CN102203286A - 免疫球蛋白编码核酸的测定 - Google Patents
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Abstract
本发明报导了测定编码免疫球蛋白的mRNA量的方法,包含:a)提供样品,b)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应扩增轻链,和/或c)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应扩增重链,和d)用2.0的效率定量。具有SEQ ID NO 23和24的引物分别结合在CL 247-266和CL166-185的位置,具有SEQ ID NO:33的探针结合在人IgG 链的189-212。SEQ IDNO:19的引物结合在CH 2区220-237位,SEQ ID NO:21的引物结合在CH 3区114-133位。最后,SEQ ID NO:40的引物结合在从CH2的315位到CH3的7位。
Description
本发明涉及免疫球蛋白编码核酸即RNA和DNA的测定方法,和用于免疫球蛋白编码核酸的PCR测定的引物。
发明背景
目前的生物技术方法应用遗传工程改造的微生物以提供高产量的治疗多肽。在制备重组多肽特别是治疗免疫球蛋白中广泛使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。此细胞系能够提供翻译后修饰,最重要的,CHO细胞系能够将重组产生的多肽分泌至培养基,使下游过程操作更加容易(Jiang,Z.,等人,Biotechnol.Prog.22(2006)313-138;Yee,J.C.,等人,Biotechnol.Bioeng.102(2009)246-263)。为了提高重组细胞系的生产率,必须优化例如亲本细胞系、培养基或培养条件等参数(Yee,J.C.,等人,Biotechnol.Bioeng.102(2009)246-263)。
基于对重组细胞系基因组中整合的异源核酸的位置、结构和拷贝数的分析,应当建立用于决定重组细胞系特性的指示物(Wurm,F.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.782(1996)70-78)。编码异源多肽的核酸以脱氧核糖核酸(DNA)整合至重组细胞系的基因组,在转录过程中其被转录为核糖核酸(RNA)。在翻译过程中RNA又作为模板用于蛋白质的生物合成。由于RNA对基因表达的重要性,对此核酸的分析非常重要(Seth,G.,等人,Biotechnol Bioeng.97(2007)933-951)。
在WO 2008/094871中报导了选择高产细胞系的方法。Chusainow,J.,等人(Biotechnol.Bioeng.102(2009)1182-1196)报导了制备单克隆抗体的CHO细胞系的研究。Barnes,L.M.,等人(Biotechnol.Bioeng.85(2004)115-121)报导了在重组NS0骨髓瘤细胞中蛋白质稳定表达的预测指示物的分子定义。
发明概述
本发明的一个方面为使用聚合酶链式反应和绝对定量测定编码IgG1或IgG4亚类的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链的mRNA的量的方法,通过
a)对免疫球蛋白轻链进行聚合酶链式反应,使用SEQ ID NO:23和24的引物和具有FAM染料的TaqMan水解探针类型(format)的SEQ ID NO:33的探针,和/或
b)对免疫球蛋白重链进行聚合酶链式反应,使用SEQ ID NO:19和21的引物和具有Cy5染料的TaqMan水解探针类型的SEQ ID NO:40的探针,和
c)进行效率为2.0的绝对定量。
本发明的另一个方面为包含SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:33的核酸的第一个试剂盒和包含SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:40的核酸的第二个试剂盒。另一个方面为SEQ ID NO:23,24和33或SEQ ID NO:19,21和40的核酸在聚合酶链式反应中的用途。
本发明的另一个方面为测定异源多肽表达细胞生产率的方法,其包含按以下顺序的以下步骤:
-在已知生产率的细胞中测定编码所述异源多肽的mRNA的量,
-在未知生产率的细胞中测定编码所述异源多肽的mRNA的量,
-计算在所述未知生产率的细胞中和所述已知生产率的细胞中测定的编码所述异源多肽的mRNA量的比率,
-将所述已知生产率细胞的生产率乘以所述计算的比率,由此测定异源多肽表达细胞的生产率。
在一个实施方案中所述异源多肽为免疫球蛋白,或免疫球蛋白片段,或免疫球蛋白缀合物。在另一个实施方案中对所述mRNA量的所述测定通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一个实施方案中mRNA量的测定通过使用SEQ ID NO:23和24的引物和具有FAM染料的TaqMan水解探针类型的SEQID NO:33的探针的聚合酶链式反应,和/或使用SEQ ID NO:19和21的引物和具有Cy5染料的TaqMan水解探针类型的SEQ ID NO:40的探针的聚合酶链式反应。在另一个实施方案中编码所述异源免疫球蛋白的所述mRNA量为编码所述异源免疫球蛋白轻链的mRNA量和编码所述异源免疫球蛋白重链的mRNA量的平均值。在另一个实施方案中所述生产率为以pg/细胞/天为单位的比生产率。在另一个实施方案中所述聚合酶链式反应为多重聚合酶链式反应。
发明详述
在本发明中发现编码免疫球蛋白的核酸(DNA)拷贝数和其产生的转录物(RNA)的量可用于测定表达异源免疫球蛋白的重组CHO细胞系的生产率。还发现编码异源多肽的mRNA的量可用于测量所述细胞的比生产率。
本发明包含测定免疫球蛋白表达细胞的生产率的方法,包含
a)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应,和/或使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应,由此在已知生产率的细胞中测定编码免疫球蛋白的mRNA的量,
b)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应,和/或使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应,由此在未知生产率的细胞中测定编码免疫球蛋白的mRNA的量,
c)计算在未知生产率的细胞中和已知生产率的细胞中测定的编码免疫球蛋白的mRNA量的比率,
d)将已知生产率细胞的生产率乘以计算的比率,由此测定表达免疫球蛋白的细胞的生产率。
对实施本发明有用的本领域技术人员已知的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.,编,Current Protocols in Molecular Biology,I至III卷(1997),Wiley和Sons;Sambrook,等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
如本申请中使用的术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸组,其可直接或以前体形式由核酸编码。单独的氨基酸由3个核苷酸组成的核酸编码,称为密码子或碱基三联体。每个氨基酸由至少1个密码子编码。将不同密码子编码相同的氨基酸称为“遗传密码的简并”。如本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸,包含丙氨酸(3字母编码:ala,单字母编码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(s er,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸(val,V)。
在此申请中可互换使用的术语“核酸”或“核酸序列”指由单个核苷酸(又称碱基)A、C、G和T(或在RNA中为U)组成的聚合分子,例如DNA、RNA或其修饰物。此多核苷酸分子可为天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子,或一种或多种天然存在的多核苷酸分子和一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。此定义还包含下述天然存在的多核苷酸分子,其中一个或多个核苷酸被改变(例如通过突变)、缺失或添加。核酸可为分离的或整合至另一种核酸例如表达盒、质粒或细胞染色体中。
本领域技术人员熟知将氨基酸序列例如多肽的氨基酸序列转化至对应的编码此氨基酸序列的核酸序列的程序和方法。因此,核酸的特征在于其由单个核苷酸组成的核酸序列,也在于由其编码的多肽的氨基酸序列。
“多肽”是通过肽键连接的由氨基酸组成的聚合物,天然产生的或者是合成的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”,而由2种或多种多肽组成的分子,或包含超过100个氨基酸残基的多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽也可包含非氨基酸成分,例如糖基、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可通过表达多肽的细胞添加,并可随细胞种类而变。此处根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸定义多肽。一般不对添加物例如糖基进行特别说明,但是可能存在。
术语“免疫球蛋白”包含各种形式的免疫球蛋白结构,包括完整的免疫球蛋白和免疫球蛋白缀合物。在本发明中应用的免疫球蛋白在一个实施方案中为人抗体,或人源化抗体,或嵌合抗体,或T细胞抗原排除(depleted)抗体(见例如WO 98/33523,WO 98/52976和WO 00/34317)。免疫球蛋白的遗传工程改造描述于例如Morrison,S.L.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238和US 5,204,244;Riechmann,L.,等人,Nature 332(1988)323-327;Neuberger,M.S.,等人,Nature 314(1985)268-270;Lonberg,N.,Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125。免疫球蛋白可以各种类型存在,包括例如Fv,Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体(例如Huston,J.S.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883;Bird,R.E.,等人,Science 242(1988)423-426;in general,Hood等人,Immunology,Benjamin N.Y.,第二版(1984);和Hunkapiller,T.和Hood,L.,Nature 323(1986)15-16)。
术语“完整的免疫球蛋白”指包含2条名为轻链和2条名为重链的免疫球蛋白。完整的免疫球蛋白的各重链和轻链包含可变结构域(可变区)(一般为多肽链的N端部分),其包含能够与抗原相互作用的结合区。完整的免疫球蛋白的各重链和轻链包含恒定区(一般为C端部分)。重链的恒定区介导抗体结合至i)具有Fcγ受体(FcγR)的细胞,例如吞噬细胞,或ii)具有新生Fc受体(FcRn)又称Brambell受体的细胞。其也介导抗体与一些因子包括经典补体系统例如成分(C1q)因子的结合。免疫球蛋白轻链和重链的可变结构域依次包含不同的区段,即4个框架区(FR)和3个高变区(CDR)。
术语“免疫球蛋白缀合物”指包含经肽键与其他多肽缀合的免疫球蛋白重链或轻链的至少1个结构域的多肽。其他多肽为非免疫球蛋白肽,例如激素,或生长受体,或抗融合肽,或补体因子,等等。示例免疫球蛋白缀合物在WO 2007/045463中报导。
术语“异源免疫球蛋白”指哺乳动物细胞或宿主细胞不天然产生的免疫球蛋白。根据本发明的方法产生的免疫球蛋白通过重组方法产生。这些方法在本领域内是众所周知的,包含在真核细胞中表达蛋白质,之后回收和分离异源免疫球蛋白,通常纯化至可药用的纯度。为了产生即表达免疫球蛋白,通过标准方法将编码轻链的核酸和编码重链的核酸分别插入表达盒。使用传统程序可容易的分离和测序编码免疫球蛋白轻链和重链的核酸。杂交瘤细胞可作为所述核酸的来源。可将表达盒插入表达质粒,之后将表达质粒转染至宿主细胞,否则宿主细胞不会产生免疫球蛋白。在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达,从裂解后的细胞或培养上清中回收免疫球蛋白。
“分离的多肽”为基本不含污染的细胞成分的多肽,所述细胞成分例如糖、脂或其他天然与多肽关联的蛋白质杂质。一般的,分离多肽制品包含高纯度形式的多肽,即至少约80%纯,至少约90%纯,至少约95%纯,高于95%纯,或高于99%纯。显示特定蛋白质制剂含有分离多肽的方法是在蛋白质制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色之后出现单一条带。然而,术语“分离的”不排除相同的多肽以另一种物理形式存在,例如二聚体或另外的糖基化或衍生形式。
“异源DNA”或“异源多肽”指在给定的宿主细胞中不天然存在的DNA分子,或多肽,或DNA分子群或多肽群。对特定宿主细胞为异源的DNA分子可包括宿主细胞物种来源的DNA(即内源DNA),只要宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)结合。例如,认为下述DNA分子为异源DNA分子,其包含与含有启动子的宿主DNA区段有效连接的编码多肽的非宿主DNA区段。相反的,异源DNA分子可包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。由非宿主DNA分子编码的肽或多肽为“异源”肽或多肽。
术语“细胞”或“宿主细胞”指可将核酸,例如编码异源多肽的核酸,转染至其中的细胞。术语“细胞”包括用于增殖质粒的原核细胞和用于表达核酸和产生编码的多肽的真核细胞二者。在一个实施方案中,真核细胞为哺乳动物细胞。在另一个实施方案中哺乳动物细胞为CHO细胞,优选CHOK1细胞(ATCC CCL-61或DSM ACC 110),或CHO DG44细胞(又称CHO-DHFR[-],DSM ACC 126),或CHO XL99细胞,CHO-T细胞(见例如Morgan,D.,等人,Biochemistry 26(1987)2959-2963),或CHO-S细胞,或Super-CHO细胞(Pak,S.C.O.,等人,Cytotechnology.22(1996)139-146)。如果这些细胞不适应在无血清培养基中或在悬浮中生长,在用于本发明的方法前需要进行适应。如此处使用的,措辞“细胞”包括所述细胞和其后代。因此,词语“转化体”或“转化细胞”包括原代所述细胞和以其为来源的培养物,不考虑转移或继代培养的次数。还应理解,由于故意或非故意突变,所有后代可能在DNA含量上不完全相同。也包括与筛选的原始转化细胞具有相同功能或生物学活性的变体后代。
如此处使用的术语“表达”指在细胞中发生的转录和翻译过程。在细胞中目的核酸序列的转录水平可基于细胞中存在的对应mRNA的量进行测定。例如,从目的序列转录的mRNA可通过RT-PCR或通过Northern杂交(见上面的Sambrook,等人,1989)定量。目的核酸编码的多肽可通过多种方法定量,例如通过ELISA,通过测定多肽的生物学活性,或通过应用不依赖这些活性的试验,例如蛋白质印迹或放射性免疫测定,使用识别并结合至多肽的免疫球蛋白(见上面的Sambrook,等人,1989)。
基因的表达通过瞬时或永久表达进行。目的多肽一般为分泌的多肽,因此包含N-端延伸(又称信号序列),其对多肽通过细胞壁进入细胞外培养基的运输/分泌是必需的。一般来说,信号序列可来自任意编码分泌多肽的基因。如果使用异源信号序列,优选的其被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)。例如用于在酵母中的分泌,可使用来自分泌基因的同源酵母信号序列替换待表达的异源基因的天然信号序列,所述酵母信号序列例如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属和汉森氏酵母属的α-因子前导序列,在US 5,010,182中描述了第二个),酸性磷酸酶信号序列或白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶信号序列(见EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞表达中,目的蛋白质的天然信号序列是符合要求的,但是其他哺乳动物信号序列可为合适的,例如相同或相关物种的分泌多肽,例如人或鼠来源的免疫球蛋白的信号序列,以及病毒分泌信号序列,例如单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列。编码前区段的DNA片段依读框的,即有效连接至编码目的多肽的DNA片段。
根据本发明方法的例如CHO细胞的转染通过转染和选择的相继步骤进行。根据本发明方法的合适的CHO细胞为例如CHO K1细胞,或CHO DG44细胞,或CHO XL99细胞,或CHO DXB11细胞,或CHO DP12细胞,或super-CHO细胞。在本发明的范围内,转染的细胞可使用本领域已知的基本上任意类型的转染方法得到。例如,通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞。可选的,可使用脂质体转染试剂例如FuGENE 6(Roche DiagnosticsGmbH,Germany),X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH,Germany),LipofectAmine(Invitrogen Corp.,USA),和核转染(AMAXA Corp)。可选的,使用基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴随病毒的合适的病毒载体系统将核酸引入细胞(Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314)。
通常DNA或RNA水平的基因表达谱通过多步骤程序在常规基础上监测。首先,从培养容器中移除各个细胞样品。在粘附细胞的情况下,可通过胰酶消化(用胰酶-EDTA溶液处理)帮助收集以将粘附细胞从固体支持物上分离。其次,将收集的细胞沉淀并进行细胞裂解。第三步通常需要至少部分纯化样品中的总RNA、mRNA或DNA(例如见EP 0389063)。之后,如果需要,使用RNA依赖性DNA聚合酶例如AMV或MoMULV逆转录酶(Roche Applied Science,Germany)进行第一链cDNA合成的步骤。
之后,通过定量PCR(Sanger,G.and Goldstein,C.,Biochemica 3(2001)15-17)或通过扩增和之后在DNA微阵列上的杂交(Kawasaki,E.S.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1020(2004)92-100)定量DNA或生成的cDNA的量。在聚合酶链式反应(PCR)的情况下,可进行一步RT-PCR,其特征在于第一链cDNA合成和之后的扩增由相同的聚合酶例如T.th聚合酶(Roche Applied Science Cat.No.11 480 014,Germany)催化。
在一个实施方案中基因表达分析基于实时PCR。所述实时监测的特征在于实时监测和定量PCR反应中核酸的扩增进展。不同的检测类型是本领域已知的。下述检测类型已被证明对PCR有用,因此为基因表达分析提供了简单和直接的可能性。
a)TaqMan水解探针类型:
单链杂交探针用2种成分标记。根据荧光共振能量转移原理,当合适波长的光激发第一种成分时,将吸收的能量转移至第二种成分,即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤,杂交探针与靶DNA结合并在之后的延伸期被Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性降解。结果激发的荧光成分和猝灭剂在空间上彼此分离,因此可以测量第一种成分的荧光发射。在US5,210,015,US 5,538,848和US 5,487,972中详细报导了TaqMan探针试验。在US 5,804,375中报导了TaqMan杂交探针和试剂混合物。
b)分子信标:
这些杂交探针用荧光成分和猝灭剂标记,标记物优选的位于探针的两端。因为探针的二级结构,在溶液中两种成分在空间上接近。在与靶核酸杂交后两种成分彼此分离,从而在用合适波长的光激发后,可以测量第一种成分的荧光发射(US 5,118,801)。
c)FRET杂交探针:
FRET杂交探针检测类型对所有种类的同源杂交试验特别有效(Matthews,J.A.和Kricka,L.J.,Anal.Biochem.169(1988)1-25)。其特征在于同时使用2种单链杂交探针,所述探针与扩增靶核酸同一条链的相邻位点互补。两种探针用不同的荧光成分标记。当两种杂交探针与待检测靶分子的相邻位置结合时,在合适波长的光激发下,根据荧光共振能量转移(FRET)原理第一种成分将吸收的能量转移至第二种成分从而可测量第二种成分的荧光发射。除了监测FRET接受体成分的荧光增加以外,也可以监测FRET供体成分的荧光降低作为杂交事件的定量测量。
特别的,FRET杂交探针类型可用于实时PCR以检测扩增的靶DNA。在实时PCR领域已知的所有检测类型中,已证明FRET-杂交探针类型是高度敏感、准确和可信的(见WO 97/46707;WO 97/46712;WO 97/46714)。除了2种FRET杂交探针以外,也可以使用荧光标记的引物和单个标记的寡核苷酸探针(Bernard,P.S.,等人,Anal.Biochem.255(1998)101-107)。其中可任意选择用FRET供体或FRET接受体化合物标记引物。
如果实时PCR在添加剂存在下进行,其中使用双链核酸结合基团检测扩增产物,也属于本发明的范围内。例如,根据本发明可通过荧光DNA结合染料检测各扩增产物,在与双链核酸相互作用后,所述染料在合适波长的光激发下发射对应的荧光信号。已证明染料Green I和Gold(Molecular Probes,USA)特别适用于此应用。可选的可使用嵌入染料。然而,在此类型中为了区分不同的扩增产物,必须进行各自的解链曲线分析(US 6,174,670)。
e)多重类型:
将在一个反应容器中同时测定不同的核酸称为多重实时PCR。一般来说为了测定各个核酸,需要荧光染料不干扰其他使用的染料或与其他使用的染料仅少量重叠。
在本发明中使用的PCR引物也是本发明的方面,所述引物使用软件eprimer3设计,根据以下参数:
-与待扩增序列的特异性结合,
-不形成或不大可能形成引物二聚体,
-长度在18和25个核苷酸之间,
-G/C含量约50%,
-解链温度约60℃,
-扩增子为500碱基对或更短,在一个实施方案中在100和260碱基对之间,
-优选的引物应与相邻的外显子结合,PCR产物应跨越至少一个内含子以区分基因组DNA和cDNA的扩增。
与设计的引物互补的核酸位于在IgG1和IgG4型免疫球蛋白中相同的免疫球蛋白重链和轻链的恒定区内。
在方法中使用的探针也是本发明的一个方面,所述探针使用软件eprimer3设计,根据以下参数:
-解链温度约70℃,
-在5′端没有G,
-与引物或其他探针不形成或不大可能形成二聚体,
-优选的计划用于RT-PCR的探针应与2个不同的相邻外显子结合以区分基因组DNA和cDNA的扩增。
在一个实施方案中与设计的引物互补的核酸位于在IgG1和IgG4型免疫球蛋白中相同的免疫球蛋白重链和轻链的恒定区内。探针按如下标记以用于多重RT-PCR反应:
-轻链:荧光染料FAM,在465nm激发,在510nm检测,
-参考基因:Yakima Yellow染料,在533nm激发,在580nm检测,
-重链:荧光染料IRD 700或Cy5,在618nm激发,在660nm检测。
设计了表1中所列的引物和探针,单独或组合作为本发明的一个方面。
表1:引物和探针。
引物和探针在免疫球蛋白恒定区的位置显示于图1至4。
下面基于3个产生特异性与淀粉状蛋白β-A4肽结合的免疫球蛋白(抗A β抗体)的细胞系举例说明本发明,其中用包含编码免疫球蛋白的核酸的质粒转染第一个细胞系1次,转染第二个细胞系2次,转染第三个细胞系3次。
在3个细胞系中独立进行5次抗体轻链mRNA量的测定,每次测定使用3种不同的mRNA量,250ng,50ng和10ng,和染料Green I。使用引物组合#131和#132得到的一次代表性试验结果列于表2,基于单次转染的细胞系8C8的mRNA量,将其设定为100%相对量。可以看到,转染2次的细胞系4F5比单次转染的细胞系具有约40%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA,转染3次的细胞系20F2具有约70%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA。
表2:使用引物组合#131和#132的示例结果。
上面进行的测定方法是特异性的,因为经琼脂糖凝胶电泳验证仅得到单个产物,结果显示于图5。
为了使用TaqMan水解探针测定3个细胞系中的抗体轻链mRNA量,首先必须确定在本发明的此方面有用的引物和探针组合。检测了表3中所列的组合。
表3:检测的TaqMan类型核酸。
使用如上所列的不同引物-探针组合得到的PCR产物显示(例如图6)引物#133和#132和探针#166组合以及引物#133和#38和探针#166组合得到具有高特异性产物和低副产物形成。因此,引物-探针组合#133,#132和#166以及引物-探针组合#133,#38,#166自身以及这些引物-探针组合的用途为本发明的具体方面。优选此组合因为其显示了更高的PCR效率,即图7中指示的扩增曲线的较陡增长。
在3个细胞系中独立进行4次抗体轻链mRNA量的测定,每次测定使用3种不同的mRNA量,250ng,50ng和10ng。使用引物组合#133/#132和探针#166得到的一次代表性试验结果列于表4,基于单次转染的细胞系的mRNA量,将其设定为100%相对量。可以看到,细胞系4F5比单次转染的细胞系具有约77%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA,细胞系20F2具有约114%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA。
表4:使用引物-探针组合#133/#132/#166的示例结果。
上面进行的测定方法是特异性的,因为经琼脂糖凝胶电泳验证仅得到单个产物。
在3个细胞系中独立进行3次抗体重链mRNA量的测定,每次测定使用3种不同的mRNA量,250ng,50ng和10ng。上面进行的测定方法是特异性的,因为经琼脂糖凝胶电泳验证仅得到单个产物,结果显示于图8.
使用引物组合#62/#65得到的一次代表性试验结果列于表5,基于单次转染的细胞系的mRNA量,将其设定为100%相对量。可以看到,细胞系4F5比单次转染的细胞系具有约60%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA,细胞系20F2具有约140%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA。
表5:使用引物组合#62/#65的示例性结果。
为了使用TaqMan水解探针测定3个细胞系中的抗体重链mRNA量,首先必须确定在本发明的此方面有用的引物和探针组合。检测了引物#62,#65,#66,#68,#67,#62,#63和TaqMan探针#167和#168的组合。探针在5′端含有染料IRD700。使用如上所列的不同引物-探针组合得到的PCR产物显示(例如图9)引物#66和#68和探针#168组合以及引物#67和#68和探针#168组合得到具有高特异性产物和低副产物形成的PCR产物。为了提高荧光强度,将探针#168的荧光染料变为Cy5。将此新探针用#173表示。因此,引物-探针组合#66,#68,和#168或#173以及引物-探针组合#67,#68,和#168或#173自身及这些引物-探针组合在根据本发明方法中的用途为本发明的特定方面。在一个实施方案中引物-探针组合为#66,#68,和#173。优选此组合因为其显示了更高的PCR效率,即扩增曲线的较陡增长。
在3个细胞系中独立进行4次抗体重链mRNA量的测定,每次测定使用3种不同的mRNA量,250ng,50ng和10ng。使用引物组合#66/#68和探针#173得到的一次代表性试验结果列于表6,基于单次转染的细胞系的mRNA量,将其设定为100%相对量。可以看到,细胞系4F5比单次转染的细胞系具有约88%更多的编码免疫球蛋白重链的mRNA,细胞系20F2具有约126%更多的编码免疫球蛋白轻链的mRNA。
表6:使用引物-探针组合#66/#68/#173的示例性结果。
上面进行的测定方法是特异性的,因为经琼脂糖凝胶电泳验证仅得到单个产物。
为了将得到的结果标准化以消除一天内和实验室间的变化,可使用持家基因与之关联。发现编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因可用于此目的。因此,本发明的一个方面为引物-探针组合#169/#170和#171及所述组合在TaqMan探针PCR类型中测定GAPDH mRNA中的用途。
在多重PCR反应中对编码免疫球蛋白重链的mRNA,编码免疫球蛋白轻链的mRNA和编码GAPDH的mRNA进行同时扩增和检测。在一次测定中使用引物-探针组合#132/#133/#166(轻链,FAM染料),#66/#68/#173(重链,Cy5染料),和#169/#170/#171(GAPDH,Yakima Yellow染料)。在多重PCR反应中用于GAPDH基因的组合无效。但是发现引物-探针组合#148/#149/#174在GAPDH mRNA的多重PCR测定中有用。因此,本发明的一个方面为引物-探针组合#148/#149和#174及其在多重PCR反应中的用途。
在应用引物-探针组合#132/#133/#166(用于轻链扩增和检测,FAM染料),#66/#68/#173(用于重链扩增和检测,Cy5染料)和#148/#149/#174(用于GAPDH扩增和检测,Yakima Yellow染料)进行多重PCR后,在2%琼脂糖凝胶上分离PCR产物。检测的条带与101bp(轻链),197bp(GAPDH),244bp(重链)的预期片段相符(见图10)。
实时PCR反应的效率基于连续稀释(200ng,100ng,50ng,25ng,12.5ng,6.25ng,3.125ng)测定,一式四份测定,结果显示于表7。
表7:效率。
因此,可使用为2的效率用于计算。
在多重PCR中发现细胞系4F5和20F2相对细胞系8C8(将其设定为100%)中的编码免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的以下mRNA量。
表8:示例性多重PCR结果。
发现细胞的比生产率(SPR)与编码产生的异源多肽的mRNA量具有很好的相关性。
在单一PCR反应(表9)和多重PCR反应(表10)中均有此发现。
表9:示例性单一PCR反应结果。
表10:示例性多重PCR反应结果。
发现基于通过PCR在具有未知SPR细胞和具有已知SPR细胞中测定的异源多肽mRNA量可计算一个因子,这可用于计算未知SPR。
表11:因子测定。
因此,本发明的一个发明为测定表达异源多肽细胞的生产率的方法,包含以下步骤:
-在已知生产率的细胞中测定编码异源多肽的mRNA的量,
-在未知生产率的细胞中测定编码异源多肽的mRNA的量,
-计算在未知生产率的细胞中和已知生产率的细胞中测定的编码异源多肽的mRNA量的比率,
-将所述已知生产率细胞的生产率乘以所述计算的比率,由此测定表达异源多肽细胞的生产率。
在一个实施方案中异源多肽为免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中异源免疫球蛋白为多亚基异源免疫球蛋白。在另一个实施方案中编码异源多肽的mRNA量为编码所述异源多肽所有亚基的mRNA量的总和除以亚基数。在一个实施方案中生产率为以pg/细胞/天为单位的比生产率。在一个实施方案中编码异源免疫球蛋白的mRNA量为编码异源免疫球蛋白轻链的mRNA量和编码异源免疫球蛋白重链的mRNA量的平均值。在一个实施方案中通过聚合酶链式反应(PCR)测定mRNA量。在一个实施方案中PCR为多重PCR。在另一个实施方案中PCR为逆转录PCR(RT-PCR)。在一个实施方案中计算的比率乘以0.925的因子。
例如,亲本细胞的比生产率为100pg/细胞/天。通过未知生产率细胞中mRNA的多重PCR,测得相对亲本细胞的mRNA量,编码免疫球蛋白轻链的mRNA量为169%,编码免疫球蛋白重链的mRNA量为161%。所述RNA量的平均值为亲本细胞mRNA量的165%或1.65倍。因此,将亲本细胞100pg/细胞/天的SPR乘以1.65,由此得到165pg/细胞/天的SPR。测得未知细胞的SPR为165pg/细胞/天。
如本申请中使用的术语“约”指在示值+/-10%内的偏差。因此,术语“约1.65”指从1.49至1.82的范围。
取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列,可将抗体分为以下种类:I gA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中一些还可进一步分为亚类,例如IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4,IgA1和IgA2。对应不同抗体种类的重链恒定区分别称为α,δ,ε,γ和μ。在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区称为κ(kappa)和λ(lambda)。
由于整合进基因组的编码异源免疫球蛋白的基因具有不同的拷贝数,从这些基因转录的mRNA量也不同。因此,本发明的另一个方面为测定mRNA或DNA量的方法,所述方法可相对定量mRNA或绝对定量DNA,包含
a)提供样品,
b)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应,和/或
c)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应,和
d)用2.0的效率定量。
进一步发现不同细胞系的比生产率与mRNA量具有很好的相关性。还发现编码免疫球蛋白重链的mRNA占编码免疫球蛋白的mRNA的30%,编码免疫球蛋白轻链的mRNA占编码免疫球蛋白的mRNA的70%。
本发明的另一个方面为选择生产免疫球蛋白的细胞的方法,包含
a)提供细胞,
b)分离所述细胞的RNA,
c)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应,
d)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应,
e)如果在步骤c)和d)中得到聚合酶链式反应产物,则将细胞选择为制备免疫球蛋白的细胞。
在一个实施方案中提供的细胞已转染了编码免疫球蛋白的核酸。在另一个实施方案中提供的细胞不内源产生免疫球蛋白。在一个实施方案中细胞为多种细胞。
本发明的另一个实施方案为制备免疫球蛋白的方法,包含
a)提供多种细胞,
b)分离各所述细胞的RNA,
c)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应,
d)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应,
e)基于在步骤c)和d)中形成的聚合酶链式反应产物的量选择细胞,
f)培养选择的细胞,
g)将免疫球蛋白从细胞或培养基中回收,由此制备免疫球蛋白。
在一个实施方案中选择在步骤d)中具有最高聚合酶链式反应产物量的细胞。
本发明的另一个方面为以高通量方式同时测定IgG1和IgG4重链和轻链的方法。
在本发明的一个实施方案中异源多肽为抗A β抗体。
在根据本发明的上述方法的一个实施方案中聚合酶链式反应为TaqMan水解探针类型。在另一个实施方案中所述轻链引物用染料FAM标记,重链引物用染料Cy5标记。在一个实施方案中SEQ ID NO:23和24的引物用于免疫球蛋白轻链,SEQ ID NO:19和20的引物用于免疫球蛋白重链。在一个实施方案中步骤c)和d)另外包含实时测量核酸的扩增以测定扩增的核酸量。
提供以下实施例,序列表和图以帮助理解本发明,本发明的实际范围陈列于随附的权利要求书。应当理解可在陈述的程序中进行修改而不背离本发明的精神。
附图说明
图1引物和探针在轻链恒定区(人IgGκ链;SEQ ID NO:44)的位置和方向。
图2引物和探针在重链恒定区1(人IgG重链CH1;SEQ ID NO:45)的位置和方向。
图3引物和探针在重链恒定区2(人IgG重链CH2;SEQ ID NO:46)的位置和方向。
图4引物和探针在重链恒定区3(人IgG重链CH3;SEQ ID NO:47)的位置和方向。
图6 8μl 45个循环PCR反应样品的琼脂糖凝胶分离;样品:MW:碱基对标记物;1:139/134-165;2:139/134-166;3:139/132-165;4:139/132-166;5:139/146-165;6:139/146-166;7:139/38-147;8:139/38-165;9:139/38-166;10:139/146-147;11:131/38-166;12:131/38-147;13:37/134-166;14:37/132-166;15:37/146-166;16:37/146-147;17:145/146-147;18:145/38-147;19:131/134-165;20:131/134-166;21:131/132-165;22:131/132-166;23:131/146-166;24:131/146-165;25:131/146-147;26:131/38-165;27:37/38-166;28:133/134-166;29:133/132-166;30:133/146-166;31:133/146-147;32:133/38-166。
图7分别使用引物-探针组合#133,#132和#166,或#133/#38和#160的PCR反应的扩增曲线。
图98μl 45个循环PCR反应样品的琼脂糖凝胶分离;样品:MW:碱基对标记物;1:空参考;2:62/65-167;3:66/68-168;4:67/68-168。
图10应用引物-探针组合#132/#133/#166(用于轻链扩增和检测,FAM染料),#66/#68/#173(用于重链扩增和检测,Cy5染料),和#148/#149/#174(用于GAPDH扩增和检测,Yakima Yellow染料)的多重PCR的PCR产物的琼脂糖凝胶。检测的条带对应101bp(轻链),197bp(GAPDH),和244bp(重链)的预期片段。
实施例
材料和方法
有关人免疫球蛋白轻链和重链核苷酸序列的一般信息见Kabat,E.A.,等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸根据EU编号系统编号(Edelman,G.M.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85;Kabat,E.A.,等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,(1991))。
重组DNA技术:
使用如Sambrook,J.,等人,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989描述的操纵DNA的标准方法。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成:
期望的基因区段通过化学合成的寡核苷酸制备。通过包括PCR扩增的寡核苷酸的退火和连接组装100-600bp长的基因区段,在其两侧为单一限制性内切酶切割位点,之后克隆至pCR2.1-TOPO-TA克隆载体(Invitrogen Corp.,USA)(通过A-突出端)或pPCR-Script Amp SK(+)克隆载体(Stratagene Corp.,USA)。亚克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序确认。
DNA寡核苷酸合成:
通过化学合成生成未标记的引物和用荧光染料和猝灭剂标记的探针。
蛋白质测定:
通过测定280nm处的光密度(OD)测定蛋白质浓度,使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数。
DNA和RNA测定:
通过测量260nm处的光密度测定DNA和RNA浓度,假定光密度为1对应50μg/ml双链DNA或40μg/ml RNA。
细胞数测定:
免疫球蛋白滴度测定:
免疫球蛋白滴度通过抗人Fc ELISA或蛋白质A层析测定,使用自体纯化抗体作为参考。
SDS-PAGE
LDS样品缓冲液,4倍浓度(4x):4g甘油,0.682g TRIS-碱,0.666gTRIS-HCl,0.8g LDS(十二烷基硫酸锂),0.006g EDTA(乙二胺四乙酸),0.75ml 1%以重量计的(w/w)Serva Blue G250水溶液,0.75ml 1%以重量计的(w/w)酚红溶液,加水至终体积为10ml。
包含分泌的免疫球蛋白的培养肉汤经离心去除细胞和细胞碎片。等分试样的澄清上清与1/4体积的(v/v)4xLDS样品缓冲液和1/10体积的(v/v)0.5M 1,4-二硫苏糖醇(DTT)混合。之后样品在70℃孵育10分钟,通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据制造商的说明书使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen Corp.,USA)。具体的,使用10%Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和MOPS电泳缓冲液。
蛋白质印迹
转移缓冲液:39mM甘氨酸,48mM TRIS-HCl,0.04%(w/w)SDS,和20%(v/v)甲醇。
在SDS-PAGE之后,根据Burnette的“半干印迹法”(Burnette,W.N.,Anal.Biochem.112(1981)195-203)将分离的免疫球蛋白链经电泳转移至硝酸纤维素滤膜(孔径:0.45μm)。
RNA的分离
DNA的分离
使用Qiagen的Blood & Culture DNA Midi试剂盒(Hilden,Germany)根据制造商的说明书从培养第4天的1x107细胞中分离基因组DNA。
实时PCR或实时RT-PCR
在实时PCR或实时RT-PCR中使用染料Green I和TaqMan探针。在制备后和扩增前将反应混合物在黑暗中置于冰上。使用2.0-系统和软件4.1或使用II 480-系统和软件1.5(均来自Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)进行测定和分析。
实施例1
表达抗Aβ抗体的表达载体
可示例说明根据本发明方法的示例抗体为抗淀粉样蛋白β-A4肽的抗体(抗Aβ抗体)。所述抗体和相应的核酸序列在例如WO 2003/070760或US 2005/0169925中报导,或见SEQ ID NO:1至12。
表达抗Aβ抗体的三种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系通过如WO 2009/046978报导的3次连续的完全转染和选择过程生成。
将基因组人κ-轻链恒定区基因区段(C-κ,CL)加入抗A β抗体的轻链可变区,同时将人γ1-重链恒定区基因区段(CH1-铰链区-CH2-CH3)加入抗Aβ抗体的重链可变区。之后将完整的κ-轻链和γ1-重链抗体基因在5’端与人巨细胞病毒(HCMV)启动子连接,在3’端与人免疫球蛋白多聚腺苷酸化信号序列连接。
为了表达和制备抗Aβ抗体,将轻链和重链表达盒置于单表达载体(重链在轻链的上游,以顺时针方向)。生成了3个相同的表达载体,仅在包含的选择标记基因上有区别,具体来说,在赋予对选择剂新霉素、潮霉素或嘌呤霉素的抗性基因上有区别。
预适应的亲本宿主细胞在合成的无动物成分ProCHO4完全培养基中在标准加湿条件下(95%,37℃和5%CO2)悬浮培养。取决于细胞密度定期将细胞分离至新鲜的培养基。在指数生长期通过离心收获细胞,在无菌的磷酸缓冲液中(PBS)中洗一次,并在无菌PBS中重悬。
转染前将表达抗Aβ抗体的质粒在β-内酰胺酶基因(大肠杆菌氨苄青霉素抗性标记基因)内线性化,使用限制性内切酶PvuI或AviII。切割的DNA用乙醇沉淀,真空干燥,溶解于无菌PBS。
一般的,用于转染,以每约107在PBS中的细胞20-50μg线性化质粒DNA(的量)在室温电穿孔CHO细胞。使用Gene Pulser XCell电穿孔仪器(Bio-Rad Laboratories)在2mm间隙小池中使用180V单脉冲的方波方案进行电穿孔。转染后,将细胞置于96孔培养板的ProCHO4完全培养基中。培养24小时后加入含有一种或几种选择试剂的溶液(ProCHO4完全选择培养基;G418:400μg/ml;潮霉素:600μg/ml;嘌呤霉素:8μg/ml)。每周1次替换ProCHO4完全选择培养基。培养上清中的抗Aβ抗体浓度使用特异性针对人IgG1的ELISA试验分析。
为了选择抗Aβ抗体的制备细胞系,在6孔培养板、T-烧瓶和/或Erlenmeyer摇瓶中增殖后在ProCHO4完全选择培养基中使用抗人IgG1ELISA和/或分析型蛋白质A HPLC检测生产率。
使用包含赋予对选择试剂新霉素抗性基因的质粒进行第一次转染和选择步骤。质粒用电穿孔转染至适应在ProCHO4完全培养基中生长的亲本细胞系。转染的细胞在添加最多700μg/ml G418的ProCHO4完全培养基中在96孔板上培养。通过抗人IgG1ELISA评估培养上清中的抗体浓度。检测了约1000个克隆,选择的克隆在24孔板、6孔板之后在摇瓶中进一步培养。通过抗人IgG1ELISA和/或分析型蛋白质A HPLC在静态和悬浮培养中检测约20个克隆的生长和生产率。通过有限稀释在添加700μg/ml G418的ProCHO4条件培养基中亚克隆最佳克隆(最佳克隆不是指生产率最高的克隆,而是指对后续步骤具最佳性能的克隆)。将选择的克隆称为8C8。
使用包含赋予对选择试剂潮霉素抗性基因的质粒进行第二次转染和选择步骤。质粒用电穿孔转染至在添加700μg/ml G418的ProCHO4完全培养基中培养的细胞系。转染细胞在添加200μg/ml G418和300μg/ml潮霉素的ProCHO4条件培养基(ProCHO4双选择培养基)中扩增约2至3周。基于蛋白质A Alexa Fluor缀合物染色后的荧光强度通过FACS分析鉴定和收集分泌抗体的细胞。收集的细胞在ProCHO4双选择培养基中在96孔板上培养。通过抗人IgG1 ELISA评估培养上清中的抗体浓度。检测了约500个克隆,选择的克隆在24孔板、6孔板之后在摇瓶中进一步培养。通过抗人IgG1ELISA和/或分析型蛋白质A HPLC在静态和悬浮培养中检测约14个克隆的生长和生产率。将选择的克隆称为4F5。
使用包含赋予对选择试剂嘌呤霉素抗性基因的质粒进行第三次转染和选择步骤。质粒用电穿孔转染至在ProCHO4双选择培养基中培养的细胞系。转染细胞在ProCHO4三选择培养基(添加200μg/ml G418、300μg/ml潮霉素和4μg/ml嘌呤霉素的ProCHO4条件培养基)中扩增约2至3周。基于蛋白质A Alexa Fluor缀合物染色后的荧光强度通过FACS分析鉴定和收集分泌抗体的单个细胞。收集的细胞在ProCHO4三选择培养基中在96孔板上培养。通过抗人IgG1 ELISA评估培养上清中的抗体浓度。检测了约500个克隆,选择的克隆在24孔板、6孔板之后在摇瓶中进一步培养。通过抗人IgG1 ELISA和/或分析型蛋白质A HPLC在静态和悬浮培养中检测约10个克隆的生长和生产率。将选择的克隆称为20F2。
克隆特征:
在下表中可见,当比较基础细胞系CHO-K1(野生型)和选择的克隆时,培养3天后的倍增时间和细胞密度是差不多的。
表12:克隆特征。
实施例2
在使用Green I的RT-PCR中应用2.0系统(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。制备和分析了分别来自8C8,4F5和20F2细胞系RNA的RNA浓度递减的连续稀释。在所有样品的RNA量中添加野生型RNA,使在所有样品中的总RNA量(即野生型RNA和样品RNA的和)相同。
样品制备后,将5μl样品与15μl RT-PCR-SG溶液混合。RT-PCR-SG溶液包含:
5μl PCR级水
1.3μl 50nM Mn(OAc)2
0.6μl正向引物(10pmol/μl)
0.6μl反向引物(10pmol/μl)。
对各样品分析了3个不同的RNA量(250ng,50ng和10ng)。PCR条件显示于表13。
表13:PCR条件。
在530nm处测定荧光。
表14:PCR条件。
实施例3
使用TaqMan水解探针的实时RT-PCR
在使用TaqMan水解探针的RT-PCR中应用II 480系统(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。使用480RNA Master水解探针试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)制备PCR样品。
样品制备后,将5μl样品与15μl RT-PCR-HS溶液混合。RT-PCR-HS溶液包含:
3.8μl PCR级水
1.3μl 3.25nM Mn(OAc)2
7.4μlPre-Mix
1.0μl正向引物(10pmol/μl)
1.0μl反向引物(10pmol/μl)
0.5μl TaqMan水解探针(10pmol/μl)。
PCR条件显示于表15。
表15:PCR条件。
实施例4
使用TaqMan水解探针的实时多重RT-PCR
用于多重RT-PCR,分别将2种或3种TaqMan水解探针组合。样品制备后,将5μl样品与15μl RT-PCR-M_HS溶液混合。
表16:RT-PCR-M_HS溶液的成分。
用针对应用的TaqMan探针生成的颜色补偿程序校正多重RT-PCR的结果。
实施例5
实时PCR
在实时PCR中使用应用Green I和TaqMan探针的II 480系统。每种样品一式四份在样品-DNA稀释液50ng,25ng,10ng,5ng和2.5ng中测定。用于实时PCR,将15μl对应的PCR溶液置于96孔微滴定板的孔中,接着加入5μl样-DNA。用480密封膜(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)将板密封并于1,500xg离心2分钟。之后将板放入480系统。使用480软件版本1.5进行数据的测定和分析。
通过绝对定量测定拷贝数,实施例1中的第一次转染质粒以线性形式作为外标。
9μl PCR级水
1μl正向引物(10pmol/μl)
1μl反向引物(10pmol/μl)。
应用的PCR条件显示于表17。
表17:PCR条件。
TaqMan水解探针
2.5μl PCR级水
1μl正向引物(10pmol/μl)
1μl反向引物(10pmol/μl)
0.5μl TaqMan水解探针(10pmol/μl)。
应用的PCR条件显示于表18。
表18:PCR条件。
绝对定量
在绝对定量中,以所述序列的拷贝数为单位测量核酸序列的量。通过对实施例1中使用的第一种质粒的5种已知浓度溶液的分析测定标准或参考函数。参考函数提供了Cp值和核酸拷贝数之间的线性关系,用于测定样品中的未知拷贝数。
标准样品的稀释液含有2.5x107至2.5x102拷贝的质粒。根据以下方程(1)至(4)(见例如Jiang,Z.,等人,Biotechnol.Prog.22(2006)313-318)计算标准函数中的线性化质粒的拷贝数(Nk):
(1)M质粒=bp质粒xMbp=14,033bp·660gmol-1=9,261,780gmol-1
(2)c质粒=92.92ngμl-1(线性化之后)
(3)NA=6.022x1023mol-1(阿伏伽德罗常数)
Claims (16)
1.测定mRNA量的方法,包含
a)提供样品,
b)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应,和/或
c)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应,和
d)用2.0的效率定量。
2.测定表达免疫球蛋白的细胞的生产率的方法,包含
a)提供未知生产率的细胞和已知生产率的细胞,
b)对已知生产率的所述细胞RNA使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应,和/或使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应,由此在已知生产率的细胞中测定编码所述免疫球蛋白的mRNA的量,
c)对未知生产率的所述细胞RNA使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针进行聚合酶链式反应,和/或使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针进行聚合酶链式反应,由此在未知生产率的细胞中测定编码所述免疫球蛋白的mRNA的量,
d)计算在未知生产率的所述细胞中和已知生产率的所述细胞中测定的编码所述免疫球蛋白的mRNA量的比率,
e)将已知生产率的所述细胞的生产率乘以所述计算出的比率,由此确定表达免疫球蛋白的细胞的生产率。
3.选择制备免疫球蛋白的细胞的方法,包含
a)提供细胞,
b)分离所述细胞的RNA,
c)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应,
d)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应,
e)如果在步骤c)和d)中得到聚合酶链式反应产物,则将细胞选择为制备免疫球蛋白的细胞。
4.选择制备免疫球蛋白的细胞的方法,包含
a)提供多种细胞,
b)分离各所述细胞的RNA,
c)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针对各分离的RNA分别进行聚合酶链式反应,
d)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针对各分离的RNA分别进行聚合酶链式反应,
e)基于在步骤c)和d)中形成的聚合酶链式反应产物的量,选择细胞作为制备免疫球蛋白的细胞。
5.制备免疫球蛋白的方法,包含
a)提供多种细胞,
b)分离各所述细胞的RNA,
c)使用SEQ ID NO:23和24的引物和SEQ ID NO:33的探针对各分离的RNA进行聚合酶链式反应,
d)使用SEQ ID NO:19和21的引物和SEQ ID NO:40的探针对各分离的RNA进行聚合酶链式反应,
e)基于在步骤c)和/或d)中形成的聚合酶链式反应产物的量选择细胞,
f)培养选择的细胞,
g)将免疫球蛋白从细胞或培养基中回收,由此制备免疫球蛋白。
6.根据权利要求4或5的方法,其特征在于选择在步骤d)中具有最高聚合酶链式反应产物量的细胞。
7.根据权利要求3至6中任一项的方法,其特征在于提供的单种细胞或多种细胞已转染了编码免疫球蛋白的核酸。
8.根据权利要求2的方法,其特征在于用因子0.925乘以所述比率。
9.根据前面权利要求中任一项的方法,其特征在于聚合酶链式反应为TaqMan水解探针类型。
10.根据前面权利要求中任一项的方法,其特征在于SEQ ID NO:23和24的引物用于免疫球蛋白轻链,SEQ ID NO:19和20的引物用于免疫球蛋白重链。
11.根据权利要求10的方法,其特征在于所述轻链引物用染料FAM标记,重链引物用染料Cy5标记。
12.根据前面权利要求中任一项的方法,其特征在于进行聚合酶链式反应的步骤另外包含实时测量扩增的核酸以测定扩增的核酸量。
13.根据前面权利要求中任一项的方法,其特征在于所述聚合酶链式反应为逆转录酶聚合酶链式反应。
14.试剂盒,其包含
a)SEQ ID NO:23的核酸,
b)SEQ ID NO:24的核酸,和
c)SEQ ID NO:33的核酸。
15.试剂盒,其包含
a)SEQ ID NO:19的核酸,
b)SEQ ID NO:21的核酸,和
c)SEQ ID NO:40的核酸。
16.SEQ ID NO:23,24和33的核酸或SEQ ID NO:19,21和40的核酸在聚合酶链式反应中的用途。
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