DE102013207146B4

DE102013207146B4 - Verbindung und Verfahren zum Nachweis von Analyten

Info

Publication number: DE102013207146B4
Application number: DE102013207146.9A
Authority: DE
Inventors: Martin Giersberg; Gotthard Kunze
Original assignee: LEIBNIZ INST fur PFLANZENGENETIK und KULTURPFLANZENFORSCHUNG; Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: LEIBNIZ INST fur PFLANZENGENETIK und KULTURPFLANZENFORSCHUNG; Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2015-10-15
Anticipated expiration: 2033-04-20
Also published as: DE102013207146A1

Abstract

Nachweisverbindung zum Nachweisen eines Analyten mit einem Rezeptor, gekennzeichnet durch einen ersten Bestandteil, der einen ersten Anteil des Rezeptors als ersten Rezeptorabschnitt und einen ersten Anteil einer Reporterverbindung als ersten Reporterabschnitt aufweist und durch einen zweiten Bestandteil, der einen mit dem ersten Rezeptorabschnitt zumindest dimerisierbaren zweiten Anteil des Rezeptors als zweiten Rezeptorabschnitt und einen zweiten Anteil der Reporterverbindung als zweiten Reporterabschnitt aufweist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung zum Nachweisen eines Analyten und ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten mittels der Verbindung, sowie Verfahren zur Herstellung der Nachweisverbindung.
Die Nachweisverbindung zeichnet sich dadurch aus, dass sie aus zumindest zwei Bestandteilen besteht, die in Anwesenheit des Analyten aneinander binden und eine optisch detektierbare Verbindung bilden oder alternativ eine reaktive Bindung bilden, die ein Substrat zu einem detektierbaren Produkt umsetzen kann. Das Verfahren zum Nachweisen des Analyten weist entsprechend den Schritt des Messens der detektierbaren Verbindung der Bestandteile der Nachweisverbindung auf, z. B. des Messens eines Unterschieds der optischen Eigenschaften der Bestandteile der Nachweisverbindung vor und nach deren Kontaktierung mit einem Analyten.
Stand der Technik
Die DE 103 45 386 A1 beschreibt den Nachweis einer Substanz mit Östrogenwirkung mittels einer rekombinanten Hefezelle, die einen Östrogenrezeptor exprimiert und ein Reportergen mit einem Promotor enthält, der ein Östrogen-Response-Element (ERE) aufweist. Die Bindung von Östrogen an den Östrogenrezeptor führt zu dessen Dimerisierung und zur Bindung des Rezeptor-Dimers an das Östrogen-Response-Element, wodurch der Promotor aktiviert wird.
Kaiser et al., Science of the Total Environment 6017–6026 (2010) beschreiben genetisch manipulierte Hefe, die den menschlichen Östrogenrezeptor alpha (hERα) exprimiert und ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors enthält, dessen Aktivität von 2 Östrogen-Response-Elementen (ERE) abhängig ist.
Die DE 10 2007 027 619 B4 beschreibt eine als Biosensor verwendbare Hefezelle, die aufgrund genetischer Manipulation mitotisch stabil einen Östrogenrezeptor und eine Expressionskassette für ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors kodiert, der von einem Östrogen-Response-Element reguliert ist. Die Gegenwart einer Substanz mit Östrogenwirkung führt zur Expression des Reportergens, das detektierbar ist.
Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung einer alternativen Nachweisverbindung und eines alternativen Verfahrens zum Nachweisen eines Analyten. Bevorzugt liegt die Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung einer alternativen Nachweisverbindung bzw. eines alternativen Verfahrens zum Nachweisen eines Analyten, die eine schnellere Detektion der Anwesenheit des Analyten erlauben, bevorzugt auch im zellfreien System.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche, insbesondere mit einer Nachweisverbindung, die zumindest zwei Bestandteile aufweist, die in Anwesenheit eines Analyten aneinander binden, wobei jeder Bestandteil zumindest einen Anteil eines Rezeptors als Rezeptorabschnitt aufweist, an den zumindest ein Anteil einer Reporterverbindung als Reporterabschnitt gebunden ist, wobei die Reporterabschnitte, die mit jeweils einem Rezeptorabschnitt verbunden sind, in Anwesenheit des Analyten die Bindung von zumindest zwei Bestandteilen der Nachweisverbindung zu einer Änderung des von der Reporterverbindung detektierbaren Signals führt. Die Nachweisverbindung zum Nachweisen eines Analyten weist daher zumindest zwei Bestandteile auf, die in Anwesenheit des Analyten aneinander binden und zu einer Änderung des von der Nachweisverbindung detektierbaren Signals führt. Entsprechend kann die Nachweisverbindung auch als Kombination der beiden Bestandteile bezeichnet werden.
Der Rezeptor ist vorzugsweise ein Kernrezeptor, so dass entsprechend die Rezeptorabschnitte vorzugsweise Anteile eines Kernrezeptors sind. Die Rezeptorabschnitte können gleich sein und zumindest dimerisieren oder können unterschiedlich sein und zumindest heterodimerisieren.
In einem ersten Bestandteil der zumindest zwei Bestandteile der Nachweisverbindung ist ein erster Rezeptorabschnitt eines zumindest dimerisierbaren Rezeptors mit einem ersten Reporterabschnitt verbunden. Bevorzugt ist der erste Rezeptorabschnitt mittels eines Verbindungsabschnitts mit dem ersten Reporterabschnitt verbunden.
Entsprechend des ersten Bestandteils weist der zweite Bestandteil einen zweiten Rezeptorabschnitt und einen damit verbundenen zweiten Reporterabschnitt auf, wobei bevorzugt der zweite Rezeptorabschnitt mittels eines Verbindungselements mit dem zweiten Reporterabschnitt verbunden ist.
Die Verbindungselemente von erstem und zweitem Bestandteil können jeweils gleich oder unterschiedlich sein. Die Verbindungselemente können bifunktionelle Gruppen sein, an denen ein Rezeptorabschnitt und ein Reporterabschnitt gebunden sind, z. B. kovalent, durch eine Komplexbindung oder eine spezifische Affinität.
Der erste Rezeptorabschnitt und der zweite Rezeptorabschnitt sind bevorzugt natürliche Anteile oder Untereinheiten eines Rezeptors, die in Anwesenheit des Analyten eine Verbindung bilden, die z. B. zumindest zwei, optional drei, vier oder mehr Anteile oder Untereinheiten des Rezeptors aufweist.
Der erste und der zweite Bestandteil der Nachweisverbindung sind dadurch, dass sie jeweils einen Anteil eines Rezeptors als Rezeptorabschnitt aufweisen, dazu eingerichtet, in Anwesenheit des Analyten aneinander zu binden. Die Bindung des ersten Rezeptorabschnitts des ersten Bestandteils an den zweiten Rezeptorabschnitt des zweiten Bestandteils führt zu einer Annäherung des ersten Reporterabschnitts an den zweiten Reporterabschnitt, sodass das für die Reporterabschnitte detektierbare Signal durch deren Annäherung verändert wird.
Der erste und der zweite Reporterabschnitt können ein erster bzw. ein zweiter Anteil einer Reporterverbindung sein, die ein fluoreszierendes oder ein lumineszierendes Protein ist. Bevorzugt sind der erste und der zweite Reporterabschnitt Anteile einer Reporterverbindung, die sich bei Annäherung zu einer Reporterverbindung ergänzen, die insbesondere andere optische Eigenschaften aufweist als die Reporterabschnitte in einer voneinander räumlich beabstandeten Anordnung, z. B. andere Fluoreszenzeigenschaften. Bevorzugt sind der erste und zweite Reporterabschnitt Anteile der Reporterverbindung, die für sich jeweils keine optische Aktivität aufweisen, z. B. keine Fluoreszenz, die sich bei Annäherung des ersten und zweiten Rezeptorabschnitts, die durch die Anwesenheit des Analyten erzeugt wird, zu einer funktionellen Reporterverbindung ergänzen, die die optische Aktivität aufweist. Bevorzugt sind der erste und zweite Reporterabschnitt Anteile eines fluoreszierenden Proteins, die bei Annäherung ein gegenüber den voneinander beabstandeten Reporterabschnitten geändertes Fluoreszenzverhalten zeigen, z. B. eine Fluoreszenz bei Annäherung, die bei Beabstandung der Reporterabschnitte, wie sie in Abwesenheit des Analyten ohne Bindung der Bestandteile aneinander vorliegt, keine bzw. eine verminderte Fluoreszenz bei derselben Anregungswellenlänge aufweist.
Alternativ kann der erste Reporterabschnitt ein fluoreszierender oder lumineszierender Farbstoff sein und der zweite Reporterabschnitt ein Quencher, der zumindest einen Anteil der vom ersten Reporterelement abgegebenen Strahlung reduziert.
Weiter alternativ können der erste und der zweite Reporterabschnitt Anteile eines Enzyms sein, das bei Annäherung der Reporterabschnitte in eine katalytisch aktive Form gebracht wird, die durch Umsetzung eines Indikatorsubstrats nachweisbar ist. Generell kann einer der Reporterabschnitte z. B. einen N-terminalen Anteil von 20 bis 70% des Enzyms umfassen und der andere Reporterabschnitt den verbleibenden C-terminalen Anteil. Ein solches Enzym kann alkalische Phosphatase (p-Nitrophenylphosphat als Indikatorsubstrat), β-Lactamase (in Kombination mit CCF2, CCF4 CCF2/4 als fluorogenem Indikatorsubstrat) oder Phytase (in Kombination mit p-Nitrophenylphosphat als Indikatorsubstrat) sein.
Weiter alternativ können der erste und der zweite Reporterabschnitt Anteile eines Transkriptionsfaktors (TF) sein, die durch ihre Annäherung in eine aktive Form gebracht werden, die spezifisch die Expression eines Proteins, welches ein detektierbares Signal verursacht, z. B. durch Umsetzung eines Indikatorsubstrats. Generell kann einer der Reporterabschnitte z. B. einen N-terminalen Anteil von 20 bis 70% des TF umfassen und der andere Reporterabschnitt den verbleibenden C-terminalen Anteil. Ein solcher TF kann z. B. der spezifische TF der Gene Uratoxidase, Tannase, Glucoamylase, Adenindeaminase sein.
Die Nachweisverbindung kann den ersten und zweiten Bestandteil getrennt oder in einer Mischung dieser aufweisen oder daraus bestehen, z. B. zellgebunden oder in einem zellfreien System, beispielsweise in wässriger Lösung. Wenn die Nachweisverbindung zellgebunden ist, sind der erste und zweite Bestandteil durch ein in einem Mikroorganismus enthaltenes Nukleinsäurekonstrukt kodiert, von dem sie exprimierbar sind, beispielsweise unter der Kontrolle eines oder mehrerer konstitutiver oder induzierbarer Promotoren. Das Nukleinsäurekonstrukt kann die Bestandteile in aneinander angrenzenden Abschnitten oder in beabstandeten Abschnitten kodieren. Zur Herstellung können kodierende Nukleinsäuren in einer Expressionskassette angeordnet sein, z. B. zwischen einem Promotor, der in 5'-Orientierung zur kodierenden Nukleinsäure angeordnet ist und einem Terminator, der in 3'-Orientierung zur kodierenden Nukleinsäure angeordnet ist.
Bevorzugt ist eine Zelle, in der Nukleinsäurekonstrukte enthalten sind, die den ersten und den zweiten Bestandteil kodieren, eine eukaryotische Zelle, z. B. eine menschliche Zelllinie, bevorzugt eine Hefe, z. B. der Gattung Arxula, Saccharomyces, Pichia spp., Hansenula spp. oder Yarrowia spp.
Das Verfahren zur Herstellung der Nachweisverbindung kann die Schritte aufweisen, den ersten Bestandteil durch Erzeugen einer Bindung zwischen einem ersten Rezeptorabschnitt und einem ersten Reporterabschnitt herzustellen und den zweiten Bestandteil durch Erzeugen einer Bindung zwischen dem zweiten Rezeptorabschnitt mit einem zweiten Reporterabschnitt herzustellen. Bevorzugt werden jeweils eine Bindung eines Rezeptorabschnitts und eine Bindung eines Reporterabschnitts zu einem gemeinsamen Verbindungsabschnitt erzeugt.
In Ausführungsformen, in denen ein erster Reporterabschnitt ein Farbstoff ist und ein zweiter Reporterabschnitt ein Quencher oder in denen beide Reporterabschnitte Anteile eines fluoreszierenden oder lumineszenten Proteins sind, kann der Verbindungsabschnitt eine bifunkionelle Gruppe sein, von der die eine Funktion eine Bindung mit dem Rezeptorabschnitt und die andere Funktion eine Bindung mit dem Reporterabschnitt eingeht. Bevorzugt sind die Funktionen einer bifunktionellen Gruppe, die einen Verbindungsabschnitt bildet, nicht miteinander reaktiv, besonders bevorzugt sind diese Funktionen überdies unterschiedlich. Beispiele für solche bifunktionellen Gruppen sind Komplexe aus Avidin oder Streptavidin und Biotin, von denen ein Komplexbildner mit einem von Rezeptorabschnitt und Reporterabschnitt und der andere Komplexbildner mit dem anderen von Rezeptorabschnitt und Reporterabschnitt verbunden sind.
Reporterabschnitte, die Anteile eines fluoreszierenden oder lumineszenten Proteins sind, können z. B. ein N-terminaler Abschnitt und ein C-terminaler Abschnitt eines solchen Proteins sein, wobei sich die Abschnitte bevorzugt zu 100% ergänzen und der N-terminale oder der C-terminale Abschnitt 10 bis 80%, bevorzugt 30 bis 50% des Proteins aufweisen.
Weitere Beispiele für solche bifunktionellen Gruppen sind bifunktionelle C₆- bis C₁₂-Kohlenwasserstoffe, z. B. mit zwei gleichen oder unterschiedlichen funktionellen Gruppe aus der Gruppe, die Aminogruppen bzw. Carbonsäuregruppen umfasst, sowie Peptide, insbesondere Peptide, die nachfolgend als Verbindungselemente aus Aminosäuren beschrieben sind.
Bevorzugt ist sowohl der erste Bestandteil als auch der zweite Bestandteil jeweils als ein Peptid ausgebildet, wahlweise ist die Nachweisverbindung mit erstem Bestandteil und zweitem Bestandteil als ein gemeinsames Peptid ausgebildet. Bevorzugt ist zwischen dem ersten Bestandteil und dem zweiten Bestandteil ein Verbindungselement aus Aminosäuren gebildet, das z. B. ein oder mehrere gleiche oder verschiedene Strukturelemente aufweist oder daraus besteht, die zwischen dem ersten Rezeptorelement und dem ersten Reporterelement angeordnet sein können. Bevorzugt ist der erste Bestandteil in Form einer durchgehenden Aminosäurekette ausgebildet und der zweite Bestandteil in Form einer weiteren durchgehenden Aminosäurekette. Optional können der erste und der zweite Bestandteil in Form einer gemeinsamen durchgehenden Aminosäurekette ausgebildet sein, wobei bevorzugt ein Kopplungsabschnitt zwischen erstem und zweitem Bestandteil angeordnet ist. Der Kopplungsabschnitt kann z. B. aus einem oder mehreren Verbindungselementen aus Aminosäuren gebildet sein.
Generell kann der Reporterabschnitt direkt oder mittels eines Verbindungselements mit dem N-Terminus des Rezeptorabschnitts verbunden sein, wobei die Domäne des Rezeptorabschnitts, die den Analyten bindet und auch als Ligandenbindedomäne bezeichnet wird, bevorzugt am C-Terminus des Rezeptorabschnitts angeordnet ist. Optional weist der Rezeptorabschnitt eine DNA-Bindedomäne auf, die bevorzugt N-terminal zur Ligandenbindedomäne angeordnet ist.
Alternativ ist der Reporterabschnitt direkt oder mittels eines Verbindungselements mit dem C-Terminus des Rezeptorabschnitts verbunden.
Erste und zweite Rezeptorabschnitte können z. B. gleich oder unterschiedlich sein und aus den folgenden Rezeptoren ausgewählt werden:

RXR: (Retinsäure-Rezeptor, SEQ ID NO: 1)
PXR: (Pregnan-Rezeptor, SEQ ID NO: 2)
CAR: (konstitutiver Androstan-Rezeptor, SEQ ID NO: 3)
AHR: (Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor, Dioxin-Rezeptor, SEQ ID NO: 4)
ARNT: (Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Kerntranslokator, SEQ ID NO: 5)
GR: (Glucocorticoid-Rezeptor, SEQ ID NO: 6)
MR: (Mineralocorticoid-Rezeptor, SEQ ID NO: 7)
PR: (Progesteron-Rezeptor, SEQ ID NO: 8)
AR: (Androgen-Rezeptor, SEQ ID NO: 9)
ERα: (Östrogen-Rezeptor alpha, SEQ ID NO: 10)
PPAR: (Peroxisom-proliferator-aktivierter Rezeptor alpha, SEQ ID NO: 11)
RAR-α: (Retinsäure-Rezeptor alpha, SEQ ID NO: 12)
FXR: (Farnesol-Rezeptor HRR-1, SEQ ID NO: 13)
ROR-α: (Kernrezeptor ROR-alpha, SEQ ID NO: 14)
LXR-α: (Oxysterol-Rezeptor alpha, SEQ ID NO: 15)
VDR: (Vitamin-D3-Rezeptor, SEQ ID NO: 16)

Wenn der erste und der zweite Rezeptorabschnitt unterschiedlich sind, können sie z. B. aus den folgenden Kombinationen ausgewählt werden:

	Erster und zweiter Rezeptorabschnitt		Analyt z. B.
1.	PXR (Pregnan-Rezeptor) (SEQ ID NO: 2)	RXR (Retinsäure-Rezeptor) (SEQ ID NO: 1)	Stoffe mit pharmazeutischer Wirkung, z. B. Diclofenac
2.	ARNT (Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Kerntranslokator) (SEQ ID NO: 5)	AHR (Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor, Dioxin-Rezeptor) (SEQ ID NO: 4)	Dioxine, Furane, Pharmaka z. B. 2, 3, 7, 8, 8, TCDD, Omeprazol
3.	CAR (konstitutiver Androstan-Rezeptor, SEQ ID NO: 3	RXR (Retinsäure-Rezeptor) (SEQ ID NO: 1)	Stoffe mit pharmazeutischer Wirkung, z. B. Diclofenac

Erste und zweite Reporterabschnitte können z. B. aus den folgenden Paaren ausgewählt sein:

	Reporter C-Terminus	Reporter N-Terminus
1.	C-terminaler Abschnitt von Venus-Yellow (SEQ ID NO: 17)	N-terminaler Abschnitt von Venus-Yellow (SEQ ID NO: 19)
2.	C-terminaler Abschnitt von Super-Cyan (SEQ ID NO: 18)	N-terminaler Abschnitt von Super-Cyan (SEQ ID NO: 20)
3.	C-terminaler Abschnitt von Super-Cyan (SEQ ID NO: 18)	N-terminaler Abschnitt von Venus-Yellow (SEQ ID NO: 19)
4	C-terminaler Abschnitt von Venus-Yellow (SEQ ID NO: 17)	N-terminaler Abschnitt von Super-Cyan (SEQ ID NO: 20)
5.	C-terminaler Abschnitt von GFP (SEQ ID NO: 27)	N-terminaler Abschnitt von GFP (SEQ ID NO: 26)
6.	C-terminaler Abschnitt von YFP (SEQ ID NO: 25)	N-terminaler Abschnitt von YFP (SEQ ID NO: 24)

Bevorzugt weist jeder Bestandteil zumindest einen Abschnitt mit hoher Affinität zu einem immobilisierbaren Bindeelement auf, z. B. N-terminal und/oder C-terminal, so dass das Verfahren zur Herstellung den Schritt der Anreicherung der Bestandteile aus einer Mischung durch Binden an das immobilisierbare Bindeelement, Waschen und Eluieren der gebundenen Bestandteile umfassen kann. Beispiele für Abschnitte mit hoher Affinität sind Polyhistidinabschnitte, wie z. B. His₆, His₁₀, His₅, HAT-tag, Strep-tag, c-myc Epitop-tag, Flag-tag, GST-tag, und immobilisierbare Bindeelemente sind z. B. komplexierte Nickelionen Kobaltionen, Zinkionen und Kupferionen, Streptavidin, Antikörper und Glutathion.
Das Verbindungselement kann z. B. ein oder mehrere, insbesondere 3 bis 5, bevorzugt 4 Strukturelemente der Aminosäuresequenz GGGS (SEQ ID NO: 21), GGGGS (SEQ ID NO: 23) und/oder EEGEFSEAR (SEQ ID NO: 22) aufweisen oder daraus bestehen.
Das Verfahren zum Nachweisen eines Analyten weist die Schritte des Kontaktierens der Nachweisverbindung mit oder aus erstem und zweitem Bestandteil mit dem Analyten auf, bzw. mit einer einen Analyten enthaltenen Probe, und Messen der Änderung eines Signals, das von dem ersten und/oder zweiten Reporterabschnitt detektierbar ist, beispielsweise mit Einstrahlen einer Anregungswellenlänge, die für den ersten Reporterabschnitt oder den zweiten Reporterabschnitt oder für die aneinander gebundenen ersten und zweiten Reporterabschnitte spezifisch ist, oder aus diesen Schritten besteht.
Entsprechend kann das Messen des detektierbaren Signals bei einer Wellenlänge erfolgen, die für den ersten Reporterabschnitt, den zweiten Reporterabschnitt oder bevorzugt für eine Verbindung aus erstem und zweitem Reporterabschnitt spezifisch ist, oder daraus bestehen.
In Ausführungsformen, in denen die Reporterabschnitte Anteile eines Enzyms sind, die bei Annäherung der Reporterabschnitte in Anwesenheit des Analyten eine katalytisch aktive Form des Enzyms bilden, wird insbesondere anstelle des Einstrahlens einer Anregungswellenlänge die Umsetzung eines Indikatorsubstrats bzw. eines internen Metaboliten detektiert, z. B. durch kolorimetrische oder photometrische Messung.
Bevorzugte Analyten sind Stoffe mit Wirkung auf einen Rezeptor der Nachweisverbindung, z. B. Stoffe mit Hormonwirkung, pharmazeutische Wirkstoffe, Schadstoffe und Toxine.
Entsprechend betrifft die Erfindung auch Verfahren zum Nachweisen eines Analyten und/oder zum Nachweisen der Wirkung eines Analyten auf den Rezeptor der Nachweisverbindung, z. B. Screeningverfahren für pharmazeutische Wirkstoffe als Analyten, um deren Wirkung auf den Rezeptor zu bestimmen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren beschrieben, die in
1 schematisch ein Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der Bestandteile einer Nachweisverbindung in Hefen,
2A) und B) die Analyse der Bestandteile der Nachweisverbindung mittels SDS-PAGE A) und Western Blot B)
3 fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Arxula adeninivorans Hefezellen, transformiert mit Expressionsvektoren für die Bestandteile der Nachweisverbindung (VY-N-Terminus-AHR/VY-C-Terminus-ARNT) A) ohne zugesetzten Analyten und B) mit zugesetztem Analyten,
4A eine graphische Darstellung mit dem Verfahren (zellgebunden) gemessener Fluoreszenzwerte nach Zusatz verschiedener Analytkonzentrationen zeigen (B: nach Subtraktion Kontrollwert (Blank) 0 μg) und in
5 fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der menschlichen HeLa Zelllinie, transformiert mit Expressionsvektoren für die Bestandteile der Nachweisverbindung (VY-C-Terminus-PXR/Cyan-N-Terminus-RXR) A) ohne zugesetzten Analyten und B) mit zugesetztem Analyten.
Beispiel 1: Herstellung einer Nachweisverbindung durch chemische Bindung von Rezeptorabschnitten mit Reporterabschnitten
Als Beispiel für Rezeptorabschnitte wurden der RX-Rezeptor (SEQ ID NO: 1) und der PX-Rezeptor (SEQ ID NO: 2) von Expressionskassetten kodiert und jeweils in getrennten Kulturen eines Mikroorganismus exprimiert. Die Rezeptorabschnitte wurden in herkömmlicher Weise aus den Kulturen isoliert, z. B. mit gelchromatographischen Verfahren. Bevorzugt wiesen die Rezeptorabschnitte ein His₆ auf, z. B. N-terminal, und die Isolierung erfolgte mittels Affinitätschromatographie.
Als Reporterabschnitte wurden der C-terminale Anteil von Venus-yellow (SEQ ID NO: 17) und davon getrennt der N-terminale Anteil von Venus-yellow (SEQ ID NO: 19), jeweils mit zusätzlichem N-terminalem His₆ und C-terminalem GGGS-Verbindungselement (SEQ ID NO: 21), von Expressionskassetten in einem Mikroorganismus exprimiert und mittels Affinitätschromatographie an Ni-Säulen isoliert.
Beispiel 2: Herstellung einer Nachweisverbindung durch Bindung von Rezeptorabschnitten mit Farbstoffen als Reporterabschnitten
Gemäß Beispiel 1 wurden Rezeptorabschnitte durch Expression und Isolation hergestellt.
In Alternative zu den mit His₆ und dem Verbindungselement versehenen C-terminalen und N-terminalen Abschnitten von Venus-Yellow von Beispiel 1 wurde ein Rezeptorabschnitt mit GFP oder YFP als fluoreszierender Reporterabschnitt und der andere Rezeptorabschnitt mit einem spezifischen Antikörper (als Quencher) am zweiten Reporterabschnitt verbunden. Bevorzugt wies jeder Rezeptorabschnitt N-terminal zumindest ein GGGS-Element (SEQ ID NO: 21) als Verbindungselement auf.
In Alternative zu den mit His₆ und dem Verbindungselement versehenen C-terminalen und N-terminalen Abschnitten von Venus-Yellow von Beispiel 1 wurde ein Rezeptorabschnitt mit einem Fluorochrom als Reporterabschnitt und der andere Rezeptorabschnitt mit einem Quencher oder einem zweiten Fluorochrom als Reporterabschnitt verbunden. Bevorzugt wies jeder Rezeptorabschnitt N-terminal zumindest ein GGGS-Element als Verbindungselement auf und der Reporterabschnitt wurde mit dem Verbindungselement verbunden, insbesondere für die ortsspezifische Bindung an der terminalen Aminosäure des Verbindungselements.
Beispiel 3: Herstellung von Nachweisverbindung durch Expression von Rezeptorabschnitten mit Reporterabschnitten
Zur Expression der Bestandteile der Nachweisverbindung wurde ein Vektor, der schematisch in 1 gezeigt ist, linearisiert und in A. adeninivorans transformiert. Dieser Transformationsvektor ist zur gleichzeitigen Expression der Nachweisverbindungen Cyan-N-Terminus-PX-Rezeptor und Venus Yellow-C-Terminus-RX-Rezeptor in Hefe geeignet. Der Vektor enthält zur Komplementierung der Tryptophan-Auxotrophie des Arxula-Stamms das ATRP1-Gen unter der Kontrolle des ALEU2-Promotors und zur homologen Rekombination bzw. Integration Abschnitte der 25S-rDNA (d25S-rDNA2 und d25S-rDNA-1) aus Arxula.
Ein erster Bestandteil ist in einer Expressionskassette als einem Fusionsprotein, vom N-Terminus zum C-Terminus, aus dem C-terminalen Anteil von Cyan-blau (SC-Cterm, SEQ ID NO: 18), GGGS (GGGS-Linker, SEQ ID NO: 21) als Verbindungselement und dem RX-Rezeptor (SEQ ID NO: 1) kodiert und zwischen einem Promotor (TEF-e-Promotor) und einem Terminator (PHO5-Terminator) angeordnet.
Ein zweiter Bestandteil ist in einer separaten Expressionskassette des Vektors als ein Fusionsprotein, vom N-Terminus zum C-Terminus, aus einem His₆ (HIS-6x) mit dem N-terminalen Anteil von Cyan-Blau (Nterm1, SEQ ID NO: 20), GGGS (GGGS-L, SEQ ID NO: 21) als Verbindungselement und dem PXR-Rezeptor (PXR, SEQ ID NO: 2) kodiert und zwischen einem Promotor (TEF-e) und einem Terminator (PHO5) angeordnet.
In Alternative zu den C-terminalen und N-terminalen Anteilen von Venus-Yellow könnte ein C-terminaler Anteil bzw. ein N-terminaler Anteil des Enzyms Phytase bzw. eines Transkriptionsfaktors der in der kodierenden Nukleinsäuresequenz für die Fusionsproteine der Bestandteile kodiert, sein.
Optional wurden die Bestandteile isoliert. 2 zeigt mit Coomassie-Blau gefärbte SDS-Polyacrylamidgele (PAGE) mit elektrophoretisch getrennten Proteinen, wobei jeweils die linke Spur Markerproteine enthält und RE einen Rohextrakt, DL der Durchlauf durch die Säule, W1 und W2 Waschfraktionen und E1, E2 und E3 Elutionsfraktionen von einer Ni-NTA Säule sind. Der Rohextrakt lag in Phosphat-Puffer vor, zum Waschen wurde Tris-Puffer mit 20 mM Imidazol verwendet, die Elution erfolgte mit Tris-Puffer, 250 mM Imidazol.
2A) zeigt am Beispiel der Expression und Reinigung der Fluoreszenzpeptid-Rezeptorfusionen (E. coli), dass der Bestandteil aus Retinsäure-Rezeptor (RXR) mit C-terminalem Reporterabschnitt (RX-N-term, 74 kDa, Pfeil), der Bestandteil aus Retinsäure-Rezeptor mit C-terminalem Reporterabschnitt (RX-C-term, 64 kDa, Pfeil), der Bestandteil aus PregnanX-Rezeptor mit N-terminalem Reporterabschnitt (PX-N-term, 72 kDa, Pfeil) in E. coli exprimiert und isoliert werden kann.
2B) zeigt im Western Blot von E. coli-Extrakten durch die Erkennung der Fusionsproteine durch spezifische Antikörper, dass unterschiedliche Kombinationen aus Reporteranteil und Rezeptor in E. coli exprimiert und isoliert werden können. Dabei bezeichnen

RVN:: RXR-N-Terminus Venus Yellow
RVC:: RXR-C-Terminus Venus Yellow
RCN:: RXR-N-Terminus Cyan
PVC:: PXR-C-Terminus Venus Yellow
PVN:: PXR-N-Terminus Venus Yellow
PCN:: PXR-N-Terminus Cyan
WT:: E. coli Negativkontrolle
K:: Western Blot Positivkontrolle
M:: Proteinmarker
i:: mit IPTG induzierte Probe/Kultur
ni:: nicht induzierte Probe/Kultur

Beispiel 4: Zellgebundenes Verfahren zum Nachweisen eines Analyten
Nach Beispiel 3 hergestellte Arxula-Stämme, die mit einem Konstrukt für den ersten Bestandteil, der vom N-Terminus zum C-Terminus aus dem Dioxin-Rezeptor als Rezeptorabschnitt, dem 4 × GGGS Sequenzmotiv als Verbindungselement und dem C-Terminus des Venus-Yellow Proteins als Reporterabschnitt bestand, sowie für den zweiten Bestandteil, vom N-Terminus zum C-Terminus aus dem ARNT als Rezeptorabschnitt, dem 4 × GGGS Sequenzmotiv als Verbindungselement und dem N-Terminus des Venus-Yellow Proteins als Reporterabschnitt bestand, transformiert waren, wurden in Schüttelkultur bei 30°C angezogen. Ein Aliquot wurde mit 500 ng/L Indirubin als Analyt versetzt und nach einer Inkubation für 4 h mit einer Anregungsstrahlung von 488 nm bestrahlt. Anschließend wurde die Emission bei 530 nm gemessen.
3 zeigt die Inkubation der A. adeninivorans-Stämme, die als Nachweisverbindung: Venus Yellow-N-Terminus-AHR (SEQ ID: 28) in Kombination mit Venus-Yellow C-Terminus-ARNT (SEQ ID: 29) exprimieren, als ein Beispiel für den Nachweis von Dioxinen und/oder Pharmaka den Nachweis von 500 ng/l Indirubin. Die 3A) zeigt, dass auch in Abwesenheit von Analyt eine geringe Fluoreszenz detektierbar ist. In 3B) wird deutlich, dass in Anwesenheit des Analyten die Fluoreszenz stark zunimmt. Durch die Translokation des Rezeptor-Ligand-Komplexes in den Zellkern und anschließender Dimerisierung ist die Fluoreszenz im Wesentlichen auf den Zellkern beschränkt und zeigt die Funktionalität, sowie die Spezifität des Systems an. Diese Ergebnisse belegen, dass die erfindungsgemäße Nachweisverbindung eine für den Analyten spezifische Reaktion zeigt, die durch Detektion einer Änderung der Eigenschaften der Reporterabschnitte messbar ist, hier in Form der Messung der Zunahme der Fluoreszenz. Der Maßbalken entspricht in den Abbildungen von 3 jeweils 5 μm.
Die 4 zeigt Fluoreszenzwerte relativ zur Fluoreszenz ohne Analyt (DMSO als Kontrolle), die im Mikrotiterplattenformat in 100 μL Zellkultur bei den angegebenen Mengen Indirubin gemessen wurden. Die Daten machen deutlich, dass eine konzentrationsabhängige rezeptorspezifische Wirkung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren im Mikrotiterplattenformat bestimmt werden kann.
Nach Beispiel 3 hergestellte A. adeninivorans, die mit dem Konstrukt von 1 transformiert waren, wurden in Schüttelkultur bei 30°C angezogen. Rifampicin als Analyt konnte nach einer Inkubationszeit von 4 h durch eine spezifische, im Zellkern lokalisierte erzeugte Fluoreszenz detektiert werden. 5 zeigt Inkubation der A. adeninivorans Transformanden, die als Nachweisverbindung Venus-Yellow-C-Terminus-PX in Kombination Venus-Cyan N-Terminus-RX exprimieren, mit 50 nM Rifampicin als Beispiel für den Nachweis von Xenobiotika und/oder Pharmaka.
Alternativ wurden HeLa-Zellen mit den Expressionskassetten für die Bestandteile der Nachweisverbindung gemäß 1 transfiziert. Die 6 zeigt die transfizierten HeLa-Zellen in Anwesenheit von 10 μM Dexamethason als Analyt, jeweils unter Einstrahlung einer Anregungsstrahlung von 488 nm und unter Verwendung eines GFP-Filtersatzes. Dies zeigt, dass auch in menschlichen Zellen die Bestandteile der Nachweisverbindung im Zellkern eine funktionelle Einheit bilden und eine für den Analyten spezifische Änderung erfahren, die als detektierbares Signal messbar ist, vorliegend als Fluoreszenz. 6A) zeigt die Hela-Zellen inkubiert mit Analyt (10 μM Dexamethason), 6B) zeigt die Hela-Zellen mit Analyt und mit Farbstoff Hoechst zur gleichzeitigen Chromatinfärbung (blau). Dadurch wird deutlich, dass das durch den Analyten erzeugte Signal der Nachweisverbindung im blau gefärbten Kern erzeugt wird.
Beispiel 5: Zellfreies Verfahren zum Nachweisen eines Analyten
Nach Beispiel 3 exprimierte Bestandteile der Nachweisverbindung, z. B. ein erster Bestandteil aus einem RX-Rezeptorabschnitt mit N-terminal über ein Verbindungselement aus 1 bis 4 GGGS-Einheiten verbundenen C-terminalen Anteil von Super-Cyan und ein zweiter Bestandteil aus einem PX-Rezeptorabschnitt mit N-terminal über ein gleiches Verbindungselement verbundenen N-terminalen Anteil von Super-Cyan wurden als Zellextrakte in wässrigem Puffer gemischt und mit Analyt versetzt. Es konnte eine in Abhängigkeit vom Analyten zunehmende Fluoreszenz detektiert werden.
Beispiel 6: Screeningverfahren für pharmazeutische Wirkstoffe
Zellen von Mikroorganismen, z. B. Hefe, bevorzugt menschliche Zellen, die für einen ersten und einen zweiten Bestandteil der Nachweisverbindung eine Expressionskassette enthalten, wurden kultiviert und aliquotiert. Zu den Aliquots wurde jeweils zumindest ein Analyt oder eine Kombination von zwei oder mehreren Analyten zugesetzt, deren pharmakologische Wirkung auf den Rezeptor der Nachweisverbindung analysiert werden sollte. Dabei zeigte sich ein Vorteil der Nachweisverbindung darin, dass eine Wechselwirkung von Analyten auf einfache Weise direkt als Änderung einer Eigenschaft der Reporterabschnitte detektierbar war und z. B. schneller messbar war als die durch einen Analyten induzierte Expression eines Reportergens.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Nachweisverbindung zum Nachweisen eines Analyten mit einem Rezeptor, gekennzeichnet durch einen ersten Bestandteil, der einen ersten Anteil des Rezeptors als ersten Rezeptorabschnitt und einen ersten Anteil einer Reporterverbindung als ersten Reporterabschnitt aufweist und durch einen zweiten Bestandteil, der einen mit dem ersten Rezeptorabschnitt zumindest dimerisierbaren zweiten Anteil des Rezeptors als zweiten Rezeptorabschnitt und einen zweiten Anteil der Reporterverbindung als zweiten Reporterabschnitt aufweist.
Nachweisverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor ein Kernrezeptor ist.
Nachweisverbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Reporterabschnitt unter Anteilen eines fluoreszierenden Peptids, Anteilen eines Enzyms, Anteilen eines Transkriptionsfaktors, Anteilen eines Antikörpers, fluoreszierenden Farbstoffen oder einer Kombination aus fluoreszierendem Farbstoff oder Peptid und Quencher, der von dem fluoreszierenden Farbstoff emittiertes Licht absorbiert oder dessen Emission verändert oder verhindert, ausgewählt sind.
Nachweisverbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Reporterabschnitt mittels jeweils eines Verbindungselements mit dem ersten bzw. zweiten Rezeptorabschnitt verbunden sind, das eingerichtet ist, bei Annäherung von erstem und zweitem Rezeptorabschnitt eine Annäherung von erstem und zweitem Reporterabschnitt zuzulassen.
Nachweisverbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass erster und zweiter Bestandteil in einem Mikroorganismus oder einer kultivierten tierischen oder menschlichen oder pflanzlichen Zelle exprimiert sind.
Nachweisverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass erster und zweiter Bestandteil zellfrei getrennt oder in Mischung miteinander vorliegen.
Nachweisverbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass erster und zweiter Rezeptorabschnitt gleich sind.
Nachweisverbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und/oder der zweite Bestandteil am N-Terminus und/oder am C-Terminus zumindest einen Abschnitt mit hoher Affinität zu einem immobilisierbaren Bindeelement aufweist.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten durch Kontaktieren des Analyten mit einer Nachweisverbindung nach einem der voranstehenden Ansprüche und Detektieren einer Änderung einer Eigenschaft der Reporterverbindung.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektieren einer Änderung einer Eigenschaft der Reporterverbindung das Messen von Fluoreszenz ist oder das Messen einer von der Reporterverbindung verursachten Metabolitumsetzung oder nach Zusetzen eines Indikatorsubstrats, das von der Reporterverbindung umgesetzt wird, das Messen einer Änderung des Indikatorsubstrats oder eines Produkts des Indikatorsubstrats.
Verfahren zur Herstellung einer Nachweisverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass erster und zweiter Bestandteil als jeweils ein Peptid von einer kodierenden Nukleinsäuresequenz oder als ein Peptid von einer beide Bestandteile kodierenden Nukleinsäuresequenz exprimiert werden.
Verfahren zur Herstellung einer Nachweisverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Rezeptorabschnitt jeweils durch Expression einer kodierenden Nukleinsäuresequenz erzeugt und isoliert werden und der erste und der zweite Rezeptorabschnitt mit jeweils einem Reporterabschnitt verbunden werden.