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Zytobakteriologische Färbelösung und Verfahren zur Herstellung derselben
Die Erfindung betrifft eine zytobakteriologische Färbelösung für das selektive Farben von Pflanzenzellen und tierischen Zellen, sowie von Bakterien, und und Verfahren zur Herstellung dieser Färbelösung.
Zurmophologischen Untersuchung werden seit Ende des vorigen Jahrhunderts zahlreiche Färbende- thoden verwendet. Zur bakterioskopischen Prüfung verwendet man z. B. die Methode nach Gram ; das Färben mit Methylenblau usw., wogegen für zytoskopische Untersuchungen das Verfahren nach Giemsa, Field usw. verwendet wird. In der Zytogenetik kommt das Verfahren nach Felgen, Giemsa usw. zur Anwendung.
Im allgemeinen wird nun für jeden diagnostischen Zweck eine mehrstufige Methode angewendet, bei der mehrere Farbstoffe zur Verwendung kommen, wobei die einzelnen Farbstoffe jeweils nur bestimmte Arten von Zellen anfärben. Beispielsweise können mit
Fuchsin [Di- (p-aminophenyl)- (p-amino-m-methylphenyl)-carbinol < Hydrochlorid] und
Malachitgrün [Di- (p-dimethylamino-phenyl) -phenyl-carbinol. Hydrochlorid oder 1/2 Oxalat] Zellkeine und mit
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-dimethylamino-phenazthioniumsalz]durch verschieden starkes Anfärben unterschieden werden.
Es stellt nun einen gewissen Nachteil dar, beim Vorliegen eines hinsichtlich der in Frage kommenden Zellen noch unbekannten Präparates mehrere der oben angegebenen Färbemethoden bzw. mehrere der für mikroskopische Untersuchungen üblichen Farbstoffe, beispielsweise mehrere der oben angegebenen Farbstoffe, aufeinanderfolgend anwenden zu müssen um, insbesondere bei kompliziert gelagerten Fällen, eine für die erforderliche Diagnose ausreichende Vorinformation zu erhalten. Die damit gegebene Verzögerung der Diagnose ist insbesondere in eine Vielzahl verschiedener Präparate untersuchenden diagnostischen Laboratorien von Nachteil.
Mit der Erfindung wird nun bezweckt, eine zytobakteriologische Färbelösung zu schaffen, welche es ermöglicht, in einem einzigen Färbevorgang Präparate verschiedenster Provenienz in einer in den meisten der Fälle voll informativen Weise anzufärben. Dies gelingt mit einer zytobakteriologischen Färbelösung für das selektive Färben von pflanzlichen und tierischen Zellen, sowie von Bakterien, welche gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie zu 0, 25 bis 7, 0% aus Brillantgrün bzw.
Malachitgrün und zu 0,0335 bis 8% aus basischem Fuchsin, sowie gegebenenfalls bis zu 5, 0% aus 2Methylamino-7-dimethylaminophenazthioniumsalz (Azur D oder Azur 1 und Methylenblau (Azur 1+ Methylenblau = Azur ID, allenfalls als Eosinat,gelöst in destilliertemWasser, Kochsalzlösungund/oder Methylalkohol und gegebenenfalls Glycerin besteht.
Diese erfindungsgemässe Färbelösung ist nun für das Färben von Zellen verschiedensten Ursprungs
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brauchbar, wie im folgenden für einige mögliche Fälle angegeben wird.
Bei Infektionskrankheiten : Abstriche von Pharyngealexsudaten, Angina, Tonsillitis, Stomatitis, Abszessen Phlegmonen mit pyrogenen Erregern, Karbunkelpusteln, Faeces bei Dysenterie oder andern bakteriellen Enterocolitiden, Liquor cerebrospinalis zur Sichtbarmachung von Bald : erien (und Zellen) bei
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pischen morphologischen Kennzeichen, in Form von Kaffeebohnen. Ferner AbsMche von Vaginalsekret bei Infektion mit Trichomonas vaginalis und assoziierter Flora.
In der Zytologie : Abstriche aus Liquorsediment bei $eitrigen, viralen oder tuberkulösen Meningitiden.
In der Zytologie : Abstriche, sowohl in der tierischen als auch, insbesondere, in der pflanzlichen Zytogenetik, wo Zellkeme und Chromosomen selektiv, dem Zytoplasma gegenüber, eine lila Färbung annehmen. Letzteres erscheint bei tierischen Zellen graurosa und bei Pflanzenzellen blaugrün.
In der Mikrobiologie : Auf diesem Gebiet wurden über 1000 Abstriche von Kulturen aeroberund anaerober, gram-positiver und gram-negativer, sporenbildender und sporenfreier, kapsulârer und kapselfreier Bakterien gefärbt. Gram-positive Bakterien, z. B. Staphylokokken, Streptokokken" Enterokokken, Pneumokokken mit oder ohne Kapsel, B. anthracis, B. dyphtheriae und B. pseudodypitterîae, Tetanus-
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megatherius, sowie auch pathogene und nichtpathogene Leptospira erscheinen in verschiedenen Farbtönen von dunkelviolett bis rot, rosagrau und blaugrün. Auch TuberkelbaziUen komsten, nach Erhitzen des mit Farbstoff bedeckten Abstrichs bis zu Dampfbildung, gefärbt werden. Die Sporen der sporentragenden
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negativ.
Einen Sonderfall bilden Pneumokokken, bei denen sich die Kapseln gelegentlich grunblau fär- ben ; dies ist ein nur bei dieser Bakterienart beobachtetes Merkmal. Bei Dyphtherie- (und dyphterimorphen) Bazillen nehmen die Babes-Emst-Granula, sofern sie existieren, eine vom Bazillenkörper klarun- teischeldbare Färbung an und erscheinen viel dunkler (in Dunkelviolett, im Gegensatz zum hellen Rosaviolett des Bakterienkörpers).
In der Mykologie: Es können verschiedenste Abstriche gefärbt werden, besonders solche, die von pathologischen Aufwürfen oder aus Kulturen von Candida albicans und Aspergillus stammten. Die Pilz-
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grad der Kultur.
Die erfindungsgemässe zytobakteriologische Färbelösung wird gemäss der Erfindung vorzugsweise so hergestellt, dass eine 1 bis 7 Tage stehen gelassene Lösung von Brillantgrün bzw. Malachitgriln in de- stilliertem Wasser (mit oder ohne Zusatz von Phenol) oder in Kochsalzlösung mit einer 1 bis 7 Tage stehen gelassenen Lösung von basischem Fuchsin in Methanol und gegebenenfalls Glycerin vermischt wird, wobei die Lösung des basischen Fuchsins zweckmässig zu der LösungdesBrillantgriinsbzw. Malachitgrüns, u. zw. in solcher Menge zugesetzt wird, dass die Farbe des Gemisches der Lösungen von griin eben nach dunkelblau umschlägt. Beim Vermischen der genannten gealterten Lösungen ergibt sich eine besonders haltbare Färbelösung.
Eine für Färbezwecke besonders geeignete Lösung ergibt sich hiebei beim Zusetzen der Lösung des basischen Fuchsins zur Lösung des Brillantgrüns bzw. Malachitgiaasbis zum Umschlag der Farbe des Gemisches von Grün nach Dunkelblau.
Beispiel 1 : a) 1 g Brillantgrün wird in 100 ml S iger (zwischen 3-9), frisch bereiteter Koch- salzlösung (NaC1 5/1000) (nicht mehr als 24 h alt) gelöst, was eine l igeBrillantgtanlösung ergibt. Nach sorgfältigem Schütteln wird die Lösung 1 bis 7 Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. b) 1 g basisches Fuchsin wird in 20 ml reinem Methylalkohol aufgelöst, wodurch eine 5% ige Losung basischen Fuchsins entsteht, die 3 bis 24 h lang stehen gelassen wird. c) Zu 100 ml der 1%igen Brillantgrünlösung wird mit einer sterilen Pipette (1 bis 2 ml) tropfenweise und unter ständigem Schütteln die basische Fuchsinlösung zugefügt, bis sich der Farbstoff von grün bis dunkelblau verwandelt, zu welchem Zeitpunkt keine weitere Beigabe mehr erfolgt.
Kontrolle des Farbstoffes. Folgende Richtlinien müssen beachtet werden : a) Der Farbstoff soll dunkelblau sein. b) Bei Lichtbrechung soll beim Schütteln auf der Wand des Reagenzglases eine leicht violette Fär- bung auftreten. Dieser Farbton kann, zwecks Genauigkeit, mit einem Kolorimeter überprüft werden. c) Bei Aufbringen eines Tropfens des Farbstoffes auf poröses Papier (z. B. Filter-oder Zeitungspapier) soll eine dunkelblaue zentrale Zone, umgeben von einer grünblauen Zone von zumindest 1 bis 2 mm
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auftreten. d) Man versucht die Färbung eines Abstriches von E. coli aus einer Kultur auf Fleischbrühe (oder einfacher Gelose) im Alter von 24 bis 48 h.
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scheinlich im Zusammenhang mit dem jeweiligen Alter der Bakterien).
Der auf diese Weise zubereitete Farbstoffwird 1 bis 7 Tage stehen gelassen, wobei täglich mehrmals geschüttelt wird. Darauf wird er durch keimfreies Filterpapier filtriertund in eine Tropfflasche mit Schliffverschluss gebrauchsfertig aufbewahrt.
Es wird durchwegs keimfrei gearbeitet. Alle Gefässe, Pipetten und Lösungen müssen vorher sterilisiert sein.
Die Mischung ist monate- oder auch jahrelang verwendbar.
Beis Massnahmen gleichen denen in Beispiel 1. In diesem Fall erscheinen gram-positive Bakterien und Gra- nula der gram-negativen Bakterien in dunklerer Färbung.
Beispiel 3 : Zum gemäss Beispiel 1 erhaltenen Farbstoff können nach genügender Lagerung der
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1In diesem Fall erscheinen die Granulb der Eo$ínphi1en deutlicher und gelegentlich auch gefärbt.
Beispiel 4 : a) Man löst 1 g Brillantgrün in 70 ml frisch zubereitetem neutralem destilliertem Wasser. Nach Schütteln wird die Lösung 24 bis 36 h lang stehen gelassen. b) Man bereitet 30 ml einer Mischung von neutralem Glycerin und Methylalkohol pro analysi (etwa 15 ml). Nach mehrmaligem kräftigem Schütteln wird die Mischung schlierenfrei. Sie wird dann 48 bis 72 h lang stehen gelassen. c) Die Lösungen a) und b) werden unter kräftigem Schütteln homogen gemischtund 48 bis 72 h lang stehen gelassen.
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spiel 1 ausgeführt. Bei Verwendung dieser Lösung erscheint die Zellstruktur viel deutlicher.
Beispiel S : a) Zubereitung einer zien Brtl1antgliinlösung. b) Zubereitung einer l X) igen basischen Fuchsinlösung (mit oder ohne fhenolbeigabe (1 bis 20/0). c) Mischung wie in Beispiel 1. In diesem Fall dauert die Färbung etwas länger, u. zw. 2 bis 5 min.
Beispiel 6 : a) Zubereitung einer 21eigen Brillant- oder alachitgrünlösung. b) Zugabe einer angemessenen Menge 5% figer (oder 7% tiger) basischer Fuchsinlösung.. In diesem Fall ist die Färbedauer sehr kurz, u. zw. 15 bis 30 sec.
Beispiel 7 : a) Zubereitung einer 1 bis 2%igen Brillantgrünlösung in 80 ml Methylalkohol. b) Zugabe von 20 ml neutralem Glycerin. Kräftig schütteln und 48 bis 72 h stehen gelassen. c) Zugabe einer angemessenen Menge 5% iger Fuchsinlösung und 24 bis 72 hstehen gelassen.. Indie- sem Fall wirkt der Farbstoff in zwei Stufen. Die erste fixiert und die zweite färbt nach Verdünnung mit destilliertem Wasser. Diese Mischung kann auch für Blutabstriche verwendet werden.
FÄRBEVERFAHREN
Färben von Sediment von Liquor cerebrospinalia bei eitrigen, viralen oder tuberkulösen Meningitiden.
Sehr dünne Abstriche (einzellige Schicht wie bei Blutabstrichen) auf neuen, ganz sauberen Objektträgern, werden schnell und sorgfältig durch Schütteln an der Luft getrocknet. Die Färbung kann ohne Fixierung erfolgen, oder nach sehr leichter Fixierung über einer Gasflamme oder mit Methyl alkohol während 1 bis 3 min. Die Färbung erfolgt einstufig, indem man die Färbelösung über den Abstrich aufträgt und diesen 30 sec bis 1 oder 2 min lang, je nach Abstrich oder der verwendeten Lösung. mit der Lösung in Berührung lässt. Dann wird leicht und schnell mit Leitungswasser, ohne starken Strahl, nachgespült.
Das Trocknen erfolgt an der Luft durch Schwenken des Objektträgers. Untersuchung im Immersionsobjektiv. Wenn durch das Spülen eine zu starke Entfärbung entstanden ist, kann 30 sec bis zu 1 min lang nachgefärbt werden. Ist hingegen zu starke Färbung entstanden, so kann entweder durch kräftiges Nachspülen mit Wasser, oder noch besser mit Methylalkohol entfärbt werden. Dann kann man, je nach Bedarf, erneut färben. Die Abstriche können lange Zeit unter Deckgläsem mit Zedernöl aufbewahrt werden.
Ergebnisse : Die Zellen erscheinen äusserst deutlich, in selektiver Färbung, mit granulafreiem Zy-
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toplasma, was in diesem Fall einen Vorteil bedeutet, da es dem Auge gestattet, schnell und genau die Gegenwart eventuell vorhandener, noch so spärliche Erreger, zu ermitteln. Das Zytoplasma der neutrophilen Segmentkemigen erscheint blaugrün, ohne Granulation, oder zuweilen mit kaum sichtbaren Granula. Die Zellkeme sind rotviolett gefärbt, sehr deutlich in allen Einzelheiten sichtbar und scharf umrissen (Stiele, Verbindungsstege usw.). Das Zytoplasma der Eosinophilenerscheint mit Granula angefüllt, die vom Farbstoff im Negativ (weiss) ganz leicht umrissen sind und mitunter auch Teile des Zellkernes verdecken. Im Falle von Beispiel 3 können diese Granula eine graublaue Färbung annehmen.
Das Zytoplasma der Monozyten und Lymphozyten erscheint in Rosa oder Graurosa und die Zellkeme in Lilaviolett bis Rot. Das Zytoplasma der Plasmazellen färbt sich rotviolett, mit dunkelvioletten Granulationen von verschiedener Grösse und Form, die das Zytoplasma fast gänzlich ausfüllen, wobei jedoch
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eckigen Granula in verschiedenen Farbtönen, von Violett bis Ziegelrot, oft auch zerstört.
Bakterien sind, sowohl extra- als auch intrazellulär, leicht zu erkennen, dank der oben erwähnten Tatsache, dass das Zytoplasma klar, ohne Granulationen oder Präzipitate, erscheint.
Bemerkung : Wenn die Färbelösung sorgfältig filtriert und der Objektträger sauber und neu ist, treten keine Färbungen auf. In den seltenen Fällen, in denen dies geschieht, sind sie leicht zu erkennen und sollen als solche gedeutet werden.
Bei diesem Verfahren erscheinen die gram-positiven Erreger immer in dunklem Blauviolett und
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oder Blauviolett bisGrunblau. Diese, bei andem Verfahren nicht vorkommenden Farbtöne entsprechen immer den roten bis dunkelvioletten oder rosaroten Schattierungen, die bei mit Gram gefärbten gram-negativen Bakterien auftreten. Gram-negative Bazillen erscheinen häufig bipolär oder mit Granulationen. Erneute Verwendung des Koprozytogramms bei Dysenterie mittels dieses Verfahrens.
Verfahren : Dünne Abstriche werden auf saubere Objektträger mittels eines sterilen Rechenpinsels aufgetragen, indem man Teile von Mucus oder blutigem Mucus aus frischen Faeces Dysenteriekranker auswählt. Bei Kleinkindern kann nötigenfalls mit einem derartigen PinseldaspathologischeMaterial direkt aus dem Rectum genommen werden. Der Abstrich wird über einer Flamme leicht fixiert und 1 bis 2 min (je nach der verwendeten Färbelösung) gefärbt. Nach raschem Spülenmit LeitungswasserundTrok- nen, wird das Präparat unter dem Immersionsobjektiv untersucht.
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obachtungen gemacht : Bazillen grossen, mittleren oder kleinen Umfangs, darunter viele deutlich bipolär, mit dunkelvioletten Granulationen an den Extremitäten und blasser gefärbtem, rosarotem Körper.
Meist extrazellulär, doch auch intrazellulär, in Makrophagen und Segmentkemigen zu finden. Die Bazillen treten immer beinahe in Reinkultur auf (wenn Entnahme und Abstrichregelrechtdurchgeführtwur- den). Mitunter erscheinen die Bazillen grünblau, grün oder grau gefärbt. Die Zellen sind meist intaKte oder zerfallende Segmentkemige. deren Zytoplasma gninblau und Zellkem lila oder violett gefärbt ist, oder Makrophagen - grosse Mononukleäre - mit rosa oder grau-blaBrosa Zytoplasma, in dessen Innerem sich oft phagozytierte Erreger befinden. Ihr Zytoplasma ist violett oder dunkelrot gefärbt.
Bei akuten Enterocolitiden andem bakteriellen Ursprungs ist eine polymorphe Bakterienflora zu beobachten, beste- hend aus dunkelblau-violetten Kokken (d. h. gram-positiv) und rotvioletten oder grünblaue Bazillen (d. h. gram-negativ). Pilze färben sich dunkelblau bis schwarz und ihre Myzelien violett oder rosarot.
Zellen fehlen fast vollständig. Färbung von Vaginalabstrichen zur Auffindung von Trichomonas veginalis, Candida albicans u. a. Krankheitserregern.
Verfahren : Aus dem Vaginalsekret werden dünne Abstriche hergestellt, die schnell an der Luft getrocknet werden. Man kann die Färbung entweder gleich, oder nach längerer Aufbewahrungszeit (von mehreren Stunden bis Tagen oder Monaten) vornehmen, doch sollen die Abstriche vor Staub geschützt werden. Die auf diese Weise gewonnenen Abstriche werden leicht über einer Gasflamme oder in Methylalkohol (3 min lang) fixiert ; Fixierung ist nicht unbedingt notwendig, da das Ergebnis auch ohne Fixierung das gleiche ist. Die Färbung dauert 4 bis 8 min. Danach wird, ohne starken Strahl, mit Leitungswasser nachgespült und mit Ölimmersion untersucht.
Ergebnisse : Vagina-Epithelzellen erscheinen in verschiedenen Farbtönen von Rosa bis Dunkelblau (wahrscheinlich im Zusammenhang mit dem östrogenen Zyklus). Segmentkemige Leukozyten erscheinen mit violettem Zellkem und blaugrünem Zytoplasma. Pilze erscheinen scharfumrissen, in Dunkelviolett, Blau oder Schwarz und Bakterien in verschiedenen Tönen von Violett und Rosa. manche davon mit Granulationen. Trichomonas vaginalis ist von der Grösse der Leukozyten, etwas kleiner oder grösser als diese, polymorph, oft birnenförmig oder rund, in blauvioletter Färbung, mit Vaknolen im Zytoplasma und
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dunkelviolettem Zellkern.
Die Flagellen, einzeln oder in Bündeln, dem Parasiten anhaftend oder in einiger Entfernung von seinem Korper gelegen, erscheinen in Grau oder Graurosa (Blassviolett) und sind von den sie umgebenden Zellen leicht unterscheidbar.
Färbung von Pflanzenzellen.
Verfahren : Man nimmt entsprechend präparierte Wurzelfaserchen von verschiedenen Pflanzenkeimen (Weizen, Zwiebeln, Lilien usw. ) die 5 bis 15 min lang bei 600C in n-HC1 hydrolysiert werden.
Nach Abkühlen werden eine oder zwei dieser Fasem in ein kleines Reagenzglas oder Fläschchen getan, dem 3 bis 4 ml der Färbelösung beigefügt werden. Man lässt die Fasem 3 bis 10 min in der Färbelösung, je nach der Art der Pflanze und der Konzentration der Lösung. Die Fasem werden dann auf einem sauberen Objektträger ausgebreitet, nachdem die meristematische Vegetationsspitze abgeschnitten wurde.
Nur diese wird zur Färbung verwendet. Man bedeckt sie mit einem Tropfen destillierten Wassers und trok- knet leicht mit Filterpapier nach. Dann wird ein Deckgläschen darübergelegt. Über das Deckgläschen wird mit einem Streichholz leicht aber beständig so lange gedrückt, bis sich das Präparat in einer einzelligen Schicht ausgebreitet hat. Mit Objektiv 30 oder 60 untersuchen.
Bemerkung : Die Färbung kann auch direkt auf dem Objektträger erfolgen, indem 2 bis 3 Tropfen der Färbelösung über das hydrolysierte Präparat geschüttet werden und die nötige Färbungszeit abgewartet wird.
Ergebnisse : Zellkerne und Chromosomen erscheinen in Rotviolett und das Zytoplasma in Grün oder Blaugrün.
Aus den obenstehenden Angaben geht hervor, dass die Erfindung folgende Vorteile bietet :
1. Ein einfach zu bereitender Farbstoff.
2. Einfache Färbemethode.
3. Selektives zytobakteriologisches Verfahren.
4. Einfaches und schnelles Orientiemngsverfahren für Routinediagnosen.
5. Das Verfahren hat einen weiten Anwendungsbereich (ist allgemein verwendbar), da es sowohl tierische als auch pflanzliche Zellen, wie z. B. Bakterien, Pilze, Parasiten z. B. Trichomonas vaginalis und eventuell Malariaerreger, selektiv färbt. Bei letzteren wurden nur wenige Versuche ausgeführt und diese nur bei Mäusemalaria, (da Sumpffieber hierzulande ausgerottet wurde), sowie auch dadurch, dass Zellkeme und Chromosomen deutlich und selektiv vom Zytoplasma der tierischen und besonders der pflanzlichen Zellen abstechen.
PA TENT ANSPRÜCHE :
1. Zytobakteriologische Färbelösung für das selektive Färben von pflanzlichen und tierischen Zel-
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bzw. Malachitgrün und zu 0,0335 bis 8% aus basischem Fuchsin, sowie gegebenenfalls bis zu 5, 0% aus 2-Methylamino-7-dimethylamino-phenazthioniumsalz (Azur 1) oder Azur I und Methylenblau (Azur 1+ Methylenblau = Azur 11), allenfalls als Eosinat, gelöst in destilliertem Wasser, Kochsalzlösung und/oder Methylalkohol und gegebenenfalls Glycerin, besteht.
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