DE69935313T2 - Nachweisverfahren für peptide - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft generell ein Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten einer Protein-Protein Interaktion sowie Agentien zur Verwendung hierfür. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Inhibitoren biologischer Interaktionen umfassend Protein- und/oder Nukleinsäuremoleküle sowie insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung von Peptidinhibitoren biologischer Interaktionen, welche adverse Wirkungen auf lebende Zellen, Gewebe oder Organismen haben. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel bereit, durch welche eine große Anzahl Peptid-basierter therapeutischer, prophylaktischer und diagnostischer Reagenzien entwickelt werden können.
  • Allgemein
  • Diese Beschreibung umfasst Nucleotid- und Aminosäuresequenzinformationen hergestellt unter Verwendung des Programmes Patentln Version 2.0, dargestellt nach den bibliographischen Angaben. Jede Nucleotid- oder Aminosäuresequenz wird in der Sequenzliste durch numerische Indikatoren <210> gefolgt durch Sequenzidentifizierern (z. B. <210>1, <210>2, etc.) identifiziert. Die Länge, der Typ der Sequenz (DNA, Protein (PRT), etc.) sowie der Ursprungsorganismus jedes Nucleotides oder jeder Aminosäuresequenz werden durch Informationen indiziert, die jeweils in den numerischen Indikatorfeldern <211>, <212> und <213> bereitgestellt werden. Nucleotid- und Aminosäuresequenzen, auf die in der vorliegenden Beschreibung Bezug genommen werden, werden durch die Informationen definiert, die in den numerischen Indikatorfeldern <400> gefolgt durch Sequenzidentifizierer (z. B. <400>1, <400>2, etc.) bereitgestellt werden.
  • Bibliographische Details der Publikationen, auf die numerisch in der Beschreibung Bezug genommen wird, werden am Ende der Beschreibung gemeinsam dargestellt.
  • Der Ausdruck „erhalten von", wie hierin benutzt, soll so aufgefasst werden, dass er indiziert, dass ein spezifischer Integer von einem bestimmten Ursprung erhalten werden kann, obwohl er nicht notwendiger Weise direkt von diesem Ursprung erhalten werden muss.
  • In der Beschreibung wird das Wort „umfassen" oder Variationen, wie zum Beispiel „umfasst" oder „umfassend" durchgehend, außer der Kontext erfordert eine andere Deutung, so verstanden, dass es impliziert, dass die genannten Schritte oder Elemente oder Integer oder Gruppen von Schritten oder Elementen oder Integern umfasst sind, aber nicht bestimmte andere Schritte oder Elemente oder Integer oder Gruppen von Elementen oder Integern ausgeschlossen werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Biologische Interaktionen, wie zum Beispiel Protein-Protein Interaktionen, Protein-Nuclein-Interaktionen, Protein-Liganden-Interaktionen und Nucleinsäure-Nucleinsäure-Interaktionen, sind in einer breiten Vielfalt von Prozessen, die in lebenden Zellen stattfinden, involviert. Agonisten und Antagonisten von Rezeptoren können zum Beispiel durch spezifische Liganden, umfassend Wirkstoffe, Hormone, second messenger Moleküle, etc. eine Vielfalt an biologischen Prozessen, wie zum Beispiel Genexpression, zellulärer Differentiation und Wachstum, Enzymaktivität, Metabolitenfluss und Metabolitenaufteilung zwischen zellulären Kompartimenten neben anderen, beeinflussen. DNA-Protein- und RNA-Protein-Interaktionen sind bekannt für ihre Wirkungen in der Regulation der Genexpression sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen zusätzlich üben sie einen kritischen Einfluss auf die DNA Replikation und, im Falle bestimmter Viren, auf die RNA Replikation.
  • Unerwünschte und unangemessene Genexpression und/oder zelluläre Differentiation, zellulärer Wachstum und Metabolismus können, zumindest in vielen Fällen, biologischen Interaktionen umfassend die Bindung und/oder Aktivität von Proteinmolekülen, wie zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, Peptidhormonen, Rezepturmolekülen und Enzymen neben anderen, zugeordnet werden.
  • In einem Beispiel ist es bekannt, dass mehrere Gene, die durch chromosomale Translokationen in lymphoiden Malignitäten aktiviert werden, Transkriptionsfaktoren, zum Beispiel MYC, LYL-1 und SCL, welche über eine Protein-Proteininteraktion funktionieren, kodieren. In normalen Zellen befinden sich diese Proteine in einem angemessenen Gleichgewicht mit ihren Interaktionspartnern, welches als Konsequenz der Onkogenaktivation gestört ist, und es wird angenommen, dass diese in der Transkription von Zielgenen resultiert, die normal in anderen Zellen oder Linien exprimiert werden. Diese Transkriptionsfaktoren können ebenfalls die Funktion eng verbundener endogener Proteine ersetzen oder antagonisieren, und so die Genexpression essenzieller und normaler Wachstumskontrollen stören.
  • Peptide stellen mögliche therapeutische und prophylaktische Agenzien für viele Humane und tierische Erkrankungen, biochemische Störungen, adverse Wirkstoffeffekte dar, da sie mit anderen Molekülen hoch spezifisch interagieren können. Über mimetische Peptide wurde zum Beispiel berichtet, dass sie Proteininteraktionen und/oder Enzymfunktionen inhibieren. Weitere spezifische Beispiele umfassen ein Nonapeptid erhalten aus der Ribonucleotidreduktase des Herpessimplexviruses, welches an einer Enterotoxin Untereinheit zum Transport in Zellen über dessen Rezeptor verbunden ist. Es wurde gefunden, dass der Peptidzusammenschluss Herpessimplex Typ I Replikation in ruhenden Verozellen (Marcello et al. 1994) inhibiert. Unter Verwendung des detaillierten Wissens über die PCNA-Interaktionsdomäne von p21WAF1 wurde ein Peptid designed, welches wirksam diese Interaktion blockiert. Dieses 20-mer Peptid bindet mit ausreichender Affinität, um die SV40 Replikation zu blockieren (Warbrick et al. 1996). Es wurde gefunden, dass eine 20-mer Peptidsequenz erhalten aus p16 mit cdk4 und cdk6 interagiert und pRB-Phosphorolation und Zellzyklus-Progression inhibiert (Fahraeus 1996). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Peptide als Inhibitoren in Tiermodellen funktionieren. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass bei einem Peptid Targeting die ICE Protease ein potenter protektiver Inhibitor gegen Leberapoptose, welche durch TNF-α in Mäusen induziert wird (Rouquet et al. 1996), darstellt.
  • Ein großes Problem, welches im Gebiet der Peptidtherapeutika und Prophylaktika gelöst werden muss, ist die Identifikation spezifischer Aminosäuresequenzen, die eine wünschenswerte antagonistische oder agonistische Aktivität gegen bestimmte biologische Interaktionen in einem bestimmten zellulären Milieu haben.
  • Zusätzlich ist unter Betrachtung der großen Anzahl möglicher Anwendungsgebiete von Peptidtherapeutika die mögliche Anzahl verwendbarer Aminosäuresequenzen enorm. Dies stellt ein besonderes Problem in Bezug auf die Identifizierung aus einem großen Pool möglicher verwendbarer Aminosäuresequenzen dar, wobei diese Aminosäuresequenzen eine spezifische Aktivität unter bestimmten zellulären Bedingungen aufweisen.
  • WO 95/20652 beschreibt ein „forward-split" Hybridsystem, dass mittels eines Repressors operiert, sodass durch Inhibierungen der Interaktion zwischen zwei proteinbindenden Partnern die Aktivierung der Expression eines Tet-GST Gens verhindert wird, wodurch die Expression eines Reportergenes dereprimiert wird, worin die Expression der interagierenden Proteine operativ unter Kontrolle eines nicht-induzierbaren Promotors operiert. Mendelson et al., Curr. Opinion Biotechnology 5, 482–486, 1994 gibt einen Überblick über „forward-split" zwei-Hybridsysteme und empfiehlt die Verwendung von gegen-selektierbaren Reportergenen in einer Interaktionsfalle, um gegen transkriptionale Aktivierungen auszuwählen. WO 96/32503 beschreibt verschiedene reverse zwei-Hybrid Assays unter Verwendung gegen-selektierbarer Reportergene, in welchen die Expression der interagierenden Proteine operativ unter Kontrolle des nicht-induzierbaren Hefe ADH1 Promotors operiert.
  • Es sind zur Zeit keine reversen Hybrid Assay Verfahren zum Screening von zufälligen Peptidbibliotheken in vivo mit dem Ziel spezifische Peptide zu identifizieren erhältlich, welche spezifische Proteininteraktionen inhibieren ohne eine Leaky-Expression der gegen-selektierbaren Reportergene und dabei unangemessenen Zelltod verursachen. Dementsprechend besteht ein Bedarf an der Entwicklung von Technologien, welche eine schnelle Bestimmung von verwendbaren Peptidtherapeutika im großen Maßstab bereitstellen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung eines Peptides, Oligopeptides oder Polypeptid Antagonisten einer Protein-Protein-Interaktion, die zwei oder mehrere interagierende Proteine in einer Wirtszelle umfasst, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (i) Herstellung einer Peptidbibliothek in einem zellulären Wert, wobei die transformierten Zellen der Bibliothek eine erste Nucleotidsequenz umfassen, welche ein gegen-selektierbares Reportermolekül kodieren, das geeignet ist, Zellwachstum und/oder Entwicklung zu reduzieren, wenn es in der Wirtszelle exprimiert wird und dessen Expression operativ unter Kontrolle der Protein-Proteininteraktion, die zwei oder mehrere interagierende Proteine umfasst, durchgeführt wird, sowie eine zweite Nucleotidsequenz, welche das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid operativ unter Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz platziert, kodiert und wobei die Expression der interagierenden Proteine unter Kontrolle einer GAL1 Promotorsequenz durchgeführt wird;
    • (ii) Kultivierung des zellulären Wirts für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, dass die Expression der zweiten Nucleotidsequenz stattfindet und
    • (iii) Auswahl von Zellen, wobei die Expression des Reportermoleküls modifiziert ist und wobei die modifizierte Expression eine inhibierte, herabgesetzte oder unterdrückte Protein-Protein-Interaktion indiziert.
  • Peptide, Oligopeptide und Polypeptidantagonisten können durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend ein Peptid, Oligopeptid und Polypeptidantagonisten einer Protein-Protein-Interaktion, die durch die Verfahren identifiziert wurden, und ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Lösungsmittel können ebenfalls hergestellt werden.
  • Ein Shuttle-Vektor kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, welcher geeignet ist zur Expression einer ersten Aminosäuresequenz, die durch eine zweite Nucleotidsequenz als eine Fusion mit einer zweiten Aminosäuresequenz kodiert ist, in welcher sie konformativ abhängig ist, worin dieser Shuttle-Vektor zumindest umfasst:
    • (i) eine erste Expressionskassette umfassend:
    • (a) eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion der zweiten Nucleotidsequenz, die diese erste Aminosäuresequenz kodiert, wobei die mutiple Klonierungsstelle an eine oder mehrere Nucleotidsequenzen angrenzt, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder ein Polypeptidloop kodieren, sodass ein Fusionspeptid hergestellt wird, dass geeignet ist, zwischen der ersten und der zweiten Aminosäuresequenz hergestellt zu werden;
    • (b) zwei oder mehrere Tandem-Promotorsequenzen, zu welchen die zweiten Nucleotidsequenzen, die ein nucleares Lokalisationsmotiv und/oder ein Polypeptid loop kodieren, operativ verbunden sind, wobei eine dieser Promotorsequenzen ein bakteriell-exprimierbarer Promotor ist und wobei eine dieser Promotorsequenzen ein Hefe-exprimierbarer Promotor ist und
    • (c) eine Terminatorsequenz, die an die multiple Klonierungsstelle angrenzt und fern von der Promotorsequenz liegt und diese Nucleotidssequenzen ein nucleares Lokalisationsmotiv und/oder ein Polypeptid loop kodieren;
    • (ii) einen bakteriellen Replikaktionsursprung und
    • (iii) ein eukaryontischen Replikationsursprung.
  • In einer alternativen Ausgestaltung umfasst der Shuttle-Vektor in dem erfindungsgemäßen Verfahren ferner eine zweite Expressionskassette, die ein selek tierbares Markergen umfasst, das mit zwei oder mehreren Promotorsequenzen verbunden und upstream der Terminatorsequenz platziert ist, wobei eine dieser Promotorsequenzen ein bakteriell-exprimierbarer Promotor und wobei eine dieser Promotorsequenzen ein Hefe-exprirnierbarer Promotor ist.
  • In einer alternativen Ausgestaltung ist der Shuttle-Vektor, der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, weiter modifiziert, um Expressionen in Säugetierzellen zu ermöglichen, wobei die erste und zweite Expressionskassette Säugetierzell-exprimierbare Promotor- und Terminatorsequenzen in einem Tandem-Array umfasst, wobei die Promotor- und Terminatorsequenzen bereits in den Expressionskassetten vorhanden sind.
  • In einer alternativen Ausgestaltung umfasst der Shuttle-Vektor, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, die Nucleotidsequenz des Plasmid pBLOCK-1 (SEQ ID NO:1) oder eine Variante hiervon, die CMV und SV40 Promotoren und die SPA Terminatorsequenz umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine Diagrammdarstellung des Hefe/E.Coli Shuttle-Vektors pBLOCK-1. Positionen der ADH1, T7, EM7 und TEF1 Promotoren sind indiziert. Pfeile indizieren die Richtung der Transkription. Die CYC1 und ADH Terminatorsequenzen werden jeweils durch den Begriff CYC1 und ADHT beschrieben. Die EM7 und TEF1 Promotoren regulieren die Expression des Zeocinresistenten Gens, während die ADH1 und T7 Promotoren die Expression eines Nucleinsäuremoleküls reguliert, das jeweils in die multiple Klonierungsseite (EcoRi....PstI) in Hefe und in Bakterienzellen eingefügt wurde, worin dieses Nucleinsäuremolekül als ein Fusionspeptid, Oligopeptid oder Polypeptid mit SV40 nuclearem Lokalisationsignal (SV40 NLS) und das V5 Epitop exprimiert wird.
  • 2 ist eine Diagrammdarstellung des Säugetier/Hefe/E.coli Shuttle-Vektors pBLOCK-2. Der pBLOCK-2 Vektor ist identisch mit dem pBLOCK-1 Vektor mit Ausnahme der Anwesenheit der säugetierexprimierbaren CMV und SV40 Promotoren und der SPA Terminatorsequenzen.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen
  • In der Arbeit, die zur vorliegenden Erfindung führte, versuchten die Erfinder neue Screeningverfahren zur Identifizierung potentieller Peptid-basierter Verbindungen zu entwickeln, welche geeignet sind, biologische Interaktionen umfassend Proteine oder Polypeptide zu modulieren. Die Erfinder haben unter Verwendung von Gentechnologie ein zelluläres Genexpressionssystem entwickelt, in welchem die Wirkung einer Peptid-basierten Verbindung auf jede spezifische Interaktion umfassend ein Proteinmolekül durch Kupplung proteininteraktionsabhängiger Genexpression zur zellulären Vermehrungsfähigkeit und/oder Rezepturgenexpression getestet werden kann. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung allgemein ein Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten einer Protein-Proteininteraktion und Agentien, die hierfür geeignet sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Dedektion von Inhibitoren biologischer Interaktionen umfassend Protein- und/oder Nucleinsäuremoleküle und sowie insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung von Peptidinhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen, welche adverse im Wirkungen auf lebende Zellen, Gewebe und Organismen haben. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel bereit, durch welche eine große Anzahl an Peptid-basierten therapeutischen, prophylaktischen und diagnostischen Reagenzien entwickelt werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Peptides, Oligopeptides oder Polypeptidantagonisten einer Protein-Proteininteraktion umfassend zwei oder mehrere interagierende Proteine in einer Wirtszelle bereit, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst:
    • (i) Herstellung einer Peptidbibliothek in einem zellulären Wirt, wobei die transformierten Zellen der Bibliothek eine erste Nucleotidsequenz umfassen, welche ein gegen-selektierbares Reportermolekül kodieren, dass geeignet ist, Zellwachstum und/oder Entwicklung zu reduzieren, wenn es in der Wirtszelle exprimiert wird, und dessen Expression operativ unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion, die zwei oder mehrere interagierende Proteine umfasst, durchgeführt wird, sowie eine zweite Nucleotidsequenz, welche dass Peptid, Oligopeptid, oder Polypeptid, das operativ unter Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz platziert ist, kodiert und wobei die Expression der interagierenden Proteine unter Kontrolle einer GAL1 Promotorsequenz durchgeführt wird;
    • (ii) Kultivierung des zellulären Wirts für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, dass die Expression der zweiten Nucleotidsequenz stattfindet und
    • (iii) Auswahl von Zellen, wobei die Expression des Reportermoleküls modifiziert ist und wobei die modifizierte Expression eine inhibierte, herabgesetzte oder unterdrückte Protein-Protein-Interaktion indiziert.
  • Wie hierin benutzt, bedeutet der Begriff „biologische Interaktion" die physikalische Assoziation zwischen zwei oder mehreren Molekülen oder „Partnern", wobei diese Assoziation in einem zellulärem Prozess eingebunden ist oder alternativ zum Ablauf dieses zellulären Prozesses erforderlich ist. Diese „Assoziation" kann die Bildung eines induzierten magnetischen Feldes oder paramagnetischen Feldes, die Bildung kovalenter Bindungen, wie z.B. die Sulfidbrücken, Bildung zwischen Polypeptidmolekülen, ionischen Interaktionen, wie z. B. in einem lonengitter, Wasserstoffbindung oder alternativ einer van der Waals Interaktion, wie z. B. eine Dipol-Dipol-Interaktion, dipol-induzierte Dipol-Interaktion, induzierte Dipol-Interaktion oder eine repulsive Interaktion oder jegliche Kombinationen der vorstehenden Anziehungskräfte umfassen.
  • Zumindest zwei der Partner in einer biologischen Interaktion, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in einem Assey überprüft werden, sind Peptide, Polypeptide, Proteine oder Enzymmoleküle oder modifizierte Derivate hiervon. Gemäß dieser Ausgestaltung ist (sind) der (die) übrigen Partner Moleküle ausgewählt aus der Liste umfassend Nukleinsäure, wie z. B. Einzelstrang oder Doppelstrang RNA oder DNA, ein Peptid, Polypeptid, Protein, Enzym, Kohlenwasserstoff, Aminosäure, Nukleotid, Nukleosid, Lipid, Lipoprotein, Vitamin, Co-Enzym, Rezeptormolekül, Hormon, eine chemische Verbindung, zyklisches AMP, Metallion oder ein zweites Messengermolekül neben anderen.
  • Biologische Interaktionen, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung im Assay überprüft werden, sind demnach Protein-Protein-Interaktionen höherer Ordnung (d.h. tertiärer, quaternärer, etc.) Komplexe derselben (z. B. eine Protein-Protein-Interaktion).
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Protein-Protein-Interaktion, welche die Expression des gegen-selektierbaren Reportergens reguliert, eine Interaktion zwischen zwei Proteinen oder Polypeptidpartnern umfassen, welche geeignet ist, die Aktivität eines nicht-natürlich auftretenden Promotors zu regulieren, wodurch die Expression der ersten Nukleotidsequenz (welche die gegen-selektierbaren Reportermoleküle kodiert) zu welcher dieser Promotor operativ verbunden ist, geändert wird.
  • In einer alternativen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung umfasst der Verfahrensgegenstand weiter den Schritt der Einführung von ein oder mehreren weiteren Nukleinsäuremolekülen in den zellulären Wert, welche ein oder mehrere interaktive Proteine kodieren, die in der Protein-Protein-Interaktion in einem exprimierbaren Format, insbesondere operativ unter Kontrolle einer GAL1 Promotorsequenz platziert sind.
  • Die weiteren Nukleinsäuremoleküle können in den zellulären Wert eingebracht werden, bevor oder nachdem die Peptidbibliothek hergestellt wurde. Jegliche Standardmittel können für die Einführung verwendet werden, umfassend Waren zur Zell-Mating, Transformation oder Transfektion.
  • Die Anzahl der polypeptidbindenden Partner beträgt zumindest zwei und diese können von separaten DNA-Molekülen oder genetischen Konstrukten oder alternativ von einem einzelnen DNA-Molekül oder genetischen Konstrukt exprimiert werden, wobei die einzigen Erfordernisse darin bestehen, dass beide polypeptidbindenden Partner in jeder Zelle zur selben Zeit wie die zweite Nukleotidsequenz exprimiert werden und dass diese polypeptidbindenden Partner unter Bedingungen und für eine Zeit exprimiert werden, welche zur Bildung einer produktiven, biologischen Interaktion, die zur Modulierung der Expression der ersten Nukleotidsequenz ausreicht.
  • Dementsprechend kann der nicht-natürlich-auftretende Promotor, der die Expression des gegen-selektierbaren Reportergens reguliert, ein Derivat einer natürlich auftretenden Promotorsequenz oder einer synthetischen Promotorsequenz sein, ggf. umfassend LexA Operatorsequenzen oder GAL4 Bindungsseitensequenzen, zur Verwendung in der Modulation von Protein-Protein-Interaktionen umfassen, wobei einer der polypeptidbindenden Partner ein Protein darstellt, dass zur Erkennung und funktionellen Bindung an diese Sequenz geeignet ist. Gemäß dieser Ausgestaltung führt die biologische Interaktion zwischen den Partnern zur transkriptionalen Aktivierung der promotorregulierten Expression der ersten Nukleotidsequenz, z. B. durch Wiederherstellung eines funktionalen Transkriptionsfaktors, was zur Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls führt. Gemäß der Expression eines Polypeptides, Oligopeptides oder Polypeptides, welches zur Antagonisierung der Protein-Protein-Interaktion geeignet ist, z. B. durch Dissoziation der Bindung zwischen polypeptidbindenden Partnern oder durch kompetetive oder nicht-kompetetive Inhibierung der Bildung der Interaktion, wird die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls modifiziert.
  • Entsprechend kann die Protein-Protein-Interaktion einen Transkriptionsfaktor wiederherstellen, der sowohl zur Bindung mit einem Promotor/Operator als auch zur Aktivierung der Expressionen des gegen-selektierbaren Reportergens geeignet ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Protein-Protein-Interaktion zwei interagierende Proteine, die an einen dritten Bindungspartner binden, der ein Nucleinsäuremolekül umfasst, dass eine cis-Acting Sequenz, welche die Expression der ersten Nucleotidsequenz moduliert, umfasst.
  • Vorzugsweise:
    • (i) umfasst ein erstes interagierendes Protein einer Fusion einer DNA bindenden Domäne zwischen der DNA bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors und einer Aminosäuresequenz, die mit einem zweiten interagierenden Protein dimerisiert; und
    • (ii) umfasst das zweite interagierende Protein eine Aktivierung der Domänenfusion zwischen der transkriptionalen Aktivatordomäne und ei ner Aminosäuresequenz, die mit dem ersten interagierenden Protein dimerisiert;
  • Sodass die Dimerisierung zwischen dem ersten interagierenden Protein und dem zweiten interagierenden Protein einen funktionalen Transkriptionsfaktor produziert, der geeignet ist, an einen dritten Bindungspartner zu binden. Im Kontext zu dieser Ausgestaltung stellt die Assoziation zwischen dem ersten und dem zweiten interagierenden Protein einen funktionalen und neuen Transkriptionsfaktor oder alternativ ein transkriptionales Aktivatormolekül wieder her, welches die Expression des gegen-selektierbaren Reportergens aktiviert, wenn es an den dritten Partner umfassend Nucleinsäure gebunden ist, welches mit einer Operatorsequenz oder dem cis-Acting Element, wie zum Beispiel einem LexA Operator (zum Beispiel von ColE1-Promotor) oder einer GAL4-DNA-Bindungsseite (d.h. GAL4 wiedererkennende Sequenz) korrespondiert. In diesem Zusammenhang kann das exprimierte Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid die Expression des Reportergens unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion antagonisieren.
  • In einem erläuternden Beispiel dieser Ausgestaltung kann das erste interagierende Protein eine Fusion einer DNA bindenden Domäne zwischen GAL4-DNA oder LexA-Operator bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors und einer Aminosäuresequenz umfassen, welche zur Dimerisierung mit dem zweiten interagierenden Protein geeignet ist, sodass eine Region des SCL-Polypeptids zur Interaktion mit DRG-, E47- oder LMO2-Proteinen geeignet ist, wobei das zweite interagierende Protein eine Aktivierung der Domänenfusion zwischen einer transkriptionalen Aktivatordomäne (z.B. von GAL4 oder einem anderen genomischen Ursprung) und einer Region des DRG-, E47- oder LMO2-Proteins umfasst, welches zur Interaktion mit dem ersten interagierenden Protein geeignet ist und der dritte Bindungspartner eine nicht-natürlich-auftretende Promotorsequenz umfasst, welche die GAL4-Bindungsseite oder LexA-Operatorsequenzen zum "Andocken" an die DNA bindende Fusionsdomäne und anderen Sequenzen, wie zur Modulierung der Expression der gegen-selektierbaren Reportergene erforderlich unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion umfasst. Die Fusion der DNA bindenden Domäne und die Fusion der Aktivierungsdomäne sowie Peptide, Oligopeptide oder Polypeptide sind vorzugsweise fusionierte Proteine mit nuklearen Lokalisationssequenzen, um ihren Transport zu der Stelle der Transkription in einer eukaryontischen Zelle (d.h. dem Nucleus) insbesondere des SV40 großen T-Antigennuklear-Lokalisationssignals zu ermöglichen.
  • Vorzugsweise umfasst das gegen-selektierbare Reportermolekül URA3-Strukturgene, welche, wenn in Anwesenheit von 5-fluororotischer Säure unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion exprimiert wird, wird in einem reduzierten Zellwachstum oder Entwicklung oder Zelltod resultiert. In diesem Fall führt die Inhibierung der Protein-Protein-Interaktion durch das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid zu einer erhöhten Zellentwicklung oder Zelllebensfähigkeit in Anwesenheit von 5-fluororotischer Säure als Substrat.
  • Alternativ kann das gegen-selektierbare Reportergen CYH2 sein, welches ein Produkt kodiert, welches in Anwesenheit des Arzneistoffes Cycloheximid letal ist.
  • Alternativ kann das gegen-selektierbare Markergen LYS2 sein, welches Letalität in Anwesenheit des Arzneistoffes α-Aminoadipat (α-AA) überträgt.
  • Alternativ können mehr als eines der oben genannten gegen-selektierbaren Reportergene zusammen eingesetzt werden.
  • Die Protein-Protein-Interaktion kann ferner die Interaktion eines Adapterproteins mit den ersten und zweiten interagierenden Proteinen umfassen. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung ferner auf ein "Drei-Hybrid"-Screening angewendet werden, wobei ein Adapterprotein von der zweiten Nucleotidsequenz exprimiert wird und wobei dieses Adapterprotein zur Interaktion zwischen den ersten und zweiten interagierenden Proteinen erforderlich ist. In einer solchen erfindungsgemäßen Ausgestaltung können dieselben Zelllinien (d.h. Hefestämme oder andere zelluläre Wirte) in einem "Zwei-Hybrid"-Screening, wie hierin beschrieben, verwendet werden. In einem erläuternden Beispiel dieser Ausgestaltung wird die Peptidbibliothek in einer Hefezelllinie hergestellt, die eine erste Nucleotidsequenz trägt, welche die LexA- oder GAL4-Operatorsequenz operativ mit dem URA3-Reportergen verbunden umfasst und zur Expression der ersten und zweiten interagierenden Proteine mit der Maßgabe geeignet ist, dass zumindest eines dieser ersten und zweiten interagierenden Proteine zur Interaktion mit diesen LexA- oder GAL4-Operatorsequenzen geeignet ist und dass die tertiären Komplexe zwischen den ersten und zweiten interagierenden Proteinen und dem Adapter zur Interaktion mit dem dritten Bindungspartner (d.h. LexA oder GAL4) zur Aktivierung der Expression des URA3-Reportergens geeignet sind.
  • Z.B. kann das erste interagierende Protein einer Fusion der DNA bindenden Domäne zwischen der GAL4-DNA oder LexA-Operator bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors und einer Aminosäuresequenz, die mit dem Adapterpolypeptid dimerisiert, umfassen, während das zweite interagierende Protein eine aktivierende Fusionsdomäne zwischen einer transkriptionalen Aktivatordomäne, wie z.B. der GAL4-Aktivatordomäne, und einer Aminosäuresequenz, die mit dem Adapterprotein dimerisiert, umfasst.
  • Alternativ kann eine direkte Interaktion zwischen den ersten und zweiten interagierenden Proteinen bestehen, wobei volle transkriptionale Aktivität nur in Anwesenheit des Adapterproteins, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, auftritt.
  • Fachleute wissen, dass die vorliegende Erfindung modifiziert werden kann, um jegliche der Polypeptidbindenden Partner in entweder dem "Zwei-Hybrid"- oder "Drei-Hybrid"-Screeningformaten, wie hierin beschrieben, zu identifizieren.
  • In dem vorliegenden Kontext betrifft das Wort "Wirtszelle" oder "zellulärer Wirt" oder ähnliche Begriffe, prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die zur Unterstützung der Expression eines gegen-selektierbaren Reportermoleküls unter Kontrolle einer Protein-Protein-Interaktion geeignet sind, unabhängig davon, ob die Protein-Protein-Interaktion oder das Reportermolekül endogen zur Zelle ist oder ob nicht.
  • Fachleute wissen, dass eine "transformierte Zelle" eine Zelle darstellt, in welche exogene Nucleinsäure eingeführt wurde, wobei die exogene Nucleinsäure entweder in das Genom der Wirtszelle integriert wurde oder alternativ als extrachromosomales genetisches Element, wie z.B. ein Plasmid, Episom oder artifizielles Chromosom neben anderen erhalten bleibt.
  • Eine transformierte Zelle, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann jede Zelle sein, die zur Unterstützung der Expression von exogener DNA, wie z.B. einer Bakterienzelle, Insektenzelle, Hefezelle, Säugetierzelle oder Pflanzenzelle, geeignet ist. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die verwendete Wirtszelle in dem Verfahren der Erfindung eine Bakterienzelle, Säugetierzelle oder eine Hefezelle.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die Wirtszelle eine Hefezelle, weiter vorzugsweise eine Hefezelle des Genotyps MATα, ura3, trp1, his3.cyh2R, lexAop-URA3, lexAop-CYH2, ade2. Solch ein Hefestamm kann unter Verwendung von spontanen Cycloheximid-resistenten Derivaten von YPH252 (Sikorski et al., 1989) oder EGY40 (Golemis und Brent, 1992; Gyuris et al., 1993) erstellt werden.
  • Der Begriff "Expression" betrifft zumindest die Transkription einer Nucleotidsequenz zur Herstellung eines RNA-Moleküls. Der Begriff "Expression" kann ebenfalls die kombinierte Transkription und Translation einer Nucleotidsequenz zur Herstellung eines Peptids, Polypeptids, Proteins oder eines Enzymmoleküls oder alternativ das Verfahren der Translation von mRNA zur Herstellung eines Peptids, Polypeptids, Proteins oder eines Enzymmoleküls betreffen.
  • Durch "operativ unter Kontrolle" ist gemeint, dass ein genannter erster Integer durch einen genannten zweiten Integer reguliert oder kontrolliert wird.
  • In dem vorliegenden Kontext, wobei die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls operativ unter Kontrolle einer Protein-Protein-Interaktion ist, wird diese Expression modifiziert (d.h. erniedrigt oder unterdrückt), wenn ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das zur Antagonisierung der Bildung dieser Protein-Protein-Interaktion geeignet ist, exprimiert wird. Es reicht gewöhnlich nicht aus, dass nur ein interagierendes Protein für eine solche modifizierte Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls anwesend ist, allerdings kann eine gewisse Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls in der Anwesenheit lediglich eines Partners auftreten.
  • Wie hierin beschrieben, bedeutet der Begriff "Peptidbibliothek" einen Satz diverser Nucleotidsequenzen, die einen Satz Aminosäuresequenzen kodieren, wobei diese Nucleotidsequenzen vorzugsweise innerhalb eines geeigneten Plasmids, Cosmids, Bakteriophagen oder Virusvektormoleküls enthalten sind, welche zur Aufrechterhaltung und/oder Replikation in einem zellulären Wirt geeignet sind. Der Begriff "Peptidbibliothek" umfasst eine zufällige synthetische Peptidbibliothek, in welcher das Ausmaß der Diversität zwischen den Aminosäuresequenzen oder Nucleotidsequenzen häufig ist und eine limitierte Peptidbibliothek, in welcher ein geringerer Grad der Diversität zwischen diesen Sequenzen besteht. Der Begriff "Peptidbibliothek" umfasst ferner zufällige Aminosäuresequenzen, die aus einem zellulären Ursprung erhalten werden, wobei diese Aminosäuresequenzen durch eine zweite Nucleotidsequenz kodiert werden, welche Bakteriengenomfragmente, Hefegenomfragmente, Insektengenomfragmente oder kompakte Wirbeltiergenomfragmente neben anderen umfassen, wobei diese z.B. durch Fragmentierung oder teilweiser Verdauung der genomischen DNA unter Verwendung von Restriktionsendonucleasen neben anderen Ansätzen erhalten werden. Eine "Peptidbibliothek" umfasst ferner Zellen, virale Partikel und Bakteriophagenpartikel, welche die individuellen Aminosäuresequenzen oder Nucleotidsequenzen der diversen Sätze umfassen.
  • Bevorzugte Peptidbibliotheken, die zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden, sind "repräsentative Bibliotheken", welche einen Satz Aminosäuresequenzen oder Nucleotidsequenzen, welche diese selbst kodieren, umfassen, wobei alle möglichen Kombinationen an Aminosäuren oder Nucleotidsequenzen jeweils für eine spezifizierte Länge des Peptids oder der Nucleinsäuremoleküle umfasst sind.
  • Die Diversität der Peptidbibliotheken, insbesondere solcher, die aus genomischem Ursprung erhalten werden, kann mittels dem Fachmann bekannter Verfahren erhöht werden, sodass zufällige oder andere Mutagene auftreten. In einem erläuternden Beispiel zu dieser Ausgestaltung werden Peptidbibliotheken, die aus der Expression genomischer DNA erhalten werden, in bakteriellen Stämmen vergrößert oder vermehrt, welche in der Epsilon-(ε)-Untereinheit der DNA-Polymerase III (d.h. dnaQ- und mutD-Allele) und/oder in der Reparatur defekt sind. Escherichia-coli-Mutatorstämme umfassend mutY- und/oder mutM- und/oder mutD- und/oder mutT- und/oder mutA- und/oder mutC- und/oder mutS-Allele sind besonders geeignet für solche Anwendungen. Bakterielle Stämme, die solche Mutationen tragen, sind für den Fachmann jederzeit erhältlich und werden vollständig beschrieben z.B. durch Akiyama et al., 1989; Fijalkowska und Schaaper, 1995; Frick et al., 1995; Lu et al., 1995; Maki und Sekiguchi, 1992; Miller, 1992; Miller und Michaels, 1996; Moriya und Gollman, 1992; Schaaper und Cornacchio, 1992; Slupska et al., 1996 und Tajiri et al., 1995.
  • Eine Peptidbibliothek, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann Zellen, Virenpartikel oder Bakteriophagenpartikel, umfassend einen diversen Satz an Nucleotidsequenzen, welche einen diversen Satz an Aminosäuresequenzen kodieren, umfassen, wobei die Mitglieder des diversen Satzes an Nucleotidsequenzen unter operativer Kontrolle einer Promotorsequenz platziert werden, welche geeignet ist, die Expression der Nucleotidsequenz in diesen Zellen, viralen Partikeln oder Bakteriophagenpartikeln zu steuern.
  • Entsprechend kann das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, jede Aminosäuresequenzlänge von zumindest 1 bis 60 Aminosäuren umfassen und kann durch die Expression von Nucleotidsequenzen erhalten werden, welche durch jede der verschiedenen Verfahren, wie z.B. zufällig synthetische Generierung, hergestellt werden. Vorzugsweise ist das Peptid ein 20-mer-Peptid. Die Verwendung von längeren Fragmenten, insbesondere die Verwendung von zufällig fragmentierter Nucleinsäure, erhalten von bakteriellem, Hefe oder tierischem Genom, ist nicht ausgeschlossen.
  • Alternativ oder zusätzlich wird das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, als ein Fusionsprotein mit einem nuklearen Target-Motiv exprimiert, d.h. ein nukleares Lokalisationssignal (NLS), das geeignet ist, das Peptid gezielt zum Kern der Wirtszelle, worin Transkription stattfindet, zu führen, insbesondere das Hefe-operative SV40-nukleare Lokalisationssignal.
  • Alternativ oder zusätzlich kann das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, als ein Fusionsprotein mit einer Peptidsequenz exprimiert werden, die geeignet ist, die Penetration oder die Auf nahme des Peptids durch eine isolierte Zelle zu verstärken, erhöhen oder zu unterstützen, wie z.B., wenn das Subjekt-Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid ex vivo synthetisiert wird und in Kultur zu isolierten Zellen gegeben wird. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die Peptidsequenz geeignet, die Penetration oder Aufnahme in Insektenzellen oder tierischen Zellen zu vergrößern, erhöhen oder zu unterstützen, z.B. unter anderem die Drosophila penetrierende Target-Sequenz. Entsprechend dieser Ausgestaltung umfasst das Fusionsprotein zumindest die folgende Aminosäuresequenz, wie dargestellt in SEQ ID Nr. 4:
    CysArgGlnIleLysIleTrpPheGlnAsnArgArgMetLysTrpLysLys(Xaa)nCys
    oder ein Homolog, Derivat oder Analog hiervon, wobei Xaa jeden Aminosäurerest darstellt und n den Wert größer oder gleich 1 hat. Vorzugsweise ist der Wert für n zumindest 5, weiter bevorzugt zwischen ungefähr 5 und ungefähr 20, und noch weiter bevorzugt zwischen ungefähr 15 und ungefähr 35 und immer noch weiter bevorzugt zwischen ungefähr 30 und ungefähr 50 und immer noch weiter bevorzugt zwischen ungefähr 35 und ungefähr 55. In einer immer noch weiter bevorzugten Ausgestaltung ist der Wert für n zwischen zumindest ungefähr 40 und zumindest ungefähr 60.
  • Das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, kann ebenfalls in einer konstrahierten Konformationsform exprimiert werden. Aminosäuresequenzen, welche in einer konstrahierten Konformationsform exprimiert werden, können innerhalb eines zweiten Polypeptids als ein Fusionsprotein exprimiert werden, sodass sie effektiv in der Sekundärstruktur des zweiten Polypeptids "genestet" sind. Alternativ kann das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid durch oxidierende flankierende Cystein-Reste zirkularisiert werden, um konformationale Unterschiede zu limitieren. Dies kann besonders von Vorteil sein, wenn die Aminosäuresequenzen innerhalb einer Oberflächen-exponierten oder einer funktionalen Seite eines Proteins genestet sind, sodass sie zugänglich sind für die biologischen Interaktionen von Interesse. Beispielsweise kann das Peptid, die Oligopeptide oder Polypeptide in einer konstrahierten Konformationsform innerhalb eines Thioredoxin-(Trx)-Polypeptidloops exprimiert werden und/oder oxidierbare flankierende Cysteinreste umfassen. Die Expression der Peptide, Oligopeptide oder Polypeptide in einer konstrahierten Konformations form limitiert die Freiheitsgrade und die entropischen Kosten, die mit ihrer Bindung verbunden sind, wobei ein hoher Grad an Affinität und Spezifität zu der Interaktion übertragen wird, während sie nicht an eine bestimmte Mode-of-action-Theorie gebunden ist.
  • Der Bezug auf einen "Promotor" soll im weitesten Kontext aufgefasst werden und umfasst die transkriptionell regulatorischen Sequenzen eines klassischen genomischen Gens, umfassend die TATA-Box, welche erforderlich ist für die akkurate Transkriptionsinitiation in eukaryontischen Zellen, mit oder ohne einer CCAAT-Boxsequenz und zusätzlichen regulatorischen Elementen (d.h. upstream aktivierenden Sequenzen, Enhancen und Schaltern). Promotoren können ebenfalls ein TATA-Boxmotiv nicht aufweisen, aber eine oder mehrere "Initiatorelemente" umfassen oder, wie im Fall der Promotorsequenzen aus Hefe, ein oder mehrere "upstream Aktivatorsequenzen" oder "UAS"-Elemente umfassen. Zur Expression in prokaryontischen Zellen, wie z.B. Bakterien, sollte der Promotor zumindest die -35-Box- und -10-Boxsequenzen enthalten.
  • Ein Promotor ist üblicherweise upstream oder 5 von einem Strukturgen positioniert, welche dessen Expression reguliert. Des Weiteren sind die regulatorischen Elemente umfassend einen Promotor üblicherweise innerhalb 2 kb von der Startstelle der Transkription des Gens positioniert.
  • Im vorliegenden Kontext wird der Begriff "Promotor" ebenfalls verwendet, um ein synthetisches oder ein Fusions-Molekül oder ein Derivat, welches die Expression des Subjektreportermoleküls in einer Zelle aktiviert oder verstärkt, zu beschreiben. Bevorzugte Promotoren können zusätzliche Kopien eines oder mehrerer spezifischer regulatorischen Elemente enthalten, um die Expression der Gene weiter zu verstärken und/oder die räumliche und/oder temporäre Expression zu ändern. Beispielsweise können regulatorische Elemente, welche Kupfer-Induzierbarkeit verleihen, neben einer heterologen Promotorsequenz platziert werden, welche die Expression des Reporters driven, wodurch die Kupfer-Induzierbarkeit bei der Genexpression verliehen wird.
  • Platzierung eines Gens operativ unter Kontrolle einer Promotorsequenz bedeutet, dass das Gen so positioniert wird, dass dessen Expression durch die Promo torsequenz kontrolliert wird. Promotoren werden allgemein 5' (upstream) zu den Genen, die sie kontrollieren, positioniert. In der Konstruktion einer heterologen Promotor/Strukturgen-Kombination ist es allgemein bevorzugt, den Promotor in einer Entfernung von der Gentranskriptionsstartstelle zu platzieren, die ungefähr der gleichen Entfernung entspricht, die zwischen dem Promotor und dem Gen, das es kontrolliert, in dem natürlichen Setting, d.h., dem Gen, von welchem der Promotor erhalten wird, liegt. Wie fachbekannt, können einige Variationen in der Entfernung ohne Verlust der Promotorfunktion vorgenommen werden. In ähnlicher Weise kann die bevorzugte Positionierung eines regulatorischen Sequenzelementes in Bezug auf ein heterologes Gen, das unter dessen Kontrolle platziert wird, durch die Positionierung des Elementes in dessen natürlichen Setting, d.h. dem Gen, von welchem es erhalten wird, definiert werden. Es können wie fachbekannt ebenfalls einige Variationen in der Entfernung vorgenommen werden.
  • Beispiele für Promotoren, die zur Regulierung der Expression der gegenselektierbaren Reportermoleküle und/oder des Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, in einer Zelle, umfassend virale, fungale, Hefe, Insekten, tierische und pflanzlich erhaltene Promotoren, verwendet werden. Bevorzugte Promotoren sind geeignet, die Expression in einer eukaryontischen Zelle, beispielsweise einer Hefe- oder Säugetierzelle, zu übertragen. Der Promotor kann die Expression eines Gens konstitutiv oder differentiell mit Bezug auf das Gewebe, in welchem die Expression stattfindet, oder mit Bezug auf die Entwicklungsstufe, in welcher die Expression stattfindet, oder als Antwort auf externe Stimuli, wie z.B. unter anderem Umweltstress oder Hormone, regulieren.
  • Besonders bevorzugte Promotoren zur Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls und/oder des Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, umfassen natürlich vorkommende und synthetische Promotoren, welche die Bindungsstelle für Transkriptionsfaktoren enthalten, weiter bevorzugt für die Helix-Loop-Helix-(HLH)-Transkriptionsfaktoren, Zink-Fingerproteine, Leucin-Zipper-Proteine und ähnliche. Bevorzugte Promotoren können ebenfalls synthetische Sequenzen darstellen, umfassend ein oder mehrere upstream Operatorsequenzen, wie z.B. LexA-Operatorsequenzen oder aktivierende Sequenzen erhaltend von jeder der hier beschriebenen Promotoren, wie z.B. GAL4-DNA-Bindungsstellen. Fachleute werden erkennen, dass die Wahl des Promotors von der Natur der Zelle abhängt, die transformiert wird und dem Molekül, das exprimiert wird. Solche Personen sind geeignet zur Bestimmung der funktionalen Kombinationen der Minimumpromotorsequenzen und Operatoren für Zelltypen, in welchen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird.
  • Während die Erfindung vorzugsweise in Hefezellen durchgeführt wird, ziehen die Erfinder Modifikationen in Erwägung, worin die Erfindung gänzlich in Bakterien oder tierischen Zellen durchgeführt wird, die angemessene Promotoren nutzen, welche operativ die Expression der verschiedenen Assaykomponenten driven, in Kombination mit einem gegen-selektiven Reportergen, das in solchen Zellen arbeitet. Solche Ausgestaltungen sind innerhalb der (SIC) der Fachleute.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist der Promotor der Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls und/oder Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, eine Hefe-Promotor-, eine Säugetier-Promotor-, eine Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotor-Sequenz. Die Erfindung umfasst ferner das Screening von Blockern, die in Hefe-reversen Zwei-Hybrid-Screens, in Säugetier-Bioassays, in Toxizitäts- und/oder Vermehrungsassays in nachgeschalteten Screens ex vivo unter Verwendung von Shuttle-Vektoren, die in Hefe- und Säugetierzellen funktionieren, isoliert werden.
  • Zur Expression in Säugetierzellen ist es bevorzugt, dass der Promotor zur Expression des gegen-selektierbaren Promotormoleküls und/oder Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids, das durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert wird, die CMV-Promotor-Sequenz, mehr bevorzugt die CMVIE-Promotor- oder alternativ die SV40-Promotor- und insbesondere die SV40-Spätpromotor-Sequenz darstellt. Diese und andere Promotorsequenzen sind als geeignete Sequenzen für die Genexpressionen in tierischen Zellen wohl bekannt.
  • Beispiele für tierische Zellen, die vorliegend für solche Expressionen als geeignet dargestellt werden, umfassen COS, VERO, HeLa, Maus-C127, Chinesische- Hamster-Ovarius (CHO), WI-38, Babyhamsterleber (BHK) oder MDCK-Zelllinien neben anderen. Solche Zelllinien sind für Fachleute verfügbar.
  • Die Voraussetzung zur Herstellung intakter Polypeptide in Bakterienzellen und insbesondere in Escherichia-coli-Zellen, ist die Verwendung eines starken Promotors mit einer effektiven Ribosomen-Bindungsstelle, wie z.B. eine Shine-Dalgarno-Sequenz, welche in Expressionsvektoren, welche die ersten und zweiten Nucleotidsequenzen umfassen, oder in andere Genkonstrukte, die zur Durchführung der verschiedenen alternativen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen, inkorporiert werden kann. Typische Promotoren, die zur Expression des gegenselektierbaren Reportermoleküls und/oder Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids, die durch die zweite Nucleotidsequenz kodiert werden, in Bakterienzellen, welche z.B. E. coli umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, geeignet sind, sind der lacz-Promotor, temperatursensitive λL- oder λR-Promotoren, T7-Promotor oder der IPTG-induzierbare tac-Promotor. Eine Anzahl anderer Vektorsysteme, die für die Verwendung in E. coli wohl bekannt sind, werden beispielsweise in Ausubel et al. (1987) oder Sambrook of al. (1989) beschrieben. Zahlreiche Quellen für genetische Sequenzen, die zur Expression in Bakterien geeignet sind, sind ebenfalls öffentlich zugänglich in verschiedenen Plasmidkonstrukten, wie z.B. pKC30 (λL: Shimatake und Rosenberg, 1981), pKK173-3 (fac: Amann und Brosius, 1985), pET-3 (T7: Studier und Moffat, 1986) oder pQE-Serien der Expressionsvektoren (Qiagen, CA) neben anderen.
  • Geeignete prokaryontische Expressionszellen umfassen unter anderem Corynebakterium, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus sp. und Pseudomonas sp neben anderen. Bakterienstämme, welche für den vorliegenden Zweck geeignet sind, sind auf dem jeweiligen Fachgebiet wohl bekannt (Ausubel et al., 1987; Sambrook et al., 1989).
  • Wenn der Promotor dazu dient, die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls zu regulieren, dann umfasst der Promotor besonders bevorzugt eine oder mehrere Erkennungssequenzen zur Bindung an eine DNA bindende Domäne, erhalten aus einem Transkriptionsfaktor, beispielsweise einer GAL4-Bindungsstelle oder LexA-Operatorsequenz.
  • Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Reportermolekül" so aufgefasst werden, dass er sich auf jedes Molekül bezieht, welches geeignet ist, ein identifizierbares oder detektierbares Ergebnis zu liefern.
  • Ein Reportermolekül kann ein Enzym, Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid sein, welches ein visuelles Produkt umfasst oder zumindest, falls in Anwesenheit eines Substratmoleküls inkubiert, dieses Substrat zu einem visuellen Produkt konvertieren kann, sodass die Zellen, die das Reportermolekül exprimieren, detektiert werden können. Beispielsweise kann ein Reportergen ein Polypeptid kodieren, welches fluoresziert oder Fluoreszenz eines zweiten Moleküls verursacht, um die Detektion der Zellen, in denen die Expression des Reportermoleküls präsent oder nicht präsent ist, zu ermöglichen. Solche Anwendungen sind besonders geeignet für High-through-put-Wirkstoffscreeningversuche, wobei es wünschenswert ist, eine große Anzahl an Wirkstoffkandidaten schnell auf ihre Agonist/Antagonist-Eigenschaften mit Bezug auf die jeweilige biologische Interaktion zu screenen. Reportermoleküle, die für eine solche Anwendung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht hierauf beschränkt, Escherichia-coli-β-Galactosidaseenzym, Firefly-Luciferaseprotein (Ow et al., 1986; Thompson et al., 1991) und das grüne Fluoreszenzprotein (Prasher et al., 1992; Chalfie et al., 1994; Inouye und Tsuji, 1994; Cormack et al., 1996; Haas et al., 1996; vergleiche ebenfalls GenBank Accession Nr. U55762). Fachleuten ist es ohne unangemessene Experimentation bekannt, wie sie die genetischen Sequenzen, die solche Reportermoleküle kodieren, verwenden. Beispielsweise kann die kodierende Sequenz des Gens, das ein solches Reportermolekül kodiert, zur Verwendung in einer interessanten Zelllinie (beispielsweise menschlichen Zellen, Hefezellen) gemäß bekannter bevorzugter Codon-Verwendung modifiziert werden. Zusätzlich kann die translationale Effizienz von mRNA, erhalten aus nicht-eukaryontischem Ursprung, durch Mutation der korrespondierenden Gensequenz oder andernfalls durch Einführung einer Kozak-Konsens-Translations-Initialisationsstelle (Kozak, 1987) in die Gensequenz verbessert werden.
  • Gegen-selektierbare Reportermoleküle, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind solche, welche die Zellvermehrung oder Entwicklung, umfassend die Fähigkeit, Zelltod zu induzieren, reduzieren. In dem vorliegenden Kontext wird das gegen-selektierbare Reportermolekül durch die erste Nucleotidsequenz kodiert. Entsprechend ist es Fachleuten bekannt, dass das gegen-selektierbare Reportermolekül einer solchen Ausgestaltung, bevorzugt ein Peptid, Polypeptid, Enzym, Abzym oder ein anderes Proteinmolekül darstellt.
  • Das gegen-selektierbare Reportermolekül, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist bevorzugt geeignet, direkt oder indirekt die Vermehrung und/oder Entwicklung der Wirtszellen zu inhibieren. Direkte Modulation der Zellvermehrung und/oder Entwicklung besteht dann, wenn die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls eine direkte Konsequenz auf die Zellvermehrung und/oder Entwicklung hat. Indirekte Modulation der Zellvermehrung und/oder Entwicklung besteht dann, wenn die Expression des gegenselektierbaren Moleküls keine direkte Konsequenz auf die Zellvermehrung und/oder Entwicklung hat, aber die Expression die Zellvermehrung und/oder Entwicklung modulieren kann, wenn Zellen unter anderem in Anwesenheit eines geeigneten Co-Faktors oder Substratmoleküls kultiviert werden.
  • Wenn das gegen-selektierbare Reportermolekül ein Peptid, Polypeptid, Enzym, Abzym oder ein anderes Proteinmolekül darstellt, welches eine cytostatische Verbindung, anti-mitotische Verbindung oder ein Toxin umfasst, kann es einen direkten Effekt auf die Zellentwicklung oder Vermehrung haben, wenn es darin exprimiert wird.
  • Wenn es erwünscht ist, dass das gegen-selektierbare Reportermolekül einen indirekten Effekt auf die Zellvermehrung und/oder Entwicklung hat, kann dies beispielsweise ermöglicht werden durch Kupplung der Expression des Reportermoleküls mit der Produktion einer cytostatischen Verbindung, anti-mitotischen Verbindung, eines Toxins oder eines Moleküls, das die Vermehrung negativ reguliert.
  • Entsprechend einer weiteren Ausgestaltung stellt das gegen-selektierbare Reportermolekül ein Enzym dar, welches, falls in der Wirtszelle exprimiert, die Konversion eines Substratmoleküls, welches nicht geeignet ist, Zellvermehrung und/oder Entwicklung zu ändern oder einen Einfluss hierauf zu haben, katalysiert, um ein Produkt, welches ein Toxin, eine cytostatische Verbindung oder eine anti-mitotische Verbindung umfasst, zu produzieren. Entsprechend dieser Aus gestaltung führt die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls in Anwesenheit dieses Substrats zur Produktion einer ausreichend hohen Konzentration des Toxins, der cytostatischen Verbindung oder der anti-mitotischen Verbindung, welche die Zellvermehrung reduziert oder zum Zelltod führt.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wird, geeignet, die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls zu modulieren, wobei dies eine Indikation eines inhibierten, erniedrigten oder einer unterdrückten protein-Protein-Interaktion darstellt. Entsprechend ist das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid ein Antagonist der Protein-Protein-Interaktion, unter welcher die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls operativ platziert ist.
  • Wenn das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid ein Antagonist der Protein-Protein-Interaktion ist, dann wird die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls erniedrigt oder unterdrückt oder inaktiviert und, da das Reportermolekül direkt oder indirekt Zellvermehrung und/oder Entwicklung reduziert, wird die Zellvermehrung verstärkt sein. Da die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls direkt oder indirekt zum Zelltod führt, ermöglicht die Antagonisierung der biologischen Interaktion durch das antagonistische Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid das Überleben der Zellen im Vergleich zu Zellen, welche nicht den Antagonisten, aber das gegen-selektierbare Reportermolekül exprimieren.
  • Beispiele geeigneter gegen-selektierbarer Reportergene umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, URA3-Gen, wobei URA3-Expression toxisch für eine Zelle ist, die dieses Gen in Anwesenheit des Wirkstoffs 5-Fluoro-orotische Säure (5FOA) exprimiert. Andere gegen-selektierbare Reportergene umfassen CYH2 und LYS2, welche jeweils in Anwesenheit der Wirkstoffe Cycloheximid und α-Aminoadipat (α-AA) letal wirken.
  • Es werden Standardverfahren verwendet, um die erste und zweite Nucleotidsequenz in den zellulären Wirt einzuführen. Im Fall von Hefezellen kann dies durch Mass-mating oder Transformation erreicht werden.
  • In einer Ausgestaltung enthalten die ersten und zweiten Nucleotidsequenzen jeweils ein separates genetisches Konstrukt, weiter umfassend ein selektierbares Markergen, um die Detektion von transformierten Zellen zu ermöglichen, beispielsweise ein Antibiotika-resistentes selektierbares Markergen. Vorzugsweise sind die selektierbaren Markergene für jedes genetische Konstrukt unterschiedlich, sodass die Anwesenheit eines oder beider genetischen Konstrukte in einer Zelle ermöglicht werden kann. Die ersten und zweiten Nucleotidsequenzen können demzufolge in den zellulären Wirt durch Shotgun-Cotransformation und Selektion eines geeigneten Mediums, um die Anwesenheit beider selektierbarer Markergene auswählen zu können, eingebracht werden.
  • Alternativ können die ersten und zweiten Nucleotidsequenzen durch sequenzielle Transformation neben Selektion der geeigneten Markergene nach jeder Transformation eingebracht werden.
  • Alternativ können die ersten und zweiten Nucleotidsequenzen in separate Populationen der Wirtszellen eingebracht werden, welche anschließend gepaart werden, und solche Zellpopulationen, die beide Nucleotidsequenzen umfassen, werden in einem Medium, das Vermehrung der Wirtszellen, die erfolgreich mit sowohl den ersten und zweiten Nucleinsäuremolekülen transformiert wurden, selektiert.
  • Alternativ können die ersten und zweiten Nucleotidsequenzen in einem einzigen genetischen Konstrukt enthalten sein und in einem einzigen Schritt in die Wirtszellpopulation eingebracht werden. In einer solchen erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird die zufällige Peptidbibliothek gewöhnlich unter Verwendung eines Vektors hergestellt, welcher zumindest die erste Nucleotidsequenz operativ unter Kontrolle eines geeigneten Promotors mit oder ohne Operatorsequenz und ein selektierbares Markergen umfasst, wobei die Insertionsstelle für die zweite Nucleotidsequenz selektiert wird, sodass die insertierte zweite Nucleotidsequenz exprimierbar ist.
  • Diese Ausgestaltungen werden zusätzlich zu den Schritten durchgeführt, die in Beziehung zu der Einbringung der Nucleotidsequenzen stehen, welche eine oder mehrere der interagierenden Proteinvariationen, wie oben beschrieben, kodieren.
  • Die ausgewählten Wirtszellen können in Medium gescreent werden, welches die Komponenten umfasst, die erforderlich sind, um die gegen-selektierbaren Reportermoleküle zu verwenden. Wirtszellen, welche ein Peptid exprimieren, welches die Protein-Protein-Interaktion inhibiert, sind nicht geeignet, um adäquat die gegen-selektierbaren Reportergene zu transkribieren, wodurch sie erlauben, dass die Wirtszellen in dem Selektionsmedium leben. Diese Wirtszellen, die Peptide, Oligopeptide oder Polypeptide exprimieren, welche nicht geeignet sind, die Protein-Protein-Interaktion zu inhibieren, transkribieren die gegen-selektierbaren Reportergene, was in der Bildung eines Produktes resultiert, welches in Anwesenheit des Selektionsmediums toxisch für die Wirtszelle ist.
  • Das genetische Konstrukt kann in Form eines autonomen Replikationsvektors sein oder kann genetische Sequenzen umfassen, welche die Integration in ein Wirtszellgenom ermöglichen.
  • Alternativ kann die erste Nucleotidsequenz, die das gegen-selektierbare Reportermolekül kodiert, in das Chromosom der Wirtszelle durch homologe Rekombination der Produkte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder von Sequenzen eines anderen DNA-Moleküls, welches nicht geeignet ist, autonom in Hefezellen repliziert zu werden, integriert werden.
  • Die erste Nucleotidsequenz kann operativ in Verbindung mit einer Promotorsequenz, die geeignet ist, die Genexpression in der ausgewählten Wirtszelle zu regulieren, platziert sein. Üblicherweise wird die Wirtszelle so variiert, dass sie zu der Promotorsequenz passt.
  • Tatsächlich ermöglicht die vorliegende Erfindung die Identifizierung und Isolierung eines Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids, welches die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls durch Antagonisierung der Protein-Protein-Interaktion, welche erforderlich ist, damit die Expression stattfindet, moduliert. Wenn es erwünscht ist, eine spezifische Aminosäuresequenz zu isolieren, welche geeignet ist, eine bestimmte Protein-Protein-Interaktion zu modulieren, dann ist es nur notwendig, die Expression der ersten Nucleotidsequenz mit der Protein-Protein-Interaktion von Interesse operativ zu verbinden. Dies wird dadurch erreicht, dass die erste Nucleotidsequenz operativ in Verbindung mit einer Promotorsequenz, welche durch die Protein-Protein-Interaktion reguliert wird, platziert wird oder alternativ dadurch, dass eine Promotorsequenz, welche operativ mit dem ersten Nucleinsäuremolekül verbunden wird, genetisch manipuliert wird, wodurch die Promotorsequenz operativ unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion platziert wird.
  • In dem Fall, dass eine Protein-Protein-Interaktion eine Genexpression kontrolliert, wird der Promotor, der die Expression des ersten Nucleinsäuremoleküls kontrolliert, so ausgewählt, dass er die notwendigen cis-Acting-Elemente enthält, an welche zumindest ein Protein, das in der Interaktion bindet, involviert ist. Wenn kein komplettes Wissen über die cis-Acting-Sequenzen oder die trans-Acting-Faktoren, die in der Regulation der Genexpression involviert sind, besteht, aber die Promotorsequenz und der Zelltyp, in welchem die Expression stattfindet, bekannt sind, dann kann die erste Nucleotidsequenz operativ in Verbindung mit dieser Promotorsequenz platziert werden und das resultierende Nucleinsäuremolekül in diesen Zelltyp eingebracht werden. Solche eine Beziehung formt die Basis eines "Zwei-Hybrid"- oder "Drei-Hybrid"-Screeningansatzes (vgl. Allen et al., 1995 Review). Wenn das Peptid von Interesse die Protein-Protein-Interaktion antagonisiert, welche für die Expression der Aktivierung, Repression oder Verstärkung der Genexpression erforderlich ist, dann wird der Effekt durch die Aufnahme geänderter Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls identifiziert.
  • Im Wege lediglich eines Ausführungsbeispiels und ohne Limitierung der vorliegenden Erfindung hierauf haben die Erfinder gezeigt, dass die vorliegende Erfindung erfolgreich Peptide detektiert, die geeignet sind, die Expression des URA3- und/oder CYH2- oder LYS2-Gens, das operativ in Verbindung mit einem Promotor platziert ist, welcher geeignet ist, artifiziell durch die besagte Protein-Protein-Interaktion reguliert zu werden, insbesondere in Hefezellen zu modulieren. In dem Fall des LexA-basierten Assays wird der Promotor, der die Expression des gegen-selektierbaren Reportergens reguliert, ein oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfassen, während in dem Fall eines GAL4-basierten Assays der Promotor ein oder mehrerer GAL4-Bindungsstellen umfasst. Demzufolge können die interagierenden Proteine Transkriptionsfaktoren darstellen oder nicht, jedenfalls sind sie so konstruiert, dass sie bei Assoziierung miteinander als Hefetranskriptionsfaktoren funktionieren.
  • Die vorliegende Erfindung zieht weiter die Detektion von Peptiden, Oligopeptiden und Polypeptiden in Betracht, welche eine Protein-Protein-Interaktion in einer Säugetierzelle antagonisieren, wobei die Expression des gegen-selektierbaren Reportergens operativ unter Kontrolle einer Säugetier-exprimierbaren Promotorsequenz platziert wird, welche aberrant aktiv in pathogenen Situationen ist, z.B. ein onkogener Promotor, wie z.B. MYC. Die Aktivität solch eines Promotors würde in Zellen, die ein Peptid, Oligopeptid oder Peptid geeignet zur Inhibition des onkogenen Promotors in einer Säugetierzelle exprimieren, direkt blockiert werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Identifizierung eines Peptids, Oligopeptids oder Polypeptids verwendet werden, welche geeignet sind, eine Protein-Protein-Interaktion in einer Wirtszelle zu antagonisieren, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (i) Herstellung einer Peptidbibliothek in einem zellulären Wirt, wobei die transformierten Zellen der Bibliothek eine erste Nucleotidsequenz umfassen, welche ein gegen-selektierbares Reportermolekül kodieren, das geeignet ist, Zellwachstum und/oder Entwicklung der Wirtszelle zu reduzieren, wenn die Expression operativ unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion durchgeführt wird, und eine zweite Nucleotidsequenz, welche dieses Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das operativ unter Kontrolle einer Promotorsequenz platziert ist, kodiert;
    • (ii) Kultivierung des zellulären Wirts für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, dass die Expression der zweiten Nucleotidsequenz stattfindet und
    • (iii) Auswahl von Zellen, wobei die Expression des Reportermoleküls antagonisiert, unterdrückt oder reduziert wird.
  • Vorzugsweise umfasst das gegenständliche Verfahren einen zusätzlichen ersten Schritt oder einen späteren Schritt, wobei ein oder mehrere weitere Nucleinsäuremoleküle, welche ein oder mehrere interagierende Proteine, welche in der Protein-Protein-Interaktion involviert sind, in den zellulären Wirt operativ unter Kontrolle der GAL1-Promotorsequenz eingebracht werden. Solche Ausgestaltungen werden im Detail oben beschrieben.
  • Entsprechend dieser erfindungsgemäßen Ausgestaltungen ist es bevorzugt, dass das gegen-selektierbare Reportermolekül ein Peptid, Polypeptid, Enzym oder ein anderes Proteinmolekül umfasst, welches geeignet ist, ein unschädliches Substratmolekül in eine cytostatische Verbindung, eine antimitotische Verbindung oder ein Toxin zu konvertieren, sodass die antagonisierte Expression des Reportermoleküls durch das gegenständliche Peptid in Anwesenheit des Substrats Zelltod oder zumindest die Reduktion des Zellwachstums und/oder Entwicklung verhindert.
  • Besonders bevorzugt ist unter anderem das Reportergen URA3 und/oder CYH2, wie z.B. LYS2.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Reportermolekül ein Produkt des URA3-Gens, welches, wenn exprimiert, 5-Fluoroorotische Säure (5-FOA) in ein toxisches Produkt konvertiert.
  • Eine Ausgestaltung dieses Gegenstands zieht Vorteil aus der Tatsache, dass die meisten aktiven eukaryontischen Transkriptionsaktivatoren modular sind und eine DNA bindende Domäne und eine DNA-Aktivierungsdomäne umfassen, wobei die DNA bindende Domäne und die DNA-Aktivierungsdomäne auf demselben Proteinmolekül oder alternativ auf separaten Molekülen, welche interagieren, um die Genexpression zu regulieren, enthalten sein können. Entsprechend dieser Ausgestaltung wird die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls operativ unter Kontrolle einer Protein-Protein-Interaktion platziert, beispielsweise zwischen die onkogenen Proteine SCL und LMO2, welche binden, um einen aktiven artifiziellen Transkriptionsfaktor zu bilden. Die Transkription des gegenselektierbaren Reportergens kann deshalb als ein Indikator für zwei interagierende Proteine verwendet werden, wobei eines dieser besagten Proteine zumindest eine DNA bindende Domäne umfasst und an ein Operatorpromotorelement bindet, das upstream zu dem Reportergen ist, und dieses andere besagte Protein zumindest eine DNA-Aktivierungsdomäne umfasst. Bindung des DNA-Bindungsproteins mit dem Operator in Anwesenheit einer Funktionsaktivierungsdomäne initiiert Transkription des gegen-selektierbaren Reportergens. Der URA3-Reporter agiert so als gegen-selektierbarer Marker.
  • Diese Ausgestaltung kann zur Identifizierung von Aminosäuresequenzen, welche andere Protein-Protein-Interaktionen modulieren, dadurch adaptiert werden, das die DNA-Bindungsdomäne funktionell durch einen Transkriptionsfaktor mit einer unterschiedlichen DNA-Bindungsdomäne, welche spezifisch für ein unterschiedliches cis-Acting-Element in dem Promotor ist, der die Expression des gegenselektierbaren Reportermoleküls reguliert, ausgetauscht werden. Verfahren zur Herstellung solcher Fusionsproteine sind Fachleuten wohl bekannt. In solchen Fällen wird die Selektion einer geeigneten DNA-Bindungsdomäne von der Natur der DNA-Bindungsstelle abhängen, die upstream von dem gegenselektierbaren Reportergen lokalisiert ist.
  • Beispielsweise können Fusionsproteine zwischen ein Onkoprotein und eine DNA-Bindungsdomäne und/oder einer DNA-Aktivierungsdomäne eingebaut werden. Beispielsweise kann eine Nucleotidsequenz, die eine Nucleotidsequenz, die die Reste 176 bis 331 von SCL kodiert oder komplementär dazu ist, mit der LexA-DNA-Bindungsdomäne fusioniert werden und eine Nucleotidsequenz, die LMO2 kodiert, kann mit einer DNA-Aktivierungsdomäne fusioniert werden (oder vice-versa). Alternativ kann eine Nucleotidsequenz, die HOX11 kodiert, kann operativ mit der LexA-DNA-Bindungsdomäne gelinkt werden, und eine Nucleotidsequenz, die ein HOX11-Bindungsprotein kodiert, kann operativ mit einem DNA-Bindungsprotein gelinkt werden (oder vice-versa).
  • Das vorliegende Verfahren ist ebenfalls besonders geeignet für die Identifizierung von Peptiden, Oligopeptiden oder Polypeptiden, welche Protein-Protein-Interaktionen inhibieren, welche normalerweise einen schädigenden Effekt hervorrufen (neben dem schädigenden Effekt auf bestimmte Reportermoleküle), beispielsweise Interaktionen, welche onkogene Produkte involvieren. Spezifische Beispiele für Onkogene umfassen SCL und eine oder mehrere von DRG, E47 und/oder LMO2, wobei die Produkte Transkriptionsfaktoren bilden, welche die Tumorgenese unterstützen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls so adaptiert werden, dass es umfasst:
    • (i) Einbringung von ein oder mehreren Nucleinsäuremolekülen in diese Wirtszelle, welche zumindest umfasst:
    • (a) eine erste isolierte Nucleotidsequenz, welche ein gegen-selektierbares Reportermolekül kodiert, wobei diese Nucleotidsequenz operativ verbunden ist mit einer Operatorsequenz oder einer Transkriptionsfaktorbindungsstelle;
    • (b) einer zweiten Nucleotidsequenz, welche ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid kodiert; und
    • (c) ein oder mehrere weitere dritte Nucleotidsequenzen, welche zwei oder mehrere interagierende Proteine kodieren, wobei zumindest eines dieser interagierenden Proteine zumindest eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, die geeignet ist, mit der Operatorsequenz oder der Transkriptionsfaktorbindungsstelle zu binden und zumindest ein interagierendes Protein zumindest einer DNA-Aktivierungsdomäne oder ein Derivat hiervon umfasst, das geeignet ist zur Aktivierung der Expression der ersten Nucleotidsequenz, sofern der Promotor/Operator durch Interaktion mit einem anderen Protein, das die Erkennungs-DNA-Bindungsdomäne trägt, und wobei die Expression der interagierenden Proteine unter Kontrolle einer GAL1-Promotorsequenz platziert ist;
    • (ii) Kultivierung dieser Wirtszelle für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, dass die Expression der zweiten und weiteren Nucleotidsequenzen stattfinden; und
    • (iii) Auswahl von Zellen, wobei die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls inhibiert wird, wobei die inhibierte Expression ein Indikator für eine inhibierte, herabgesetzte oder unterdrückte Protein-Protein-Interaktion zwischen den interagierenden Proteinen darstellt.
  • Die Proteine, die in der Protein-Protein-Interaktion von Interesse involviert sind, welche durch ein oder mehrere weitere dritte Nucleotidsequenzen kodiert werden, werden in der Wirtszelle entweder durch eine oder mehrere fremde Nucleotidsequenzen synthetisiert, die in die Wirtszelle transformiert oder in das Genom der Zelle integriert wurden. Jedenfalls erstreckt sich die vorliegende Erfindung ganz klar auf Situationen, in welchen diese Sequenzen ebenfalls durch endogene Wirtszellgene kodiert werden.
  • Die DNA-Bindungsdomäne bindet an die Operatorsequenz und in Anwesenheit der DNA-Aktivierungsregion findet die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls statt. Wenn die zweite Nucleotidsequenz ein Peptid kodiert, welches die DNA-Bindung und/oder DNA-Aktivierung antagonisiert oder inhibiert, dann wird die Expression des gegen-selektierbaren Reportermoleküls unterdrückt, herabgesetzt oder in anderer Weise inhibiert.
  • Fachleute werden erkennen, dass die DNA-Bindungsdomäne und die DNA-Aktivierungsdomäne auf einem einzelnen Aminosäuremolekül enthalten sein kann oder alternativ können sie in separaten Aminosäuremolekülen, welche miteinander interagieren, um die Expression des gegen-selektierbaren Reportergens zu regulieren, enthalten sein.
  • In ähnlicher Weise können die ersten und/oder zweiten und/oder weitere Nucleotidsequenzen auf einem einzelnen Nucleinsäuremolekül enthalten sein oder beispielsweise in einem genetischen Konstrukt enthalten sein oder alternativ können ein, zwei, drei oder mehrere dieser Sequenzen auf separaten Nucleinsäuremolekülen enthalten sein. Wenn ein oder mehrere dieser Nucleotidsequenzen auf separaten Nucleinsäuremolekülen enthalten sind, dann wird jede dieser Nucleotidsequenzen weiter bevorzugt operativ mit seiner eigenen Promotorsequenz verbunden. Alternativ können Nucleotidsequenzen, wo zwei oder mehrere der Nucleotidsequenzen auf demselben Nucleinsäuremolekül enthalten sind, unter Kontrolle eines einzelnen Promotors oder alternativ unter Kontrolle von separaten Promotorsequenzen exprimiert werden.
  • Fachleute werden erkennen, dass die oben beschriebenen Alternativen in gleicher Weise für den Gegenstand der Erfindung zu verwenden sind.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter adaptiert werden, um die Schritte zu umfassen:
    • (i) Einbringung von einem oder mehreren Nucleinsäuremolekülen in eine eukaryontische Zelle, welche zumindest umfassen:
    • (a) eine erste isolierte Nucleotidsequenz, welche URA3 oder ein Derivat hiervon kodiert, operativ an eine LexA-Operatorsequenz oder GAL4-Bindungsstelle gelinkt;
    • (b) eine zweite Nucleotidsequenz, welche ein Fusionspeptid, Oligopeptid oder Polypeptid zwischen einer zufälligen Peptidsequenz und einer nuklearen Targetsequenz kodiert; und
    • (c) eine oder mehrere weitere Nucleotidsequenzen, welche zwei oder mehrerer interagierende Proteine kodiert, worin zumindest eines dieser interagierenden Proteine zumindest eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, die geeignet ist zur Bindung mit der Operatorsequenz oder mit der Bindungsstelle, und zumindest eines dieser interagierenden Proteine zumindest eine DNA-Aktivierungsdomäne oder ein Derivat hiervon umfasst, das geeignet ist zur Aktivierung der Expression der ersten Nucleotidsequenz, und wobei jede dieser interagierenden Proteine eine nukleare Targetsequenz umfasst und wobei die Expression der interagierenden Proteine unter Kontrolle einer GAL1-Promotorsequenz platziert ist.
    • (ii) Kultivierung dieser Wirtszelle für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, dass die Expression der zweiten und weiteren Nucleotidsequenzen stattfinden; und
    • (iii) Auswahl von Zellen, welche in einem Medium enthaltend 5-FOA wachsen.
  • Gegebenenfalls können die zweiten Nucleotidsequenzen ferner Cysteinreste, welche diese zufälligen Peptidsequenzen (z.B. NLS-Cys-(Xaa)n-Cys) flankieren, kodieren oder alternativ zusätzlich ein Polypeptidloop, in welcher diese zufällige Peptidsequenz konformationell konstrahiert ist, kodieren, um den Grad der konformationellen Freiheit, welche diese Peptide aufweisen können, wenn sie in einer Zelle exprimiert werden, zu limitieren.
  • Vorzugsweise ist die eukaryontische Zelle eine Hefezelle.
  • Vorzugsweise ist die nukleare Targetsequenz das SV40-nukleare Lokalisationssignal. Weiter vorzugsweise kodieren die weiteren Nucleotidsequenz(en) die interagierenden Proteine, wobei sie weiter eine Nucleotidsequenz umfassen, welche den Thioredoxin-(Trx)-Polypeptidloop kodieren und immer noch weiter bevorzugt das Fusionspeptid so exprimiert wird, dass es konformationell durch den Trx-Polypeptidloop konstrahiert ist.
  • Peptide, Oligopeptide und Polypeptide können durch das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren identifiziert werden, welche Antagonisten der Protein-Protein-Interaktionen darstellen.
  • Die identifizierten Peptide können Interaktionen antagonisieren oder inhibieren, welche schädigenden Effekte in eukaryontischen Zellen, insbesondere in humanen oder tierischen Zellen, hervorrufen und vorzugsweise antagonisieren oder inhibieren Interaktionen, welche ein oder mehrere Onkoproteine umfassen.
  • Die identifizierten Peptide, Oligopeptide und Polypeptide oder Fragmente oder Derivate hiervon können in der Prophylaxe oder therapeutischen Behandlung von Menschen oder Tieren verwendet werden. Behandlungsverfahren umfassen ihre Verwendung in Peptidtherapieregimen, wie z.B. in dem Behandlungsprotokoll für Patienten mit Leukämie und/oder soliden Tumoren. Ihre Verwendung in Behandlungsprotokollen für diese Patienten umfassen ihre Administration als ein Mittel zur Blockierung weiterer Zellteilung der malignen Zellen, beispielsweise wo SCL-Onkoproteine das Ziel darstellen, Arrest der malignen Zellteilung des Patienten. Das spezifische Ziel der Onkoproteine mit Pharmazeutika umfassend die se Peptide, wird die Nebenwirkungen, die durch Patienten erfahren werden, im Vergleich zu solchen erfahren durch konventionelle Chemotherapie reduzieren.
  • Behandlungsverfahren umfassen ebenfalls andere Erkrankungen, die von schädigender Expression aberranter biologischer Moleküle resultieren, welche mit normalen zellulären Funktionen interferieren.
  • Entsprechend kann eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert worden ist, und ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Lösungsmittel umfassen, hergestellt werden.
  • Solche eine pharmazeutische Zusammensetzung kann hergestellt werden, wobei dieses Peptid, Oligopeptid und Polypeptid, welches eine Protein-Protein-Interaktion antagonisiert, nachteilige Konsequenzen auf Zellwachstum und/oder Entwicklung hat, wie z.B. eine Onkoproteininteraktion.
  • Die pharmazeutischen Formen sind geeignet zur injizierbaren Verwendung umfassend sterile wässrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Puder zur extemporären Herstellung steriler, injizierbarer Lösungen oder Dispersionen oder können in Form einer Creme oder anderen geeigneten topischen Applikationen sein. Alternativ können injizierbare Lösungen in Liposomen verkapselt sein, um ihren Transport durch Zellmembranen zu unterstützen. Alternativ oder zusätzlich können solche Zubereitungen selbst aggregierende Porenstrukturen enthalten, um den Transport durch die Zellmembran zu ermöglichen. Sie müssen stabil unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen sein und müssen gegen Kontaminierung/destruktive Aktion von Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien und Pilzen, konserviert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium enthaltend beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und Ähnliches) geeignete Mischungen hiervon und pflanzliche Öle enthalten. Die geeignete Fluidität kann aufrechterhalten werden durch beispielsweise die Verwendung einer Beschichtung, wie z.B. Lecithin, durch das Aufrechterhalten der erforderlichen Partikelgröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen. Die Verhinderung der Aktion von Mikroorganis men kann durch verschiedene antibakteriell und antifungal wirkende Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thirmerosal und Ähnliches bewirkt werden. In vielen Fällen wird es von Vorteil sein, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzubringen. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann durch die Verwendung von Agenzien mit verzögerter Absorption, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, bewirkt werden.
  • Sterile injizierbare Lösungen können dadurch hergestellt werden, dass aktive Verbindungen in der erforderlichen Menge in dem geeigneten Lösungsmittel mit verschiedenen anderen Bestandteilen, wie oben aufgezählt, je nach Bedarf eingebracht werden und anschließend sterilfiltriert werden. Üblicherweise werden Dispersionen dadurch hergestellt, dass die verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile in ein Sterilvehikel eingebracht werden, welches das Basisdispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile, wie oben aufgezählt, enthält. In dem Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen bestehen die bevorzugten Herstellungsverfahren darin, dass Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, welche ein Pulver der aktiven Bestandteile plus jeden zusätzlichen erforderlichen Bestandteil der vorher sterilfiltrierten Lösung hiervon ergibt.
  • Wenn die aktiven Bestandteile in der geeigneten Weise geschützt sind, können sie oral appliziert werden, beispielsweise mit einem inerten Lösungsmittel oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger oder sie können in einer Hartkapsel oder einer Weichgelatinekapsel eingeschlossen sein oder sie können in Tabletten verpresst werden oder sie können direkt in die Nahrung oder diätetische Ernährung inkorporiert werden. Für die orale therapeutische Applikation können die aktiven Verbindungen mit Hilfsstoffen inkorporiert werden und in Form von verdaubaren Tabletten, Bukkaltabletten, Troches, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Wafern und Ähnlichen vorliegen. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten zumindest 1 Gew.-% der aktiven Verbindung enthalten. Der Prozentanteil in den Zusammensetzungen und Zubereitungen kann natürlich variiert werden und liegt günstigerweise zwischen ungefähr 5 bis ungefähr 80% des Gewichtes der Einheit. Die Menge der aktiven Verbindung in einer solchen therapeutisch geeigneten Zusammensetzung ist so, dass eine geeignete Dosie rung erhalten wird. Bevorzugte Zusammensetzungen oder Zubereitungen entsprechend der vorliegenden Erfindung werden so hergestellt, dass die Dosierungseinheit zwischen ungefähr 0,1 ug und 20 g der aktiven Verbindung enthält.
  • Die Tabletten, Troches, Pillen, Kapseln und Ähnliches können ebenfalls die nachfolgenden Komponenten enthalten: Ein Binder, wie z.B. Gummi, Akazia, Maisstärke oder Gelatine; Hilfsstoffe, wie z.B. Dicalciumphosphat; ein Trennmittel, wie z.B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und Änliches; ein Fließmittel, wie z.B. Magnesiumstearat, ein Süßungsmittel, wie z.B. Sucrose, Lactose oder Saccharin oder ein Aromastoff, wie z.B. Pfefferminze, Wintergreen-Oil [amerikanisches Immergrün] oder Kirschgeschmack. Wenn die Dosierungseinheit eine Kapsel darstellt, kann es zusätzlich zu den oben dargestellten Materialien einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Coatings vorhanden sein oder in anderer Weise die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet sein. Ein Sirup oder ein Elixier kann die aktive Verbindung, Sucrose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff und Aromastoff, wie z.B. Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Natürlich sollte jedes verwendete Material zur Herstellung jeder Dosierungseinheit pharmazeutisch rein und im Wesentlichen nicht toxisch sein, in den Mengen, in denen es verwendet wird. Zusätzlich können die aktive(n) Verbindung(en) in Sustained-release-Zubereitungen und Formulierungen inkorporiert werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur topischen Applikation, wie z.B. Cremes, Lotionen und Gels geeignet sein.
  • Pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Lösungsmittel umfassen jede und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Coatings, antibakteriell und antifungal wirkende Mittel, isotonische Mittel und absorptionsverzögernde Mittel und Ähnliches. Der Nutzen solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik wohl bekannt. Außer insofern, dass ein konventionelles Medium oder Agens inkompatibel mit dem aktiven Bestandteil ist, ist die Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen hiermit dargestellt. Zusätz liche aktive Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzung inkorporiert werden.
  • Es ist speziell von Vorteil, parenterale Zusammensetzung als Dosierungseinheit zur Vereinfachung der Applikation und Vereinheitlichung der Dosierung zu formulieren. Dosierungseinheit, wie hierin beschrieben, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die geeignet sind, Einzeldosierungen für die Behandlung von Säugetieren darzustellen; jede Einheit enthält ein vorbestimmtes Quantum des aktiven Materials, das so errechnet wird, dass es den erwünschten therapeutischen Effekt in Assoziation mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger hervorruft. Die Spezifizierung für neue Dosierungseinheiten der Erfindung werden durch (a) die eigenen Charakteristika des aktiven Materials und insbesondere des therapeutischen Effektes, der erreicht werden soll, und (b) die Limitationen, die inhärent mit der Verarbeitungstechnik eines solchen aktiven Materials zur Behandlung einer Erkrankung in lebenden Subjekten, die erkrankt sind, worin die körperliche Gesundheit wie hierin im Detail beschrieben, beeinträchtigt ist, diktiert wird oder direkt davon abhängt.
  • Der aktive Hauptbestandteil wird zur günstigen und effektiven Applikation in effektiven Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer Dosierungseinheit verarbeitet. Eine Dosierungseinheit kann beispielsweise die aktive Hauptverbindung in Mengen im Bereich von 0,5 μg bis etwa 2000 mg enthalten. Dargestellt in Proportionen, ist die aktive Verbindung üblicherweise anwesend von zwischen 0,5 μg bis 2000 mg/ml des Trägers. In dem Fall, dass die Zubereitungen zusätzliche aktive Bestandteile enthalten, werden die Dosierungen durch Referenz auf die übliche Dosis und Applikationsweise der Bestandteile ermittelt.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ebenfalls genetische Moleküle, wie z.B. ein Vektor, der geeignet ist, Zielzellen zu transfizieren, umfassen, wobei der Vektor ein Nucleinsäuremolekül trägt, der geeignet ist zur Inhibierung solcher schädigender Protein-Protein-Interaktionen. Der Vektor kann beispielsweise ein viraler Vektor sein.
  • Ein Shuttle-Vektor, der geeignet ist zur Expression einer ersten Aminosäuresequenz, die durch die zweite Nucleotidsequenz als eine Fusion mit einer zweiten Aminosäuresequenz, in welcher sie konformationell konstrahiert ist, kodiert wird, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, wobei der Shuttle-Vektor zumindest umfasst:
    • (i) eine erste Expressionskassette umfassend:
    • (a) eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion der zweiten Nucleotidsequenz, die die erste Aminosäuresequenz kodiert, wobei die multiple Klonierungsstelle an eine oder mehrere Nucleotidsequenzen angrenzt, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder ein Polypeptidloop kodieren, sodass ein Fusionspeptid hergestellt wird, das geeignet ist, zwischen der ersten und der zweiten Aminosäure hergestellt zu werden;
    • (b) zwei oder mehrere Tandempromotorsequenzen, zu welchen die zweite Nucleotidsequenz und die Nucleotidsequenzen, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder einen Polypeptidloop kodieren, operativ in Verwendung verbunden sind, wobei eine dieser Promotorsequenzen ein bakteriell-exprimierbarer Promotor ist und wobei eine dieser Promotorsequenzen ein Hefe-exprimierbarer Promotor ist; und
    • (c) eine Terminatorsequenz, die an die multiple Klonierungsstelle angrenzt und fern von der Promotorsequenz liegt und diese Nucleotidsequenzen ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder ein Polypeptidloop kodieren;
    • (ii) einen bakteriellen Replikationsursprung; und
    • (iii) einen eukaryontischen Replikationsursprung.
  • Der Shuttle-Vektor, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, umfasst zudem eine zweite Expressionskassette, die ein selektierbares Markergen umfasst, das mit zwei oder mehreren Promotorsequenzen operativ gelinkt ist und upstream von der Terminatorsequenz platziert ist, wobei eine dieser Promo torsequenzen ein bakteriell-exprimierbarer Promotor und wobei eine dieser Promotorsequenzen ein Hefe-exprimierbarer Promotor ist.
  • Der bakterielle Ursprung der Replikation kann ein ColE1-Ursprung und der eukaryontische Ursprung zur Replikation kann operativ zumindest in einer Hefezelle sein und bevorzugt 2 Mikron (2 μm) Ursprung der Replikation sein.
  • Vorzugsweise ist das selektierbare Markergen ein Zeocin-resistentes Gen (Zeocin ist ein Wirkstoff der Bleomycinfamilie, welches ein Marker der InVitrogen Corporation ist). Ein alternatives selektierbares Markergen ist AURI-C, welches eine Resistenz gegenüber dem antibiotischen Aureobasidin A aufweist. Fachleute kennen ebenfalls andere selektierbare Markergene, die geeignet sind zur Ausführung der vorliegenden Erfindung und die gegenständliche Erfindung ist nicht limitiert durch die Natur der selektierbaren Markergene.
  • Der bakteriell-exprimierbare Promotor kann jeder Promotor sein, der zur Regulation der Expression eines Gens zumindest in einer Bakterienzelle geeignet ist, vorzugsweise einer Escherichia-coli-Zelle. Beispiele geeigneter bakteriellexprimierbarer Promotoren umfassen den T3-Promotor, SP6-Promotor, T7-Promotor, lac-Promotor, tac-Promotor und EM7-Promotorsequenzen neben anderen.
  • Der Hefe-exprimierbare Promotor kann jeder Promotor sein, der zur Regulation der Expression eines Gens zumindest in einer Hefezelle geeignet ist.
  • Derivate solcher Promotoren können ebenfalls eingesetzt werden. "Derivate" dieser Promotoren umfassen funktionelle Mutanten, Teile, Fragmente, Homologe und Analoge. Üblicherweise können diese Promotoren mutagenen Verfahren ausgesetzt werden, um einzelne oder mehrfache Nucleotidsubstitutionen, Deletionen und/oder Additionen herzustellen. Insertionale Nucleotidderivate dieser Promotoren umfassen 5'- und 3'-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Nucleotiden. Beispielsweise können Promotoren durch Insertion zusätzlicher Sequenzen modifiziert werden, um die Expressionslevel zu verstärken oder zu modifizieren. Varianten insertionaler Nucleotidsequenzen sind solche, in denen ein oder mehrere Nucleotide an einer vorbestimmten Stelle in der Nucleotidsequenz eingebracht werden, obwohl zufällige Insertion ebenfalls mit geeignetem Screening des resultierenden Produktes möglich ist. Deletionsvarianten sind dadurch charakterisiert, dass ein oder mehrere Nucleotide von der Sequenz entfernt werden. Substitutionsnucleotidvarianten sind solche, in welchen zumindest ein Nucleotid in der Sequenz entfernt wurde und ein unterschiedliches Nucleotid an dieser Stelle eingesetzt wurde.
  • Der Terminator kann jede Terminatorsequenz darstellen, die in den Zellen, in denen sie verwendet werden soll, operiert. Beispiele von Transkriptionsterminatoren zur Verwendung in Hefezellen umfassen die CYC1- und ADH-Terminatoren. Die Verwendung zusätzlicher Terminatorsequenzen ist nicht ausgeschlossen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung umfasst die erste Expressionskassette ferner ein oder mehrere Nucleotidsequenzen, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder einen Polypeptidloop kodieren, wobei diese Nucleotidsequenzen innerhalb dieser Expressionskassette so angeordnet sind, dass die erste Aminosäuresequenz als ein In-frame-Fusionspolypeptid mit dem nuklearen Lokalisationsmotiv und/oder einem Epitop-Tag-Motiv und/oder einer Polypeptidloopdomäne synthetisiert wird.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das nukleare Lokalisationsmotiv die SV40-T-Antigen nukleare Lokalisationssequenz (SV40 NLS) und der Epitop-Tag ist der V5 (V5-Epitop) und das Polypeptidloop wird von Thioredoxin erhalten.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Shuttle-Vektor zumindest:
    • (i) eine erste Expressionskassette umfassend eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion einer zweiten Nucleotidsequenz, welche die erste Aminosäuresequenz kodiert, wobei die multiple Klonierungsstelle an eine oder mehrere Nucleotidsequenzen angrenzt, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder Epitop-Tag kodieren, das so positioniert ist, dass ein Fusionspolypeptid zwischen der ersten Aminosäuresequenz und dem nuklearen Lo kalisationsmotiv und/oder dem Epitop-Tag hergestellt werden kann, und wobei die zweite Nucleotidsequenz und die Nucleotidsequenzen, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder Epitop-Tag kodieren, ferner operativ an zwei oder mehrere Tandernpromotorsequenzen gelinkt sind und upstream von der Terminatorsequenz platziert werden und wobei eine dieser Promotorsequenzen ein bakteriell exprimierbarer T7-Promotor ist und wobei eine dieser Promotorsequenzen der Hefe-exprimierbare ADH1-Promotor und der Terminator ADH-Terminator ist;
    • (ii) eine zweite Expressionskassette umfassend ein selektierbares Markergen, das operativ an zwei oder mehrerer Tandempromotorsequenzen gelinkt ist und upstream von einer Terminatorsequenz platziert ist, wobei eine der Promotorsequenzen der bakteriell-exprimierbare EM7-Promotor ist und wobei eine der Promotorsequenzen der Hefe-exprimierbare TEF1-Promotor ist und der Terminator der CYC1-Terminator ist;
    • (iii) ein bakterieller Replikationsursprung; und
    • (iv) ein eukaryontischer Replikationsursprung.
  • Weiter bevorzugt wird die erste Aminosäuresequenz als ein Fusionsprotein sowohl mit einem nuklearen Lokalisationsmotiv und einem Polypeptidloop, in welchem es konformationell konstrahiert ist, hergestellt.
  • Weiter bevorzugt oder alternativ umfasst der erfindungsgemäße Shuttle-Vektor die Merkmale des Hefe-E.-coli-Shuttle-Vektors pBLOCK-1, hierin mit Bezug zu 1 beschrieben oder Varianten hiervon umfassen CMV- und SV40-Promotoren und die SPA-Terminatorsequenz. Die komplette Nucleotidsequenz des Vektors pBLOCK-1 ist ebenfalls hierin als SEQ ID Nr. 1 beschrieben. Die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 beschrieben, umfasst die folgenden Merkmale: ADH-Promotor innerhalb der Nucleotidpositionen 1 bis 430, T7-Promotor innerhalb der Nucleotidposition 431 bis 470; Translationsstartcodon (ATG) bei Nucleotidpositionen 471 bis 473; V5-Epitop-kodierende Region innerhalb der Nucleotidpositionen 474 bis 530; SV40-nukleares Lokalisationsmotivkodierende Region innerhalb der Nucleotidpositionen 531 bis 557; Polylinker (E coRI-PstI) bei Nucleotidpositionen 558–616; ADH-Terminator auftretend bei Nucleotidposition 670; und Zeocin-resistentes Gen auftretend bei Nucleotidposition 2864.
  • Eine Peptidbibliothek kann innerhalb eines Peptidloops (z.B. von Thioredoxinenzym), der in den Polylinker von pBLOCK-1 oder pBLOCK-2 kloniert ist, exprimiert werden, um ein Fusionsprotein im Rahmen mit einem nuklearen Lokalisationsmotiv und Epitop-Tag herzustellen.
  • Der hierin beschriebene Shuttle-Vektor unterscheidet sich von im voraus beschriebenen Vektoren dadurch, dass er ein universeller Shuttle-Vektor ist, der zur Verwendung in Multi-Step-Klonierungsverfahren in Wirtszellen mehr als einer Spezies designed ist.
  • Der gegenständliche Shuttle-Vektor kann ferner durch Einbringung Säugetierzellexprimierbarer Promotor- und Terminatorsequenzen in dem Tandem-Array mit den Promotor- und Terminatorsequenzen, die bereits in der Expressionskassette vorhanden sind, modifiziert werden, um eine Expression in Säugetierzellen zu ermöglichen. Der Vorteil eines solchen Arrangements liegt darin, dass Klone, welche wünschenswerte Aminosäuresequenzen exprimieren, basiert auf Screening-Assays, die in bakteriellen Zellen oder Hefezellen durchgeführt werden, direkt auf Säugetier-Bioassays transferiert werden können. Beispielsweise erlaubt diese Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren die Testung der Peptidklone, die aus Hefewirtszellen isoliert werden, auf biologische Aktivität in Säugetierwirtszellen, ohne dass es erforderlich ist, dass ein Subklonierungsschritt dieser Peptidnucleotidsequenz in einen Vektor, der zur Expression in Säugetierwirtszellen geeignet ist, vorgenommen werden muss. Dies vereinfacht sehr stark das Verfahren eines High-Through-Put-Screenings zur Blockierung schädlicher zellulärer Interaktionen.
  • Geeignete Säugetierzell-exprimierbare Promotorsequenzen umfassen jede Promotorsequenz, welche zumindest zur Regulation der Expression in einer Säugetierzelle geeignet ist. Beispiele geeigneter Promotoren umfassen die CMV-Promotorsequenz und SV40-Promotorsequenz neben anderen.
  • Geeignete Säugetierzell-exprimierbare Terminatorsequenzen umfassen die SPA-Terminatorsequenz, ursprünglich identifiziert durch Levitt et al., 1989, neben anderen.
  • Noch weiter bevorzugt umfasst der erfindungsgemäße Shuttle-Vektor die Merkmale des Säugetier/Hefe/E. coli/Shuttle-Vektor-pBLOCK-2, hierin beschrieben mit Bezug auf 2 oder ein Homolog, Analog oder Derivat hiervon.
  • Die Nucleotidsequenz, welche in die multiple Klonierungsstelle der ersten Expressionskassette insertiert wird, kann durch jede dem Fachmann bekannten Mittel generiert werden, wobei das einzige Erfordernis darin besteht, dass es eine Aminosäuresequenz kodiert. In den spezifischen Ausgestaltungen des hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens kann die gegenständliche Nucleotidsequenz eine zufällig-synthetisierte Oligonucleotid oder zufällig-fragmentierte genomische DNA, erhalten aus ein oder mehreren bakteriellen Genomen umfassen. Der vorliegenden Beschreibung ist zu entnehmen, dass zufällige Bibliotheken durch "Shotgun"-Klonierung von Pools dieser Nucleotidsequenzen in einen gegenständlichen Shuttle-Vektor generiert werden können, wodurch das Screening einer großen Anzahl an Peptid- oder Polypeptid-kodierender Klone in Hefe und/oder Bakterienzellen ermöglicht wird.
  • In Verwendung ist es insbesondere bevorzugt, dass die Nucleotidsequenz, welche in die multiple Klonierungsstelle der zweiten Expressionskassette insertiert wird, eine erste Peptid-kodierende Sequenz umfasst, die operativ unter Kontrolle der Promotorsequenzen ist, wobei diese Sequenz ein Epitop kodiert, welches geeignet ist, detektiert zu werden, wenn es auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird, um die physikalische Selektion eines Transfektanten zu ermöglichen. Entsprechend dieser Ausgestaltung werden nur solche Zellen, welche das Epitop exprimieren, geeignet sein, ebenfalls die klonierte Nucleotidsequenz zu exprimieren. Besonders bevorzugte Epitope gemäß dieser Ausgestaltung umfassen, sind aber nicht hierauf limitiert, Ratten-CD2 und Single-Chain-Antikörpermoleküle, das an eine transmembranäre Domäne gelinkt ist.
  • Es soll verstanden werden, dass der hierin beschriebene Shuttle-Vektor nicht auf die Verwendung in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren limitiert ist.
  • Beispielsweise können die pBLOCK-Vektorserien verwendet werden, um einen Agonisten oder Antagonisten jeder Protein-Protein-Interaktion in einer Zelle zu identifizieren, wie z.B. in dem Screening für Peptide, die geeignet sind eine Protein-Protein-Interaktion, die gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wird, zu perturbieren.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren und Vektoren können verwendet werden, um neue Wirkstoffe zu identifizieren, wie z.B. Antibiotika oder inhibierende Mittel. Tatsächlich ist die vorliegende Erfindung insbesondere geeignet für Wirkstoff-Screening-Protokolle, um Kandidatenantagonisten einer jeden Protein-Protein-Interaktion zu identifizieren. Beispielsweise können bakterielle Expressionssysteme in High-Through-Put-Screening für neue Antibiotika oder andere inhibitorische Agenzien, welche spezifische Protein-Protein-Interaktion als Ziel haben, verwendet werden. Die p-BLOCK-Vektorserien, die hierin beschrieben sind, sind besonders in solchen Anwendungen geeignet, in denen die darin enthaltene T7-Promotorsequenz, die bakterielle Expression ermöglicht. In den Anwendungen, in denen Nucleotidsequenz(en) in den pBLOCK-Vektor inkorporiert sind, welche exprimiert werden, tragen diese eine wie oben beschriebene geeignete bakterielle Translationsinitiationssequenz, (vgl. Beschreibung, die Seiten 20 und 21 überbrückt (Seite 22, 1. vollständiger Absatz der Übersetzung)). Die zweite Nucleotidsequenz kann ferner so exprimiert werden, dass die resultierenden Peptide innerhalb der aktiven Seite des Thioredoxinloops oder innerhalb der flankierenden Cysteinreste konstrahiert sind. Wie auch mit anderen Ausgestaltungen der Erfindung kann auch diese zweite Nucleotidsequenz synthetischen Ursprungs sein und/oder von genomischem Ursprung erhalten werden. Expression aus dem pBLOCK-Vektor wird durch Infektion von Bakterien erreicht, die die Plasmidbibliothek mit Bakteriophagen T7 enthalten oder alternativ durch Verwendung öffentlich zugänglichen Stämmen, wie z.B. E. coli BL21, welcher das T7-Polymerasegen unter lac-Kontrolle enthält, weil in solchen Stämmen IPTG zu dem Wachstumsmedium zugegeben werden kann, um die Expression des T7-Polymerasegens zu induzieren.
  • Die biologische Interaktion ist in der Abwesenheit des Wirkstoffs, der gescreent wird, funktional und Perturbation der Interaktion wird in Anwesenheit einer Kandidatenwirkstoffverbindung geassayt, wobei eine modifizierte Reporterge nexpression in der Weise detektiert wird, wie sie oben für andere Ausgestaltungen der Erfindung beschrieben wird.
  • Die Merkmale der vorliegenden Erfindung werden vollständiger in den folgenden nicht limitierenden Beispielen beschrieben. Es ist jedoch zu verstehen, dass diese detaillierte Beschreibung alleine für den Zweck als Beispiele der vorliegenden Erfindung aufgenommen wurden. Es soll in keinster Weise als eine Restriktion der breiten Beschreibung der oben beschriebenen Erfindung verstanden werden.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion des Plasmidvektor-pBLOCK-1
  • Zur Konstruktion des Plasmidvektors pBLOCK-1 (1; <400>1) wird das LexA-Gen von dem Plasmid pHybLex/Zeo (Invitrogen Corporation) durch Verdauung mit HindIII entfernt und religierf, um pHybLex/Zeo/ΔLexA herzustellen. Der T7-Promotor und die SV40-nukleare Lokalisationssequenz, die in dem Plasmid pY-EStrp anwesend sind, werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemäß folgender Primer amplifiziert:
    • 1. 5'-gagagagaagcttccccggatcggactactagc-3' (d.h. <400>2); und
    • 2. 5'-gagagagagctcgaattcagctacctttctcttcttttttggagg-3' (d.h. <400>3).
  • Das PCR-Produkt wird mit HindIII und Ecl136II verdaut und dann in das Zwischenplasmid pHybLex/Zeo/ΔLexA, welches vorher mit denselben Enzymen verdaut wurde, kloniert, um pBLOCK-1 herzustellen.
  • Beispiel 2
  • Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen
  • Ein gegen-selektierbares Reportergen wird in den Hefestamm, der für den Screen verwendet wird, eingebracht. Der Stamm wird dann modifiziert, um die Einbringung eines zusätzlichen Plasmids, das potenzielle Disruptoren der Interaktionen exprimiert, zu ermöglichen. In einer Ausgestaltung wurde das gegen selektierbare Reportergen URA3 verwendet, um die Toxizität des URA3-Genproduktes in Anwesenheit des Wirkstoffs 5-Fluororotische Säure (5FOA) zu verwerten. Jede Aktivierung des Reportergens, das von der Protein-Protein-Interaktion, die beobachtet wurde, resultierte, wurde gegen die Anwesenheit des Wirkstoffs 5FOA selektiert. Hefezellen, welche Peptide der Bibliothek exprimieren, welche die Interaktion blockieren, werden deshalb geeignet sein in der Anwesenheit von 5FOA zu wachsen. In einer alternativen Ausgestaltung wurde in zweites gegen-selektierbares Reportergen, bezeichnet CYH2, verwendet, um Hefezellen in Anwesenheit von Cycloheximid zu selektieren. In einer weiteren Ausgestaltung umfassen die verwerteten genetischen Konstrukte sowohl die URA3 und CYH2 gegen-selektierbaren Reportergene, um die Erfindung in Hefezellen durchzuführen.
  • Als ein "Bait" (DNA bindende Fusionsdomäne) wurde ein existierendes LexA/SCL-Fusionsprotein verwendet, welches vorher gezeigt hat, dass es mit den DRG- und E47-Proteinen (Mahajan, M.A. et al. (1996)) interagiert. Dieses Bait enthält die bHLH-Domäne (Reste 176 bis 245) des SCL ebenfalls impliziert in der Interaktion mit LMO2 (Wadman, I. (1994)). Die "Prey"-Konstrukte (Aktivierungsfusionsdomäne) kodieren die bekannten SCL-Interaktoren.
  • Screening wird gemäß Vidal, M. et al. (1996), Green, A.R. et al. (1991), Vidal M. et al. (1996) mit folgenden Modifikationen durchgeführt. Zuerst wird das Paar der zwei Hybridinteraktoren auf den Vektoren pJG4-5 und pEG202 (oder pGilda) des lex-A-basierten Zwei-Hybrid-Systems basiert (Gyuris, J.E. et al. (1993)). Der SCL-exprimierende LexA-Hybridklon exprimiert Reste 176 bis 331 von SCL (Mahajan, M.A. et al. (1996)). Zweitens ist die reverse Zwei-Hybrid-Aptamerbibliothek basiert auf der zufälligen Aptamerbibliothek, die durch Colas et al., (23), beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass der Vektor basiert auf pBLOCK-1 ist, was die Expression der Peptide entweder alleine oder als Fusionen mit anderen Aminosäuren (z.B. mit flankierenden Cysteinresten) erlaubt. Diese Bibliothek wird einmal transformiert und mit den Interaktorpaaren durch Mass-Mating-Verfahren gescreent (Bendixen et al. (1994)). Kurz gesagt, wird die Zeo-markierte Bibliothek in den Stamm YPH250 (Sikorski, R.S. et al. (1989)) des Genotyps (MATα, leu2, ura3, lys2, trp1) eingebracht und die Transformanten werden eingefroren. Die interagierenden Proteine, die durch die mit TRP1 und HIS4 markierten Plas mide kodiert sind, werden dann in ein Derivat des Stammes YPH252 (Sikorski, R.S. et al., 1989) oder in den Stamm EGY40 (Golemis und Brent, 1992; Gyuris et al., 1993) des Genotyps (MATα, leu2, ura3, his4, trp1, lys2), welcher stabil mit den gegen-selektierbaren Reporterkonstrukten transformiert wurde, transformiert. Diploide Hefe, die aus dem Mating-Verfahren der zwei oben genannten Stämme resultiert, wird in ein Minimalmedium, das kein Tryptophan und Histidin, aber Zeocin enthält, selektiert und gefroren gelagert. Screening der Bibliothek wird dann durch Re-Plattierung in Minimalmedium, das kein Leucin, Tryptophan und Histidin, aber 5-FOA, Zeocin und Raffinose und/oder Galactose enthält, durchgeführt. In Fällen, in denen der Rezipientstamm den CYH2-Reporter zusätzlich zu dem URA3-Reporter enthält, ist es notwendig, dass beide parentalen Stämme Spontanmutationen in dem CYH2-Gen aufweisen, welche die Stämme resistent gegenüber Cycloheximid werden lassen. Unter solchen Umständen kann das Gegen-Selektionsmedium Cycloheximid enthalten.
  • Das alternative Bait-Plasmid pGilda (OriGene Corporation) kann in dem oben genannten Schema gegenüber dem pEG202 bevorzugt sein, wobei das Peptid, Polypeptid oder Protein, das als eine LexA-Fusion exprimiert wird, toxisch auf die Zelle wirkt oder alternativ endogene transkriptionale Aktivierungsaktivität besitzt, die ausreicht, um Letalität in dem Gegen-Selektionsscreen hervorzurufen, der unabhängig von der relevanten biologischen Interaktion ist, die getestet wird. Obwohl nicht gebunden an eine Theorie oder Aktivierungsmethode, kann die verbesserte Wirksamkeit von pGilda darin bestehen, dass das Plasmid bei einer niedrigen Kopiezahl erhalten wird, beruhend auf der Anwesenheit eines CEN/ARS-Ursprungs der Replikation eher als der 2-Mikron-Ursprung der Replikation, der verwendet wird in vielen anderen Hefevektoren. Alternativ oder zusätzlich verwertet pGilda eine induzierbare GAL1-Promotorsequenz eher als die ADH-Promotorsequenz, die in pEG202 anwesend ist, was erlaubt, dass der Level der Expression der interagierenden Proteinbindungspartner durch die Konzentration von Galactose in dem Wachstumsmedium reguliert wird. Insbesondere wird die Expression der interagierenden Proteinbindungspartner von pGilda aufgrund eines Mediums enthaltend eine neutrale Kohlenstoffquelle, wie z.B. Raftinose, sichergestellt. In Fällen, wo die Expression der interagierenden Proteinbindungspartner nicht ausreicht, um Letalität zu erreichen, können höhere Konzentrationen an Galactose zu dem Wachstumsmedium zugegeben werden, bis die Quantität der interagierenden Proteine, die exprimiert werden, für die Letalität assoziiert mit der Interaktion, die auf gegen-selektierbaren Platten zu bestimmen ist, ausreicht.
  • Beispiel 3
  • Konstruktion der Peptidbibliothek
  • Übliche Zwei-Hybrid-Bibliotheken sind für das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren nicht geeignet, da sie mit einer transkriptionalen Aktivierungsdomäne fusioniert sind und so die Klonierung aller Arten von Peptidblockern nicht erlauben, da einige Mitglieder der Bibliothek die Transkription aktivieren würden (dadurch dem Screen ausweichen), unabhängig davon, ob sie die Interaktion unter Testbedingungen blockieren oder nicht. Im Weiteren ist es für die Vektoren, die im Drei-Hybrid-Screening (Zhang, J. et al. (1996)) verwendet werden, notwendig, einen zusätzlichen selektierbaren Marker in den Hefevektor bereitzustellen und einen geeigneten Stamm für ihre Selektion zu verwenden.
  • Wenn man Peptide in einer konstrahierten Form präsentiert, werden die Freiheitsgrade limitiert und somit die entropischen Kosten der Bindung, die für die hohe Affinität der beobachteten Interaktionen steht (Colas et al. (1996)). Eine Trx-präsentierte zufällige Peptidbibliothek wird in dem vorliegenden Verfahren verwendet. Die Herstellung der zufälligen Inserte und des Trx-Teils wird vorstehend beschrieben (Colas et al. (1996)). Die zufälligen Aptamerinserte werden in den reversen Zwei-Hybrid-Vektor-pBLOCK-1 kloniert.
  • Beispiel 4
  • Durchführung des Screens für Peptidblocker von Protein-Protein-Interaktionen
  • Um die Anzahl der Transformationen der Hefebibliothek zu reduzieren, wird eine Mass-Mating-Technik verwendet, um die Bibliotheksplasmide mit den Stämmen, welche die zwei Hybridpartner exprimieren, effektiv zu kombinieren (Bendixen, C. (1994)). Nach Selektion von Diploiden und Ausplattierung in einem Medium enthaltend 5FOA werden nur Klone, die blockierende Peptide ("Blocker") in Form von Kolonien exprimiert, da sie die Transkription des gegen-selektierbar URA3-Reportergens unterdrücken. Die geeignete Stringenz zur negativen 5FOA-Selektion wird empirisch für jedes interagierende Paar gemäß Vidal et al. (1996) bestimmt.
  • Beispiel 5
  • Testung der Blocker auf Spezifität unter Verwendung von Interagierungs-Mating-Verfahren
  • Die "interagierende Mating"-Technik (Finley Jr., R.L. et al. (1994)) wird verwendet, um schnell zu bestimmen, ob die isolierten Blocker des oben dargestellten Screens spezifisch sind für das erwünschte Interaktionspaar. Bibliotheksplasmide, die Blocker kodieren, werden durch Transformation in E. coli und Retransformation in Hefe gerettet. Sie werden dann jeweils parallel mit einer großen Panel von nichtspezifischen Zwei-Hybrid-Fusionspaaren in einem Hefestamm des gegensätzlichen Mating-Typs gematet und auf Sensitivität gegenüber 5FOA getestet. Es ist notwendig, dass zumindest einer der zwei Hefestämme geeignete Reportergene, wie oben beschrieben, enthält. Nur Klone, welche spezifisch die Interaktion von SCL mit ihren Interaktoren blockt und nicht die Interaktion mit anderen ähnlichen interagierenden Proteinen blockt, werden für die weitere Analyse genommen.
  • Beispiel 6
  • Auswahl von hoch affinen Blockern unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanz
  • HOX11- und SCL-Interaktionsdomänen werden als Maltose bindende Fusionsproteine unter Verwendung des Vektors pMalC2 (New England Biolabs) gereinigt und kovalent mit dem BIAcore (Pharmacia) Biosensorchip gekuppelt. Gereingte GST-Fusionen bekannter HOX11- und/oder SCL-Interaktoren werden über den Biosensorchip geleitet und die Bindung wird mit einem BIAcore2000 in Anwesenheit und Abwesenheit eines Hefeextraktes enthalten überexprimierte Trx-Aptamerblocker überwacht. Um das geeignete Verhältnis für die Kompetition herauszufinden, wird jeder der Interaktoren durch limitierende Dilution gegen eine konstante Konzentration eines Hefeextrakts titriert. Blockierende Aktivität cyclischer Peptide wird in ähnlicher Weise durch Oberflächenplasmonresonanz bestätigt.
  • Oberflächenplasmonresonanz ist geeignet, um Interaktionen von Proteinen, die in zwei Hybridscreens identifiziert wurden, zu studieren (Colas, P. et al. (1996), Yang, M. et al. 1995). Die Sensitivität der Oberflächenplasmonresonanzinstrumente ermöglicht die Identifizierung von Komponenten eines rohen Zellextrakts, welcher mit der Interaktion gereinigter Proteine in Lösung mit ihren erkennenden Partnern, die an einen Biosensorchip gebunden sind, konkurrieren kann (Bartley, T.D. et al. (1994)). Gereinigte SCL wird durch kovalente Kupplung mit der Chipoberfläche immobilisiert. Gereinigte GST-Fusionen der Interaktonen (LMO2, DRG und E47) werden dann über den Chip passiert und die Bindung wird durch den BIAsensor überwacht. Hefeextrakte, welche die viel kleineren Peptidaptamerblocker, die in dem obigen genetischen Screen selektiert werden, überexprimieren oder über ein Trx-Vektorkontrollpolypeptid überexprimieren, werden dann über den Chip passiert und ihre Fähigkeit, Assoziationen mit Erkennungspartnern mit SCL zu blockieren, bestimmt. Falls eine der Peptidaptamere eine Interaktion blockiert, wird die Bindung des natürlichen SCL-Partners inhibiert und eine Veränderung des refraktiven Indexes detektiert. Diese Änderung wird durch den BIAsensor gemessen, unabhängig davon, ob der Aptamerblocker an SCL, an ihre Partner oder an beide Proteine bindet. Da das Signal proportional zu der Größe der interagierenden Proteine ist, ist es möglich, den Unterschied zwischen der Bindung der erkennenden Partner von SCL und den viel kleineren artifiziellen Aptamere sollte dieses direkt mit SCL interagieren, zu bestimmen. Diese Experimente werden mit verwandten Proteinpaaren wiederholt, um Spezifität zu sichern. Peptidaptamere, welche Interaktionen mit höchster Affinität und Spezifität blockieren, werden via ihrer Trx-Domäne immungereinigt und auf direkte Interaktionen getestet und die Dissoziationskonstanten bestimmt, bevor ihre Inserte sequenziert werden.
  • Basiert auf den oben genannten Studien werden die Blocker mit höchster Affinität weiter untersucht. Der inhibitorische Effekt der Peptidaptamere wird initiell durch Expression dieser konstrahiert mit dem Trx-Polypeptidloop in Zelllinien getestet.
  • Wir synthetisieren dann die 20-mer-Inserte korrespondierende zu den Peptidaptameren.
  • Die 38-mer-Peptide werden in der folgenden Form designed:
    Cys(Penetratin 16-mer)(interagierend 20-mer)Cys
    wobei die Aminosäuresequenz des Penetratin 16-mer-Motivs durch Derossi et al. (1994) beschrieben wird: (Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys).
  • Die Peptide (synthetisiert durch Chiron Mimotopes, Australien) werden durch Oxidation der flankierenden Cysteinreste mit 10 mM K3Fe(CN)6 (Mimotopes, Australien) bei pH 8,4 cyclisiert und durch Reverse-Phase-HPLC gemäß Koiveunen et al. (1994) gereinigt.
  • Erfolgsversprechende Kandidatblockerklone werden demzufolge als cyclische Peptide synthetisiert, die die interagierenden Peptide an das Penetratinmotiv fusioniert umfassen. Die Cyclisierung mit flankierenden Cysteinresten wird in dem Design synthetischer Peptide verwendet, um hohe Affinität durch konformationale Konstrahierung zu erhalten (Giebel, L.B. et al., 1995). Dieser Ansatz hat einige biologisch aktive Peptidinhibitoren hervorgebracht.
  • Beispiel 7
  • Anwendung des Modellsystems zur Isolierung von Blockern der HOX11-Interaktionen
  • Die Screens werden ebenfalls ausgeweitet, um Blocker der HOX11-Interaktoren zu finden, welche gerade isoliert wurden. In dem Fall von HOX11, wo Targetgene identifiziert wurden, werden Luciferase-Reporterkonstrukte enthaltend die Promotoren der HOX11-Targets cotransfektioniert mit Blockerkonstrukten/peptiden und der Effekt auf das Wachstum und der Reportergenexpression bestimmt. Jedes der SCL- oder HOX11-spezifischen Peptide, welche das Wachstum inhibieren, werden in Kombination zu den Zellen gegeben als ein Test auf synergistische kooperative Inhibition von HOX11 und SCL.
  • Beispiel 8
  • Assays der Targetgen-Aktivierung
  • Die Promotoren der HOX11-Targetgene werden mit dem Luciferase-Reporter pGL3 Basisvektor fusioniert und die Expression von Luciferase wird aus dem Rohextrakt (Promega) in einem Luminometer bestimmt. Eine Plasmid-Cotransfektionskontrolle, die β-Galactosidase exprimiert, wird verwendet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren. Peptide werden direkt zu dem frischen Medium in Konzentrationen von 0,1 μM, 1 μM, 10 μM und 100 μM zugegeben.
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  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00610001
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Claims (18)

  1. Verfahren zur Identifizierung eines Peptid-, Oligopeptid- oder Polypeptidantagonisten einer Protein-Protein-Interaktion, die zwei oder mehrerer interagierende Proteine in einer Wirtszelle umfasst, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: i) Herstellung einer Peptidbibliothek in einem zellulären Wirt, wobei die transformierten Zellen der Bibliothek eine erste Nucleotidsequenz umfassen, welche ein gegen-selektierbares Reportermolekül kodieren, das geeignet ist, Zellwachstum und/oder Entwicklung zu reduzieren, wenn es in der Wirtszelle exprimiert wird, und dessen Expression operativ unter Kontrolle der Protein-Protein-Interaktion, die zwei oder mehrere interagierende Proteine umfasst, durchgeführt wird, sowie eine zweite Nucleotidsequenz, welche das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid, das operativ unter Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz platziert ist, kodiert und wobei die Expression der interagierenden Proteine unter Kontrolle einer GAL1-Promotorsequenz durchgeführt wird; ii) Kultivierung des zellulären Wirts für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, dass die Expression der zweiten Nucleotidsequenz stattfindet und iii) Auswahl von Zellen, wobei die Expression des Reportermoleküls modifiziert ist und wobei die modifizierte Expression eine inhibierte, herabgesetzte oder unterdrückte Protein-Protein-Interaktion indiziert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Protein-Protein-Interaktion zwischen den interagierenden Proteinen und einem dritten Bindungspartner stattfindet, der ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das eine cis-Acting-Sequenz, welche die Expression der ersten Nucleotidsequenz moduliert, umfasst.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei ein erstes interagierendes Protein eine Fusion einer DNA bindenden Domäne zwischen der DNA bindenden Domäne eines Transkriptionsfaktors und einer Aminosäuresequenz, die mit einem zweiten interagierenden Protein dimerisiert, umfasst, und wobei das zweite interagierende Protein eine Aktivierung der Domänenfusion zwischen der transkriptionalen Aktivatordomäne und einer Aminosäuresequenz, die mit dem ersten interagierenden Protein dimerisiert, umfasst, sodass die Dimerisierung zwischen dem ersten interagierenden Protein und dem zweiten interagierenden Protein einen funktionalen Transkriptionsfaktor produziert, der geeignet ist, an einen dritten Bindungspartner zu binden.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die DNA bindende Domäne eine LexA-Operator bindende Domäne oder eine GAL4-DNA bindende Domäne umfasst.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die transkriptionale Aktivatordomäne von dem GAL4-Protein oder einem anderen genomischen Ursprung erhalten wird.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Aminosäuresequenz, die mit dem zweiten interagierenden Protein dimerisiert, eine Region des SCL-Polypeptids umfasst, das geeignet ist mit DRG, E47 oder LMO2-Proteinen zu interagieren und wobei die Aminosäuresequenz, die mit dem ersten interagierenden Protein dimerisiert, eine Region des DRG, E47 oder LMO2-Proteins umfasst, die geeignet ist, mit der SCL-Polypeptidregion in dem ersten interagierenden Protein zu interagieren.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Protein-Protein-Interaktion ferner die Interaktion eines Adapter-Proteins mit dem ersten und zweiten interagierenden Protein umfasst.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste Nucleotidsequenz einen Bindungspartner umfasst, der eine LexA-Operatorsequenz oder eine GAL4-Bindungsstelle umfasst.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner umfassend die Einführung von einem oder mehreren Nucleinsäuremolekülen in den zellulären Wirt, welcher ein oder mehrere interagierende Proteine, die in der Protein-Protein-Interaktion einbezogen sind, in einem exprimierbaren Format kodiert.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das gegen-auswählbare Reportermolekül ausgewählt wird von der Liste umfassend URA3-Strukturgen, CYH2-Strukturgen und LYS2-Strukturgen oder wobei mehr als eines dieser Reportermoleküle gleichzeitig eingesetzt wird.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Nucleotidsequenz einer konformativ konstrahierten Form innerhalb eines Trx-Polypeptidloops und/oder umfassend oxidierbare flankierende Cysteinreste exprimiert wird.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Nucleotidsequenz ferner ein nukleares Lokalisationssignal (NLS) umfasst.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste und/oder zweite Nucleotidsequenz in einem Plasmidvektor pBLOCK-1 (SEQ ID Nr. 1) oder in einer Variante des Plasmidvektors, die CMV und SV40-Promotoren sowie die spa-Terminatorsequenz umfasst, enthalten sind.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle, mit dem Genotyp MATα, ura3, trp1, his3, cyh2, lexAop-URA3, lexAop-CYH2, ade2 ist.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Nucleotidsequenz in einen Shuttle-Vektor kloniert ist, welche geeignet ist, eine erste Aminosäuresequenz zu exprimieren, die durch die zweite Nucleotidsequenz als eine Fusion mit einer zweiten Aminosäuresequenz kodiert ist, in welcher sie konformativ konstrahiert ist, wobei dieser Shuttle-Vektor zumindest umfasst: (i) eine erste Expressionskassette umfassend: (a) eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion der zweiten Nucleotidsequenz, die diese erste Aminosäuresequenz kodiert, wobei die multiple Klonierungsstelle an eine oder mehrere Nucleotidsequen zen angrenzt, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder ein Polypeptidloop kodieren, sodass ein Fusionspeptid hergestellt wird, das geeignet ist, zwischen der ersten und der zweiten Aminosäure hergestellt zu werden; (b) zwei oder mehrere Tandempromotorsequenzen, an welche die zweite Nucleotidsequenz und die Nucleotidsequenzen, die ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder einen Polypeptidloop kodieren, operativ in Anwendung verbunden sind, wobei eine dieser Promotorsequenzen ein bakteriell-exprimierbarer Promotor ist und wobei eine dieser Promotorsequenzen ein Hefe-exprimierbarer Promotor ist; und (c) eine Terminatorsequenz, die an die multiple Klonierungsstelle angrenzt und fern von der Promotorsequenz liegt und diese Nucleotidsequenzen ein nukleares Lokalisationsmotiv und/oder einen Polypeptidloop kodieren; (ii) einen bakteriellen Replikationsursprung; und (iii) einen eukaryontischen Replikationsursprung.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Shuttle-Vektor ferner eine zweite Expressionskassette umfasst, die ein selektierbares Markergen umfasst, das mit zwei oder mehreren Promotorsequenzen verbunden ist und aufsteigend von der Terminatorsequenz platziert ist, wobei eine dieser Promotorsequenzen ein Hefe-exprimierbarer Promotor ist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die erste und zweite Expressionskassette, zu dem eine oder mehrere Säugetier-exprimierbare Promotor- und Terminatorsequenzen in einem Tandem-Array mit anderen Promotor- und Terminatorsequenzen umfasst.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Shuttle-Vektor die Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 oder eine Variante hiervon, die CMV und SV40-Promotoren sowie die SPA-Terminatorsequenz umfasst.
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