WO2017045970A1 - Verfahren zum nachweis von liganden vermittels biosensoren - Google Patents

Verfahren zum nachweis von liganden vermittels biosensoren Download PDF

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WO2017045970A1
WO2017045970A1 PCT/EP2016/070937 EP2016070937W WO2017045970A1 WO 2017045970 A1 WO2017045970 A1 WO 2017045970A1 EP 2016070937 W EP2016070937 W EP 2016070937W WO 2017045970 A1 WO2017045970 A1 WO 2017045970A1
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binding
protein
ligand
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Ulrich Benjamin Kaupp
Dagmar Wachten
Reinhard Seifert
Vera Jansen
Shatanik Mukherjee
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Stiftung Caesar Center Of Advanced European Studies
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • a biosensor is a protein. which comprises three portions, wherein a first portion has the function of a donor, wherein a second portion has the function of an acceptor, and wherein a third portion connects the first portion and the second portion, the third portion having an area for interaction with the ligand to be detected and wherein the interaction reaction causes a change in the geometric structure of the third portion of the protein.
  • Biosensors are generally defined as integrated measuring systems in which the ligand to be examined is interacted with a biological recognition structure oriented on it and in which the specific interaction of the interaction partners is converted into a signal accessible by means of chemical or physical transducers.
  • cAMP cyclic nucleotide cyclic adenosine monophosphate
  • cAMP is also detected by FRET-based biosensors using the cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) as the donor-acceptor pair of the FRET method completing donor and acceptor-binding structure is a cAMP-specific binding protein domain called cyclic nucleotide-binding domain (CNBD) and which is the binding site for cyclic nucleotides of the Epad and Epac2 proteins ("exchange p red in directly activated by cAMP”) represents.
  • CFP cyan fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • cAMP cyclic adenosine monophosphate
  • PKA protein kinase A
  • the enzyme forms the cAMP-sensitive unit.
  • the catalytic and regulatory subunits of the PKA are used, to which the donor-acceptor pair is coupled.
  • the approach has a high specificity towards cAMP, it also requires a balance in the expression of both subunits, which is difficult to achieve, especially in living cells.
  • due to the catalytically active subunits of PKA disturbing changes in the intracellular signal transmission.
  • the object of the invention is now a development of the method for the detection of ligands, in particular of cAMP, by means of molecular biosensors, with which the disadvantages of the above prior art are overcome.
  • the method is characterized in that the third section of the biosensor is a protein which is suitable for binding cyclic nucleotides and, in particular, prokaryotic nature.
  • the core of the invention thus lies in the fact that for the specific interaction with the ligand, a protein is used which has a particularly high affinity for the cyclic nucleotide adenosine monophosphate cAMP. According to the invention, this is the binding site for cyclic nucleotides mICNBD of the bacterial ion channel mICNG.
  • the affinity of this protein is characterized by values for the corresponding dissociation constant, which are in the nanomolar range, in particular in the range from 70 to 110 nM
  • the method achieves a particularly high sensitivity to cAMP, in particular because of the use of the protein mlCNBD.
  • concentration values of cAMP in solution can be determined with an accuracy which was not possible with hitherto known FRET-based methods.
  • a major advantage of the approach of the invention is that it allows the analysis of cAMP dynamics in living cells. The process accomplishes this with a temporal and spatial resolution that is unprecedented. The process also allows biosensors to be produced that are readily producible in bacterial expression systems.
  • cell lines which comprise the biosensors underlying the method according to the invention also offer the prospect of screening new active substances influencing cAMP-dependent signaling pathways in a high-throughput process.
  • the particular advantage is therefore that genetically encoded, FRET-based biosensors can be generated, which are useful for the determination of cAMP concentration both in solution and in living cells.
  • the method overcomes the requirement of stoichiometric expression rates as well as the occurrence of undesired interactions of the biosensors with the intracellular environment.
  • the biosensors according to the invention are easy to clean and have a high specificity and sensitivity to the ligand.
  • the FRET pair of a biosensor according to the invention is formed by two fluorophores, which are preferably the substances cerulean and citrine. Cerulean acts as donor and citrin as acceptor. Similar to the light of the yellow fluorescent protein YFP, citrin emits light originating in the yellow-green spectral region, while cerulean emits light comparable to that of the cyan fluorescent protein CFP from the blue-green spectral region.
  • the method serves to detect cyclic adenosine monophosphate cAMP and / or cAMP-comprising ligands.
  • the detection of each ligand is preferably carried out by a bond between the respective ligand and the binding site for cyclic nucleotides CNBD of bacterial ion channel mICNG.
  • the binding takes place as a specific binding.
  • the interaction of one ligand and one biosensor each leads to a change in the geometric structure of the binding site for cyclic nucleotides CNBD of the relevant biosensor.
  • the interaction leads to a conformational change, ie a change in the folding state of the protein CNBD.
  • the folding state of the respective protein CNBD changes in such a way that as a result of the binding of the relevant ligand to the binding site donor and acceptor of the biosensor in question undergo a change in their spatial distance from each other, in particular an increase in their distance.
  • the biosensors comprising the binding sites for the ligands, the donors and the acceptors, are genetically encoded, whereby the genetic coding expresses the biosensors as fusion proteins by means of living cells.
  • biosensors according to the invention are expressed by a bacterial cell system, in particular E. coli bacteria.
  • tags preferably histidine tags on.
  • Each biosensor is advantageously provided with one histidine tag in each case, the histidine tag in question being attached to the donor of the relevant biosensor, in particular at the end of the Cerulean protein.
  • the cleaning is preferably carried out by means of the so-called cobalt-based immobilized-metal affinity chromatography method, IMAC.
  • IMAC cobalt-based immobilized-metal affinity chromatography method
  • the biosensors thus obtained are preferably used for the detection and analysis of cAMP in solution.
  • the biosensors according to the invention are expressed by the cells to be examined, in particular by eukaryotic cells. It is mediated The detection, localization and analysis of the dynamics of ligands, in particular of cAMP, within living cells can be carried out in such a manner produced biosensors.
  • FIG. 1 The binding site mICNBD for cyclic nucleotides of the bacterial ion channel mICNG,
  • FIG. 2 shows the primary structure of the mICNBD
  • FIG. 3 shows a biosensor of the method, in a schematic illustration
  • FIG. 4 a shows the representation of a biosensor according to the invention before the binding of the ligand
  • FIG. 4 b the schematic representation of a bound ligand biosensor according to the invention
  • Figure 5 is a microscopy of a living cell comprising mICNBD-based
  • FIG. 6 shows the time profile of the measurement signal in response to an increase in the cAMP concentration.
  • FIG. 1 shows, in the band model representation, the binding-active core of a biosensor 6 according to the invention, namely the protein 1 mICNBD, which forms the binding site for cyclic nucleotides of the bacterial ion channel mICNG and which use the biosensors 6 according to the invention for the specific binding of cAMP.
  • FIG. 1 shows the secondary and tertiary structure of protein 1 and, in particular, the region to which cAMP specifically binds, the phosphate binding cassette 2 (PBC).
  • PBC phosphate binding cassette 2
  • the amino acid sequence which forms the primary structure of the protein 1 mICNBD is shown schematically in FIG. Highlighted are some essential structural features of the sequence. These are the alpha-helices 3 having the conformational change and the beta-sheets 4 of protein 1, the phosphates binding cassette 2 PBC and the amino acid arginine 5, which is important for the binding of cAMP.
  • FIG. 3 Shown schematically are the two flurophores - the donor 7, here cerulean, and the acceptor 8, here citrine - the protein 1 mICNBD which connects the donor-acceptor pair, as well as that of the extraction and Purification Histidine Day 9.
  • FIG. 4 a shows a biosensor 6 before the binding of a ligand 10 cAMP to the protein 1 mICNBD.
  • FIG. 4a shows that, in the state before ligand binding, the donor 7 cerulean and the acceptor 8 citrin are in spatial proximity to one another in such a way that the light signal caused by fluorescence is dominated by the acceptor 8 citrin.
  • FIG. 5 shows a micrograph of living cells 11-here, intact HEK 293 cells-which have heterologously expressed the mICNBD-based FRET biosensors according to the invention.
  • the biosensors 6 can be seen as structures of increased brightness 12. If an increase in the cAMP concentration is now brought about on HEK 293 cells prepared in this way, as is possible, for example, by means of the addition of suitable Concentrations of NKH 477 and IBMX is effected, this leads to a change in the color signal mediated by the light signal and thus of the measurement signal 13.

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Abstract

Verfahren zum Nachweis von Liganden 10 vermittels Biosensoren 6, die auf dem Förster Resonanz Energie Transfer Prinzip basieren, wobei ein Biosensor 6 ein Protein ist, das drei Abschnitte umfasst, wobei der erste Abschnitt die Funktion eines Donors 7 hat, wobei der zweite Abschnitt die Funktion eines Akzeptors 8 hat und wobei der dritte Abschnitt den ersten Abschnitt und den zweiten Abschnitt verbindet, wobei der dritte Abschnitt einen Bereich zur Wechselwirkung mit dem nachzuweisenden Liganden 10 aufweist und wobei die Wechselwirkungsreaktion eine Änderung der geometrischen Struktur des dritten Abschnitts bewirkt, wobei der dritte Abschnitt ein zur Bindung von zyklischen Nukleotiden geeignetes Protein 1 prokaryotischer Natur ist.

Description

Verfahren zum Nachweis von Liganden vermittels Biosensoren
Verfahren zum Nachweis von Liganden vermittels Biosensoren, die auf dem Förster Resonanz Energie Transfer Prinzip basieren, wobei ein Biosensor ein Protein ist. das drei Abschnitte umfasst, wobei ein erster Abschnitt die Funktion eines Donors aufweist, wobei ein zweiter Abschnitt die Funktion eines Akzeptors aufweist und wobei ein dritter Abschnitt den ersten Abschnitt und den zweiten Abschnitt verbindet, wobei der dritte Abschnitt einen Bereich zur Wechselwirkung mit dem nachzuweisenden Liganden aufweist und wobei die Wechselwirkungsreaktion eine Änderung der geometrischen Struktur des dritten Abschnitts des Proteins bewirkt.
Verfahren zum Nachweis von Liganden, die sich der Nutzung biologischer Moleküle bedienen, die als Biosensoren fungieren und die den Nachweis auf der Basis einer Fluoreszenzreaktion bewirken, sind bekannt. Dabei sind Biosensoren allgemein als integrierte Messsysteme definiert, bei denen der zu untersuchende Ligand mit einer auf diesen ausgerichteten Erkennungsstruktur biologischer Natur in Wechselwirkung gebracht wird und bei denen die spezifische Interaktion der Wechselwirkungspartner vermittels chemischer oder physikalischer Transducer in ein messtechnisch zugängliches Signal gewandelt wird.
Die DE 601 25 145 T2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung und zur Anwendung solch makromolekularerer Biosensoren. Der Nachweis des Liganden wird dort vermittels einer Immunfluoreszenzreaktion, mithin eines Licht-basierten Signals erbracht. Ferner sind Verfahren bekannt, bei denen die Biosensoren respektive die Fluoreszenzreaktion speziell auf dem Prinzip der Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) aufbauen. Dabei bewirkt die den Liganden erkennende Reaktion einen Energietransfer zwischen zwei Flurophoren - dem Donor-Akzeptor-Paar - der dann vermittels eines Fluoreszenzsignals nachgewiesen wird. In Zaccolo et al., IUBMB Life, 49, 5, 375, (2000) erfolgt auf dieser Basis der Nachweis des zyklischen Nukleotids cyclic adenosine-monophosphate (cAMP). cAMP ist eine im Rahmen der zielgerichteten Ausbreitung informationstragender Signale innerhalb einer biologischen Zelle („cell signaling") wesentliche Substanz. Insbesondere betrifft dies die Wechselwirkung der Zelle mit ihrer Umgebung. In Nikolaev et al., J. Biol. Chem., 279, 36, 37215 (2004) wird der Nachweis von cAMP ebenfalls vermittels FRET-basierter Biosensoren erzielt. Als Donor- Akzeptor-Paar des FRET-Verfahrens werden dort die Substanzen cyan fluoreszierendes Protein (CFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) genutzt. Die den Biosensor vervollständigende Donor und Akzeptor verbindende Struktur ist eine gegenüber cAMP spezifisch bindende Proteindomäne, die als cyclic nucleotide- binding domain (CNBD) bezeichnet ist und welche die Bindungsstelle für zyklische Nukleotide der Proteine Epad und Epac2 („exchange p rote in directly activated by cAMP") darstellt. Durch die vermittels der spezifischen Bindung des Liganden an CNBD bewirkte Konformationsänderung, also die Änderung des Faltungszustandes des Proteins, kommt es dort zu einer Verkürzung der räumlichen Distanz zwischen Donor und Akzeptor, wodurch die gewünschte Austauschreaktion zwischen CFP und YFP initiiert wird. Das aus dem Austausch resultierende und das Bindungsereignis anzeigende Lichtsignal wird schließlich vermittels optischer Methoden nachgewiesen und anschließend ausgewertet.
Verfahren, die für den Nachweis von zyklischem Adenosinmonophospaht (cAMP) auf dem FRET-Prinzip aufbauende Biosensoren nutzen, beruhen häufig auf der Verwendung des Enzyms Protein Kinase A (PKA). Dabei bildet das Enzym die gegenüber cAMP sensitive Einheit. Für das FRET-Verfahren werden die katalytischen und regulatorischen Untereinheiten der PKA genutzt, an welche das Donor-Akzeptor-Paar gekoppelt wird. Zwar weist der Ansatz eine hohe Spezifität gegenüber cAMP auf, er erfordert aber auch ein Gleichgewicht in der Expression beider Untereinheiten, was insbesondere in lebenden Zellen schwer zu realisieren ist. Zudem kommt es aufgrund der katalytisch aktiven Untereinheiten des PKA zu störenden Veränderungen in der intrazellularen Signalübermittlung. Verfahren, die für den Nachweis von cAMP Biosensoren einsetzen, welche die Bindungsstelle für zyklische Nukleotide der Faktoren Epad oder Epac2 nutzen, überwinden die Erfordernis stöchiometrischer Expressionsraten. Sie zeichnen sich zudem durch eine hohe Spezifität aus und beeinträchtigen auch nicht das cell signaling durch störende katalytische Aktivitäten. Allerdings weisen solche Biosensoren eine nur geringe Affinität gegenüber dem nachzuweisenden Liganden auf. Dies ist der verwendeten CNBD geschuldet und folglich der Substanz inhärent. Typische Werte für die solche geringe Affinitäten quantifizierenden Dissoziationskonstanten, liegen im mikromolaren Bereich. Damit ist die Sensitivität dieser Art von Biosensoren entsprechend eingeschränkt. Die Tatsache, dass FRET-basierte Biosensoren, die dem Nachweis und der Analyse von cAMP zugedacht sind, in der Regel eukaryotische Bindestellen nutzen, führt zudem zu einer deutlichen Erschwernis bei der Extraktion und Reinigung der Biosensoren bei Expression in einem bakteriellen System.
Aufgabe der Erfindung ist nun eine Weiterbildung des Verfahrens zum Nachweis von Liganden, insbesondere von cAMP, vermittels molekularer Biosensoren, mit der die Nachteile des vorstehenden Standes der Technik überwunden werden.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen genannt.
Anspruchsgemäß zeichnet sich das Verfahren dadurch aus, dass der dritte Abschnitt des Biosensors ein Protein ist, das zur Bindung von zyklischen Nukleotiden geeignet und insbesondere prokaryotischer Natur ist. Der Kern der Erfindung liegt somit darin, dass für die spezifische Wechselwirkung mit dem Liganden ein Protein genutzt wird, das eine besonders hohe Affinität gegenüber dem zyklischen Nukleotid Adenosinmonophospaht cAMP aufweist. Erfindungsgemäß ist dies die Bindestelle für zyklische Nukleotide mICNBD des bakteriellen lonenkanals mICNG. Die Affinität dieses Proteins ist durch Werte für die korrespondierende Dissoziationskonstante gekennzeichnet, die im nanomolaren Bereich, insbesondere im Bereich von 70 bis 1 10 nM, liegen Das Verfahren erzielt insbesondere wegen der Verwendung des Proteins mlCNBD eine besonders hohe Sensitivität gegenüber cAMP. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Konzentrationswerte von cAMP in Lösung mit einer Genauigkeit bestimmt werden, wie dies mit bislang bekannten FRET-basierten Verfahren nicht möglich war. Ein großer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorgehensweise ist, dass es die Analyse von cAMP-Dynamiken in lebenden Zellen ermöglicht. Das Verfahren leistet dies mit einer zeitlichen und räumlichen Auflösung, die bislang unerreicht ist. Mit dem Verfahren, lassen sich überdies Biosensoren erzeugen, die gut in bakteriellen Expressionssystemen herstellbar sind. Schließlich stellen Zelllinien, welche dem erfindungsgemäßen Verfahren zu Grunde liegende Biosensoren umfassen, auch in Aussicht, neue, auf cAMP-abhängige Signalwege einflussnehmende Wirkstoffe, im Hochdurchsatzverfahren zu screenen.
Der besondere Vorteil liegt somit darin, dass genetisch codierte, FRET-basierte Biosensoren erzeugt werden können, die für die Bestimmung von cAMP- Konzentration sowohl in Lösung als auch in lebenden Zellen nutzbar sind. Das Verfahren überwindet das Erfordernis stöchiometrischer Expressionsraten ebenso, wie das Auftreten unerwünschter Wechselwirkungen der Biosensoren mit der intrazellularen Umgebung. Die erfindungsgemäßen Biosensoren sind leicht zu reinigen und weisen eine hohe Spezifität sowie Sensitivität gegenüber dem Liganden auf.
In einer vorteilhaften Ausführungsvariante des Verfahrens wird das FRET-Paar je eines erfindungsgemäßen Biosensors durch zwei Fluorophore gebildet, die vorzugsweise die Substanzen Cerulean und Citrin sind. Dabei wirkt Cerulean als Donor und Citrin als Akzeptor. Ähnlich dem Licht des gelb fluoreszierenden Proteins YFP, emittiert Citrin Licht, das dem gelb-grünen Spektralbereich entstammt, während Cerulean Licht emittiert, das vergleichbar dem des cyan fluoreszierenden Proteins CFP dem blau-grünen Spektralbereich entstammt.
In einer weiteren Variante dient das Verfahren dem Nachweis von zyklischem Adenosinmonophosphat cAMP und/oder cAMP umfassenden Liganden. Dabei erfolgt der Nachweis je eines Liganden vorzugsweise durch eine Bindung zwischen dem betreffenden Liganden und der Bindestelle für zyklische Nukleotide CNBD des bakteriellen lonenkanals mICNG. Vorzugsweise erfolgt dabei die Bindung als spezifische Bindung.
In einer Ausführungsvariante führt die Wechselwirkung von je einem Liganden und je einem Biosensor zu einer Änderung der geometrischen Struktur der Bindestelle für zyklische Nukleotide CNBD des betreffenden Biosensors. Vorzugsweise führt die Wechselwirkung zu einer Konformationsänderung, also einer Änderung des Faltungszustandes des Proteins CNBD. Der Faltungszustand des betreffenden Proteins CNBD ändert sich dabei dergestalt, dass in Folge der Bindung des betreffenden Liganden an die Bindestelle Donor und Akzeptor des betreffenden Biosensors eine Änderung ihrer räumlichen Distanz zueinander erfahren, insbesondere eine Zunahme ihrer Distanz.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsvariante sind die Biosensoren, umfassend die Bindungsstellen für die Liganden, die Donoren und die Akzeptoren, genetisch codiert, wobei vermittels der genetischen Codierung die Biosensoren als Fusionsproteine vermittels lebender Zellen exprimiert werden.
Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens sieht vor, dass die erfindungsgemäßen Biosensoren von einem bakteriellen Zellsystem exprimiert werden, insbesondere von E.coli-Bakterien. Dabei weisen die Biosensoren für die Extraktion aus dem Zellsystem, insbesondere für die Reinigung, molekulare Hilfsstrukturen, sogenannte Tags, vorzugsweise Histidin-Tags, auf. Vorteilhafterweise ist je ein Biosensor mit je einem Histidin-Tag versehen, wobei der betreffende Histidin-Tag an dem Donor des betreffenden Biosensors, insbesondere am Ende des Proteins Cerulean, angebracht ist. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise vermittels des sogenannten cobalt-basierten immobilized- metal affin ity chromatography Verfahrens, IMAC. Die auf solche Weise gewonnenen Biosensoren werden vorzugsweise für den Nachweis und die Analyse von cAMP in Lösung angewandt.
Schließlich werden in einer besonders vorteilhaften Ausführungsvariante die erfindungsgemäßen Biosensoren von den zu untersuchenden Zellen selbst exprimiert, insbesondere von eukaryotischen Zellen. Dabei ist vermittels solchermaßen erzeugter Biosensoren der Nachweis, die Lokalisation und die Analyse der Dynamik von Liganden, insbesondere von cAMP, innerhalb lebender Zellen durchführbar.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren 1 - 6 näher erläutert. Hierin zeigen:
Figur 1 Die Bindestelle mICNBD für zyklischen Nukleotide des bakteriellen lonenkanals mICNG,
Figur 2 die Primärstruktur des mICNBD,
Figur 3 einen Biosensor des Verfahrens, in schematischer Darstellung,
Figur 4 a die Darstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors vor der Bindung des Liganden,
Figur 4 b die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors mit gebundenem Liganden,
Figur 5 eine Mikroskopie einer lebenden Zelle umfassend mICNBD-basierte
FRET-Biosensoren und
Figur 6 den zeitlichen Verlauf des Messsignal in Reaktion auf eine Erhöhung der cAMP-Konzentration.
Figur 1 zeigt in der Bändermodell-Darstellung den bindungsaktiven Kern eines erfindungsgemäßen Biosensors 6, nämlich das Protein 1 mICNBD, welches die Bindestelle für zyklische Nukleotide des bakteriellen lonenkanals mICNG bildet und welches die erfindungsgemäßen Biosensoren 6 für die spezifische Bindung von cAMP nutzen. Die Figur 1 zeigt die Sekundär- und Tertiärstruktur des Proteins 1 sowie speziell den Bereich, an den cAMP spezifisch bindet, die Phosphate Bindecassette 2 (PBC).
Die Aminosäuresequenz, welche die Primärstruktur des Proteins 1 mICNBD bildet, ist in schematischer Darstellung in Figur 2 gezeigt. Hervorgehoben sind einige wesentliche strukturelle Merkmale der Sequenz. Diese sind die die Konformationsänderung vorrangig aufweisenden alpha-Helices 3 und die beta- Faltblätter 4 des Proteins 1 , die Phosphate Bindecassette 2 PBC sowie die für die Bindung von cAMP bedeutsame Aminosäure Arginin 5.
Einen vollständigen erfindungsgemäßen Biosensor 6 zeigt die Figur 3. Abgebildet sind in schematischer Darstellung die beiden Flurophore - der Donor 7, hier Cerulean, und der Akzeptor 8, hier Citrin - das das Donor-Akzeptor-Paar verbindende Protein 1 mICNBD, sowie der der Extraktion und Reinigung dienende Histidin-Tag 9.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Funktionsweise des Verfahrens geht aus den schematischen Darstellungen der Figuren 4a und 4b hervor. Dargestellt ist die Funktion anhand eines einzelnen erfindungsgemäßen Biosensors 6. Dabei zeigt Figur 4a einen Biosensor 6 vor der Bindung eines Liganden 10 cAMP an das Protein 1 mICNBD. Der Figur 4a ist zu entnehmen, dass im Zustand vor der Ligandenbindung der Donor 7 Cerulean und der Akzeptor 8 Citrin dergestalt in räumlicher Nähe zueinander befindlich sind, dass das vermittels Fluoreszenz bewirkte Lichtsignal durch den Akzeptor 8 Citrin dominiert ist. Hat sich demgegenüber eine Bindungswechselwirkung zwischen dem Liganden 10 cAMP und der Bindestelle mICNBD ereignet, so wird eine Änderung der Konformation des Proteins 1 mICNBD bewirkt, die in der Folge zu einer Streckung des betreffenden Biosensors 6 führt (Figur 4b). Die Distanz zwischen beiden Fluro- phoren wird so vergrößert. Als Resultat der Abstandszunahme zwischen Donor 7 und Akzeptor 8 wird der Einfluss der Fluoreszenz des Cerulean auf das Lichtsignal erhöht. Gleichzeitig wird der Einfluss des Citrin reduziert. Im Ergebnis kommt es so zu einer Verschiebung des durch das Lichtsignal vermittelten Farbeindruckes.
In Figur 5 ist eine mikroskopische Aufnahme lebender Zellen 1 1 gezeigt - hier intakter HEK 293-Zellen - die die erfindungsgemäßen mICNBD-basierte FRET- Biosensoren heterolog exprimiert haben. Innerhalb der Zellen 1 1 sind dabei die Biosensoren 6 als Strukturen erhöhter Helligkeit 12 zu erkennen. Wird nun an dergestalt vorbereiteten HEK 293-Zellen eine Erhöhung der cAMP-Konzentration herbeigeführt, wie dies beispielsweise vermittels der Zugabe geeigneter Konzentrationen von NKH 477 und IBMX bewirkt wird, so führt dies zu einer Änderung des durch das Lichtsignal vermittelten Farbeindruckes und mithin des Messsignals 13.
Ein solches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermitteltes Messsignal 13 im Zeitverlauf, wie es an HEK 293-Zellen auftritt, die eine, die cAMP-Konzentration, wie beschrieben erhöhende Behandlung erfahren haben, zeigt schließlich Figur 6.

Claims

Ansprüche
Verfahren zum Nachweis von Liganden (10) vermittels Biosensoren (6), die auf dem Förster Resonanz Energie Transfer Prinzip basieren, wobei ein Biosensor (6) ein Protein ist, das drei Abschnitte umfasst, wobei der erste Abschnitt die Funktion eines Donors (7) hat, wobei der zweite Abschnitt die Funktion eines Akzeptors (8) hat und wobei der dritte Abschnitt den ersten Abschnitt und den zweiten Abschnitt verbindet, wobei der dritte Abschnitt einen Bereich zur Wechselwirkung mit dem nachzuweisenden Liganden (10) aufweist und wobei die Wechselwirkungsreaktion eine Änderung der geometrischen Struktur des dritten Abschnitts bewirkt,
dadurch gekennzeichnet,
dass der dritte Abschnitt ein zur Bindung von zyklischen Nukleotiden geeignetes Protein (1) prokaryotischer Natur, nämlich die Bindestelle mICNBD des bakteriellen Ionen-Kanals mICNG, ist.
Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Donor (7) die Substanz Cerulean ist und/oder dass der Akzeptor (8) die Substanz Citrin ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Ligand (10) ein zyklisches Nukleotid ist und/oder umfasst, insbesondere zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP).
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Wechselwirkung mit dem Liganden (10) eine spezifische Bindung ist.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Änderung der geometrischen Struktur des Proteins (1), das die Bindungsstelle für den Liganden (10) bildet, eine Konformationsänderung ist.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die die Affinität der Bindungswechselwirkung quantifizierende Dissoziationskonstante einen Wert im nanomolaren Bereich aufweist, insbesondere einen Wert im Bereich von 70 bis 110 nM.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Nachweis von Liganden (10) in Lösung und/oder innerhalb lebender Zellen (11) durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Biosensoren (6) umfassend die Proteine (1), welche die Bindungsstellen für die Liganden (10) bilden, die Donoren (7) und die Akzeptoren (8) genetisch codiert sind, dass die Biosensoren (6) als Fusionsproteine exprimiert werden und dass die Biosensoren (6) vermittels lebender Zellen (11) exprimiert werden, insbesondere vermittels bakterieller Zellen und/oder der zu untersuchenden Zellen.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass je ein Biosensor (6) je einen Tag (9) aufweist, insbesondere je einen Histidin-Tag, und dass der Tag (9) dem Zwecke der Reinigung dient.
PCT/EP2016/070937 2015-09-16 2016-09-06 Verfahren zum nachweis von liganden vermittels biosensoren WO2017045970A1 (de)

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