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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Reportermoleküle und Markierungen,
die zur Überwachung
einer Zielsubstanz in einem biologischen System verwendet werden
können.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines
Apo-Metallbindungsproteins
als Reportermolekül
oder Markierung. Ein Apo-Metallbindungsprotein kann an ein Protein
oder Gewebe gebunden oder in eine Zelle eingeführt werden. Die Erfindung betrifft
ferner Verfahren zur Verwendung des Apo-Metallbindungsproteins zum Nachweis
einer Zelle, die ein Protein von Interesse exprimiert, zur Lokalisierung
eines Proteins in einer Zelle und zur Entwicklung eines Therapeutikums
zur Behandlung einer Krankheit oder Infektion.
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Hintergrund
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Es
existieren mehrere Verfahren zur Überwachung einer Zielsubstanz
in einem biologischen System, einschließlich der Überwachung von Aktivitäten innerhalb
einer Zelle und von intrazellulären
Vorgängen.
Diese Verfahren verwenden verschiedene Reportermoleküle und -gene
sowie andere molekulare Markierungen und umfassen zum Beispiel die
Bildung von Fusionsproteinen mit kodierenden Sequenzen für Chloramphenicol-Acetyltransferase
(CAT), Gluceronidase (GUC), beta-Galactosidase (bGAL) und Luciferasen
(LUC). Viele dieser Reporter und Markierungen können als Indikatoren für Vorgänge verwendet
werden, die auf andere Weise schwer erkannt werden können. Silhavy,
T. J. & Beckwith,
J. R. Microbiol. Rev. (49), 398 (1985); Gould, S. J. & Subramani, S.
Anal. Biochem. (175), 5 (1988); und Stewart, G. S. A. B. & Williams, P.
J. Gen. Microbiol. (138), 1289, (1992). Viele Anwendungen dieser
Reportergene sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Ihre Verwendung
ist jedoch beschränkt,
weil sie zusätzliche
Manipulationen erfordern. Zum Beispiel machen es das Fixieren von
Zellpräparationen
oder die Zugabe exogener Substrate oder Cofaktoren schwierig, die
Verwendung dieser Reporter in vollautomatisierte Assays zu integrieren.
Andererseits unterliegt die Anwendung eines anderen Reportergens,
des grünen
fluoreszierenden Proteins (GFP), nicht diesen Einschränkungen,
hat aber andere Nachteile, wie Hintergrundrauschen und die Notwendigkeit
komplexer und teurer Nachweisausrüstung. Cormack, B. P., et al.
Gene, 173(1): 33–38
(1996); Kroes, S. J., et al., Eur. J. Biochem. 240(2), 342–351 (1996).
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Bis
vor kurzem basierte außerdem
der Nachweis bei automatisierten Assays aus Gründen der Sensitivität auf enzymatischen
oder fluorimetrischen Verfahren. Mit der Entwicklung des Nachweises
auf mikroskopischer Ebene wurde es jedoch technisch möglich, Marker
ohne Verstärkung
des Markers selbst oder ohne Signalverstärkung zu verwenden. Folglich
ist die Entwicklung neuer Reportergene oder Marker erwünscht, die keine
der vorstehenden Einschränkungen
und Nachteile aufweisen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Um
diese und andere Vorteile zu erreichen und in Übereinstimmung mit dem Zweck
der Erfindung, wie hierin ausgeführt
und im Großen
und Ganzen erläutert,
stellt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt ein Verfahren
zum Überwachen
einer Zielsubstanz in einem biologischen System bereit, umfassend
das Bereitstellen eines biologischen Systems mit einer Zielsubstanz,
die mit einem blauen Kupferprotein markiert ist. Es werden Bedingungen
bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal
auszusenden, und das Signal wird beobachtet oder gemessen. Die Zielsubstanz
wird auf Basis des Signals überwacht.
Das Überwachungsverfahren
kann das Bestimmen des Ortes der Zielsubstanz und/oder das Quantifizieren
der Menge der Zielsubstanz in dem biologischen System umfassen.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen
Verfahrens zum Überwachen
einer Zielsubstanz ein Verfahren zur Bestimmung der Cytotoxizität eines Medikaments
von Interesse bereit. Die Zielsubstanz, eine Zelle, wird mit einem
blauen Kupferprotein markiert und dem Medikament von Interesse ausgesetzt.
Die Zelle wird überwacht,
und die Cytotoxizität
des Medikaments von Interesse wird dadurch bestimmt, ob die Zelle
durch das Medikament von Interesse beeinflusst wird.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Markieren eines Proteins
von Interesse bereit, umfassend das Fusionieren eines Proteins von
Interesse an ein blaues Kupferprotein. In einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Markieren einer Zelle von
Interesse bereit, umfassend das Einführen eines blauen Kupferproteins
in die Zelle oder durch Binden eines blauen Kupferproteins an die
Membran der Zelle.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung einer Zelle
bereit, die ein Protein von Interesse exprimiert, umfassend das
Einbringen eines DNA-Moleküls
mit einer DNA-Sequenz, die das Protein von Interesse codiert, und
eines zusätzlichen
DNA-Moleküls
mit einer DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, in
die Zelle. Dann werden Bedingungen bereitgestellt, die die Expression
des blauen Kupferproteins und des Proteins von Interesse erlauben.
Es werden zudem Bedingungen bereitgestellt, die es dem Protein erlauben,
ein Signal auszusenden. Die Zelle, die das Protein von Interesse
exprimiert, wird durch Beobachten oder Messen des Signals des blauen
Kupferproteins nachgewiesen.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Lokalisieren eines Proteins von
Interesse in einer Zelle bereit, umfassend das Einbringen eines
DNA-Moleküls
in die Zelle, das eine DNA-Sequenz umfasst, die das Protein von
Interesse codiert, gebunden an eine zusätzliche DNA-Sequenz, die ein
blaues Kupferprotein codiert. Die zwei Sequenzen sind derart verbunden,
dass bei dem durch das DNA- Molekül produzierten
Protein das Protein von Interesse an das blaue Kupferprotein fusioniert
ist. Es werden Bedingungen bereitgestellt, die die Expression des
Fusionsproteins erlauben. Es werden ferner Bedingungen bereitgestellt,
die es dem blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden.
Die Lokalisierung des Fusionsproteins und damit die Lokalisierung
des Proteins von Interesse in der Zelle wird durch Beobachten oder
Messen des Signals bestimmt.
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Die
Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren zum Screening nach einem Therapeutikum zur Behandlung
einer Erkrankung bereit. Eine Zelle, die ein Ziel der Erkrankung
ist, wird mit dem blauen Kupferprotein markiert, und es werden Bedingungen
bereitgestellt, die es dem Protein gestatten, ein Signal auszusenden. Ob
das Therapeutikum zur Behandlung der Erkrankung wirksam ist, wird
durch Überwachen
des beobachteten oder gemessenen Signals von der Zelle bestimmt.
Bei einer weiteren Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen Verfahren
zum Screening nach einem Therapeutikum zur Behandlung einer viralen
oder bakteriellen Infektion verwendet werden, umfassend das Markieren
des Virus oder der Bakterien mit einem blauen Kupferprotein. Es
werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein
gestatten, ein Signal auszusenden, und das Signal wird beobachtet
oder gemessen. Die Wirksamkeit des Therapeutikums zur Behandlung
der Virus- oder Bakterieninfektion wird durch Beobachten oder Messen
des Signals von dem Virus oder den Bakterien bestimmt.
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Die
Erfindung zieht auch eine eukaryotische Zelle in Betracht, die eine
DNA-Sequenz umfasst, die ein blaues Kupferprotein codiert. Bei einer
Ausführungsform
ist die eukaryotische Zelle eine Tierzelle, das blaue Kupferprotein
ist Azurin, und die DNA-Sequenz umfasst das azu-Gen.
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Weitere
Aufgaben und Vorteile der Erfindung sind teilweise in der nachstehenden
Beschreibung erläutert
und sind teilweise aus der Beschreibung ersichtlich oder können durch
die Ausübung
der Erfindung erfahren werden. Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung
werden anhand der Elemente und Kombinationen erkannt und erreicht,
die in den beigefügten
Ansprüchen
besonders herausgestellt worden sind.
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Es
sollte selbstverständlich
sein, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch
die nachstehende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und
erläuternd
und für
die Erfindung, wie beansprucht, nicht beschränkend sind.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1 zeigt
die zur Amplifikation des azu-Gens aus der bakteriellen DNA mittels
PCR verwendeten Primer: die 5'-Primer
BCP-1C oder BCP-2C und den 3'-Primer BCP-1NC.
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2 ist
eine Karte des pLNCX-BCP1-Vektors: 5'-MoMuLV-LTR:
145–733; ψ+ (erweitertes Verpackungssignal): 803–1612; Neomycinresistenzgen
(Neor): 1656–2450; Immediate-Early-CMV-Promotor (Pcmv):
2800–3617;
BCP1-Gen: 3622–4701; 3'-MoMuLV-LTR: 4128–4720; Ampicillinresistenzgen
(B-Lactamase, Ampr): 6023–6865.
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Der
Vektor pLNCX-BCP1 wurde bei der Belgian Coordinated Collections
of Micro-Organisms an der Universität Gent – Laboratorium voor Moleculaire
Biologie – am
3. August 2000 hinterlegt, und die Zugangsnummer lautet LMBP4156.
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3A–D
zeigen die Western-Blots von Zelllysaten. Die Blots bestätigen die
Expression von Azurin.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Im
Folgenden wird auf die erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung detailliert Bezug genommen. Die vorliegende Erfindung
stellt unter einem Aspekt ein Verfahren zum Überwachen mindestens einer
Zielsubstanz in einem biologischen System bereit, umfassend das
Markieren einer Zielsubstanz in dem biologischen System mit einem
blauen Kupferprotein.
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Dann
werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein
gestatten, ein Signal auszusenden, und das Signal kann dann beobachtet
oder gemessen werden. Das Signal kann dazu verwendet werden, die
Zielsubstanz, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, die Lokalisation oder Position der Zielsubstanz in dem biologischen
System und/oder der Menge der Zielsubstanz in dem biologischen System,
zu überwachen.
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Ein
Apo-Metallbindungsprotein, wie hier definiert, ist jedes Protein
oder Peptid, das nach dem Binden von einem oder mehreren Metallionen
eine nachweisbare Farbe erwirbt oder nach dem Binden eines Metallions
oder eines zusätzlichen
Metallions die Farbe ändert.
Die erhaltene Farbe oder die beobachtete Farbveränderung kann ferner mit der
Oxidationsstufe des Metallions variieren. Bei einer Ausführungsform
nutzt die Erfindung diese Eigenschaft als Marker zur Analyse eines
biologischen Vorgangs, einschließlich jedes Vorgangs innerhalb
oder außerhalb
von Zellen, aber nicht darauf beschränkt, bei In-vitro-Assays oder
zur Beobachtung von Zellen oder Vorgängen in Geweben oder in gesamten
Organismen. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Apo-Metallbindungsprotein
Gruppen oder Familien von Metall bindenden Proteinen, die nach Bindung
an ein Metall eine intensive Farbe oder einen Farbwechsel aufweisen.
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Im
Gegensatz zu Proteinen, die eine Farbe durch eine enzymatische Reaktion
erzeugen, oder Proteinen, die ein Luminophor enthalten, erwirbt
ein Apo-Metallbindungsprotein
eine nachweisbare Farbe oder Farbveränderung nach dem Binden eines
Metallions. So stellen Apo-Metallbindungsproteine, die eine intrinsische,
leicht nachweisbare Farbe erwerben, einen neuartigen Marker bereit.
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Apo-Metallbindungsproteine
sind eine heterogene Sammlung von Proteinen aus verschiedenen Quellen,
einschließlich
blauer Kupferproteine in Bakterien und Säugerproteinen, wie Hämoglobin,
Katalase und Transferrin. Der hauptsächliche Vorteil der Verwendung von
Apo-Metallbindungsproteinen als Marker verglichen mit der Verwendung
bestehender Reportergene oder Marker ist die Tatsache, dass sie
einfach nachgewiesen werden können,
ohne dass ein Bedarf an zusätzlichen
Manipulationen oder an der Verwendung teurer und komplizierter Ausrüstung besteht.
Da viele dieser Proteine nicht in Säugerzellen vorkommen, sind
sie perfekte Marker für
die Einführung
in solche Zellen (z.B. bei diagnostischen Assays).
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Bisher
hat man Apo-Metallbindungsproteine nicht als Marker bei analytischen
Tests, diagnostischen Tests oder beim Screening nach Medikamenten
verwendet. Ein Patent (U.S.-Patent Nr. 5,210,019) beschreibt die
Verwendung von Azurin, einem blauen Kupferprotein, zum Nachweis
von Pseudomonas-Bakterien. Diese Bakterien exprimieren jedoch natürlicherweise
Azurin, d.h. das Protein wurde in die Bakterien nicht mit der Absicht
eingeführt,
es als Marker für
einen internen oder externen Vorgang zu verwenden. Azurin wird nur
zum Nachweis der Anwesenheit der Bakterien als solche verwendet.
In ähnlicher
Weise offenbart die PCT-Anmeldung
WO 99/30730A1 die Verwendung der Metall bindenden Protease Superoxiddismutase,
es gibt jedoch keine Offenbarung des Metall bindenden Proteins als
ein Reportermolekül
oder Marker.
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Das
erfindungsgemäße Apo-Metallbindungsprotein
ist ein blaues Kupferprotein, ein Derivat oder eine Mutante eines
blauen Kupferproteins oder jede Protein- oder Peptidsequenz mit
den Kupfer bindenden Eigenschaften einer blauen Kupferproteinsequenz,
wie vorstehend beschrieben. In lebenden Zellen übt Kupfer mehrere physiologische
Funktionen in Verbindung mit spezifischen metabolischen Proteinen
aus, z.B. Teilnahme an Elektronentransferreaktionen, verschiedenen
enzymatischen Reaktionen und Transport und Speicherung des Metalls
selbst. Kupferproteine und, genauer gesagt, blaue Kupferproteine,
bestehen aus einer großen Vielfalt
an Proteinen (Familien), gewöhnlich
mit einer Farbe, die je nach dem pH und/oder Mutationen in eine andere
Farbe geändert
werden kann. Kroes, S. J., et al., Eur. J. Biochem. 240(2), 342–351 (1996)
und E. Solomon, Chemical Reviews; 1996; 96(7); 2239–2314. Kupferproteine
können
je nach ihrer biologischen Funktion nach dem Typ des Kupferzentrums,
der Zahl an prosthetischen Gruppen und der Sequenzähnlichkeit
klassifiziert werden.
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Alternativ
zu Kupferproteinen können
andere Apo-Metallproteine
Proteine umfassen, die an Übergangsmetalle,
wie Co, Ni, Mn, Zn, Fe, oder ein Alkalimetall, wie Ca, Mg, Na, und
K, gebunden sind.
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Bei
der vorliegenden Erfindung ist das Apo-Metallbindungsprotein mindestens ein
blaues Kupferprotein oder ein Derivat oder eine Mutante eines blauen
Kupferproteins. Gemäß der Klassifizierung
der Kupferproteine nach ihrem Kupferzentrum bilden die blauen Kupferproteine
eine eigene Klasse. In dieser Klasse können sie in drei Gruppen eingeteilt
werden: die kleinen blauen Kupferproteine (z.B. Azurine, Pseudoazurine,
die Plastocyanin-Familie und die Phytocyanin-Familie), die blauen
Oxidasen (z.B. Ascorbatoxidase, Ceruloplasmin und Laccase) und Nitritreduktase.
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Blaue
Kupferproteine, auch als "Typ-1"-Kupferproteine bezeichnet, umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, kleine Proteine, die ein einziges Kupferatom binden und die
durch ihre sehr intensive Absorption im Bereich von 600 nm, verursacht
durch einen Landungstransferübergang
von einem Cysteinrest, gekennzeichnet sind. Ohne sich an eine Theorie
binden zu wollen, gibt es eine Beziehung zwischen dem EPR-Spektrum des blauen
Kupferproteins, der relativen Intensität der wichtigen Peaks im UV/VIS-Absorptionsspektrum und
der Struktur des aktiven Zentrums. Auf Basis dieser beobachteten
Parameter lassen sich die am weitesten verbreitet beobachteten blauen
Kupferproteine in vier strukturelle Klaasen unterteilen.
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Die
erste Klasse besteht aus den klassischen blauen Kupferproteinen
mit dem am besten untersuchten Beispiel Plastocyanin. Hier bilden
der Cystein- und die zwei Histidinreste eine Ebene mit dem leicht
darüber liegenden
Cu(II)-Atom. Der SCys-Cu(II)-Abstand ist
sehr kurz (±2,1 Ǻ).
Axial zu dieser Ebene befindet sich der vierte Rest Methionin in
einem großen
Abstand (±2,9 Ǻ).
Die Gesamtstruktur des aktiven Zentrums ist verdreht tetraedrisch
oder trigonal (C3ν).
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Eine
zweite Gruppe von blauen Kupferproteinen beinhaltet Proteine, in
denen Verknüpfungen
mit fünf Resten
koordiniert sind: die Azurine. Die zusätzliche Bindung wird von einem
Carbonyl-Sauerstoff gebildet, der an das Kupfer an der Methionin
gegenüberliegenden
Seite bindet. Der Methioninrest befindet sich in einer etwas größeren Entfernung
als im Plastocyanin (±3,1 Ǻ).
Die Carbonylgruppe ist etwa 3,0 Ǻ entfernt. Das EPR-Spektrum
der Proteine, die zur ersten und zweiten Klasse gehören, ist
vom Axialtyp, und sie zeigen nur einen intensiven Peak bei 600 nm
im Absorptionsspektrum.
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Eine
dritte Klasse von blauen Kupferproteinen umfasst Proteine, welche
die gleichen vier Koordinationsverbindungen wie im Plastocyanin
aufweisen, die aber in einer mehr verdrehten Konformation angeordnet sind.
Die SCys-Cu(II)-Bindungslänge nimmt gleichzeitig mit
der Abnahme der SMet-Cu(II)-Bindungslänge zu.
Das EPR-Spektrum ist rhombisch, und es gibt einen Anstieg des Absorptionsbereichs
bei 460 nm. Eine vierte Klasse von blauen Kupferproteinen wird von
Proteinen gebildet, die eine axiale Verknüpfung mit einem anderen Rest
als Methionin aufweisen.
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Obwohl
es ein deutliches Ausmaß an
Divergenz in der Sequenz der blauen Kupferproteine gibt, sind die
Kupferligandenstellen bei vielen der Proteine konserviert und zeigen
das folgende Muster: [GA]-x(0, 2)-[YSA]-x(0,
1)-[VFY]-x-C-x(1, 2)-[PG]-x(0, 1)-H-x(2, 4)-[MQ]. Siehe http://bess.u-strasbg.fr/BioInfo/ Prosite/00174.pdoc.
Eine spezielle, verdreht-trigonal-planare Anordnung von zwei Histidinliganden
und einem Cysteinliganden um das Kupfer verursacht die ganz besonderen
elektronischen Eigenschaften des Metallzentrums: eine intensive
blaue Farbe, die 100-mal intensiver ist als bei den meisten anorganischen
Kupferkomplexen (Cys-S-Cu-Ladungstransfer), axiale EPR-Spektren mit kleinen
Hyperfein-Kopplungskonstanten und hohen Redoxpotenzialen. Das Apo-Metallbindungsprotein
für die
Verwendung bei der Ausführung
der Erfindung ist ein blaues Kupferprotein mit diesen Eigenschaften.
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Die
bekanntesten Mitglieder dieser Proteinklasse sind Plastocyanine
aus Pflanzen-Chloroplasten, die Elektronen mit Cytochrom c6 austauschen,
und die entfernt verwandten bakteriellen Azurine, die Elektronen mit
Cytochrom 551 austauschen. Andere blaue Kupferproteine sind u.a.,
sind aber nicht beschränkt
auf Amicyanin aus Bakterien, wie Methylobacterium extorquens oder
Thiobacillus versatus, das auf Methylamin wachsen kann; die Auracyanine
A und B aus Chloroflexus aurantiacus; blaues Kupferprotein aus Alcaligenes
faecalis; Cupredoxin (CPC) aus Gurkenschalen, Cusacyanin (basisches
blaues Protein, Plantacyanin, CBP) aus Gurke; Halocyanin aus Natrobacterium
pharaonis, ein membranassoziiertes Kupfer bindendes Protein; Pseudoazurin
aus Pseudomonas; Rusticyanin aus Thiobacillus ferrooxidans; Stellacyanin
aus dem Japanischen Lackbaum; Umecyanin aus Meerrettichwurzeln und
das Allergen Ra3 von Ambrosie. Garret T. P. J., et al., J. Biol.
Chem. 259: 2822–2825
(1984); Ryden L. G. & Hunt
L. T., J. Mol. Evol. 36: 41–66
(1993); McManus J. D., et al., J. Biol. Chem. 267: 6531–6540 (1992);
Mann K., et al., FEBS Lett. 314: 220–223 (1992); Mattar S., et al.,
J. Biol. Chem. 269: 14939–14945
(1994); Yano T., et al., FEBS Lett. 288: 159–162 (1991).
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Das
Signal, das von einem blauen Kupferprotein ausgesendet wird, kann
jeder Wechsel oder jeder Erwerb von Farbe oder Veränderung
in der Intensität
von blauer Farbe sein. Farbe, wie hier verwendet, ist als jedes
chromatische Signal definiert. Bei einer Ausführungsform liegt die beobachtete
oder bestimmte Farbe im sichtbaren oder ultravioletten Wellenlängenbereich.
Farbe, wie hier definiert, kann auch ein Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignal
sein. Das Signal kann durch alle im Stand der Technik bekannten
Mittel beobachtet oder gemessen werden, einschließlich, sichtbarer
Bestimmung mit dem bloßen
Auge, einem Mikroskop, einer Photonenröhre oder Diode, aber nicht
darauf beschränkt.
Bei einer Ausführungsform
werden die Frequenz, Dauer, Intensität und/oder Lokalisation des
Signals zu einem einzigen Zeitpunkt oder als eine Funktion der Zeit
gemessen oder beobachtet.
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Wie
hier definiert, kann ein biologisches System jedes biologische oder
biochemische In-vivo- oder In-vitro-System
sein, einschließlich
jeder Zelle oder Zellkultur, jedes Virus, aller Bakterien, jeder
Pflanze oder jedes Tiers oder jedes Teils oder simulierten Systems
davon, aber nicht darauf beschränkt.
Bei der Ausführung der
Erfindung kann die Zielsubstanz aus jeder Zelle, wie jeder bakteriellen,
Pilz-, Pflanzen- oder
Tierzelle, jedem Gewebe, jedem Virus oder jedem Protein ausgewählt werden.
Geeignete Tierzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Vero-Zellen, HeLa-Zellen, Cos-Zellen, CV1-Zellen und verschiedene
primäre
Säugerzellen.
Bei einer Ausführungsform
ist die bakterielle Zelle Escherichia coli. Die Zielsubstanz kann
auch ein Medikament oder eine therapeutische Behandlung sein, das/die
markiert wird, um seine/ihre Aktivität oder Funktion in vivo oder
in vitro zu verfolgen. Bei einer Ausführungsform ist das blaue Kupferprotein,
z.B. durch kovalente oder ionische Bindung, mit einem Gewebe, einer
Zelle und/oder einem Protein verknüpft, oder ein Fusionsprotein
zwischen einem oder mehreren Proteinen von Interesse und einem oder
mehreren blauen Kupferproteinen wird hergestellt.
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Eine
Zelle kann auch durch Einführen
eines blauen Kupferproteins in die Zelle oder durch Transfizieren der
Zelle mit einem DNA-Molekül,
das ein blaues Kupferprotein codiert, markiert werden. Ein blaues
Kupferprotein kann auch an die Membran einer Zelle, entweder an
der Innen- oder Außenseite
der Zellwand, gebunden oder daran verankert werden. Das blaue Kupferprotein
kann einer Zelle, einem Gewebe oder Protein von Interesse in vivo
oder in vitro bereitgestellt werden.
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Zur
Ausführung
der Erfindung gehört
auch eine eukaryotische Zelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein
blaues Kupferprotein codiert. Die eukaryotische Zelle kann eine
Tierzelle sein, und bei einer Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz
das azu-Gen.
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Bei
einer Ausführungsform
kann das blaue Kupferprotein als Reportergen verwendet werden. Das
Reportergen kann in eine Zelle eingeführt werden, und die Zelle kann
ein DNA-Molekül
mit einem regulatorischen Element aus einem anderen Gen als ein
Gen, das ein blaues Kupferprotein codiert, umfassen, das an eine DNA-Sequenz
funktionsfähig
gebunden ist, die ein blaues Kupferprotein codiert. Wie hier verwendet,
ist "ein regulatorisches
Element" eines Gens
die DNA-Sequenz, die zur Expression des Gens notwendig ist. Bei
dieser Erfindung bedeutet die Bezeichnung "funktionsfähig gebunden", dass nach einer
solchen Verknüpfung
das regulatorische Element die Expression der verknüpften DNA-Sequenz
steuern kann. Ein Gen, das ein blaues Kupferprotein codiert, beinhaltet
DNA-Moleküle, die
für Polypeptidanaloga,
Fragmente oder Derivate antigener Polypeptide codieren, die sich
von natürlich
vorkommenden Formen hinsichtlich der Identität oder Lokalisation von einem
oder mehreren Aminosäureresten
unterscheiden (Deletionsanaloga, die weniger als alle für das Protein
angegebenen Reste enthalten, Substitutionsanaloga, wobei einer oder
mehrere angegebene Reste durch andere Reste ersetzt sind, und Additionsanaloga,
wobei einer oder mehrere Aminosäurereste
zu einem endständigen
oder mittleren Abschnitt der Polypeptide hinzugefügt worden
sind) und die einige oder alle Eigenschaften der natürlich vorkommenden
Formen besitzen.
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Diese
DNA-Moleküle
beinhalten: das Einfügen
von Codons, die für
die Expression durch ausgewählte Nichtsäugerwirte "bevorzugt" sind; die Bereitstellung
von Spaltstellen für
Restriktionsendonukleaseenzyme und die Bereitstellung von zusätzlichen
Anfangs-, End-, oder Mittel-DNA-Sequenzen, welche die Konstruktion leicht
exprimierbarer Vektoren erleichtern.
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Bei
einer Ausführungsform
kann das blaue Kupferprotein an einen Promoter gebunden werden,
der von sich aus auf einen intrazellulären Vorgang anspricht. Jeder
Einfluss (z.B. durch ein zu der Zelle hinzugefügtes Medikament) auf diesen
Vorgang beeinflusst die Expressionsrate des Metall bindenden Proteins
und kann folglich durch Messen der Farbintensität der Zelle überwacht
werden.
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Ein
Durchschnittsfachmann ist in der Lage, je nach dem gewählten blauen
Kupferprotein und der beabsichtigten Anwendung die Bedingungen zu
bestimmen, die bereitgestellt werden müssen, um es einem blauen Kupferprotein
zu ermöglichen,
ein Signal auszusenden. Die genauen Bedingungen können Variation des
pH-Werts, der Ionenstärke,
des intrazellulären
Redoxpotenzials, das Bereitstellen eines Metalls für die Bindung
an blaues Kupferprotein und das Ändern
der Ladung des Metalls umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Um
beispielsweise Bedingungen bereitzustellen, die es Azurin gestatten,
ein Signal auszusenden, z.B. blaue Farbe, sollten zwei Bedingungen
erfüllt
sein: (1) Azurin muss Kupfer entweder vor oder nach der Markierung
der Zielsubstanz binden, und (2) das Protein muss im oxidierten
Zustand vorliegen. Außerdem
müssen diese
Bedingungen mit den In-vivo- oder Kulturbedingungen des biologischen
Systems kompatibel sein. Freies Cu2+ ist
zum Beispiel sogar in relativ niedrigen Konzentrationen für die Zellen
toxisch.
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Azurin
bindet Kupfer mit hoher Affinität
(die Bindung von Kupfer ist thermodynamisch begünstigt, wobei die Bindungsenergie
von Cu(II) die von anderen Übergangsmetallionen übersteigt),
und der entstandene Kupfer-Protein-Komplex ist sehr stabil. Daher
sollten niedrige, nicht-toxische Mengen von Cu2+ im
Medium (in einem Bereich von 0,5 bis 1 μM) eine irreversible Bindung
des Metalls an Azurin gestatten. Bei einer Ausführungsform kann der Kupfertransport
innerhalb eines biologischen Systems durch Trafficking-Proteine
erfolgen, die das Cu2+ zu verschiedenen
Kupfer enthaltenden Oxidasen in den vesikulären Systemen befördern.
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Ohne
sich an eine Theorie binden zu wollen, ist die intensive blaue Farbe
des Azurin eine Eigenschaft der oxidierten Cu(II)-Form, die eine
starke sichtbare Absorptionsbande bei 628 nm (ε = 5700 M–1cm–1)
aufweist, während
die Cu(I)-Form farblos ist. Das oxidierte Azurin ist die stabilste
Form, aber das Reduktionspotenzial der Cu-Komplexe wird durch das
Medium und die Ionenstärke
stark beeinflusst, und die blaue Farbe des Cu(II)-Komplex verblasst
mit sinkendem pH. Folglich kann bei einer Ausführungsform eine Veränderung
des Mediums oder der Ionenstärke
des Mediums die Bedingung liefern, die es dem blauen Kupferprotein
gestattet, ein Signal auszusenden.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
gestattet der physiologische pH des Zellcytoplasmas die Bildung des
funktionellen Proteins. Da das Reduktionspotenzial der Zellumgebung
jedoch recht niedrig ist und damit die farblose Cu(I)-Form begünstigt,
wird bei einer Ausführungsform
eine Zelle am Endpunkt des Assays zum Nachweis der blauen Farbe
des exprimierten Azurins in einem Lysispuffer mit kompatiblem pH,
kompatibler Kupferkonzentration und kompatiblem Reduktionspotential
lysiert.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
kann das exprimierte blaue Kupferprotein an spezifische "oxidative" Organellen, wie
Mitochondrien, Post-Golgi-Vesikel
und Peroxisomen, gelenkt werden. Gemäß der biologischen Rolle von
Azurin sind zum Beispiel die Mitochondrien die geeigneten Organellen
zur Expression des Proteins. Azurin gehört zu einer Familie von Proteinen,
die in der Atmungskette denitrifizierender Bakterien und Pflanzen
als Elektronentransfermittel fungieren. Ihre Rolle ist es, Elektronen
zwischen verschiedenen Oxidasen (z.B. Cytochrom c und Cytochromoxidase,
ATPasen) zu transportieren. Die Zielsteuerung der Proteine an die
Mitochondrien kann durch Platzierung eines mitochondrialen Zielsteuerungssignals
vor die das azu-Gen codierende Sequenz einfach erreicht werden.
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Eine
Zielsteuerung von Azurin an die Mitochondrien hat einen zusätzlichen
Vorteil auf die Konzentration des exprimierten Proteins. Obwohl
die Expression des pLNCX-BCP1/2-Konstrukts durch den starken konstitutiven
CMV-Promotor induziert wird, kann die Menge an Azurin in einigen
Systemen für
einen effizienten Nachweis der blauen Farbe unzureichend sein, weil
es keine enzymatische Amplifikation des Signals (= der blauen Farbe)
gibt. Die Zielsteuerung der Proteine an die Mitochondrien konzentriert
die blaue Farbe, was einen präziseren
Nachweis ermöglichen
sollte. Die Proteinausbeute kann durch Platzierung eines Translationsenhancers
unmittelbar stromaufwärts
der codierenden Sequenz von Azurin ebenfalls erhöht werden. Auf diese Weise
können
bis zu fünffach
höhere
Expressionsspiegel erreicht werden. Infolge von Zielsteuerung und
verstärkter
Expression sollten die mitochondrialen blauen "Pixel" beispielsweise mit einem Elektronenmikroskop, einem
konfokalen Mikroskop, einer Farbkamera oder mit dem Tibotec-Multisampling-Mikroskop
leicht nachzuweisen und zu messen sein, wie im U.S.-Patent, Veröffentlichungsnr.
US 2003/0142398, beschrieben.
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Es
gibt zahllose Anwendungen, bei denen die erfindungsgemäßen Verfahren
und Zusammensetzungen angewendet werden können. Bei einer Ausführungsform
stellt die Erfindung zum Beispiel ein Verfahren zum Nachweis mindestens
einer Zelle, die das Protein von Interesse exprimiert, bereit. Ein
DNA-Molekül
mit einer DNA-Sequenz, die ein oder mehrere Protein(e) von Interesse
codiert, und ein zusätzliches
DNA-Molekül mit
einer DNA-Sequenz, die ein oder mehrere blaue Kupferprotein(e) codiert,
können
in die Zelle eingeführt werden.
Durch Bereitstellen von Bedingungen, die es dem blauen Kupferprotein
erlauben, ein Signal auszusenden, kann man die Zelle, die das Protein
von Interesse exprimiert, durch Beobachten oder Messen des Signals
des blauen Kupferproteins nachweisen. Das DNA-Molekül und das zusätzliche
DNA-Molekül
können verknüpft sein.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Lokalisierung mindestens eines
Proteins von Interesse in einer Zelle bereit. Hier wird ein DNA-Molekül, das eine
DNA-Sequenz umfasst, die mindestens ein Protein codiert, verknüpft mit
einer zusätzlichen
DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, in eine Zelle
eingeführt.
Die Sequenzen sind derart verknüpft,
dass in dem durch das DNA-Molekül produzierten
Protein mindestens ein Protein von Interesse, fusioniert mit dem
blauen Kupferprotein, vorliegt. Der Ort des Fusionsproteins kann
aus dem Signal des exprimierten Fusionsproteins bestimmt werden,
wobei auch das Protein in der Zelle lokalisiert wird.
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Die
Erfindung umfasst die Verwendung dieser Proteine oder Peptide bei
Medikamentenentdeckungstechnologien und diagnostischen Tests. Bei
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Medikament oder eine Behandlung bereit,
das/die unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren entdeckt,
identifiziert oder entwickelt wurde.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
sind insbesondere in Hochdurchsatztest- oder -auswertungsvorrichtungen
einsetzbar. Die Erfindung kann auch beim Hochdurchsatzscreening
nach Medikamenten verwendet werden. Auf diesem Gebiet wird die Screening-Geschwindigkeit als
einer der wichtigsten Flaschenhälse bei
dem Verfahren zur Medikamentenentdeckung betrachtet. Eine Vereinfachung
des Nachweises des Reporters oder der Markierung ist eine Weise,
das Screeningverfahren zu beschleunigen. Die blauen Kupferproteine sind
für diesen
Zweck ideal. Es besteht keine Notwendigkeit an zusätzlichen
Manipulationen für
den Nachweis, und sie könnten
somit in homogenen Assays verwendet werden, wodurch sie für eine Automatisierung
zugänglich
werden. Die Tatsache, dass kein Bedarf an komplizierter und teurer
Nachweisausrüstung
besteht, ist ein weiterer wichtiger direkter Vorteil.
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Es
liegt innerhalb der erfindungsgemäßen Praxis, einen aus zahlreichen
Reaktionsvertiefungen zusammengesetzten Probenständer oder festen Träger herzustellen,
so dass jede Reaktion von jeder anderen isoliert bleibt. Gleichzeitiges Überführung eines
oder mehrerer Reagenzien in die Reaktionsvertiefungen kann dann
durch eine der vielen Techniken erfolgen, die auf dem Fachgebiet
der Hochdurchsatzanalyse verwendet werden.
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Ein
oder mehrere der Inhalte jeder der Reaktionsvertiefungen können abgewandelt
werden. Bei einer Ausführungsform
enthält
zum Beispiel jede Reaktionsvertiefung das gleiche biologische System
und die gleiche, mit blauem Kupferprotein markierte Zielsubstanz.
Dann wird jedoch ein Medikament zu jeder Reaktionsvertiefung gegeben.
Die Reaktionsvertiefungen können
einen Array bilden oder andere Mittel zur Identifizierung oder Zuweisung
jedes Kompartiments einsetzen. Die Aktivität jeder Reaktion kann dann
aus der nachgewiesenen Menge an Signal von dem blauen Kupferprotein
automatisch bestimmt und aufgezeichnet werden. Andere Ausführungsformen
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf das Variieren der Konzentration einer oder mehrerer Komponenten.
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Es
gibt zahlreiche Verfahren zur Handhabung eines hohen Durchsatzes,
z.B. das Analysieren einer großen
Anzahl von Proben in einem verhältnismäßig kurzen
Zeitraum. Jedes verfügbare
Verfahren zur Hochdurchsatzanalyse kann auf die erfindungsgemäßen Verfahren.
Beispiele sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf: U.S.-Patent Nr. 5,985,215
von Sakazume et al., betitelt Analyzing Apparatus Having a Function
Pipette Samples; U.S.-Patent Nr. 6,046,056 von Parce et al., betitelt
High Throughput Screening Assay Systems in Microscale Fluidic Devices;
WO 00/14540 von Pauwels et al., betitelt Method For the Rapid Screening
of Analytes; WO 99/30154 von Beutel et al., betitelt Continuous
Format High Throughput Screening; und WO 99/67639 von Wada et al.,
betitelt High Throughput Methods, Systems and Apparatus for Performing
Cell Based Screening Assays.
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Bei
einer spezifischen Ausführungsform
können
blaue Kupferproteine als Reporter bei diagnostischen Tests verwendet
werden, wie Medikamentensensitivitätsanalysen, die gemäß WO 97/27480
durchgeführt
werden. Bei einer Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen eines Therapeutikums
zur Behandlung einer Erkrankung bereit, umfassend das Markieren
mindestens einer Zelle, die ein Ziel der Erkrankung ist, mit einem
blauen Kupferprotein. Ob das Therapeutikum zur Behandlung der Erkrankung
wirksam ist, wird durch Überwachen
des beobachteten oder gemessenen Signals von dem blauen Kupferprotein
und somit der Zelle bestimmt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screenen eines Therapeutikums
zur Behandlung einer Virus- oder Bakterieninfektion bereit. Das
Virus oder die Bakterien wird/werden mit einem blauen Kupferprotein markiert,
und es werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupfersignal
gestatten, ein Signal auszusenden. Ob das Therapeutikum zur Behandlung
der Virus- oder Bakterieninfektion wirksam ist, wird durch Überwachen
des beobachteten oder gemessenen Signals von dem Virus bestimmt.
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Bei
einer Ausführungsform
ist das Virus das HIV-Virus,
und die blauen Kupferproteine werden zum Screenen von Medikamenten
verwendet, die gegen HIV wirksam sind. Zum Beispiel kann das Gen,
das für dieses
Protein codiert, mit einem konstitutiv aktiven Promotor einer CD4+-Zelle funktionsfähig verbunden sein. Wenn das
Medikament gegen das Virus inaktiv ist, töten die Zugabe des Medikaments
und des HIV-Virus zu einer CD4+-Zelle diese Zelle,
weil der Virus in der Lage ist, in die Zelle einzudringen und sie
abzutöten.
Die Zelle exprimiert das Metall bindende Protein nicht mehr und
verliert ihre Farbe. Wenn das Medikament gegen HIV wirksam ist,
kann das Virus die Zelle nicht abtöten, und die Zelle behält ihre
Farbe.
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Die
Cytotoxizität
von Medikamenten kann auch durch Verwendung dieser neuen Marker
bestimmt werden. In diesem Fall kann das Gen, das für das blaue
Kupferprotein codiert, mit einem konstitutiv aktiven Promotor funktionsfähig verbunden
und in eine Zelle eingeführt
werden. Lebende Zellen, die nicht durch ein Medikament beeinflusst
werden, werden nachgewiesen, da sie mit der Unterstützung der
Genexpression fortfahren und somit das Metall bindende Protein exprimieren,
wodurch die Zelle eine intensive Farbe erhält. Ist ein Medikament toxisch
für die
Zelle, erfolgt es keine Expression des Markers mehr, und die Farbe
der Zelle verschwindet.
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Zusätzlich kann
man sich die Verwendung eines blauen Kupferproteins oder eines verwandten
Peptids bei beinahe jeder Anwendung vorstellen, bei der ein grünes fluoreszierendes
Protein (GFP) (oder verwandte Mutanten davon) verwendet wird. Viele
Verwendungen von GFP sind durch
US
5,491,084 offenbart/abgedeckt. Ein Beispiel ist die Verwendung
von (modifiziertem) GFP in einem Farnesyltransferase-Assay, das
wir vor kurzem beschrieben haben (PCT/EP00/04923 und PCT/EP/004919),
in dem ein gefärbtes
Metall bindendes Protein in ein Fusionsprotein mit einer spaltbaren
Stelle (wie DVED für
Caspasen) zusammen mit Ras-Sequenzen eingeführt wurde, die das gesamte
Fusionsprotein an die Plasmamembran lenken. Jede Einwirkung einer
Protease, wie Caspase, bewirkt eine nachweisbare Umverteilung des
Metall bindenden Proteins innerhalb der Zelle.
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Blaues
Kupferprotein kann auch zurzeit bei diagnostischen Tests, wie dem
in WO 97/27480 offenbarten antiVirogramTM-Verfahren,
verwendete Reporter ersetzen.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Kit bereit. Das Kit kann für jedes
der hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Bei einer Ausführungsform
kann das Kit zur Überwachung
mindestens einer Zielsubstanz in einem biologischen System verwendet
werden. Das erfindungsgemäße Kit kann
ein blaues Kupferprotein und/oder eine DNA-Sequenz, die ein blaues
Kupferprotein codiert, umfassen. Das Kit kann ferner ein Plasmid zur
Zuführung
der DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, an eine Zelle
umfassen. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Kit
eine eukaryotische Zelle, die eine DNA-Sequenz umfasst, die ein
blaues Kupferprotein codiert.
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Beispiele
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Beispiel 1: Konstruktion
von pLNCX-BCP1 und pLNCX-BCP2
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Die
Bakterien Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans (oder
Alcaligenes denitrificans) wurde von der ATCC (ATCC-Nummer 15173,
NCTC 8582) erworben. Das für
Azurin codierende Gen azu wurde aus bakterieller DNA mittels PCR
amplifiziert und in einen Säugerexpressionsvektor
kloniert. Das azu-Gen codiert ein Präprotein, in welchem dem reifen
Azurin (130 AS) ein 19-AS-Signalpeptid vorausgeht. Dieses Peptid
dient wahrscheinlich der Translokation des Proteins über die
periplasmatische Membran. Das vollständige Protein (mit Signalpeptid)
wurde kloniert, um Schwierigkeiten mit der korrekten Proteinfaltung
zu vermeiden. In einem zweiten Konstrukt wurde ein Sekretionssignal
(= Ig-κ-Leadersequenz) vor
dem Gen platziert, so dass die Sekretion in das Medium möglich wurde.
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Das
azu-Gen wurde in den retroviralen Vektor pLNCX (Clontech) kloniert.
Dieser von dem Moloney-Mäuse- Leukämievirus
(MoMuLV) stammende Vektor ist für
eine retrovirale Genzuführung
und -expression ausgelegt. Er enthält ein durch virale 5'-LTR (5' LTR) gesteuertes
Neomycinresistenzgen (Neor) für die Antibiotikaselektion
in eukaryotischen Zellen und eine Klonierungsstelle (HindIII, HpaI
und ClaI) stromabwärts
eines Cytomegalievirus-Immediate-Early-Promotors (Pcmv). Die ψ+-Sequenz ist ein erweitertes virales Verpackungssignal,
das für
die Verpackung des viralen Vektortransskripts in Virionen erforderlich
ist. pLNCX enthält keine
viralen Strukturgene (gag-pol und env), die für Partikelbildung und Replikation
notwendig sind, sie können
jedoch in trans in Verpackungszelllinien bereitgestellt werden,
die diese Gene stabil exprimieren.
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Das
azu-Gen wurde aus bakterieller DNA mittels PCR unter Verwendung
des 5'-Primers BCP-1C (SEQ
ID: 1) oder BCP-2C (SEQ ID: 3) und des 3'-Primers BCP-1NC (SEQ ID: 2) (1)
amplifiziert. Die 5'-Primer
sind derart gestaltet, dass sie eine Translationsinitiations-(Kozak-)Sequenz vor
dem ATG-Initiationscodon enthalten. Der Primer BCP-2C (SEQ ID: 3)
enthält
die Ig-κ-Leadersequenz
zur Sekretion von BCP in das Medium. Die 3'-Primer enthalten das native Stoppcodon
des Proteins. Die Primer enthalten ferner eine Restriktionsstelle
(HindIII für
die 5'-Primer und
EcoRI für
die 3'-Primer),
die eine leichte Subklonierung des azu-Gens ermöglichen.
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Das
PCR-Produkt wurde nach Restriktion mit HindIII in die HindIII-HpaI-Stelle
von pLNCX kloniert (2).
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Beispiel 2: Transfektion
und Nachweis von Azurin in eukaryotischen Zellen
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Das
Protein Azurin ist ein blaues Kupferprotein, das durch eine intensive
Absorption nahe 600 nM charakterisiert ist, wodurch eine blaue Farbe
hervorgerufen wird, wenn Cu2+ an das Protein
gebunden ist. Das Protein wird von verschiedenen Bakterienstämmen exprimiert.
Das blau gefärbte
Protein wurde in eukaryotischen Zellen exprimiert und als Alternative
zu verschiedenen Reportersystemen (β-Gal, GFP, ...) in zellbasierten
Assays verwendet. Das Experiment zeigte, dass konstitutive Expression
und Nachweis des Proteins als Marker für Lebensfähigkeit verwendet werden könnten.
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293T-Zellen,
humane, mit T-Antigen transformierte embryonale Nierenzellen, wurden
mit den Konstrukten pLNXC-BCP1 oder pLNCX-BCP2 unter Verwendung
von Effectene-Transfektionsreagenz (Qiagen) transient transfiziert.
SDS-PAGE (15%), gefolgt von Western-Blotting der Zelllysate, bestätigten die
Expression von Azurin durch beide Konstrukte (3).
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Azurin
wurde in Zelllysaten (Zelllysate (106 Zellen/Probe))
mit polyklonalem Anti-A.-denitrificans-Azurin-Antikörper (Leiden Institute of Chemistry,
Gorlaeus Laboratories) nachgewiesen. Die in 3 gezeigten Western-Blots
können
wie folgt interpretiert werden:
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