DE60226056T2

DE60226056T2 - Aequorin als reportergen in hefe

Info

Publication number: DE60226056T2
Application number: DE60226056T
Authority: DE
Inventors: Pauline Fraissignes; Denis Guedin
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-10-27
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2009-08-13
Anticipated expiration: 2022-10-18
Also published as: CA2464987C; ES2304139T3; JP2005508635A; EP1306385A1; JP4410563B2; ATE391722T1; DK1442054T3; CA2464987A1; EP1442054B1; EP1442054A1; DE60226056D1; WO2003037924A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizerite Hefezelle, die Aequorin als Reportergen enthält, für den Nachweis der Signalwegaktivität, und Verfahren zur Verwendung von solchen modifizierten Hefezellen.
Aequorin ist ein Photoprotein, das aus der lumineszierenden Qualle Aequoria victoria isoliert wurde.
Apoaequorin ist ein Photoprotein, das bei Bindung an Coelenterazin in Gegenwart von Ca²⁺ Photonen zu emittieren vermag.
Der Aequorinkomplex umfaßt ein Apoaequorin-Protein mit einem MG von 22.514, molekularen Sauerstoff und den Luminophor Coelenterazin (Inouye et al., 1989; Johnson und Shimomura, 1978; Shimomura und Johnson, 1978). Wenn drei Ca²⁺-Ionen an diesen Komplex binden, wird das Coelenterazin zu Coelenteramid oxidiert, wobei gleichzeitig Kohlendioxid und blaues Licht (Emissionsmaximum ~466 nm) freigesetzt werden (7).
Aufgrund seiner Ca² ⁺-abhängigen Lumineszenz wurde der Aequorin-Komplex häufig als Indikator für intrazelluläres Ca²⁺ eingesetzt.
Aequorin soll angeblich die Zellfunktionen bzw. die Embrionalentwicklung nicht stören (Miller et al., 1994).
Dieses Photoprotein kann in Säugetierzellen leicht exprimiert werden. Es wird dazu verwendet, um die freie Calciumkonzentration im Cytosol zu verfolgen (Thomas und Delaville, 1991) (Sheu et al., 1993) (Stables et al., 2000).
Aequorin kann auch leicht an spezifische Organellen wie die Mitochondrien (Brini et al., 1999) (Rizzuto et al., 1992) adressiert werden, um verschiedene Aspekte der Calciumhomeostase zu verfolgen.
Die Pharmaindustrie nutzt die unterschiedlichen Eigenschaften von Aequorin in großem Ausmaß, insbesondere beim Screening mit hohem Durchsatz (Detheux, 2000). Die Aktivierung eines Rezeptors, der mit dem Transduktionsweg der Phospholipase C gekoppelt ist, kann in Gegenwart des Photoproteins Aequorin leicht nachgewiesen werden, da sofort Calcium vom endoplasmatischen Retikulum freigesetzt wird.
WO0002045 , Detheux et al. (EUROSCREEN S.A.) beschreiben ein Assay- und/oder Diagnoseverfahren mit hohem Durchsatz für einen Agonisten und/oder einen Antagonisten eines mit Calcium gekoppelten Rezeptors (in Säugetierzellen), wo Aequorin als Marker für Veränderungen des intrazellulären Calciums bei Stimulation eines Rezeptors eingesetzt wird.
Es wurde bereits gezeigt, daß Aequorin in Hefe funktional exprimiert und nachgewiesen werden kann.
Nakajima-Shimada et al. (Nakajima-Shimada et al., 1991b) beschreiben die Verfolgung des intrazellulären Calciums in Saccharomyces cerevisiae mit einem Apoaequorin-cDNA-Expressionssystem. Wiederum wurde hier Aequorin als Marker für das intrazelluläre Calcium bei Streß oder Glukoseschwankungen im Medium eingesetzt.
Im Gegensatz zum Signalweg bei Säugetieren gibt es in Hefezellen keine vergleichbare Ca² ⁺-Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum bei Aktivierung der von mit G-Proteinen gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Zugabe von α-Faktor zu einer Zelle (d. h. Stimulation des GPCR Ste2) vom Basalniveau auf ungefähr 100 nM erhöht das [Ca2+]i auf einige Hundert nanomolar in den Zellen, was simultan mit der Induktion des Einströmens von Ca2+ erfolgt. Wenn die Zellen mit α-Faktor in einem Ca2(+)-defizienten Medium inkubiert werden, wird das Einstromen von Ca2+ stark reduziert, und der Anstieg des [Ca2+]i wird nicht nachgewiesen (Lida et al., 1990). In unseren Versuchen stört diese Gleitvariation den Nachweis der Wegaktivität nicht.
In der Hefe Saccharomyces cerevisiae kann nur eine begrenzte Anzahl Reportergene eingesetzt werden, und diese sind nicht immer günstig. Für Durchmusterungszwecke muß das Reporterprodukt leicht nachweisbar sein, und aus diesem Grund sind bequeme Reporter-Assays erforderlich. Das am häufigsten verwendete Reportergen ist LacZ, das für das sehr große und stabile Enzym β-Galactosidase codiert.
Aequorin ist ein Photoprotein, das wie die β-Galactosidase in einem Chemilumineszenz-Assay nachgewiesen wird.
Da Aequorin (MG 22514) fünfmal kleiner ist als die β-Galactosidase (MG 116351), kann es in einer größeren Menge akkumulieren, was zu einer höheren Empfindlichkeit des Assays führt und die Hinauf- bzw. Hinunterregulation des Leitungswegs (aktivierende oder hemmende Wirkung der Testverbindung) besser angibt.
Außerdem tritt beim Hefe-Assay manchmal eine Kontamination mit Bakterien auf und die meisten Kontaminanten exprimieren physiologisch eine β-Galactosidase. Die kontaminierten Kulturen würden in Gegenwart des Substrats für die β-Galactosidase ein sehr starkes Signal geben. Durch die Verwendung von Aequorin kann man das Risiko von falsch-positiven Ergebnissen aufgrund von Kontamination ausschalten.
Insgesamt kann gesagt werden, daß Aequorin geeigneter als β-Galactosidase ist.
Aequorin kann funktional von der Hefe S. cerevisiae exprimiert werden (Nakajima-Shimada et al., 1991a).
Aequorin kann in einem Lumineszenz-Assay in Gegenwart von Coelenterazin und Ca²⁺ leicht nachgewiesen werden.
Aequorin ist bis jetzt noch nicht als Reportergen für die Signalwegaktivität (wie dies für LacZ und HIS3 beschrieben wurde, wo ein mit einem G-Protein gekoppelten Rezeptor aus einem Säugetier mit dem Hefepheromon-Leitungsweg gekoppelt wurde) eingesetzt worden (King et al., 1990; Hadcock und Pausch, 1999).
Die Kontrolle der Mating-Signaltransduktion in der Hefe durch einen Säugetierrezeptor (den β2-adrenergen Rezeptor) wurde zuerst im Jahr 1990 beschrieben (King et al., 1990).
Die US 5 876 951 A beansprucht Hefezellen, die gentechnisch so verändert wurden, daß sie Ersatzstoffe für das Pheromonsystemprotein produzieren, sowie ihre Verwendungen (pFUS1-lacZ- und pFUS1-Luciferase).
Aequorin wird als transduktionswegabhängiger Reporter eingesetzt: Das Aequorin-Reportergen wird dann nur bei Aktivierung des interessierenden Transduktionswegs exprimiert. Für die Mischung der Aktivität des Pheromonreaktions-Leitungsweg zum Beispiel wird die Expression des Reportergens Aequorin von einem Promotor, der einige "Pheromone Responsive Elements" enthält, kontrolliert. Der am häufigsten verwendete Promotor ist der FUS1-Promoter. In haploiden Zellen von Saccharomyces cerevisiae regulieren GPCRs den Paarungsvorgang. Der Ste2-Rezeptor weist das Vorhandensein von Zellen des entgegengesetzten Paarungstyps nach (und zwar durch die Bindung von Peptid-Paarungspheromonen) und aktiviert intrazelluläre heterotrimäre G-Proteine, wodurch der Paarungsvorgang initiiert wird. Gpa1 (α-Untereinheit) wird von dem βγ-Komplex (Ste4-Ste18-Komplex), der stromabwärts gelegene Elemente des Pheromonreaktionsleitungswegs, der eine gut charakterisierte Proteinkinase (MAP-Kinase)-Kette beinhaltet, aktiviert, dissoziiert. Der aktivierte Transkriptionsfaktor Ste12 kann dann die Transkription von mehreren Mating-Factor-induzierbaren Genen wie FUS1 initiieren.
Unter der Kontrolle eines pheromonabhängigen Genpromoters wird Aequorin proportional zur Aktivierung des Hefepheromon-Transduktionswegs exprimiert. Das Aequorinnachweissignal quantifiziert die Aktivität des Leitungswegs.
Pheromonreaktionselemente sind erforderlich und ausreichend für die basale und pheromoninduzierte Transkription des FUS1-Gens von Saccharomyces cerevisiae (Hagen et al., 1991).
Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte Hefezelle umfassend eine für Aequorin codierende Sequenz unter der Kontrolle eines Promoters eines Mating-Factor-induzierbaren Gens, des FUS1-Promoters oder eines Teils davon, z. B. 4PRE. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist die für Aequorin codierende Sequenz SEQ ID NO. 1. In einer weiteren speziellen Ausführungsform der Erfindung exprimiert die modifizierte Hefezelle ein weiteres heterologes Protein, vorzugsweise ein zu untersuchendes heterologes Protein. Beispiele für solche anderen heterologen Proteine sind Zelloberflächenproteine, z. B. mit G-Proteinen gekoppelte Rezeptoren oder Kinasen. Hefezellen, die modifiziert werden können, sind zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Candida albicans. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der modifizierten Hefezellen, z. B. für das Durchmustern von Verbindungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die von einem heterologen Zelloberflächenprotein vermittelte Aequorinexpression modulieren, wobei

(a) eine modifizierte Hefezelle, die eine für Aequorin codierende Sequenz unter der Kontrolle des Promoters eines Mating-Factor-induzierbaren Gens umfaßt,
(b) die modifizierte Hefezelle mit einer Verbindung inkubiert wird und
(c) das Ausmaß der Aequorinexpression bestimmt wird.

Unsere Beobachtungen zeigen, daß Aequorin der β-Galactosidase in einem Transduktionsweg-abhängigen Reporter-Assay überlegen ist.
1: offenes Leseraster des Aequorins (SEQ ID NO. 1)
2: 4PRE-Sequenz (SEQ ID NO. 2)
3: Restriktionskarte von p78 4PRE-Aeq
4: Restriktionskarte von p78 4PRE-lacZ
5: Ergebnisse der Leitungswegaktivitätsreporter/Aequorin-Aktivität
6: Ergebnisse der Leitungswegaktivitätsreporter/β-Galactosidase-Aktivität
7: Ca²⁺-abhängige Erzeugung von Lumineszenz durch den Aequorinkomplex, der Apoaequorin (APO) und Coelenterazin enthält (Ohmiya und Hirano, 1996).
Beispiele
Beispiel 1: Material und Methoden
Als Hefestamm wurde W303 MAT a, far::hisG, sst2::URA3^FOA, fus1::HIS3 verwendet.
Der Hefestamm wurde mit den verschiedenen Plasmiden nach der Lithiumacetatmethode transformiert (Ito et al., 1983).
Beispiel 2: Konstruktion der Aequorin-Expressionsvektoren
Das Vollängen-cDNA-Aequoringen wurde mittels PCR unter Verwendung des chimären mitochondriellen Aequorins mtAEQ (bei dem das verkürzte N-terminale Ende mit dem Adressierungssignal des menschlichen Cytochrom C fusioniert ist (Rizzuto et al., 1992) als Matrize amplifiziert. Der 5'-PCR-Primer enthielt die 50 ersten Nukleotide der Aequorin-Wildtypsequenz und eine EcoRI-Klonierungsstelle (unten fettgedruckt). Der 3'-Primer enthielt keine Klonierungsstelle.
Die Vollängen-Wildtyp-Aequorin-Codiersequenz (1) wurde dann in den Pheromon-Transduktionsweg-abhängigen Expressionsvektor p78-4PRE (TRP1, 2μ) kloniert (3).
Der minimale ausreichende Abschnitt des FUS1-Promoters (Hagen et al., 1991), den wir 4PRE nennen, besteht aus den letzten 261 Bp der Promotorregion stromaufwärts des offenen Leserasters von FUS1. Dieser Promoter wurde mit den folgenden beiden Primern aus der genomischen DNA der Wildtyp-Hefe amplifiziert:
Beispiel 3: Konstruktion der β-Galactosidase-Expressionsvektoren
Um den Vergleich zu ermöglichen, wurde LacZ auf gleiche Art und Weise wie das Aequorin in denselben Expressionsvektor und ohne irgendeine Fusion mit der 5'-Sequenz eines endogenen Gens subkloniert (wie häufig zwecks Erhöhung des Expressionsniveaus getan ist wird (King et al., 1990)).
Die Vollängen-β-Galactosidase-Gensequenz aus Escherichia coli wurde in den pheromontransduktionswegaktivitätsabhängigen Expressionsvektor p78-4PRE (TRP1, 2μ) kloniert (4).
Beispiel 4: Nachweis des Aequorins
Die Zellen werden in eine(r) weißen 96-Well-Platte in einem Volumen von 100 μl verteilt und/oder gezüchtet.
30 Minuten vor dem Meßzeitpunkt werden 10 μl einer Lösung von 5 μM Coelenterazin (Molecular Probes) in jedes Näpfchen gegeben (um zu einer Endkonzentration von 0,5 μM zu gelangen), um die Zellen zu beschicken.
Anschließend wird die Platte die letzten 30 Minuten bei 30°C inkubiert.
Der Nachweiß des Aequorins erfolgt in einem Luminometer mit Einspritzsystem (Luminoskan, Labsystems). Für jedes Näpfchen wird unmittelbar nach dem Einspritzen einer 10 mM CaCl₂-Lösung (1 M CaCl₂, verdünnt mit Lysepuffer Y-PER der Fa. Pierce) das Lumineszenzsignal 15 Sekunden lang integriert.
Um den Zwischenschritt des Beschickens zu vermeiden, ist es möglich, Coelenterazin zu Beginn des Assays in das Medium einzubringen: Coelenterazin wird in einer Konzentration von 0,5 μM zugegeben.
Beispiel 5: Nachweis der β-Galactosidase
Die Zellen werden in eine(r) weißen 96-Well-Platte in einem Volumen von 100 μl verteilt und/oder gezüchtet. Zum Meßzeitpunkt wird jedes Näpfchen mit 100 μl einer Mischung für den Nachweis von β-Galactosidase (Galscreen, Tropix) versetzt.
Die Platte wird eine Stunde lang bei 28°C inkubiert.
Das β-Galactosidase-Signal wird in einem Luminometer abgelesen; das Lumineszenzsignal wird 0,5 Sekunden lang integriert.
Beispiel 6: Klassischer Reporter einer Leitungswegsaktivität
In diesem Assay hängt die Expression der beiden Reportergene von der Aktivität des Pheromone-Mating-Leitungswegs ab (Leberer et al., 1997). Der 4PRE-Minimalpromoter, der aus der FUS1-Promoterregion amplifiziert wurde (Hagen et al., 1991), wird nur bei einem Mating-Signal aktiviert. Dieses Signal wird durch Stimulation des Pheromonrezeptors Ste2 durch seinen Liganden α-Faktor hervorgerufen.
Drei Kolonien des Hefestamms, der entweder mit dem Plasmid p78 4PRE-AEQ oder p78 4PRE-LacZ transformiert wurde, wurden in entsprechendem Medium (SC Glucose-Trp) bis zur stationären Phase gezüchtet und dann mit demselben Medium (beim Aequorin-Stamm mit 0,5 μM Coelenterazin), das 0, 10^–7, 10^–9, 10^–11 M α-Faktor (Sigma) enthielt, verdünnt. Die Platten wurden dann 3, 6 und 24 Stunden lang bei 30°C und 700 U/min geschüttelt.
Um den Vergleich zwischen den beiden Reportern und die unterschiedlichen Stimulationszeiten zu ermöglichen, wurden die gemessenen Nachweiszahlen von Aequorin (5) und β-Galactosidase (6) als Verhältnis zwischen stimuliert und nicht stimuliert ausgedrückt.
Nach dreistündiger Stimulation ist das nachgewiesene Verhältnis bei 1 nM oder 100 nM α-Faktor für Aequorin bereits höher als für β-Galactosidase (Verhältnis bei Aequorin 8 und 14 bzw. bei β-Galactosidase 4 und 7). Nach 6stündiger Stimulation verbleibt das β-Galactosidase-Verhältnis auf demselben Niveau (Verhältnis 7 bei beiden α-Faktor-Konzentrationen), der Nachweis mit Aequorin ergibt jedoch höhere Niveaus (Verhältnis 11 bei 1 nM α-Faktor und 36 bei 100 nM α-Faktor). Nach 24stündiger Stimulation verbleiben die Aequorinzahlen höher als die β-Galactosidase.
Insgesamt zeigt dieser Versuch, daß Aequorin die Stimulation von Ste2 bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen innerhalb eines weiten Zeitbereichs besser widerspiegelt als die β-Galactosidase.
Literaturverzeichnis:

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Schlüssel zu den Figuren

Fig. 3

bp

Bp

Fig. 4

bp

Bp

Fig. 5

raw data	Rohdaten
stimulation time	Stimulationsdauer
hours	Stunden
α-factor	α-Faktor
mean	Mittelwert
stand dev.	Standardabweichung
ratio	Verhältnis
Aequorin expression	Expression von Aequorin
relative light units	relative Lichteinheiten

Fig. 6

raw data	Rohdaten
stimulation time	Stimulationsdauer
hours	Stunden
α-factor	α-Faktor
mean	Mittelwert
stand dev.	Standardabweichung
ratio	Verhältnis
Aequorin expression	Expression von Aequorin
relative light units	relative Lichteinheiten
β-Galactosidase	Durch den α-Faktor
expression induced by	induzierte Expression von
α-factor	β-Galactosidase

Fig. 7

coelenterazine	Coelenterazin
coelenteramide	Coelenteramid

Claims

Modifizierte Hefezelle, umfassend eine für Aequorin codierende Sequenz, die unter der Kontrolle des Promoters eines Mating-Factor-induzierbaren Gens exprimiert wird.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die von einem heterologen Zelloberflächenprotein vermittelten Aequorinexpression modulieren, wobei (a) eine modifizierte Hefezelle, die eine für Aequorin codierende Sequenz unter der Kontrolle des Promoters eines Mating-Factor-induzierbaren Gens umfaßt, bereitgestellt wird, (b) die modifizierte Hefezelle mit einer Verbindung inkubiert wird und (c) das Ausmaß der Aequorinexpression bestimmt wird, wobei das heterologe Zelloberflächenprotein fähig ist, den Hefepheromon-Transduktionsweg zu aktivieren.