WO1995023967A1 - Method of rapidly detecting herbicidal active substances in water - Google Patents

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WO1995023967A1
WO1995023967A1 PCT/EP1995/000750 EP9500750W WO9523967A1 WO 1995023967 A1 WO1995023967 A1 WO 1995023967A1 EP 9500750 W EP9500750 W EP 9500750W WO 9523967 A1 WO9523967 A1 WO 9523967A1
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Jürgen BAUSCH-WEIS
Ekkehard Hostert
Stephan Overmeyer
Heide Schnabl
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Biolytik Gesellschaft Für Bio-Sensitive Analytik Mbh
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    • G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish
    • G01N33/1866—Water using one or more living organisms, e.g. a fish using microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a method for the rapid detection of herbicidal active substances in water using chloroplast thylakoids.
  • Pesticides are used in agriculture to secure and increase yields. Plant protection agents, in particular herbicides, are also used on track systems, on paths, in tree nurseries and forestry facilities and in allotments. With the rain and drainage water as well as through surface runoff, they reach the surface water. The seepage water also contaminates the groundwater with pesticides.
  • bioassays can provide valuable services in which the effect of pollutants on living organisms or other biological units is measured.
  • the test method is based on the observation that the behavior of the whole organism changes when pollutants are added to the water.
  • these tests are particularly difficult to standardize and cannot be used to detect low concentrations of pollutants in the area of the drinking water limit.
  • the inhibition of the breathability of water-typical pseudomonas by pollutants is measured in a measuring cell based on the oxygen consumption. This method primarily captures respiratory toxins, among which only a few herbicide active ingredients are represented. For other bacteria (e.g. luminous bacteria, cyanobacteria) and algae, the inhibition of bioluminescence or photosynthetic activity is used to detect pollutants.
  • bacteria e.g. luminous bacteria, cyanobacteria
  • photosynthetic activity is used to detect pollutants.
  • Thylakoids are biomembranes composed of proteins and lipids, in which the pigments, protein complexes and enzymes involved in photosynthesis are embedded or attached. They contain the elements of photosynthetic electron transport, which has proven to be one of the most important targets for herbicides.
  • the thylakoid membrane brakes are isolated from higher plants by disintegrating the chloroplasts.
  • the chloroplasts are existing NADP, ferredoxin and the NADP ferredoxin oxidoreductase, which serve as electron acceptors in photosynthetic electron transport, washed out. The system thus no longer contains an electron acceptor. The electrons can then only be transferred to elemental oxygen: the so-called Mehler reaction takes place, in which weak oxygen consumption is determined with water production.
  • concentrations of the herbicidal active ingredients below 0.5 ⁇ g / l can be detected without enriching the samples. Only the biosensors based on the use of antibodies can detect this concentration range, but they are not effect tests and can only be used for a certain group of chemically closely related substances.
  • the present invention is used here. It is the object of this invention to provide a method which, using chloroplast thylakoids, enables rapid detection of herbicidal active ingredients in the concentration range of the drinking water limit value.
  • the invention proposes starting from
  • Flavin nucleotides are capable of taking up and transferring hydrogen, which can also be understood here as taking up and transferring electrons with the participation of hydrogen ions.
  • Flavin mononucleotide is a physiological substance that occurs, for example, in the flavoprotein functioning as ferredoxin NADP + oxidoreductase in many cases as a prosthetic group and as such can switch between the reduced and oxidized state.
  • FMN is a redox system with a redox potential that is very similar to that of the ferredoxin present in the electron transport chain and washed out during isolation. As a result, FMN is able to take the place of ferredoxin and to take over electrons from photo system I while simultaneously absorbing hydrogen ions. Flavin mononucleotide thus works as a mediator.
  • FMNH2 is not stable and is immediately oxidized again using oxygen.
  • the mediator is therefore not used up, as is the case with K3 [Fe (CN) g] or DCPIP, but regenerates and can accept new electrons.
  • Another advantage of the method according to the present invention is that when using FMN the electrons run along the entire electron transport chain. FMN takes over the electrons exclusively from the acceptor of the photosystem I, while DCPIP and K3 [Fe (CN) g] do not act specifically for Photosystem I in chloroplast fragments, but also take over electrons from the acceptor of the photosystem II.
  • DCPIP and K3 [Fe (CN) g] partially bypasses the inhibition of the electron transport chain by herbicides, since their place of action lies below Photosystem II. As a result, the system loses sensitivity to inhibition by herbicides.
  • the acceptor system used in the process according to the present invention is very efficient. Although the electrons are transferred to the end acceptor oxygen as in the Mehler reaction, the electron transport is greatly accelerated. FMN is not toxic and is very inexpensive in the amounts used in the process according to the invention.
  • the method according to Cohen and Baxter, Plant Physiol. Volume 93, 1005-1010 (1990) can be used.
  • the membrane preparation can be standardized and the prepared membranes can be preserved by freezing and lyophilizing, which enables the measurements to be automated.
  • the cost and time required for the isolation of the thylakoid membranes and for the measurements is very low.
  • herbicide concentrations (atrazine, diuron, terbuthylazine) around the drinking water limit of 0.1 ⁇ g / l were detected using the method according to the invention.
  • a quantification of the amount of herbicide for a particular herbicide in water can be carried out by comparing the measurement curves with standard measurements.
  • the use of FMN as mediator causes a strong light-dependent electron flow on the thylakoid membranes.
  • This flow of electrons is inhibited by various herbicidal agents.
  • the inhibition has a negative effect on the oxygen consumption while the fluorescence emission is increased.
  • the effect of the herbicide on the electron transport is determined by measuring the fluorescence yield in the case of light-adapted chlorophyll under saturating flashes of light. The difference between the maximum fluorescence yield with a saturating light flash (Fm /) and the basic yield with the measuring light (Ft) in relation to Fm 'is measured:
  • Fluorescence measurement has the advantage over oxygen measurement that the results are more reproducible and that the sensitivity to herbicides is higher.
  • the fluorescence measurement on a thylakoid membrane system it is possible to detect herbicide concentrations below the drinking water limit value of 0.5 ⁇ g / l.
  • the time required for a measurement is very short: only two minutes are required.
  • the improved reproducibility makes the number of repetitions required to ensure a result lower and contributes to the fact that the method according to the invention can be used as a rapid test.
  • the inhibition of the herbicidal active compounds on the electron flow is monitored via the oxygen consumption.
  • Sauer's off measurements can be carried out with Clark electrodes, for example.
  • a predetermined amount of chlorophyll is used as a suspension of thylakoid membranes in each measurement.
  • the measurements are compared with control measurements.
  • bio-monitoring in groundwater and surface water for the detection of herbicidal active substances which inhibit photosynthetic electron transport, such as are used in commercially available herbicide preparations. It is particularly advantageous that the method can be used as a rapid test to check compliance with the drinking water limit value for herbicides at changing locations.

Abstract

The invention concerns a method of rapidly detecting herbicidal active substances in water by using chloroplast thylakoids. The widespread use of pesticides and, in particular, herbicidal active substances in agriculture frequently leads to contamination of surface water and groundwater. For rapidly detecting herbicidal active substances in the drinking water limiting value concentration range by using chloroplast thylakoids, the invention proposes a method in which a mediator is used instead of the electron acceptor washed out of the photosynthetic electron transfer system when the chloroplast thylakoids are isolated, and the effect of the herbicidal active substance on electron transfer is determined.

Description

Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Wasger Process for the rapid detection of herbicidal active ingredients in a washer
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Wasser unter Verwendung von Chloroplastenthylakoiden.The invention relates to a method for the rapid detection of herbicidal active substances in water using chloroplast thylakoids.
Pflanzenschutzmittel werden in der Landwirtschaft zur Ertrags¬ sicherung und -Steigerung eingesetzt. Auch auf Gleisanlagen, an Wegen, in Baumschulen und Forstanlagen sowie in Kleingärten kommen Planzenschutzmittel, insbesondere Herbizide, zur Anwendung. Mit dem Regen- und Drainagewasser sowie durch Oberflächenabfluß gelangen sie in die Oberflächengewässer, über das Sickerwasser wird auch das Grundwasser mit Pflanzenschutz- mittein kontaminiert.Pesticides are used in agriculture to secure and increase yields. Plant protection agents, in particular herbicides, are also used on track systems, on paths, in tree nurseries and forestry facilities and in allotments. With the rain and drainage water as well as through surface runoff, they reach the surface water. The seepage water also contaminates the groundwater with pesticides.
Erst in den letzten Jahren wurde erkannt, daß viele Pflanzen¬ schutzmittel beim Menschen schon in sehr geringer Konzentration neuropatologische Störungen hervorrufen können. Deshalb fordere die Trinkwasserverordnung von 1989, daß der Gehalt an Pflanzen- behandlungs- und Schädlingsbekämpfungsmitteln im Trinkwasser 0,1 μg/1 für je einen Wirkstoff und 0,5 μg/1 für die gesamten Wirkstoffe einschließlich ihrer toxischen Abbauprodukte nicht überschreitet. Der Nachweis von Pflanzenschutzmitteln mittels chemisch-analytischer Methoden erweist sich angesichts der gro-Only in recent years has it been recognized that many plant protection products can cause neuropatological disorders in humans even in very low concentrations. Therefore, the Drinking Water Ordinance of 1989 stipulated that the content of plant treatment and pesticides in drinking water should not exceed 0.1 μg / 1 for each active ingredient and 0.5 μg / 1 for all active ingredients including their toxic breakdown products. The detection of pesticides using chemical-analytical methods proves itself in view of the large
ORIGINAL UNTERLAGEN ßen Zahl nachzuweisender Wirkstoffe und ihrer zum größten Teil unbekannten Metabolite als aufwendig und teuer.ORIGINAL DOCUMENTS ß number of active ingredients to be detected and their largely unknown metabolites as complex and expensive.
Hier können Biotests wertvolle Dienste leisten, bei denen die Wirkung von Schadstoffen auf lebende Organismen oder andere biologische Einheiten gemessen wird. Bei Fischen, Muscheln und Daphnien beruht die Testmethode auf der Beobachtung, daß sich das Verhalten des ganzen Organismus bei Zugabe von Schadstoffen zum Wasser ändert. Jedoch sind diese Tests besonders schwer zu standardisieren und können zum Nachweis von niedrigen Schadstoffkonzentrationen im Bereich des Trinkwassergrenzwertes nicht eingesetzt werden.Here, bioassays can provide valuable services in which the effect of pollutants on living organisms or other biological units is measured. For fish, mussels and daphnia, the test method is based on the observation that the behavior of the whole organism changes when pollutants are added to the water. However, these tests are particularly difficult to standardize and cannot be used to detect low concentrations of pollutants in the area of the drinking water limit.
Beim Bakterientoxi eter wird die Hemmung der Atmungsaktivität von gewässertypischen Pseudomonaden durch Schadstoffe in einer Meßzelle anhand des SauerstoffVerbrauchs gemessen. Diese Methode erfaßt vor allem Atmungsgifte, unter denen nur wenige Herbizidwirkstoffe repräsentiert sind. Bei anderen Bakterien (z.B. Leuchtbakterien, Cyanobakterien) und bei Algen wird die Hemmung der Bioluminiszenz bzw. der photosynthetischer- Aktivität zum Nachweis von Schadstoffen eingesetzt.In the bacterial toxi eter, the inhibition of the breathability of water-typical pseudomonas by pollutants is measured in a measuring cell based on the oxygen consumption. This method primarily captures respiratory toxins, among which only a few herbicide active ingredients are represented. For other bacteria (e.g. luminous bacteria, cyanobacteria) and algae, the inhibition of bioluminescence or photosynthetic activity is used to detect pollutants.
Zum Nachweis von Triazin-Herbiziden im Wasser wurden immunoche- mische Methoden entwickelt, die eine hohe Empfindlichkeit auf¬ weisen. Damit können Herbizid-Konzentrationen unter 0,1 μg/1 nachgewiesen werden, jedoch ist die Zahl der nachweisbaren Her¬ bizide auf jeweils einen oder wenige verwandte Stoffe be- schränkt.For the detection of triazine herbicides in water, immunochemical methods have been developed which are highly sensitive. Herbicide concentrations below 0.1 μg / l can thus be detected, but the number of detectable herbicides is limited to one or a few related substances in each case.
Derzeit gehören mehr als die Hälfte der in der Landwirtschaft eingesetzten Herbizide zu der Klasse der sogenannten Elektro- nentransportinhibitoren, deren primäre Wirkung auf der Hemmung des photosynthetischen Elektronentransports im Bereich des Pho- tosystems II beruht. Die in den Photosystemen eingefangene Lichtenergie kann daher nicht zur Bildung von ATP und Reduk- tionsäquivalenten verwendet werden und wird zum Teil als Fluo¬ reszenz freigesetzt. Ein anderer Teil jedoch bewirkt die Bildung von Sauerstoffradikalen, die eine Zerstörung der Membranen und damit eine Dekompartimentierung der Zelle verursachen.Currently more than half of the herbicides used in agriculture belong to the class of so-called electron transport inhibitors, the primary effect of which is based on the inhibition of photosynthetic electron transport in the area of photo system II. The light energy captured in the photosystems can therefore not be used to form ATP and reduc- equivalents are used and is released in part as fluorescence. Another part, however, causes the formation of oxygen radicals, which destroy the membranes and thus cause the cells to decompartment.
Es gibt Bestrebungen zur Entwicklung von Testsystemen, die dieses breite Spektrum von chemisch sehr unterschiedlichen Substanzen mit größtmöglicher Empfindlichkeit nachweisen können. Dazu gehört der Protoplastenbiotest, bei dem die durch herbizide Wirkstoffe bedingte Hemmung der Nettophotosyntheserate an immobiliserten oder suspendierten Protoplasten gemessen wird. Damit können verschiedene herbizide Wirkstoffe im Bereich um 5 μ g/1 nachgewiesen werden. Bei einer anderen Testmethode unter Verwendung von Chloroplasten reagieren diese auf herbizide Wirkstoffe mit einer Hemmung des photosynthetischen Elek- tronentransportes, was sich in einer Minderung der Sauerstoff- Produktion niederschlägt und so gemessen werden kann. Die als Elektronenakzeptorsystem eingesetzten Substanzen (K3[Fe(CN)g] und DCPIP) sind allerdings giftig. Außerdem wird hier die von der Trinkwasserverordnung gefordete Empfindlichkeit ohne Anrei- cherung der Proben nicht erreicht.There are efforts to develop test systems that can detect this broad spectrum of chemically very different substances with the greatest possible sensitivity. This includes the protoplast bioassay, in which the inhibition of the net photosynthesis rate due to herbicidal active substances is measured on immobilized or suspended protoplasts. Various herbicidal active substances in the range around 5 μg / l can thus be detected. In another test method using chloroplasts, these react to herbicidal active ingredients by inhibiting photosynthetic electron transport, which is reflected in a reduction in oxygen production and can thus be measured. However, the substances used as the electron acceptor system (K3 [Fe (CN) g] and DCPIP) are toxic. In addition, the sensitivity required by the Drinking Water Ordinance is not achieved here without enriching the samples.
Zur Schnellbestimmung von Schadstoffen in Gewässern ist aus DE 3412023 AI ein Verfahren bekannt, bei dem als Biomaterial Thylakoide von unter standardisierten Bedingungen gezogenen hö¬ heren Pflanzen verwendet werden. Thylakoide sind aus Proteinen und Lipiden zusammengesetzte Biomembranen, in denen die an der Photosynthese beteiligten Pigmente, Proteinkomplexe und Enzyme eingebettet bzw. angelagert sind. Sie enthalten die Elemente des photosynthetischen Elektronentransports, der sich als einer der wichtigsten Angriffsorte für Herbizide erwiesen hat.For the rapid determination of pollutants in water, a method is known from DE 3412023 AI in which thylakoids from higher plants grown under standardized conditions are used as biomaterial. Thylakoids are biomembranes composed of proteins and lipids, in which the pigments, protein complexes and enzymes involved in photosynthesis are embedded or attached. They contain the elements of photosynthetic electron transport, which has proven to be one of the most important targets for herbicides.
In dem Verfahren nach dem Stand der Technik werden die Thyla- koidmembrahen durch Aufschluß der Chloroplasten aus höheren Pflanzen isoliert. Dabei werden das in den Chloroplasten vor- handene NADP, Ferredoxin und die NADP-Ferredoxin-Oxidoreduktase, welche beim photosynthetischen Elektronentransport als Elektronenakzeptor dienen, ausgewaschen. Das System enthält so¬ mit keinen Elektronenakzeptor mehr. Die Elektronen können dann nur auf elementaren Sauerstoff übertragen werden: Es läuft die sogenannte Mehler-Reaktion ab, bei der schwacher Sauerstoffver¬ brauch mit Wasserproduktion festgestellt wird.In the prior art method, the thylakoid membrane brakes are isolated from higher plants by disintegrating the chloroplasts. The chloroplasts are existing NADP, ferredoxin and the NADP ferredoxin oxidoreductase, which serve as electron acceptors in photosynthetic electron transport, washed out. The system thus no longer contains an electron acceptor. The electrons can then only be transferred to elemental oxygen: the so-called Mehler reaction takes place, in which weak oxygen consumption is determined with water production.
Diese Reaktion ist zur Erfassung von Photosys em II-Herbiziden nicht geeignet, da kein Mediator/Akzeptor zum Elektronen- transport zur Verfügung steht. Der Sauerstoffverbrauch durch die Mehler-Reaktion ist dann zu gering, um bei der Messung der Hemmung durch herbizide Wirkstoffe reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Eine Rekonstitution der Elektronentransportkette durch Zugabe von Ferredoxin, Reduktase und NADP kommt aus Kostengründen nicht in Frage. Auch sollte die Verwendung von toxischen Substanzen (z.B. K3[Fe(CN)]g oder DCPIP) vermieden werden.This reaction is not suitable for the detection of Photosys em II herbicides, since there is no mediator / acceptor available for electron transport. The oxygen consumption by the Mehler reaction is then too low to achieve reproducible results when measuring the inhibition by herbicidal active ingredients. Reconstitution of the electron transport chain by adding ferredoxin, reductase and NADP is out of the question for reasons of cost. The use of toxic substances (e.g. K3 [Fe (CN)] g or DCPIP) should also be avoided.
Bei keiner der genannten Methoden können ohne Anreicherung der Proben Konzentrationen der herbiziden Wirkstoffe unter 0,5 μg/1 nachgewiesen werden. Lediglich die auf dem Einsatz von Antikör¬ pern beruhenden Biosensoren können diesen Konzentrationsbereich erfassen, sie sind jedoch keine Wirkungstests und können jeweils nur für eine bestimmte Gruppe von chemisch eng verwandten Substanzen angewendet werden.In none of the methods mentioned, concentrations of the herbicidal active ingredients below 0.5 μg / l can be detected without enriching the samples. Only the biosensors based on the use of antibodies can detect this concentration range, but they are not effect tests and can only be used for a certain group of chemically closely related substances.
Hier kommt die vorliegende Erfindung zum Einsatz. Es ist Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das unter Verwendung von Chloroplastenthylakoiden einen schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Konzentrarionsbereich des Trinkwassergrenzwertes ermöglicht.The present invention is used here. It is the object of this invention to provide a method which, using chloroplast thylakoids, enables rapid detection of herbicidal active ingredients in the concentration range of the drinking water limit value.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ausgehend vomTo achieve this object, the invention proposes starting from
Verfahren der oben genannten Art vor, daß anstelle des bei der Isolierung der Chloroplastenthylakoiden aus dem photosynthe¬ tischen Elektronentransportsystem ausgewaschenen Elektronenak¬ zeptors ein Mediator eingesetzt wird, und die Wirkung des her¬ biziden Wirkstoffes auf den Elektronentransport bestimmt wird.Procedure of the type mentioned above that instead of the Isolation of the chloroplast thylakoids from the photosynthetic electron transport system washed electron acceptor, a mediator is used, and the effect of the herbicidal active ingredient on the electron transport is determined.
Flavinnukleotide sind zur Aufnahme und Übertragung von Wasser¬ stoff fähig, was hier auch als Aufnahme und Übertragung von Elektronen unter Beteiligung von Wasserstoffionen verstanden werden kann. Flavin-Mononukleotid (FMN) ist ein physiologischer Stoff, der z.B. in dem als Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase fun- gierenden Flavoprotein in vielen Fällen als prosthetische Gruppe vorkommt und als solche zwischen dem reduzierten und oxidierten Zustand wechseln kann. FMN stellt ein Redoxsystem mit einem Redoxpotential dar, das dem des in der Elektronentransportkette vorhandenen und bei der Isolierung ausgewaschenen Ferredoxins sehr ähnlich ist. Dadurch ist FMN in der Lage, an die Stelle des Ferredoxins zu treten und bei gleichzeitiger Aufnahme von Wasserstoffionen Elektronen vom Photoεystem I zu übernehmen. Flavin-Mononukleotid funktioniert also als Mediator.Flavin nucleotides are capable of taking up and transferring hydrogen, which can also be understood here as taking up and transferring electrons with the participation of hydrogen ions. Flavin mononucleotide (FMN) is a physiological substance that occurs, for example, in the flavoprotein functioning as ferredoxin NADP + oxidoreductase in many cases as a prosthetic group and as such can switch between the reduced and oxidized state. FMN is a redox system with a redox potential that is very similar to that of the ferredoxin present in the electron transport chain and washed out during isolation. As a result, FMN is able to take the place of ferredoxin and to take over electrons from photo system I while simultaneously absorbing hydrogen ions. Flavin mononucleotide thus works as a mediator.
2e~ 2e~ 2e~ H2O > Photosystem II > Photosystem I > FMNH22e ~ 2e ~ 2e ~ H2O> Photosystem II> Photosystem I> FMNH2
FMNH2 ist nicht stabil und wird sofort unter Sauerstoffverbrauch wieder oxidiert. Der Mediator wird also nicht verbraucht, wie es bei K3[Fe(CN)g] oder DCPIP der Fall ist, sondern regeneriert sich und kann neue Elektronen aufnehmen.FMNH2 is not stable and is immediately oxidized again using oxygen. The mediator is therefore not used up, as is the case with K3 [Fe (CN) g] or DCPIP, but regenerates and can accept new electrons.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Er¬ findung liegt darin, daß bei Benutzung von FMN die Elektronen die gesamte Elektronentransportkette entlanglaufen. FMN über¬ nimmt die Elektronen ausschließlich vom Akzeptor des Photo¬ systems I, während DCPIP und K3[Fe(CN)g] bei Chloroplastenfrag- enten nicht Photosystem-I-spezifisch wirken, sondern auch Elektronen vom Akzeptor des Photosystems II übernehmen. Bei Be- nutzung von DCPIP und K3[Fe(CN)g] wird die Hemmung der Elektro¬ nentransportkette durch Herbizide teilweise umgegangen, da deren Wirkungsort unterhalb des Photosystems II liegt. Dadurch verliert das System an Empfindlichkeit für Hemmung durch Herbi- zide.Another advantage of the method according to the present invention is that when using FMN the electrons run along the entire electron transport chain. FMN takes over the electrons exclusively from the acceptor of the photosystem I, while DCPIP and K3 [Fe (CN) g] do not act specifically for Photosystem I in chloroplast fragments, but also take over electrons from the acceptor of the photosystem II. When loading The use of DCPIP and K3 [Fe (CN) g] partially bypasses the inhibition of the electron transport chain by herbicides, since their place of action lies below Photosystem II. As a result, the system loses sensitivity to inhibition by herbicides.
Das im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Akzeptorsystem ist sehr effizient. Die Elektronen werden zwar wie in der Mehler-Reaktion auf den Endakzeptor Sauerstoff über¬ tragen, der Elektronentransport ist aber stark beschleunigt. FMN ist nicht toxisch und in den im Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten Mengen sehr preisgünstig.The acceptor system used in the process according to the present invention is very efficient. Although the electrons are transferred to the end acceptor oxygen as in the Mehler reaction, the electron transport is greatly accelerated. FMN is not toxic and is very inexpensive in the amounts used in the process according to the invention.
Zur Isolierung der Thylakoidmembranen kann beispielsweise die Methode nach Cohen und Baxter, Plant Physiol. Band 93, 1005-1010 (1990) angewandt werden. Die Membranpräparation kann stan- dardisiert und die präparierten Membranen können durch Ein¬ frieren und Lyophilisieren konserviert werden, was eine Automa¬ tisierung der Messungen ermöglicht. Der Kosten- und Zeitaufwand für die Isolierung der Thylakoidmembranen und für die Messungen ist sehr gering.To isolate the thylakoid membranes, for example, the method according to Cohen and Baxter, Plant Physiol. Volume 93, 1005-1010 (1990) can be used. The membrane preparation can be standardized and the prepared membranes can be preserved by freezing and lyophilizing, which enables the measurements to be automated. The cost and time required for the isolation of the thylakoid membranes and for the measurements is very low.
Im Chemikalientest wurden mit dem Verfahren gemäß der Erfindung Herbizidkonzentrationen (Atrazin, Diuron, Terbuthylazin) um den Trinkwassergrenzwert von 0,1 μg/1 nachgewiesen. Eine Quantifi¬ zierung der Herbizidmenge für ein bestimmtes Herbizid im Wasser kann durch Vergleich der Meßkurven mit Standard-Messungen durchgeführt werden.In the chemical test, herbicide concentrations (atrazine, diuron, terbuthylazine) around the drinking water limit of 0.1 μg / l were detected using the method according to the invention. A quantification of the amount of herbicide for a particular herbicide in water can be carried out by comparing the measurement curves with standard measurements.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung wird durch den Einsatz von FMN als Mediator ein starker lichtabhängiger Elektronenfluß an den Thylakoidmembranen hervorgerufen. Dieser Elektronenfluß wird durch verschiedene herbizide Wirkstoffe gehemmt. Die Hemmung wirkt sich auf den Sauerstoffverbrauch negativ aus während die Fluoreszenzemission verstärkt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Wirkung des Herbizids auf den Elektronen¬ transport durch Messung der Fluoreszenzausbeute bei lichtadap¬ tiertem Chlorophyll unter sättingenden Lichtblitzen ermittelt. Die Differenz der maximalen Fluoreszenzausbeute bei sättigendem Lichtblitz (Fm/) zur Grundausbeute beim Meßlicht (Ft) bezogen auf Fm' wird gemessen:In the method according to the invention, the use of FMN as mediator causes a strong light-dependent electron flow on the thylakoid membranes. This flow of electrons is inhibited by various herbicidal agents. The inhibition has a negative effect on the oxygen consumption while the fluorescence emission is increased. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the effect of the herbicide on the electron transport is determined by measuring the fluorescence yield in the case of light-adapted chlorophyll under saturating flashes of light. The difference between the maximum fluorescence yield with a saturating light flash (Fm /) and the basic yield with the measuring light (Ft) in relation to Fm 'is measured:
(Fm' - Ft) : Fm' = Δ F : Fm'(Fm '- Ft): Fm' = Δ F: Fm '
Durch den Bezug der Differenz auf F ' wird die Messung weitge- hend unabhängig von der eingesetzten Chlorophyllmenge.By referring the difference to F ', the measurement is largely independent of the amount of chlorophyll used.
Die Fluoreszenzmessung bietet gegenüber der Sauerstoffmessung den Vorteil, daß die Ergebnisse besser reproduzierbar sind und daß die Empfindlichkeit gegenüber Herbiziden höher ist. Durch Anwendung der Fluoreszenzmessung an einem Thylakoidmembransystem ist es möglich, Herbizidkonzentrationen unter dem Trink¬ wassersummengrenzwert von 0,5 μg/1 zu detektieren. Darüberhinaus ist der Zeitaufwand für eine Messung sehr gering: nur zwei Minuten werden dafür benötigt. Die verbesserte Reproduzierbar¬ keit macht die Anzahl an Wiederholungen, die zur Absicherung eines Ergebnisses erforderlich sind, geringer und trägt dazu bei, daß das Verfahren gemäß der Erfindung als Schnelltest ein¬ gesetzt werden kann.Fluorescence measurement has the advantage over oxygen measurement that the results are more reproducible and that the sensitivity to herbicides is higher. By using the fluorescence measurement on a thylakoid membrane system, it is possible to detect herbicide concentrations below the drinking water limit value of 0.5 μg / l. In addition, the time required for a measurement is very short: only two minutes are required. The improved reproducibility makes the number of repetitions required to ensure a result lower and contributes to the fact that the method according to the invention can be used as a rapid test.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vor¬ liegenden Erfindung wird die Hemmung der herbiziden Wirkstoffe auf den Elektronenfluß über den Sauerstoffverbrauch verfolgt. Sauers offmessungen können beispielsweise mit Clark-Elektroden durchgeführt werden. Bei jeder Messung wird eine vorbestimmte Chlorophyllmenge als Suspension von Thylakoidmembranen einge¬ setzt. Zur quantitativen Auswertung werden die Messungen jeweils mit Kontrollmessungen verglichen. Für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt sich ein breites Anwendungsfeld. Hierbei ist u.a. zu denken an Bio¬ monitoring im Grund- und Oberflächenwasser zur Detektion herbi¬ zider Wirkstoffe, die den photosynthetischen Elektronentransport hemmen, wie sie in handelsüblichen Herbizidpräparaten eingesetzt werden. Es ist insbesondere von Vorteil, daß das Verfahren als Schnelltest eingesetzt werden kann, um am wechselnde Einsatzorten die Einhaltung des Trinkwassergrenzwertes für Her¬ bizide zu kontrollieren. In a further embodiment of the method according to the present invention, the inhibition of the herbicidal active compounds on the electron flow is monitored via the oxygen consumption. Sauer's off measurements can be carried out with Clark electrodes, for example. A predetermined amount of chlorophyll is used as a suspension of thylakoid membranes in each measurement. For quantitative evaluation, the measurements are compared with control measurements. There is a wide range of applications for the method according to the present invention. In this context, one should think of, for example, bio-monitoring in groundwater and surface water for the detection of herbicidal active substances which inhibit photosynthetic electron transport, such as are used in commercially available herbicide preparations. It is particularly advantageous that the method can be used as a rapid test to check compliance with the drinking water limit value for herbicides at changing locations.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirk- Stoffen im Wasser unter Verwendung von Chloroplastenthylakoiden, d a d u r c h g e k e n z e i c h n e t, daß anstelle des bei der Isolierung der Chloroplastenthylakoiden aus dem photosynthetischen Elektronentransportsystem ausgewaschenen Elektronenakzeptors ein Mediator eingesetzt wird und die Wirkung des herbiziden Wirkstoffes auf den Elektronen¬ transport bestimmt wird.1. A method for the rapid detection of herbicidal active substances in water using chloroplast thylakoids, characterized in that a mediator is used instead of the electron acceptor washed out from the photosynthetic electron transport system during the isolation of the chloroplast thylakoids and the effect of the herbicidal active substance on electron transport is determined becomes.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator Flavin-Mononukleotid (FMN) ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the mediator is flavin mononucleotide (FMN).
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch ge- kennzeichnet, daß der Nachweis des herbiziden Wirkstoffes im3. The method according to claims 1 or 2, characterized in that the detection of the herbicidal active ingredient in
Wasser durch Messung der Verringerung des SauerstoffVerbrauchs als Maß für die Hemmung des Elektronentransporrsystems erfolgt.Water is measured by measuring the reduction in oxygen consumption as a measure of the inhibition of the electron transport system.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß der Nachweis des herbiziden Wirkstoffes im Wasser durch Messung der Steigerung der Fluoreszenzemission als Maß für die Hemmung des Elektronentransportsystems erfolgt . 4. The method according to claims 1 or 2, characterized ge indicates that the detection of the herbicidal active ingredient in Water by measuring the increase in fluorescence emission as a ß M for Hemmun g of the electron transport system takes place.
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