DE60029017T2 - USE OF BLUE COPPER PROTEINS - Google Patents

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Abstract

The present invention is directed to reporter molecules and tags that may be used to monitor a target substance in a biological system. More particularly, the present invention relates to the use of an apo metal binding protein as a reporter molecule or tag. An apo metal binding protein may be bound to a protein or tissue or introduced into a cell. The invention also relates to methods of utilizing the apo metal binding protein for detecting a cell expressing a protein of interest, localizing a protein in a cell, and designing a therapeutic agent for treating a disease or infection.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Reportermoleküle und Markierungen, die zur Überwachung einer Zielsubstanz in einem biologischen System verwendet werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Apo-Metallbindungsproteins als Reportermolekül oder Markierung. Ein Apo-Metallbindungsprotein kann an ein Protein oder Gewebe gebunden oder in eine Zelle eingeführt werden. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Verwendung des Apo-Metallbindungsproteins zum Nachweis einer Zelle, die ein Protein von Interesse exprimiert, zur Lokalisierung eines Proteins in einer Zelle und zur Entwicklung eines Therapeutikums zur Behandlung einer Krankheit oder Infektion.The The present invention relates to the field of reporter molecules and labels, the for monitoring of a target substance in a biological system can. In particular, the present invention relates to the use of a Apo metal binding protein as a reporter molecule or mark. An apo-metal binding protein can bind to a protein or tissues are bound or introduced into a cell. The invention relates a method of using the apo-metal binding protein for detection a cell expressing a protein of interest for localization a protein in a cell and to develop a therapeutic agent for the treatment of a disease or infection.

Hintergrundbackground

Es existieren mehrere Verfahren zur Überwachung einer Zielsubstanz in einem biologischen System, einschließlich der Überwachung von Aktivitäten innerhalb einer Zelle und von intrazellulären Vorgängen. Diese Verfahren verwenden verschiedene Reportermoleküle und -gene sowie andere molekulare Markierungen und umfassen zum Beispiel die Bildung von Fusionsproteinen mit kodierenden Sequenzen für Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Gluceronidase (GUC), beta-Galactosidase (bGAL) und Luciferasen (LUC). Viele dieser Reporter und Markierungen können als Indikatoren für Vorgänge verwendet werden, die auf andere Weise schwer erkannt werden können. Silhavy, T. J. & Beckwith, J. R. Microbiol. Rev. (49), 398 (1985); Gould, S. J. & Subramani, S. Anal. Biochem. (175), 5 (1988); und Stewart, G. S. A. B. & Williams, P. J. Gen. Microbiol. (138), 1289, (1992). Viele Anwendungen dieser Reportergene sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Ihre Verwendung ist jedoch beschränkt, weil sie zusätzliche Manipulationen erfordern. Zum Beispiel machen es das Fixieren von Zellpräparationen oder die Zugabe exogener Substrate oder Cofaktoren schwierig, die Verwendung dieser Reporter in vollautomatisierte Assays zu integrieren. Andererseits unterliegt die Anwendung eines anderen Reportergens, des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), nicht diesen Einschränkungen, hat aber andere Nachteile, wie Hintergrundrauschen und die Notwendigkeit komplexer und teurer Nachweisausrüstung. Cormack, B. P., et al. Gene, 173(1): 33–38 (1996); Kroes, S. J., et al., Eur. J. Biochem. 240(2), 342–351 (1996).It There are several methods for monitoring a target substance in a biological system, including monitoring activities within a cell and of intracellular Operations. These methods use various reporter molecules and genes as well as other molecular markers and include, for example, the Formation of fusion proteins with coding sequences for chloramphenicol acetyltransferase (CAT), gluceronidase (GUC), beta-galactosidase (bGAL) and luciferases (LUC). Many of these reporters and markers can be used as indicators of operations become difficult to be recognized in any other way. Silhavy, T.J. & Beckwith, J.R. Microbiol. Rev. (49), 398 (1985); Gould, S.J. & Subramani, S. Anal. Biochem. (175), 5 (1988); and Stewart, G.S.A.B. & Williams, P. J. Gen. Microbiol. (138), 1289, (1992). Many applications of this Reporter genes are described in detail in the prior art. Your use is limited, however because they are extra Require manipulation. For example, it is fixing by cell preparations or the addition of exogenous substrates or cofactors difficult Use of these reporters to integrate into fully automated assays. On the other hand, the use of another reporter gene, of the green fluorescent protein (GFP), not these limitations, but has other disadvantages, such as background noise and the need complex and expensive detection equipment. Cormack, B.P., et al. Gene, 173 (1): 33-38 (1996); Kroes, S.J., et al., Eur. J. Biochem. 240 (2), 342-351 (1996).

Bis vor kurzem basierte außerdem der Nachweis bei automatisierten Assays aus Gründen der Sensitivität auf enzymatischen oder fluorimetrischen Verfahren. Mit der Entwicklung des Nachweises auf mikroskopischer Ebene wurde es jedoch technisch möglich, Marker ohne Verstärkung des Markers selbst oder ohne Signalverstärkung zu verwenden. Folglich ist die Entwicklung neuer Reportergene oder Marker erwünscht, die keine der vorstehenden Einschränkungen und Nachteile aufweisen.To recently based as well the detection in automated assays for reasons of sensitivity to enzymatic or fluorimetric method. With the development of proof At the microscopic level, however, it became technically possible to use markers without reinforcement of the marker itself or without signal amplification. consequently it is desirable to develop new reporter genes or markers that are not the above limitations and disadvantages.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Um diese und andere Vorteile zu erreichen und in Übereinstimmung mit dem Zweck der Erfindung, wie hierin ausgeführt und im Großen und Ganzen erläutert, stellt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt ein Verfahren zum Überwachen einer Zielsubstanz in einem biologischen System bereit, umfassend das Bereitstellen eines biologischen Systems mit einer Zielsubstanz, die mit einem blauen Kupferprotein markiert ist. Es werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, und das Signal wird beobachtet oder gemessen. Die Zielsubstanz wird auf Basis des Signals überwacht. Das Überwachungsverfahren kann das Bestimmen des Ortes der Zielsubstanz und/oder das Quantifizieren der Menge der Zielsubstanz in dem biologischen System umfassen.Around Achieve these and other benefits and in accordance with the purpose of the invention as embodied herein and in the big one and whole explained, In one aspect, the present invention provides a method to monitor a target substance in a biological system ready, comprising the provision of a biological system with a target substance, which is marked with a blue copper protein. There are conditions provided that allow the blue copper protein, a signal and the signal is observed or measured. The target substance is monitored based on the signal. The monitoring process may include determining the location of the target substance and / or quantifying the amount of the target substance in the biological system.

Bei einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zum Überwachen einer Zielsubstanz ein Verfahren zur Bestimmung der Cytotoxizität eines Medikaments von Interesse bereit. Die Zielsubstanz, eine Zelle, wird mit einem blauen Kupferprotein markiert und dem Medikament von Interesse ausgesetzt. Die Zelle wird überwacht, und die Cytotoxizität des Medikaments von Interesse wird dadurch bestimmt, ob die Zelle durch das Medikament von Interesse beeinflusst wird.at another embodiment represents the invention using the above-described Method for monitoring a target substance, a method for determining the cytotoxicity of a drug of interest. The target substance, a cell, is labeled with a marked blue copper protein and exposed to the drug of interest. The cell is being monitored and cytotoxicity The drug of interest is determined by whether the cell influenced by the drug of interest.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Markieren eines Proteins von Interesse bereit, umfassend das Fusionieren eines Proteins von Interesse an ein blaues Kupferprotein. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Markieren einer Zelle von Interesse bereit, umfassend das Einführen eines blauen Kupferproteins in die Zelle oder durch Binden eines blauen Kupferproteins an die Membran der Zelle.The The invention further provides a method for labeling a protein of interest, comprising fusing a protein of Interest in a blue copper protein. In a further embodiment the invention provides a method of marking a cell of Interested in embracing the introduction of a blue copper protein into the cell or by binding a blue copper protein to the Membrane of the cell.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung einer Zelle bereit, die ein Protein von Interesse exprimiert, umfassend das Einbringen eines DNA-Moleküls mit einer DNA-Sequenz, die das Protein von Interesse codiert, und eines zusätzlichen DNA-Moleküls mit einer DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, in die Zelle. Dann werden Bedingungen bereitgestellt, die die Expression des blauen Kupferproteins und des Proteins von Interesse erlauben. Es werden zudem Bedingungen bereitgestellt, die es dem Protein erlauben, ein Signal auszusenden. Die Zelle, die das Protein von Interesse exprimiert, wird durch Beobachten oder Messen des Signals des blauen Kupferproteins nachgewiesen.The invention further provides a method of detecting a cell expressing a protein of interest, comprising introducing a DNA molecule with a DNA sequence comprising the protein of Interest encoded, and an additional DNA molecule with a DNA sequence encoding a blue copper protein in the cell. Then, conditions are provided which allow expression of the blue copper protein and the protein of interest. It also provides conditions that allow the protein to send a signal. The cell expressing the protein of interest is detected by observing or measuring the signal of the blue copper protein.

Bei einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Lokalisieren eines Proteins von Interesse in einer Zelle bereit, umfassend das Einbringen eines DNA-Moleküls in die Zelle, das eine DNA-Sequenz umfasst, die das Protein von Interesse codiert, gebunden an eine zusätzliche DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert. Die zwei Sequenzen sind derart verbunden, dass bei dem durch das DNA- Molekül produzierten Protein das Protein von Interesse an das blaue Kupferprotein fusioniert ist. Es werden Bedingungen bereitgestellt, die die Expression des Fusionsproteins erlauben. Es werden ferner Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden. Die Lokalisierung des Fusionsproteins und damit die Lokalisierung des Proteins von Interesse in der Zelle wird durch Beobachten oder Messen des Signals bestimmt.at another embodiment the invention provides a method for localizing a protein of Interest in a cell ready, comprising the introduction of a DNA molecule into the cell, which includes a DNA sequence that contains the protein of Interest encoded, bound to an additional DNA sequence, the coded blue copper protein. The two sequences are connected in such a way in that produced by the DNA molecule Protein fused the protein of interest to the blue copper protein is. Conditions are provided that support the expression of the Allow fusion protein. Conditions are also provided which allow the blue copper protein to send a signal. The localization of the fusion protein and thus the localization The protein of interest in the cell is monitored by or Measuring the signal determines.

Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Screening nach einem Therapeutikum zur Behandlung einer Erkrankung bereit. Eine Zelle, die ein Ziel der Erkrankung ist, wird mit dem blauen Kupferprotein markiert, und es werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem Protein gestatten, ein Signal auszusenden. Ob das Therapeutikum zur Behandlung der Erkrankung wirksam ist, wird durch Überwachen des beobachteten oder gemessenen Signals von der Zelle bestimmt. Bei einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren zum Screening nach einem Therapeutikum zur Behandlung einer viralen oder bakteriellen Infektion verwendet werden, umfassend das Markieren des Virus oder der Bakterien mit einem blauen Kupferprotein. Es werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, und das Signal wird beobachtet oder gemessen. Die Wirksamkeit des Therapeutikums zur Behandlung der Virus- oder Bakterieninfektion wird durch Beobachten oder Messen des Signals von dem Virus oder den Bakterien bestimmt.The Invention also provides a method of screening for a therapeutic for treatment a disease ready. A cell that is a target of the disease is marked with the blue copper protein, and it becomes conditions provided that allow the protein to send a signal. If the therapeutic agent is effective in treating the condition by monitoring of the observed or measured signal from the cell. In a further embodiment can the methods of the invention to screen for a therapeutic for the treatment of a viral or bacterial infection, including labeling of the virus or bacteria with a blue copper protein. It conditions are provided that make it the blue copper protein allow a signal to be sent and the signal is observed or measured. The effectiveness of the therapeutic for treatment The virus or bacterial infection is monitored by observing or measuring the signal from the virus or bacteria.

Die Erfindung zieht auch eine eukaryotische Zelle in Betracht, die eine DNA-Sequenz umfasst, die ein blaues Kupferprotein codiert. Bei einer Ausführungsform ist die eukaryotische Zelle eine Tierzelle, das blaue Kupferprotein ist Azurin, und die DNA-Sequenz umfasst das azu-Gen.The The invention also contemplates a eukaryotic cell having a DNA sequence encoding a blue copper protein. At a embodiment the eukaryotic cell is an animal cell, the blue copper protein is azurin, and the DNA sequence includes the azu gene.

Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung sind teilweise in der nachstehenden Beschreibung erläutert und sind teilweise aus der Beschreibung ersichtlich oder können durch die Ausübung der Erfindung erfahren werden. Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden anhand der Elemente und Kombinationen erkannt und erreicht, die in den beigefügten Ansprüchen besonders herausgestellt worden sind.Further Objects and advantages of the invention are set forth in part in the following Description explained and are partially apparent from the description or may by the exercise of the invention. The objects and advantages of the invention are recognized and achieved by means of the elements and combinations which in the attached claims been specially exposed.

Es sollte selbstverständlich sein, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachstehende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd und für die Erfindung, wie beansprucht, nicht beschränkend sind.It should of course be that both the above general description as well the following detailed description only by way of example and illustrative and for the invention as claimed is not limiting.

Kurze Beschreibung der AbbildungenShort description of pictures

1 zeigt die zur Amplifikation des azu-Gens aus der bakteriellen DNA mittels PCR verwendeten Primer: die 5'-Primer BCP-1C oder BCP-2C und den 3'-Primer BCP-1NC. 1 shows the primers used to amplify the azu gene from the bacterial DNA by PCR: the 5 'primers BCP-1C or BCP-2C and the 3' primer BCP-1NC.

2 ist eine Karte des pLNCX-BCP1-Vektors: 5'-MoMuLV-LTR: 145–733; ψ+ (erweitertes Verpackungssignal): 803–1612; Neomycinresistenzgen (Neor): 1656–2450; Immediate-Early-CMV-Promotor (Pcmv): 2800–3617; BCP1-Gen: 3622–4701; 3'-MoMuLV-LTR: 4128–4720; Ampicillinresistenzgen (B-Lactamase, Ampr): 6023–6865. 2 is a map of the pLNCX-BCP1 vector: 5'-MoMuLV-LTR: 145-733; ψ + (extended packaging signal): 803-1612; Neomycin resistance gene (Neo r ): 1656-2450; Immediate Early CMV Promoter (Pcmv): 2800-3617; BCP1 gene: 3622-4701; 3'-MoMuLV-LTR: 4128-4720; Ampicillin resistance gene (B-lactamase, Amp r ): 6023-6865.

Der Vektor pLNCX-BCP1 wurde bei der Belgian Coordinated Collections of Micro-Organisms an der Universität Gent – Laboratorium voor Moleculaire Biologie – am 3. August 2000 hinterlegt, und die Zugangsnummer lautet LMBP4156.Of the Vector pLNCX-BCP1 was used at the Belgian Coordinated Collections of Micro-Organisms at the University of Ghent - Laboratory voor Moleculaire Biology - am 3 August 2000 and the accession number is LMBP4156.

3A–D zeigen die Western-Blots von Zelllysaten. Die Blots bestätigen die Expression von Azurin. 3A -D show the Western blots of cell lysates. The blots confirm the expression of azurin.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description the invention

Im Folgenden wird auf die erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung detailliert Bezug genommen. Die vorliegende Erfindung stellt unter einem Aspekt ein Verfahren zum Überwachen mindestens einer Zielsubstanz in einem biologischen System bereit, umfassend das Markieren einer Zielsubstanz in dem biologischen System mit einem blauen Kupferprotein.In the following, the preferred embodiments of the invention are described in detail Referenced. The present invention, in one aspect, provides a method for monitoring at least one target substance in a biological system, comprising labeling a target substance in the biological system with a blue copper protein.

Dann werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, und das Signal kann dann beobachtet oder gemessen werden. Das Signal kann dazu verwendet werden, die Zielsubstanz, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Lokalisation oder Position der Zielsubstanz in dem biologischen System und/oder der Menge der Zielsubstanz in dem biologischen System, zu überwachen.Then conditions are provided that make it the blue copper protein allow a signal to be transmitted and the signal can then be observed or measured. The signal can be used to Target substance, including, but not limited on, the localization or position of the target substance in the biological System and / or the amount of the target substance in the biological system, to monitor.

Ein Apo-Metallbindungsprotein, wie hier definiert, ist jedes Protein oder Peptid, das nach dem Binden von einem oder mehreren Metallionen eine nachweisbare Farbe erwirbt oder nach dem Binden eines Metallions oder eines zusätzlichen Metallions die Farbe ändert. Die erhaltene Farbe oder die beobachtete Farbveränderung kann ferner mit der Oxidationsstufe des Metallions variieren. Bei einer Ausführungsform nutzt die Erfindung diese Eigenschaft als Marker zur Analyse eines biologischen Vorgangs, einschließlich jedes Vorgangs innerhalb oder außerhalb von Zellen, aber nicht darauf beschränkt, bei In-vitro-Assays oder zur Beobachtung von Zellen oder Vorgängen in Geweben oder in gesamten Organismen. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Apo-Metallbindungsprotein Gruppen oder Familien von Metall bindenden Proteinen, die nach Bindung an ein Metall eine intensive Farbe oder einen Farbwechsel aufweisen.One Apo-metal binding protein as defined herein is any protein or peptide following binding of one or more metal ions acquires a detectable color or after binding a metal ion or an additional one Metal ions change the color. The resulting color or the observed color change can also be combined with the Oxidation level of the metal ion vary. In one embodiment the invention uses this property as a marker for analyzing a biological process, including every operation within or outside of cells, but not limited to in vitro assays or for observation of cells or processes in tissues or in whole Organisms. In another embodiment, the apo-metal binding protein comprises Groups or families of metal binding proteins after binding on a metal have an intense color or a color change.

Im Gegensatz zu Proteinen, die eine Farbe durch eine enzymatische Reaktion erzeugen, oder Proteinen, die ein Luminophor enthalten, erwirbt ein Apo-Metallbindungsprotein eine nachweisbare Farbe oder Farbveränderung nach dem Binden eines Metallions. So stellen Apo-Metallbindungsproteine, die eine intrinsische, leicht nachweisbare Farbe erwerben, einen neuartigen Marker bereit.in the Unlike proteins that produce a color through an enzymatic reaction or acquires proteins containing a luminophore an apo-metal binding protein a detectable color or color change after binding a Metal ion. Thus, apo-metal binding proteins that are intrinsic, acquire easily detectable color, a novel marker ready.

Apo-Metallbindungsproteine sind eine heterogene Sammlung von Proteinen aus verschiedenen Quellen, einschließlich blauer Kupferproteine in Bakterien und Säugerproteinen, wie Hämoglobin, Katalase und Transferrin. Der hauptsächliche Vorteil der Verwendung von Apo-Metallbindungsproteinen als Marker verglichen mit der Verwendung bestehender Reportergene oder Marker ist die Tatsache, dass sie einfach nachgewiesen werden können, ohne dass ein Bedarf an zusätzlichen Manipulationen oder an der Verwendung teurer und komplizierter Ausrüstung besteht. Da viele dieser Proteine nicht in Säugerzellen vorkommen, sind sie perfekte Marker für die Einführung in solche Zellen (z.B. bei diagnostischen Assays).Apo metal binding proteins are a heterogeneous collection of proteins from different sources, including blue copper proteins in bacteria and mammalian proteins, such as hemoglobin, Catalase and transferrin. The main advantage of using Apo-metal binding proteins as markers compared to use Existing reporter genes or markers is the fact that they are can be easily detected without a need for additional Manipulation or the use of expensive and complicated equipment. Since many of these proteins are not found in mammalian cells, they are they are perfect markers for the introduction in such cells (e.g., in diagnostic assays).

Bisher hat man Apo-Metallbindungsproteine nicht als Marker bei analytischen Tests, diagnostischen Tests oder beim Screening nach Medikamenten verwendet. Ein Patent (U.S.-Patent Nr. 5,210,019) beschreibt die Verwendung von Azurin, einem blauen Kupferprotein, zum Nachweis von Pseudomonas-Bakterien. Diese Bakterien exprimieren jedoch natürlicherweise Azurin, d.h. das Protein wurde in die Bakterien nicht mit der Absicht eingeführt, es als Marker für einen internen oder externen Vorgang zu verwenden. Azurin wird nur zum Nachweis der Anwesenheit der Bakterien als solche verwendet. In ähnlicher Weise offenbart die PCT-Anmeldung WO 99/30730A1 die Verwendung der Metall bindenden Protease Superoxiddismutase, es gibt jedoch keine Offenbarung des Metall bindenden Proteins als ein Reportermolekül oder Marker.So far one has apo-metal binding proteins not as markers in analytical Tests, diagnostic tests or drug screening used. A patent (U.S. Patent No. 5,210,019) describes the Use of Azurine, a blue copper protein, for detection of Pseudomonas bacteria. However, these bacteria naturally express Azurine, i. the protein was not in the bacteria with the intention introduced, it as a marker for to use an internal or external process. Azurin will only used to detect the presence of the bacteria as such. In similar Weise discloses the PCT application WO 99 / 30730A1 the use of the metal-binding protease superoxide dismutase, however, there is no disclosure of the metal binding protein as a reporter molecule or markers.

Das erfindungsgemäße Apo-Metallbindungsprotein ist ein blaues Kupferprotein, ein Derivat oder eine Mutante eines blauen Kupferproteins oder jede Protein- oder Peptidsequenz mit den Kupfer bindenden Eigenschaften einer blauen Kupferproteinsequenz, wie vorstehend beschrieben. In lebenden Zellen übt Kupfer mehrere physiologische Funktionen in Verbindung mit spezifischen metabolischen Proteinen aus, z.B. Teilnahme an Elektronentransferreaktionen, verschiedenen enzymatischen Reaktionen und Transport und Speicherung des Metalls selbst. Kupferproteine und, genauer gesagt, blaue Kupferproteine, bestehen aus einer großen Vielfalt an Proteinen (Familien), gewöhnlich mit einer Farbe, die je nach dem pH und/oder Mutationen in eine andere Farbe geändert werden kann. Kroes, S. J., et al., Eur. J. Biochem. 240(2), 342–351 (1996) und E. Solomon, Chemical Reviews; 1996; 96(7); 2239–2314. Kupferproteine können je nach ihrer biologischen Funktion nach dem Typ des Kupferzentrums, der Zahl an prosthetischen Gruppen und der Sequenzähnlichkeit klassifiziert werden.The Apo-metal binding protein according to the invention is a blue copper protein, a derivative or a mutant of a blue copper protein or any protein or peptide sequence the copper binding properties of a blue copper protein sequence, as described above. In living cells, copper exerts several physiological functions Functions related to specific metabolic proteins out, e.g. Participation in electron transfer reactions, various enzymatic reactions and transport and storage of the metal itself. Copper proteins and, more specifically, blue copper proteins, consist of a great variety at proteins (families), usually with one color, depending on the pH and / or mutations in another Color changed can be. Kroes, S.J., et al., Eur. J. Biochem. 240 (2), 342-351 (1996) and E. Solomon, Chemical Reviews; 1996; 96 (7); From 2239 to 2314. copper proteins can depending on their biological function according to the type of copper center, the number of prosthetic groups and sequence similarity be classified.

Alternativ zu Kupferproteinen können andere Apo-Metallproteine Proteine umfassen, die an Übergangsmetalle, wie Co, Ni, Mn, Zn, Fe, oder ein Alkalimetall, wie Ca, Mg, Na, und K, gebunden sind.alternative to copper proteins other apo-metal proteins Include proteins attached to transition metals, such as Co, Ni, Mn, Zn, Fe, or an alkali metal such as Ca, Mg, Na, and K, are bound.

Bei der vorliegenden Erfindung ist das Apo-Metallbindungsprotein mindestens ein blaues Kupferprotein oder ein Derivat oder eine Mutante eines blauen Kupferproteins. Gemäß der Klassifizierung der Kupferproteine nach ihrem Kupferzentrum bilden die blauen Kupferproteine eine eigene Klasse. In dieser Klasse können sie in drei Gruppen eingeteilt werden: die kleinen blauen Kupferproteine (z.B. Azurine, Pseudoazurine, die Plastocyanin-Familie und die Phytocyanin-Familie), die blauen Oxidasen (z.B. Ascorbatoxidase, Ceruloplasmin und Laccase) und Nitritreduktase.In the present invention, the apo-metal binding protein is at least one blue copper protein or a derivative or mutant of a blue copper protein. According to the classification of copper proteins according to their copper center, the blue copper proteins form their own class. In this class you can They are divided into three groups: the small blue copper proteins (eg azurines, pseudoazurins, the plastocyanin family and the phytocyanin family), the blue oxidases (eg ascorbate oxidase, ceruloplasmin and laccase) and nitrite reductase.

Blaue Kupferproteine, auch als "Typ-1"-Kupferproteine bezeichnet, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, kleine Proteine, die ein einziges Kupferatom binden und die durch ihre sehr intensive Absorption im Bereich von 600 nm, verursacht durch einen Landungstransferübergang von einem Cysteinrest, gekennzeichnet sind. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, gibt es eine Beziehung zwischen dem EPR-Spektrum des blauen Kupferproteins, der relativen Intensität der wichtigen Peaks im UV/VIS-Absorptionsspektrum und der Struktur des aktiven Zentrums. Auf Basis dieser beobachteten Parameter lassen sich die am weitesten verbreitet beobachteten blauen Kupferproteine in vier strukturelle Klaasen unterteilen.Blueness Copper proteins, also referred to as "type 1" copper proteins include, but are not limited on, small proteins that bind a single copper atom and the caused by their very intense absorption in the range of 600 nm through a landing transfer crossing from a cysteine residue. Without adhering to a theory want to tie, there is a relationship between the EPR spectrum of the blue Copper protein, the relative intensity of the important peaks in the UV / VIS absorption spectrum and the structure of the active center. Based on this observed Parameters can be the most widely observed blue Divide copper proteins into four structural clays.

Die erste Klasse besteht aus den klassischen blauen Kupferproteinen mit dem am besten untersuchten Beispiel Plastocyanin. Hier bilden der Cystein- und die zwei Histidinreste eine Ebene mit dem leicht darüber liegenden Cu(II)-Atom. Der SCys-Cu(II)-Abstand ist sehr kurz (±2,1 Ǻ). Axial zu dieser Ebene befindet sich der vierte Rest Methionin in einem großen Abstand (±2,9 Ǻ). Die Gesamtstruktur des aktiven Zentrums ist verdreht tetraedrisch oder trigonal (C3ν).The first class consists of the classical blue copper proteins with the best studied example of plastocyanin. Here, the cysteine and the two histidine residues form a plane with the slightly overlying Cu (II) atom. The S Cys -Cu (II) distance is very short (± 2.1 Ǻ). Axially to this level is the fourth remainder of methionine at a large distance (± 2.9 Ǻ). The overall structure of the active site is twisted tetrahedral or trigonal (C 3ν ).

Eine zweite Gruppe von blauen Kupferproteinen beinhaltet Proteine, in denen Verknüpfungen mit fünf Resten koordiniert sind: die Azurine. Die zusätzliche Bindung wird von einem Carbonyl-Sauerstoff gebildet, der an das Kupfer an der Methionin gegenüberliegenden Seite bindet. Der Methioninrest befindet sich in einer etwas größeren Entfernung als im Plastocyanin (±3,1 Ǻ). Die Carbonylgruppe ist etwa 3,0 Ǻ entfernt. Das EPR-Spektrum der Proteine, die zur ersten und zweiten Klasse gehören, ist vom Axialtyp, und sie zeigen nur einen intensiven Peak bei 600 nm im Absorptionsspektrum.A second group of blue copper proteins includes proteins, in which links with five leftovers coordinated: the azurines. The additional bond is from a Carbonyl oxygen is formed, which binds to the copper at the methionine opposite Page binds. The methionine residue is located at a slightly greater distance as in plastocyanin (± 3.1 Ǻ). The carbonyl group is about 3.0 Ǻ away. The EPR spectrum the proteins belonging to the first and second class is of the axial type, and they only show an intense peak at 600 nm in the absorption spectrum.

Eine dritte Klasse von blauen Kupferproteinen umfasst Proteine, welche die gleichen vier Koordinationsverbindungen wie im Plastocyanin aufweisen, die aber in einer mehr verdrehten Konformation angeordnet sind. Die SCys-Cu(II)-Bindungslänge nimmt gleichzeitig mit der Abnahme der SMet-Cu(II)-Bindungslänge zu. Das EPR-Spektrum ist rhombisch, und es gibt einen Anstieg des Absorptionsbereichs bei 460 nm. Eine vierte Klasse von blauen Kupferproteinen wird von Proteinen gebildet, die eine axiale Verknüpfung mit einem anderen Rest als Methionin aufweisen.A third class of blue copper proteins comprises proteins having the same four coordination compounds as in the plastocyanin, but arranged in a more twisted conformation. The S Cys -Cu (II) bond length increases simultaneously with the decrease in S Met -Cu (II) bond length. The EPR spectrum is rhombic, and there is an increase in absorbance at 460 nm. A fourth class of blue copper proteins is formed by proteins that are axially linked to a residue other than methionine.

Obwohl es ein deutliches Ausmaß an Divergenz in der Sequenz der blauen Kupferproteine gibt, sind die Kupferligandenstellen bei vielen der Proteine konserviert und zeigen das folgende Muster: [GA]-x(0, 2)-[YSA]-x(0, 1)-[VFY]-x-C-x(1, 2)-[PG]-x(0, 1)-H-x(2, 4)-[MQ]. Siehe http://bess.u-strasbg.fr/BioInfo/ Prosite/00174.pdoc. Eine spezielle, verdreht-trigonal-planare Anordnung von zwei Histidinliganden und einem Cysteinliganden um das Kupfer verursacht die ganz besonderen elektronischen Eigenschaften des Metallzentrums: eine intensive blaue Farbe, die 100-mal intensiver ist als bei den meisten anorganischen Kupferkomplexen (Cys-S-Cu-Ladungstransfer), axiale EPR-Spektren mit kleinen Hyperfein-Kopplungskonstanten und hohen Redoxpotenzialen. Das Apo-Metallbindungsprotein für die Verwendung bei der Ausführung der Erfindung ist ein blaues Kupferprotein mit diesen Eigenschaften.Even though it's a significant amount Divergence in the sequence of blue copper proteins are the Conserved and show copper ligand sites in many of the proteins the following pattern: [GA] -x (0, 2) - [YSA] -x (0, 1) - [VFY] -x-C-x (1, 2) - [PG] -x (0, 1) -H-x (2, 4) - [MQ]. See http://bess.u-strasbg.fr/BioInfo/Prosite/00174.pdoc. A special twisted trigonal planar arrangement of two histidine ligands and a cysteine ligand around the copper causes the very special electronic properties of the metal center: an intense blue color that is 100 times more intense than most inorganic ones Copper complexes (Cys-S-Cu charge transfer), axial EPR spectra with small Hyperfine coupling constants and high redox potentials. The apo-metal binding protein for the Use in the execution The invention is a blue copper protein with these properties.

Die bekanntesten Mitglieder dieser Proteinklasse sind Plastocyanine aus Pflanzen-Chloroplasten, die Elektronen mit Cytochrom c6 austauschen, und die entfernt verwandten bakteriellen Azurine, die Elektronen mit Cytochrom 551 austauschen. Andere blaue Kupferproteine sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf Amicyanin aus Bakterien, wie Methylobacterium extorquens oder Thiobacillus versatus, das auf Methylamin wachsen kann; die Auracyanine A und B aus Chloroflexus aurantiacus; blaues Kupferprotein aus Alcaligenes faecalis; Cupredoxin (CPC) aus Gurkenschalen, Cusacyanin (basisches blaues Protein, Plantacyanin, CBP) aus Gurke; Halocyanin aus Natrobacterium pharaonis, ein membranassoziiertes Kupfer bindendes Protein; Pseudoazurin aus Pseudomonas; Rusticyanin aus Thiobacillus ferrooxidans; Stellacyanin aus dem Japanischen Lackbaum; Umecyanin aus Meerrettichwurzeln und das Allergen Ra3 von Ambrosie. Garret T. P. J., et al., J. Biol. Chem. 259: 2822–2825 (1984); Ryden L. G. & Hunt L. T., J. Mol. Evol. 36: 41–66 (1993); McManus J. D., et al., J. Biol. Chem. 267: 6531–6540 (1992); Mann K., et al., FEBS Lett. 314: 220–223 (1992); Mattar S., et al., J. Biol. Chem. 269: 14939–14945 (1994); Yano T., et al., FEBS Lett. 288: 159–162 (1991).The The best-known members of this protein class are plastocyanines from plant chloroplasts that exchange electrons with cytochrome c6, and the distantly related bacterial azurines that carry electrons Replace cytochrome 551. Other blue copper proteins include, but are not limited on amicyanine from bacteria, such as Methylobacterium extorquens or Thiobacillus versatus, which can grow on methylamine; the auracyanine A and B from Chloroflexus aurantiacus; blue copper protein from Alcaligenes faecalis; Cupredoxin (CPC) from cucumber peels, cusacyanin (basic blue protein, plantacyanin, CBP) from cucumber; Halocyanin from Natrobacterium pharaonis, a membrane-associated copper-binding protein; pseudoazurin from Pseudomonas; Rusticyanine from Thiobacillus ferrooxidans; stellacyanin from the Japanese lacquer tree; Umecyanin from horseradish roots and the allergen Ra3 of ragweed. Garret T.P.J., et al., J. Biol. Chem. 259: 2822-2825 (1984); Ryden L.G. & Hunt L.T., J. Mol. Evol. 36: 41-66 (1993); McManus J.D., et al., J. Biol. Chem. 267: 6531-6540 (1992); Mann K., et al., FEBS Lett. 314: 220-223 (1992); Mattar S., et al. J. Biol. Chem. 269: 14939-14945 (1994); Yano T., et al., FEBS Lett. 288: 159-162 (1991).

Das Signal, das von einem blauen Kupferprotein ausgesendet wird, kann jeder Wechsel oder jeder Erwerb von Farbe oder Veränderung in der Intensität von blauer Farbe sein. Farbe, wie hier verwendet, ist als jedes chromatische Signal definiert. Bei einer Ausführungsform liegt die beobachtete oder bestimmte Farbe im sichtbaren oder ultravioletten Wellenlängenbereich. Farbe, wie hier definiert, kann auch ein Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignal sein. Das Signal kann durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel beobachtet oder gemessen werden, einschließlich, sichtbarer Bestimmung mit dem bloßen Auge, einem Mikroskop, einer Photonenröhre oder Diode, aber nicht darauf beschränkt. Bei einer Ausführungsform werden die Frequenz, Dauer, Intensität und/oder Lokalisation des Signals zu einem einzigen Zeitpunkt oder als eine Funktion der Zeit gemessen oder beobachtet.The signal emitted by a blue copper protein can be any change or acquisition of color or change in intensity of blue color. Color, as used here, is defined as any chromatic signal. In one embodiment, the observed or particular color is in the visible or ultraviolet wavelength range. Color, as defined herein, may also be a fluorescent or luminescent signal. The signal may be observed by any means known in the art or including, but not limited to, the visible eye, microscope, photon tube, or diode. In one embodiment, the frequency, duration, intensity, and / or localization of the signal are measured or observed at a single time or as a function of time.

Wie hier definiert, kann ein biologisches System jedes biologische oder biochemische In-vivo- oder In-vitro-System sein, einschließlich jeder Zelle oder Zellkultur, jedes Virus, aller Bakterien, jeder Pflanze oder jedes Tiers oder jedes Teils oder simulierten Systems davon, aber nicht darauf beschränkt. Bei der Ausführung der Erfindung kann die Zielsubstanz aus jeder Zelle, wie jeder bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle, jedem Gewebe, jedem Virus oder jedem Protein ausgewählt werden. Geeignete Tierzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Vero-Zellen, HeLa-Zellen, Cos-Zellen, CV1-Zellen und verschiedene primäre Säugerzellen. Bei einer Ausführungsform ist die bakterielle Zelle Escherichia coli. Die Zielsubstanz kann auch ein Medikament oder eine therapeutische Behandlung sein, das/die markiert wird, um seine/ihre Aktivität oder Funktion in vivo oder in vitro zu verfolgen. Bei einer Ausführungsform ist das blaue Kupferprotein, z.B. durch kovalente oder ionische Bindung, mit einem Gewebe, einer Zelle und/oder einem Protein verknüpft, oder ein Fusionsprotein zwischen einem oder mehreren Proteinen von Interesse und einem oder mehreren blauen Kupferproteinen wird hergestellt.As defined here, a biological system can be any biological or biochemical in vivo or in vitro system be inclusive every cell or cell culture, every virus, every bacteria, every one Plant or any animal or part or simulated system but not limited to this. In the execution of the Invention can remove the target substance from each cell, such as each bacterial, Mushroom, plant or Animal cell, any tissue, virus or protein. Suitable animal cells include, but are not limited to Vero cells, HeLa cells, Cos cells, CV1 cells and various primary Mammalian cells. In one embodiment is the bacterial cell Escherichia coli. The target substance can also be a drug or therapeutic treatment that is tagged to his / her activity or function in vivo or to follow in vitro. In one embodiment, the blue copper protein is e.g. by covalent or ionic bonding, with a tissue, a Cell and / or a protein linked, or a fusion protein between one or more proteins of interest and one or more several blue copper proteins are produced.

Eine Zelle kann auch durch Einführen eines blauen Kupferproteins in die Zelle oder durch Transfizieren der Zelle mit einem DNA-Molekül, das ein blaues Kupferprotein codiert, markiert werden. Ein blaues Kupferprotein kann auch an die Membran einer Zelle, entweder an der Innen- oder Außenseite der Zellwand, gebunden oder daran verankert werden. Das blaue Kupferprotein kann einer Zelle, einem Gewebe oder Protein von Interesse in vivo oder in vitro bereitgestellt werden.A Cell can also be introduced by insertion a blue copper protein into the cell or by transfecting the Cell with a DNA molecule, which encodes a blue copper protein. A blue one Copper protein can also bind to the membrane of a cell, either the inside or outside the cell wall, bound or anchored to it. The blue copper protein may be a cell, a tissue or protein of interest in vivo or provided in vitro.

Zur Ausführung der Erfindung gehört auch eine eukaryotische Zelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert. Die eukaryotische Zelle kann eine Tierzelle sein, und bei einer Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz das azu-Gen.to execution belongs to the invention also a eukaryotic cell comprising a DNA sequence containing a coded blue copper protein. The eukaryotic cell can be one Animal cell, and in one embodiment, the DNA sequence comprises the azu gene.

Bei einer Ausführungsform kann das blaue Kupferprotein als Reportergen verwendet werden. Das Reportergen kann in eine Zelle eingeführt werden, und die Zelle kann ein DNA-Molekül mit einem regulatorischen Element aus einem anderen Gen als ein Gen, das ein blaues Kupferprotein codiert, umfassen, das an eine DNA-Sequenz funktionsfähig gebunden ist, die ein blaues Kupferprotein codiert. Wie hier verwendet, ist "ein regulatorisches Element" eines Gens die DNA-Sequenz, die zur Expression des Gens notwendig ist. Bei dieser Erfindung bedeutet die Bezeichnung "funktionsfähig gebunden", dass nach einer solchen Verknüpfung das regulatorische Element die Expression der verknüpften DNA-Sequenz steuern kann. Ein Gen, das ein blaues Kupferprotein codiert, beinhaltet DNA-Moleküle, die für Polypeptidanaloga, Fragmente oder Derivate antigener Polypeptide codieren, die sich von natürlich vorkommenden Formen hinsichtlich der Identität oder Lokalisation von einem oder mehreren Aminosäureresten unterscheiden (Deletionsanaloga, die weniger als alle für das Protein angegebenen Reste enthalten, Substitutionsanaloga, wobei einer oder mehrere angegebene Reste durch andere Reste ersetzt sind, und Additionsanaloga, wobei einer oder mehrere Aminosäurereste zu einem endständigen oder mittleren Abschnitt der Polypeptide hinzugefügt worden sind) und die einige oder alle Eigenschaften der natürlich vorkommenden Formen besitzen.at an embodiment For example, the blue copper protein can be used as a reporter gene. The Reporter gene can be introduced into a cell, and the cell can a DNA molecule with a regulatory element from a gene other than one Gene encoding a blue copper protein comprises that attached to a DNA sequence functioning which encodes a blue copper protein. As used here is "a regulatory Element of a gene the DNA sequence necessary for the expression of the gene. at of this invention means the term "operably linked" that after a such linkage the regulatory element is the expression of the linked DNA sequence can control. A gene encoding a blue copper protein includes DNA molecules that for polypeptide analogs, Encode fragments or derivatives of antigenic polypeptides which are of course occurring forms regarding the identity or localization of one or more amino acid residues distinguish (deletion analogues that are less than all for the protein contain residues, substitution analogues, wherein one or several specified radicals are replaced by other radicals, and addition analogs, wherein one or more amino acid residues to a terminal or middle section of the polypeptides are) and some or all of the features of the naturally occurring Own forms.

Diese DNA-Moleküle beinhalten: das Einfügen von Codons, die für die Expression durch ausgewählte Nichtsäugerwirte "bevorzugt" sind; die Bereitstellung von Spaltstellen für Restriktionsendonukleaseenzyme und die Bereitstellung von zusätzlichen Anfangs-, End-, oder Mittel-DNA-Sequenzen, welche die Konstruktion leicht exprimierbarer Vektoren erleichtern.These DNA molecules include: the insertion of codons for the expression is "preferred" by selected non-mammalian hosts; the provision from cleavage sites for Restrictionendonukleaseenzyme and the provision of additional Initial, final, or middle DNA sequences, which make the construction easy facilitate expressible vectors.

Bei einer Ausführungsform kann das blaue Kupferprotein an einen Promoter gebunden werden, der von sich aus auf einen intrazellulären Vorgang anspricht. Jeder Einfluss (z.B. durch ein zu der Zelle hinzugefügtes Medikament) auf diesen Vorgang beeinflusst die Expressionsrate des Metall bindenden Proteins und kann folglich durch Messen der Farbintensität der Zelle überwacht werden.at an embodiment the blue copper protein can be bound to a promoter, which, of itself, responds to an intracellular process. Everyone Influence (e.g., by a drug added to the cell) on this Process influences the expression rate of the metal-binding protein and thus can be monitored by measuring the color intensity of the cell become.

Ein Durchschnittsfachmann ist in der Lage, je nach dem gewählten blauen Kupferprotein und der beabsichtigten Anwendung die Bedingungen zu bestimmen, die bereitgestellt werden müssen, um es einem blauen Kupferprotein zu ermöglichen, ein Signal auszusenden. Die genauen Bedingungen können Variation des pH-Werts, der Ionenstärke, des intrazellulären Redoxpotenzials, das Bereitstellen eines Metalls für die Bindung an blaues Kupferprotein und das Ändern der Ladung des Metalls umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.One Average expert is able, depending on the chosen blue Copper protein and the intended use of the conditions determine which must be provided to a blue copper protein to enable to send a signal. The exact conditions may vary pH, ionic strength, of the intracellular Redox potentials, providing a metal for binding on blue copper protein and changing The charge of the metal include, but are not limited to.

Um beispielsweise Bedingungen bereitzustellen, die es Azurin gestatten, ein Signal auszusenden, z.B. blaue Farbe, sollten zwei Bedingungen erfüllt sein: (1) Azurin muss Kupfer entweder vor oder nach der Markierung der Zielsubstanz binden, und (2) das Protein muss im oxidierten Zustand vorliegen. Außerdem müssen diese Bedingungen mit den In-vivo- oder Kulturbedingungen des biologischen Systems kompatibel sein. Freies Cu2+ ist zum Beispiel sogar in relativ niedrigen Konzentrationen für die Zellen toxisch.For example, to provide conditions that allow azurine to emit a signal, eg, blue color, two conditions should be met: (1) azurine must bind copper either before or after labeling the target substance, and (2) the protein must be in the oxidized state available. In addition, these conditions must be compatible with the in vivo or culture conditions of the biological system. Free Cu 2+ , for example, is toxic to the cells even at relatively low concentrations.

Azurin bindet Kupfer mit hoher Affinität (die Bindung von Kupfer ist thermodynamisch begünstigt, wobei die Bindungsenergie von Cu(II) die von anderen Übergangsmetallionen übersteigt), und der entstandene Kupfer-Protein-Komplex ist sehr stabil. Daher sollten niedrige, nicht-toxische Mengen von Cu2+ im Medium (in einem Bereich von 0,5 bis 1 μM) eine irreversible Bindung des Metalls an Azurin gestatten. Bei einer Ausführungsform kann der Kupfertransport innerhalb eines biologischen Systems durch Trafficking-Proteine erfolgen, die das Cu2+ zu verschiedenen Kupfer enthaltenden Oxidasen in den vesikulären Systemen befördern.Azurine binds copper with high affinity (the binding of copper is thermodynamically favored, with the binding energy of Cu (II) exceeding that of other transition metal ions), and the resulting copper-protein complex is very stable. Therefore, low non-toxic levels of Cu 2+ in the medium (in a range of 0.5 to 1 μM) should allow irreversible binding of the metal to azurin. In one embodiment, copper transport within a biological system may be by trafficking proteins that carry the Cu 2+ to various copper-containing oxidases in the vesicular systems.

Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, ist die intensive blaue Farbe des Azurin eine Eigenschaft der oxidierten Cu(II)-Form, die eine starke sichtbare Absorptionsbande bei 628 nm (ε = 5700 M–1cm–1) aufweist, während die Cu(I)-Form farblos ist. Das oxidierte Azurin ist die stabilste Form, aber das Reduktionspotenzial der Cu-Komplexe wird durch das Medium und die Ionenstärke stark beeinflusst, und die blaue Farbe des Cu(II)-Komplex verblasst mit sinkendem pH. Folglich kann bei einer Ausführungsform eine Veränderung des Mediums oder der Ionenstärke des Mediums die Bedingung liefern, die es dem blauen Kupferprotein gestattet, ein Signal auszusenden.Without wishing to be bound by theory, the intense blue color of the azurin is a property of the oxidized Cu (II) form, which has a strong visible absorption band at 628 nm (ε = 5700 M -1 cm -1 ), while the Cu (I) form is colorless. The oxidized azurin is the most stable form, but the reduction potential of the Cu complexes is strongly influenced by the medium and the ionic strength, and the blue color of the Cu (II) complex fades with decreasing pH. Thus, in one embodiment, a change in the medium or ionic strength of the medium can provide the condition that allows the blue copper protein to emit a signal.

Bei einer weiteren Ausführungsform gestattet der physiologische pH des Zellcytoplasmas die Bildung des funktionellen Proteins. Da das Reduktionspotenzial der Zellumgebung jedoch recht niedrig ist und damit die farblose Cu(I)-Form begünstigt, wird bei einer Ausführungsform eine Zelle am Endpunkt des Assays zum Nachweis der blauen Farbe des exprimierten Azurins in einem Lysispuffer mit kompatiblem pH, kompatibler Kupferkonzentration und kompatiblem Reduktionspotential lysiert.at a further embodiment The physiological pH of the cell cytoplasm allows the formation of the functional protein. Because the reduction potential of the cell environment however, is quite low and thus favors the colorless Cu (I) form, is in one embodiment one cell at the end point of the blue color detection assay of the expressed azurin in a lysis buffer of compatible pH, compatible copper concentration and compatible reduction potential lysed.

Bei einer anderen Ausführungsform kann das exprimierte blaue Kupferprotein an spezifische "oxidative" Organellen, wie Mitochondrien, Post-Golgi-Vesikel und Peroxisomen, gelenkt werden. Gemäß der biologischen Rolle von Azurin sind zum Beispiel die Mitochondrien die geeigneten Organellen zur Expression des Proteins. Azurin gehört zu einer Familie von Proteinen, die in der Atmungskette denitrifizierender Bakterien und Pflanzen als Elektronentransfermittel fungieren. Ihre Rolle ist es, Elektronen zwischen verschiedenen Oxidasen (z.B. Cytochrom c und Cytochromoxidase, ATPasen) zu transportieren. Die Zielsteuerung der Proteine an die Mitochondrien kann durch Platzierung eines mitochondrialen Zielsteuerungssignals vor die das azu-Gen codierende Sequenz einfach erreicht werden.at another embodiment The expressed blue copper protein can bind to specific "oxidative" organelles, such as Mitochondria, post-Golgi vesicles and peroxisomes. According to the biological role of Azurin, for example, the mitochondria are the appropriate organelles for the expression of the protein. Azurin belongs to a family of proteins, the denitrifying bacteria and plants in the respiratory chain act as an electron transfer agent. Your role is to electrons between different oxidases (e.g., cytochrome c and cytochrome oxidase, ATPases). The targeting of proteins to the Mitochondria can by placing a mitochondrial targeting signal before the azu gene coding sequence can be easily achieved.

Eine Zielsteuerung von Azurin an die Mitochondrien hat einen zusätzlichen Vorteil auf die Konzentration des exprimierten Proteins. Obwohl die Expression des pLNCX-BCP1/2-Konstrukts durch den starken konstitutiven CMV-Promotor induziert wird, kann die Menge an Azurin in einigen Systemen für einen effizienten Nachweis der blauen Farbe unzureichend sein, weil es keine enzymatische Amplifikation des Signals (= der blauen Farbe) gibt. Die Zielsteuerung der Proteine an die Mitochondrien konzentriert die blaue Farbe, was einen präziseren Nachweis ermöglichen sollte. Die Proteinausbeute kann durch Platzierung eines Translationsenhancers unmittelbar stromaufwärts der codierenden Sequenz von Azurin ebenfalls erhöht werden. Auf diese Weise können bis zu fünffach höhere Expressionsspiegel erreicht werden. Infolge von Zielsteuerung und verstärkter Expression sollten die mitochondrialen blauen "Pixel" beispielsweise mit einem Elektronenmikroskop, einem konfokalen Mikroskop, einer Farbkamera oder mit dem Tibotec-Multisampling-Mikroskop leicht nachzuweisen und zu messen sein, wie im U.S.-Patent, Veröffentlichungsnr. US 2003/0142398, beschrieben.A Targeting of azurin to the mitochondria has an additional Advantage on the concentration of the expressed protein. Even though the expression of the pLNCX-BCP1 / 2 construct by the strong constitutive CMV promoter can induce the amount of azurin in some Systems for efficient detection of the blue color will be inadequate because there is no enzymatic amplification of the signal (= the blue color) gives. The targeting of proteins is focused on the mitochondria the blue color, which makes it more precise Enable proof should. The protein yield can be determined by placing a translational enhancer immediately upstream the coding sequence of azurin are also increased. In this way can up to five times higher Expression levels can be achieved. As a result of targeting and reinforced For example, the mitochondrial blue "pixels" should be expressed with an electron microscope, a confocal microscope, a color camera or with the Tibotec multisampling microscope be easily detected and measured as described in U.S. Patent, Pub. US 2003/0142398.

Es gibt zahllose Anwendungen, bei denen die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen angewendet werden können. Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung zum Beispiel ein Verfahren zum Nachweis mindestens einer Zelle, die das Protein von Interesse exprimiert, bereit. Ein DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz, die ein oder mehrere Protein(e) von Interesse codiert, und ein zusätzliches DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz, die ein oder mehrere blaue Kupferprotein(e) codiert, können in die Zelle eingeführt werden. Durch Bereitstellen von Bedingungen, die es dem blauen Kupferprotein erlauben, ein Signal auszusenden, kann man die Zelle, die das Protein von Interesse exprimiert, durch Beobachten oder Messen des Signals des blauen Kupferproteins nachweisen. Das DNA-Molekül und das zusätzliche DNA-Molekül können verknüpft sein.It There are countless applications involving the methods of the invention and compositions can be applied. In one embodiment For example, the invention provides a method for detecting at least a cell expressing the protein of interest. One DNA molecule with a DNA sequence containing one or more protein (s) of interest coded, and an additional one DNA molecule with a DNA sequence encoding one or more blue copper protein (s), can be introduced into the cell. By providing conditions that allow the blue copper protein allow one to send a signal, one can see the cell containing the protein of interest, by observing or measuring the signal of the blue copper protein. The DNA molecule and the extra DNA molecule can be linked.

Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Lokalisierung mindestens eines Proteins von Interesse in einer Zelle bereit. Hier wird ein DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfasst, die mindestens ein Protein codiert, verknüpft mit einer zusätzlichen DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, in eine Zelle eingeführt. Die Sequenzen sind derart verknüpft, dass in dem durch das DNA-Molekül produzierten Protein mindestens ein Protein von Interesse, fusioniert mit dem blauen Kupferprotein, vorliegt. Der Ort des Fusionsproteins kann aus dem Signal des exprimierten Fusionsproteins bestimmt werden, wobei auch das Protein in der Zelle lokalisiert wird.In another embodiment, the invention provides a method for localizing at least one protein of interest in a cell. Here, a DNA molecule comprising a DNA sequence, which encodes at least one protein linked to an additional DNA sequence encoding a blue copper protein, introduced into a cell. The sequences are linked such that at least one protein of interest fused to the blue copper protein is present in the protein produced by the DNA molecule. The location of the fusion protein can be determined from the signal of the expressed fusion protein, whereby the protein is also localized in the cell.

Die Erfindung umfasst die Verwendung dieser Proteine oder Peptide bei Medikamentenentdeckungstechnologien und diagnostischen Tests. Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Medikament oder eine Behandlung bereit, das/die unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren entdeckt, identifiziert oder entwickelt wurde.The The invention includes the use of these proteins or peptides in Drug discovery technologies and diagnostic tests. at an embodiment the invention provides a medicament or a treatment, discovered using the methods described herein, was identified or developed.

Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere in Hochdurchsatztest- oder -auswertungsvorrichtungen einsetzbar. Die Erfindung kann auch beim Hochdurchsatzscreening nach Medikamenten verwendet werden. Auf diesem Gebiet wird die Screening-Geschwindigkeit als einer der wichtigsten Flaschenhälse bei dem Verfahren zur Medikamentenentdeckung betrachtet. Eine Vereinfachung des Nachweises des Reporters oder der Markierung ist eine Weise, das Screeningverfahren zu beschleunigen. Die blauen Kupferproteine sind für diesen Zweck ideal. Es besteht keine Notwendigkeit an zusätzlichen Manipulationen für den Nachweis, und sie könnten somit in homogenen Assays verwendet werden, wodurch sie für eine Automatisierung zugänglich werden. Die Tatsache, dass kein Bedarf an komplizierter und teurer Nachweisausrüstung besteht, ist ein weiterer wichtiger direkter Vorteil.The inventive method are especially in high-throughput testing or evaluation devices used. The invention can also be used in high-throughput screening to be used after medication. In this area, the screening speed is called one of the most important bottlenecks considered in the drug discovery process. A simplification proof of the reporter or marker is a way speed up the screening process. The blue copper proteins are For this Purpose ideal. There is no need for additional Manipulations for the proof and they could thus being used in homogeneous assays, thereby allowing for automation accessible become. The fact that no need for more complicated and expensive detection equipment is another important direct benefit.

Es liegt innerhalb der erfindungsgemäßen Praxis, einen aus zahlreichen Reaktionsvertiefungen zusammengesetzten Probenständer oder festen Träger herzustellen, so dass jede Reaktion von jeder anderen isoliert bleibt. Gleichzeitiges Überführung eines oder mehrerer Reagenzien in die Reaktionsvertiefungen kann dann durch eine der vielen Techniken erfolgen, die auf dem Fachgebiet der Hochdurchsatzanalyse verwendet werden.It lies within the practice of the invention, one of numerous Produce reaction wells composite sample stand or solid support, so that each reaction remains isolated from each other. Simultaneous transfer of a or more reagents in the reaction wells can then done by one of the many techniques that are in the field high-throughput analysis.

Ein oder mehrere der Inhalte jeder der Reaktionsvertiefungen können abgewandelt werden. Bei einer Ausführungsform enthält zum Beispiel jede Reaktionsvertiefung das gleiche biologische System und die gleiche, mit blauem Kupferprotein markierte Zielsubstanz. Dann wird jedoch ein Medikament zu jeder Reaktionsvertiefung gegeben. Die Reaktionsvertiefungen können einen Array bilden oder andere Mittel zur Identifizierung oder Zuweisung jedes Kompartiments einsetzen. Die Aktivität jeder Reaktion kann dann aus der nachgewiesenen Menge an Signal von dem blauen Kupferprotein automatisch bestimmt und aufgezeichnet werden. Andere Ausführungsformen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Variieren der Konzentration einer oder mehrerer Komponenten.One or more of the contents of each of the reaction wells may be modified become. In one embodiment contains for example, each reaction well the same biological system and the same target substance labeled with blue copper protein. Then, however, a drug is added to each reaction well. The reaction wells can form an array or other means of identification or assignment use each compartment. The activity of each reaction can then from the detected amount of signal from the blue copper protein automatically determined and recorded. Other embodiments include, but are not limited to on varying the concentration of one or more components.

Es gibt zahlreiche Verfahren zur Handhabung eines hohen Durchsatzes, z.B. das Analysieren einer großen Anzahl von Proben in einem verhältnismäßig kurzen Zeitraum. Jedes verfügbare Verfahren zur Hochdurchsatzanalyse kann auf die erfindungsgemäßen Verfahren. Beispiele sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf: U.S.-Patent Nr. 5,985,215 von Sakazume et al., betitelt Analyzing Apparatus Having a Function Pipette Samples; U.S.-Patent Nr. 6,046,056 von Parce et al., betitelt High Throughput Screening Assay Systems in Microscale Fluidic Devices; WO 00/14540 von Pauwels et al., betitelt Method For the Rapid Screening of Analytes; WO 99/30154 von Beutel et al., betitelt Continuous Format High Throughput Screening; und WO 99/67639 von Wada et al., betitelt High Throughput Methods, Systems and Apparatus for Performing Cell Based Screening Assays.It There are numerous methods for handling high throughput, e.g. analyzing a big one Number of samples in a relatively short time Period. Any available Methods for high throughput analysis may be based on the methods of the invention. Examples include, but are not limited to, U.S. Patent No. 5,985,215 by Sakazume et al., entitled Analyzing Apparatus Having a Function Pipette samples; U.S. Patent No. 6,046,056 to Parce et al., Entitled High Throughput Screening Assay Systems in Microscale Fluidic Devices; WO 00/14540 to Pauwels et al., Entitled Method For the Rapid Screening of analytes; WO 99/30154 by Beutel et al., Entitled Continuous Format High Throughput Screening; and WO 99/67639 to Wada et al., titled High Throughput Methods, Systems and Apparatus for Performing Cell Based Screening Assays.

Bei einer spezifischen Ausführungsform können blaue Kupferproteine als Reporter bei diagnostischen Tests verwendet werden, wie Medikamentensensitivitätsanalysen, die gemäß WO 97/27480 durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen eines Therapeutikums zur Behandlung einer Erkrankung bereit, umfassend das Markieren mindestens einer Zelle, die ein Ziel der Erkrankung ist, mit einem blauen Kupferprotein. Ob das Therapeutikum zur Behandlung der Erkrankung wirksam ist, wird durch Überwachen des beobachteten oder gemessenen Signals von dem blauen Kupferprotein und somit der Zelle bestimmt.at a specific embodiment can blue copper proteins used as reporters in diagnostic tests such as drug sensitivity analyzes, according to WO 97/27480 carried out become. In one embodiment the invention provides a method of screening a therapeutic agent to treat a disease comprising labeling at least one cell that is a target of the disease with one blue copper protein. Whether the therapeutic for the treatment of the disease is effective, by monitoring the observed or measured signal from the blue copper protein and thus the cell determined.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screenen eines Therapeutikums zur Behandlung einer Virus- oder Bakterieninfektion bereit. Das Virus oder die Bakterien wird/werden mit einem blauen Kupferprotein markiert, und es werden Bedingungen bereitgestellt, die es dem blauen Kupfersignal gestatten, ein Signal auszusenden. Ob das Therapeutikum zur Behandlung der Virus- oder Bakterieninfektion wirksam ist, wird durch Überwachen des beobachteten oder gemessenen Signals von dem Virus bestimmt.The The invention also provides a method for screening a therapeutic agent ready for the treatment of a virus or bacterial infection. The Virus or bacteria is / are marked with a blue copper protein, and conditions are provided that allow the blue copper signal allow to send a signal. Whether the therapeutic for treatment The virus or bacterial infection is effective by monitoring of the observed or measured signal from the virus.

Bei einer Ausführungsform ist das Virus das HIV-Virus, und die blauen Kupferproteine werden zum Screenen von Medikamenten verwendet, die gegen HIV wirksam sind. Zum Beispiel kann das Gen, das für dieses Protein codiert, mit einem konstitutiv aktiven Promotor einer CD4+-Zelle funktionsfähig verbunden sein. Wenn das Medikament gegen das Virus inaktiv ist, töten die Zugabe des Medikaments und des HIV-Virus zu einer CD4+-Zelle diese Zelle, weil der Virus in der Lage ist, in die Zelle einzudringen und sie abzutöten. Die Zelle exprimiert das Metall bindende Protein nicht mehr und verliert ihre Farbe. Wenn das Medikament gegen HIV wirksam ist, kann das Virus die Zelle nicht abtöten, und die Zelle behält ihre Farbe.In one embodiment, the virus is the HIV virus, and the blue copper proteins are used to screen for drugs effective against HIV. For example, the gene encoding this protein may be operably linked to a constitutively active promoter of a CD4 + cell. If the drug is inactive against the virus, adding the drug and the HIV virus to a CD4 + cell kills that cell because the virus is able to invade and kill the cell. The cell no longer expresses the metal-binding protein and loses its color. If the drug is effective against HIV, the virus can not kill the cell and the cell retains its color.

Die Cytotoxizität von Medikamenten kann auch durch Verwendung dieser neuen Marker bestimmt werden. In diesem Fall kann das Gen, das für das blaue Kupferprotein codiert, mit einem konstitutiv aktiven Promotor funktionsfähig verbunden und in eine Zelle eingeführt werden. Lebende Zellen, die nicht durch ein Medikament beeinflusst werden, werden nachgewiesen, da sie mit der Unterstützung der Genexpression fortfahren und somit das Metall bindende Protein exprimieren, wodurch die Zelle eine intensive Farbe erhält. Ist ein Medikament toxisch für die Zelle, erfolgt es keine Expression des Markers mehr, und die Farbe der Zelle verschwindet.The cytotoxicity Medication can also be achieved by using these new markers be determined. In this case, the gene responsible for the blue Copper protein encoded, operably linked to a constitutively active promoter and introduced into a cell become. Living cells that are not affected by a drug be proved, since they are with the support of Continue gene expression and thus express the metal-binding protein, whereby the cell receives an intense color. Is a drug toxic? for the Cell, there is no more expression of the marker, and the color the cell disappears.

Zusätzlich kann man sich die Verwendung eines blauen Kupferproteins oder eines verwandten Peptids bei beinahe jeder Anwendung vorstellen, bei der ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) (oder verwandte Mutanten davon) verwendet wird. Viele Verwendungen von GFP sind durch US 5,491,084 offenbart/abgedeckt. Ein Beispiel ist die Verwendung von (modifiziertem) GFP in einem Farnesyltransferase-Assay, das wir vor kurzem beschrieben haben (PCT/EP00/04923 und PCT/EP/004919), in dem ein gefärbtes Metall bindendes Protein in ein Fusionsprotein mit einer spaltbaren Stelle (wie DVED für Caspasen) zusammen mit Ras-Sequenzen eingeführt wurde, die das gesamte Fusionsprotein an die Plasmamembran lenken. Jede Einwirkung einer Protease, wie Caspase, bewirkt eine nachweisbare Umverteilung des Metall bindenden Proteins innerhalb der Zelle.In addition, one can envision the use of a blue copper protein or a related peptide in almost any application that uses a green fluorescent protein (GFP) (or related mutants thereof). Many uses of GFP are through US 5,491,084 reveals / covered. An example is the use of (modified) GFP in a farnesyl transferase assay, which we have recently described (PCT / EP00 / 04923 and PCT / EP / 004919), in which a stained metal-binding protein is transformed into a cleavable site fusion protein (as DVED for caspases) was introduced along with Ras sequences that direct the entire fusion protein to the plasma membrane. Any action of a protease, such as caspase, causes a detectable redistribution of the metal-binding protein within the cell.

Blaues Kupferprotein kann auch zurzeit bei diagnostischen Tests, wie dem in WO 97/27480 offenbarten antiVirogramTM-Verfahren, verwendete Reporter ersetzen.Blue copper protein can also currently replace reporters used in diagnostic assays, such as the antiVirogram ™ method disclosed in WO 97/27480.

Die Erfindung stellt ferner ein Kit bereit. Das Kit kann für jedes der hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Bei einer Ausführungsform kann das Kit zur Überwachung mindestens einer Zielsubstanz in einem biologischen System verwendet werden. Das erfindungsgemäße Kit kann ein blaues Kupferprotein und/oder eine DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, umfassen. Das Kit kann ferner ein Plasmid zur Zuführung der DNA-Sequenz, die ein blaues Kupferprotein codiert, an eine Zelle umfassen. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Kit eine eukaryotische Zelle, die eine DNA-Sequenz umfasst, die ein blaues Kupferprotein codiert.The The invention further provides a kit. The kit can be for each the methods described herein are used. In one embodiment can the kit for monitoring at least one target substance used in a biological system become. The kit according to the invention can a blue copper protein and / or a DNA sequence that is a blue one Copper protein encoded include. The kit may further comprise a plasmid for feed the DNA sequence encoding a blue copper protein to a cell include. In another embodiment, a kit comprises a eukaryotic cell that includes a DNA sequence that contains a coded blue copper protein.

BeispieleExamples

Beispiel 1: Konstruktion von pLNCX-BCP1 und pLNCX-BCP2Example 1: Construction of pLNCX-BCP1 and pLNCX-BCP2

Die Bakterien Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans (oder Alcaligenes denitrificans) wurde von der ATCC (ATCC-Nummer 15173, NCTC 8582) erworben. Das für Azurin codierende Gen azu wurde aus bakterieller DNA mittels PCR amplifiziert und in einen Säugerexpressionsvektor kloniert. Das azu-Gen codiert ein Präprotein, in welchem dem reifen Azurin (130 AS) ein 19-AS-Signalpeptid vorausgeht. Dieses Peptid dient wahrscheinlich der Translokation des Proteins über die periplasmatische Membran. Das vollständige Protein (mit Signalpeptid) wurde kloniert, um Schwierigkeiten mit der korrekten Proteinfaltung zu vermeiden. In einem zweiten Konstrukt wurde ein Sekretionssignal (= Ig-κ-Leadersequenz) vor dem Gen platziert, so dass die Sekretion in das Medium möglich wurde.The Bacteria Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans (or Alcaligenes denitrificans) was purchased from the ATCC (ATCC number 15173, NCTC 8582). That for Azurin-encoding gene azu was obtained from bacterial DNA by PCR amplified and into a mammalian expression vector cloned. The azu gene encodes a preprotein in which the mature Azurin (130 aa) precedes a 19 aa signal peptide. This peptide probably serves the translocation of the protein over the periplasmic membrane. The complete protein (with signal peptide) was cloned to difficulties with the correct protein folding to avoid. In a second construct, a secretion signal was generated (= Ig-κ leader sequence) placed in the gene so that secretion into the medium became possible.

Das azu-Gen wurde in den retroviralen Vektor pLNCX (Clontech) kloniert. Dieser von dem Moloney-Mäuse- Leukämievirus (MoMuLV) stammende Vektor ist für eine retrovirale Genzuführung und -expression ausgelegt. Er enthält ein durch virale 5'-LTR (5' LTR) gesteuertes Neomycinresistenzgen (Neor) für die Antibiotikaselektion in eukaryotischen Zellen und eine Klonierungsstelle (HindIII, HpaI und ClaI) stromabwärts eines Cytomegalievirus-Immediate-Early-Promotors (Pcmv). Die ψ+-Sequenz ist ein erweitertes virales Verpackungssignal, das für die Verpackung des viralen Vektortransskripts in Virionen erforderlich ist. pLNCX enthält keine viralen Strukturgene (gag-pol und env), die für Partikelbildung und Replikation notwendig sind, sie können jedoch in trans in Verpackungszelllinien bereitgestellt werden, die diese Gene stabil exprimieren.The azu gene was cloned into the retroviral vector pLNCX (Clontech). This Moloney murine leukemia virus (MoMuLV) vector is designed for retroviral gene delivery and expression. It contains a viral 5'-LTR (5'LTR) -controlled neomycin resistance gene (Neo r ) for antibiotic selection in eukaryotic cells and a cloning site (HindIII, HpaI and ClaI) downstream of a cytomegalovirus immediate early promoter (Pcmv). The ψ + sequence is an extended viral packaging signal required for packaging the viral vector transcript in virions. pLNCX does not contain viral structural genes (gag-pol and env) necessary for particle formation and replication, but can be provided in trans in packaging cell lines stably expressing these genes.

Das azu-Gen wurde aus bakterieller DNA mittels PCR unter Verwendung des 5'-Primers BCP-1C (SEQ ID: 1) oder BCP-2C (SEQ ID: 3) und des 3'-Primers BCP-1NC (SEQ ID: 2) (1) amplifiziert. Die 5'-Primer sind derart gestaltet, dass sie eine Translationsinitiations-(Kozak-)Sequenz vor dem ATG-Initiationscodon enthalten. Der Primer BCP-2C (SEQ ID: 3) enthält die Ig-κ-Leadersequenz zur Sekretion von BCP in das Medium. Die 3'-Primer enthalten das native Stoppcodon des Proteins. Die Primer enthalten ferner eine Restriktionsstelle (HindIII für die 5'-Primer und EcoRI für die 3'-Primer), die eine leichte Subklonierung des azu-Gens ermöglichen.The azu gene was isolated from bacterial DNA by PCR using the 5 'primer BCP-1C (SEQ ID: 1) or BCP-2C (SEQ ID: 3) and the 3 'primer BCP-1NC (SEQ ID: 2) ( 1 ) amplified. The 5 'primers are designed to contain a translation initiation (Kozak) sequence before the ATG initiation codon. The primer BCP-2C (SEQ ID: 3) contains the Ig κ leader sequence for secretion of BCP into the medium. The 3 'primers contain the native stop codon of the protein. The primers also contain a restriction site (HindIII for the 5 'primers and EcoRI for the 3' primers) which allow for easy subcloning of the azu gene.

Das PCR-Produkt wurde nach Restriktion mit HindIII in die HindIII-HpaI-Stelle von pLNCX kloniert (2).The PCR product was cloned after restriction with HindIII into the HindIII-HpaI site of pLNCX ( 2 ).

Beispiel 2: Transfektion und Nachweis von Azurin in eukaryotischen ZellenExample 2: Transfection and detection of azurin in eukaryotic cells

Das Protein Azurin ist ein blaues Kupferprotein, das durch eine intensive Absorption nahe 600 nM charakterisiert ist, wodurch eine blaue Farbe hervorgerufen wird, wenn Cu2+ an das Protein gebunden ist. Das Protein wird von verschiedenen Bakterienstämmen exprimiert. Das blau gefärbte Protein wurde in eukaryotischen Zellen exprimiert und als Alternative zu verschiedenen Reportersystemen (β-Gal, GFP, ...) in zellbasierten Assays verwendet. Das Experiment zeigte, dass konstitutive Expression und Nachweis des Proteins als Marker für Lebensfähigkeit verwendet werden könnten.The protein azurin is a blue copper protein characterized by an intense absorption near 600 nM, which causes a blue color when Cu 2+ is bound to the protein. The protein is expressed by different bacterial strains. The blue-stained protein was expressed in eukaryotic cells and used as an alternative to various reporter systems (β-Gal, GFP, ...) in cell-based assays. The experiment showed that constitutive expression and detection of the protein could be used as markers of viability.

293T-Zellen, humane, mit T-Antigen transformierte embryonale Nierenzellen, wurden mit den Konstrukten pLNXC-BCP1 oder pLNCX-BCP2 unter Verwendung von Effectene-Transfektionsreagenz (Qiagen) transient transfiziert. SDS-PAGE (15%), gefolgt von Western-Blotting der Zelllysate, bestätigten die Expression von Azurin durch beide Konstrukte (3).293T cells, human T-antigen-transformed embryonic kidney cells, were transiently transfected with the constructs pLNXC-BCP1 or pLNCX-BCP2 using Effectene transfection reagent (Qiagen). SDS-PAGE (15%) followed by Western blotting of the cell lysates confirmed the expression of azurin by both constructs ( 3 ).

Azurin wurde in Zelllysaten (Zelllysate (106 Zellen/Probe)) mit polyklonalem Anti-A.-denitrificans-Azurin-Antikörper (Leiden Institute of Chemistry, Gorlaeus Laboratories) nachgewiesen. Die in 3 gezeigten Western-Blots können wie folgt interpretiert werden:Azurin was in cell lysates (Cell lysates (10 6 cells / sample)) with polyclonal anti-A. denitrificans azurin antibody (Leiden Institute of Chemistry, Gorlaeus Laboratories) detected. In the 3 Western blots shown can be interpreted as follows:

Figure 00220001
Figure 00220001

SEQUENZPROTOKOLL

Figure 00230001
SEQUENCE LISTING
Figure 00230001

Figure 00240001
Figure 00240001

Claims (28)

Verfahren zum Überwachen mindestens einer Zielsubstanz in einem biologischen In-vitro-System, umfassend: a) Bereitstellen des biologischen Systems, das die mindestens eine Zielsubstanz umfasst, b) Markieren der mindestens einen Zielsubstanz mit mindestens einem blauen Kupferprotein, c) Bereitstellen von Bedingungen, die es dem mindestens einen blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, d) Beobachten oder Messen des Signals, e) Überwachen der mindestens einen Zielsubstanz auf Basis des beobachteten oder gemessenen Signals.A method for monitoring at least one target substance in an in vitro biological system, comprising: a) providing the biological system comprising the at least one target substance, b) labeling the at least one target substance with at least one blue copper protein, c) providing conditions that allow the at least one blue copper protein to emit a signal, d) observing or Measuring the signal, e) monitoring the at least one target substance based on the observed or measured signal. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Überwachens das Bestimmen des Ortes der mindestens einen Zielsubstanz in dem biologischen System umfasst.The method of claim 1, wherein the step of monitoring determining the location of the at least one target substance in the includes biological system. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Überwachens das Quantifizieren der Menge der mindestens einen Zielsubstanz in dem biologischen System umfasst.The method of claim 1, wherein the step of monitoring quantifying the amount of the at least one target substance in the biological system. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das biologische System aus einem Virus, Bakterien, einer Pflanze oder einem Tier ausgewählt ist.The method of claim 1, wherein the biological System of a virus, bacteria, a plant or an animal selected is. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Zielsubstanz aus einer Zelle oder einem Gewebe ausgewählt ist.The method of claim 1, wherein the at least one Target substance is selected from a cell or a tissue. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle aus einer Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle ausgewählt ist.The method of claim 5, wherein the cell consists of a Bacterial, fungal, plant or animal cell is selected. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle durch Transfizieren der Zelle mit einem DNA-Molekül, welches das mindestens eine blaue Kupferprotein codiert, markiert wird.The method of claim 5, wherein the cell is characterized by Transfecting the cell with a DNA molecule containing the at least one encoded blue copper protein. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zelle durch Verknüpfen des mindestens einen blauen Kupferproteins mit der Zelle markiert wird.The method of claim 5, wherein the cell is characterized by Link of the at least one blue copper protein labeled with the cell becomes. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das mindestens eine blaue Kupferprotein der Zelle in vivo zur Verfügung gestellt wird.The method of claim 5, wherein the at least one blue copper protein is provided to the cell in vivo. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das mindestens eine blaue Kupferprotein der Zelle in vitro zur Verfügung gestellt wird.The method of claim 5, wherein the at least provided a blue copper protein of the cell in vitro becomes. Verfahren zur Bestimmung der Cytotoxizität eines Medikaments, umfassend a) Aussetzen mindestens einer Zelle dem Medikament von Interesse, b) Überwachen der mindestens einen Zelle unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 5, c) Bestimmen der Cytotoxizität des Medikaments von Interesse durch Bestimmen, ob die mindestens eine Zelle durch das Medikament von Interesse beeinflusst wird.Method for determining the cytotoxicity of a Medicament, comprising a) expose at least one cell the drug of interest, b) monitoring the at least one Cell using the method according to claim 5, c) Determine the cytotoxicity of the drug of interest by determining whether the at least a cell is affected by the drug of interest. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das mindestens eine blaue Kupferprotein mit dem Gewebe verknüpft wird.The method of claim 5, wherein the at least a blue copper protein is linked to the tissue. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Zielsubstanz ein Protein ist.The method of claim 1, wherein the at least a target substance is a protein. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Protein durch Herstellen eines Fusionsproteins mit dem Protein und mindestens einem blauen Kupferprotein markiert wird.The method of claim 13, wherein the protein is characterized by Producing a fusion protein with the protein and at least a blue copper protein is marked. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen, die es dem mindestens einen blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, das Bereitstellen von Kupfer umfassen, das an das mindestens eine blaue Kupferprotein bindet.The method of claim 1, wherein the conditions which allow the at least one blue copper protein to enter Signaling, the provision of copper include the which binds at least one blue copper protein. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das blaue Kupferprotein aus Azurin, Pseudoazurin, einem Plastocyanin und einem Phytocyanin ausgewählt ist.The method of claim 15, wherein the blue copper protein from azurin, pseudoazurin, a plastocyanin and a phytocyanin selected is. Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem blauen Kupferprotein um eine aus Ascorbatoxidase, Ceruloplasmin und Laccase ausgewählte blaue Oxidase handelt.The method of claim 15, wherein the blue copper protein around one from ascorbate oxidase, ceruloplasmin and laccase selected is blue oxidase. Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem blauen Kupferprotein um eine Nitritreduktase handelt.The method of claim 15, wherein the blue copper protein is a nitrite reductase. Verfahren zum Nachweisen mindestens einer Zelle, die ein Protein von Interesse exprimiert, umfassend: a) Einbringen eines DNA-Moleküls mit einer DNA-Sequenz, die das Protein von Interesse codiert, und eines zusätzlichen DNA-Moleküls mit einer DNA-Sequenz, die mindestens ein blaues Kupferprotein codiert, in die mindestens eine Zelle, b) Bereitstellen von Bedingungen, welche die Expression des mindestens einen blauen Kupferproteins und des Proteins von Interesse gestatten, c) Bereitstellen von Bedingungen, die es dem mindestens einen blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, und d) Nachweisen der Zelle, die das Protein von Interesse exprimiert, durch Beobachten oder Messen des Signals von dem mindestens einen blauen Kupferprotein.Method for detecting at least one cell, which expresses a protein of interest, comprising: a) introduce a DNA molecule with a DNA sequence, which encodes the protein of interest, and an additional one DNA molecule with a DNA sequence, which encodes at least one blue copper protein into which at least a cell, b) providing conditions which limit the expression of the at least one blue copper protein and the protein of To allow interest c) providing conditions that allow the at least one blue copper protein to send a signal, and d) Detecting the cell containing the protein of interest expressed by observing or measuring the signal of the at least a blue copper protein. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das DNA-Molekül und das zusätzliche DNA-Molekül verknüpft sind.The method of claim 19, wherein the DNA molecule and the additional DNA molecule are linked. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zelle aus einer Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle ausgewählt ist.The method of claim 19, wherein the cell comprises a bacterial, fungal, plant or animal cell is selected. Verfahren zum Lokalisieren mindestens eines Proteins von Interesse in einer Zelle, umfassend: a) Einbringen eines DNA-Moleküls, das eine DNA-Sequenz, die das mindestens eine Protein von Interesse codiert, verknüpft mit einer zusätzlichen DNA-Sequenz umfasst, die mindestens ein blaues Kupferprotein codiert, in die Zelle, so dass bei dem von dem DNA-Molekül hergestellten Protein das mindestens eine Protein von Interesse an das mindestens eine blaue Kupferprotein fusioniert ist, b) Bereitstellen von Bedingungen, welche die Expression des Fusionsproteins gestatten, c) Bereitstellen von Bedingungen, die es dem mindestens einen blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, und d) Nachweisen des Ortes des Fusionsproteins anhand des Signals, wodurch das Protein von Interesse in der Zelle lokalisiert wird.Method for localizing at least one protein of interest in a cell comprising: a) bringing in a DNA molecule, the one DNA sequence, which encodes the at least one protein of interest linked to an additional one Comprises a DNA sequence encoding at least one blue copper protein, into the cell, so that in the protein produced by the DNA molecule the at least one protein of interest to the at least one blue one Copper protein is fused, b) providing conditions which allow the expression of the fusion protein, c) Provide of conditions that make it the least one blue copper protein allow to send a signal, and d) Evidence of the place of the fusion protein based on the signal, thereby reducing the protein of Interest in the cell is localized. Verfahren zum Screenen eines Therapeutikums zur Behandlung einer Erkrankung, umfassend: a) Markieren mindestens einer Zelle, die ein Ziel der Erkrankung ist, mit mindestens einem blauen Kupferprotein, b) Bereitstellen von Bedingungen, die es dem mindestens einen blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, c) Beobachten oder Messen des Signals, d) Bestimmen, ob das Therapeutikum zur Behandlung der Erkrankung wirksam ist, durch Überwachen des beobachteten oder gemessenen Signals von der Zelle.Method for screening a therapeutic for Treatment of a disease comprising: a) Mark at least a cell that is a target of the disease with at least one blue copper protein, b) providing conditions that allow the at least one blue copper protein to send a signal, c) Observing or measuring the signal, d) Determine if the therapeutic agent is effective for the treatment of the disease by monitoring the observed or measured signal from the cell. Verfahren zum Screenen eines Therapeutikums zur Behandlung einer Virus- oder Bakterieninfektion, umfassend: a) Markieren des Virus oder der Bakterien mit mindestens einem blauen Kupferprotein, b) Bereitstellen von Bedingungen, die es dem mindestens einen blauen Kupferprotein gestatten, ein Signal auszusenden, c) Beobachten oder Messen des Signals, d) Bestimmen, ob das Therapeutikum zur Behandlung der Virus- oder Bakterieninfektion wirksam ist, durch Überwachen des beobachteten oder gemessenen Signals von dem Virus oder den Bakterien.Method for screening a therapeutic for Treatment of a viral or bacterial infection comprising: a) Mark the virus or bacteria with at least one blue Copper protein, b) providing conditions that allow it allow at least one blue copper protein to send a signal, c) Observing or measuring the signal, d) Determine if the therapeutic agent is effective for treating the virus or bacterial infection by monitoring the observed or measured signal from the virus or the Bacteria. Verfahren nach Anspruch 24, wobei es sich bei dem Virus um das HIV-Virus handelt.The method of claim 24, wherein the Virus is about the HIV virus. Eukaryotische Zelle, die eine Azurin codierende DNA-Sequenz umfasst.Eukaryotic cell encoding an azurin Includes DNA sequence. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 26, wobei die eukaryotische Zelle eine Tierzelle ist.A eukaryotic cell according to claim 26, wherein said eukaryotic cell is an animal cell. Eukaryotische Zelle nach Anspruch 26, wobei die DNA-Sequenz das azu-Gen umfasst.A eukaryotic cell according to claim 26, wherein said DNA sequence comprises the azu gene.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5210019A (en) * 1990-03-30 1993-05-11 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Pseudomonas screening assay
ZA967411B (en) * 1995-09-01 1997-04-16 Novo Nordisk Biotech Inc Blue copper oxidase mutants with enhanced activity

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