DE102020129009A1 - Nachweis von umwelteinflüssen mittels biolumineszenz - Google Patents

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Martin Gruhlke
Jana Reiter
Alan Slusarenko
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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für luxA kodiert, (ii) ein Gen, das für luxB kodiert, (iii) ein Gen, das für luxC kodiert, (iv) ein Gen, das für luxD kodiert, (v) ein Gen, das für luxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Vektoren und Wirtszellen umfassend die Nukleinsäure. Ferner beschrieben sind Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung sowie Verfahren und Verwendungen zum Nachweis eines Umwelteinflusses sowie ein entsprechendes Kit.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Vektoren und Wirtszellen umfassend die Nukleinsäure. Ferner beschrieben sind Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung sowie Verfahren und Verwendungen zum Nachweis eines Umwelteinflusses sowie ein entsprechendes Kit.
  • HINTERGRUND
  • Obwohl sich die Biolumineszenz mehrmals parallel entwickelt hat, ist die grundlegende Lichtreaktion bei allen Organismen gleich. Eine Luciferase katalysiert die Reaktion von Luciferin unter Sauerstoffverbrauch zu einem Luciferase-gebundenen Peroxy-Luciferin-Zwischenprodukt, welches seine überschüssige Energie durch Lichtemission freisetzt. Die Nutzung von Luciferasen wie der Renilla-Luciferase aus Renilla reniformis, der Firefly-Luciferase aus Photinus pyralis oder der bakteriellen Luciferasen, z.B. aus Vibrio, Photobacterium oder Photorhabdus luminescens in der Bioanalytik wurde bereits beschrieben (Bhaumik & Gambhir, 2002; Contag et al., 1995; Contag et al., 1998).
  • Die bakterielle Luciferase ist ein Heterodimer und wird durch die Gene luxA und luxB codiert (Foran & Brown, 1988). Die Gene luxC, IuxD, und luxE codieren für eine Transferase (LuxD) und für eine Synthethase/Reduktase (LuxCE), die für die Synthese des in der Lichtreaktion benötigten Aldehyd-Substrats notwendig sind. Diese Gene sind Teil des bakteriellen lux-Operons (Close et al., 2009).
  • Die unterschiedliche genetische Organisation bakterieller Gene im Vergleich zu eukaryotischen Genen erschwert jedoch den direkten Gentransfer von Bakterien auf Pilze oder anderen Eukaryoten. Im Stand der Technik sind mehrere Ansätze zur Expression des bakteriellen Systems in der Hefe beschrieben (Gupta et al., 2003; Xu et al., 2018). Für die Expression des bakteriellen Lux-Systems in Eukaryoten wurde bisher die prokaryotische Operon-Struktur mit Hilfe bestimmter Gen-verknüpfender Sequenzen nachgeahmt.. Nur so konnten alle Gene unter Verwendung nur eines Promotors und eines Terminators reguliert werden. In beiden Veröffentlichungen werden die Gene des lux-Operons, in einer Genkassette hintereinander angeordnet, wobei die codierenden Gensequenzen durch IRES (internal ribosomal entry sites) oder 2A-Sequenzen miteinander verbunden sind.
  • Das größte und breiteste Anwendungspotential von Biolumineszenz besteht momentan auf dem Gebiet der Biosensoren. Durch Einführung einer mit einer regulatorischen DNA-Sequenz fusionierten Luciferase, welche nur bei Anwesenheit eines bestimmten Stimulus die Expression der Luciferase induziert, kann ein induzierbares Reportersystem etabliert werden. Ein solches System kann automatisiert werden und für High-Throughput-Screenings verwendet werden.
  • Die mit IRES (abnehmende Expression der Gene nach jeder IRES-Sequenz) oder 2A-Sequenzen (Verbleib der 2A-Sequenz C-terminal der Schnittstelle und eines Prolins N-terminal der Schnittstelle) verbundenen Nachteile machen die aus dem Stand der Technik bekannten Luciferase-Systeme hierfür jedoch weniger effizient. Ziel der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines verbesserten Luciferase-Systems, das zur Verwendung als Biosensor geeignet ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder konnten unerwartet zeigen, dass die Kombination aller Gene des lux-Operons auf einer einzigen Nukleinsäure, wobei alle Gene jeweils einen eigenen Promoter und Terminator besitzen, vorteilhaft gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Luciferase-Systemen ist, wodurch das technische Problem gelöst wurde.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
  • Vorzugsweise ist der heterologe Promotor ein eukaryotischer Promotor. Vorzugsweise vermitteln die heterologen Promotoren die annähernd gleiche Expressionsstärke. Auf jedes Gen kann ein Terminator folgen.
  • LuxA und LuxB sind vorzugsweise von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi, vorzugsweise P. luminescens. In der Nukleinsäure der Erfindung ist das von luxA und luxB kodierte Polypeptid vorzugsweise in einem Fusionsprotein umfasst, wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind. Das Fusionsprotein bzw. das Gen, das für das für das Fusionsprotein kodiert, ist unter der Kontrolle eines eigenen heterologen Promoters und kann dadurch Gene (i) und (ii) inklusive deren zugehörigen heterologen Promotoren in der Nukleinsäure der Erfindung ersetzen. LuxA hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. LuxB hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  • LuxC, IuxD und luxE sind vorzugsweise von P. luminescens. LuxC hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. LuxD hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. LuxE hat vorzugsweise eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  • Die Nukleinsäure umfasst vorzugsweise zusätzlich (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert. Die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase ist vorzugsweise frp, vorzugsweise von V. harveyi, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  • Die Nukleinsäure enthält vorzugsweise keine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und/oder keine selbstschneidenden Peptide, z.B. 2A-Peptide, zwischen einem der Gene (i) bis (vi).
  • LuxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend luxA und luxB sind vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, wobei der Promotor vorzugsweise regulierbar durch einen Umwelteinfluss ist, (wobei der Umwelteinfluss) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalischen Einflüssen.
  • LuxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase können konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sein, wobei der Promotor von luxC vorzugsweise der TEF2-Promotor ist, der Promotor von IuxD vorzugsweise der CDC19-Promotor ist, der Promotor von luxE vorzugsweise der ENO2-Promotor ist und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise der PDC1-Promotor ist. In einer Ausführungsform sind luxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen Vektor, z.B. ein Plasmid, der die Nukleinsäure der Erfindung umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure der Erfindung oder den Vektor der Erfindung, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine eukaryotische Wirtszelle ist. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Hefe, vorzugsweise eine Hefe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe und Blastobotrys adeninivorans (auch bekannt als Arxula adeninivorans), vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist. Die Nukleinsäure der Erfindung kann in ein Chromosom der Wirtszelle integriert sein.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung umfassend das Einbringen der Nukleinsäure der Erfindung oder des Vektors der Erfindung in eine Wirtszelle.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle der Erfindung; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend luxA und luxB unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss reguliert wird und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist, wobei der Umwelteinfluss vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüssen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine Verwendung einer Wirtszelle der Erfindung als Biosensor oder in einem Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses der Erfindung oder zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung einer Wirtszelle der Erfindung als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der Biolumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Kit umfassend die Nukleinsäure der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder die Wirtszelle der Erfindung.
  • Figurenliste
    • zeigt die Messung der Lumineszenz (schwarz) und des Wachstums (grau) des S. cerevisiae-Stamms BY4742, der mit dem Plasmid pRS426-Lux eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
    • zeigt die Biolumineszenz der Wirtszelle der Erfindung. Die CSM-URA-Platten wurden bei Tageslicht (A) und bei völliger Dunkelheit (B) fotografiert. (C) ist eine schematische Darstellung der Erfindung. (D) zeigt einen Vergleich der Wirtszelle der Erfindung („Prototyp“, obere Linie) mit der Firefly-Luciferase (mittlere Linie) sowie dem Leervektor pRS426 (untere Linie).
    • zeigt eine Lumineszenz-Messung von S. cerevisiae (dunkle Linie) sowie die OD600 (helle Linie), welche mit den Plasmiden pRS426-Leu2-LuxAB und pRS426-Ura3-LuxCDE-frp transformiert wurde.
    • zeigt den Verlauf der Lumineszenz bei verschiedenen Konzentrationen von Leucin bzw. Kontrollen (Wasser, URA und Histidin).
    • zeigt ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure basierend auf dem pRS426-Plasmid (vgl. auch SEQ ID NO: 7).
    • zeigt ein beispielhaftes Plasmid, das für die Firefly-Luciferase kodiert (SEQ ID NO: 20).
    • zeigt zwei beispielhafte Plasmide, die LuxA/B (SEQ ID NO: 22) und LuxC/D/E (SEQ ID NO: 21) auf zwei verschiedenen Plasmiden kodieren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • 2018 berichtete die Arbeitsgruppe von Xu et al., dass sie einen biolumineszenten Reporter entwickelt habe, welcher Dioxine und dioxinähnliche Stoffe detektieren könne. Hierfür wurde das lux-Operon und frp unter Kontrolle eines Dioxin-sensitiven Promotors gestellt und die einzelnen Gene via verschiedener viraler 2A-Elemente miteinander verbunden, um die Expression mittels eines einzigen Promotors zu ermöglichen. Die 2A-Peptide werden aufgrund ihrer geringen Sequenzgröße (54 - 174 bp) (Xu et al., 2018) verwendet. Allerdings bringt die Nutzung dieser Sequenzen auch einige entscheidende Nachteile mit sich. So bleibt das 2A Peptid als C-terminale Erweiterung an dem Produkt, welches upstream liegt, und der N-Terminus des downstream Produkts wird um die Aminosäure Prolin ergänzt. Diese C-terminale Erweiterung kann dazu führen, dass die Konformation des Proteins beeinträchtigt wird und so die Aktivität eingeschränkt ist bzw. ganz verloren gehen kann (Minskaia et al., 2013). Zudem kann in bestimmten Fällen die C-terminale Sequenz des upstream liegenden Gens das Schneiden des 2A Peptids vollständig inhibieren. Dies kann zur Aggregation der Proteine im Organismus führen (Minskaia et al., 2013).
  • Ein weiteres aus dem Stand der Technik bekanntes Beispiel der Expression des lux-Operons in S. cerevisiae war ebenfalls auf die Verwendung viraler Elemente angewiesen. In dieser Arbeit wurden IRES Sequenzen benutzt, um luxE und frp und IuxD und luxC bicistronisch zu exprimieren. LuxAB und luxCDE + frp wurden zudem auf jeweils eigenen Vektoren kloniert (Gupta et al., 2003). IRES Sequenzen haben allerdings gegenüber 2A Peptiden noch größere Nachteile. Diese Sequenzen bieten den Ribosomen eine zusätzliche Bindestelle an und rekrutieren die Ribosomen unabhängig von den durch die Viren inhibierten Elongationsfaktoren (Pelletier & Sonenberg, 1988). Allerdings unterscheiden sich die benötigten Bindungsfaktoren von Zelle zu Zelle. Zudem wird das von der IRES downstream kodierte Protein meist nur zu 20 % - 50 % exprimiert im Gegensatz zum upstream kodierten Protein (Mizuguchi et al., 2000).
  • Die damit verbundenen Nachteile verhindern daher eine breite Einsetzbarkeit und Verlässlichkeit in der Verwendung von eukaryotischen Zellen als Biosensoren. Die von den Erfindern gefundene Lösung vermeidet die Verwendung viraler Faktoren. Die Nukleinsäure der Erfindung unterscheidet sich vom Stand der Technik dadurch, dass zum einen alle Gene des lux-Operons auf einer einzigen Nukleinsäure umfasst sind und dass jedes der Gene des lux-Operons unter der Kontrolle eines eigenen Promotors ist. Wirtszellen umfassend die Nukleinsäure der Erfindung können für eine Vielzahl verschiedener Zwecke eingesetzt werden, die wir im Folgenden erläutern werden.
  • Wie die Erfinder zeigen konnten, ist das von ihnen verwendete System einem auf zwei Nukleinsäuren aufgeteilten System sowie der Firefly-Luciferase überraschenderweise deutlich überlegen (siehe Beispiel 3, ). Abbilddung 2D zeigt den Vergleich der beiden Plasmide pRS426-Lux, d.h. die erfindungsgemäße Nukleinsäure, und pRS426-FBA1::Firefly aus dem Stand der Technik, die über dieselben regulatorischen Elementen verfügen, während des Wachstums in entsprechendem Mangelmedium. Bei pRS426-Lux wurde kein Luciferin extern hinzugegeben, während dem Firefly-Plasmid Luciferin im Überschuss hinzugegeben werden musste. Es ist zu sehen, dass das Lumineszenz-Signal der Firefly-Luciferase sehr schnell abnimmt, da das Luciferin schlicht verbraucht wird. Die bakterielle Luciferase hingegen erzeugt ein konstantes Signal, das zudem mehr als doppelt so stark ist ( ). Dies erlaubt auch einen Vergleich mit Xu et al., die die Lumineszenz-Intensität in „Fold of induction“ (FOI) angeben. FOI ist das Verhältnis des durchschnittlichen Lumineszenzsignals zum Zeitpunkt t zu einer Negativ-Kontrolle, welches auch als Hintergrundleuchten bezeichnet wird. Xu et al. erhalten einen maximalen Wert von 13,8 FOI. Berechnet man den FOI für den in dieser Offenbarung höchsten erhaltenen Wert ( ), würde man eine Induktion von 738 FOI erhalten (130.000 RLU Signal gegen 176 RLU Hintergrundleuchten). Das würde ein mehr als 50fach stärkeres Lichtsignal bedeuten als bei Xu et al, was die deutliche Überlegenheit des erfindungsgemäßen Systems unterstreicht. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen bakteriellen Lux-Systems ist zudem, dass das Substrat von der Wirtszelle selbst produziert werden kann. Dadurch, dass die Zugabe und der Zukauf von Luciferin entfällt, können Arbeitszeit und Kosten verringert werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich dementsprechend auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
  • Die Nukleinsäure enthält also alle essenziellen Gene, die eine Biolumineszenz ermöglichen. Dabei ist die Nukleinsäure fortlaufend, d.h. alle Gene befinden sich auf einer einzigen, fortlaufenden Nukleinsäure. In anderen Worten, sie sind samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht umfasst. Dies schließt jedoch nicht zwangsläufig aus, dass sich zwischen den einzelnen Genen nicht nicht-kodierende Bereiche oder Gene, die nicht aus dem Lux-Operon stammen, befinden können. Auch bedeutet dies nicht zwangsläufig, dass die Reihenfolge der Gene (i) bis (vi) wie hierin beschrieben in der Reihenfolge ihrer Nummerierung auf der Nukleinsäure vorhanden sein muss.
  • Wie bereits erläutert, enthält die Nukleinsäure Gene, die für das lux-Operon kodieren. Die Gene, die für die prokaryotische Biolumineszenz verantwortlich sind, wurden von Engebrecht et al. (1983) aus Vibrio harveyi isoliert und charakterisiert. Diese werden innerhalb dieser Offenbarung als „lux-Operon“ bezeichnet. Die im lux-Operon enthaltenen Gene werden als luxC, IuxD, luxE, luxA, und luxB bezeichnet.
  • Die bakterielle Luciferase ist ein Heterodimer, welches von LuxA und LuxB gebildet wird (Foran and Brown, 1988). LuxA und LuxB können hierbei von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi sein, wobei LuxA und LuxB vorzugsweise von P. luminescens sind. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxA eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxB eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  • In einer besonderen Ausführungsform liegen LuxA und LuxB als ein Fusionsprotein vor. Innerhalb des Fusionsproteins können LuxA und LuxB durch einen Linker, z.B. einen Serin-Threonin-Linker oder einen Serin-Arginin-Linker, vorzugsweise einen Serin-Arginin-Linker, verknüpft sein. Das Fusionsprotein bzw. das Gen, das für das für das Fusionsprotein kodiert, ist unter der Kontrolle eines eigenen heterologen Promoters und kann dadurch Gene (i) und (ii) inklusive deren zugehörigen heterologen Promotoren in der Nukleinsäure der Erfindung ersetzen. Ein beispielhaftes Fusionsprotein von LuxA und LuxB ist in SEQ ID NO: 8 gezeigt. Das LuxA/LuxB-Fusionsprotein kann unter der Kontrolle eines FBA1-Promotors sein (wie z.B. in SEQ ID NO: 13 gezeigt). Alternativ kann das LuxA/LuxB-Fusionsprotein auch unter der Kontrolle des OSI1-Promotors sein (wie z.B. in SEQ ID NO: 19 gezeigt). Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung dementsprechend auch auf eine Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für ein Fusionsprotein umfassend LuxA und LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
  • Die übrigen Gene des lux-Operons luxC, IuxD, und luxE codieren für eine Transferase (LuxD) und für eine Synthetase/Reduktase (LuxCE), welche dafür sorgen, dass das für die Lichtreaktion benötigte Aldehyd-Substrat in ausreichender Menge vorliegt (Close et al., 2009). Das Aldehyd-Substrat für die bakterielle Luciferase wird in diesem Zusammenhang auch als bakterielles Luciferin bezeichnet. Das Lux-Operon ist auch Basis anderer biolumineszierender Bakterien wie z.B. von Photobacterium phosphoreum (Dunlap, 2014). LuxC, LuxD und LuxE sind vorzugsweise von P. luminescens. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxC eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxD eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat LuxE eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  • Zur Unterstützung der Luciferinsynthese im Kontext der Erfindung kann zusätzlich eine NAPDH-Flavin-Oxidoreduktase überexprimiert oder zusätzlich exprimiert werden. Diese kann auf einer zusätzlichen Nukleinsäure oder auf der Nukleinsäure der Erfindung umfasst sein. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure der Erfindung (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert. Vorzugsweise ist die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase frp, vorzugsweise frp von Vibrio harveyi. In einer besonderen Ausführungsform hat die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase eine Aminosäurensequenz, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  • Ein „funktionsfähiges Fragment“ im Kontext der vorliegenden Erfindung meint ein Fragment des jeweiligen Proteins, das eine Aktivität von mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% des unmodifizierten Proteins, d.h. der in dieser Offenbarung genannten Sequenz hat. Die Bestimmung der Aktivität eines Proteins liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns. Hierfür kann die Aktivität, z.B. die Lumineszenz, zwischen der jeweiligen Referenzsequenz und dem zu testenden Fragment unter ansonsten gleichen Bedingungen verglichen werden.
  • Sequenzidentität kann durch jede bekannte Methode bestimmt werden, jedoch sind für die Bestimmung des Grades der Identität von Sequenzen Computerprogramme nützlich. Vielfältige Sequenzabgleiche und %-Identität Kalkulationen können mit Hilfe von Standard BLAST Parametern durchgeführt werden (Verwendung von Sequenzen aller verfügbaren Organismen, Matrix BLOSUM 62, gap costs: existence 11, extension1). Alternativ kann das Program Align Plus 4, Version 4.10 (Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite) mit folgenden Parametern genutzt werden: DNA comparison: Global comparison, Standard Linear Scoring Matrix, Mismatch Penalty = 2, Open Gap Penalty = 4, Extend Gap Penalty = 1 / Amino Acid Comparison: Global Comparison, BLOSUM 62 Scoring Matrix.
  • „Nukleinsäure“ wie hierin genutzt beschreibt aus einzelnen Bausteinen, den Nukleotiden, aufgebaute Makromoleküle, die bei allen Organismen die genetische Information enthalten. Abwechselnde Einfachzucker und Phosphorsäureester bilden eine Kette, wobei an jedem Zucker eine Nukleinbase hängt. Die Nukleinsäure kann aus DNA oder RNA bestehen, wobei DNA bevorzugt wird. Wenn eine Nukleinsäure exprimiert wird, führt dies zur Produktion des Peptids bzw. Proteins, das durch das jeweilige Gen kodiert wird.
  • In der Nukleinsäure der Erfindung ist jedes der Gene unter der Kontrolle eines (eigenen) zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors. Der jeweilige heterologe Promotor ist vorzugsweise ein eukaryotischer Promotor. Die Promotoren der einzelnen Gene (i) bis (v) oder (i) bis (vi) können gleich sein, sind vorzugsweise jedoch unterschiedlich. Vorzugsweise ist zumindest ein Promotor im Vergleich zu den anderen verwendeten Promotoren unterschiedlich, mehr bevorzugt sind zumindest zwei Promotoren zu den anderen Promotoren unterschiedlich, wobei auch die zwei Promotoren zueinander unterschiedlich sind, noch mehr bevorzugt sind zumindest drei Promotoren zu den anderen Promotoren unterschiedlich, wobei auch die drei Promotoren zueinander unterschiedlich sind, am meisten bevorzugt sind alle verwendeten Promotoren zueinander unterschiedlich. Der Begriff eukaryotischer Promoter kann synthetische Promotoren umfassen. Der Begriff eukaryotischer Promotor kann den 35S-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus oder andere virale Promotoren umfassen.
  • Da die Gene des lux-Operons in Bakterien gleichmäßig exprimiert werden, kann versucht werden, dies durch gleich starke Promotoren in Eukaryoten nachzubilden. Jedoch ist dies nicht essenziell für die Ausführbarkeit der Erfindung. Die heterologen Promotoren vermitteln daher vorzugsweise die gleiche Expressionsstärke. „Expressionsstärke“ meint in diesem Kontext die Menge (z.B. Anzahl) der transkribierten mRNA und/oder die Menge (z.B. Masse) der translatierten Proteine. „Gleich“ kann in diesem Kontext eine Abweichung von 25% oder weniger, 10% oder weniger, oder 5% oder weniger beinhalten. Verfahren zur Bestimmung der Menge von mRNA und Proteinen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und zum Beispiel in Sun et al. (2012), Biotechnology and Bioengineering 2012, 109:2082-2092, beschrieben. Zum Beispiel kann mittels quantitativer PCR die transkribierte Menge an mRNA des gleichen Gens, z.B. gfp, in Abhängigkeit verschiedener Promotoren miteinander verglichen werden. Alternativ oder zusätzlich kann ein Gen, das für ein fluoreszierenden Protein wie GFP kodiert, unter die Kontrolle verschiedener Promotoren gestellt werden und die jeweilige Fluoreszenz in Abhängigkeit des Promotors bestimmt werden.
  • Die Biolumineszenz, die durch die Expressionsprodukte der Nukleinsäure der Erfindung vermittelt wird, kann zum Nachweis verschiedenster Faktoren, z.B. Umwelteinflüssen, genutzt werden. Hierfür sind luxA und luxB bzw. das luxA/luxB-Fusionsprotein vorzugsweise unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors. „Regulierbar“ kann in diesen Kontext die Induktion der Genexpression oder die Repression der Genexpression im Hinblick auf einen Umwelteinfluss bedeuten. Der regulierbare Promotor ist somit vorzugsweise durch einen Umwelteinfluss regulierbar.
  • Im Kontext der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn luxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Oxidoreduktase bereits vor der Expression der Luciferase luxA/luxB exprimiert werden. Dies hat den Vorteil, dass bereits das Substrat Luciferin in der Wirtszelle zur Verfügung stehen kann, bevor die Expression der Luciferase LuxA/LuxB gestartet wird. Dies kann eine schnellere Verfügbarkeit der Biolumineszenz ermöglichen, da nicht zusätzlich erst die Proteine, die das Substrat der Luciferase produzieren, exprimiert werden müssen. Dementsprechend können luxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sein. In einer Ausführungsform sind luxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Im Falle eines regulierbaren oder induzierbaren Promotors sind die Promotoren von luxC, IuxD, luxE und optional der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise unterschiedlich zu den (induzierbaren) Promotoren von luxA und luxB. Der Promotor von luxC ist vorzugsweise der TEF2-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 9 gezeigt), der Promotor von IuxD ist vorzugsweise der CDC19-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt), der Promotor von luxE ist vorzugsweise der ENO2-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 11 gezeigt) und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase ist vorzugsweise der PDC1-Promotor (z.B. wie in SEQ ID NO: 12 gezeigt).
  • Auf jedes der Gene (i) bis (v) oder (i) bis (vi) kann ein Terminator folgen. Ein „Terminator“ oder „Transkriptionsterminator“ kann ein Abschnitt einer genetischen Sequenz auf der DNA bezeichnet werden, der das Ende eines Gens oder Operons markiert, da er zur Beendigung (Termination) der Transkription führt. Beispiele für Terminatoren sind z.B. der TEF2-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 14 gezeigt), der CDC19-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 15 gezeigt), der ENO2-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 16 gezeigt), der PDC1-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 17 gezeigt) oder der FBA1-Terminator (wie z.B. in SEQ ID NO: 18 gezeigt).
  • Wie bereits erläutert, ist es ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäure der Erfindung keine IRES-Sequenz oder 2A-Peptidsequenz enthalten muss. Als interne ribosomale Eintrittsstelle (engl. internal ribosomal entry site), abgekürzt IRES, wird in der Zellbiologie ein spezifisch gefalteter Abschnitt der Sekundärstruktur eines RNA-Einzelstrangs bezeichnet, der die Bindung an Ribosomen vermittelt. Damit kann bei der Synthese von Proteinen in Eukaryoten die Translation unabhängig von der 5'-Cap-Struktur initiiert werden, beispielsweise auch von der Mitte einer messenger-RNA (mRNA) aus. IRES wurden bisher in der RNA von Viren gefunden sowie in der mRNA für einige Gene von Zellen beschrieben. 2A-selbstschneidende Peptide oder 2A-Peptide bilden eine Klasse von 18-22 Aminosäuren langen Peptiden, die das Spalten eines rekombinanten Proteins in einer Wirtszelle induzieren können. 2A-Peptide sind z.B. von der 2A-Region des Maul- und Klauenseuche-Virus abgeleitet. In einer Ausführungsform enthält die Nukleinsäure der Erfindung keine IRES-Sequenz und/oder keine 2A-Peptidsequenz zwischen einem der Gene (i) bis (vi).
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen Vektor, der die Nukleinsäure der Erfindung umfasst. Ein „Vektor“ oder auch „Plasmid“ bezeichnet eine Nukleinsäure, die als ein Transportvehikel zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine (lebende) Wirtszelle durch Transfektion oder Transduktion geeignet ist. Beispielhaft hierfür kann das pRS426-Plasmid genannt werden, das z.B. in (Mumberg et al., 1995) et al. beschrieben ist. Der Vektor enthält vorzugsweise einen oder mehrere Replikationsursprünge, die die Vermehrung oder Persistenz in einer Wirtszelle ermöglichen. Diese können durch den Fachmann je nach vorgesehener Wirtszelle angepasst werden. Ein erfindungsgemäßer Vektor ist beispielhaft in SEQ ID NO: 7 dargestellt.
  • Verfahren zum Herstellen der Nukleinsäure oder des Vektors der Erfindung sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Neben der Klonierung der einzelnen Gene in eine Nukleinsäure oder einen Vektor kann die Nukleinsäure bzw. der Vektor alternativ auch durch eine Totalsynthese hergestellt werden. Die Gene können je nach Wirtszelle Codon-optimiert sein.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auch auf eine Wirtszelle, die die Nukleinsäure der Erfindung oder den Vektor der Erfindung umfasst. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle. Besonders bevorzugt ist die Wirtszelle eine Hefe, wobei die Hefe vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe, und Blastobotrys adeninivorans (auch bekannt als Arxula adeninivorans). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle von Saccharomyces cerevisiae. In einer besonderen Ausführungsform ist die Wirtszelle S. cerevisiae-Stamm BY4742, wie z.B. in Brachmann et al. 1998 beschrieben. Die Nukleinsäure oder der Vektor der Erfindung können in ein Chromosom der Wirtszelle integriert sein.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle der Erfindung umfassend das Einbringen der Nukleinsäure der Erfindung oder des Vektors der Erfindung in eine Wirtszelle. Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren oder Vektoren in eine Wirtszelle sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Zum Beispiel kann die Wirtszelle mit der Nukleinsäure oder dem Vektor der Erfindung transformiert oder transduziert werden.
  • Die Nukleinsäure, der Vektor oder die Wirtszelle der Erfindung können zu vielfältigen Zwecken eingesetzt werden. Einer dieser Zwecke ist der Nachweis eines Umwelteinflusses. Im Zusammenhang mit der Verwendung eines regulierbaren Promotors zur Kontrolle von luxA und luxB oder des IuxA/IuxB-Fusionsproteins kann die Veränderung der Biolumineszenz beobachtet und anhand dessen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des Umwelteinflusses geschlossen werden. Die Stärke der Lumineszenz kann auch zur Konzentrationsbestimmung genutzt werden (siehe auch Beispiel 4). Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle der Erfindung; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend luxA und luxB optional unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss aktiviert oder beeinflusst wird und wobei ein Anstieg der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist (im Kontext eines induzierbaren Promotors) oder wobei eine Verringerung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist (bei Verwendung eines reprimierbaren Promotors). Ein solches Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses kann Grundlage für die Verwendung der Wirtszelle als Umweltsensor sein. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben. In einer Ausführungsform sind luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend luxA und luxB nicht unter der Kontrolle eines regulierbaren sondern unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors. In diesem Fall kann, wenn der Umwelteinfluss das Wachstum der Wirtszelle verändert (stärken oder schwächen) die Veränderung der Biolumineszenz zum Nachweis des Umwelteinflusses genutzt werden. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle der Erfindung; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend luxA und luxB optional unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors sind, und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist.
  • Ein „Umwelteinfluss“ im Kontext der vorliegenden Offenbarung meint jeden Einfluss, der geeignet ist, die Genexpression eines unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors stehenden Gens zu verändern, und/oder tödlich oder wachstumshemmend für die Wirtszelle ist. Dies kann im Sinne eines Analyten, einer synthetischen oder natürlichen Verbindung, bioverfügbaren Verbindung (wie Nährstoffe, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Stickstoff, Phosphor, Schwefel), eines physikalischen Einflusses, der direkt oder indirekt (indirekt bedeutet z.B., wenn ein Analyt einen Signalweg aktiviert, der letztlich auf das regulative Element wirkt) auf das regulative Element einwirken kann, verstanden werden. Dadurch kann das System als ein Indikator für Umwelteinflüsse, aber auch für Genexpression und Regulation sowie für Monitoring von bioverfügbaren Verbindungen eingesetzt werden, da die Biolumineszenz in Abhängigkeit des Stoffwechsels (Proteinsynthese, DNA-Synthese) bzw. des Wachstums verändert/reguliert wird. Beispiele für Umwelteinflüsse umfassen Medikamente, Drogen, Hormone, Umweltgifte, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüsse.
  • „Medikamente“ können Stoffe und Zubereitungen umfassen, die bei Mensch oder Tier angewendet werden und zur Heilung, zur Linderung oder zur Verhütung von Erkrankungen oder krankhafter Beschwerden, oder zur Wiederherstellung, Korrektur oder Beeinflussung von physiologischen Funktionen bestimmt sind. Auch können sie als Grundlage für medizinische Diagnosen dienen. Der Umwelteinfluss kann ein Antibiotikum sein.
  • „Drogen“ können folgendes umfassen: Benzodiazepine, Thienodiazepine, Indolalkaloide (z.B. LSD), Opioide (z.B. Morphin, Diacetylmorphin, Methadon), Arylcyclohexylamine (z.B. Ketamin), Phenylethylamine (z.B. Amphetamine), Tropan-Alkaloide (z.B. Kokain, Skopolamin), Xanthine oder Cannibinoide (z.B. Cannabidiol, THC) sein.
  • „Hormone“ können körpereigene oder nicht-körpereigene, aber hormonähnliche Substanzen sein. Beispiele hierfür sind Östrogene, Gestagene, aber auch Stoffe die hormonähnliche Wirkungen entfalten wie z.B. DDT, PCB, PBDE oder Phthalate.
  • Als „Umweltgifte“ können Stoffe oder Zubereitungen verstanden werden, die selbst oder deren Umwandlungsprodukte geeignet sind, die Beschaffenheit des Naturhaushaltes, von Wasser, Boden oder Luft, Klima, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen derart zu verändern, dass dadurch sofort oder später Gefahren für die Umwelt herbeigeführt werden können. Umweltgifte können chemische Stoffe sein, die im Rahmen der GHS-Kennzeichnung als „umweltgefährlich“ eingestuft sind. Beispiele hierfür sind unter anderem Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), leichtflüchtige halogenierte Kohlenwasserstoffe (LHKW wie z. B. Dichlormethan, Trichlormethan, Trichlorethan), Pentachlorphenol (PCP), Polybromierte Diphenylether (PBDE), Polychlorierte Biphenyle (PCB), Polychlorierte Dibenzodioxine und Dibenzofurane, Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK wie z. B. Benzo[a]pyren), Propenal, Schwefeltrioxid, Schwermetalle (z.B. Arsen, Antimon, Blei, Cadmium, Chrom, Kupfer, Nickel, Thallium, Quecksilber) oder TMDD.
  • Eine „bioverfügbare Verbindung“ kann als ein Stoff oder ein Stoffgemisch verstanden werden, der von Organismen verstoffwechselt werden kann, ohne diesen dabei zu schaden. Beispiele umfassen Nährstoffe, Stickstoff und Stickstoffverbindungen, Phosphor und Phosphorverbindungen und Schwefel und Schwefelverbindungen.
  • Ein „physikalischer Einfluss“ kann einen Umwelteinfluss bezeichnen, der über Parameter wie Hitze, Kälte oder osmotische Konzentration auf eine Wirtszelle einwirken kann. Ein weiterer physikalischer Einfluss kann oxidativer Stress sein. Zum Nachweis von oxidativem Stress kann der OSI1-Promotor zur Kontrolle der Expression von luxA/luxB eingesetzt werden.
  • Eine „Umweltprobe“ kann eine Probe bezeichnen, die aus der Umwelt, d.h. z.B. nicht von einem Tier gewonnen wurde. Beispielhafte Umweltproben sind Gewässerproben (z.B. Meer, Seen, Fließgewässer, Abwasser, Trinkwasser) oder Bodenproben, vorzugsweise Gewässerproben.
  • Verfahren zur Messung der Biolumineszenz sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Sie umfassen z.B. die Verwendung eines Photometers z.B. innerhalb eines (Mikro-)Plattenlesers. Grundlage dieser Verfahren ist die Messung des durch die Wirtszelle emittierten Lichts. Die Aktivität der in dieser Offenbarung beschriebenen bakteriellen LuxA/LuxB-Luciferase kann bei etwa 490 nm gemessen werden.
  • Wie hierin erwähnt, kann die Wirtszelle der Erfindung als Biosensor verwendet werden. Folglich bezieht sich die Erfindung auch auf die Verwendung der Wirtszelle als Biosensor. „Biosensor“ kann sich im Kontext der Erfindung auf die Verwendung der Wirtszelle der Erfindung zum Nachweis eines Umwelteinflusses beziehen, z.B. in einem Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses wie hierin beschrieben. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben.
  • Die Wirtszelle der Erfindung kann zusätzlich als Vitalitätssensor verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform sind luxA und luxB bzw. das IuxA/IuxB-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promoters. D.h. die Lumineszenz der Wirtszelle bleibt konstant. Wenn nun die Vitalität der Wirtszelle sinkt, z.B. durch den Einfluss eines Umweltgiftes, kann die Wirtszelle die Proteinproduktion einschränken oder sterben, wodurch die Lumineszenz sinkt. D.h., das Maß der Lumineszenz kann als Indikator für die Vitalität der Wirtszelle dienen. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der Wirtszelle der Erfindung als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der (Bio-)Lumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben.
  • Die Nukleinsäure der Erfindung kann auch zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen verwendet werden. Hierfür kann ein System ähnlich eines Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (engl. yeast two-hybrid system, Y2H) verwendet werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann das Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase durch die unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors stehenden Gene luxC, IuxD, luxE und optional NAPDH-Flavin-Oxidoreduktase produziert werden. Gleichzeitig sind die luxA/luxB-Gene bzw. das LuxA/LuxB-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Promotors, der durch die Bindung des rekonstituierten Transkriptionsfaktors im Y2H-System aktiviert wird. Häufig wird hierfür ein Ga/4-Promotor verwendet, der vom rekonstituierten GaI4-Transkriptionsfaktor bei vorhandener Protein-Protein-Interaktion aktiviert wird. Ein auf Luciferasen beruhendes System ist in Massoud et al. 2007 beschrieben. Vorzugsweise wird zu der Wirtszelle kein Substrat für die LuxA/LuxB-Luciferase von außen hinzugegeben.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Kit umfassend die Nukleinsäure der Erfindung, den Vektor der Erfindung oder die Wirtszelle der Erfindung. Das Kit kann zusätzlich eine Anleitung umfassen. Weitere Bestandteile können Probenaufnahmebehälter, Nährmedien oder Mittel zur Transfektion der Nukleinsäure sein.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf folgende Gegenstände:
    1. 1. Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend:
      1. (i) ein Gen, das für LuxA kodiert,
      2. (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert,
      3. (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert,
      4. (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert,
      5. (v) ein Gen, das für LuxE kodiert,
      wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
    2. 2. Nukleinsäure nach Gegenstand 1, wobei der heterologe Promotor ein eukaryotischer Promotor ist.
    3. 3. Nukleinsäure nach Gegenstand 1 oder 2, wobei die heterologen Promotoren die annähernd gleiche Expressionsstärke vermitteln.
    4. 4. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei auf jedes Gen ein Terminator folgt.
    5. 5. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxA und LuxB von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi, vorzugsweise P. luminescens sind.
    6. 6. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei die von luxA und luxB kodierten Polypeptide in einem Fusionsprotein umfasst sind und wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind.
    7. 7. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxA eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
    8. 8. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxB eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
    9. 9. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxC, LuxD und LuxE von P. luminescens sind.
    10. 10. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxC eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
    11. 11. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxD eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
    12. 12. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei LuxE eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
    13. 13. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei die Nukleinsäure zusätzlich (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert, umfasst.
    14. 14. Nukleinsäure nach Gegenstand 13, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase frp ist, vorzugsweise von V. harveyi, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
    15. 15. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei die Nukleinsäure keine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und/oder keine selbstschneidenden Peptide, z.B. 2A-Peptide, zwischen einem der Gene (i) bis (vi) enthält.
    16. 16. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend LuxA und LuxB unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor vorzugsweise regulierbar durch einen Umwelteinfluss ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüssen.
    17. 17. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Gegenstände, wobei luxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor von luxC vorzugsweise der TEF2-Promotor ist, der Promotor von IuxD vorzugsweise der CDC19-Promotor ist, der Promotor von luxE vorzugsweise der ENO2-Promotor ist und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise der PDC1-Promotor ist.
    18. 18. Vektor, z.B. ein Plasmid, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17.
    19. 19. Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17 oder den Vektor nach Gegenstand 18, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine eukaryotische Wirtszelle ist.
    20. 20. Wirtszelle nach Gegenstand 19, wobei die Wirtszelle eine Hefe, vorzugsweise eine Hefe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe und Blastobotrys adeninivorans, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist.
    21. 21. Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20 umfassend das Einbringen der Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17 oder des Vektors nach Gegenstand 18 in eine Wirtszelle.
    22. 22. Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend:
      1. (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20;
      2. (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle;
      wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend LuxA und LuxB optional unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss reguliert wird und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist.
    23. 23. Verfahren nach Gegenstand 22, wobei der Umwelteinfluss ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalischen Einflüssen.
    24. 24. Verwendung einer Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20 als Biosensor, in einem Verfahren nach Gegenstand 22 oder 23 oder zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen.
    25. 25. Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Gegenstände 19 oder 20 als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der Biolumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist.
    26. 26. Kit umfassend die Nukleinsäure nach einem der Gegenstände 1 bis 17, den Vektor nach Gegenstand 18 oder die Wirtszelle nach Gegenstand 19 oder 20.
  • Wir weisen darauf hin, dass die hier verwendeten Singularformen „ein“/„eine“, und „der“/„die“/„das“ Pluralverweise enthalten, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes angibt. So schließt z.B. der Verweis auf „ein Reagenz“ ein oder mehrere solcher verschiedenen Reagenzien ein, und der Verweis auf „das Verfahren“ schließt den Verweis auf gleichwertige Schritte und Verfahren ein, die dem Fachmann bekannt sind und die die hier beschriebenen Verfahren modifizieren oder ersetzen könnten.
  • Sofern nicht anders angegeben, ist der Begriff „mindestens“ vor einer Reihe von Elementen so zu verstehen, dass er sich auf jedes Element in der Reihe bezieht. Der Fachmann kann viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung erkennen oder durch routinemäßiges Experimentieren finden können. Solche Äquivalente sollen von der vorliegenden Erfindung erfasst werden.
  • Der Begriff „und/oder“ enthält die Bedeutungen von „und“, „oder“ und „alle oder jedwede andere Kombination der Elemente, die durch diesen Begriff verbunden werden“.
  • Der Begriff „weniger“ oder umgekehrt „mehr als“ enthält nicht die konkret genannte Nummer. Zum Beispiel bedeutet „weniger als 20“ weniger als die angegebene Zahl. Ebenso bedeutet „mehr als“ oder „größer als“ die angegebene Zahl, z.B. „mehr als 80%“ bedeutet mehr als oder größer als die angegebene Zahl von 80%.
  • In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird, sofern sich aus dem Kontext nichts anderes ergibt, das Wort „umfassen“ und Variationen wie „umfasst“ und „umfassend“ so verstanden, dass es die Einbeziehung einer angegebenen ganzen Zahl oder Schritten oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten bedeutet, nicht aber den Ausschluss einer anderen ganzen Zahl oder eines Schritts oder Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten. Wenn hier der Begriff „umfasst“ verwendet wird, kann er durch den Begriff „enthält“ oder „einschließt“ oder manchmal, wenn er hier verwendet wird, durch den Begriff „hat“ ersetzt werden. Wenn hierin „bestehend aus“ verwendet wird, schließt „bestehend aus“ jedes Element, jeden Schritt oder jede Zutat aus, die nicht angegeben sind.
  • Der Begriff „einschließlich“ bedeutet „einschließlich, aber nicht beschränkt auf“. Die Begriffe „einschließlich“ und „einschließlich, aber nicht beschränkt auf“ werden austauschbar verwendet.
  • Es sollte verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf die spezielle Methodik, die Protokolle, das Material, die Reagenzien und die Substanzen usw., die hier beschrieben werden, beschränkt ist und als solche variieren kann. Die hier verwendete Terminologie dient nur der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen und soll den Umfang der vorliegenden Erfindung, der allein durch die Ansprüche definiert wird, nicht einschränken.
  • Alle im gesamten Text dieser Beschreibung zitierten Veröffentlichungen (einschließlich aller Patente, Patentanmeldungen, wissenschaftlichen Veröffentlichungen, Anleitungen usw.), egal ob vorher oder nachher genannt, werden hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit einbezogen. Nichts hierin ist als Eingeständnis zu verstehen, dass die Erfindung nicht aufgrund einer früheren Erfindung zu einer solchen vorzeitigen Offenbarung berechtigt ist. In dem Maße, in dem das durch Verweis aufgenommene Offenbarung dieser Beschreibung widerspricht oder mit ihr unvereinbar ist, ersetzt die Beschreibung jegliche derartige Offenbarung.
  • Die folgenden Beispiele, die nur zur Veranschaulichung angeführt werden, sollen zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer Vorteile beitragen. Die Beispiele sollen den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • BEISPIELE
  • Materialien und Methoden
  • Hefe und Bakterienlinien
  • In dieser Arbeit wurde der Saccharomyces cerevisiae-Stamm BY4742 (Genotyp: MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) verwendet, welche aus der Gen-Knockout Kollektion der Firma Euroscarf in Oberursel stammt (Ando & Suzuki, 2005; Brachmann et al., 1998).
  • Verwendete Medien
  • YPD (für S. cerevisiae)
    Komponenten Endkonzentration
    Pepton 20 g/L
    D-Glucose 20 g/L
    Hefeextrakt 10 g/L
    Agar (für Festmedium) 15 g/L
  • SD-URA-Medium (für S. cerevisiae)
  • Komponenten Endkonzentration
    D-Glucose 20 g/L
    Ammoniumsulfat 5 g/L
    Yeast Nitrogen Base 1,7 g/L
    CSM -URA 0,77 g/L
    Agar (für Festmedium) 15 g/L
  • SD-Leu-Medium (für S. cerevisiae)
  • Komponenten Endkonzentration
    D-Glucose 20 g/L
    Ammoniumsulfat 5 g/L
    Yeast Nitrogen Base 1,7 g/L
    CSM -Leu 0,69 g/L
    Agar (für Festmedium) 15 g/L
  • SD-Leu-URA Medium (für S. cerevisiae)
  • Komponenten Endkonzentration
    D-Glucose 20 g/L
    Ammoniumsulfat 5 g/L
    Yeast Nitrogen Base 1,7 g/L
    CSM -Leu -URA 0,67 g/L
    Agar (für Festmedium) 15 g/L
    Plasmide
    Name Eigenschaft Referenz
    pRS426 High-copy Plasmid mit f1 ori, CoIE1, Beta-Lactamase Sequenz und URA3 Sequenz. (Mumberg et al., 1995)
    pGADT7 AD yeast two-hybrid „prey“ Plasmid für die Expression von Proteinen, welche mit der GAL4 Domäne verbunden sind. (Chien et al., 1991)
  • Transformation von Hefen
  • Die Transformation basiert auf dem Protokoll von Gietz and Woods (2002) und auf Jansen et al. (2005) mit einigen eigenen Abänderungen: Hefen wurden auf YPD-Agarplatten über Nacht 1-2 Tage bei 28°C inkubiert. Zellrasen entsprechend einer 1-µl Impföse wurden in 50 µl zuvor aufgekochtem und anschließend abgekühltem Heringsperma (2mg/ml in 10 mM TRIS-HCI, 1 mM Na2EDTA, pH 8) gegeben und vermischt. Anschließend wurden zunächst die zu transformierende DNA - und ein Gemisch aus 240 µl 50% Polyethylenglycol 6000 (Gewicht/Volumen) und 36 µl 1 M Lithiumacetat hinzugegeben. Nach einer Inkubation bei 30°C für 30 Minuten wurde ein Hitzeschock bei 42°C für 30 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen bei 3000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 100 µl destilliertem und sterilisiertem Wasser aufgenommen und auf Selektionsmedium mit entsprechender Selektion ausgebracht. Diese Platten wurden bei 28°C inkubiert, bis Transformanten auftraten.
  • Messung der Lumineszenz
  • D-Luciferin Natriumsalz (Carl Roth, Deutschland) wurde in 0,1 M Na2HPO4-Citrat Puffer pH 5 zu einer finalen Luciferin-Konzentration von 1 mM gelöst. 100 µl einer Übernacht-Hefekultur wurde je nach experimenteller Fragestellung auf eine geeignete Start-OD600 von ca.1,0 oder weniger in CSM-Medium eingestellt. 100 µl Hefezellen, 25 µl einer Testlösung (z.B. Aminosäure) und 25 µl 1 mM Luciferinlösung wurden in dieser Reihenfolge für eine Messung in eine Vertiefung einer schwarzen 96-well Mikrotiterplatte mit durchsichtigem Boden (Microplate, 96 well, PS, F-Bottom (Chimney Well) µClear®, Black, Med. Binding; Greiner bio-one, Deutschland) gegeben. Die Messungen wurden mit einem Tristar2S Platereader (Berthold, Deutschland) bei einer konstanten Temperatur von 28°C durchgeführt.
  • Beispiel 1: Transformation des Plasmids pRS426-Lux in BY4742 und Wachstums- und Lumineszenz-Vergleich-Messung
  • Das Plasmid pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7, siehe auch ) wurde in den S. cerevisiae-Stamm BY4742 chemisch transformiert. Nach zwei Tagen konnten 86 Kolonien erhalten werden. Nachdem die Kolonien auf CSM-Ura-Selektionsplatten vereinzelt wurden, konnte die Lumineszenz erfolgreich gemessen werden ( ). In ist der Stamm BY4742 zu sehen, der bei einer Lumineszenz von etwa 3000 RLU startet, die bis auf maximal 5000 RLU ansteigt. Die Nukleinsäure der Erfindung kann also Biolumineszenz in Hefen ohne Zugabe von externem Luciferase-Substrat erzeugen.
  • Beispiel 2: Vergleich der bakteriellen Luciferase der Erfindung mit der Firefly-Luciferase
  • Um das erzeugte erfindungsgemäße Konstrukt pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7) in Bezug auf Wachstumsverhalten und Lumineszenz zu vergleichen, wurde eine Luciferase unter denselben Promotor und Terminator wie die bakterielle Luciferase LuxAB gestellt (SEQ ID NO: 20), um vergleichbare Bedingungen zu schaffen. Für den Vergleich wurde die Luciferase von Photinus pyralis gewählt, da diese am häufigsten in der Bioanalytik Anwendung findet (siehe ).
  • Nachdem beide Plasmide über dieselben genetischen Voraussetzungen verfügen, wie FBA1 Promotor und Terminator, dasselbe Vektorrückgrat und auch in BY4742 transformiert wurden, konnten beide Plasmide direkt miteinander verglichen werden. Das Experiment wurde zweimal mit jeweils drei technischen Replikaten durchgeführt. Die Kulturen wurden über Nacht bei 28°C kultiviert und wurden jeweils mit 50 µl frischem Medium (YPD-Medium) verdünnt. Bei dem hergestellten Prototyp (Nukleinsäure der Erfindung, SEQ ID NO: 7) wurde Wasser statt 50 µl der Luciferin-Lösung (2 mM Endkonzentration) hinzugegeben.
  • Die Nukleinsäure der Erfindung („Prototyp“) zeigt eine anfängliche Lumineszenz von etwa 100.000 RLU und steigt langsam auf 130.000 RLU nach 5,4 h an. Im Gegensatz dazu startet die Firefly-Luciferase bei nur 52.475 RLU und sinkt bereits nach 1,7 h auf 19.143 RLU. Nach 5,4 h kann nur noch eine geringe Lumineszenz von 6893 gemessen werden (siehe ). Die CSM-URA Platten wurden bei Tageslicht ( und bei völliger Dunkelheit ( von einer handelsüblichen Fotokamera aufgenommen. Auch mit bloßem Auge konnte das erzeugte Licht der Hefen wahrgenommen werden.
  • Anhand dieser Daten wird deutlich, dass die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung der herkömmlichen Firefly-Luciferase weit überlegen ist.
  • Beispiel 3: Konstruktion eines Biosensors auf Basis von Lux-Biolumineszenz-Plasmiden
  • Es wurde ein Plasmid kloniert, welches die Luciferase konstitutiv exprimiert. So sollte die Lumineszenz des Plasmids pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7), welches Luciferin- und Luciferase-Synthese auf einem einzigen Plasmid vereint ( ), mit einem System basierend auf den zwei Plasmiden pRS426-Leu2-FBA1::LuxAB (SEQ ID NO: 22) und pRS426-URA43-LuxCDE-frp verglichen werden (SEQ ID NO: 21, ). Nachdem die transformierten Hefen über Nacht gewachsen waren, konnte die Lumineszenz gemessen werden. Es wurden 100 µl der Hefekultur und 50 µl frisches Nährmedium in eine Messvertiefung gegeben ( ).
  • Entgegen der Erwartungen zeigte sich überraschend, dass das Aufteilen der Luciferin- und Luciferase-Synthese auf zwei Plasmide keine höhere Lumineszenz mit sich bringt. Im Gegenteil - hier wurde eine deutlich geringere Lumineszenz gemessen wurden ( ) im Gegensatz zur erfindungsgemäßen Nukleinsäure pRS426-Lux. Im System basierend auf zwei Plasmiden erreichte die Lumineszenz nach 5,3 h den Höhepunkt von nur 1948 RLU.
  • Die Erfinder konnten also völlig überraschend feststellen, dass das Aufteilen auf zwei Plasmide keinen positiven Effekt auf die Lumineszenz hat, sondern im Gegenteil, dass die erfindungsgemäße Expression des lux-Operons von einer Nukleinsäure vorteilhaft ist.
  • Beispiel 4: Nachweis von Leucin mittels des erfindungsgemäßen Systems
  • Es gibt viele Möglichkeiten das Luciferase-System der Erfindung als Biosensor einzusetzen. Beispielhaft soll dies anhand des Nachweises der Leucin-Konzentration in einem Leucin-Mangelmedium gezeigt werden.
  • Der von den Erfindern verwendete Hefestamm BY4742 hat einige Auxotrophien, u.a. auch eine Leucin-Auxotrophie, die diesen Stamm für den Leucin-Nachweis als nützlich erscheinen lässt. Hierfür wurde der Stamm über Nacht in CSM-URA Medium angezogen. Da der Vektor pRS426-Lux (SEQ ID NO: 7, siehe auch ) einen URA3-Marker enthält, ist für diese Hefezellen normales Wachstum möglich. Am nächsten Tag wurden die Zellen abzentrifugiert und in CSM-Leu-URA Medium, d.h. in ein Medium ohne Leucin, aufgenommen. Folglich konnten diese Zellen aufgrund von Fehlen der Aminosäure Leucin nicht wachsen. Nach 5 h Inkubationszeit wurde eine definierte Menge Leucin hinzugegeben und die Lumineszenz im Anschluss gemessen ( ). Es konnte aber beobachtet werden, dass ab einer Leucin-Konzentration >49 mg/L die Organismen wachsen und das Lichtsignal zunimmt unabhängig von der Konzentration. Gibt man allerdings weniger als 20 mg/L Leucin hinzu wirkt diese Menge limitierend auf den Zellstoffwechsel, und damit auf die maximal mögliche Biolumineszenz. Durch den Verbrauch des vorhandenen Leucins wird dieses immer mehr limitiert, wodurch der Zellstoffwechsel und damit die Biolumineszenz über die Zeit abnehmen ( ). Der Zusammenhang zwischen vorhandenem Leucin und gemessener Biolumineszenz verhält sich in einem bestimmten Konzentrationsbereich konzentrationsabhängig, sodass die Leucin-Konzentration mit der Biolumineszenz korreliert und gemessen werden kann.
  • Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann also unter Zuhilfenahme einer (erfindungsgemäßen) Wirtszelle dazu eingesetzt werden, Umwelteinflüsse wie z.B. Leucin nachzuweisen und zu quantifizieren.
  • REFERENZEN
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    • Mumberg, D., Müller, R., & Funk, M. (1995). Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene, 156(1), 119-122. https://doi.org/10.1016/0378-1119(95)00037-7
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  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims (15)

  1. Nukleinsäure, umfassend eine fortlaufende Nukleotidsequenz, enthaltend: (i) ein Gen, das für LuxA kodiert, (ii) ein Gen, das für LuxB kodiert, (iii) ein Gen, das für LuxC kodiert, (iv) ein Gen, das für LuxD kodiert, (v) ein Gen, das für LuxE kodiert, wobei jedes der Gene unter der Kontrolle eines zu dem jeweiligen Gen heterologen Promotors ist, und wobei alle Gene samt Promotor in einer einzigen Nukleotidsequenz aufgereiht enthalten sind.
  2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, (i) wobei der heterologe Promotor ein eukaryotischer Promotor ist; (ii) wobei die heterologen Promotoren die annähernd gleiche Expressionsstärke vermitteln; (iii) wobei auf jedes Gen ein Terminator folgt; und/oder (iv) wobei die Nukleinsäure keine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) und/oder keine selbstschneidenden Peptide, z.B. 2A-Peptide, zwischen einem der Gene (i) bis (vi) enthält.
  3. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei LuxA und LuxB von Photorhabdus luminescens oder Vibrio harveyi, vorzugsweise P. luminescens sind, vorzugsweise (i) wobei LuxA eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 1 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist; und/oder (ii) LuxB eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 2 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  4. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die von luxA und luxB kodierten Polypeptide in einem Fusionsprotein umfasst sind und wobei LuxA und LuxB vorzugsweise durch einen Linker verknüpft sind.
  5. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei LuxC, LuxD und LuxE von P. luminescens sind, vorzugsweise (i) wobei LuxC eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 3 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist; (ii) wobei LuxD eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 4 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist; und/oder (iii) wobei LuxE eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 5 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  6. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Nukleinsäure zusätzlich (vi) ein Gen, das für eine NADPH-Flavin-Oxidoreduktase kodiert, umfasst, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise frp ist, vorzugsweise von V. harveyi, wobei die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise eine Aminosäurensequenz hat, die zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 97,5%, mindestens 99% oder 100% identisch zur SEQ ID NO: 6 oder einem funktionsfähigen Fragment davon ist.
  7. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend LuxA und LuxB unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor vorzugsweise regulierbar durch einen Umwelteinfluss ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalische Einflüssen.
  8. Nukleinsäure nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei luxC, IuxD, luxE und optional die NADPH-Flavin-Oxidoreduktase konstitutiv exprimiert werden oder unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, wobei der Promotor von luxC vorzugsweise der TEF2-Promotor ist, der Promotor von IuxD vorzugsweise der CDC19-Promotor ist, der Promotor von luxE vorzugsweise der ENO2-Promotor ist und/oder der Promotor der NADPH-Flavin-Oxidoreduktase vorzugsweise der PDC1-Promotor ist.
  9. Vektor, z.B. ein Plasmid, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Wirtszelle umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder den Vektor nach Anspruch 9, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine eukaryotische Wirtszelle ist, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine Hefe, vorzugsweise eine Hefe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Komagataella phaffii (Pichia pastoris), Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia methanolica, Candida boidinii, Komagataella spp., Schizosaccharomyces pombe und Blastobotrys adeninivorans, vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae ist.
  11. Verfahren zum Herstellen einer Wirtszelle nach Anspruch 10 umfassend das Einbringen der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des Vektors nach Anspruch 9 in eine Wirtszelle.
  12. Verfahren zum Nachweis eines Umwelteinflusses, umfassend: (i) Kontaktieren einer Umweltprobe mit der Wirtszelle nach Anspruch 10; (ii) Bestimmen der Lumineszenz der Wirtszelle; wobei luxA und luxB oder das Fusionsprotein umfassend LuxA und LuxB optional unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors sind, der durch den Umwelteinfluss reguliert wird und wobei eine Veränderung der Biolumineszenz im Vergleich zu einer Kontrollprobe hinweisend auf die Anwesenheit des Umwelteinflusses ist, wobei der Umwelteinfluss vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Medikamenten, Drogen, Hormonen, Umweltgiften, bioverfügbare Verbindungen und physikalischen Einflüssen.
  13. Verwendung einer Wirtszelle nach Anspruch 10 als Biosensor, in einem Verfahren nach Anspruch 12 oder zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen.
  14. Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 10 als Vitalitätssensor, wobei die Verminderung oder der Verlust der Biolumineszenz hinweisend auf eine verminderte Vitalität der Wirtszelle ist.
  15. Kit umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8, den Vektor nach Anspruch 9 oder die Wirtszelle nach Anspruch 10.
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