JP2001522242A - 生物試料液体を微容量に分割するための方法と装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 微生物を検出し、列挙するために、水性生物液体試料を別個の微容量に分割するための方法を記載している。本発明の方法は、各液体保持ゾーンが疎水性「ランド」領域の一部によって囲まれている培養装置の複数の親水性液体保持ゾーンに微容量の試料を分配するステップを含む。また、これらの方法を実施するための装置を開示している。

Description

【発明の詳細な説明】 生物試料液体を微容量に分割するための方法と装置 本発明は、水性液体が本発明の装置の親水性ゾーン内に保持されると同時に、 本発明の疎水性領域から実質的に排除される傾向に基づいて、生物試料を微容量 分量に分割するための方法と装置とに関する。背景技術 微生物の検出および列挙は、食品加工業界(大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および黄 色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）などの微生物による食品の汚染について試験 する)、医療業界(感染または汚染について患者の試料または他の臨床試料を試験 する)、環境試験業界、医薬品業界並びに化粧品業界を含む数多くの状況におい て実施されている。 増殖に基づいた微生物の検出および列挙は、液体栄養培地（最確数分析（ＭＰ Ｎ)）または半固形栄養培地（寒天シャーレ）のどちらかを使用して普通に実施 されている。液体ＭＰＮ法を使用した列挙は、一般に、選択培地および化学的指 示薬を入れた一連の重複培養試験管に関心のある試料の連続１０倍希釈液を入れ ることによって実施されている。試験管を高温で（２４〜４８時間）インキュベ ーションし、次に生物の増殖を調査する。各組の陽性および陰性の試験管の数に 基づいて統計式を使用して最初の試料に存在する生物の数を推定する。 ＭＰＮ分析を実施するこの方法にはいくつかの欠点がある。この分析を実施す るのに必要な多数回の希釈ステップおよび分注ステップのために、この方法は労 働集約的である。また、実際には各希釈について約３〜５本の試験管による重複 培養組を使用するのが実用的である。結果として、微生物濃度のＭＰＮ推定値の ９５％信頼限界は極めて広くなる。例えば、試験管３本のＭＰＮ推定値２０は９ ５％信頼限界が７〜８９である。 上記の方法とは異なって、試料中の目に見える細菌の直接的な計数は、ゲル化 剤を入れた栄養培地を使用して、規定された領域に試料を塗抹することによって 実施することができる。ゲル化剤（寒天）はインキュベーション中（２４〜４８ 時間）の生物の拡散を予防し、最初の生物を付着させた領域にコロニーを形成す る。しかし、近隣のコロニーと融合して計数を困難にする前に栄養培地の所定の 領域に適合することができるコロニーの数には限界がある。これは、通常は、各 試料について数回の希釈を実施することを必要とする。また、混じり合った集団 の中に存在する個々の種類の微生物を同定するために使用することができる部類 の化学的指示薬分子は、ゲル化培地に不溶性である生成物を生成するものに限定 される。 これらの欠点に加えて、現在使用されているるＭＰＮ分析およびゲル化システ ムは共に、陽性の結果を検出することができる前に比較的長期のインキュベーシ ョン時間を必要とする。発明の開示 本発明は、生物液体試料を操作者の側の最小の操作だけで別個の微容量に分割 することができるという発見に基づいている。分割方法は、疎水性「ランド」エ リアに囲まれた親水性液体保持ゾーンを具備する装置を使用する。本発明の方法 と装置は、現在使用されているシステムによる問題を解決する、微生物および他 の生物材料を検出および列挙するためのシステムを提供する。本発明のシステム は液体系システムで、試験をするために試料を別個の微容量に効率的且つ効果的 に分割することを可能にし、迅速な検出および列挙を可能にする。 微生物を検出および列挙するためのＭＰＮ分析の場合には、本明細書に記載す る方法は水溶性指示薬種の使用を可能にし、現在のＭＰＮ分析に一般に必要とさ れているいくつかの希釈液の必要性が少ないし、または必要性がない。 一般に、本発明は水性液体試料を別個の微容量に分割するための方法であって 、 ａ）微生物を培養するための装置を提供するステップであって、前記装置が親 水性液体保持ゾーンと、前記ゾーンの間の疎水性ランド領域とを具備するアッセ イ面を有し、各ゾーンが微容量収容能力の液体保持性を有するステップと、 ｂ）液体試料が親水性液体保持ゾーンに分割されるように、液体試料とアッセ イ面とを接触させるステップと、 を含む方法を特徴とする。 ゾーンは栄養培地または指示薬物質などのアッセイ試薬の被覆または付着を有 してもよい。適当な指示薬物質は発色指示薬、蛍光指示薬、発光指示薬および電 気化学的指示薬を含むが、これらに限定されない。本発明の用途のために、「電 気化学的」という用語は微生物と反応する結果、試料の抵抗すなわち伝導率を変 化させる化学的指示薬を意味する。 ゾーンはサイズが均一であることができ、各ゾーンは約０．０１〜約２５マイ クロリッター、さらに好ましくは約１〜約２マイクロリッターの液体保持能力を 有する。 培養装置は、例えば、約１０〜約１０，０００個の親水性液体保持ゾーン、さ らに好ましくは約４００〜約６００個の親水性液体保持ゾーンを有することがで きる。 親水性液体保持ゾーンは疎水性ランド領域に囲まれた微容量ウェルを有しても よい。または、培養装置は処理済みのナノ構造フィルムを具備するランド領域を 有してもよい。さらに別の実施態様では、親水性液体保持ゾーンはアッセイ面か ら突出する親水性繊維材料を具備してもよい。繊維材料は親水性吸着性ディスク または親水性不織繊維ループ材料から構成されてもよい。 別の実施態様では、培養装置は複数の組の親水性液体保持ゾーンを具備し、組 の各々は均一なサイズのゾーンを有し、組は液体保持能力が異なり、本発明の装 置は少なくとも２つの組のゾーンを具備してもよい。 別の態様では、本発明は微生物を検出または列挙するための培養装置であって 、親水性液体保持ゾーンと、前記ゾーンの間の疎水性ランド領域とを具備するア ッセイ面を有し、各ゾーンが微容量収容能力の液体保持性を有し、ゾーンの少な くともいくつかがアッセイ試薬を有する装置を特徴とする。 本明細書に使用する「微生物」という用語は、細菌、マイコプラズマ、リケッ チア、スピロヘータ、酵母、糸状菌、原生動物を含むがこれらに限定されない全 ての顕微鏡的生生物および生細胞並びに例えば、単細胞（組織もしくは器官から 直接培養もしくは誘導されたもの）または小集団の細胞のような顕微鏡的形態の 真核細胞を含む。微生物は、細胞全体が直接検出されたときだけでなく、このよ うな細胞が、細胞画分、細胞性生物分子または細胞副産物の検出または定量によ るなどして間接的に検出されたときも検出および／または列挙される。 「疎水性」および「親水性」という用語は、本明細書において、当技術分野に おいて普通に理解されている意味を与える。このように、「疎水性」材料は水ま たは水性媒体に対する親和性が相対的に少ないまたは全くないが、「親水性」材 料は水または水性媒体に対する親和性が相対的に強い。本明細書に記載する装置 の相対的な疎水性および親水性は、液体試料を、試料適用時に本明細書に記載す る親水性液体保持ゾーンに実質的に確実に分割するものである。疎水性および親 水性の必要な程度は試料の性質に応じて変わってもよいが、装置への適用時に、 液体試料を単純に実験的に観察する事に基づいて容易に調整することができる。 本発明の他の利点は以下の詳細な説明および図面によりあきらかになる。図面の簡単な説明 図１は、アッセイ装置の一実施態様の斜視図である。 図２は、微容量収容能力の液体保持性が異なる親水性液体保持ゾーンの組を具 備するアッセイ装置の上面図を示す。 図３は、疎水性ナノ構造フィルムを具備するアッセイ装置の概略図である。 図４は、親水性液体保持ゾーンが紙ディスクから構成されているアッセイ装置 の概略図である。 図５ａは、親水性液体保持ゾーンが不織繊維ループ材料から構成されているア ッセイ装置の斜視図である。 図５ｂは、図５ａに示す装置の拡大上面図である。 図６ａは、アッセイ面が親水性であるアッセイ装置の上面の写真である。 図６ｂは、親水性液体保持ゾーンと疎水性ランド領域とを有するアッセイ装置 の上面図の写真である。詳細な説明 本発明は、液体試料中の微生物を信号に基づいて検出および列挙するために、 生物試料を微容量の液体試料分量に分割することに関する。 微生物の液体試料の試験に関する分野において遭遇される問題には、相対的に 長いインキュベーション時間、試験する分量に分割するために多数回の分注操作 を行う必要性および試験するために相対的に大容量の試料の必要性がある。 本発明はこのような試験に関連するこれらの問題および他の問題の解決法を提 供する。実験室の技術者または他の操作者に必要な液体試料の操作を最小にして 、液体試料を試験装置の微容量小部屋に分割するための方法と装置とを提供する 。本明細書において使用する「微容量」は約２５マイクロリッターより少ない容 量をいい、マイクロリッターより少ない範囲の容量を含む。本発明の発明者らは 、液体試料中の微生物を信号に基づいて検出する際に微容量を使用することによ り、検出可能な信号を生成するのに必要なインキュベーション時間を顕著に短縮 することができることを発見した。インキュベーション時間の短縮は当分野にお いてかなり望ましいので、本発明のこの特徴は別個の利点となる。 インキュベーション時間の短縮を達成することに加えて、液体試料を試験する 際に微容量を使用することにより、実質的により少量の試験試料を使用すること が可能となる。ときには、試料原料の容量が非常に少量であることにより非常に 小容量の試験試料が必要になることがある。例えば、試料の取り扱いまたは試験 施設への試料の輸送を容易にするためにも小容量の試験試料が望ましいときがあ る。 本発明の発明者らは生物液体試料を親水性液体保持ゾーン（また、本明細書に おいて「液体保持ゾーン」または「ゾーン」ともいう）に別個の微容量で分割す るための多数の新規な装置を開発した。これらの装置の限定的でない例には、液 体保持ゾーンとして機能する、例えば微容量ウェルのような複数の微小部屋とウ ェルの間の疎水性である領域（「ランド」領域）とを有する微細型押またはプレス 加工フィルム；フィルムの別個の液体保持ゾーンが親水性で、試験するための微 容量の液体試料を保持するように調節されたナノ構造疎水性フィルム;および、 親水性液体保持ゾーンと疎水性ランド領域を具備し、所定の親水性ゾーンが親水 性繊維材料から製造され、周囲のランド領域の平面から上方または下方に突出す る装置が含まれる。 有利なことに、上記の装置は１つの装置に微容量の分量を使用して、このよう な試験に別個の容器を使用する必要性をなくして、液体試料を試験することを可 能にする。試験試料を数百個または数千個もの別個の液体保持ゾーンに分配する ことができ、液体試料の試験においてデータ採取時点数を実質的に増やすことが できる。 本発明の方法と装置の特に有用な用途は液体試験試料の増殖に基づいた微生物 の検出および列挙である。このような増殖に基づいた検出および列挙は、微生物 による汚染について食物試料、環境試料、臨床試料、化粧品試料および他の試料 を試験する際に非常に重要である。本発明の方法と装置はこのような試料の効率 的で、正確で、簡便で、費用効果のある試験を可能にする。 このような微生物試験における本発明の方法と装置の好ましい用途はＭＰＮに おいてである。伝統的なＭＰＮでは、関心のある試料を連続（１０倍）希釈し、 選択増殖培地および化学的指示薬を入れた重複培養試験管の組に等量ずつ分注す る。試験管を高温において約２４〜４８時間インキュベーションし、次に生物の 増殖を調査する。各組の陽性および陰性の試験管の数に基づいて、統計式を使用 して最初の試料に存在する生物の数を推定する。現在使用されているこの伝統的 な方法にはいくつかの欠点がある。分析を実施するのに必要な多数回の希釈およ び分注ステップのために労働集約的である。実際には、各希釈について約３〜５ 本の試験からなる重複培養組が普通に使用されている。結果として、この方法を 使用した微生物濃度のＭＰＮ推定値の９５％信頼限界は極めて広い。例えば、９ 本の試験管（３種類の１０倍希釈液）によるＭＰＮ推定値２０は９５％信頼限界 が７〜８９である。 ＭＰＮ分析に本発明の方法と装置を使用することにより、上記のいくつかの欠 点が克服される。個々の試験管への分注操作の必要がなくなり、攪拌または他の 操作がほとんどまたは全く必要なくなるので、労働量は大幅に削減される。それ に代わり、液体試料を装置に単純に接触させることによって、液体試料を微容量 液体保持ゾーンに分配する。また、大多数の液体保持ゾーンが装置に存在する場 合には、より少ない本数の試料希釈液が必要になるだけである。比較的大多数の 液体保持ゾーンはまた、より正確な微生物濃度の推定値を提供する。これは、デ ータ採取時点の数が多いほど、信頼限界区間は狭くなるからである。 従って、本発明は液体試験試料中の微生物を検出（列挙を含む）するための方 法を提供する。本発明の方法は、アッセイ装置の複数の親水性液体保持ゾーンに 微容量の試験試料を分配するステップを含む。アッセイ装置は、複数の親水性液 体保持ゾーンを有し、各ゾーンは微容量収容能力の液体保持性を有するアッセイ 面を具備するいかなる装置であってもよい。装置はまた、疎水性であり、生物試 料が液体保持ゾーンに分配された後も液体を実質的に含まないでいるランド領域 をゾーンの間に具備する。このようなアッセイ装置の限定的でない例は本明細書 に記載するものを含む。 アッセイ装置の液体保持ゾーンはサイズが均一で、各ゾーンは約０．０１〜約 ２５マイクロリッターの液体試料の液体保持能力を有する。好ましくは、各ゾー ンは約０．１〜約１０マイクロリッター、さらに好ましくは約１〜約２マイクロ リッターの液体保持能力を有する。アッセイ装置は、好ましくは、１〜約１００ ，０００個の液体保持ゾーン、さらに好ましくは約１０〜約１０，０００個のゾ ーン、よりさらに好ましくは約２００〜約５，０００個のゾーン、最も好ましく は約４００〜約６００個のゾーンを有する。 約４００〜約６００個の親水性液体保持ゾーンを有する装置の使用は、ＭＰＮ を使用して微生物濃度について液体試料を試験する場合に特に有用である。ある 種の規制要件は、試験方法は１〜５ミリリッターの試料中の１個の細菌を検出で きなければならないと指示している。このような試料サイズは微生物を試験する 食品加工業界では標準的である。従って、例えば各ゾーンが約２マイクロリッタ ーの液体収容能力を有する、５００個の親水性液体保持ゾーンを有するアッセイ 装置は１−ｍｌの試料を試験するために非常に有用であると思われる。２マイク ロリッターの収容能力を有する液体保持ゾーンは本発明による検出可能な信号の 迅速な発生を可能にし、約４００〜約６００個のゾーンの使用はＭＰＮ算出の信 頼区間を実質的に改善するのに十分に大きい数のデータ採取時点を提供する。ま た、微生物陽性の試験結果を示す液体保持ゾーンを手動で計数することが可能で ある。実質的に４００個より多い液体保持ゾーンを有する装置の使用は、実際に は、機器の補助、すなわち自動計数装置を必要とすることがある。 液体試験試料はいかなる起源の関心のあるいかなる試料であってもよい。試料 は複数の液体保持ゾーンに直接分配されても、ゾーンに分配される前に試料を希 釈してもよい。試料の希釈が必要であるかどうかに関する決定は試料の起源およ び材齢などの種々の要因に依存し、このような決定は当業者には日常的なことで ある。 液体試験試料は関心のある微生物の選択栄養増殖培地および／または増殖中の 微生物の存在下において信号を生成する指示薬物質を含んでもよい。必要に応じ て、栄養培地は、増殖中の微生物を「封入する」助けをするゲル化剤を含んでも よい。このようなゲル化剤は当業者に周知であり、水性液体の添加によりゲル化 する任意の吸水性材料を含む。 または、選択栄養増殖培地および指示薬物質の一方および両方が、微容量の液 体試験試料をゾーンに分配するとき、望ましい濃度を達成するのに十分な量で、 液体保持ゾーン内に被覆または他の形態の付着物として存在してもよい。このよ うな被覆は、例えば栄養培地（ゲル化剤を含有または含有しない）および／また は指示薬物質の溶液を液体保持ゾーンに入れるまたは分配して、溶液を乾燥して ゾーンの中に栄養培地および／または指示薬物質の被覆または付着物を形成する ことによって得ることができる。 関心のある多種多様の微生物の多種多様の選択増殖培地が周知であり、同様に 多種多様の微生物の多種多様の指示薬も周知であり、これらの培地または指示薬 物質のいかなるものも本発明の方法に使用するのに好適である。本発明の利点は 、可溶性指示薬を使用することができるということである。その理由は、水性生 物試料の液体を親水性液体保持ゾーンにだけとどめることによって拡散を防げる からである。 種々の方法を使用して液体試験試料を液体保持ゾーンに分配することができる 。１つの特定の装置には複数の方法を適用することができるが、好ましい方法は ある程度は特定のアッセイ装置の構造に依存する。例えば、親水性微容量ウェル を有するフィルム装置またはゾーンがアッセイ表面の平面から突出する親水性繊 維材料を有する装置では、試料を装置の上に注ぐかまたは分注し、装置を傾斜ま たは揺らすことによって試料を液体保持ゾーンに拡散することができる。または 、実施例４に記載するように、装置のアッセイ面を試料に浸漬することができる 。 液体試料からアッセイ面を取り出すと、液体は親水性液体保持ゾーンに保持され 、疎水性ランド領域からは実質的に排除される。 試料をアッセイ装置の親水性液体保持ゾーンに分布した後、望ましい用途に応 じて種々のアッセイを実施することができる。微生物を検出または列挙するため には、アッセイ装置を、微生物の少なくとも１回の細胞分裂周期を可能にするの に十分な時間の間インキュベーションすることができる。これらの目的のために は、装置を、一般に、約２５℃〜約４５℃、さらに好ましくは約３０℃〜約３７ ℃においてインキュベーションする。細菌の検出のインキュベーション時間はさ まざまである。インキュベーションされた液体試験試料中の指示薬物質によって 証明される検出可能な増殖を生成するためには、大抵の細菌の検出時間は約２０ 分〜約２４時間の範囲である。この比較的短いインキュベーション時間は、一般 に約２４時間以上のインキュベーション時間を必要とする、現在使用されている 検出方法を上回る別個の利点となる。 アッセイ装置のインキュベーション後、液体保持ゾーン（従って、液体試験試 料中）の微生物の有無を検出する。検出様式は本発明の方法に使用する指示薬物 質の種類に依存する。検出可能な信号を提供することができるいかなる指示薬物 質を使用することができる。このような指示薬には、蛍光指示薬、発色指示薬、 発光指示薬および電気化学的指示薬が含まれるが、これらに限定されない。発色 指示薬または発光指示薬を使用する場合には、ゾーンの微生物の有無は、裸眼ま たは顕微鏡により目視的に検出することもできる。蛍光指示薬物質を使用する場 合には、蛍光信号を検出するための装置と方法を検出のために使用することがで きる。微生物を検出する分野に周知であり、電気化学的変化を検出するためのシ ステムを含む多数の指示薬物質および信号検出システムが存在し、このようない かなる物質またはシステムを本発明によって使用することができる。 液体試料中の微生物の検出は液体試験試料中の微生物計数値の列挙を含む。好 ましい態様において、列挙はＭＰＮを使用して実施される。関心のある微生物を 含有する液体保持ゾーンの数が決定されると、既知のＭＰＮ技法を使用してＭＰ Ｎ算出を実施することができる。望ましい場合には、例えば、既知の標準と比較 した信号強度のような既知の技法を使用して、またはゾーンの内容物を平板培養 することによって、個々のゾーンの微生物の数を求めることができる。有利なこ とには、本発明の方法に使用される大多数の液体保持ゾーンは液体試験試料のＭ ＰＮ分析の９５％信頼限界の間隔が狭い。 １つの装置で操作することができる大多数の液体保持ゾーンのために、本発明 の利点を保持しながら、関心のある多数の微生物の検出および列挙に１つの装置 を使用することができる。例えば、１つの液体試験試料を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）と黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の存在または濃度について試験するこ とができる。アッセイ装置の一部はこれらの微生物の１つの検出および列挙のた めの親水性液体保持ゾーンを有することができ、同時にゾーンに第の組は関心の ある別の微生物の検出および列挙に使用することができる。これは、例えば、液 体保持ゾーンのそれぞれの組に微生物に特異的な栄養および／または指示薬物質 を入れることによって実施することができる。または、全ての液体保持ゾーンは 多数の微生物を同時に検出するために作成されたアッセイ試薬を含有することが できる。例えば、蛍光指示薬物質を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を検出するこ とができるが、同時に発色指示薬物質を用いて他の大腸菌群が検出される。 別の実施態様において、分配ステップは、複数の組のゾーンを具備するアッセ イ装置の複数の親水性液体保持ゾーンに液体試験試料の少量を分配するステップ を含む。各組は均一なサイズのゾーンを有し、装置は少なくとも２つの組のゾー ンを有する。例えば、アッセイ装置は複数のレーンを有してもよく、特定のレー ンの親水性液体保持ゾーンは同じ液体保持能力を有する。この特徴により、１つ のアッセイ装置に異なる試験容量サイズずつの液体試験試料を分配することが可 能になる。ＭＰＮでは、高濃度の試料について、適当な容量サイズを選択し、連 続希釈の必要なく１つの装置で１つの分配ステップを使用してＭＰＮ分析を実施 することができるという点において、この特徴は重要な利点となる。 上記のように、実施される特定の実施態様に応じて、親水性液体保持ゾーンと 疎水性ランド領域とを具備する任意のアッセイ装置を使用して、本発明の方法を 実施することができる。本発明の発明者らは本発明の方法に使用するのに好適な いくつかの新規な装置を開発した。以下はこのような装置の限定的ではない例で ある。 図１を参照すると、装置１０は親水性微容量ウェル１４の形態の複数の親水性 液体保持ゾーンを具備する基材１２を含む。基材１２は、微容量ウェルを形作り 、装置１０の有効寿命期間にわたってそれぞれの形状を維持するいかなる材料か ら製造されてもよい。基材１２は、例えば、ポリマーフィルムまたは他の適当な 材料から製造されてもよい。適当なポリマーには、ポリエチレン、ポリプロピレ ン、ポリイミド、フルオロポリマー、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびポ リスチレンが含まれるが、これらに限定されない。特定のポリマーが十分に親水 性でない場合には、親水性を与えるように処理することができる。例えば、界面 活性剤をフィルムに添加して親水性を与えることができる。当業者は表面の親水 性を与えるための他の手段を認識している。基材１２の材料に適当に任意に加工 処理することによって微容量ウェル１４を形成することができる。このような加 工処理には、加熱型押加工、キャスト型押加工、レーザードリル加工、反応性材 料によるエッチングまたは複数の小開口部を有するパターン化材料シートの支持 フィルムへの積層を含むが、これらに限定されない。ポリエチレンまたはポリプ ロピレンフィルムは、例えば、プレス型押加工または押出型押加工されてもよく 、種々の顔料または界面活性剤を含んでもよい。 再び図１を参照すると、微容量ウェル１４の間の領域１３（「ランド領域」）は 疎水性であるように製造される。これは、微容量ウェル１４の間に水性液体が橋 かけしないように作用し、それによって交差汚染を防ぐ。ランド領域１３は種々 の方法で疎水性にしておくことができる。例えば、界面活性剤の添加によってす でに親水性にされている押出型押加工済みポリエチレンのランド領域は、アクリ レート化シリコーンまたは他の疎水性材料の薄層をランド領域に転写することに よって疎水性にすることができる。 装置１０は任意の望ましい数の微容量ウェルを具備することができる。また、 装置１０は、装置内の適当な湿度レベルを維持するためにより大容量の液体を保 持するように調節した比較的大きい受け器または他の小部屋を具備してもよい。 予備的なスクリーニングなどのある種の用途のためには、微容量ウェルの数は比 較的少なくてもよいが(例えば、２〜５０)、微容量ウェルのサイズは小さいので 、１つの装置１０に比較的大多数のウェルを製造することができる。好ましく は、本発明の装置は約１０〜約１０，０００個の液体保持ゾーンを有し、よりさ らに好ましくは約２００〜約５，０００個のゾーンを有し、最も好ましくは約４ ００〜約６００個のゾーンを有する。装置１０は、サイズが均一な微容量ウェル １４の集団を有するが、ウェルは均一なサイズである必要はない。例えば、図２ に示す装置１６は、容量が同一組内では同じであるが、組が異なると変わる微容 量ウェルの組（例えば、列）を有してもよい。図２に示すように、容量はウェル の組の配列に従って変化して増加してよく、小さい方のウェル１８はマイクロリ ッターより少ない容量を保持し、大きい方のウェル２０はマイクロリッター容量 を保持する。図２に示すような装置の最も大きいウェルが「微容量」ウェルと分 類されないようなウェル２２を有することさえもできる。このようなウェルは、 例えば、実質的に２５マイクロリッターより多い液体保持能力を有してもよい。 別の実施態様では、基材１２は疎水性ナノ構造フィルムで被覆されてもよい。 特許出願国際公開公報第９６／３４６９７号に記載されているように、例えば、 ポリイミドまたはフルオロポリマーウェブは、有機顔料、鉛、金および他の材料 を蒸着被覆して特殊なナノ構造フィルムを形成し、次いでオクタデシルメルカプ タンまたはフルオロカーボン−炭化水素チオールなどの有機分子集成物で被覆す ることによって疎水性にすることができる。相対的に親水性の微容量ウェルおよ び他の液体保持ゾーンは、基材１２の選択された領域から疎水性ナノ構造構成要 素を除去することによって形作られてもよい。これは、以下の実施例３に記載す るように、封入／剥離およびレーザー研磨を含むがこれに限定されない種々の方 法で実施することができる。 代表的な疎水性ナノ構造フィルム装置２４は、図３に概略図を示す。このよう な装置は、水性試料溶液に浸漬することによって簡単に試料を入れるすることが できる。この目的のために、装置２４はハンドル２６を具備してもよい。ハンド ル２６により、液体試料に装置２４の全体を浸漬することを含む望ましい深さま で、操作者は装置２４を液体試料に入れることができるが、操作者の指を試料に 接触させない。試料から装置２４を取り出すと、液体試料は、装置の親水性液体 保持ゾーン２８の部位にだけ付着したままである。次いで、上記のようにインキ ュベーションと検出を実施する。 アッセイ装置はまた、疎水性面に配列された親水性吸収材料から構成された親 水性液体保持ゾーンで製造されてもよい。例えば、ゾーンは、円形、卵形、四角 形、多角形または他の適当な形状を有する吸収性の紙から構成されてもよい。図 ４に示すように、例えば、綿リンター結合剤無添加紙３０をシリコーン被覆フィ ルム３２に積層して、周囲の疎水性面３６の平面から突出する親水性液体保持領 域３２を形成することができる。または、不織繊維ループ材料から、周囲の疎水 性ランド領域の平面から突き出る（突出する）親水性液体保持ゾーンを構成して もよい。例えば、図５ａおよび図５ｂに示すように、アッセイ装置３８は、界面 活性剤を含有するポリプロピレン不織繊維ループ材料から製造された突出部４２ の配列を有する疎水性ポリプロピレンフィルム４０のシートを含んでもよい。 アッセイ装置の液体保持ゾーンにアッセイ試薬を被覆または付着させてもよい 。このようなアッセイ試薬は微生物増殖の栄養；ゲル化剤;発色指示薬、蛍光指 示薬、発光指示薬および電気化学的指示薬などの指示薬物質を含んでもよいが、 これらに限定されない。アッセイ試薬は、当業者に周知の固体の基材にアッセイ 試薬を固定するための多数の方法のいかなる方法によって液体保持ゾーンに固定 されてもよい。このような方法には、例えば、アッセイ試薬を含有する液体をゾ ーンの中で乾燥する方法、並びに生物分子および他のアッセイ試薬を固体の基材 に非共有結合的に結合するための他の方法が含まれる。または、当業者に周知の 方法によって種々の方法を使用して、アッセイ試薬をウェル１４内の基材１２材 料に共有結合で結合することができる。 上記に考察するように、アッセイ装置内に微容量液体保持能力を有する親水性 液体保持ゾーンが存在することにより、液体試験試料を相対的に大多数の試験容 量に分離することができる。液体試料を微容量分量に分離し、分量間の交差汚染 を生じることなくＭＰＮまたは他のアッセイを実施する能力は本発明の方法と装 置の一利点である。 本明細書に引用した全ての参考文献および出版物はその内容が参考として本明 細書において本発明の開示内に組み入れられている。本発明の特定の実施態様は 詳細に考察され、本発明の範囲内において可能な形態について言及されている。 当業者が利用可能であり、本発明を同様にうまく実施させると思われる種々の別 の技法および手順が存在する。 実施例 以下の実施例は本発明を理解する際の助力とするために提供されており、本発 明の範囲を限定するものと考えられるものではない。特に示さない限り、全ての 部および割合は重量による。 実施例１ 型押フィルム培養装置 複数の微小小部屋を具備し、液体試験試料中の微生物の検出に使用することが できる型押フィルム培養装置をこの実施例に記載するように構成した。 親水性液体保持ゾーンは、例えば加熱型押フィルム加工、キャスト型押加工、 レーザードリル加工のような多数の方法によって、および反応性材料を用いて表 面をエッチングすることによって基材に形成されてもよい。ポリマーフィルムに 窪みすなわち微容量ウェルを形成する方法についての詳細な説明は、米国特許第 ５，１９２，５４８号；同第５，２１９，４６２号；同第５，３４４，６８１号 および同第５，４３７，７５４号に提供されている。以下の説明はこの後の実施 例に使用する特殊な型押フィルム培養装置の代表である。 Ａ．複数の微容量ウェルを含有するプレス加工 １０重量％のＴｉＯ₂（５０％ＴｉＯ₂／５０％ポリエチレン顔料濃縮物）と０ ．５重量％トリトンＸ−３５界面活性剤（シグマケミカルカンパニー(Ｓｉｇｍ ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ)）を含有するポリエチレン（イーストマ ンケミカルカンパニーレジン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｍｐａｎｙ Ｒｅｓｉｎ）＃１８ＢＯＡ）またはポリプロピレンをフィルム（厚さ４ｍｉｌ ）に押出キャスト成型した。フィルムをシートに切断し、米国特許第５，２１９ ，４６２号に記載するように、複数の微容量ウェルを形成するように設計した、 フォトリソグラフィーによりエッチングしたマグネシウム合金工具に積層した( 〜２０シート)。エッチング加工したマグネシウム工具は、この後の実施例に記 載するパターンで配列された突出部を有した。積層したポリエチレンシートは 米国特許第５，２１９，４６２号に記載されているように、加熱液圧プレス（１ ３２℃、１．４Ｎ／ｍ²、１２０秒滞留時間）で型押加工した。微容量ウェルは ６角形に配列し(〜１９ウェル／ｃｍ²)、各ウェルは、表面の直径約１．９ｍｍ 、深さ約１．１ｍｍでの直径１．０ｍｍを有する逆切頭円錐の形状であった。微 容量ウェルは米国特許第５，２１９，４６２号に記載されているように、かみそ りの刃の端で希釈した試料溶液をフィルムに描くことによって充填した。試料を 冷却し、その温度で工具をはずして、工具の「陰」像を有する単層フィードブロ ックを得た。 Ｂ．複数の微容量ウェルを具備する押出型押しフィルム フォトリソグラフィーによりエッチングしたマグネシウムマスター工具を感圧 転写接着剤を使用してスチール工具に取り付けた。実施例１Ａに記載したポリエ チレン、顔料および界面活性剤組成物をブレンドし、米国特許第５，１９２，５ ４８号に記載されているようにロールに押出鋳造した。トリトンＸ−３５界面活 性剤を含有しない型押フィルムもこの方法で製造した。 Ｃ．疎水性「ランド」領域を有する押出型押フィルム トリトンＸ−３５界面活性剤を含有する押出型押ポリエチレンフィルムを実施 例１Ｂにより製造した。ロール対ロール被覆装置（スクラブデザイン社（Ｓｃｒ ｕｂ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏ.）を用いて、４．８％の架橋剤を含有するアクリレー ト化シリコーン（ゴールドシュミット（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ）ＦＣ７１１） の薄層を転写することによって、微容量ウェルの間の領域（「ランド」領域）を疎 水性にした。８５ミリジュール／ｃｍ²の線量を提供するＨバルブ付きフュージ ョンシステムズ（Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製ＵＶランプを使用し、窒 素大気中でフィルムを紫外線に暴露することによって疎水性被覆を硬化した。 実施例２ 接種方法 （複数の微容量ウェルを使用する方法） Ａ．指示薬溶液の接種 フェノール赤指示薬（コントラストを提供するため）を含有する水性溶液を ピペットで、複数の微容量ウェルを具備するシリコーン処理およびシリコーン未 処理ポリエチレン型押フィルムに適用した（それぞれ、実施例１Ｃおよび１Ｂ） (約１．３μｌ／ウェル)。微容量ウェルは６角形に配列し(〜１９ウェル／ｃｍ ２)、各ウェルは、表面の直径約１．９ｍｍ、深さ約１．１ｍｍでの直径１．０ ｍｍを有する逆切頭円錐の形状であった。微容量ウェルは米国特許第５，２１９ ，４６２号に記載されているように、かみそりの刃の端で希釈した試料溶液をフ ィルムに描くことによって充填した。疎水性シリコーン被覆で処理した試料は、 ウェルの間に流体の橋かけを生ずることなく液体を個々の微容量に分配すること を示したが、未処理のフィルムでは液体の橋かけが観察された。 Ｂ．微生物を含有する試料の接種 複数の微容量ウェルを具備する型押フィルム培養装置に細菌を含有する試料を 接種する方法をこの実施例で明らかにする。接種した装置を使用して、細菌の大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を検出し、列挙した。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ５１８１３の一晩ブロス培養物（トリプシ ン大豆ブロス（ＴＳＢ）培地中〜１０⁹ＣＦＵ／ｍｌ）を、４−メチルウンベリ フェリル−β−Ｄ−グルクロニド（０．５ｍｇ／ｍｌ）(ＭＵＧ、バイオシンス インターナショナル(Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ)、イリノ イ州ナパービル)）を含有するバイオレットレッド胆汁（ＶＲＢ）培地（７．０ ｇ／ｌのバクトペプトン、３．０ｇ／ｌの酵母抽出液および１．５ｇ／ｌの胆汁 酸塩）中で連続希釈した。希釈液はおおよその細菌濃度１００ＣＦＵ／ｍｌに調 製した。実施例２Ａに記載するように、希釈した試料（０．５ｍｌ）をピペット でシリコーン処理およびシリコーン未処理ポリエチレン型押フィルム（４０６個 の微容量ウェル）に適用した。接種した型押フィルム４３をペトリ皿の中に入れ て、３７℃において１２時間インキュベーションした。シリコーン処理フィルム ４６の２８個の微容量ウェル４４が、鮮明な別個の蛍光スポットを示した(図６ ｂ)。一方、未処理のフィルムではかなりのウェル間の交差汚染が観察された。 シリコーン処理したフィルムでは、２８個の陽性ウェルは、式ＭＰＮ＝Ｎ ln( Ｎ／Ｎ−Ｘ)（式中、Ｎは充填されたウェルの総数で、Ｘは陽性反応を示すウェ ルの総数である）を使用して算出した、最確数（ＭＰＮ）５８ＣＦＵ／ｍｌに相 当 する。 この実施例の結果は、微生物は、複数の微容量ウェルを具備する型押フィルム 培養装置を使用して容易に検出および列挙することができ、ウェルの間のランド エリアに疎水性物質を被覆することによってウェル間の交差汚染を排除すること ができることを示す。 実施例３ ナノ構造フィルム培養装置 疎水性ナノ構造フィルムを被覆した基材に配列した複数の親水性微容量液体保 持ゾーンを具備するナノ構造フィルム培養装置をこの実施例に記載するように構 成した。 Ａ．ナノ構造フィルム ナノ構造面を作成するための方法は米国特許第４，８１２，３５２号および同 第５，０３９，５６１号に開示されている。簡単に説明すると、有機顔料Ｃ．Ｉ ．顔料赤１４９（アメリカン ヘキスト−セラネス(Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｏｅｃ ｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ)、ニュージャージー州ソメルセット）を、予め７０ ０Åのプラチナで金属蒸着しておいた厚さ０．０１２５−ｎｍ、３０×３０ｃｍ のポリイミドウェブシートに２５０ｎｍの厚さまで真空蒸着した。ＰＲ １４９ 顔料をウェブ基材に垂直に濃い分布で配向した別個のひげ結晶に変換させるのに 十分である、２６４℃の真空オーブンで３０分より長く試料を焼きなました。２ ５００Åの厚さに相当する質量の金をひげ結晶に蒸着し、ＳＥＭで測定したとき 、高さ〜２μｍ、直径〜０．１５μｍ、面積数密度５／（μｍ）²の金粒子の配 座被覆を形成した。 別の方法として、ポリイミドを透明なフルオレノンポリエステル（ＦＰＥ、３ Ｍ社(３Ｍ Ｃｏ.））と交換し、ＰＲ １４９の蒸着中の表面の帯電を予防する が、本質的に透明さを保つ５０Åの金を蒸着した。 Ｂ．疎水性ナノ構造フィルム 次いで、Ｃ₈Ｆ₁₇（ＣＨ₂）₁₁ＳＨの０．１ｍＭエタノール溶液に４時間浸漬し 、次に純粋なエタノールですすぎ、空気乾燥して、ナノ構造フィルムを疎水性 にした。得られた疎水性の高い面は、水に対する前進および後退接触角が同じ１ ７８°であると測定された。この方法は特許出願国際公開公報第９６／３４６９ ７号に記載されている。 Ｃ．ナノ構造フィルム培養装置 米国特許第５，３３６，５５８号に記載されているナノ構造フィルムの封入／ 剥離方法を使用して、ナノ構造フィルム培養装置を構成した。簡単に説明すると 、ナノ構造疎水性フィルム片を１．５×２．０ｃｍの帯状物に切断した。直径１ ．５−ｍｍの穴が〜４ｍｍの間隔をおいて配置された四角形の配列を有する厚さ ０．２５−ｍｍの貫通しているスチールシートを帯状物のナノ構造側に重ねた。 速硬性ビニルポリシロキサンカプセル剤（３Ｍエクスプレス（３Ｍ ＥＸＰＲＥ ＳＳ）歯科用印象材、３Ｍ社(３ＭＣｏ.)）をスチール板上に大量に適用し、穴 を通って材料を浸透させ、ナノ構造ひげ結晶を封入した。数分後、印象材を硬化 させ、スチールシートを除去することにより、ポリイミドウェブの穴の配列部分 だけナノ構造構成要素をきれいに除去した。穴の下の領域の露出した金属被覆ポ リイミド基材は、面の残りと比較して相対的に親水性であった。これは、帯状物 を水性溶液に浸漬し、露出スポットまたはゾーン領域の配列にだけ小さい液滴が 残存していることを観察することによって証明された。 別の方法で、好ましくは、ポリイミドウェブからナノ構造構成要素を除去する ためにレーザー研磨を使用して、相対的に親水性液体保持ゾーンの望ましい配列 を提供した。ナノ構造疎水性フィルムの帯状物を、直径１ｍｍの平行ビーム、約 ２ミリジュール、６０ナノ秒パルスのＱ−スイッチモードで作動させたＮｄ−Ｙ ＡＧレーザーで研磨した。単パルスを使用して、中心間隔４−ｍｍおよび５−ｍ ｍの直径１−ｍｍのゾーンの列を研磨した。９個の直径１−ｍｍのゾーンからな る３×３マトリックスを重ねることによってより大きいゾーン、〜１．６×１． ６ｍｍ平方を作成した。得られた４０個（４×１０）個のゾーンを有するナノ構 造フィルム培養装置を最初に水に１分間沈めて、研磨したゾーン領域を親水性に した。板を引き上げると、４０個のゾーンの各々は直径〜１−ｍｍ、半球系の液 滴が付着していた。 実施例４ 接種方法（ナノ構造フィルム培養装置を使用する方法） Ａ．水性液体試料による接種 ナノ構造フィルム培養装置（実施例３Ｃ）によって選択的に回収される液体の 量を接種し、測定するために、サイズの直径１〜２．５ｍｍ（平均２ｍｍ）の１ ２個の親水性液体保持ゾーンを具備する板を純粋な水に浸漬し、ゾーンに抽出さ れた水の量を重量で測定した。最初板を〜３秒／ｃｍの遅い引き上げ速度で浸漬 した。引き上げ後、板の背面をティッシュペーパーに接触させて、ポリイミド板 の背面についた全ての水滴を除去し、次いで板を質量平衡計（最小感度０．１ｍ ｇ）にのせ、１５秒後に質量を記録した。これを１５回繰り返し実施した。１２ 個の水を含んだゾーンの質量の平均値および標準偏差は３．７±０．２ｍｇで、 平均ゾーン容量は０．３１０μｌ±５％であった。次いで、この手順を速い引き 上げ速度で繰り返し実施し、板を〜０．１秒であると推定される時間内に水から 引き上げた。この速度では、親水性ゾーンに残存した液体の量はより多かった。 その理由は、液体が「のびて」、動的に平衡になる時間がなかったからである。 １５回の試験の平均値および標準偏差は６．０±０．５ｍｇで、平均ゾーン容量 は０．５００μｌ±１２％であった。 Ｂ．黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含有する試料の接種 複数の微容量液体保持ゾーンを具備するナノ構造フィルム培養装置に細菌を含 有する培地を接種する方法をこの実施例で明らかにした。接種した装置を使用し て黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）(実施例４Ｂ)および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）(実施例４Ｃ)の細菌を検出および列挙した。 融解した（〜６０℃）細菌増殖培地ＢＨＩ（ブレーンハートインフージョン、 ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ.） と寒天（１．２％重量／容量）の混合物（５μｌ）を、実施例３Ｃに記載したよ うに調製したナノ構造フィルム培養装置の親水性ゾーンにスポットした。寒天「 スポット」を室温で冷却させ、固化させた。１枚の板をＢＨＩブロス培地の黄色 ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の増殖培養物（〜 １０⁸細胞／ｍｌ）に短時間浸漬した。同様に、他の板をそれぞれ、１０⁷およ び１０⁵細胞／ｍｌである、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）培養物の１： １０および１：１０００希釈液に浸漬した。板を、湿度を維持するために水を飽 和させたフィルターペーパーを入れたプラスチック製のペトリ皿に入れ、３７℃ で４時間インキュベーションした。次いで、９００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液(シ グマケミカル社(Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.)、ｐＨ８．０)；１２０μ ｌの蛍光指示薬溶液（１．０ｍｇ／ｍｌのＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａ ＭＣＨＣｌ(ノババイオケム(ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ)、カリフォルニア州サン ジエゴ)）を７２ｍＭトリエタノールアミン、１４４ｍＭＮａＣｌに溶解したも の、ｐＨ８．４)；および、３０μｌのヒトプロトロンビン（シグマケミカル社( Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.)、５０ｍｇ／ｍｌを５ｍＭトリス緩衝液、 ５０ｍＭＮａＣｌに溶解したもの、ｐＨ８．０）を含有する溶液に板を浸漬した 。上記と同じ条件下において板をさらに１時間インキュベーションし、次いで、 ＵＶ光線下（〜３６６ｎｍ、ミネラライト(Ｍｉｎｅｒａｌｉｔｅ)、ＵＶＰ社( ＵＶＰ，Ｉｎｃ.)、カリフォルニア州サンガブリエル）で調査した。寒天培地、 細菌懸濁液および指示薬溶液を含有するゾーンは全て、細菌を全く添加しないで 調製した対照試料の蛍光が見えないものと比較して、目に見える強烈な青みがか った蛍光を示した。ゾーン間の交差汚染は観察されなかった。 Ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する試料の接種 以下の成分を合わせて寒天培地を調製した：ゼラチンの膵臓消化物（１０ｇ、 ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ）Ｇ、アクメディアマニュファクチャー社(Ａｃｕｍ ｅｄｉａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ)、メリーランド州バルチモア)；バクト 胆汁酸塩番号３(ＢａｃｔｏＢｉｌｅ Ｓａｌｔｓ Ｎｕｍｂｅｒ ３）(２．５ｇ 、ディフコラボズ(Ｄｅｆｃｏ Ｌａｂｓ)、ミシガン州デトロイト)；寒天(６ｇ 、ディフコラボズ(ＤｅｆｃｏＬａｂｓ))；および、脱イオン水(５００ｍｌ)。 混合物を攪拌し、寒天が解けるまで１００℃までの温度で加熱し、１２１℃で１ ５分間蒸気滅菌し、次いで室温まで冷却して固化させた。フィルター滅菌(０． ２ｍｍ)イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、カルバイオケム社(Ｃ ａｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ.)、カリフォルニア州ラジョラ）の脱イオン水溶 液（２００ｍｇ／ｍｌ）からＩＰＴＧストック溶液を調製し、使用時まで− ２０℃で保存した。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵ −Ｇａｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）からＭＵ− Ｇａｌストック溶液を調製し、使用時まで４℃で保存した。使用直前に、寒天培 地を１００℃で溶かして、２５ｍｌを滅菌した５０−ｍｌの試験管に移した。次 いで、ＩＰＴＧストック溶液（１２．５ｍｌ）とＭＵ−Ｇａｌストック溶液（１ ５０ｍｌ）を冷却した（〜６０℃）寒天懸濁液中で混合した。混合物を速やかに 、実施例４Ｂに記載したナノ構造フィルム培養装置に移した(４−μｌ分量)。室 温まで冷却した後、板を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ５１８１３の指数関数 的な増殖培養物（ＬＢ培地３中で〜１０⁸細胞／ｍｌ）の中央に浸漬し、３７℃ において個別の加湿ペトリ皿中でインキュベーションした。４時間のインキュベ ーション後、ミネラライト（Ｍｉｎｅｒａｌｉｇｈｔ）ＵＶランプを用いて蛍光 について板を調べた。接種したゾーンは、未接種のゾーンで観察されるものより もわずかに強い蛍光を示した。次いで、板をさらに１６時間インキュベーション し、再度調べた。接種したゾーンは、未接種のゾーンに比べて有意に強い青い蛍 光を示した。透明なフィルム基材(ＦＰＥを使用した実施例３Ａ)で調製した板は 、一方の側から発光し、もう一方の側から観察または写真撮影することができる ので、測定するのに特に便利であった。ゾーン間の交差汚染は観察されなかった 。 実施例５ 吸収性ディスク培養装置 疎水性面に配列された複数の親水性吸収性ディスクを具備し、液体試験試料中 の微生物の検出および列挙に使用することができる吸収性ディスク培養装置をこ の実施例に記載するように構成した。 吸収性材料シート(シェイチャー＆シュエル（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ＆ＳＣｈｕ ｅｌｌ）等級９０３ペーパー；約４．５ｇの水／１００ｃｍ²を吸収する）を、 発色指示薬２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＴＴ Ｃ）(アムレスコ(Ａｍｒｅｓｃｏ)、オハイオ州ソロン)を含有するアクリレート 感圧接着剤（ＰＳＡ）を用いて、レクサム（Ｒｅｘａｍ）シリコーン被覆フィ ルム（基材として厚さ２−ｍｉｌの透明ポリエステルを有する等級＃１５８１９ Ｄ ２ＭＩＬ ＣＬ ＰＥＴ ＭＭ３４Ｐ／０００、レクサムリリース(Ｒｅｘ ａｍ Ｒｅｌｅａｓｅ)、イリノイ州オークブルック）に積層した。材料を０．５ ％蛍光指示薬４−メチルウンベリフェリルホスフェート（１００μｇ／ｍｌ、シ グマ(Ｓｉｇｍａ)、ミズーリ州セントルイス）と４−メチルウンベリフェリル− α−Ｄ−グルコシド（５０μｇ／ｍｌ、シグマ(Ｓｉｇｍａ)）を含有するＴＳＢ 増殖栄養液で飽和し、ワイヤーを巻き付けた棒でぬぐい、１１０℃で１０分間乾 燥した。直径約０．６３５ｃｍの円形ディスクを積層物から抜き取り、シリコー ン被覆フィルムバッキングを除去した。次いで、ディスクが等しい間隔の平行な 棒状パターンになるように、ＰＳＡ付きディスクを別のレクサム（Ｒｅｘａｍ） シリコーン被覆フィルムシートに接着した。フィルムとディスクの集成物を８． ９ｋＧｙのレベルまでガンマ線照射し、サイズに切断し、次いで角皿が２０ディ スクのフィルムを１枚有するように、ペトリ皿に貼った。重量測定値に基づいて 、得られた培養装置中の角ディスクは約４０μｌの液体を保持する能力を有した 。 実施例６ 接種方法 （吸収性ディスク培養装置を使用する方法） 複数の微容量液体保持ゾーンを具備する吸収性ディスク培養装置(吸収性ディ スク)に細菌を含有する培地を接種する方法をこの実施例において明らかにした 。接種したディスクを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を検出および列挙し た。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ５１８１３の培養物を希釈して、約１０ＣＦ Ｕ／ｍｌおよび１ＣＦＵ／ｍｌを含有する懸濁液を作成した。懸濁液試料（１〜 ２ｍｌ）をピペットによって実施例５に記載した吸収性ディスク培養装置に適用 した。過剰の液体試料を捨て、それによりディスクに約０．８ｍｌが残った(１ ０ディスク、約４０μｌの液体／ディスク)。接種した装置を３５℃で、２３時 間インキュベーションし、紫外線下で調査した。蛍光を示すディスクの数を角デ ィスクについて計数し、最確数（ＭＰＮ）値を実施例２Ｂに記載した式を使用し て算出した。ＭＰＮ／１ミリリッターは、得られた値を試料の総容量（０．８ｍ ｌ）で割ることによって算出した。結果を表６ａに示し、大腸菌群計数登録商標 ペトリフィルム（ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ）プレート（３Ｍ社（３Ｍ Ｃｏ.）を用い て試験した標準品によって得られた計数値と比較した。蛍光を示すディスクはし ばしば、通常はディスク内の別個のスポットとして、赤いＴＴＣ色を示した。吸 収性ディスク間の交差汚染は観察されなかった。 この実施例の結果は、疎水性フィルムに配列された複数の吸収性ディスクを具 備する吸収性ディスク培養装置は細菌を含有する液体試料を容易に接種すること ができること、および接種したディスクは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出および 列挙に使用することができ、得られた値は市販の大腸菌群計数登録商標ペトリフ ィルム（ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ）プレートによって得られた値に匹敵することを示 す。 実施例７ 接種方法 （親水性繊維培養装置を使用する方法） 複数の微容量液体保持ゾーンを具備する親水性繊維培養装置（不織繊維ループ )を構成し、これに指示薬溶液および細菌を含有する培地を接種する方法をこの 実施例において明らかにした。接種したディスクを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）細菌を検出および列挙した。Ａ．装置の構成 相対的に親水性界面活性剤を含有するポリプロピレン不織繊維ループ突出部の 配列を具備する疎水性ポリプロピレンフィルムシートを米国特許第５，２５６， ２３１号に記載されているように調製した。シートをサイズに切断し、ペトリ皿 の底に貼りつけ、培養装置を作成した。各装置は、等しい間隔で平行の棒状で六 角形にパターン化された約２００本の繊維ループ突出部を有するフィルムを含ん だ。角半球形の突出部は基底面が六角形で(辺の長さ約３ｍｍ、高さ２ｍｍ)、約 １０μｌの液体を保持する能力を有した。 Ｂ．指示薬溶液の接種 フェノール赤指示薬(コントラストを与えるため)を含有するリン酸緩衝液(「バ ッターフィールド(Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ)、フィッシャーサイエンティフィッ ク(Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ))試料（１ｍｌ）をピペットで装置中央 のフィルムに適用した。液体は、接種地点から速やかに親水性繊維ループ突出部 に進入していくのが観察された。液体は、速やかにループ突出部に分配されると 同時に、疎水性ポリプロピレンランド領域から「排水していく」のが観察された 。２００個の突出部のうち約６５個が充填された。ループ突出部の間にあるラン ド領域の上に着色された液体の橋かけは観察されなかった。 Ｃ．微生物を含有する試料の接種 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）(ＡＴＣＣ５１８１３、ＴＳＢ培地中〜１０⁹ＣＦＵ／ ｍｌ）の一晩培養物を、４−メチルウンベリフェロン−β−Ｄ−グルクロニド（ ０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するＶＲＢ培地(７．０ｇ／ｌバクトペプトン(Ｂａｃ ｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ)、３．０ｇ／ｌ酵母抽出液、１．５ｇ／ｌ胆汁酸塩)で連 続希釈した。１０^-8希釈液は、細菌濃度約１０ＣＦＵ／ｍｌに対応して調製した 。試料（１ｍｌ）を、実施例７Ｂに記載したように、親水性繊維培養装置（実施 例７Ａ）の中央部のフィルムにピペットで適用した。接種後、ペトリ皿の蓋をし て、蒸散しないように絶縁テープを使用して密封した。次いで、装置を逆さにし 、３７℃で１９時間インキュベーションした。インキュベーション後、３６５ｎ ｍの照射下で蛍光を示す突出部の数を計数した。５つの分離した別個の突出部が 、強い蛍光を有することが観察された。突出部の間では蛍光は観察され なかったことにより、交差汚染はなかったことを示している。実施例２Ｂに記載 した式を使用して、ＭＰＮ値は５ＣＦＵ／ｍｌであることが算出された。 この実施例の結果は、疎水性フィルムの上に配列された複数の親水性繊維ゾー ンを具備する親水性繊維培養装置は細菌を含有する液体試料を容易に接種するこ とができること、および接種した装置は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出および列 挙に使用することができることを示す。 本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の種々の改良および変 更を加えられることは当業者にあきらかであり、本発明は本明細書に記載する例 示的な実施態様に限定されないことが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 クレジカレック，ゲイリー・イー アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 (72)発明者 ウェイ，アイ−ピン アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 (72)発明者 バーグ，ジェイムズ・ジー アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 (72)発明者 ウィカート，ピーター・ディ アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 (72)発明者 カルハウン，クライド・ディ アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 (72)発明者 デーブ，マーク・ケイ アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 (72)発明者 キウ，ジュン アメリカ合衆国55133―3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水性液体試料を別個の微容量に分割するための方法であって、 ａ）微生物を培養するための装置を提供するステップであって、前記装置 が親水性液体保持ゾーンと、前記ゾーンの間の疎水性ランド領域とを具備するア ッセイ面を有し、各前記ゾーンが微容量収容能力の液体保持性を有するステップ と、 ｂ）前記液体試料が前記親水性液体保持ゾーンに分割されるように、前記 液体試料を前記アッセイ面に接触させるステップと を含む方法。 ２．前記ゾーンがアッセイ試薬の被覆または付着を含む、請求項１に記載の方 法。 ３．前記栄養培地が少なくとも１種の指示薬物質を含む、請求項２に記載の方 法。 ４．前記指示薬物質が発色指示薬、蛍光指示薬、発光指示薬および電気化学的 指示薬からなる群から選択される請求項３に記載の方法。 ５．前記培養装置が、約４００〜約６００個の親水性液体保持ゾーンを具備す る、請求項１に記載の方法。 ６．請求項１に記載の方法を実施する際に使用するための培養装置であって、 親水性液体保持ゾーンと、前記ゾーンの間の疎水性ランド領域とを具備するアッ セイ面を有し、各前記ゾーンが微容量収容能力の液体保持性を有し、前記ゾーン の少なくともいくつかがアッセイ試薬を含む装置。 ７．前記装置が約１０〜約１０，０００個のゾーンを具備する、請求項６に記 載の培養装置。 ８．各前記ゾーンが約０．０１〜約２５マイクロリッターの液体保持能力を有 する、請求項６に記載の培養装置。 ９．前記アッセイ試薬が栄養培地を含む、請求項６に記載の培養装置。 １０．前記アッセイ試薬が指示薬物質を含む、請求項６に記載の培養装置。