DE2334061B2

DE2334061B2 - Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von Streptokokken der Gruppe A in Anwesenheit anderer Streptokokken und Staphylokokken in einer Probe unbekannter Zusammensetzung Abbott Laboratories, North Chicago, 111. (V.StA.)

Info

Publication number: DE2334061B2
Application number: DE2334061A
Authority: DE
Inventors: William Franklin Lake Villa Boley; Arthur Atsunobu Waukegan Hirata
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1972-07-05
Filing date: 1973-07-04
Publication date: 1975-01-23
Also published as: DE2334061A1; JPS4943479A; FR2190917B1; GB1420806A; AU470394B2; US3790447A; FR2190917A1; CA996455A; AU5650673A

Description

erhalten. In gleicher Weise wird die positive Vergleichsprobe aus einer NCDC-Kultur von Streptokokken der Gruppe A, die nicht lebensfähig sind und 30 von einem Iyophilisierten Vorrat gewonnen werden,

Eine genaue und rasche Identifizierung <0-hämoly- erhalten. Die drei luftgetrockneten Ausstriche werden tischer Streptokokken der Gruppe A als Ursache gewöhnlich für einige Minuten in einem Puffer, wie einer Nasopharyngitis ist eine wesentliche Voraus- einem Tris-salin-puffer (pH-Wert 7,5), gespült und Setzung für eine erfolgreiche Behandlung und gege- dann entfeuchtet, gewöhnlich mit einem Filterpapier, benenfalls Verhütung möglicher Folgen dieser Infek- 35 Natürlich können auch alle drei Ausstriche auf getion, d. h. von Scharlach, rheumatischem Fiieber oder trennten Bereichen eines einzigen Objektträgers ge-Glomerulonephritis. macht werden.

Zur Identifizierung von Streptokokken der Gruppe A Ein Tropfen des wie obenbeschrieben hergestellten,

Sind eine Anzahl Verfahren bekannt. Eines dieser an eine Peroxydase gebundenen Antikörpers der Verfahren bedient sich fluoreszierender Antikörper 40 Gruppe A wird auf jeden trockenen Ausstrich aufgefcur spezifischen Identifizierung infektiöser Organismen. bracht, und die Ausstriche werden dann inkubiert. Dieses Laboratoriumsverfahren erfordert aber die Die Inkubation kann beispielsweise in einer feuchten Verwendung eines aufwendigen Fluoreszenzmikro- Kammer 20 Minuten bei Raumtemperatur erfolgen, tkops. Nach einem anderen Verfahren wird eine Die Objektträger werden dann erneut mit Puffer-Eakterienkultur gezüchtet Die positive Identifizierung 45 lösung gespült und entfeuchtet. Die Eintauchzeit der von Streptokokken der Gruppe A erfordert jedoch Objektträger in die Pufferlösung kann beispielsweise 48 Stunden, was für Diagnose und Behandlung eine etwa 5 Minuten betragen.

Unerwünschte Verzögerung bedeutet. Dann wird den Objektträgern ein Elektronen-

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur donatorfarbstoff zugesetzt. Ein gut geeigneter Farbstoff Feststellung der Anwesenheit von Streptokokken der 50 ist j-Amino-9-äthylcarbazol. Andere geeignete Farb-Gruppe A in Anwesenheit anderer Streptokokken und stoffe sind 3,3' Diaminobenzidin, p-Chloranilin und Staphylokokken in einer Probe unbekannter Zu- ein Gemisch von Λ-Naphthol und p-Phenylendiaminlammensetzung unter Verwendung wenigstens eines zu dihydrochlorid. Zusammen mit dem Farbstoff wird Untersuchenden Ausstrichs, einer positiven, nur aus Wasserstoffperoxid zugesetzt.

Streptokokken der Gruppe A bestehenden und einer 55 Beispielsweise werden jedem Ausstrich zwei Tropfen •egativen Vergleichsprobe auf Objektträgern, ebenfalls 0,l°/₀iges 3-Amino-9-äthylcarbazol in einem Puffer, in Form von Ausstrichen, und von Antikörpern und der 0,3% Wasserstoffperoxid enthält, zugesetzt. Nach »ergleichender Untersuchung der wenigstens drei einer geeigneten Wartezeit, beispielsweise 15 Minuten, Brdben unter dem Mikroskop, das dadurch gekenn· werden die Objektträger erneut mit Leitungswasser zeichnet ist, daß man jedem der wenigstens drei 6o gewaschen, und jeder wird unter dem Mikroskop Ausstriche, von denen die negative Vergleichsprobe untersucht. Die Streptokokkenflecken erscheinen leuchaus Streptokokken der Gruppe G und Staphylococcus tend rot gefärbt.

aureus besteht, Antikörper van Streptokokkus der Vermutlich wird bei dem erfindungsgemißen VerGruppe A, die an eiitie Peroxydase gebunden sind, fahren das Wasserstoffperoxid von dem Peroxydase' zusetzt, die so behandelten Ausstriebs inkubiert, 6$ enzym abgebaut. Das Wassersloffperoxidabbauprodann Wasserstoffperoxid und einen Elektroneiidöflator- dukt verursacht seinerseits, daß der Farbstoff seine farbstoff zusetzt und die so behandelten Ausstriche Farbe entwickelt, und dieses gefärbte Material wird an unter dem Mikroskop untersucht, die Streptokokken gebunden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfin- werden die Objektträger auf die Anwesenheit einer

dung· Färbung geprüft. Von nun an können die Objekt-

Beispiel 1 träger einige Monate in einem Objektträgerkasten bei

H*r«ti.ii!ino ι,ηΛ Piviernn« «_Λ- rw„ v™ Raumtemperatur aufbewahrt werden, ohne daß es

Herstellungund^erung^onOrgarusmen , _cjner ^_{erkljcben AbwUjjne der Färbeimen8itat}

xommt.

Ein Tupfer mit einem Racbenschleimhautabstrich Die Objektträger werden unter einem Lichtmikrowird etwa 30 Sekunden kräftig in 0,5 ml Kochsalz- skop mit einem Objektiv mit 40facher und Okularen lösung in einem Kahn-Glas oder einem ähnlichen mit 12,5facher Vergrößerung (Gesamtvergrößerung Glas gespült. Die Kochsalzlösung wird aus dem Tupfer ίο SOOfacb) untersucht. Die verhältnismäßig geringe herausgepreßt. Gewünschtenfalls kann der gleiche Vergrößerung ermöglicht die Untersuchung eines Abstriebtupfer zum Beimpfen einer Blutagarplatte für größeren Bereichs beim Abtasten des Kreises von die Isolierung von (9-häraolytischen Streptokokken 1 cm Durchmesser auf dem Objektträger. Wenn bei verwendet werden. Unmittelbar danach wird eine diesem Verfahren andere Objektive und/oder andere wegwerfbare Pasteur-Pipette verwendet, um einen 15 Vergrößerungsbereicbe angewandt werden, so sind Tropfen (etwa 25 μΐ) der Bakterien-Suspension in der die angegebenen Erkennungsgrenzen nicht mehr Kochsalzlösung auf den hierfür bestimmten Bereich direkt anwendbar.

eines Objektträgers aufzubringen. Proben (0,01 ml, Die positive Vergleichsprobe (Streptokokken der

0,0001 ml) der gleichen Bakterien-Suspension in Gruppe A) unterscheidet sich von der negativen Kochsalzlösung können mittels einer kalibrierten öse ao Vergleichsprobe (Streptokokken der Gruppe G und auf Blutagarplatten aufgebracht werden, um die Koch- Staphylococcus aureus) durch eine learhtmd rete Salzlösung zu titrieren. Dann wird der Testbereich auf Farbe. Streptokokken der Gruppe A, die direkt von dem Objektträger an Luft trocknen gelassen. Die dem Rachenabstrich erhalten sind, sind mit der Ausstriche werden fixiert, indem man sie 5 Minuten gleichen Intensität gefärbt und besitzen die gleiche in absolutes Methanol taucht und abtropfen läßt, as Einzelzellmorphologie wie die positive Vergleichs-

probe. Die Prüfung richtet sich hauptsächlich auf die

Einfärben unter Verwendung Farbintensität und Ausmaß gefärbter Organismen,

von an Enzym gebundenen Antikörper

Streptokokkus-Antikörper werden an Meerrettich- Beispiel 2
peroxydase gebunden. Jedem trockenen Ausstrich 30 Man gibt einen Tupfer mit einem Rachenschleimwerden mittels einer Pasteur-Pipette zwei Tropfen hautabstrich in 1 ml Todd-Hewitt-Brühe und inkubiert (etwa 50 μΐ) des gebundenen Antikörpers zugesetzt. 2 bis 5 Stunden bei 37° C. Dann wird die Brühe Das Reagens wir^ unter Verwendung getrennter 5 Minuten mit etwa 2000 Upm zentrifugiert, um die Spatel oder Zahnstocher sorgfältig über jeden Test- Organismen abzutrennen. Die überstehende Flüssigbereich verteilt. Der Ausstreichstab kann horizontal 35 keit wird dekantiert, und die Zellen werden erneut gehalten werden, so daß er am Meni kus der Flüssig- in 1 ml Kochsalzlösung suspendiert und zentrifugiert, keit angreift und damit das Abkratzen von Zellen von Die Kochsalzlösung wird dekantiert, und das Rohr dem Objektträger vermieden wird. wird 2 bis 3 Minuten in einem Ständer stehen gelassen,

Der Objektträger wird etwa 20 Minuten in einer damit die Organismen sich am Boden des Rohrs

feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert, 40 sammeln können. Die Organismen werden gründlich

wofür beispielsweise ein Objektträgerkasten oder eine mit der restlichen Kochsalzlösung vermischt. Unter

umgekehrte Petrischale verwendet werden kann, Verwendung einer Pasteur-Pipette wird ein Teil des

wobei die so gebildete Kammer nasse Papiertücher gewaschenen Sediments entnommen und auf den

enthält oder damit umwickelt ist. Dann wird der vorbestimmten Bereich eines Objektträgers aufgebracht.

Objektträger mit 10 ml Tris-salin-puffer, die man aus 45 Dann läßt man die Testbereiche an der Luft trock-

einer Pipette auftropfen läßt, gespült und darauf nen. Der Objektträger wird 5 Minuten in absolutem

gewaschen, indem man ihn 5 Minuten in einem Tris- Methanol fixiert und durch Abtropfenlassen getrock-

salin-puffer in einer Schale taucht. Der Objektträger net. Dann werden die Ausstriche weiter verarbeitet,

wird getrocknet, indem man ihn um einen Winkel wie wenn die Zellen direkt von dem Abstrich erhalten kippt und ein Stück absorbierendes Papier (Papiertuch) 50 worden wären. Die Vergleichsproben sind die gleichen,

an die Kante des Ausstrichbereichs legt. Es kann auch so verfahren werden, daß man mit

Dann werden jedem Abstrich zwei Tropfen (etwa einer Inokuliernadel einige Organismen einer auf 50 μΐ) Färbelösung zugesetzt und 15 Minuten ein- einer Blutagarplatte gezüchteten Kolonie aufnimmt, wirken gelassen. Der Objektträger wird mit 10 ml die Kolonie in einer Kochsalzlösung emulgiert und destilliertem Wasser, das aus einer Pipette aufge- 55 dann einen Tropfen auf ein bestimmtes Gebiet eines tropft wird, gespült und durch Eintauchen in eine mit Objektträgers aufbringt und wie oben weiter verdestilliertem Wasser gefüllte Schale gewaschen. Dann arbeitet.

Claims

Normalerweise werden die Ausstriche vor der

Patentanspruch: Zugabe von Wasserstoffperoxid und Elektronendonator mit einer Pufferlösung gespült und erneut Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von getrocknet.

Streptokokken der Gruppe A in Anwesenheit 5 Das eröndungsgeraäße Verfahren hat den Vorteil, anderer Streptokokken und Staphylokokken in daß es empfindlich und rasch ist und zur Identifieiner Probe unbekannter Zusammensetzung unter zierung nur die Verwendung eines gewöhnlichen Verwendung wenigstens eines zu untersuchenden Lichtmikroskops statt eines Fluoreszenzmikroskops Ausstrichs, einer positiven, nur aus Streptokokken erfordert.

der Gruppe A bestehenden und einer negativen xo Der erfindungsgemäß verwendete Antikörper von Vergleichsprobe auf Objektträgern, ebenfalls in Streptokokkus der Gruppe A wird in üblicher Weise Form von Ausstrichen, und von Antikörpern und aus einem Testtier, wie einem Kaninchen, erhalten, vergleichender Untersuchung der wenigstens drei Dann wird der Antikörper unter Zuhilfenahme eines Proben unter dem Mikroskop, dadurch ge- Kupplungsmittels, wie Glutaldehyd oder Diisocyanat, kennzeichnet, daß man jedem der wenig- 15 an eine Peroxydase gebunden. Typische Peroxydasen stens drei Ausstriche, von denen die negative hierfür sind Meerettich- und Lactoperoxydase. Die Vergleichsprobe aus Streptokokken der Gruppe G Peroxydase wirkt als eine Art Ve:\.tirker, der die und Staphylococcus aureus besteht, Antikörper Beobachtung des Antigen-Antikörper-k jmplexes unvon Streptokokkus der Gruppe A, die an eine ter dem Mikroskop unter Zuhilfenahme eines Farb-Peroxydase gebunden sind, zusetzt, die so behan- 20 stoffes ermöglicht.

delten Ausstriche inkubiert, dann Wasserstoff- Die positive und die negative Vergleichsprobe werden

peroxid und einen Elektronendonatorfarbstoff zu- in üblicher Weise hergestellt. Die negative Vergleichssetzt und die so behandelten Ausstriche unter dem probe wird von einer NCDC-Kultur von Strepto-Mikroskop untersucht. kokken der Gruppe G und von Staphylococcus aureus,

35 die koagulase-posiliv und nicht lebensfähig sind und von einem Iyophilisierten Vorrat gewonnen werden,