WO2002083941A2 - Hochspezifisches detektionssystem für den nachweis von lambda- und kappa- leichte ketten codierenden nukleotidsequenzen - Google Patents

Hochspezifisches detektionssystem für den nachweis von lambda- und kappa- leichte ketten codierenden nukleotidsequenzen Download PDF

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WO2002083941A2
WO2002083941A2 PCT/EP2002/003975 EP0203975W WO02083941A2 WO 2002083941 A2 WO2002083941 A2 WO 2002083941A2 EP 0203975 W EP0203975 W EP 0203975W WO 02083941 A2 WO02083941 A2 WO 02083941A2
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nucleotide sequences
oligonucleotide
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Astrid Stratmann
Ingrid Horschke
Ana Fulgencio
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Histaggen Gmbh & Co. Kg
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a highly specific in-situ hybridization method of labeled oligonucleotides with nucleotide sequences to be detected in a target object, as well as hybridization buffers, oligonucleotides and methods for labeling the oligonucleotides used.
  • the in situ hybridization method has in common that after radioactive or non-radioactive labeling of the nucleic acid probes and, if appropriate in situ amplification of the nucleotide sequences to be investigated hybridization takes place in situ.
  • the tissue is usually first fixed, embedded, a cut is made, the target nucleic acid is unmasked, a DNAse or RNAse digestion is carried out, if appropriate, and the target nucleic acid and the sample are denatured if necessary. The actual hybridization with the labeled probe can then take place.
  • a particularly important area of application of in situ hybridization is the investigation of processes related to the human or animal immune system. Knowledge of the sequence of the DNA or RNA to be detected is necessary to carry out the ISH.
  • the nucleotide sequences of the Ig ⁇ light chain genes are from Hieter et al. (Nature 294 (1981), 536-540) and that of the K light chain genes from Hieter et al. (Cell 22 (1980), 197-207). Both diagnostic and therapeutic methods, in the context of which the quality and quantity of an Ig-based immune response must be analyzed, are known.
  • Hybridization buffers are for use in ISH, for example, from Rüger et al. (Biochemica 3 (1995), 27-29).
  • these buffers have the disadvantage of being hazardous to health and the environment. In addition, they are made up of a large number of different components and are comparatively expensive.
  • the aforementioned documents also do not relate to the in situ hybridization of Ig ⁇ and K light chain nucleotide sequences.
  • the technical problem underlying the present invention was therefore to develop an in situ hybridization technique which enables the detection of immunoglobulin ⁇ - and K-light chain nucleotide sequences in an automated, fast and highly sensitive manner, while at the same time using inexpensive, environment- and health-friendly means a reduction in background activity should be achieved as far as possible.
  • the present invention solves the technical problem on which it is based by providing a method for carrying out in situ hybridizations of at least one labeled oligonucleotide with nucleotide sequences to be detected in target objects, the at least one labeled oligonucleotide in situ with the addition of a formamide-free hybridization buffer with the Nucleotide sequences are brought into contact and hybridizing nucleotide sequences are detected in the target object.
  • target objects are understood to mean any type of objects which contain or consist of nucleotide sequences. These are in particular biological materials such as cells, tissues, tissue sections, cell organelles, nucleotide sequence-containing particles such as viruses or liposomes, human, animal or vegetable chromosomes, human, animal or vegetable extrachromosomal structures, as well as chromosomal or extrachronosomal structures in procaryotes or similar.
  • the target objects can be alive or dead, pretreated or untreated.
  • the nucleotide sequences to be contained in them can be present in the target object or bound to other structures. They can also be in amplified form.
  • the nucleotide sequences can single or double-stranded and possibly multiple-stranded in the target object.
  • nucleotide sequences to be detected are understood to mean pro- or eucaryotic nucleotide sequences of nucleotide sequences containing a few to many hundreds or thousands of nucleotides, for example gene segments, genes, plasmids, nucleotide sequences in chromosomes or chromosome fragments etc.
  • the nucleotide sequence can be used as RNA - Or DNA sequence are available. It can be single, double or multiple strands. According to the invention, it is therefore not absolutely necessary to convert the nucleotide sequences to be detected in situ double-stranded before the ISH into the single-stranded form. Rather, the formation of triple formations, that is to say formations formed from three nucleic acid ranks, can be provided according to the invention.
  • the invention of course also covers hybridization with single-stranded sections, which may be present in regions in native DNA.
  • the invention also relates to specially developed labeled oligonucleotides or mixtures thereof, which are particularly suitable for use in the aforementioned ISH process, for example, for hybridization with immunoglobulin ⁇ and with immunoglobulin K light chain nucleotide sequences.
  • these oligonucleotides are also suitable for other purposes, for example other ISH methods or in-situ amplifications.
  • the immunoglobulin ⁇ light chain oligonucleotide is selected from the group of the sequences consisting of SEQ ID Nos. 1 to 6.
  • the invention also relates to a mixture of different, for example two, three, four, five or six of the oligonucleotides mentioned, and particularly suitable for use in the aforementioned ISH method, in particular a mixture of SEQ ID Nos. 2, 3 and 6.
  • the nucleotide sequence of the K light chain oligonucleotide is selected from the group of the sequences consisting of SEQ ID No. 7 to 10.
  • the invention also relates to a mixture of different, for example two, three or four of the mentioned oligonucleotides, in particular all four oligonucleotides (SEQ ID No. 7, 8, 9 and 10).
  • ⁇ and K oligonucleotides according to the invention are highly sensitive, highly specific and each correspond to the constant region of the human ⁇ and ⁇ genes.
  • the oligonucleotides can be used as individual oligonucleotides, for example in the process according to the invention, or as a mixture of, for example, three, in particular SEQ No. 2, 3, 6 for the ⁇ and four, in particular SEQ No. 7, 8, 9 and 10 for the K Ig light chain nucleotide sequence detection can be used.
  • the oligonucleotides according to the invention or their mixtures are also distinguished by the fact that the background staining that occurs with a conventional ISH can be largely or completely avoided.
  • the single oligonucleotides according to the invention have a sensitivity which is more than fifty to a hundred times higher than probes of the prior art.
  • the oligonucleotides can be designed as sense or antisense oligonucleotides.
  • oligonucleotide probes in particular in the form of an antisense oligonucleotide, in the form of a mixture, at the same final concentration as for a single oligonucleotide, leads to an additional increase in sensitivity by a factor of 2 to 5.
  • the invention also relates to the aforementioned oligonucleotides and their use in the aforementioned in-situ hybridization method, the oligonucleotides being labeled, for example with a radioactive or chemiluminescent label.
  • the oligonucleotides are labeled with isotopes, in particular radioisotopes.
  • labeling with enzymes, antibodies, fluorochromes, fluorogens, photoaffinity or spin labels is preferred.
  • the oligonucleotides are labeled with biotin, FITC or DIG (digoxigenin).
  • a particularly preferred embodiment provides for labeling the oligonucleotides at their 3 1 or 5 ′ ends. Preference is given to a 3 'end label, in a preferred embodiment the molar ratio of labeled nucleotide dNTP to unlabeled dNTP is 1: 1.
  • the invention also relates to a hybridization buffer and its use in a hybrid doping process, for example the aforementioned in-situ hybridization process, this hybridization buffer consisting of 10% by weight of dextran sulfate, 0.2% by weight of lauroylsarcosine, 0.1 to 0.8 M NaCl and 0.01 to 0.8 M Na 3 citrate consists of water.
  • the buffer according to the invention thus has only 4 components in water and contains no denaturing agents such as formamide, but also no RNA, DNA or other additives.
  • the NaCl content is 0.3 to 0.6 M, in particular 0.6 M.
  • the Na 3 citrate content is 0.03 to 0.06 M, in particular 0.06 M.
  • the hybridization buffer according to the invention is therefore free of formamide and has no components other than those mentioned above. It is therefore particularly simple and inexpensive to manufacture, since it is composed of only five components.
  • the hybridization buffer is also non-toxic due to the lack of formamide, is not harmful to the fruit and can therefore be used without special precautionary measures.
  • the hybridization buffer enables a highly specific, background-free hybridization in a particularly advantageous manner.
  • the invention relates to a method for labeling oligonucleotides, in particular at their 3 'end, at least one oligo to be labeled being nucleotide in a reaction buffer and H 2 0 after addition of a molar 1: 1 ratio of labeled dNTP to unlabelled dNTP with a terminal transferase and an attachment of a terminally labeled nucleotide sequence is achieved.
  • the labeled and unlabeled dNTP is dATP, dCTP, dGTP, dUTP or dTTP.
  • a molar 1: 1 ratio of labeled dUTP to unlabeled dATP is used.
  • a molar 1: 1 ratio of labeled dATP to unlabeled dATP is used.
  • the label can be a label that is usually used, in particular a biotin, FITC or DIG label.
  • the molar ratio of 1: 1 used according to the invention in the terminal labeling reaction deviates by a power of 10 from the labeling ratio normally used (usually a 1:10 ratio of labeled to unlabeled dNTP is used, see e.g. Boehringer Mannheim labeling kit; order no 1417231).
  • the molar 1: 1 ratio provided in the labeling reaction according to the invention leads, particularly when using the hybridization buffer according to the invention, in particular in the in-situ hybridization method according to the invention, to a particularly high sensitivity and low background coloration when detecting the nucleotide sequences to be tested. According to the invention, a drastic increase in probe sensitivity and a particularly significant reduction in the usual Marking reactions occurring background stains can be caused.
  • the method for 3 'labeling of oligonucleotides is carried out at a temperature of 30 to 40 ° C., in particular 37 ° C., particularly preferably for a period of 10 to 60 minutes, in particular 30 minutes.
  • the reaction buffer is supplied with Co 2+ , for example in the form of CoCl 2 .
  • Co 2+ for example in the form of CoCl 2 .
  • 0.5 to 5, in particular 1 mM CoCl 2 are added to the reaction buffer.
  • the in-situ hybridization according to the invention made possible by means of the above-mentioned means and procedures is characterized by a particularly rapid execution of the procedure of, for example, only 3.5 hours for the entire process, a particularly gentle treatment of the target objects or nucleotide sequences to be detected due to the absence denaturing chemical agents, easy handling due to the absence of toxic components and, above all, extremely high sensitivity with little or no background staining.
  • the procedure according to the invention in particular enables the detection of nucleic acids to be detected by means of automated systems as well as an evaluation by means of automated image analysis systems and allows the analysis of larger quantities in a simple, inexpensive and fast manner Material.
  • the procedure according to the invention is therefore particularly suitable for high-throughput processes.
  • the invention also provides that the target objects are subjected to a pretreatment before the hybridization.
  • Such pretreatment can be, for example, fixation, embedding, cutting, unmasking of the target nucleic acid, DNAse digestion, RNAse digestion and / or denaturation.
  • an aldehyde fixation or an alcohol-acid fixation can be provided according to the invention.
  • the fixation can take place especially in formalin.
  • it can further be provided to embed the fixed target objects in, for example, paraffin.
  • the optionally fixed and embedded target objects can then be mounted on optionally also pretreated specimen slides, for example heated, washed and dried specimen slides, and then deparaffinized.
  • the slides can optionally be pretreated with, for example, aminopropyltriethoxisilane-TESPA.
  • the fixation that may be provided according to the invention can lead to crosslinking between proteins and between nucleic acids and proteins.
  • it is therefore advantageous to carry out limited proteolysis for example with pepsin, proteinase K or pronase.
  • a DNAse or RNAse digestion can optionally be provided to increase the specificity of a DNA or RNA detection, particularly in more complex systems.
  • nucleotide sequences to be detected and oligonucleotide probes preferably single-stranded
  • this can, however, be carried out if appropriate, the nucleotide sequence and / or oligonucleotide probe to be detected, for example by heating to 75 ° C. to 95 ° C. be denatured.
  • the hybridization according to the invention can take place over a period of 0.5 to 2 hours. A period of one hour is preferred. In a preferred embodiment, the hybridization takes place at 45 ° C. to 60 ° C., in particular 55 ° C. Of course, it is possible that at least one washing step is carried out after the hybridization. In an advantageous embodiment of the invention, a detection step is carried out at 30 to 37 ° C. after the washing step which may have taken place or directly after the hybridization.
  • the in-situ hybridization method according to the invention can be used, for example, in the diagnosis of Diseases of the human or animal body are used, for example in allergic diseases, autoimmune diseases and oncogenic diseases.
  • the procedure according to the invention can also be used in the context of basic or applied research.
  • the invention also relates to a test kit for carrying out the aforementioned in-situ hybridization method, comprising at least one vessel which contains at least one of the aforementioned oligonucleotides selected from the group consisting of SEQ ID No. 1 to 10, preferably labeled, optionally also amplified and / or at least one vessel containing a hybridization buffer according to the invention, and / or optionally at least one vessel containing washing solutions.
  • oligonucleotides labeled according to the invention in the kit. It is preferred to include other components in the kit, e.g. To provide antibodies.
  • the invention relates to a kit for labeling oligonucleotides
  • a kit for labeling oligonucleotides comprising at least one vessel containing a terminal transferase and / or a vessel containing a reaction buffer and optionally CoCl 2 solution, optionally containing a vessel control oligonucleotide (unlabeled) Vessel optionally containing a further control oligonucleotide with labeling optionally containing a vessel containing a control nucleotide sequence and either separately in individual vessels or already mixes a labeled dNTP and an unlabeled dNTP in a molar 1: 1 ratio in a vessel, eg unlabeled dATP and labeled dUTP.
  • sequence listing captures the nucleotide sequences shown in SEQ ID Nos. 1 to 10, with SEQ ID Nos. 1 to 6 representing antisense oligonucleotides which are used to detect the Ig- ⁇ light chain mRNA and SEQ ID Nos. 7 to 10 are used to detect serve mRNA of the Ig-K light chain.
  • FIGS. 1 to 7 show in a photographic (FIGS. 1 to 7) and a graphic (FIGS. 8 and 9) representation:
  • ISH in-situ hybridization
  • SEQ ID No. 1 to 6 in hybridization buffer according to the invention on human tonsil, the oligonucleotides being labeled (biotin-labeled) by the method according to the invention
  • FIG. 2 shows the representation of an ISH with the oligonucleotides and the hybridization buffer according to FIG. 1 on a human tonsil, one for labeling the oligonucleotides usual labeling reaction (FITC- labeled) was used,
  • FIG. 3 shows an ISH on a human tonsil using a mixture of six oligonucleotides according to the invention with the SEQ
  • FIG. 4 shows an ISH on a human tonsil using a ⁇ -oligonucleotide mixture (FITC-labeled) from the prior art
  • FIG. 5 shows an ISH on a human tonsil using a ⁇ -oligonucleotide mixture
  • FIG. 6 shows an ISH on a human tonsil using a mixture according to the invention of six oligonucleotides with the sequences according to SEQ ID No. 1 to 6, the oligonucleotides being labeled according to the invention (biotin-labeled) and a hybridization buffer according to the prior art (containing 50% formamide ) was used,
  • Figure 7 is an ISH according to the conditions of Figure 6 (biotin labeled), but instead of the hybridization buffer of the prior art a hybridization buffer according to the invention was used in the art,
  • FIG. 8 shows a graphic representation of the hybridization signal intensity and the background staining that occurs in the tissue of a 1:10 marked ⁇ 9 probe
  • FIG. 9 shows a graphic representation of the hybridization signal intensity and the background staining occurring in the tissue of a ⁇ 9 probe marked according to the invention (SEQ ID No. 10).
  • MBI Fermentas 25 U / ⁇ l dATP (ImM) R ⁇ CHE dUTP (ImM) - Biotin R ⁇ CHE - FITC NEN
  • a 20 ⁇ l reaction mixture is prepared from: 4 ⁇ l reaction buffer (5x) l ⁇ l oligonucleotide (antisense) (l ⁇ g / ⁇ l) (or mixture of the oligonucleotides) 1 ⁇ l dATP (ImM) 1 ⁇ l dUTP (FITC / BIOTIN / DIGOXIGENIN) (ImM) 1 ⁇ l terminal transferase (25 U / ⁇ l)
  • the components are mixed and incubated at 37 ° C (water bath) for 30 minutes.
  • the hybridization buffer according to the invention consists of:
  • a standard hybridization buffer which was composed as follows, was produced as a comparison buffer:
  • buffers not used directly in the hybridization but in the context of the present example had the following composition: TBST: 0.1 M Tris / HCl, 0.1 M NaCL, 0.05% Tween-20, pH 7.5
  • Blocking buffer 1% blocking reagent (Röche) in 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, pH 7.5
  • AP buffer 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris / HCl, pH 9.5
  • NBT Tubes: 100 mg / ml in 70% dimethylformamide
  • BCIP tubes: 50 mg / ml in dimethylformamide
  • tissue-provided slides were heated to 70 ° C. for 15 minutes and washed twice in xylene for 10 minutes and then once in ethanol for 5 minutes and then air-dried.
  • LSD buffer according to the invention The mixture was then washed twice with TBST for five minutes at room temperature (in the case of a standard hybridization buffer) or once for five minutes at 55 ° C. and twice in each case for five minutes at room temperature (in the case of the LSD buffer according to the invention).
  • FIGS. 1, 3 and 7 show ISHs carried out in accordance with the method described above, an oligonucleotide mixture according to the invention of the sequences SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 and 6, in each case in equimolar ratios to one another, in the LSD hybridization buffer according to the invention was used, the oligonucleotides used being 3 'end-labeled according to the present invention. It can be seen that advantageously no background coloring and a very high signal strength is achieved.
  • the result documented in FIG. 2 can also be seen in direct comparison to the results documented in FIGS. 1, 3 and 7.
  • standard labeling was carried out. This was carried out as described in the prior art (DIG Oligonucleotide Tailing Kit, Order No. 1417231, Boehringer Mannheim), using a 1:10 molar ratio of labeled dUTP to unlabeled dATP.
  • DIG Oligonucleotide Tailing Kit Order No. 1417231, Boehringer Mannheim
  • FIGS. 4 and 5 known ⁇ -light chain oligonucleotide mixtures (FIG. 4: Biogenex, USA, San Ramon, cat. No. HK856-2K, FIG. 5: Kreatech, NL, Amsterdam, Cat.No. PLD 182) each carried out an ISH.
  • FIG. 4 shows a significantly stronger background coloring and reduced signal strength than in the procedure according to the invention (compare for example FIG. 3).
  • FIG. 5 shows a very weak signal strength compared to the procedure according to the invention (compare for example FIG. 3).
  • FIGS. 8 and 9 represent the intensity of the hybridization signal and the background staining occurring in the tissue as a function of the dilution of a ⁇ 9 probe (SEQ ID No. 10).
  • FIG. 8 shows that by means of a standard labeling using a 1:10 molar ratio of bio-, DIG- or FITC-labeled dNTP (here: dATP or dUTP) to dATP, a lower sensitivity, that is to say signal strength, and a stronger background coloration are obtained becomes.
  • a lower sensitivity that is to say signal strength, and a stronger background coloration are obtained becomes.
  • FIG. 9 when using a 1: 1 molar ratio of bio-, DIG- or FITC-labeled dNTP (here: dATP or dUTP) to dATP an increased sensitivity, that means stronger hybridization signal intensity and less or no background coloring.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes In-situ-Hybridisierungsverfahren für den Nachweis von λ und κ-leichte Ketten codierenden Nucleotidsequenzen sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Hochspezifisches DetektionsSystem
Besehreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein hochspezifisches In-situ-Hybridisierungsverfahren von markierten Oligonucleotiden mit in einem Zielobjekt nachzuweisenden Nucleotidsequenzen sowie dabei eingesetzte Hybridisierungspuffer, Oligonucleotide sowie Verfahren zur Markierung der Oligonucleotide.
Sowohl die molekularbiologische Grundlagenforschung als auch die angewandte Forschung, insbesondere die molekulare Beschreibung physiologischer oder krankhafter Vorgänge, bedient sich in zunehmendem Maße einer Nucleotidanalyse auf Zeil- und Gewebeebene. Zur exakten Lokalisation und quantitativen Abschätzung der Expression von zum Beispiel DNA oder RNA in Zellen oder Geweben wird die molekulare In-situ- Hybridisierung eingesetzt. Grundlage dieses moleku- larbiologischen Nucleinsäurenachweises ist das Prinzip der spezifischen Basenpaarung zweier komplementärer Nucleinsäuremolekülen . Eine in einem Zielobjekt vorhandene Nucleotidsequenz wird durch Basenpaarung mit einer markierten komplementären Nucleotidsequenz, der Sonde, nachgewiesen. Derartige Verfahren sind aus ernert und Behrens (mta 13 (1998) 12, 880-886) bekannt.
Den In-situ-Hybridisierungsverfahren ist gemeinsam, dass nach radioaktiver oder nicht-radioaktiver Mar- kierung der Nucleinsäure-Sonden und gegebenenfalls erfolgender In-situ-Amplifikation der zu untersuchenden Nucleotidsequenzen eine Hybridisierung in situ stattfindet. Im Vorfeld der In-situ- Hybridisierung wird üblicherweise zunächst das Ge- webe fixiert, eingebettet, ein Schnitt hergestellt, die Zielnucleinsäure demaskiert, gegebenenfalls ein DNAse oder RNAse-Verdau durchgeführt und gegebenenfalls die Zielnucleinsäure und die Probe denaturiert. Anschließend kann dann die eigentliche Hybridisierung mit der markierten Sonde stattfinden .
Ein besonders bedeutsamer Anwendungsbereich der In- situ-Hybridisierung ist die Untersuchung von mit dem menschlichen oder tierischen Immunsystem zusam- menhängenden Vorgängen. Für die Durchführung der ISH ist die Kenntnis der Sequenz der nachzuweisenden DNA oder RNA notwendig. Die Nucleotidsequenzen der Ig-λ-leichte Ketten-Gene sind aus Hieter et al. (Nature 294 (1981), 536-540) und die der K-leichte Ketten-Gene aus Hieter et al . (Cell 22 (1980), 197- 207) bekannt. Sowohl diagnostische als auch therapeutische Verfahren, im Rahmen derer Qualität und Quantität einer Ig-basierten Immunantwort analysiert werden müssen, sind bekannt.
So ist beispielsweise aus Takahashi et al . (J. Oral. Pathol. Med. 1996 (25) 331-335) bekannt, die Immunglobulin (Ig) λ und K leichten Ketten mRNA mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) als Hinweis auf eine Immunreaktion im Rahmen einer Zahnerkran- kung nachzuweisen. Unter Einsatz Fluoreszein- Isothiocyanat ( FITC) -markierter λ- und K-leichte Ketten-Oligonucleotidgemische sowie Anti-FITC- Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert worden waren, wurden λ- und K-leichte Ketten- mRNA in verschiedenen Schnitten nachgewiesen. Auch Pringle et al. (J. of Pathology 162 (1990), 197- 207) beschreibt eine ISH von Ig leichte Ketten mRNA unter Verwendung von Gemischen von markierten Oli- gonucleotiden . Die beschriebenen Verfahren erweisen sich jedoch insofern als nachteilig, als dass einerseits die Hybridisierungszeit vergleichsweise lang, andererseits auch die erhaltene Sensitivität verbesserungsfähig sind.
Aus der DE 42 16 949 02 und der WO 93/24652 sind Verfahren zur Hybridisierung von spezifischen Proben in situ bekannt, wobei Hybridisierungspuffer eingesetzt werden, die keine oder wenig denaturierende Agentien enthalten. Formamid-haltige Hybridisierungspuffer sind für den Einsatz in ISH zum Beispiel aus Rüger et al. (Biochemica 3 (1995), 27-29) bekannt. Diesen Puffern haftet jedoch der Nachteil an, gesundheits- und umweltgefährdend zu sein. Überdies sind sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten aufgebaut und vergleichsweise teuer. Die vorgenannten Druckschriften betreffen auch nicht die In-situ-Hybridisierung von Ig-λ- und K-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen .
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem bestand also darin, eine In- situ-Hybridisierungstechnik zu entwickeln, die in automatisierbarer, schneller und hochsensitiver Weise den Nachweis von Immunglobulin λ- und K- leichte Ketten-Nucleotidsequenzen ermöglicht, wobei gleichzeitig unter Einsatz preisgünstiger, umweit- und gesundheitsverträglicher Mittel eine Reduzierung der Hintergrundaktivität soweit wie möglich erreicht werden soll.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens für die Durchführung von In- situ-Hybridisierungen von mindestens einem markierten Oligonucleotid mit nachzuweisenden Nucleotidsequenzen in Zielobjekten, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid in situ unter Zusatz eines formamidfreien Hybridisierungspuffers mit den Nucleotidsequenzen in Kontakt gebracht und hybridisierende Nucleotidsequenzen im Zielobjekt nachgewiesen werden .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Zielobjekten jedwede Art von Objekten verstanden, die Nucleotidsequenzen enthalten oder aus diesen bestehen. Dies sind insbesondere biologische Materialien wie Zellen, Gewebe, Gewebe- schnitte, Zellorganelle, Nucleotidsequenz-haltige Partikel wie Viren oder Liposomen, menschliche, tierische oder pflanzliche Chromosomen, menschliche, tierische oder pflanzliche extrachromosomale Strukturen, ebenso wie chromosomale oder extrachro- rnosomale Strukturen in Procaryoten oder ähnliches. Die Zielobjekte können lebend oder tot, vorbehandelt oder unbehandelt sein. Die in ihnen enthaltenden nachzuweisenden Nucleotidsequenzen können im Zielobjekt oder an andere Strukturen gebunden vor- liegen. Sie können auch in amplifizierter Form vorliegen. Überdies können die Nucleotidsequenzen ein- zel- oder doppelsträngig sowie gegebenenfalls mehr- fachsträngig im Zielobjekt vorliegen.
Im Zusammenhang mit der- vorliegenden Erfindung werden unter nachzuweisenden Nucleotidsequenzen pro- oder eucaryotische Nucleotidsequenzen von einige wenige bis viele hundert oder tausend Nucleotide enthaltende Nucleotidsequenzen verstanden, beispielsweise Genabschnitte, Gene, Plasmide, Nucleotidsequenzen in Chromosomen oder Chromosomenfrag- mente etc. Die Nucleotidsequenz kann als RNA- oder DNA-Sequenz vorliegen. Sie kann einzel-, doppel- oder mehrfachsträngig sein. Erfindungsgemäß ist es daher nicht zwingend notwendig, doppelsträngig in situ vorhandene nachzuweisende Nucleotidsequenzen vor der ISH in die einzelsträngige Form zu überführen. Erfindungsgemäß kann vielmehr die Bildung von Tripel-Formationen, das heißt aus drei Nucleinsäu- resträngen gebildete Formationen vorgesehen sein. Die Erfindung erfasst natürlich auch die Hybridi- sierung mit einzelsträngigen Abschnitten, die in nativer DNA bereichsweise vorliegen kann.
Die Erfindung betrifft auch speziell entwickelte markierte und z.B. für den Einsatz im vorgenannten ISH-Verfahren besonders geeignete Oligonucleotide oder Gemische davon sowohl für die Hybridisierung mit Immunglobulin-λ als auch mit Immunglobulin-K- leichte Ketten-Nucleotidsequenzen. Selbstverständlich sind diese Oligonucleotide auch für andere Zwecke, z.B. andere ISH-Verfahren oder In-situ- Amplifikationen geeignet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Immunglobulin-λ-leichte Ketten-Oligonucleotid ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 6. Die Erfindung betrifft auch ein Gemisch aus verschiedenen, zum Beispiel zwei, drei, vier, fünf oder sechs der genannten Oligonucleotide, und für den Einsatz im vorgenannten ISH- Verfahren besonders geeignet, insbesondere ein Gemisch aus SEQ ID Nr. 2, 3 und 6.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleotidsequenz des K-leichte Ketten Oligonuc- leotids ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen, bestehend aus SEQ ID Nr. 7 bis 10. Die Erfindung betrifft auch ein Gemisch aus verschiedenen, zum Beispiel zwei, drei oder vier der genannten Oligonucleotide, insbesondere aller vier Oligonucleotide (SEQ ID Nr. 7, 8, 9 und 10) .
Diese erfindungsgemäßen λ- und K-Oligonucleotide sind hochsensitiv, hochspezifisch und entsprechen jeweils der konstanten Region der menschlichen λ- und κ-Gene . Die Oligonucleotide können als einzelne Oligonucleotide zum Beispiel in dem erfindungsgemäßen Verfahren oder als Gemisch aus zum Beispiel drei, insbesondere SEQ Nr. 2, 3, 6 für die λ- beziehungsweise vier, insbesondere SEQ Nr. 7, 8, 9 und 10 für die K Ig-leichte Ketten- Nucleotidsequenz-Detektion eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide beziehungsweise deren Gemische zeichnen sich auch dadurch aus, dass die bei einer herkömmlichen ISH auftretende Hintergrundfärbung weitgehend bis ganz vermieden werden kann. Die erfindungsgemäßen Einzeloligonucleotide weisen eine über fünfzig- bis hundertfach höhere Sensitivität auf, als Sonden des Standes der Technik. Die Oligonucleotide können als Sinn- oder An- tisinn-Oligonucleotide ausgeführt sein.
Die Verwendung der vorgenannten, insbesondere als Antisinn-Oligonucleotide ausgeführten, Oligonucleo- tidsonden in Form eines Gemisches führt bei gleicher Endkonzentration wie für ein einzelnes Oligonucleotid zu einer zusätzlichen Erhöhung der Sensi- tivität um den Faktor 2 bis 5.
Die Erfindung betrifft auch die vorgenannten Oligonucleotide und deren Verwendung in dem vorgenannten In-situ-Hybridisierungsverfahren, wobei die Oligonucleotide markiert sind, beispielsweise mit einer radioaktiven oder chemilumineszenten Markierung. So kann beispielsweise vorgesehen sein, die Oligonucleotide mit Isotopen zu markieren, insbesondere Radioisotopen. Erfindungsgemäß ist jedoch die Markierung mit Enzymen, Antikörpern, Fluorochromen, Fluo- rogenen, Photoaffinitäts- oder Spinlabeln bevorzugt. Insbesondere werden die Oligonucleotide mit Biotin, FITC oder DIG (Digoxigenin) markiert. Erfindungsgemäß ist dabei in einer besonders bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, die Oligonucleo- tide an ihrem 31- oder 5 ' -Ende zu markieren. Bevorzugt wird eine 3 ' -Endmarkierung, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform das molare Verhältnis von markiertem Nucleotid dNTP zu unmarkiertem dNTP 1:1 beträgt.
Die Erfindung betrifft auch einen Hybridisie- rungspuffer sowie dessen Verwendung in einem Hybri- disierungsverfahren, z.B. dem vorgenannten In-situ- Hybridisierungsverfahren, wobei dieser Hybridisie- rungspuffer aus 10 Gew.-% Dextransulfat , 0,2 Gew.-% Lauroylsarcosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,8 M Na3-Citrat in Wasser besteht. Der erfindungsgemäße Puffer weist in Wasser also nur 4 Komponenten auf und enthält keine denaturierenden Agentien wie Formamid, aber auch keine RNA, DNA oder sonstige Zusätze.
In besonders bevorzugter Ausführungsform beträgt der NaCl-Gehalt 0,3 bis 0,6 M, insbesondere 0,6 M.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der Na3-Citrat-Gehalt 0,03 bis 0,06 M, insbesondere 0,06 M.
Der erfindungsgemäße Hybridisierungspuffer ist also Formamid-frei und weist keine anderen als die vorgenannten Komponenten auf. Er ist daher in besonders vorteilhafter Weise einfach und kostengünstig herzustellen, da er aus insgesamt lediglich fünf Komponenten aufgebaut ist. Der Hybridisierungspuf- fer ist insbesondere auch aufgrund des Fehlens von Formamid giftfrei, nicht fruchtschädigend und daher ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen einsetzbar. Der Hybridisierungspuffer ermöglicht in besonders vor- teilhafter Weise eine hochspezifische, Hintergrundfreie Hybridisierung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Markieren von Oligonucleotiden, insbesondere an deren 3'- Ende, wobei mindestens ein zu markierendes Oligo- nucleotid in einem Reaktionspuffer und H20 nach Zugabe eines molaren 1 : 1-Verhältnisses von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP mit einer terminalen Transferase inkubiert wird und eine Anheftung einer endständigen markierten Nucleotidsequenz erzielt wird. Insbesondere ist dabei vorgesehen, dass das markierte und unmarkierte dNTP dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein molares 1 : 1-Verhältnis von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein molares 1:1- Verhältnis von markiertem dATP zu unmarkiertem dATP eingesetzt. Die Markierung kann, wie vorstehend ausgeführt, eine üblicherweise verwendete Markierung sein, insbesondere eine Biotin-, FITC- oder DIG-Markierung . Das erfindungsgemäß eingesetzte molare Verhältnis von 1:1 bei der terminalen Markierungsreaktion weicht um eine 10er Potenz von dem üblicherweise eingesetzten Markierungsverhältnis ab (üblicherweise wird ein Verhältnis 1:10 von markiertem zu unmarkiertem dNTP eingesetzt, vgl. z.B. Boehringer Mannheim Markierungskit; Best. -Nr. 1417231). Das bei der erfindungsgemäßen Markie- rungsreaktion vorgesehene molare 1 : 1-Verhältnis führt, insbesondere bei Einsatz des erfindungsgemäßen Hybridisierungspuffers, insbesondere in dem erfindungsgemäßen In-situ-Hybridisierungsverfahren, zu einer besonders hohen Sensitivität und niedrigen Hintergrundfärbung beim Nachweis der zu testenden Nucleotidsequenzen. Erfindungsgemäß konnte eine drastische Erhöhung der Sondensensitivität und eine besonders signifikante Reduzierung der bei üblichen Markierungsreaktionen auftretenden Hintergrundfärbungen bewirkt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das Verfahren zur 3 ' -Markierung von Oligonucleotiden bei einer Temperatur von 30 bis 40°C, insbesondere 37°C, besonders bevorzugt für eine Zeitdauer von 10 bis 60 Minuten, insbesondere 30 Minuten, durchgeführt.
Gemäß der Erfindung ist vorgesehen, dem Reaktions- puffer Co2+, beispielsweise in Form von CoCl2 zuzuführen. In besonders bevorzugter Ausführungsform werden dem Reaktionspuffer 0,5 bis 5, insbesondere 1 mM CoCl2 zugesetzt.
Die mittels der vorgenannten Mittel und Verfahrens- weisen ermöglichte erfindungsgemäße In-situ- Hybridisierung zeichnet sich durch eine besonders rasche Verfahrensdurchführung von zum Beispiel nur 3,5 Stunden für den gesamten Prozess, eine besonders schonende Behandlung der Zielobjekte bezie- hungsweise nachzuweisenden Nucleotidsequenzen aufgrund des Fehlens denaturierender chemischer Agenzien, eine aufgrund der Abwesenheit toxischer Bestandteile gute Handhabbarkeit und vor allen Dingen extrem hohe Sensitivität bei geringer oder gar nicht vorhandener Hintergrundfärbung aus. Die erfindungsgemäße Vorgehensweise ermöglicht insbesondere die Detektierung nachzuweisender Nucleinsäuren mittels automatisierter Systeme sowie auch eine Auswertung mittels automatisierter Bildanalysesys- teme und gewährt in einfacher, kostengünstiger und schneller Weise die Analyse auch größerer Mengen an Material. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist daher insbesondere für High-Throughput-Verfahren geeignet .
Die Erfindung sieht selbstverständlich auch vor, dass die Zielobjekte vor der Hybridisierung einer Vorbehandlung unterzogen werden.
Eine derartige Vorbehandlung kann beispielsweise eine Fixierung, Einbettung, Schnittherstellung, Demaskierung der Zielnucleinsäure, DNAse-Verdau, RNA- se-Verdau und/oder Denaturierung sein.
So kann erfindungsgemäß beispielsweise eine Aldehydfixierung oder eine Alkohol-Säure-Fixierung vorgesehen sein. Die Fixierung kann insbesondere in Formalin stattfinden. Erfindungsgemäß kann weiter- hin vorgesehen sein, die fixierten Zielobjekte in zum Beispiel Paraffin einzubetten.
Die gegebenenfalls fixierten und eingebetteten Zielobjekte können dann auf gegebenenfalls ebenfalls vorbehandelte Objektträger, beispielsweise erhitzte, gewaschene und getrocknete Objektträger aufgezogen und dann deparaffinisiert werden. Die Objektträger können gegebenenfalls mit zum Beispiel Aminopropyltriethoxisilan-TESPA vorbehandelt sein.
Die erfindungsgemäß gegebenenfalls vorgesehene Fi- xierung kann zu einer Vernetzung zwischen Proteinen und zwischen Nucleinsäuren und Proteinen führen. Um die nachzuweisende Nucleinsäure den Oligonucleotid- sonden zugänglich zu machen, ist es daher vorteilhaft, eine limitierte Proteolyse zum Beispiel mit Pepsin, Proteinase K oder Pronase durchzuführen. Erfindungsgemäß kann gegebenenfalls zur Erhöhung der Spezifität eines DNA- oder RNA-Nachweises insbesondere in komplexeren Systemen ein DNAse- oder RNAse-Verdau vorgesehen sein.
Obgleich erfindungsgemäß eine Denaturierung von nachzuweisenden Nucleotidsequenzen und erfindungsgemäßen, vorzugsweise einzelsträngig vorliegenden, Oligonucleotidsonden nicht notwendig ist, kann diese jedoch gegebenenfalls durchgeführt werden, wobei die nachzuweisende Nucleotidsequenz und/oder Oligo- nucleotidsonde, zum Beispiel durch Erhitzen auf 75°C bis 95°C, denaturiert werden.
Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die nachzuweisenden Nucleotidsequenzen und/oder die er- findungsgemäßen Oligonucleotide vor der In-situ- Hybridisierung zu amplifizieren, zum Beispiel mittels PCR.
Die erfindungsgemäße Hybridisierung kann über einen Zeitraum von 0,5 bis 2 Stunden stattfinden. Bevor- zugt wird ein Zeitraum von einer Stunde. Die Hybridisierung findet in einer bevorzugten Ausführungsform bei 45°C bis 60°C, insbesondere 55°C statt. Selbstverständlich ist es möglich, dass nach der Hybridisierung mindestens ein Waschschritt durchge- führt wird. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird nach dem gegebenenfalls erfolgten Waschschritt oder direkt nach der Hybridisierung ein Nachweisschritt bei 30 bis 37°C durchgeführt.
Das erfindungsgemäße In-situ-Hybridisierungs- verfahren kann beispielsweise bei der Diagnose von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers eingesetzt werden, beispielsweise bei allergischen Erkrankungen, Autoimmunkrankheiten sowie on- kogenen Erkrankungen. Selbstverständlich kann die erfindungsgemäße Verfahrensweise auch im Rahmen der Grundlagen- oder angewandten Forschung eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Durchführung des vorgenannten In-situ-Hybridisie- rungsverfahren, umfassend mindestens ein Gefäß, das mindestens eins der vorgenannten Oligonucleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 10, vorzugsweise markiert, gegebenenfalls auch amplifiziert enthält und/oder mindestens ein Gefäß enthaltend einen erfindungsgemäßen Hybridisierungspuffer, und/oder gegebenenfalls mindestens ein Gefäß enthaltend Waschlösungen. Es kann vorteilhafterweise vorgesehen sein, in dem Kit erfindungsgemäß markierte Oligonucleotide einzusetzen. Es ist bevorzugt, in dem Kit weitere Komponenten, z.B. Antikörper vorzusehen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Kit zur Markierung von Oligonucleoti- den umfassend mindestens ein Gefäß enthaltend eine terminale Transferase und/oder ein Gefäß enthaltend einen Reaktionspuffer und gegebenenfalls CoCl2- Lösung, gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend Kon- trolloligonucleotid (unmarkiert) , ein Gefäß enthaltend gegebenenfalls ein weiteres Kontrolloligonuc- leodit mit Markierung gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend eine Kontroll-Nucleotidsequenz sowie entweder getrennt in einzelnen Gefäßen oder bereits ge- mischt in einem Gefäß ein markiertes dNTP und ein unmarkiertes dNTP im molaren 1:1 Verhältnis, z.B. unmarkiertes dATP und markiertes dUTP.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird anhand der Beispiele, der dazugehörigen Zeichnungen und Sequenzprotokolle näher erläutert .
Das Sequenzprotokoll erfasst die in SEQ ID Nr. 1 bis 10 dargestellten Nucleotidsequenzen, wobei SEQ ID Nr. 1 bis 6 Antisenseoligonucleotide darstellen, die dem Nachweis der mRNA der Ig-λ-leichten Kette und die SEQ ID Nr. 7 bis 10 dem Nachweis der mRNA der Ig-K-leichten Kette dienen.
Die Figuren zeigen in photografischer (Figur 1 bis 7) und grafischer (Figur 8 und 9) Darstellung:
Figur 1 eine ISH (In-situ-Hybridisierung) eines Gemisches erfindungsgemäßer sechs verschiedener Oligonucleotide mit SEQ ID Nr. 1 bis 6 in erfindungsgemäßem Hybridisie- rungspuffer auf humaner Tonsille, wobei die Oligonucleotide mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens markiert (Biotin- markiert) wurden,
Figur 2 die Darstellung einer ISH mit den Oligo- nucleotiden und dem Hybridisierungspuffer gemäß Figur 1 auf humaner Tonsille, wobei zur Markierung der Oligonucleotide eine übliche Markierungsreaktion (FITC- markiert) eingesetzt wurde,
Figur 3 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines Gemisches von sechs erfin- dungsgemäßen Oligonucleotiden mit den SEQ
ID Nr. 1 bis 6 in erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer und unter Verwendung der erfindungsgemäßen Markierungsreaktion FITC-markiert (vergleiche Figur 1),
Figur 4 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines λ-Oligonucleotid-Gemisches (FITC-markiert) des Standes der Technik,
Figur 5 eine ISH auf humaner Tonsille unter Ver- wendung eines λ-Oligonucleotid-Gemisches
(DIG-markiert ) gemäß eines anderen Standes der Technik,
Figur 6 eine ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Gemisches von sechs Oligonucleotiden mit den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 6, wobei die Oligonucleotide erfindungsgemäß markiert (Biotin-markiert) und ein Hybridisierungspuffer gemäß des Standes der Technik (50 % Formamid enthaltend) eingesetzt wurde,
Figur 7 eine ISH gemäß den Bedingungen der Figur 6 (Biotin-markiert), wobei jedoch anstelle des Hybridisierungspuffers des Standes der Technik ein erfindungsgemäßer Hybridisierungspuffer verwendet wurde,
Figur 8 eine grafische Darstellung der Hybridi- sierungssignalintensität und der im Gewe- be auftretenden Hintergrundfärbung einer im Verhältnis 1:10 markierten κ9-Sonde
(SEQ ID Nr. 10) gemäß des Standes der
Technik und
Figur 9 eine grafische Darstellung der Hybridi- sierungssignalintensität und der im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung einer erfindungsgemäß markierten κ9-Sonde (SEQ ID Nr. 10) .
Beispiel
Nachweis der mRNA der λ-leichten-Kette in humanen Tonsillen-Gewebe mittels ISH
I . Markierung der Oligonucleotide
Materialien
5-facher Reaktionspuffer für die terminale Desoxy- nucleotidyltransferase (MBI Fermentas) : IM Cacody- lat, pH 7,2, 0,5 mM DTT, 0,05 %. Triton-X-100
Terminale Transferase (MBI Fermentas) : 25 U/μl dATP (ImM) RÖCHE dUTP (ImM) - Biotin RÖCHE - FITC NEN
- DIGOXIGENIN RÖCHE
20 mM CoCl2 MBI Fermentas
4M LiCl FLUKA
Glycogen (20μg/μl) RÖCHE
EDTA (0,2M, pH 8,0) SIGMA
Verfahren :
A) Markierung
Es wird ein 20μl Reaktionsgemisch hergestellt aus: 4 μl Reaktionspuffer (5x) lμl Oligonucleotid (Antisinn) (lμg/μl) (beziehungsweise Gemisch der Oligonucleotide) 1 μl dATP (ImM) 1 μl dUTP (FITC/BIOTIN/DIGOXIGENIN) (ImM) 1 μl Terminale Transferase (25 U/μl)
I μl CoCl2 (20mM)
II μl aqua dest.
Die Komponenten werden gemischt und bei 37 °C (Wasserbad) für 30 Minuten inkubiert.
B) Präzipitation
Dem Reaktionsgemisch wird in Eppendorf-Röhrchen auf Eis 2 μl Glycogen/EDTA (200 μl EDTA 0,2 M, pH 8 + 1 μl Glycogen 20μg/μl) zugegeben, 2,5 μl LiCl (4M) und 75 μl Ethanol (100 %, auf Eis) hinzugegeben und gemischt sowie anschließend über Nacht bei -20°C ausgefällt .
C) Rekonstitution Es wird bei 13000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert , der Überstand abgenommen, das Pellet 1 x mit Etha- nol (70 %, 4°C) gewaschen, 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur (RT) luftgetrocknet und in 20 μl aqua dest. aufgenommen. Die markierten Oligonucleotide werden bei -20°C gelagert.
II. Herstellung des Hybridisierungspuffers
Der erfindungsgemäße Hybridisierungspuffer besteht aus :
4X SSC (0,6 M Natriumclorid und 0,06 M Trinatrium- Citrat), 10 Gew.-% Dextransulfat und 0,2 Gew.-% Lauroylsarkosin in aqua dest. Der Puffer enthält keine weiteren Komponenten und ist daher Formamid- frei .
Als Vergleichspuffer wurde ein Standardhybridisie- rungspuffer hergestellt, der wie folgt zusammengesetzt war:
45 Ge .- Formamid, 3,6X SSC, 7,5 Gew.-% Dextran- sulfat, 4,5X Denhardt's Lösung, 1,8 Gew.-% SDS und 0,4 mg/ml Hefe-t-RNA
(20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat ) (50x Denhardt's Lösung: 1 Gew.-I Rinderserumalbumin, 1 Gew.-I Polyvinyl-Pyrrolidon, 1 Gew.-% Fi- coll-400)
Weitere nicht unmittelbar bei der Hybridisierung aber im Rahmen des vorliegenden Beispiels verwendete Puffer wiesen folgende Zusammensetzung auf: TBST: 0,1 M Tris/HCl, 0,1 M NaCL, 0,05 % Tween-20, pH 7,5
Blockierungs-Puffer: 1 % Blockierungsreagenz (Röche) in 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5 AP-Puffer: 0,1 M NaCl, 0,1 M Tris/HCl, pH 9,5 NBT (Röche) : 100 mg/ml in 70 % Dimethylformamid BCIP (Röche) : 50 mg/ml in Dimethylformamid
III. Fixierung, Einbettung und Schnittherstellung
Menschliches Tonsillen-Gewebe wurde in NBF (neutra- lem gepufferten Formalin) fixiert und in Paraffin eingebettet. Nach der Paraffineinbettung wurden 2 μm dicke Gewebe-Schnitte zur Gewährleistung besserer Haftung auf TESPA- (Aminopropyltriethoxisilan- TESPA) beschichtete Objektträger aufgezogen. Zur Entparaffinierung wurden die mit dem Gewebe versehenen Objektträger auf 70°C für 15 Minuten erwärmt und zweimal jeweils 10 Minuten in Xylol und anschließend einmal für 5 Minuten in Ethanol gewaschen sowie anschließend luftgetrocknet.
IV. Demaskierung der Ziel-Nucleinsäure
Um die nachzuweisende Nucleinsäure den Oligonucleotiden zugänglich zu machen, wurde anschließend eine limitierte Proteolyse durchgeführt, indem die Objektträger in 0,1 %igem Pepsin in 0,1 M HC1 bei 37°C für 2 bis 20 Minuten inkubiert wurden. Anschließend wurden die Objektträger zehn Sekunden in Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Es wurde weder ein DNAse- oder RNAse-Verdau noch eine Denaturierung von Zielnucleinsäuren und/oder Proben durchgeführt. V. Hybridisierung
Ein gemäß I. hergestelltes Sondengemisch aus Bio- tin-markierten λ-leichte Ketten-Oligonucleotiden der Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 6, das heißt ein sechs verschiedene Oligonucleotide enthaltendes Oligonucleotidgemisch, wurde in einer Menge von 15 μl pro Sektion (0,1 ng/μl Gesamtsondenkonzentrati- on) in Standardhybridisierungspuffer (vergleiche Figur 6) oder erfindungsgemäßem Hybridisierungspuf- fer (auch als LSD-Puffer bezeichnet) (vergleiche Figur 1, 3 und 7) und auf die Gewebebeschnitte aufgebracht. Anschließend wurde ein Deckgläschen aufgelegt und mit Klebematerial abgedichtet. Die Hybridisierung wurde anschließend eine Stunde bei 37°C (Standardhybridisierungspuffer ) oder 55°C (erfindungsgemäßer LSD-Puffer) durchgeführt. Anschließend wurde mit TBST zweimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur (bei Standardhybridisierungspuf- fer) oder einmal fünf Minuten bei 55°C und zweimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur (bei erfindungsgemäßem LSD-Puffer) gewaschen.
VI . Nachweis
Auf jeden Gewebeschnitt wurden 200 μl Anti- Bio (Biotin) -AP (alkalische Phosphatase konjugiert zu einem Anti-Biotin-Antikörper, DAKO) aufgebracht (verdünnt in 1:30 Blockierungspuffer). Anschließend wurde bei 34 °C 30 Minuten inkubiert.
Im Anschluss an die Inkubation wurde zweimal jeweils zwei Minuten mit TBST und einmal zwei Minuten mit aqua dest. gewaschen. Anschließend wurde auf jeden Gewebeschnitt 200 μl AP-Puffer gegeben, der NBT-BCIP-Farbsubstrate (2μl NBT + 10 μl BCIP in 1000 μl AP-Puffer) enthielt. Anschließend wurde bei 34 °C 30 Minuten inkubiert und sodann dreimal für jeweils zwei Minuten mit aqua dest. gewaschen. Die so gefärbten Schnitte wurden in Glycerol eingebettet, mit einem Deckgläschen versehen und mit Nagellack versiegelt.
VII. Ergebnisse
Die Figuren 1, 3 und 7 zeigen gemäß des vorbeschriebenen Verfahrens durchgeführte ISHs, wobei ein erfindungsgemäßes Oligonucleotidgemisch der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6, jeweils in äquimolaren Verhältnissen zueinander, in erfin- dungsgemäßem LSD-Hybridisierungspuffer eingesetzt wurde, wobei die eingesetzten Oligonucleotide 3'- endmarkiert gemäß der vorliegenden Erfindung waren. Es ist erkennbar, dass vorteilhafterweise keine Hintergrundfärbung und eine sehr hohe Signalstärke erreicht wird.
Im Vergleich dazu wurde wie vorstehend beschrieben vorgegangen, wobei anstelle des erfindungsgemäßen LSD-Hybridisierungspuffer ein Standard-Hybridisie- rungspuffer mit ca. 50 % Formamid eingesetzt wurde. Die dazugehörige Figur 6 zeigt eine vergleichsweise schwache Signalstärke.
Ebenfalls im direkten Vergleich zu den in den Figuren 1, 3 und 7 dokumentierten Ergebnissen ist das in Figur 2 dokumentierte Ergebnis zu sehen. Gemäß der Verfahrensweise, die zum Ergebnis nach Figur 2 führte, wurde wie im Vorstehenden beschrieben vorgegangen, wobei jedoch anstelle der erfindungsgemäßen Markierung im 1:1 molaren Verhältnis von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP eine Standardmar- kierung durchgeführt wurde. Diese wurde wie im Stand der Technik beschrieben (DIG Oligonucleotide- Tailing Kit, Bestell-Nr. 1417231, Boehringer Mannheim, durchgeführt), wobei ein 1:10 molares Verhältnis von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt wurde. Es zeigt sich eine vergleichsweise starke Hintergrundfärbung und überdies, dass die Signalstärke nicht so stark ist wie bei der Verwendung einer erfindungsgemäßen Markierungsreaktion (vergleiche zum Beispiel Figur 3).
Gemäß der in den Figuren 4 und 5 dokumentierten Ergebnisse wurde mittels bekannter λ-leichte Ketten- Oligonucleotid-Gemische (Figur 4: Firma Biogenex, USA, San Ramon, Kat.-Nr. HK856-2K, Figur 5: Firma Kreatech, NL, Amsterdam, Kat.-Nr. PLD 182) jeweils eine ISH durchgeführt. Gemäß der Resultate von Figur 4 wurde eine FITC-markierte Sonde und gemäß der Experimente der Figur 5 eine DIG-markierte Sonde eingesetzt. Figur 4 zeigt eine deutlich stärkere Hintergrundfärbung und verringerte Signalstärke als bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise (vergleiche zum Beispiel Figur 3) . Figur 5 zeigt eine sehr schwache Signalstärke im Vergleich zu erfindungsgemäßen Vorgehensweise (vergleiche zum Beispiel Figur 3) . Die eingesetzten Oligonucleotide sind gemäß Herstellerangaben markiert gewesen. Die eingesetzten Hybridisierungspuffer sind üblicherweise eingesetzte Hybridisierungspuffer . Die Figuren 8 und 9 stellen die Intensität des Hybridisierungssignals sowie der im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung in Abhängigkeit von der Verdünnung einer κ9-Sonde (SEQ ID Nr. 10) dar.
Die Figur 8 zeigt, dass mittels einer Standardmarkierung unter Verwendung eines 1:10 molaren Verhältnisses von Bio-, DIG- oder FITC-markiertem dNTP (hier: dATP beziehungsweise dUTP) zu dATP eine geringere Sensitivität, das heißt Signalstärke, und eine stärkere Hintergrundfärbung erhalten wird. Dies steht im Gegensatz zu der erfindungsgemäßen Verfahrensweise, die gemäß der in Figur 9 dargestellten Grafik bei Verwendung eines 1:1 molaren Verhältnisses von Bio-, DIG- oder FITC-markierten dNTP (hier: dATP beziehungsweise dUTP) zu dATP eine gesteigerte Sensitivität, das heißt stärkere Hybri- disierungssignalintensität, und eine geringere beziehungsweise gar keine Hintergrundfärbung mit sich bringt .

Claims

Ansprüche
1. Verfahren für die Durchführung einer In-situ- Hybridisierung mindestens eines markierten Oligo- nucleotides mit nachzuweisenden, die leichten Ketten eines Immunglobulins codierenden Nucleotidse- quenzen in Zielobjekten, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid in situ unter Zusatz eines Formamid-freien Hybridisierungspuffers mit den nachzuweisenden Nucleotidsequenzen in Kontakt gebracht wird und hybridisierende Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hybridisierungspuffer besteht aus Wasser enthaltend 10 Gew.-% Dextransulfat, 0,2 Gew.-% Lauroylsarkosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,08 M Na3-Citrat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die nachzuweisenden Nucleotidsequenzen λ- oder K- leichte Ketten der Immunglobuline codieren.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine markierte Oligo- nucleotid eins oder mehr als eins der Oligonucleotide mit den Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 6 ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das mindestens eine markierte Oligonucleotid eins oder mehr als eins der Oligonucleotide mit den Sequenzen der SEQ ID Nr. 7 bis 10 ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine markierte Oligo- nucleotid 3 ' -endmarkiert ist und wobei für die 3'- Endmarkierung ein 1:1 molares Verhältnis von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybridisierung über einen Zeitraum von 0,5 bis 2 Stunden stattfindet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybridisierung über einen Zeitraum von 1 Stunde stattfindet.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei die Hybridisierung bei 45°C bis 60°C stattfindet .
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybridisierung bei 55°C stattfindet.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei nach der Hybridisierung mindestens ein
Waschschritt durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem gegebenenfalls erfolgenden Waschschritt oder direkt nach der Hybridisierung ein Nachweisschritt bei 30 bis 37°C stattfindet.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zielobjekte vor der Hybridisierung fixiert und eingebettet werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei die Zielobjekte vor der Hybridisierung proteolytisch behandelt werden.
15. Verfahren zum 3 ' -Endmarkieren von Oligonucleotiden, insbesondere Antisensenucleotiden, wobei mindestens ein zu markierendes Oligonucleotid in einem Reaktionspuffer und Wasser nach Zugabe eines molaren 1:1 Verhältnisses von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP mit einer terminalen Transferase inkubiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das markierte oder unmarkierte dNTP dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei ein 1:1 molares Verhältnis von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei ein 1:1 molares Verhältnis von markiertem dATP zu unmarkiertem dATP eingesetzt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Markierung eine Biotin-, FITC-, oder DIG- Markierung ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Inkubation bei 37 °C für 10 bis 60 Minuten, insbesondere 30 Minuten durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei dem Reaktionspuffer Co2+ zugesetzt wird.
22. Formamid-freie Pufferlösung für eine In-situ- Hybridisierung bestehend aus in Wasser gelösten 10% (Gew.-%) Dextransulfat, 0,2% (Gew.-%) Lauroylsarko- sin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,08 M Na3- Citrat .
23. Pufferlösung nach Anspruch 22, wobei der NaCl- Gehalt 0,3 bis 0,6 M beträgt.
24. Pufferlösung nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Na3-Citrat-Gehalt 0,03 bis 0,06 M beträgt.
25. Oligonucleotidsonde oder -sondengemiseh zum in situ Nachweis von Immunglobulin λ- oder K-leichte Ketten codierenden Nucleotidsequenzen, umfassend ein oder mehrere Oligonucleotide, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 6 (für λ- leichte Ketten) oder SEQ ID Nr. 7 bis 10 (für K- leichte Ketten) .
26. Oligonucleotidsondengemisch nach Anspruch 25, wobei die Oligonucleotide als Gemisch aus Oligonucleotiden der Sequenz SEQ ID Nr. 2, 3 und 6 vorliegt .
27. Oligonucleotidsondengemisch nach Anspruch 25, wobei die Oligonucleotide als' Gemisch aus Oligo- nucleotiden der Sequenz SEQ ID Nr. 7, 8, 9 und 10 vorliegt .
28. Oligonucleotidsonde oder -sondengemiseh nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die Oligonucleotide einzel- oder doppelsträngig sind.
29. Kit für die Durchführung eines In-situ- Hybridisierungsverfahrens, umfassend einen Hybridisierungspuffer gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24 sowie mindestens ein markiertes Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 25 bis 28.
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