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Farbstoff und Färbeverfahren für zytobakteriologische Diagnosestellung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Farbstoff und ein zytobakteriologisches
Färbeverfahren für Ausstriche von Zellen und von Krankheitserregern sowie auch von
Pflanzenzellen.
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Zur morphologischen Untersuchung werden bekanntlich seit Ende vorigen
Jahrhunderts zahlreiche Färbemethoden verwendet. Zur bakterioskopischen Prüfung
verwendet man zum Beispiel das Gram-Verfahren oder die Methylenblaufärbung, u.a.für
zytoskopische Untersuchungen das Giemsa- oder Fieldverfahren usw.
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In der Zytogenetik kommen Feulgen-, Giemsa- und andere Verfahren zur
Verwendung.
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Im allgemeinen wird für jeden diagnotischen Zweck eine Methode angewandt,
die meist aus mehreren Verfahrensschritten besteht und bei der mehrere Farbstoffe
zur Verwendung kommen, was einen @achteil bedeutet.
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Infolgedessen ist in der täglichen Praxis eines klinischein Laboratoriums
ein zytobakteriologisches Ferbeverfahren notwendig, das zugleich selektiv, aufschlußreioh,
einfach und schnell ist und das einen möglichst weiten Anwsendungsbereich bietet.
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Die Erfindung wird diesen Bedingungen weitgehend gerecht.
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Dabei handelt es sich un ein Verfahren fUr selektive zytobakteriologische
Färbung, und zwar sowohl Ur (tierische und pflanzliche) Zellen als auch für Bakterien.
Erfindungsgemäß wird als Farbstoff eine Mischung von zwei basischen Farbstoffen
verwendet, und zwar: von Brillantgrün (oder Malachitgrün) und von basischem Fuchsin.
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Diese Stoffe werden in Lösungen von verschiedener passender Konzentration
angewandt, und zwar C,3% bis 7% Brillant-bzw. Malachitgrün und 0,2% bis 8% basisches
Fuchsin, dem nach Wunsch Azur I oder bzw. und Azur II (mit oder ohne Eosin) beigefügt
werden kann, in G bis 3 -rozentiger Lösung in reinem (neutralen oder 1-2% phenolhaltigen)
destilliertem Wasser, mit 3 °/oo bis 9 °/oo Kochsalzlösung, Methylalkohol pro analysi
und anhydrischem neutralem Glyzerin pro analyai.
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Mit diesen Färbelösungen wurden Ausstriche von Kulturen oder verschiedene
pathologische Produkte mit Bakterien und Zellen verschiedenen Ureprungs gefärbt.
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Beispiele: Bei I n f e Ic t i o n 5 k r a n k h e i t e n wurden Ausstriche
von: Pharyngealexsudaten, Angina, Tonsillitis, Stomatitis, Abszessen und Phlegmonen
mit pyogenen Erregern, Karbunkelpusteln, Faeces bei Dysenterie oder anderen bakteriellen
Enterocolitiden, Liquor cerebrospinalis zur Sichtbarmachung von Bakterien (und Zellen)
bei eitrigen Leningitiden, von Harnsediment, Pleuraflüßsißkeit usw. gefärbt.
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Bei G e 5 c h 1 ec h t s k r a n k h e i t e n wurden kusstriche von
Urethralsekret bei Gonokokkeninfektion gefärbt. Bei dieser Färbung erecheinen Gonokokken
blauviolett - rötlichgrau - grunblau gefärbt, intra- oder eitrazellulär, mit typischen
morphologischen Kennzeichen, in der Form von Kaffebohnen. Ferner wurden Ausstriche
von Vaginalsekret bei Infektion mit Trichomonas vaginalis und assoziierter Flora
(Beispiel Nr. 3, siehe Färbeverfahren) gefärbt.
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In der Z y t o 1 o g i e wurden Ausstriche aus Liquorsediment bei
eitrigen, viralen oder tuberkulösen Beningitiden (Beispiel Nr. 1, siehe Barbeverfahren)
gefärbt.
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In der Z y t o g e n e t i k wurden Ausstriche sowohl
in
der tierischen als auch insbesondere in der pflanzlichen Zytogenetik gefärbt, wobei
Zellkern und Chromosome selektiv, dem Zytoplasma gegenüber, eine lila Färbung annehmen.
Letzteres erscheint bei tierischen Zellen graurosa und bei Pflanzenzellen blaugrün.
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In der M i k r o b i o 1 o g i e wurden über tausend Ausstriche von
Kulturen aerober und anaerober, grampositiver und gram-negativer, sporenbildender
und sporenfreier, kapsulärer und kapselfreier Bakterien gefärbt.
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Dabei erscheinen gram-positive Bakterien etandig und ausnahmElos in
violetter bis dunkelblauer Färbung.
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Beispiele: Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken, Pneumokokken
mit oder ohne Kapsel, b. anthracis, b. dyphteriae und b. pseudodyphteriae, Tetanusbazillen,
b. histolyticus, perfringens, V. septique, b. oedenatiens etc.
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Gram-negative Erreger erscheinen dabei in verchiedenen Farbtönen von
dunkelviolett bis rot, rosagrau und blaugrün.
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Beispiele: Meningokokken, Gonokokken, b.microcatarrhalis, b. pertuesie,
b. typhi und andere Salmonellen, b. dysenteriae, b. Ooereus, b. megatherius, sowie
auch pathogene und nichtpathogene Leptospiren wurden gefärbt. Auch Tuberkelbacillen
konnten gefärbt werden, nachdem der lait Parbstoff
bedeckte Ausstrich
bis zur Iampfbildung erhitzt war. Die Sporen der sporentragenden Bazillen hoben
sich negativ (d.h. weiß) ab. Auch Bakterienkapseln erschienen negativ bei kapsulären
Bazillen. Einen Sonderfall bilden Pneumokokken: Bei ihnen färben sich die Kapseln
@ gelegentlich grünblau. Dies ist aX nur bei dieser Bakterienart beobachtetes Merkmal.
Bei Dyphterie- (und dyphterimorphen) Bazillen nehmen die Babes-Ernst Granula, sofern
sie existieren, eine vom Bazillenkörper klar unterscheidbare Färbung an und erscheinen
viel dunkler, nämlich dunkelviolett im Gegensatz zum hellen Rosaviolett des Bakterienkörpers.
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In der M y k o l o g i e wurden verschiedene Ausstriche gefärbt, besonders
solche, die von pathologischen Auswürfen oder aus Kulturen von Candida albicanus
und Aspergillus stammten. Die Pilzkörper färbten sich dunkelblau bis schwarz und
die 0tzelien rosaviolett, je nach dem Alter und dem Entwicklungsgrad der Kultur.
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Zubereitung des Farbstoffes Beispiel 1 (a) 1 g Brillantgrün wird in
100 ml 5 °/ooiger Kochsalzlösung (NaCl 5/1000), die frisch zubereitet ist (nicht
über 24 Stunden alt), gelöst. Das ergibt eine 1%ige Brillantgrünlösung. Nach sorgfältigem
Schütteln läßt man die Lösung 1 bis 7 Tage bei Zimmertemperatur reifen.
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(b) 1 g basisches Fuchs in wird in 20 ml reinem Methylalkohol aufgelöst;
dadurch entsteht eine 5%ige Lösung
basischen Fuchsins, die man 3
bis 24 Stunden lang reifen läßt.
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(c) Zu 100 ml der 1%igen Brillantgrünlösung wird tropfenweise mit
einer eterilen Pipette (von 1-2 ml) die basische Fuchsinlösung zugefügt, unter ständigem
Schütteln, bis sich der Farbstoff von grün in dunkelblau verwandelt; das bezeichnet
den Zeitpunkt, zu dem eine weitere Zugabe aufhört.
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Kontrolle des Farbstoffes: Folgende Richtlinien müssen beachtet werden:
(a) der Farbstoff soll dunkelblau sein.
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(b) Bei Lichtbrechung soll beim Schütteln auf der Wand des Reagenzglases
eine leicht violette Färbung auftreten. Dieser Farbton kann, zwecks Erhöhung der
Genauigkeit, mit einem Kolorimeter überprüft werden.
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(c) Beim Auflegen eines Tropfens des Farbstoffes auf poröses (z¢B.
Filter- oder Zeitungspapier) soll eine dunkelblaue zentrale Zone auftreten, die
von einer grünblauen Zone von zumindest 1 - 2 mm umgeben ist.
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(d) Man versucht die Färbung eines Ausstriche von E.coli aus einer
Kultur auf Fleischbrühe (oder einfacher Gelose) im Alter von 24 bis 48 Stunden.
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Zumindest ein Teil der Bazillen (oft die Mehrzahl) erscheint -dann
blaugrün gefärbt, während die übrigen die oben erwähnten Schattierungen annehmen,
nämlich von dunkelviolett bis rot, rosa und grau (wahrscheinlich im Zusammenhang
mit dem jeweiligen Alter der Bakterien).
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lien auf diese Weise zubereiteten Farbstoff lässt man 1 bis 7 Tage
lang reifen. Dabei wird er täglich mehrmals geschüttelt. Daraufhin wird er durch
keimfreies Filterpapier filtriert und in einer Tropfflasche mit Rauhglasverschluß
gebrauchsfertig aufbewahrt.
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Es wird durchwegs keimfrei gearbeitet: alle Gefäße, Pipetten und Lösungen
müssen vorher sterilisiert sein.
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Die mischung ist monate- oder auch jahrelang verwendbar.
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beispiel 2 Statt Briliantgrün kann man eine 1%ige Malachitgrünlösung
verwenden. Die übrigen Verfahrensschritte gleichen denen in Beispiel Nr. 1. In diesem
Fall erscheinen grampositive Sakterien und Granula der gram-negativen Bakterien
in dunklerer Färbung.
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3eispiel 3 Bei dem in Beispiel Nr. 1 angegebenen Verfahren kann, nach
Reifung der Brillantgrünlösung mit basischem Fuchsin noch 0,1 bis 0,3 g Azur II
und bzw. oder Azur I hinzugefügt werden. In diesem Eall erscheinen die Granula der
Eosinophilen deutlicher und gelegentlich auch gefärbt.
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Beispiel 4 (a) Man löst 1 g Brillantgrün in 70 ml Aqua destillata,
neutral,
frisch zubereitet, auf. Nach Schütteln läßt man die Lösung 24 bis 36 Stunden lang
reifen.
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(b) Man bereitet 30 ml einer Mischung von neutralem Glyzerin und Methylalkohol
pro analysi (aa 15 ml). Nach vielfachem kräftigen Schutteln wird die mischung einförmig
klar, was bei gebrochenem Licht festgestellt werden kann. Man lässt sie dann 48
bis 72 Stunden lang reifen.
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(c) Lösungen (a) und (b) werden, unter kräftigem Schütteln, zwecks
Homogenisierung, gemischt und man lässt sie 48 bis 72 Stunaen lang reifen.
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(d) Der Mischung: Brillantgrün, Aqua destillata, Methylalkohol und
Glyzerin (wie unter Cc)) wird, wie in Beispiel. Nr. 1, tropfenweise 5%ige basische
Fuchsinlösung (meist 0,3 bis 0,6 ml) zugefügt, bis die Farbe dunkelblau wird. Dies
geschieht unter ständigem Schütteln.
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Die Kontrolle wird wie in Beispiel Nr. 1 ausgeführt. Bei Verwendung
dieser Lösung erscheint die Zeilstruktur viel deutlicher.
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Beispiel 5 (a) Zubereitung einer 5%igen Brillantgrünlösung.
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(b) Zubereitung einer 1%igen basischen Fuchsinlösung (mit oder ohne
Phenolbeigabe).
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(c) Mischung wie in Beispiel Nr. 1. In diesem Fall dauert die Färbung
etwas länger@ 2 bis 5 Minuten.
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Beispiel 6 (a) Zubereitung einer 2%igen Brillant- oder Malachitgrünlösung.
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(b) Zufügung einer angemessenen Menge von 5%iger (oder 7%iger) basischer
Fuchsinlösung. In diesem Fall ist die Färbewirkung sehr rasch: 15 bis 90 Sekunden.
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Beispiel 7 (a) Zubereitung einer 1 bis 2%igen Brillantgrünlösung
in 80 ml Methylalkohol.
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(b) Beifügung von 20 ml neutralem Glyzerin. kräftig schütteln und
48 bis 72 Stunden reifen lassen.
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(c) Beifügung einer angemessenen Menge 5%iger Fuchsinlösung. Reifen
lassen: 24 bis 72 Stunden. In diesem Ball wirkt der Farbstoff in zwei Phasen. Die
erste fixiert und die zweite färbt nach Verdünnung mit destilliertem Wasser. Diese
Formel kann auch für Blutausstriche verwendet werden.
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F ä r b e v e r f a Ii r e n : Beispiele : 1. S e d i m e n t v o
n L i q u o r c e r e b r o s p n a 1 i a bei eitrigen, viralen oder tuberkulösen
Meningitiden.
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,Sehr dünne Ausstriche (einzellige Schicht, wie bei Blutausstri¢hen)
auf neuen, ganz sauberen Objekträgern, werden schnell und sorgfältig durch Schütteln
an der Luft getrocknet.
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Die Färbung kann ohne Fixierung erfolgen oder nach einersehr leichten
Fixierung über der Gasflamme oder mit Methylalkohol während 1 bis 3 minuten. Die
Färbung zeschieht in einer einzigen Phase, indem man die Parbelosung über den Ausstrich
aufträgt und diesen 30 Sekunden bis 1 oder 2 Minuten lang, je nach dem Fall oder
der verwendeten Lösung,mit ihr in Berührung lässt. Dann wird leicht und schnell
mit Leitungswasser, ohne starken Strahl, nachgespült. Trocknen an der Luft durch
Schütteln des Objektträgers. Untersuchung im Immersionsobjektiv.
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Wenn durch das Spülen eine zu starke Entfärbung entstanden ist, kann
30 Sekunden, bis zu einer Minute lang nachgefdrbt werden. Ist hingegen eine zu starke
Färbung entstanden, so kann entweder durch kräftiges Nachspülen nit Wasser oder
noch besser mit Methylalkohol entfärbt werden. Dann kann man je nach Bedarf erneut
iärben. i;ie Ausstriche können lange Zeit unter Deckgläsern mit Zedernöl aufbewahrt
werden.
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Ergebnisse: Die Zellen erscheinen äusserst deutlich, in selektiver
Färbung, mit granulafreiem Zytoplasma. Das bedeutet in diesem Fall einen Vorteil,
der es dem Auge gestattet, schnell und genau die Gegenwart eventuell vorhandener,
noch so spärlich auftretender Erreger zu ermitteln. Das Zytoplasma der neutrophilen
Segmentkerningen erscheint blaugrün, ohne Granulation, oder zuweilen mit kaum sichtbaren
Granula. Die Zellkerne sind rotviolett gefärbt, sehr deutlich in allen Einzelheiten
sichtbar und scharf umrissen (Stiele, Verbindungsstege usw). Das Zytoplasma der
Eesinophilen erscheint mit Granula angefüllt, die vorn Farbstoff im Negativ (weiß)
ganz leicht umrissen sind, und die mitunter auch Teile des Zellkerns verdecken.
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In Fall des Beispiels Ifr. 3 können diese Granula- eine graublaue
Färbung annehmen.
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Das Zytoplasma der Monozyten und Lymphozyten erscheint in rosa oder
graurosa und die Zellkerne in lilaviolett bis rot. Des Zytoplasma der Plasmazellen
färbt sich rotviolett mit dunkelvioletten Granulationen von verschiedener Größe
und Form, die das Zytoplssms fast gänzlich ausfüllen, wobei jedoch ständig ein klarer
perinuklearer Raum freibleibt. Mastzellen erscheinen mit großen, runden, ovalen
oder eckigen Granulis in verschiedenen Farbtönen, von violett bis tiegelrot, oft
auch zerstört.
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Bakterien sind sowohl extra- als auch intrazellulär leicht zu erkennen,
dank der oben erwahnten Tatsache, daß das Zytoplasma klar, ohne Granulationen oder
Präzipitate, erscheint.
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Bemerkung: Wenn die Färbelösung sorgfältig filtriert und der Ob jektträger
sauber und neu ist, treten keine Präzipitate auf. In den seltenen Fällen, in denen
dies geschieht, sind sie leicht zu erkennen und sollen als solche gedeutet werden.
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Bei diesem Verfahren erscheinen die gram-positiven reger immer in
dunklem blauviolett und gram-negative Erreger in verschiedenen Farbtönen, von dunkelviolett'
oder blauviolett bis rosarot, grau, grünblau. DieEe, bei anderen Verfahren nicht
vorkommenden Farbtöne entsprechen immer den roten bis dunkelvioletten oder rosaroten
Schattierungen
die bei mit Gram gefärbten gram-negativen Bakterien auftreten. Gram-negative Bazillen
erscheinen häufig bipolar oder mit Granulationen.
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2. Erneute Verwendung des Koprozytogramms bei Dysenterie mittels dieses
Verfahrens.
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Verfahren: Dänne Ausstriche werden auf saubere Objektträger mittels
eines sterilen Rachenpinsels aufgetragen, indem man Teile von Mucus oder blutigem
Mucus aus frischen Faeces Dysenteriekranker auswählt. Bei Kleinkindern kann nötigenfalls,
mit einem derartigen Pinsel, das pathologische Material direkt aus dem Rektum genommen
werden. Der Ausstrich wird über einer Flamme leicht fixiert und 1 bis 2 Minuten
(je nach der verwendeten Färbelösung) gefäfbt. nach raschem Spülen mit Leitungswasser
und Trockern wird das Präparat unter dem Immersionsobjektiv untersucht.
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Ergebnisse: Bei typischer, späterhin durch Koprokultur bestätigter+
Dysenterie wurden folgende Beobachtungen gemacht: Bazillen großen, mittleren oder
kleinen Umfangs, darunter viele deutlich bipolar, mit dunkelvioletten Granulationen
an den Extremitäten und blasser gefärbtem rosa rotem Körper. Keist extrazellular,
doch auch intrazellulalar, in Makrophagen und Segmentkernigen zu finden. Die Bazillen
treten immer beinahe in Reinkultur auf (wenn Entnahme und Ausstrich regelrecht durchgeführt
wurden).
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Mitunter erscheinen die Bazillen grünblau, grün oder
grau
gefärbt. Die Zellen sind meist intakte oder zerfallende Segmentkernige, deren Zytoplasma
grünblau und Zellen lila oder violett gefärbt ist, oder Makrophagen - große Mononukleare
- mit rosa oder grau-blaßrosa Zytoplasma, in dessen Innerem sich oft phagozytierte
Erreger befinden. Ihr Zytoplasma ist violett oder dunkelrot gefärbt. Bei akuten
Enterocolitiden anderen bakteriellen Ursprungs ist eine polymorphe Bakterienflora
zu beobachten, bestehend aus dunkelblau-violetten Kokken (d.h. gram-negativ). Pilze
färben sich dunlçelblau bis schwarz und ihre Myzelien violett oder rosarot. Zellen
fehlen fast vollständig.
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3. Färbung von Vaginalausstrichen zur Auffindung von Trichomonas vaginalis,
Candida albicans und anderen krankheits erregern.
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Verfahren: Aus dem Vaginalsekret werden dünne Ausstriche hergestellt,
die schnell an der Luft getrocknet werden. Man kann die Färbung entweder gleich
oder nach längerer Aufbewahrungszeit (von mehreren Stunden bis Tragen oder Monaten)
vornehmen, doch sollen die Ausstriche vor Staub geschützt werden. Die auf diese
Weise gewonnenen Ausstriche werden leicht über einer Gasflamme oder in Methylalkohol
(3 Minuten lang) fixiert; Fixierung ist nicht unbedingt notwendig, da das Ergebnis
auch ohne diese das gleiche ist. Die Färbung dauert 4 bis 8-Xinuten. Danach wird
mit Leitungswasser, ohne starken Strahl, nachgespült und mit Ölimmersion untersucht.
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Ergebnisse: Vagina-Epithelzellen erscheinen in verschiedenen Farbtönen,
von
rosa bis dunkelblau (wahrscheinlich im Zusammenhang mit dem östrogenen Zyklus),
segmentkernige Luekozyten erscheinen mit violettem Zellkern und blaugrünem Zytoplasma.
Pilze erscheinen sciiarf umrissen, iii dunkelviolett, blau oder schwarz und Bakterien
in verschiedenen Tönen von violett und rosa, manche davon mit Granulationen. Trichomonas
vaginalis ist von der Größe der Leukozyten, etwas kleiner oder größer als diese,
polymorph, oft birnenförmig oder rund, in blauvioletter Färbung, mit Vakuolen im
Zytoplasma und dunkelviolettem Zellen. Die Flagellen, einzeln oger in Bündeln, dem
Parasiten anhaftend oder in einiger Entfernung von seinem Körper gelegen, erscheinen
in grau oder graurosa (blaßviolett) und sind von den sie emgebenden Zellenleicht
unterscheidbar.
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4. Färbung von Pflanzenzellen.
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Verfahren: Man nimmt entsprechend präparierte Wurzelfaserchen von
verschiedenen Pflanzenkeimen (Weizen, Zwiebeln, Lilien usw), die 5 bis 15 minuten
lang bei 60°G in HCl N hydrolysiert werden. Nach Abkühlen werden ein oder zwei dieser
Fasern in ein kleines Reagenzglas oder Fläschchen getan, dem 3 bis 4 ml der Färbelösung
zugefügt werden. Man lässt die Fasern w bis 10 Minuten in der Färbelösung, je nach
Art der Pflanze und der Konzentration der Lösung. Sie werden dann auf einem sauberen
Objektträger ausgebreitet, nachdem die meristematische Vegetationsspitze abgeschnitten
wurde. ur diese wird zur Färbung verwendet. Man bedeckt sie mit einem Tropfen destilliertem
Wasser und trocknet leicht mit Filterpapier
nach. Dann wird ein
leckgläschen darüber gelegt. Über das Deckgl@schen wird, mit einem Streichholz leicht
@ber beständig solange gedrückt, bis sich das Präparat in einer einzelligen Schicht
ausgebreitet hat. Mit Objektiv 90 oder 60 untersuchen @emerkung: Die Färbung kann
auch direkt auf dem Objektträger erfolgen., indem bis 3 Tropfen der Färbelösung
über daß hydrolysierte Praparat geschüttet werden und die nötige Färbungszeit abgewartet
wird.
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Ergebnisse: Zellkerne und Chromosome erscheinen in rotviolett und
das Zytoplasma in grün oder blaugrün.
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Wie aus den oben stehenden Angaben hervorgeht, bietet die Erfindung
folgende Vorteile 1. Ein einfach zuzubereitender Farbstoff.
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2. Einfache Färbemethode.
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3. Selektives Zytobakteriologisches Verfahren.
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4. Einfaches und schnelles Orientierungsverfahren für Routinediagnosen.
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5. Das Verfahren hat einen weiten Anwendungs bereich, ist also allgemein
verwendbar, da es sowohl tierische als auch pflanzliche Zellen selektiv färbt, wie
z.3. Bakterien, Pilze, Parasiten (z.B. Trichomonas vaginalis und
eventuell
Malariaerreger; bei letzteren wurden nur wenige @ersuche ausgeführt und diese nur
bei Mäusemalaria da Sumpffieber hierzulande ausgerottet wurde), und da auch Zellkerne
und Chromosomen deutlich und selektiv von Zytoplasma der tierischen und besonders
der pflanzlichen Zellen abstechen.