DE602004008043T2

DE602004008043T2 - Verwendung eines viruses, der ein bindungsteil exprimiert, zur messung von analyten in einer probe

Info

Publication number: DE602004008043T2
Application number: DE602004008043T
Authority: DE
Inventors: David James Salisbury SQUIRRELL; Martin Alan Salisbury LEE; Carl Nicholas Salisbury MAYERS
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2024-03-03
Also published as: ATE369565T1; ATE515701T1; GB0304832D0; DE602004008043D1; TW200502399A; WO2004079369A1; ATE430316T1; EP2105741A2; ES2291857T3; JP2006520592A; CA2518036A1; US20060216694A1; EP1879030A3; AU2004217724B2; EP1599731A1; EP2105741B1; JP5038712B2; EP1879030B1; CN100504394C; AU2004217724A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Testverfahren sowie für diesen Test geeignete Kits.
Bei der Immuno-PCR, die aus dem Jahre 1992 stammt, werden mit Nucleinsäure markierte Antikörper verwendet, um für einen sehr empfindlichen Test-Endpunkt zu sorgen. Im allgemeinen wird der Antikörper mit Streptavidin markiert und die Nucleinsäure über das Streptavidin an den Antikörper gebunden. Die biotinylierte DNA wird üblicherweise am Ende des Immunoassays zugesetzt.
Viren können im wesentlichen DNA oder RNA umfassen und greifen Wirtszellen an, indem sie ihre Nucleinsäuren in das Wirtssystem integrieren. Was die Struktur betrifft, exprimieren Viren im allgemeinen Proteine, die einen "Überzug" bilden, der die Nucleinsäuren umgibt.
Beim Phagen-Display handelt es sich um eine Technik, die entwickelt wurde, um die Selektion und in vitro-Erzeugung von Proteinen, wie Antikörpern, zu ermöglichen. Phagenbibliotheken werden hergestellt, die eine sehr große Anzahl von verschiedenen Proteinen, wie scFv's (einzelkettige variable Fragmente von Antikörpern) enthalten. Der Phage besitzt die in sein Genom inserierte DNA für die Protein-scFv's und exprimiert sie als ein Fusionsprotein mit den Überzugsproteinen, das im allgemeinen an seinem Kopf angebracht ist.
Das günstigste Protein, z. B. scFv, für einen speziellen Zweck wird aus dem Bibliotheksgemisch ausgewählt, indem man den Phagen "herausfischt", der unter strikten Selektionsbedingungen den Analyten von Interesse bindet. Der Phage kann sodann durch Züchtung in seinem Wirtsbakterium vermehrt werden und die DNA kann ausgeschnitten und in einen Expressionsvektor inseriert werden. Bindeprotein kann sodann entweder als scFv erzeugt werden oder wieder in ein Antikörpergerüst eingebaut werden, um beispielsweise humanisierte Antikörper für die therapeutische Anwendung zu erzeugen.
Die Phagen-Displaytechnik wird somit als zwischengeschaltete Technik für die in vitro-Antikörpererzeugung eingesetzt. Jedoch wurde bisher nie vorgeschlagen, die Phagen selbst als Testreagenzien in einem kompetitiven Immunoassay unter Anwendung von quantitativer PCR zu verwenden. US-6 265 169 beschreibt deren Verwendung in einem Sandwich-Immunoassay unter Anwendung von normaler PCR.
Die Anmelderin hat ein spezielles Verfahren gemäß der Definition in den Ansprüchen entwickelt, bei dem ein Virus, das eine Bindungskomponente exprimiert und präsentiert, als eine detektierbare Komponente in einem Test zum Nachweisen des Vorhandenseins oder zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer Probe verwendet wird.
Der hier verwendete Ausdruck "detektierbare Komponente" bedeutet, dass das Virus selbst nachgewiesen (detektiert) wird, um ein Signal bereitzustellen, das ein Anzeichen für die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Analyten darstellt.
Ferner bezieht sich der Ausdruck "Bindungskomponente" auf eine beliebige Komponente, die an ein Ziel bindet, insbesondere ein Polypeptid oder Protein, bei dem es sich beispielsweise um ein Analyt-Polypeptid oder -Protein handeln kann, bei dem es sich aber auch um ein anderes Polypeptid oder Protein handeln kann, das in einem Immunoassay als Teil des Nachweissystems verwendet wird.
Die Nucleinsäure des Virus wirkt als eine Markierung, die unter Anwendung beliebiger bekannter Nucleinsäure-Nachweisverfahren nachgewiesen werden kann, insbesondere unter Anwendung von Amplifikationsreaktionen, wie der Polymerase-Kettenreaktion. Jedoch besteht der Vorteil der Verwendung eines Virus im Vergleich zu beliebigen anderen Markierungstechniken darin, dass eine große Vielzahl von Bindungskomponenten relativ einfach einbezogen werden kann, indem man Techniken anwendet, die beispielsweise zur Herstellung von rekombinanten Viren bekannt sind, z. B. Phagen-Displaybibliotheken, wobei die Notwendigkeit von zusätzlichen Bindungsstufen entfällt.
Wie nachstehend ausgeführt wird, können im Zusammenhang mit der Erfindung beliebige Typen von Viren verwendet werden, so dass es sich um ein DNA-Virus handeln kann und insbesondere um einen Bakteriophagen (Phagen), bei dem es sich um ein Virus handelt, das bakterielle Zellen angreift, wobei aber auch andere DNA-Viren oder RNA-Viren verwendet werden können. Das Virus wird so transformiert, dass es eine Bindungskomponente exprimiert und präsentiert, wie es in den Ansprüchen beschrieben wird. Somit handelt es sich im allgemeinen beim Virus um einen Phagen und insbesondere um einen rekombinanten Phagen. Insbesondere umfasst das Virus einen rekombinanten Phagen, der so transformiert worden ist, dass er eine spezifische Bindungskomponente, z. B. ein Immunoglobulin, einen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon, exprimiert und präsentiert. Jedoch kann das Virus so transformiert werden, dass es ein beliebiges Protein exprimiert, das in einem Immunoassay verwendbar ist, unter Einschluss von Zielanalyten oder Analogen davon, selbst wenn diese nicht zur Immunoglobulin-Oberfamilie gehören.
Bei den Testformaten, die sich dieser Reagenzien bedienen können, kann es sich um beliebige herkömmliche Tests vom kompetitiven Typ handeln.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Analyten in einer Probe bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Das Inkontaktbringen der Probe mit einer Oberfläche, auf der ein Bindungsreagens immobilisiert ist, welches entweder (a) den Analyten bindet oder (b) den Analyten oder ein Analoges davon umfasst, und einem Virus, das transformiert worden ist, so dass es eine Bindungskomponente exprimiert und präsentiert, die das Bindungsreagens in Konkurrenz zu einem Analyten bindet, das Trennen der Oberfläche von der Probe und das Durchführen einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion, um die Menge einer Nucleinsäuresequenz, die in dem Virus vorhanden ist, auf der Oberfläche zu bestimmen, wobei mindestens einer der Bestandteile Bindungsreagens oder Bindungskomponente für den Analyten spezifisch ist.
Geeigneterweise wird das Virus in Gegenwart der Oberfläche für eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, um zu gewährleisten, dass es an verfügbare Bindungsstellen an der Oberfläche bindet, z. B. an ein Bindungsreagens, das nicht vom Analyten aus der Probe besetzt ist. Beispielsweise kann die Inkubation für eine Zeitspanne von 5 bis 60 Minuten bei geeigneten Temperaturen, z. B. bei 25 bis 40 °C, wie etwa 37 °C, stattfinden.
Nach dieser Inkubation wird die Oberfläche unter Einschluss von etwaigem immobilisiertem Komplex von der Virussuspension abgetrennt, indem man beispielsweise die Virussuspension entfernt und die Oberfläche wäscht. Sodann wird eine Nucleinsäuresequenz und insbesondere eine Nucleinsäure, bei der es sich um eine DNA oder RNA handeln kann, die charakteristisch für das Virus ist, an der Oberfläche unter Anwendung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen.
Bei einem typischen Test vom kompetitiven Typ wird ein Bindungsreagens für einen Analyten oder der Analyt oder ein Analoges davon an einer Oberfläche immobilisiert.
Der hier verwendete Ausdruck "Analoges" bezieht sich auf eine Komponente, die an einen Bindungspartner bindet, der den Analyten bindet, selbst wenn sie nicht genau die gleiche Sequenz oder Struktur wie der Analyt aufweist. Das Analoge kann beispielsweise eine bestimmte Epitopregion eines Analyten umfassen, die durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper gebunden wird, der daher als der Bindungspartner wirkt. Somit ahmt ein Analoges einen Analyten im Zusammenhang mit einem Immunoassay unter Verwendung eines gemeinsamen Bindungspartners nach.
Bei einer Ausführungsform wird eine Probe, die mit einem Virus, das eine Bindungskomponente für den Analyten oder ein Analoges exprimiert und präsentiert, versetzt worden ist, mit der Oberfläche in Kontakt gebracht. Wenn der Analyt in der Probe vorhanden ist, konkurriert er mit dem immobilisierten Analyten oder dem Analogen um die Bindung an das Virus. Somit wird weniger Virus an der Oberfläche festgehalten, verglichen mit dem Fall, bei dem kein Analyt in der Probe vorhanden war. Diese Verringerung der Menge an festgehaltenem Virus kann erfindungsgemäß nachgewiesen werden, indem man die Oberfläche auf die Anwesenheit einer im Virus vorhandenen Nucleinsäure analysiert.
Bei einem alternativen Test vom kompetitiven Typ wird ein Bindungsreagens für den Analyten an der Oberfläche immobilisiert. In diesem Fall handelt es sich bei der am Virus präsentierten Bindungskomponente um einen spezifischen Bindungspartner, der so ausgewählt wird, dass er mit dem Analyten um die Bindung an das immobilisierte Bindungsreagens konkurriert. Je weniger Virus-DNA an der Oberfläche nach der Trennung von der Probe nachgewiesen wird, desto mehr Analyt ist vorhanden. Spezielle Beispiele für Analyten in diesem Fall sind Immunoglobuline, wie Antikörper, die sich bei der Diagnose einer Krankheit als wertvoll erweisen können.
In sämtlichen Fällen wirkt die Nucleinsäure des Virus jedoch als nachweisbare und spezifische "Markierung" für die Bindungskomponente und kann unter Anwendung einer Polymerase-Kettenreaktion oder PCR-Reaktion nachgewiesen werden, die spezifisch für die bestimmte Virus-Nucleinsäure sein kann. Eine quantitative Bestimmung des Analyten in der Probe wird unter Anwendung quantitativer PCR-Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt.
Bei einer Ausführungsform handelt es sich bei dem immobilisierten Bindungsreagens um ein Analoges des Analyten, das den Analyten in der Weise nachahmt, dass es an die Bindungskomponente des Virus in Konkurrenz mit dem Analyten bindet. Somit bindet die Bindungskomponente entweder den Analyten oder das Bindungsreagens, jedoch nicht beides. In diesem Fall wird die Probe vorzugsweise vor Kontakt mit der Oberfläche mit dem Virus inkubiert. Während dieser Stufe bildet etwaiger Analyt, der vorhanden ist, einen Komplex mit der Bindungskomponente am Virus, wobei die Bindung des Virus an das immobilisierte Bindungsreagens an der Oberfläche blockiert wird. Infolgedessen wird der Komplex nach dem Waschen nicht an der Oberfläche zurückgehalten, so dass sich die Menge an nachweisbarer Virus-Nucleinsäure verringert. In Abwesenheit des Analyten steht die Bindungskomponente des Virus zur Bindung des Bindungsreagens frei zur Verfügung, was zu einem starken viralen Nucleinsäure-"Signal" führt, das an der Oberfläche festgehalten wird.
In einigen Fällen bindet das immobilisierte Bindungsreagens den Analyten und auch die Bindungskomponente am Virus. In derartigen Fällen konkurrieren dann, wenn der Analyt in der Probe vorhanden ist, sowohl der Analyt als auch die Bindungskomponente um verfügbare Stellen an der Oberfläche. Infolgedessen wird die Menge an Virus/Bindungskomponente, die an der Oberfläche immobilisiert sind, um eine Menge verringert, die in Relation zur Konzentration des Analyten in der Probe steht. Auch in diesem Fall stellt die Situation, dass ein "Signal" auftritt, das geringer als das von der viralen Nucleinsäure erwartete Signal ist, ein Anzeichen für die Anwesenheit des Analyten in der Probe dar.
Dieser Test kann äußerst empfindlich sein und Hintergrundsignale, die mit herkömmlichen Immunoassay-Verfahren verbunden sind, lassen sich verringern. Die Analyse selbst lässt sich leichter kontrollieren, da das Virus so manipuliert werden kann, dass es beliebige Sequenzen, die zweckmäßig sind, umfasst. Der Nachweis ist von der Natur des Analyten vollkommen unabhängig.
Bei dem Analyten handelt es sich im allgemeinen um Proteine oder Polypeptide. Typische Beispiele sind Polypeptide oder Proteine, die mit einem pathogenen Organismus oder einem Teil davon, z. B. Viren, Bakterien oder bakterielle Sporen, wie Anthrax oder Anthrax-Sporen, assoziiert sind, oder ein Protein, das ein Anzeichen für einen bestimmten Krankheitszustand oder für die Belastung mit einer bestimmten Krankheit darstellt, z. B. ein Immunoglobulin, wie ein Antikörper.
Sofern das Bindungsreagens den Analyten bindet, ist es vorzugsweise spezifisch für den Zielanalyten. Es kann jedoch relativ unspezifisch sein, z. B. Protein A, wenn es sich beim Zielanalyten beispielsweise um ein Immunoglobulin, wie IgG handelt, vorausgesetzt, dass eine Bindungskomponente mit dem Virus fusioniert ist, die spezifisch für den Zielanalyten ist.
Geeignete spezifische Bindungsreagenzien umfassen Antikörper oder bindende Fragmente davon, sowie Lectine. Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein, sind aber vorzugsweise monoklonal.
Das Bindungsreagens wird unter Anwendung herkömmlicher Verfahren an der Oberfläche immobilisiert. Beispielsweise kann Protein A zur Bindung von Antikörpern oder von bindenden Fragmenten, die die Fc-Region davon umfassen, verwendet werden.
Bei der Oberfläche kann es sich um eine beliebige zweckmäßige Oberfläche handeln, z. B. um die Oberfläche einer Reaktionsplatte oder -vertiefung, z. B. um eine ELISA-Platte oder -Vertiefung, und zwar zusätzlich zu Perlen, wie magnetischen Perlen, oder Membranen, wie Cellulosemembranen, die beispielsweise bei Tests mit Eintauchstäbchen, die im Stand der Technik üblich sind, verwendet werden. Gegebenenfalls können Stellen, die nicht vom Bindungsreagens besetzt sind, "blockiert" werden, z. B. mit Protein, wie Rinderserumalbumin oder Milchprotein, oder mit Polyvinylalkohol oder Ethanolamin oder Gemischen davon, wie es im Stand der Technik üblich ist.
Insbesondere handelt es sich bei dem Virus, das im Verfahren verwendet wird, um einen rekombinanten Phagen, der eine Bindungskomponente für den Analyten oder das Bindungsreagens. das geeigneterweise einen spezifischen Bindungspartner darstellt, exprimiert. Insbesondere umfasst der spezifische Bindungspartner ein einzelkettiges, variables Fragment eines Antikörpers (scFV).
Ein rekombinanter Phage, der Bindungskomponenten exprimiert, lässt sich unter Anwendung herkömmlicher Verfahren herstellen, wie es auf dem Gebiet der Herstellung von Phagenbibliotheken für das Phagen-Display bekannt ist, wie vorstehend ausgeführt wurde (vergl. beispielsweise Antibody Engineering, R. Konterman & S. Dubel (Hrsg.), Springer Lab Manuals, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2001). Jedoch können auch ähnliche Techniken zur Herstellung anderer Typen von rekombinanten Viren herangezogen werden.
Viren, z. B. Phagen, können einzeln oder als Gemische mit mehrfacher Spezifität, sofern man nach mehr als einem Analyten sucht, zugesetzt werden. Im letztgenannten Fall wird der Nachweis von mehreren Nucleinsäuresequenzen, die jeweils charakteristisch für individuelle Viren sind, anschließend durchgeführt.
Die Nucleinsäuresequenz des Virus wird unter Anwendung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen. Dabei werden Reagenzien, unter Einschluss von Primern, Polymerasen, Nucleotiden und Puffern, die bekannt sind, der Oberfläche zugesetzt und anschließend einem herkömmlichen Thermozyklisierungsvorgang unterworfen, um etwaige Ziel-Nucleinsäuresequenzen, die vorhanden sind, zu amplifizieren.
Das Amplifikationsprodukt kann sodann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, z. B. durch Gelelektrophorese und anschließende Sichtbarmachung unter Verwendung von Farbstoffen, nachgewiesen werden.
Vorzugsweise wird die Amplifikationsreaktion so durchgeführt, dass das Amplifikationsprodukt im Verlauf der Reaktion ein nachweisbares Signal und insbesondere ein sichtbares Signal, z. B. ein fluoreszierendes Signal, erzeugt. Zahlreiche Testformate, die derartige Signale erzeugen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Dabei können beispielsweise Reagenzien verwendet werden, wie DNA-Bindungsreagenzien, z. B. interkalierende Farbstoffe, die Strahlung und insbesondere fluoreszierende Strahlung mit höherer Intensität emittieren, wenn sie in doppelsträngige DNA interkaliert sind, sowie Sonden und Primer, die fluoreszierende Markierungen umfassen, die so angeordnet sind, dass sie einem fluoreszierenden Energietransfer (FET) und insbesondere einem fluoreszierenden Resonanzenergietransfer (FREI) unterliegen.
Es gibt zwei gebräuchliche Typen von FET- oder FREI-Sonden, und zwar solche, bei denen man eine Hydrolyse von Nucleinsäuresonden zur Trennung des Donators vom Akzeptor verwendet, und solche, bei denen man eine Hybridisierung zur Veränderung der räumlichen Beziehung der Donator- und Akzeptormoleküle vornimmt.
Hydrolyse-Sonden sind im Handel als TaqMan^R-Sonden erhältlich. Sie bestehen aus DNA-Oligonucleotiden, die mit Donator- und Akzeptormolekülen markiert sind. Die Sonden sind so konstruiert, dass sie an eine spezifische Region an einem Strang eines PCR-Produkts binden. Im Anschluss an die Anlagerung des PCR-Primers an diesen Strang erweitert Taq-Enzym die DNA mit 5'- nach 3'-Polymerase-Aktivität. Das Taq-Enzym besitzt auch 5'- nach 3'-Exonuclease-Aktivität. TaqMan^R-Sonden sind am 3'-Ende durch Phosphorylierung geschützt, um sie vorm Auslösen der Taq-Erweiterung zu schützen. Wenn die TaqMan^R-Sonde mit dem Produktstrang hybridisiert, kann ein verlängerndes Taq-Molekül auch die Sonde hydrolysieren, wodurch der Donator vom Akzeptor als Grundlage des Nachweises freigesetzt wird. Das Signal ist in diesem Fall kumulativ, wobei die Konzentration der freien Donator- und Akzeptormoleküle mit jedem Zyklus der Amplifikationsreaktion zunimmt.
Hybridisierungssonden sind in einer Anzahl von Formen erhältlich. Bei molekularen Leuchttürmen handelt es sich um Oligonucleotide, die komplementäre 5'- und 3'-Sequenzen aufweisen, so dass sie Haarnadelschleifen bilden. Terminale fluoreszierende Markierungen befinden sich in enger Nachbarschaft, so dass eine FREI bei der Bildung der Haarnadelstruktur erfolgt. Nach der Hybridisierung der molekularen Leuchttürme mit einer komplementären Sequenz werden die fluoreszsierenden Markierungen abgetrennt, so dass keine FREI mehr erfolgt. Dies bildet die Grundlage für den Nachweis.
Es können auch Paare von markierten Oligonucleotiden verwendet werden. Diese hybridisieren in enger Nachbarschaft an einem PCR-Produktstrang, was Donator- und Akzeptormoleküle zusammenbringt, so dass eine FREI erfolgen kann. Eine verstärkte FREI stellt die Grundlage für den Nachweis dar. Varianten dieses Typs umfassen einen markierten Amplifikationsprimer mit einer einzelnen benachbarten Sonde.
Weitere Verfahren zum Nachweis von ablaufenden Amplifikationsreaktionen sind jedoch bekannt. Beliebige dieser Verfahren können eingesetzt werden. Spezielle Beispiele für derartige Verfahren sind beispielsweise in WO-99/28500 , GB-Patent 2 338 301 , WO-99/28501 und WO-99/42611 beschrieben.
WO-99/28500 beschreibt einen sehr erfolgreichen Test zum Nachweis der Anwesenheit einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe. Bei diesem Verfahren werden ein DNA-Duplex-Bindungsmittel und eine Sonde, die spezifisch für die Zielsequenz ist, zu der Probe gegeben. Die Sonde umfasst ein reaktives Molekül, das dazu befähigt ist, Fluoreszenz vom DNA-Duplex-Bindungsmittel zu absorbieren oder diesem Mittel Fluoreszenzenergie zu spenden. Dieses Gemisch wird sodann einer Amplifikationsreaktion unterzogen, bei der die Zielnucleinsäure amplifiziert wird. Dabei werden während oder nach dem Amplifikationsvorgang Bedingungen induziert, unter denen die Sonde mit der Zielsequenz hybridisiert. Die von der Fluoreszenz ausgehenden Probe wird überwacht.
Eine alternative Form dieses Tests, die sich eines DNA-Duplex-Bindungsmittels bedient, das Fluoreszenzenergie von der fluoreszierenden Markierung an der Sonde absorbieren kann, das aber kein sichtbares Licht emittiert, wird in der gleichzeitig anhängigen britischen Patentanmeldung 223563.8 beschrieben. Beliebige dieser Tests können im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Testverfahren eingesetzt werden, um die Zielnucleinsäuresequenz nachzuweisen.
Diese Tests werden in quantitativer Weise durchgeführt, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, indem man beispielsweise das aus dem Amplifikationsgemisch ausgesandte Signal mindestens 1-mal während eines jeden Zyklus der Amplifikationsreaktion überwacht. Durch Ausführung der Reaktion auf diese Weise kann die Menge des an der Oberfläche vorhandenen Virus bestimmt werden und diese Menge kann in Bezug zur Menge des Analyten, der in der ursprünglichen Probe vorhanden war, gesetzt werden.
Bei der speziellen Sequenz des nachgewiesenen Virus kann es sich um eine beliebige charakteristische Sequenz, die darin auftritt, handeln. Sofern bei diesem Test Viren mit einer einzigen Spezifität eingesetzt werden, kann es sich um eine beliebige Sequenz, die innerhalb des Phagen selbst auftritt, handeln, sowie um die Sequenz, die für die komplementaritätsbestimmende Region (CDR) des scFv kodiert, das "Gerüst" für die CDR eines beliebigen rekombinanten Virus oder andere Sequenzen, die in das rekombinante Virus bei seiner Herstellung eingeführt worden sind, z. B. antibiotische Resistenzgene.
Gegebenenfalls können in das Virus neben den Sequenzen, die für die Bindungskomponente kodieren, spezifische Markersequenzen aufgenommen werden. Sie können in das Virus gleichzeitig mit der Bindungskomponente, z. B. in Fusion mit der Sequenz, die für die Bindungskomponente kodiert, eingeführt werden oder sie können in einem getrennten Transformationsvorgang zugesetzt werden.
Sofern Gemische von Viren mit Mehrfachspezifität im Test verwendet werden, ist es erforderlich, Sequenzen nachzuweisen, die für jedes einzelne spezielle Virus charakteristisch sind, um zu bestimmen, ob spezifische Analyten in der Probe vorhanden sind. In diesem Fall ist es daher erforderlich, Sequenzen nachzuweisen, z. B. die für das scFv selbst kodierende Sequenz oder eine in spezifischer Weise eingeführte Markersequenz, wie vorstehend erörtert wurde.
Dabei können auch Sequenzen, die bei Viren oder rekombinanten Viren üblich sind, wie Phagen-DNA oder RNA, oder antibiotische Resistenzgene, nachgewiesen werden. Im allgemeinen kommt es immer zu einer gewissen Übertragung von viraler Nucleinsäure, die als interne Referenzsequenzen verwendet werden können, um sicherzustellen, dass die PCR-Reaktion einwandfrei abgelaufen ist.
Dabei können Multiplex-PCR-Reaktionen unter Verwendung von verschiedenen signalgebenden Reagenzien oder Systemen verwendet werden, um die erzeugten verschiedenen Sequenzen nachzuweisen. Dies kann erreicht werden, indem man beispielsweise Sonden oder Primer, die bei der Amplifikationsreaktion verwendet werden, unter Verwendung verschiedener Markierungen markiert, z. B. von Markierungen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren. Eine Prüfung des von jeder Markierung ausgehenden Signals, z. B. bei den einzelnen verschiedenen Wellenlängen, wird sodann durchgeführt, gegebenenfalls unter geeigneter Signalauflösung, wenn sich die Wellenlängen überlappen.
Alternativ wird der Test so konzipiert, dass die durch verschiedene PCR-Reaktionen erzeugten Amplicons unter Bildung von Duplexen hybridisieren oder einer Destabilisierung bei verschiedenen Temperaturen unterliegen. Eine Schmelzpunktanalyse, z. B. unter Verwendung von interkalierenden Farbstoffen, die eine verstärkte Fluoreszenz bei Bindung an doppelsträngige DNA-Spezies aufweisen, stellt eine bekannte Technik dar. Durch Zugabe eines derartigen Farbstoffes zum Reaktionssystem entweder während oder nach dem Testvorgang und durch Überwachung der Fluoreszenz bei einer gesteuerten Temperaturänderung kann die Temperatur, bei der die Duplexstruktur des Amplicons aufbricht oder sich neu bildet, bestimmt werden. Diese Temperatur kann mit dem Vorliegen des speziellen Amplicons und somit mit dem speziellen Virus, das eine Bindung eingegangen ist, in Relation gesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Testsystem stellt somit ein wertvolles und zuverlässiges Testverfahren dar.
Kits zur Verwendung beim vorstehend beschriebenen Testverfahren stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Kit zum Nachweisen der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe bereitgestellt, wobei das Kit folgendes umfasst: einen festen Körper, der auf einer Oberfläche ein daran immobilisiertes Bindungsreagens aufweist, welches entweder (a) einen Analyten bindet oder (b) den Analyten oder ein Analoges davon umfasst; ein Virus, das so transformiert worden ist, dass es eine spezifische Bindungskomponente für das Bindungsreagens in Konkurrenz zu dem Analyten exprimiert; und Reagenzien zur Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion zum Amplifizieren und Detektieren einer Nucleinsäure des Virus, wie in den Ansprüchen angegeben ist.
Wenn beispielsweise auf der Oberfläche ein Bindungsreagens, das den Analyten bindet, immobilisiert ist, exprimiert das Virus in geeigneter Weise einen Bindungspartner, der das Bindungsreagens in Konkurrenz mit dem Analyten bindet, und präsentiert diesen.
Wenn alternativ auf der Oberfläche ein Bindungsreagens immobilisiert ist, das entweder den Analyten oder ein Analoges davon umfasst, exprimiert das Virus in geeigneter Weise einen Bindungspartner für den Analyten und präsentiert diesen.
Geeigneterweise handelt es sich beim festen Körper um eine Vertiefung in einer Platte, beispielsweise um eine Platte mit zahlreichen Vertiefungen; es kann sich aber auch um Perlen, wie Magnetperlen, oder um Membranen, z. B. um Cellulosemembranen, handeln, wie sie bei herkömmlichen Tests vom Typ von Eintauchstäbchen vorliegen.
Das Kit kann mehr als einen Virustyp, insbesondere rekombinante Phagen, zur Verwendung bei Multispezifitätstests gemäß den vorstehenden Ausführungen umfassen.
Mögliche weitere Elemente des Kits umfassen Reagenzien, die sich zur Verwendung beim Nachweis der Nucleinsäuresequenzen eignen. Insbesondere kann das Kit interkalierende Farbstoffe, Primer oder Sonden zur Verwendung beim Nachweis der speziellen Nucleinsäuresequenzen, wie sie vorstehend erörtert wurden, umfassen. Beispielsweise kann das Kit Primer umfassen, die Sequenzen amplifizieren, die für spezifische scFv-Sequenzen kodieren, oder Markersequenzen, die in das Virus eingebaut sind. Zusätzlich oder alternativ zum Fall von Einzelspezifitätstests können die Kits Primer, die sich zur Amplifikation von Virussequenzen eignen, Sequenzen, die für Gerüste von scFvs kodieren oder antibiotische Resistenzgene, die im rekombinanten Virus vorhanden sind, umfassen.
Die Primer können in geeigneter Weise so markiert sein, dass das Amplifikationsprodukt direkt nachweisbar ist. Beispielsweise können sie fluoreszierende oder andere Markierungen umfassen, die vorstehend erörtert wurden.
Das Kit enthält Sonden gemäß der Definition in den Ansprüchen.
Kits können ferner interkalierende Farbstoffe umfassen, um die Schmelzpunktanalyse zu unterstützen, wo dies erforderlich ist, um Ergebnisse von Multispezifitätstests aufzutrennen.
Rekombinante Viren und insbesondere rekombinante Phagen, die so transformiert worden sind, dass sie sowohl eine Bindungskomponente als auch eine Markersequenz exprimieren, sind neu und stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt in schematischer Weise einen kompetitiven Test im Rahmen der Erfindung.
2 ist ein Diagramm der Fluoreszenz –d(F1)/dt gegen die Temperatur bei Durchführung einer PCR-Reaktion vom TAQMAN^R-Typ.
3 ist ein Diagramm der Fluoreszenz (F1) gegen die Zykluszahl der Reihe von Proben bei verschiedenen Verdünnungen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Tests.
4 zeigt die Ergebnisse eines nachstehend beschriebenen beispielhaften Tests für B. cereus-Sporen unter Einschluss einer PCR zum Nachweis von Phagen-DNA.
In der in 1A dargestellten Ausführungsform wird ein Analyt oder ein Analoges davon (7), das zur Bindung an den Bindungspartner (3) des Phagen (1) befähigt ist, an der Oberfläche (5) immobilisiert. Eine zu testende Probe, der der Phage (1) zugesetzt ist, wird in Gegenwart dieser Oberfläche inkubiert. Analyt (4) in der Probe bindet an den Bindungspartner (3) des Phagen (1). Etwaige Phagen, die eine derartige Bindung eingegangen sind, sind nicht zur Bindung an das immobilisierte Analyt-Analoge (7) befähigt (B) und werden daher bei einer anschließenden Trennstufe zusammen mit der Probe ausgewaschen. Der Nachweis von Phagen-DNA (2) an der Oberfläche (5) im Anschluss an eine derartige Waschstufe ergibt ein niedrigeres Niveau im Vergleich zu dem Wert, der in Abwesenheit des Analyten zu erwarten wäre.
Weitere kompetitive Testformate sind möglich, wie aus dem Stand der Technik ersichtlich ist.
Erläuterung 1
Test unter Verwendung von Bacillus cereus-Sporen zur Erläuterung des Nachweises von Virus-Nucleinsäure unter Anwendung von PCR.
1) Plattenformat
Eine Probe (50 μl), die eine Suspension von B. cereus-Sporen (1 × 10⁸ pro ml) in destilliertem sterilem Wasser umfasste, wurde in jede Vertiefung einer blockierten ELISA-Platte (Immulon-Mikrotiter-ELISA-Platte) gegeben. Die Platte wurde sodann über Nacht in einen auf 37 °C eingestellten Trockenschrank gelegt, um die Sporen auf den Platten zu trocknen.
Anschließend wurden die Platten 3-mal mit einer Waschlösung, die 0,05 % (Vol./Vol.) Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder PEST umfasste, gewaschen.
Ein Blockierungspuffer (200 ml), der 2 % (Gew./Vol.) Trockenmilchpulver und 0,05 % (Vol./Vol.) Tween 20 in PBS umfasste, wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde sodann verschlossen und mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde sie erneut 3-mal in PEST gewaschen.
Eine Lösung von primären Antikörper exprimierendem M13-Phagen (1 × 10⁹ transformierende Einheiten pro ml), wobei es sich beim primären Antikörper um ein B. cereus-spezifisches, einzelkettiges, variables Fragment (scFv) handelte, in PEST-Blockierungspuffer wurde hergestellt und in einer Menge von mindestens 50 μl in jede Vertiefung gegeben. PEST-Blockierungspuffer wurde in eine der Vertiefungen anstelle des den primären Antikörper exprimierenden Phagen als negative Kontrolle gegeben.
Die Platte wurde 1 Stunde bei 37 °C inkubiert und anschließend 5-mal in PEST gewaschen. Nach dem Trocknen wurde jede Vertiefung mit 50 μl dH₂O versetzt. Anschließend wurde die Platte 30 Sekunden auf den Siedepunkt erwärmt, um die Phagen für die PCR freizusetzen. Nach kurzem Abkühlen der Platte wurde der Inhalt der Vertiefungen auf ein PCR-Röhrchen zusammen mit einem herkömmlichen PCR-Gemisch (18 μl) unter Einschluss von M13-Phagenspezifischen Primern und SybrGreen (verwendet gemäß den Anweisungen des Herstellers) übertragen.
Die Probe wurde im Roche LightCycler-Gerät einer Reihe von Thermozyklisierungsstufen unter folgenden Bedingungen unterworfen:
0 Sekunden bei 94 °C (Schmelzen);
30 Sekunden bei 62 °C (Anlagerungsphase);
30 Sekunden bei 72 °C (Erweiterungsphase).
Es wurden 40 Zyklen durchgeführt. Das von den Proben ausgehende Fluoreszenzsignal wurde 1-mal pro Zyklus am Ende der Erweiterungsphase festgestellt. Das Verfahren wurde mit einer zunehmend verdünnten Probe wiederholt. Die Ergebnisse sind in 2 aufgeführt. Die negativen Kontrollproben ergaben nur eine geringe Zunahme des Signals am Ende des Zyklisierungsvorgangs. Durch eine endgültige Schmelzkurvenanalyse (3) wurde bestätigt, dass das von der negativen Kontrolle ausgehende Signal auf nicht-spezifische Produkte, wie Primer-Dimere, zurückzuführen war.
Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass die Anwesenheit von bakteriellen Sporen in den Proben unter Anwendung dieses Verfahrens nachweisbar war.
Erläuterungsbeispiel 2
Nachweis von Virus-DNA an einer Oberfläche
Zum Einsatz als Nachweistest wird eine Probe auf eine mit blockiertem Antikörper beschichtete ELISA-Platte aufgesetzt und 5 bis 60 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Anschließend wird die Platte 3- bis 5-mal mit Waschflüssigkeit gewaschen. Eine Suspension von filamentösem Phagen, der ein für das Testziel spezifisches scFv exprimiert, wird zu der Platte gegeben und 5 bis 60 Minuten inkubiert. Nach weiterem Waschen (3- bis 5-mal) werden herkömmliche PCR-Reagenzien zusammen mit einem geeigneten Reportersystem, wie der vorerwähnte SybrGreen-Farbstoff, zugesetzt. Jedoch können auch andere Reportermechanismen, z. B. unter Verwendung von Fluoreszenz-Reportersonden, wie TAQMAN^R oder andere Sonden für die in situ-Überwachung, verwendet werden. Das Reaktionsgemisch wird einem Thermozyklisiervorgang unterworfen, um die Amplifikation auf übliche Weise durchzuführen.
Die PCR-Zyklusnummer, bei der das Produkt auftritt (Fluoreszenzschwelle-Kreuzungspunkt) wird festgehalten und in Korrelation mit der Konzentration des Analyten in der ursprünglichen Probe gebracht.
Es ist möglich, mehr als ein scFv mit verschiedenen Spezifitäten gleichzeitig zuzusetzen, um eine Gruppe von Zielen zu bestimmen. In derartigen Fällen können Schmelzprofile erstellt werden, um zu unterscheiden, welches scFv vorhanden ist und eine Bindung mit dem Analyten eingegangen ist. Gegebenenfalls können Phagensequenzen oder antibiotische Resistenzsequenzen, die im transformierten Phagen auftreten, als interne Referenz für die PCR herangezogen werden.
Erläuterungsbeispiel 3
Alternatives Filtrationstestformat
Bei dieser Ausführungsform wird eine flüssige Probe durch ein 0,2 μm- oder 0,45 μm-Filter gegeben, und zwar je nach Natur des Testziels. Anschließend wird der Filter gewaschen. Der Zielanalyt, z. B. bakterielle Sporen, werden auf dem Filter zurückgehalten. Anschließend wird eine Suspension des filamentösen Phagen, der ein für das Testziel spezifisches scFv exprimiert, ebenfalls durch den Filter gegeben, der erneut gewaschen wird. Etwaige Phagen, die an das Ziel auf dem Filter binden, können sodann durch PCR nachgewiesen werden, wie vorstehend ausgeführt wurde.
Erläuterungsbeispiel 4
Nachweis eines Phagen, der einzelkettige Antikörper gegen B. cereus präsentiert, in einem Immunoassay-Format
50 μl von 10⁷ B. cereus-Sporen/ml wurden 10-fach in dH₂O in Vertiefungen einer Immulon 2-ELISA-Platte verdünnt und über Nacht bei 37 °C auf der Platte getrocknet. Dadurch wurden die Sporen auf der Platte immobilisiert, so dass sie die Situation widerspiegelten, in der ein Analyt einen immobilisierten Antikörper bindet, wie es bei einem Test auf die Sporen auftreten kann.
Die Platte wurde sodann 3-mal in dH₂O gewaschen. Jede Vertiefung wurde anschließend durch Zugabe von 150 μl 1 % Blotto/PBS blockiert und anschließend wurde die Platte bei 37 °C 1 Stunde inkubiert. Die Platte wurde sodann 3-mal in in PBS-Tween gewaschen. 50 μl Phagensuspension in 1 % Blotto/PBS wurde in jede Vertiefung gegeben und anschließend wurde die Platte 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, so dass der Phage an die Sporen auf der Platte gebunden wurde. Die Platte wurde sodann 3-mal in PBS-Tween gewaschen, wonach sich 3 Waschvorgänge mit dH₂O anschlossen, um ungebundenen Phagen zu entfernen.
Sodann wurden 50 μl dH₂O in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde 30 Sekunden in siedendem Wasser erwärmt, um den Phagen zu eluieren.
2 μl aus jeder Vertiefung wurden sodann durch PCR unter Verwendung von auf den Phagen gerichteten Primern getestet. Das lacI-Gen, das innerhalb des von M13 abgeleiteten Phagen auftrat, wurde amplifiziert. Eine Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung einer Corbett RotorGene-Einrichtung durchgeführt. Jedes Trisgepufferte Reaktionsgemisch enthielt jeweils 0,5 μM Vorwärts- und RückwärtslacI-Primer, 0,3 μM lacI-spezifische TaqMan-Sonde, 4 mM MgCl₂. Folgende Zyklisierungsparameter wurden eingehalten: 5 Sekunden bei 95 °C und 1 Minute bei 60 °C für 50 Zyklen. Nachstehend sind die Primer, die Sonde und das Ziel angegeben:
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass 10⁶ bis 10³ Sporen pro Vertiefung über dem Hintergrundniveau nachweisbar waren, obgleich das Hintergrundniveau in diesem Fall recht hoch war. Dies war vermutlich die Folge einer Kreuzverunreinigung. Es gibt gemeinsame Gene zwischen von M13 abgeleiteten Phagen und von M13 abgeleiteten Klonierungsvektoren, die routinemäßig im Laboratorium verwendet werden. Die Empfindlichkeit des Tests könnte leicht verbessert werden, indem man die Phagen-PCR-Reaktion in einem Laboratorium einrichtet, das frei von M13-Verunreinigung ist oder indem man Primer wählt, die spezifisch für B. cereus-Antikörper präsentierende Phagen sind.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Analyten in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Probe mit einer Oberfläche, auf der ein Bindungsreagens immobilisiert ist, welches entweder (a) den Analyten bindet oder (b) den Analyten oder ein Analog davon umfasst, und einem Virus, das transformiert worden ist, so dass es eine Bindungskomponente exprimiert und displayed, die das Bindungsreagens in Konkurrenz zu dem Analyten bindet, Trennen der Oberfläche von der Probe und Durchführen einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion, um die Menge einer Nucleinsäuresequenz, die in dem Virus vorhanden ist, auf der Oberfläche zu bestimmen, wobei mindestens eines aus dem Bindungsreagens oder der Bindungskomponente für den Analyten spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das immobilisierte Bindungsreagens den Analyten oder ein Analog davon umfasst, so dass die Bindungskomponente entweder den Analyten oder das Bindungsreagens binden wird, und die Gegenwart von Analyt in der Probe die Bindung der Bindungskomponente an das Bindungsreagens blockiert, so dass eine Verringerung der Menge an Virus, das befähigt ist an das Bindungsreagens zu binden, ein Anzeichen für das Vorhandensein des Analyten in der Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bindungsreagens den Analyten bindet, und auch die Bindungskomponente auf dem Virus, so dass der Analyt und die Bindungskomponente um verfügbare Stellen an der Oberfläche konkurrieren, so dass eine Verringerung der Menge an Virus, das befähigt ist an das Bindungsreagens zu binden, ein Anzeichen für das Vorhandensein des Analyten in der Probe ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin die Oberfläche die Oberfläche einer ELISA-Platte, eines ELISA-Wells, eines magnetischen Teilchens oder einer Membran ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin die Stellen an der Oberfläche, die nicht von dem Bindungsreagens besetzt sind, blockiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Analyt-spezifische Bindungspartner ein einkettiges variables Fragment eines Antikörpers (scFV) ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin das Virus eine multi-spezifische Mischung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, worin ein Nachweis auf multiple Nucleinsäuresequenzen, die jeweils charakteristisch für individuelle Viren sind, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Polymerase-Kettenreaktion derart durchgeführt wird, dass das Amplifikationsprodukt mit fortschreitender Reaktion ein detektierbares Signal erzeugt und das Signal des Amplifikationsgemisches mindestens einmal während jedes Zyklus der Amplifikationsreaktion überwacht wird, um die Menge an Virus zu bestimmen, die auf der Oberfläche vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Signal ein sichtbares Signal ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin die Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart eines DNA-Bindungsreagens oder eines Primers oder einer Sonde durchgeführt wird, die mit einem Fluoreszenzmarker markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das DNA-Bindungsreagens ein interkalierender Farbstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die Reaktion in Gegenwart einer Sonde durchgeführt wird, die ein DNA-Oligonucleotid umfasst, das mit einem Fluoreszenzenergie-Donor- und einem Fluoreszenzenergie-Akzeptormolekül markiert ist, und worin während der Amplifikation die an die Targetsequenz gebundene Sonde hydrolysiert wird, um die Donor- und Akzeptormoleküle freizusetzen.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin Virus-Nucleinsäure detektiert wird durch Amplifizieren einer Nucleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes, in dem Verfahren verwendetes Virus charakteristisch ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Virus ein rekombinantes Virus ist, das mit einer Markersequenz transformiert worden ist, wobei diese Sequenz die Sequenz ist, die amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin Sequenzen, die für mehr als ein Virus charakteristisch sind, detektiert werden.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, worin mehr als ein Virus in dem Verfahren verwendet werden, und eine anschließende Schmelzpunktanalyse durchgeführt wird, um festzustellen, welches Virus während des Assay gebunden hat.
Kit zur Bestimmung der Menge eines Analyten in einer Probe, wobei das Kit umfasst einen festen Körper, der auf einer Oberfläche ein Bindungsreagens immobilisiert aufweist, welches entweder (a) den Analyten bindet oder (b) den Analyten oder ein Analog davon umfasst; ein Virus, das transformiert worden ist, so dass es eine spezifische Bindungskomponente für das Bindungsreagens in Konkurrenz zu dem Analyten exprimiert, und Reagentien zur Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion zum Amplifizieren und Detektieren einer Nucleinsäure des Virus, wobei die zum Durchführen einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion befähigten Reagentien zum Amplifizieren und Detektieren einer Nucleinsäure des Virus eine DNA-Sonde umfassen, welche ein Fluoreszenzenergie-Donormolekül und ein Fluoreszenzenergie-Akzeptormolekül umfasst.
Kit nach Anspruch 18, welches mehr als eine Art von transformiertem Virus umfasst.
Kit nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, welches einen interkalierenden Farbstoff umfasst.