentemente
entre 1000 y 50.000 g/mol, lo más preferentemente entre 2000 y
10.000 g/mol de óxido de polietileno (PEO); entre 2000 y 250.000
g/mol, más preferentemente entre 5000 y 100.000 g/mol, lo más
preferentemente entre 10.000 y 50.000 g/mol de poli(ácido acrílico)
(PAA); entre 1000 y 250.000 g/mol, más preferentemente entre 2000 y
100.000 g/mol, lo más preferentemente entre 5000 y 50.000 g/mol de
la sal sódica del poli(ácido acrílico) (PAMPSA); y entre 500 y
500.000 g/mol, más preferentemente entre 1000 y 50.000 g/mol, lo
más preferentemente entre 1500 y 10.000 g/mol de
poliacrilamida.
En una forma de realización más preferida de la
presente invención, es preferible el uso de poli(vinil
alcohol) (PVA) con un peso molecular promedio en el intervalo de
10.000 a 100.000 g/mol y un grado de hidrólisis en el intervalo del
80% al 90%.
Los polímeros se pueden moldear en forma de
películas, algodones, placas, fibras, discos, placas de contacto,
microesferas, cuentas y similares. La forma del polímero no es
importante y se puede adaptar al entorno en el cual se necesita la
obtención de muestras del aire. Todas estas formas se pueden
adaptar usando polímeros porosos o no porosos.
Si los polímeros solubles en agua se moldean en
forma de un objeto plano, tal como una película, placa o disco, el
grosor del polímero puede variar en el intervalo entre 50 \mum y
5 mm. Se prefiere que tenga un grosor en el intervalo entre 50
\mum y 1 mm.
Cuando se desean microesferas o cuentas, se
pueden usar procedimientos de extrusión o emulsión/suspensión que
son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las microesferas se
pueden preparar por el procedimiento de Thanoo y col., J. Pharm.
Pharmacol. 45, 16 (1993).
El tamaño de las microesferas puede variar
dependiendo de la cantidad de microorganismo que se necesite
atrapar y confinar. El tamaño puede variar entre 50 nm y 3 mm, más
preferentemente entre 1 \mum y 1 mm, lo más preferentemente entre
250 \mum y 500 \mum.
Los polímeros solubles en agua se pueden extender
a partir de la disolución según los procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, el polímero en polvo se puede disolver en un
diluyente y esterilizase, si se desea.
El diluyente que se usa generalmente para
disolver el polímero soluble en agua generalmente es agua libre de
bacterias. No obstante, también se puede utilizar tampón fosfato
salino, agua destilada, agua desionizada, agua WFI, agua estéril y
sus mezclas. Si fuese necesario, el pH de la disolución polimérica
se puede ajustar usando ácido acético diluido o hidróxido sódico
hasta el pH deseado, tal como pH neutro.
Si se desea la esterilización, se puede usar
cualquier procedimiento de esterilización mientras los polímeros
solubles en agua retengan su solubilidad en agua, resistencia
mecánica, no se desequen y mantengan su capacidad de confinamiento
y atrapamiento de manera que los microorganismos sobrevivan en el
biopolímero soluble en agua. Más específicamente, los polímeros se
pueden esterilizar usando un autoclave (121ºC durante 15 minutos),
por irradiación de rayos gamma (a una dosis entre 10 K Gray y 30 K
Gray, preferentemente 20 K Gray) o usando un tratamiento de óxido
de etileno.
La disolución polimérica soluble en agua se puede
filtrar a través de una membrana de poliéster para limpiar la
disolución polimérica soluble en agua. Generalmente se usa una
membrana de entre 0,3 \mum y 0,6 \mum, preferentemente entre
0,4 \mum y 0,5 \mum, más preferentemente de 0,45 \mum.
Después de la esterilización, el polímero soluble
en agua diluido se moldea en una forma apropiada como se describe
anteriormente y se extiende dejando que la disolución se evapore a
temperatura ambiente o en una campana extractora de flujo
laminar.
En general, las concentraciones de polímero
soluble en agua durante la extensión abarcan entre el 1% y el 20%
en peso aproximadamente, preferentemente entre el 1% y 12% en peso,
más preferentemente entre 5% y el 10% en peso. Cuando se usan dos
copolímeros o mezclas de más de un homopolímero/copolímero, se usa
la misma concentración final. Por ejemplo, se puede usar una mezcla
de copolímero poli(vinil alcohol) al 1% y poli(vinil
pirrolidona) al 4% en peso.
En un procedimiento típico, se puede extender una
alícuota del polímero soluble en agua. Por ejemplo, se puede añadir
a una placa Petri 5 ml de una disolución polimérica al 10% y el
agua se deja evaporar a temperatura ambiente en una campana de
flujo laminar para extender el polímero soluble en agua.
El polímero soluble en agua se debería preparar y
extenderse preferentemente en condiciones limpias y libres de
polvo.
"Generalmente", para monitorizar el aire los
polímeros solubles en agua se extienden en placas Petri que tienen
un tamaño de entre 90 mm y 150 mm de diámetro, más preferentemente
entre 50 mm y 130 mm de diámetro. Generalmente, en la obtención de
muestras del aire se necesita una mayor cantidad de polímero que en
otras aplicaciones ambientales tal como la monitorización de
microorganismos sobre superficies.
Después de que se extiendan los polímeros, el
polímero soluble en agua se expone al aire en el que se atrapan y
confinan los microorganismos. La muestra preferentemente se recoge
en condiciones estériles por procedimientos conocidos en la
técnica.
Por ejemplo, si uno quiere medir la cantidad de
microorganismos en una sala o entorno particular, el polímero
soluble en agua extendido se puede dejar en la sala o entorno entre
1 y 10 horas, preferentemente entre 1,5 y 8 horas, más
preferentemente entre 2 y 4 horas. El polímero soluble en agua
actúa como una trampa y confina a los microorganismos en el
polímero.
Alternativamente, el polímero soluble en agua se
puede unir a una montura adecuada y colgarlo de una chimenea de
ventilación.
Después de que la mezcla desconocida se sitúe o
se atrape y confine en el polímero soluble en agua, el polímero
soluble en agua con la muestra desconocida se resuspende a
continuación en un diluyente tal como peptona y Tween80® al 0,1%, o
agua WFI, agua libre de bacterias, agua estéril, tampón fosfato
salino y similares.
Los microorganismos atrapados se pueden recuperar
por centrifugación o por filtración. En una forma de realización
preferida, se usa la etapa de filtración. La disolución polimérica
resuspendida se puede filtrar a través de membranas de entre 0,1
micrómetros y 5 micrómetros, preferentemente entre 0,2 micrómetros
y 4,5 micrómetros, lo más preferentemente de 0,4 micrómetros.
El contenido en el número de microorganismos de
la disolución polimérica resuspendida se determina usando el
analizador D-Count® (Chemunex) o usando un
analizador Scan RDI® (Chemunex) descrito en la patente de EE.UU.
5.663.057, incorporada en esta invención por referencias. Usando
estos dos analizadores, el número de microorganismos presentes en
la muestra se puede analizar en 90 minutos y no requiere que los
microorganismos se cultiven antes de su análisis. Ambos analizadores
son citómetros que usan rayos láser en el análisis.
En esta forma de realización preferida la
disolución polimérica resuspendida que contiene los microorganismos
se puede analizar con el Scan RDI®. A continuación la muestra se
filtra a través de una membrana de 0,4 micrómetros de
porosidad.
Los microorganismos retenidos sobre la superficie
se marcan bien añadiendo directamente la disolución de marcaje en
las muestras para el analizador D-Count® o para el
analizador Scan RDI®. Los microorganismos retenidos sobre la
superficie de la membrana de filtración después de la filtración de
las muestras se marcan usando un marcador fluorescente o cualquier
producto químico que genere fluorescencia.
Los marcadores fluorescentes que se pueden usar
en la presente invención incluyen, pero no están limitados a
colorantes fluorescentes basados en derivados de la fluoresceína
tales como el ChemChrome V, pero también otros tipos de marcadores
fluorescentes tales como Cascade Blue, Lucifer Yellow®, Oregon
Green®, Acridine Orange, y similares.
En esta forma de realización preferida el
ChemChrome V se usa poniendo en contacto la membrana que retiene
los microorganismos con la disolución de ChemChrome V, preparada de
la siguiente manera: se añadió 100 \mul de ChemChrome V a 10 ml de
tampón de marcaje ChemSol filtrado (0,22 \mum). Las disoluciones
se mezclaron
completamente.
completamente.
Después de incubar la membrana con el colorante
de fluorescencia, según los protocolos descritos en el documento WO
98/55861; las membranas se analizaron a continuación con el
analizador Scan RDI®. Después del análisis la cantidad de los
sucesos de fluorescencia detectados por los analizadores se
correlaciona con el número de microorganismos en la muestra.
Para ilustrar adicionalmente la presente
invención y sus ventajas, se dan los siguientes ejemplos
específicos, entendiéndose que los mismos se pretende que solamente
sean ilustrativos y de ninguna manera limitantes.
Se disolvieron 5 g de poli(vinil alcohol)
(CAS Nº 9002-89-5) con un peso
molecular promedio de 10.000 g/mol y un grado de hidrólisis del 80%
en agua (100 cm^{3}) mientras se agitaba a temperatura ambiente.
Cuando esta disolución se disolvió completamente se autoclavó. Se
añadió 20 ml de la disolución a una placa Petri de plástico
estéril. A continuación la película se extendió al aire dejando que
el agua se evaporase a temperatura ambiente en una campana
extractora de flujo laminar. El tiempo para que se produjese la
extensión de la película fue de 10 horas aproximadamente dependiendo
de las condiciones de flujo laminar. El contenido de agua en
equilibrio en la película como se mide en el procedimiento expuesto
anteriormente fue del 6% en peso aproximadamente.
Se disolvieron 5 g de poli(vinil
pirrolidona) (CAS Nº 9003-3908) con un peso
molecular promedio de 44.000 g/mol en agua (100 cm^{3}) mientras
se agitaba a temperatura ambiente. Cuando esta disolución se
disolvió completamente, se filtró a través de un filtro de 0,45
micrómetros. Se añadió una disolución al 1% a una placa Petri de
plástico estéril. A continuación, la película se extendió al aire
dejando que el agua se evaporase a temperatura ambiente en una
campana extractora de flujo laminar. El tiempo para que se
produjese la extensión de la película fue de 16 horas
aproximadamente.
Las películas se extendieron a partir de
disoluciones acuosas a un intervalo de concentraciones que varían
entre el 5% y el 10%; es decir, 5 g a 10 g de polímero en 100 ml de
agua. Se añadió 5 ml de una disolución polimérica al 10% a una
placa Petri pequeña y el agua se dejó evaporar a temperatura y
presión ambiente. Las películas se extrajeron intactas de las
placas Petri y se evaluaron las propiedades mecánicas midiendo el
tiempo necesario para que el polímero soluble en agua se disuelva,
así como el tiempo de filtración.
Así, las películas se redisolvieron en agua pura
(50 ml a 20ºC) y se anotó el tiempo necesario para su
disolución.
Las pruebas de filtración se llevaron a cabo
sobre todos los polímeros solubles en agua (disoluciones de 50 ml)
a tres concentraciones diferentes de 1, 2 y 5% en condiciones
estándar (400 mbar) usando dos membranas de filtración diferentes
con un tamaño de poro de 0,2 micrómetros y 0,4 micrómetros,
respectivamente.
Se estableció el contenido de agua en equilibrio
para algunas de las películas extendidas, ya que se considera que
esto es importante en la determinación de la retención de agua. Las
películas se extendieron al aire mediante el procedimiento habitual
diluyéndose con agua y sometiéndolas a una campana de flujo laminar
para el secado y a continuación dejándolas hasta que las muestras
alcanzasen un peso constante. A continuación las muestras se
secaron en un horno de vacío a 100ºC, de nuevo hasta que las
muestras alcanzasen un peso constante. A partir de estas medidas, se
puede calcular el contenido de agua en equilibrio a partir de la
diferencia de masa entre los dos pesos constantes, que es igual a
la masa de agua; es decir, el peso de la masa deshidratada.
Las disoluciones poliméricas anteriores, es decir
PVA o PVP, se resuspendieron en 50 ml de peptona prefiltrada (1
g/litro) y Tween80® al 0,1%. Se añadió de 10 a 103 aproximadamente
de los siguientes microorganismos a la disolución polimérica
resuspendida en tubos separados:
A continuación se analizaron 10 ml de cada uno
del polímero/microorganismo usando el Scan RDI® y los protocolos de
"TCV" y "Fungi" desarrollados por Chemunex y
comercializados con el Scan RDI®.
Más específicamente, estos protocolos se exponen
de manera general a continuación, pero los expertos apreciarán que
se puede seguir una versión más detallada que está expuesta en el
documento WO 98/55861, incorporada en esta invención por
referencias. Todos los reactivos mencionados a continuación están
disponibles al público en Chemunex SA, que tiene su sede mundial en
Maisons-Alfort, Francia.
Con una jeringa (20 ml) equipada con una aguja,
se perforó el tampón de una botella CSE/2 y se aspiró el CSE/2 (1
ml por muestra). Se instaló una unidad de filtro Autotop de 0,2
\mum a la jeringa y se dispensó 1 ml de este contador de manchas
en el embudo del filtro. Se abrió la llave de vacío y se dejó pasar
el CSE/2 a través del filtro. Cuando se completó (no quedaba
líquido sobre la superficie de la membrana pero la membrana debería
permanecer húmeda) se cerró la llave de vacío. A continuación se
liberó el vacío.
El portador de muestras se preparó colocando los
soportes Labeling Pad en posición. Se extrajo un Labeling
Pad
del paquete y a continuación se depositaron 600 \mul de ChemSol A4 (medio de activación) en el Labeling
Pad.
del paquete y a continuación se depositaron 600 \mul de ChemSol A4 (medio de activación) en el Labeling
Pad.
La membrana de muestras se transfirió al Labeling
Pad asegurándose de que la misma cara de la membrana estaba en
contacto con el Labeling Pad y con el filtro.
El Labeling Pad y las membranas se incubaron a
37ºC \pm 3ºC durante 60 min \pm 5 min.
Después de la etapa de premarcaje la membrana
Chemfilter se transfirió a un nuevo Labeling Pad empapado
previamente con 600 \mul de disolución de marcaje e incubada
durante 30 minutos a 30ºC según los protocolos descritos en el
documento WO 98/55861.
Después de la etapa de marcaje, la membrana
Chemfilter marcada se introdujo en el instrumento Scan RDI®. El
análisis se realizó en los cuatro minutos siguientes a la
introducción de la membrana en la máquina.
La membrana Chemfilter marcada del Labeling Pad
se transfirió sobre el Support Pad. El soporte de membrana
protegido en una placa Petri se transfirió al instrumento ChemScan.
El barrido se inició usando el software. El análisis se realizó en
los cuatro minutos siguientes a la preparación del soporte de
membrana.
El protocolo de hongos se expone a
continuación:
Con una jeringa (20 ml) equipada con una aguja,
se perforó el tampón de una botella CSE/5 y se aspiró el CSE/5 (1
ml por muestra). Se instaló una unidad de filtro Autotop de 0,2
\mum a la jeringa y se dispensó 1 ml en el embudo del filtro.
Se abrió la llave de vacío y se dejó pasar el
CSE/5 a través del filtro. Cuando se completó (no quedaba líquido
sobre la superficie de la membrana pero la membrana debería
permanecer húmeda) se cerró la llave de vacío. A continuación, se
liberó el vacío.
Se extrajo un Labeling Pad del paquete y a
continuación se depositaron 600 \mul de ChemSol A6 (medio de
activación) en el Labeling Pad. La membrana de muestras se
transfirió al Labeling Pad asegurándose de que la misma cara de la
membrana estaba en contacto con el Labeling Pad y con el filtro.
El Labeling Pad y las membranas se incubaron a
30ºC \pm 3ºC durante 3 h \pm 5min.
Después de la etapa de premarcaje, la membrana
Chemfilter se transfirió a un nuevo Labeling Pad empapado
previamente con 600 \mul de disolución de marcaje e incubada
durante 1 h a 37ºC \pm 3ºC según los protocolos descritos en el
documento WO 98/55861.
Se preparó un Labeling Pad fresco para la fase de
marcaje. El Labeling Pad se colocó sobre un soporte del Labeling
Pad en el ChemPrep S. Se colocó 600 \mul de una disolución de
marcaje sobre el Labeling Pad.
La membrana Chemfilter se transfirió al nuevo
Labeling Pad.
El Labeling Pad y las membranas se transfirieron
a continuación en el portador de muestras al ChemPrep S. y se
incubaron a 37ºC \pm 3ºC durante un mínimo de 1 h para completar
la incubación.
Después de la etapa de marcaje, la membrana
Chemfilter marcada se introdujo en el instrumento Scan RDI®. El
análisis se realizó en los cuatro minutos siguientes a la
introducción de la membrana en la máquina.
También se analizaron los controles que usan los
microorganismos solos que no han tenido contacto con el polímero
como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la
Tabla 1 a continuación.
En la Tabla 1 anterior, el porcentaje de
recuperación es la relación entre los resultados del Scan RDI® y
las cuentas de placa.
La preparación de los polímeros se realizó en el
Ejemplo 2. Se realizó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3,
excepto que los microorganismos se pusieron en contacto con el
polímero durante 15 minutos antes del análisis. Los resultados de
este experimento se exponen en la Tabla 2.
Como se puede ver de los resultados, las
recuperaciones fueron superiores al 100% y son muy similares al
control.
En este experimento, se midió el número de
microorganismos en el aire. El polímero de PVA se preparó como en
el Ejemplo 2 y se dejó en los laboratorios 30 minutos y 3 h 30
minutos respectivamente antes del análisis. El análisis se realizó
como se expone en el Ejemplo 3. La Tabla 3 da los resultados de
este experimento.
Se preparó óxido de polietileno (PEO), polietilen
glicol (PEG), poli(ácido acrílico) (PAA), sal sódica del poli(ácido
acrílico) (PAMPSA), poli(estiren sulfonato sódico) (PSS) y
poliacrilamida según el Ejemplo 2 y se extendieron siguiendo el
procedimiento del Ejemplo 1. Los estudios de citotoxicidad se
realizaron como en los Ejemplos 3 y 4. El número de microorganismos
se analizó según el Ejemplo 5. Se obtuvieron resultados similares
usando estos polímeros particulares.
En este experimento, se midió el número de
microorganismos en el aire en una sala limpia de clase 100. Los
polímeros se prepararon como en el Ejemplo 2 y se extendieron en
una placa Petri de 90 mm de diámetro. El polímero soluble en agua
extendido a continuación se colocó cerca del conducto de
ventilación durante las condiciones de operación y se dejó durante
4 horas antes del análisis. El análisis se realizó como se expone en
el Ejemplo 3.
Ya que no hay microorganismos presentes en esta
muestra se confirma que la sala limpia cumple los patrones de
limpieza del aire en este entomo controlado particular.
Las disoluciones poliméricas anteriores, es decir
PVA o PVP se prepararon como en el Ejemplo 2 y se extendieron en una
placa Petri de 90 mm de diámetro.
Se depositó sobre la superficie del polímero
soluble en agua extendido de 10 a 10^{3} aproximadamente
microorganismos de una mezcla (50x50) de microorganismos viables y
muertos.
A continuación las películas de polímero se
retiraron de las placas y se redisolvieron en agua pura como se
describe en el Ejemplo 2.
Las disoluciones de polímero que contenían los
microorganismos se filtraron a través de membranas Chemfilter de
0,4 \mum antes de que estas últimas se procesasen adicionalmente
con los siguientes protocolos de marcaje:
- -
- el número de microorganismos viables se define usando el marcador de viabilidad (ChemChrome) y el analizador Scan RDI® según el protocolo WC como se describe en los ejemplos previos,
- -
- la población celular total (viva y muerta) de microorganismos se determina usando el siguiente protocolo: se deposita 0,8 ml de una disolución de Orange Acridine sobre la superficie de las membranas Chemfilter y se incuban durante dos minutos a temperatura ambiente. A continuación se obtiene el número de células marcadas después de la observación manual en las membranas con un microscopio de epifluorescencia convencional.
Los resultados muestran una coherencia perfecta
entre el número de células viables determinadas por el analizador
Scan RDI®, el número esperado de células muertas y el valor de la
población total que se había determinado experimentalmente.
Claims (16)
1. Un procedimiento para atrapar y confinar
microorganismos para su análisis futuro, comprendiendo dicho
procedimiento las etapas de:
- (a)
- extender un polímero soluble en agua, en el que dicho polímero soluble en agua tiene un contenido de agua en equilibrio entre el 1% y el 50%; y
- (b)
- someter dicho polímero soluble en agua a un microorganismo presente en el aire.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho polímero soluble en agua tiene una resistencia
mecánica suficiente para ser transportado, es soluble en agua u
otro diluyente fisiológico, retiene agua y se adhiere a los
microorganismos.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que dicho polímero soluble en agua tiene un
peso molecular en el intervalo de entre 500 y 500.000 g/mol.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un peso molecular en el intervalo de entre 2000 y 250.000
g/mol.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un peso molecular en el intervalo de entre 1000 y 100.000
g/mol.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un grado de hidrólisis entre el 70% y el 90%.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un grado de hidrólisis entre el 75% y el 90%.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un grado de hidrólisis entre el 80% y el 89%.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un contenido de agua en equilibrio entre el 2% y el 40%.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un contenido de agua en equilibrio entre el 4% y el 30%.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho polímero soluble en agua
se selecciona del grupo compuesto por óxido de polietileno,
polietilen glicol, poli(vinil pirrolidona),
poli(vinil alcohol), poli(ácido acrílico), sal sódica del
poli(ácido acrílico), poli(estiren sulfonato sódico),
poliacrilamida y sus mezclas.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho polímero soluble en agua
es poli(vinil alcohol) o poli(vinil pirrolidona).
13. Un procedimiento para la detección de
microorganismos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
de:
- (a)
- atrapar y confinar dichos microorganismos con un polímero soluble en agua, en el que dicho polímero soluble en agua tiene un contenido de agua en equilibrio entre el 1% y el 50%
- (b)
- disolver dicho polímero soluble en agua en un diluyente para formar una disolución;
- (c)
- separar dichos microorganismos a partir de dicha disolución; y
- (d)
- detectar dichos microorganismos por fluorescencia usando un analizador Scan RDI® o un analizador D-Count®.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dichos microorganismos se separan en la etapa (c) por
filtración o centrifugación.
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 o reivindicación 14, en el que dicho diluyente
en la etapa (b) se selecciona del grupo de agua libre de bacterias,
tampón fosfato salino, agua destilada, agua desionizada, agua
estéril y sus mezclas.
16. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que se puede detectar hasta 1 microorganismo.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00403304A EP1209223B1 (en) | 2000-11-24 | 2000-11-24 | Process for trapping and confining microorganisms in air using water-soluble polymers |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2238979T3 true ES2238979T3 (es) | 2005-09-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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