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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine modifizerite Hefezelle, die
Aequorin als Reportergen enthält,
für den
Nachweis der Signalwegaktivität,
und Verfahren zur Verwendung von solchen modifizierten Hefezellen.
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Aequorin
ist ein Photoprotein, das aus der lumineszierenden Qualle Aequoria
victoria isoliert wurde.
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Apoaequorin
ist ein Photoprotein, das bei Bindung an Coelenterazin in Gegenwart
von Ca2+ Photonen zu emittieren vermag.
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Der
Aequorinkomplex umfaßt
ein Apoaequorin-Protein mit einem MG von 22.514, molekularen Sauerstoff
und den Luminophor Coelenterazin (Inouye et al., 1989; Johnson und
Shimomura, 1978; Shimomura und Johnson, 1978). Wenn drei Ca2+-Ionen an diesen Komplex binden, wird das
Coelenterazin zu Coelenteramid oxidiert, wobei gleichzeitig Kohlendioxid
und blaues Licht (Emissionsmaximum ~466 nm) freigesetzt werden (7).
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Aufgrund
seiner Ca2 +-abhängigen Lumineszenz
wurde der Aequorin-Komplex häufig
als Indikator für intrazelluläres Ca2+ eingesetzt.
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Aequorin
soll angeblich die Zellfunktionen bzw. die Embrionalentwicklung
nicht stören
(Miller et al., 1994).
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Dieses
Photoprotein kann in Säugetierzellen
leicht exprimiert werden. Es wird dazu verwendet, um die freie Calciumkonzentration
im Cytosol zu verfolgen (Thomas und Delaville, 1991) (Sheu et al.,
1993) (Stables et al., 2000).
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Aequorin
kann auch leicht an spezifische Organellen wie die Mitochondrien
(Brini et al., 1999) (Rizzuto et al., 1992) adressiert werden, um
verschiedene Aspekte der Calciumhomeostase zu verfolgen.
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Die
Pharmaindustrie nutzt die unterschiedlichen Eigenschaften von Aequorin
in großem
Ausmaß,
insbesondere beim Screening mit hohem Durchsatz (Detheux, 2000).
Die Aktivierung eines Rezeptors, der mit dem Transduktionsweg der
Phospholipase C gekoppelt ist, kann in Gegenwart des Photoproteins
Aequorin leicht nachgewiesen werden, da sofort Calcium vom endoplasmatischen
Retikulum freigesetzt wird.
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WO0002045 , Detheux et al.
(EUROSCREEN S.A.) beschreiben ein Assay- und/oder Diagnoseverfahren
mit hohem Durchsatz für
einen Agonisten und/oder einen Antagonisten eines mit Calcium gekoppelten
Rezeptors (in Säugetierzellen),
wo Aequorin als Marker für
Veränderungen
des intrazellulären
Calciums bei Stimulation eines Rezeptors eingesetzt wird.
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Es
wurde bereits gezeigt, daß Aequorin
in Hefe funktional exprimiert und nachgewiesen werden kann.
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Nakajima-Shimada
et al. (Nakajima-Shimada et al., 1991b) beschreiben die Verfolgung
des intrazellulären
Calciums in Saccharomyces cerevisiae mit einem Apoaequorin-cDNA-Expressionssystem.
Wiederum wurde hier Aequorin als Marker für das intrazelluläre Calcium
bei Streß oder
Glukoseschwankungen im Medium eingesetzt.
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Im
Gegensatz zum Signalweg bei Säugetieren
gibt es in Hefezellen keine vergleichbare Ca2 +-Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum
bei Aktivierung der von mit G-Proteinen gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).
Die Zugabe von α-Faktor
zu einer Zelle (d. h. Stimulation des GPCR Ste2) vom Basalniveau
auf ungefähr
100 nM erhöht
das [Ca2+]i auf einige Hundert nanomolar in den Zellen, was simultan
mit der Induktion des Einströmens
von Ca2+ erfolgt. Wenn die Zellen mit α-Faktor in einem Ca2(+)-defizienten Medium
inkubiert werden, wird das Einstromen von Ca2+ stark reduziert,
und der Anstieg des [Ca2+]i wird nicht nachgewiesen (Lida et al.,
1990). In unseren Versuchen stört
diese Gleitvariation den Nachweis der Wegaktivität nicht.
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In
der Hefe Saccharomyces cerevisiae kann nur eine begrenzte Anzahl
Reportergene eingesetzt werden, und diese sind nicht immer günstig. Für Durchmusterungszwecke
muß das
Reporterprodukt leicht nachweisbar sein, und aus diesem Grund sind
bequeme Reporter-Assays erforderlich. Das am häufigsten verwendete Reportergen
ist LacZ, das für
das sehr große
und stabile Enzym β-Galactosidase codiert.
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Aequorin
ist ein Photoprotein, das wie die β-Galactosidase in einem Chemilumineszenz-Assay
nachgewiesen wird.
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Da
Aequorin (MG 22514) fünfmal
kleiner ist als die β-Galactosidase (MG
116351), kann es in einer größeren Menge
akkumulieren, was zu einer höheren
Empfindlichkeit des Assays führt
und die Hinauf- bzw. Hinunterregulation des Leitungswegs (aktivierende
oder hemmende Wirkung der Testverbindung) besser angibt.
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Außerdem tritt
beim Hefe-Assay manchmal eine Kontamination mit Bakterien auf und
die meisten Kontaminanten exprimieren physiologisch eine β-Galactosidase.
Die kontaminierten Kulturen würden
in Gegenwart des Substrats für
die β-Galactosidase
ein sehr starkes Signal geben. Durch die Verwendung von Aequorin kann
man das Risiko von falsch-positiven Ergebnissen aufgrund von Kontamination
ausschalten.
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Insgesamt
kann gesagt werden, daß Aequorin
geeigneter als β-Galactosidase
ist.
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Aequorin
kann funktional von der Hefe S. cerevisiae exprimiert werden (Nakajima-Shimada
et al., 1991a).
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Aequorin
kann in einem Lumineszenz-Assay in Gegenwart von Coelenterazin und
Ca2+ leicht nachgewiesen werden.
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Aequorin
ist bis jetzt noch nicht als Reportergen für die Signalwegaktivität (wie dies
für LacZ
und HIS3 beschrieben wurde, wo ein mit einem G-Protein gekoppelten
Rezeptor aus einem Säugetier
mit dem Hefepheromon-Leitungsweg gekoppelt wurde) eingesetzt worden
(King et al., 1990; Hadcock und Pausch, 1999).
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Die
Kontrolle der Mating-Signaltransduktion in der Hefe durch einen
Säugetierrezeptor
(den β2-adrenergen
Rezeptor) wurde zuerst im Jahr 1990 beschrieben (King et al., 1990).
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Die
US 5 876 951 A beansprucht
Hefezellen, die gentechnisch so verändert wurden, daß sie Ersatzstoffe
für das
Pheromonsystemprotein produzieren, sowie ihre Verwendungen (pFUS1-lacZ-
und pFUS1-Luciferase).
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Aequorin
wird als transduktionswegabhängiger
Reporter eingesetzt: Das Aequorin-Reportergen wird dann nur bei
Aktivierung des interessierenden Transduktionswegs exprimiert. Für die Mischung
der Aktivität des
Pheromonreaktions-Leitungsweg zum Beispiel wird die Expression des
Reportergens Aequorin von einem Promotor, der einige "Pheromone Responsive
Elements" enthält, kontrolliert.
Der am häufigsten
verwendete Promotor ist der FUS1-Promoter. In haploiden Zellen von
Saccharomyces cerevisiae regulieren GPCRs den Paarungsvorgang. Der
Ste2-Rezeptor weist das Vorhandensein von Zellen des entgegengesetzten
Paarungstyps nach (und zwar durch die Bindung von Peptid-Paarungspheromonen)
und aktiviert intrazelluläre
heterotrimäre
G-Proteine, wodurch der Paarungsvorgang initiiert wird. Gpa1 (α-Untereinheit) wird
von dem βγ-Komplex
(Ste4-Ste18-Komplex),
der stromabwärts
gelegene Elemente des Pheromonreaktionsleitungswegs, der eine gut
charakterisierte Proteinkinase (MAP-Kinase)-Kette beinhaltet, aktiviert,
dissoziiert. Der aktivierte Transkriptionsfaktor Ste12 kann dann
die Transkription von mehreren Mating-Factor-induzierbaren Genen
wie FUS1 initiieren.
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Unter
der Kontrolle eines pheromonabhängigen
Genpromoters wird Aequorin proportional zur Aktivierung des Hefepheromon-Transduktionswegs
exprimiert. Das Aequorinnachweissignal quantifiziert die Aktivität des Leitungswegs.
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Pheromonreaktionselemente
sind erforderlich und ausreichend für die basale und pheromoninduzierte Transkription
des FUS1-Gens von Saccharomyces cerevisiae (Hagen et al., 1991).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte Hefezelle umfassend
eine für
Aequorin codierende Sequenz unter der Kontrolle eines Promoters
eines Mating-Factor-induzierbaren Gens, des FUS1-Promoters oder
eines Teils davon, z. B. 4PRE. In einer speziellen Ausführungsform
der Erfindung ist die für
Aequorin codierende Sequenz SEQ ID NO. 1. In einer weiteren speziellen
Ausführungsform
der Erfindung exprimiert die modifizierte Hefezelle ein weiteres
heterologes Protein, vorzugsweise ein zu untersuchendes heterologes
Protein. Beispiele für
solche anderen heterologen Proteine sind Zelloberflächenproteine,
z. B. mit G-Proteinen
gekoppelte Rezeptoren oder Kinasen. Hefezellen, die modifiziert
werden können,
sind zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe und Candida albicans. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die
Verwendung der modifizierten Hefezellen, z. B. für das Durchmustern von Verbindungen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen, die die von einem heterologen Zelloberflächenprotein
vermittelte Aequorinexpression modulieren, wobei
- (a)
eine modifizierte Hefezelle, die eine für Aequorin codierende Sequenz
unter der Kontrolle des Promoters eines Mating-Factor-induzierbaren
Gens umfaßt,
- (b) die modifizierte Hefezelle mit einer Verbindung inkubiert
wird und
- (c) das Ausmaß der
Aequorinexpression bestimmt wird.
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Unsere
Beobachtungen zeigen, daß Aequorin
der β-Galactosidase in
einem Transduktionsweg-abhängigen
Reporter-Assay überlegen
ist.
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1:
offenes Leseraster des Aequorins (SEQ ID NO. 1)
-
2:
4PRE-Sequenz (SEQ ID NO. 2)
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3:
Restriktionskarte von p78 4PRE-Aeq
-
4:
Restriktionskarte von p78 4PRE-lacZ
-
5:
Ergebnisse der Leitungswegaktivitätsreporter/Aequorin-Aktivität
-
6:
Ergebnisse der Leitungswegaktivitätsreporter/β-Galactosidase-Aktivität
-
7:
Ca2+-abhängige
Erzeugung von Lumineszenz durch den Aequorinkomplex, der Apoaequorin (APO)
und Coelenterazin enthält
(Ohmiya und Hirano, 1996).
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Beispiele
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Beispiel 1: Material und Methoden
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Als
Hefestamm wurde W303 MAT a, far::hisG, sst2::URA3FOA,
fus1::HIS3 verwendet.
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Der
Hefestamm wurde mit den verschiedenen Plasmiden nach der Lithiumacetatmethode
transformiert (Ito et al., 1983).
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Beispiel 2: Konstruktion der Aequorin-Expressionsvektoren
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Das
Vollängen-cDNA-Aequoringen
wurde mittels PCR unter Verwendung des chimären mitochondriellen Aequorins
mtAEQ (bei dem das verkürzte
N-terminale Ende mit dem Adressierungssignal des menschlichen Cytochrom
C fusioniert ist (Rizzuto et al., 1992) als Matrize amplifiziert.
Der 5'-PCR-Primer
enthielt die 50 ersten Nukleotide der Aequorin-Wildtypsequenz und
eine EcoRI-Klonierungsstelle
(unten fettgedruckt). Der 3'-Primer
enthielt keine Klonierungsstelle.
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Die
Vollängen-Wildtyp-Aequorin-Codiersequenz
(1) wurde dann in den Pheromon-Transduktionsweg-abhängigen Expressionsvektor
p78-4PRE (TRP1, 2μ)
kloniert (3).
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Der
minimale ausreichende Abschnitt des FUS1-Promoters (Hagen et al.,
1991), den wir 4PRE nennen, besteht aus den letzten 261 Bp der Promotorregion
stromaufwärts
des offenen Leserasters von FUS1. Dieser Promoter wurde mit den
folgenden beiden Primern aus der genomischen DNA der Wildtyp-Hefe
amplifiziert:
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Beispiel 3: Konstruktion der β-Galactosidase-Expressionsvektoren
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Um
den Vergleich zu ermöglichen,
wurde LacZ auf gleiche Art und Weise wie das Aequorin in denselben
Expressionsvektor und ohne irgendeine Fusion mit der 5'-Sequenz eines endogenen
Gens subkloniert (wie häufig
zwecks Erhöhung
des Expressionsniveaus getan ist wird (King et al., 1990)).
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Die
Vollängen-β-Galactosidase-Gensequenz
aus Escherichia coli wurde in den pheromontransduktionswegaktivitätsabhängigen Expressionsvektor
p78-4PRE (TRP1, 2μ)
kloniert (4).
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Beispiel 4: Nachweis des Aequorins
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Die
Zellen werden in eine(r) weißen
96-Well-Platte in einem Volumen von 100 μl verteilt und/oder gezüchtet.
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30
Minuten vor dem Meßzeitpunkt
werden 10 μl
einer Lösung
von 5 μM
Coelenterazin (Molecular Probes) in jedes Näpfchen gegeben (um zu einer
Endkonzentration von 0,5 μM
zu gelangen), um die Zellen zu beschicken.
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Anschließend wird
die Platte die letzten 30 Minuten bei 30°C inkubiert.
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Der
Nachweiß des
Aequorins erfolgt in einem Luminometer mit Einspritzsystem (Luminoskan,
Labsystems). Für
jedes Näpfchen
wird unmittelbar nach dem Einspritzen einer 10 mM CaCl2-Lösung (1
M CaCl2, verdünnt mit Lysepuffer Y-PER der
Fa. Pierce) das Lumineszenzsignal 15 Sekunden lang integriert.
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Um
den Zwischenschritt des Beschickens zu vermeiden, ist es möglich, Coelenterazin
zu Beginn des Assays in das Medium einzubringen: Coelenterazin wird
in einer Konzentration von 0,5 μM
zugegeben.
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Beispiel 5: Nachweis der β-Galactosidase
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Die
Zellen werden in eine(r) weißen
96-Well-Platte in einem Volumen von 100 μl verteilt und/oder gezüchtet. Zum
Meßzeitpunkt
wird jedes Näpfchen
mit 100 μl
einer Mischung für
den Nachweis von β-Galactosidase
(Galscreen, Tropix) versetzt.
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Die
Platte wird eine Stunde lang bei 28°C inkubiert.
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Das β-Galactosidase-Signal
wird in einem Luminometer abgelesen; das Lumineszenzsignal wird
0,5 Sekunden lang integriert.
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Beispiel 6: Klassischer Reporter einer
Leitungswegsaktivität
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In
diesem Assay hängt
die Expression der beiden Reportergene von der Aktivität des Pheromone-Mating-Leitungswegs ab (Leberer
et al., 1997). Der 4PRE-Minimalpromoter,
der aus der FUS1-Promoterregion amplifiziert wurde (Hagen et al.,
1991), wird nur bei einem Mating-Signal aktiviert. Dieses Signal
wird durch Stimulation des Pheromonrezeptors Ste2 durch seinen Liganden α-Faktor hervorgerufen.
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Drei
Kolonien des Hefestamms, der entweder mit dem Plasmid p78 4PRE-AEQ
oder p78 4PRE-LacZ transformiert wurde, wurden in entsprechendem
Medium (SC Glucose-Trp)
bis zur stationären
Phase gezüchtet
und dann mit demselben Medium (beim Aequorin-Stamm mit 0,5 μM Coelenterazin),
das 0, 10–7,
10–9,
10–11 M α-Faktor (Sigma)
enthielt, verdünnt.
Die Platten wurden dann 3, 6 und 24 Stunden lang bei 30°C und 700 U/min
geschüttelt.
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Um
den Vergleich zwischen den beiden Reportern und die unterschiedlichen
Stimulationszeiten zu ermöglichen,
wurden die gemessenen Nachweiszahlen von Aequorin (5)
und β-Galactosidase
(6) als Verhältnis
zwischen stimuliert und nicht stimuliert ausgedrückt.
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Nach
dreistündiger
Stimulation ist das nachgewiesene Verhältnis bei 1 nM oder 100 nM α-Faktor für Aequorin
bereits höher
als für β-Galactosidase
(Verhältnis
bei Aequorin 8 und 14 bzw. bei β-Galactosidase
4 und 7). Nach 6stündiger
Stimulation verbleibt das β-Galactosidase-Verhältnis auf
demselben Niveau (Verhältnis
7 bei beiden α-Faktor-Konzentrationen),
der Nachweis mit Aequorin ergibt jedoch höhere Niveaus (Verhältnis 11
bei 1 nM α-Faktor
und 36 bei 100 nM α-Faktor). Nach 24stündiger Stimulation
verbleiben die Aequorinzahlen höher
als die β-Galactosidase.
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Insgesamt
zeigt dieser Versuch, daß Aequorin
die Stimulation von Ste2 bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen
innerhalb eines weiten Zeitbereichs besser widerspiegelt als die β-Galactosidase.
-
Literaturverzeichnis:
-
- Brini M, Pinton P, Pozzan T und Rizzuto R (1999) Targeted
Recombinant Aequorins: Tools for Monitoring [Ca2+] in
the Various Compartments of a Living Cell. Microsc Res Tech 46:
S. 380-389.
- Detheux M (2000) Orphan Receptors: the Quest for New Drug Targets.
Innovations in Pharmaceutical Technology 00: S. 27-34.
- Hadcock JR und Pausch M (1999) Ligand screening of G protein-coupled
receptors in yeast, in G Protein-Coupled
Receptors (Hrsg.: Haga T und Berstein G) S. 49-69, CRC Press LLC, Boca Raton, Floride.
- Hagen DC, McCaffrey G und Sprague G F J (1991) Pheromone Response
Elements Are Necessary and Sufficient for Basal and Pheromone-Induced
Transcription of the FUS1 Gene of Saccharomyces Cerevisiae. Mol Cell
Biol 11: S. 2952-2961.
- Iida H, Yagawa Y und Anraku Y (1990) Essential Role for Induced
Ca2+ Influx Followed by [Ca2+]i Rise in Maintaining Viability of
Yeast Cells Late in the Mating Pheromone Response Pathway. A Study
of [Ca2+]i in Single Saccharomyces Cerevisiae Cells With Imaging
of Fura-2. J Biol Chem 265: S. 13391-13399.
- Inouye S, Aoyama S, Miyata T, Tsuji F I und Sakaki Y (1989)
Overexpression and Purification of the Recombinant Ca2+-Binding
Protein, Apoaequorin. J Biochem (Tokyo) 105: S. 473-477.
- Ito H, Fukuda Y, Murata K und Kimura A (1983) Transformation
of Intact Yeast Cells Treated With Alkali Cations. J Bacteriol 153:
S. 163-168.
- Johnson FH und Shimomura O (1978) Bioluminescence and Chemiluminescence:
Introduction to the Bioluminescence of Medusae, With Special Reference
to the Photoprotein Aequorin. Methods Enzymol 57: S. 1-653.
- King K, Dohiman H G, Thorner J, Caron M G und Lefkowitz R J
(1990) Control of Yeast Mating Signal Transduction by a Mammalian β2-Adrenergic
Receptor and Gs Alpha Subunit [Erratum publié in Science 1991 Jan 11;
251 (4990): 144]. Science 250: pp 121-1 23.
- Leberer E, Thomas D Y und Whiteway M (1997) Pheromone Signalling
and Polarized Morphogenesis in Yeast. Curr Opin Genet Dev 7: S.
59-66.
- Miller AL, Karplus E und Jaffe L F (1994) Imaging [Ca2+]i With Aequorin Using a Photon Imaging
Detector. Methods Cell Biol 40: S. 305-338.
- Nakajima-Shimada J, Iida H, Tsuji F I und Anraku Y (1991a) Galactose-Dependent
Expression of the Recombinant Ca2(+)-Binding Photoprotein Aequorin
in Yeast. Biochem Biophys Res Commun 174; S. 115-122.
- Nakajima-Shimada J, Iida H, Tsuji F I und Anraku Y (1991b) Monitoring
of Intracellular Calcium in Saccharomyces Cerevisiae With an Apoaequorin
CDNA Expression System. Proc Natl Acad Sci USA 88: S. 6878-6882.
- Ohmiya Y und Hirano T (1996) Shining the Light: the Mechanism
of the Bioluminescence Reaction of Calcium-Binding Photoproteins. Chem Biol 3:
S. 337-347.
- Rizzuto R, Simpson A W, Brini M und Pozzan T (1992) Rapid Changes
of Mitochondrial Ca2+ Revealed by Specifically Targeted Recombinant
Aequorin [Erratum publié in
Nature 1992 24-31 Dez.; 360(6406): 768]. Nature 358: S. 325-327.
- Sheu YA, Kricka L J und Pritchett D B (1993) Measurement of
Intracellular Calcium Using Bioluminescent Aequorin Expressed in
Human Cells. Anal Biochem 209: S. 343-347.
- Shimomura O und Johnson F H (1978) Peroxidized Coelenterazine,
the Active Group in the Photoprotein Aequorin. Proc Natl Acad Sci
U SA 75: S. 2611-2615.
- Stables J, Mattheakis L C, Chang R und Rees S (2000) Recombinant
Aequorin As Reporter of Changes in Intracellular Calcium in Mammalian
Cells. Methods Enzymol 327: S. 456-471.
- Thomas AP und Delaville F (1991) The Use of Fluorescent Indicators
for measurements of cytosolic-free calcium concentration in cell
populations and single cells, in Cellular Calcium: A Practical Approach
(Hrsg.: McCormack JG und Cobbold PH) S. 1-54.
-
Schlüssel zu den Figuren
-
Fig.
3
Fig.
4
Fig.
5
| raw
data | Rohdaten |
| stimulation
time | Stimulationsdauer |
| hours | Stunden |
| α-factor | α-Faktor |
| mean | Mittelwert |
| stand
dev. | Standardabweichung |
| ratio | Verhältnis |
| Aequorin
expression | Expression
von Aequorin |
| relative
light units | relative
Lichteinheiten |
Fig.
6
| raw
data | Rohdaten |
| stimulation
time | Stimulationsdauer |
| hours | Stunden |
| α-factor | α-Faktor |
| mean | Mittelwert |
| stand
dev. | Standardabweichung |
| ratio | Verhältnis |
| Aequorin
expression | Expression
von Aequorin |
| relative
light units | relative
Lichteinheiten |
| β-Galactosidase | Durch
den α-Faktor |
| expression
induced by | induzierte
Expression von |
| α-factor | β-Galactosidase |
Fig.
7
| coelenterazine | Coelenterazin |
| coelenteramide | Coelenteramid |
