DE60224383T2 - Verfahren zum nachweis in hefe für mittels die proteinfaltung beeinflussen - Google Patents

Verfahren zum nachweis in hefe für mittels die proteinfaltung beeinflussen Download PDF

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Provisional Patentanmeldung Nr. 60/269,157, die am 15. Februar 2001 eingereicht wurde. Die Regierung kann Rechte an der vorliegenden Erfindung aufgrund der Förderungsnummer R37GM25874 des National Institutes of Health haben. Förderung durch das Howard Hughes Medical Institute wird ebenfalls anerkannt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete der genetischen und der chemischen Durchmusterung und der Alpha-Synuklein assoziierten Toxizität. Insbesondere betrifft sie die Entwicklung eines auf Hefe basierenden Systems, das verwendet werden kann, um auf Substanzen, die die Alpha-Synuklein assoziierte Toxizität verringern, zu durchmustern. Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren, um genetische und chemische Durchmusterungen unter Verwendung des Hefesystems der Erfindung durchzuführen. Eine Erkrankung, die von den Verfahren der Erfindung profitiert, ist die Parkinson-Krankheit.
  • Die korrekte Faltung eines Proteins ist ein Schlüsselereignis, um eine ordnungsgemäße biologische Funktion zu erhalten. Die korrekte Faltung führt zu der charakteristischen Konformation eines Proteins, die die Proteinaktivität, Aggregation, Abbau, und Funktion bestimmt. Mehrere Proteine sind an neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD), der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (TSEs), der Alzheimer-Krankheit (AD), der familiären amyloiden Polyneuropathie (FAP), den Prion-Erkrankungen, und Chorea Huntington (HD), unter anderen, beteiligt. Diese Proteine bilden aufgrund alternativer Faltungsmechanismen anormale Aggregate. Diese falsch gefalteten Proteinaggregate bilden unlösliche Fibrillen, die dann in Geweben abgelagert werden. Die Fibrillogenese ist die Ursache für verschiedene Pathologien, an denen neuronale Degeneration beteiligt ist. Die Ablagerung unlöslicher Fibrillen in Geweben führt zur Bildung von Plaques und Tangles und mit dem Fortschreiten der Krankheit letztendlich zu zellulärer Degeneration. Trotz eines Mangels an einer Aminosäuresequenzhomologie der Fibrillen bildenden Proteine, haben die Fibrillen mehrere gemeinsame morphologische Merkmale. Zum Beispiel schließen einige gemeinsame morphologische Merkmale der Amyloid-Fasern (gebildet durch Amyloid-Proteine) eine Kreuz-β-Struktur, ähnliche Größen, die Entwicklung einer grünen Doppelbrechung nach Färbung mit Kongo-Rot bei Beobachtung unter polarisiertem Licht, Thioflavin-T-Bindung, etc., mit ein.
  • Ein Beispiel für eine Erkrankung, die auf Fibrillogenese beruht, ist die Pathologie der Amyloidosen, die durch die Ablagerung von amyloiden Fibrillen in Geweben definiert ist und für die die Alzheimer-Krankheit (AD) ein typisches Beispiel ist. Systemische Amyloidosen sind durch Amyloid-Ablagerung über die gesamten inneren Organe gekennzeichnet. Tierisches Amyloid ist ein komplexes Material, das sich teilweise aus Proteinfibrillen zusammensetzt. Das Protein, das diese Fibrillen umfasst, variiert von Erkrankung zu Erkrankung. β-Amyloid ist eines dieser Proteine, das am pathologischen Verlauf von AD beteiligt ist.
  • Im Fall der Parkinson-Krankheit (PD) durchlaufen dopaminerge Neuronen im Gehirn selektive Neurodegeneration. Ein hochgradig konserviertes prä-synaptisches Protein, α-Synuklein, mit unbekannter Funktion, ist mit PD in Verbindung gebracht worden. Zwei verschiedene Punktmutationen im α-Synuklein, A53T und A30P sind an der autosomal dominanten familiären PD beteiligt. Es ist wahrscheinlich, dass Konformationsänderungen im α-Synuklein zu der typischen proteinösen Ansammlung und dem Fibrillogenese-Charakteristikum solcher Krankheiten führen. Gereinigtes α-Synuklein voller Länge kann Fibrillen bilden, die ähnlich zu jenen sind, die man in Lewy-Körperchen (cytosolische Einschlüsse) bei PD findet. Der Mechanismus der Fibrillogenese ist nicht beschrieben worden, obwohl aktuelle Daten anzeigen, dass α-Synuklein-Aggregation einem Kernbildungs-Elongationsmechanismus folgt, wie es für die anderen krankheitsrelevante Proteine vorgeschlagen wird.
  • Es ist im Stand der Technik allgemein bekannt, dass sobald sich fibrilloide Ablagerungen gebildet haben, es keine bekannte Therapie oder Behandlung gibt, die solche Ablagerungen in situ signifikant auflöst ( U.S. Patent No. 5,643,562 ). Konsequenterweise sind Strategien, die auf der Prävention von Protein-Aggregation und von Fibrillenbildung beruhen, das Hauptziel bei der Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen, wie bei neurodegenerativen Erkrankungen und Diabetes vom Typ II. Daher besteht ein Bedarf im Stand der Technik nach einem System, mit dem man therapeutische Wirkstoffe für Erkrankungen identifizieren kann, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen, die ihre therapeutische Wirkung darin haben können, dass sie entweder Regulatoren der Proteinfaltung und/oder Inhibitoren der Proteinaggregation, und/oder Präventoren („preventors") und/oder Inhibitoren des Fibrillogeneseprozesses sind, oder welche, die einen vollkommen anderen und möglicherweise unbekannten Wirkmechanismus haben. Des Weiteren gibt es einen Bedarf, dass solch ein System ein rasches und kostengünstiges Durchmusterungsverfahren zur Verfügung stellt, das die Identifizierung von Wirkstoffen gestattet, die nützlich bei der Behandlung, Prävention und Heilung von Krankheiten sind, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen.
  • Krankheiten, an denen ein falsch gefaltetes Protein beteiligt ist, sind in Säugetieren identifiziert worden ("Krankheiten mit falsch gefaltetem Protein"). Diese Erkrankungen schließen die Parkinson-Krankheit; Prion-Erkrankungen (einschließlich der Creuzfeldt-Jakob-Erkrankung (Cm), Tödliche Familiäre Schlaflosigkeit (FFI), Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit (GSS), Rinderwahn, Scrapie, und Kuru); Familiäre Amyloide Polyneuropathie, Tauopathien (einschließlich Picksche Krankheit, lobuläre Atrophie, und Frontotemporale Demenz); Trinukleotidkrankheiten (einschließlich Chorea Huntington, Spinozerebellärer Ataxie (SCA), Dentatorubraler-Pallidolysianer Atrophie (DRPLA), Fragilem X-Syndrom, Myotoner Dystrophie, Haw-River-Syndrom, erbliche Ataxien, Machado-Joseph-Krankheit, und Kennedy-Krankheit (spinobulbäre Muskelatrophie, SBMA)) mit ein.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass Proteine, die sich falsch falten und mit einer Erkrankung in Verbindung stehen ("Krankheiten mit falsch gefaltetem Protein") in Hefe als Basis für die Durchmusterung nach therapeutischen Wirkstoffen für die Behandlung solch einer Erkrankung exprimiert werden können. Es sind Bedingungen und/oder Wirkstoffe identifiziert worden, die Toxizität in einer Hefezelle induzieren ("Toxizität induzierender Wirkstoff"), die ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein, beispielsweise Huntingtin oder Alpha-Synuklein, die mit Chorea Huntington bzw. der Parkinson-Krankheit in Verbindung stehen, exprimiert. Ferner können die Bedingungen und/oder Wirkstoffe, die Toxizität in einer ein bestimmtes falsch gefaltetes Krankheitsprotein exprimierenden Hefezelle induzieren gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden. Die identifizierten Bedingungen und/oder Wirkstoffe können auf Hefezellen angewendet werden, die das bestimmte falsch gefaltete Krankheitsprotein exprimieren, um therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, die für die Krankheit, die mit dem falsch gefalteten Krankheitsprotein in Verbindung steht, verwendet werden können. Die Durchmusterung verwendet die Lebensfähigkeit der Hefe, die ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein exprimiert und in welcher Toxizität induziert wird, um Verbindungen zu identifizieren, die ein therapeutisches Potenzial bei der Behandlung der Krankheit haben, die mit dem falsch gefalteten Krankheitsprotein in Verbindung steht. Ein Vorteil der Durchmusterungsverfahren ist, dass ein Verständnis für die Physiologie und/oder Zellbiologie des falsch gefalteten Krankheitsproteins oder für die Ätiologie einer Krankheit mit falsch gefaltetem Protein nicht notwendig ist, um therapeutische Kandidatenverbindungen zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung schließt Durchmusterungsverfahren nach einer Verbindung, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringert, gemäß den Ansprüchen 1 und 9 mit ein.
  • In einigen Ausführungsformen, die nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, umfasst das Huntingtin-Polypeptid einen N-terminalen Bereich eines Huntingtin-Polypeptids voller Länge. Es wird ins Auge gefasst, dass ein N-terminaler Bereich eines Huntingtin-Polypeptids den N-terminalen Bereich von Exon 1 oder alles von Exon 1, einschließlich eines poly Q-Repeatbereichs, umfassen kann. Poly Q-Repeatbereich bezieht sich auf einen Bereich eines Huntingtin-Polypeptids, der durch eine variable Anzahl an Glutaminrest-Wiederholungen, die an Position 18 von SEQ ID NO: 4 (das HtQ103-Protein), SEQ ID NO: 6 (das HtQ25-Protein) und SEQ ID NO: 9 (das Ht Exonl-Protein ohne poly Q-Repeats) beginnen, gekennzeichnet ist. In einigen Ausführungsformen umfasst der poly Q-Bereich 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 oder mehr Glutaminreste; in spezifischen Ausführungsformen hat der poly Q-Bereich 72 oder 103 Glutaminreste. Das Exon 1 umfasst die Aminosäuren 1–68 des Huntingtin-Proteins voller Länge; dieses Exon kann jedoch eine variable Anzahl an Glutaminresten beginnend ab Position 18 umfassen, wo die Glutamin-(CAG)-Repeats, in einigen Ausführungsformen, 25, 47, 72 oder 103 Glutaminreste lang sein können, gefolgt von den verbleibenden 51 Aminosäuren. Die menschliche Gensequenz für das Huntingtin-Polypeptid voller Länge kann man unter der Genbank-Zugangsnummer NT_006081 finden, die eine Sequenz von Chromosom 4 ist, wo sich das Huntingtin-Gen befindet. In der vorliegenden Anmeldung verändert die Anzahl der Glutaminreste in dem poly Q-Bereich, der der Bereich in Exon 1 ist, der von einer variablen Anzahl an Glutaminresten gekennzeichnet ist, die Aminosäureposition in der stromabwärts gelegenen Reste des poly Q-Bereichs nicht. Der Ausdruck „HtQ25" bezieht sich zum Beispiel auf ein Huntingtin-Polypeptid, das einen poly Q-Bereich mit 25 Glutaminresten hat, was im Allgemeinen als Wildtyp angesehen wird.
  • In einigen Ausführungsformen exprimiert eine Hefezelle ein mutiertes Hsp40-Polypeptid, das exogen oder endogen sein kann. Das Hsp40-Polypeptid kann entweder am C- oder N-Terminus verkürzt sein, oder es kann eine Insertion, Substitution, oder interne Deletion haben. In spezifischen Ausführungsformen hat das Hsp40-Polypeptid eine C-terminale Deletion. Die C- terminale Deletion wird die Aminosäure 352 von SEQ ID NO: 8 einschließen. Sie und andere Deletionen können 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 3, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 240, 250, oder mehr Aminosäuren, die entweder mit Aminosäure 352 oder Aminosäure 1 oder jeder anderen Aminosäure von SEQ ID NO: 8 zusammenhängen. Es wird ferner ins Auge gefasst, dass das Hsp40-Polypeptid Mehrfachmutationen enthalten kann. Ein endogenes Polypeptid bezieht sich auf ein Polypeptid, das von einem chromosomalen (nicht-rekombinanten) Nukleinsäuremolekül exprimiert wird, wohingegen sich ein exogenes Polypeptid auf eines bezieht, das außerhalb der Zelle exprimiert wird, oder von einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül exprimiert wird.
  • In weiteren Ausführungsformen wird eine Hefezelle, die ein wildtypisches Hsp-40 exprimiert oder nicht exprimiert, mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht. Die Hefe kann mit einer Kandidatenverbindung vor, nach oder während des In-Kontakt-Bringens mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht werden. Ein Toxizität induzierender Wirkstoff schließt eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Salz, Metall, Liposom, Antibiotikum, Anisomycin, Bleomycin, Koffein, Camptothecin, Carbonyl-Cyanid, Daurorubicin, Ethanol, Formamid, GuHCl, oder NEM oder andere in der Tabelle 3 identifizierte Verbindungen mit ein. Hinsichtlich einer Hefezelle, die ein Huntingtin-Polypeptid exprimiert, ist in einigen Ausführungsformen ein Toxizität induzierender Wirkstoff eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise Arabinose oder Kaliumacetat, oder ein Salz oder Metall, wie CdCl2, CoCl2, CsCl, FeCl2, LiCl, NH4Cl, RbCl, oder ZnCl2.
  • Die beanspruchten Verfahren können auch das Vergleichen der Lebensfähigkeit einer Hefezelle, die mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht worden ist, und die kein wildtypisches Hsp-40 exprimiert, mit der Lebensfähigkeit einer Hefezelle, die mit derselben Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht worden ist, die aber wildtypisches Hsp40 exprimiert, einschließen. Alternativ kann die Lebensfähigkeit einer Hefezelle, die mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht worden ist und die nicht wildtypisches Hsp-40 exprimiert, mit der Lebensfähigkeit einer Hefezelle verglichen werden, die kein wildtypisches Hsp-40 exprimiert, aber nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht worden ist. Eine erhöhte Lebensfähigkeit der Hefezelle, die mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht worden ist im Vergleich zu einer Hefezelle, die nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht worden ist, zeigt an, dass die Kandidatenverbindung ein therapeutischer Kandidatenwirkstoff ist. Mit anderen Worten, wie bei anderen Ausführungsformen der Erfindung, zeigt bei Gegenwart der Kandidatenverbindung absolute oder relative Lebensfähigkeit (erhöhte) an, dass die Kandidatenverbindung eine therapeutische Kandidatenverbindung ist.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung exprimiert eine Hefezelle ein Polypeptid, das das vollständige oder ein Teil des Alpha-Synuklein-Polypeptids einschließt, das das mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung stehende falsch gefaltete Krankheitsprotein ist. Die Hefen werden mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff oder einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die einen Toxizität induzierenden Wirkstoff umfasst. Die Hefe kann mit einer Kandidatenverbindung vor, nach oder während des In-Kontakt-Bringens mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht werden. Die absolute oder relative Lebensfähigkeit in Gegenwart der Kandidatenverbindung zeigt an, dass die Kandidatenverbindung eine therapeutische Kandidatenverbindung ist. Die Lebensfähigkeit wird gemäß ihrer herkömmlichen Bedeutung verwendet. Sie kann absolut oder relativ, im Vergleich zu Kontrollen, bewertet werden. In einigen Ausführungsformen exprimiert die Hefezelle kein wildtypisches Hsp-40 oder ein funktionelles Hsp-40, das in einem Zustand vorliegt, der Toxizität in der Hefezelle induziert. Wie hierin verwendet bezieht sich "In-Kontakt-Bringen" einer Hefezelle mit einer Verbindung auf das Exponieren, das Inkubieren, das Berühren, das Assoziieren mit der Hefezelle sowie das Zugänglich Machen der Hefezelle für die Verbindung.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist das Alpha-Synuklein-Polypeptid der Wildtyp (SEQ ID NO: 2), wohingegen es in anderen Ausführungsformen mutiert ist. Die Mutation kann eine Deletion, Insertion, oder Substitution in dem Polypeptid sein. In spezifischen Aspekten der Erfindung umfasst das Alpha-Synuklein-Polypeptid eine A53T-Mutation, was eine Substitution des Alanins an Position 53 durch Threonin ist. In anderen Aspekten umfasst das Alpha-Synuklein-Polypeptid eine A30P-Mutation, was eine Substitution des Alanins an Position 53 durch Prolin ist.
  • In noch weiteren Ausführungsformen wird das Alpha-Synuklein-Polypeptid von einem Fusionsprotein umfasst, das mindestens ein weiteres Polypeptid enthalten kann.
  • Eine Hefe, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Alpha-Synuklein exprimiert, kann einen Toxizität induzierenden Zustand haben oder mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff in Kontakt gebracht werden. Der Toxizität induzierende Wirkstoff kann eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Salz, Metall, Azauracil, Aurintrincarbozyklisches Bleomycin, Brefeldin A, Camptothecin, Chlorambucil, Ethidiumbromid, Formamid, GuHCl, Hydroxyharnstoff, Menadion, Paraquat oder Vanadat oder jede andere in Tabelle 3 aufgeführte Verbindung sein. In einigen Ausführungsformen ist die Kohlenstoffquelle Arabinose, Ethanol oder Glycerin, wohingegen in anderen Ausführungsformen eine Stickstoffquelle Harnstoff ist. In weiteren Ausführungsformen ist der Toxizität induzierende Wirkstoff ein Salz oder Metall, beispielsweise CaCl2, CoCl2, CsCl, oder Eisen, Magnesium, RbCl, oder SrCl2.
  • Generell gesprochen können alle Verfahren der vorliegenden Erfindung Kontrollen einschließen, die das Vergleichen von Hefezellen in Gegenwart und Abwesenheit von Kandidatenverbindungen sowie das Vergleichen von Hefezellen in Gegenwart und Abwesenheit von Toxizität induzierenden Wirkstoffen oder Toxizität induzierenden Bedingungen mit einbezieht. Solche Vergleiche werden hinsichtlich einer Hefe, die Hsp-40 exprimiert oben diskutiert, und können in jeder Durchmusterung, die ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein mit einbezieht, eingesetzt werden. Es wird ins Auge gefasst, dass jede Zusammensetzung oder jedes Verfahren, das hinsichtlich einer Ausführungsform diskutiert wird, im Kontext der anderen Ausführungsformen eingesetzt werden kann.
  • In einigen Ausführungsformen der Erfindung geht die Lebensfähigkeit nach 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden, 9 Stunden, 10 Stunden, 11 Stunden, 12 Stunden, 18 Stunden, 24 Stunden, 36 Stunden, 48 Stunden, 60 Stunden, 72 Stunden, 84 Stunden, 96 Stunden oder mehr Stunden verloren, aber in weniger Zeit als wenn die Hefezelle nicht dem Zustand oder Wirkstoff ausgesetzt worden wäre.
  • Die Kandidatenverbindung jedes der erfindungsgemäßen Verfahren können ein kleines Molekül oder eine Nukleinsäure sein. Die Kandidatenverbindungen können von einer Bibliothek umfasst sein oder für die Durchsatzdurchmusterung in großem Maßstab verarbeitet sein. Die Hefen, die eingesetzt werden können, schließen Saccharomyces cerevisiae oder jedes andere Mitglied der Saccharomyceten mit ein.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Durchmusterungsverfahren nach einer Verbindung, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringert, wobei das Verfahren umfasst:
    • a) das In-Kontakt-Bringen einer Hefezelle mit einer Kandidatenverbindung, wobei die Hefezelle ein Polypeptid exprimiert, das Alpha-Synuklein umfasst;
    • b) das In-Kontakt-Bringen der Hefezelle mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff;
    • c) das Bewerten der Lebensfähigkeit der Hefezelle, die anzeigt, dass die Kandidatenverbindung eine therapeutische Kandidatenverbindung ist.
  • Es wird auch ins Auge gefasst, dass der Toxizität induzierende Wirkstoff eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein Salz, ein Metall, ein chemotherapeutischer Wirkstoff, ein Alkohol, ein Translationsinhibitor, NSAID, eine DNA-interkalierende Substanz, ein Chelator, ein Liposom, ein Antibiotikum, ein Vitamin, ein Proteasom-Inhibitor, ein Antioxidationsmittel, oder ein reduzierender Wirkstoff sein kann. Des Weiteren wird ins Auge gefasst, dass anstelle des In-Kontakt-Bringens der Hefezelle mit einem Toxizität induzierenden Wirkstoff die Hefe einen Toxizität induzierenden Zustand aufweist, beispielsweise eine Mutation in einem Chaperon-Protein. Wie oben diskutiert können Ausführungsformen, die hinsichtlich einer Durchmusterung nach therapeutischen Wirkstoffen für Krankheiten mit falsch gefaltetem Protein wie der Parkinson-Krankheit diskutiert werden, eingesetzt werden. Es wird ins Auge gefasst, dass jedes der hierin beschriebenen Durchmusterungsverfahren hinsichtlich therapeutischer Verfahren und Zusammensetzungen eingesetzt werden kann.
  • Behandlungsverfahren schließen das Verabreichen eines therapeutischen Wirkstoffs in einer wirksamen Menge, um einen therapeutischen Nutzen zu erreichen, an einen Patienten, der der Behandlung bedarf, mit ein. Ein "therapeutischer Nutzen" in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf alles, was das Wohlbefinden des Patienten hinsichtlich der medizinischen Behandlung seines Zustandes fördert oder verbessert, was die Behandlung von Fibrillogenese-Krankheiten wie Chorea Huntington und Parkinson-Krankheit einschließt. Eine Liste nicht-erschöpfender Beispiele dafür schließt die Verlängerung des Lebens des Patienten um jeden Zeitraum, die Verringerung oder Verzögerung der Entwicklung der Krankheit, die Verringerung der Anzahl an Plaques oder Fibrillen, die Verringerung des Fibrillenwachstums, die Verringerung der Anzahl an falsch gefalteten Proteinen, die Verzögerung des Einsetzens des Verfalls der geistigen Fähigkeiten, und eine Verringerung der Atrophie, oder Demenz des Patienten, die dem Zustand des Patienten zugerechnet werden kann, mit ein.
  • Es wird ins Auge gefasst, dass Zusammensetzungen und Schritte, die im Zusammenhang mit einer Ausführungsform diskutiert werden, hinsichtlich anderer hierin diskutierter Ausführungsformen eingesetzt werden können.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich "Aggregation" auf eine Anhäufung oder Ansammlung von mindestens drei separaten Polypeptiden. Solch eine "Aggregation" schließt spezifische Protein:Protein-Wechselwirkungen zwischen Polypeptiden mit verschiedener Sequenz aus, wie sie bei Hefe-Zwei-Hybrid-Assays beobachtet werden.
  • Wie hierin verwendet meint die Beschreibung oder der Anspruch/die Ansprüche, wenn sie in Verbindung mit dem Wort "umfassen" verwendet werden, mit den Wörtern „ein", „einer", oder „eines" eins oder mehr als eins. Wie hierin verwendet kann "ein weiteres" mindestens ein zweites oder mehr meinen.
  • Die nachfolgenden Abbildungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und werden mit einbezogen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter darzulegen. Die Erfindung kann unter Verweis auf eine oder mehrere dieser Bbildungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung von spezifischen hierin gezeigten Ausführungsformen besser verstanden werden.
  • 1. Deletionen/Verkürzungen von Sis1p
  • 2. Expression des Ht-Fragments in Hefe. Schematische Darstellung des in dieser Studie verwendeten Ht-GFP-Fragments. Grauer Kasten, GFP; weißer Kasten, Aminosäuren 1–68 des N-terminalen Bereichs des humanen Ht-Proteins, der einen Abschnitt von 25, 47, 72 oder 103 Glutaminen enthält (schwarzer Kasten).
  • 3. Expression des Alpha-Synukleins fusioniert an GFP unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors. Die Expression von WT und A53T ist in den Zellen toxisch. Ähnliche Phänotypen wurden mit Alpha-Synuklein alleine beobachtet. Diese Assays wurden in den Durchmusterungsverfahren verwendet, um Wirkstoffe zu identifizieren, die die beobachtete Toxizität abmildern können.
  • 4. Schema der Durchmusterung einer DNA-Bibliothek beruhend auf der Unterbrechung von FREI zwischen den mit CFP und YFP markierten Proteinen.
  • Die Ablagerung unlöslicher Fibrillen-Proteine in Geweben ist ein Kennzeichen von Erkrankungen, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen. Die häufigsten dieser Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen und ebenso Erkrankungen wie Diabetes vom Typ 2 (siehe Tabelle 1 für eine Liste von Krankheiten, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen). Bis heute gibt es keine bekannte Therapie oder Behandlung, die diese Proteinablagerungen auflösen können. Daher werden Wirkstoffe, die die Proteinaggregation und Fibrillenbildung verhindern können, aktiv gesucht. Es fehlen jedoch im Stand der Technik Verfahren, um potentielle Kandidatensubstanzen zu identifizieren.
  • Die vorliegenden Erfinder haben ein System entwickelt, das die rasche Identifizierung von therapeutischen Kandidatenwirkstoffen, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringern, erlaubt. Das System ist ein auf Hefe beruhendes System, wobei im Falle der Parkinson-Krankheit eine Hefezelle technisch so hergestellt wird, dass sie ein Alpha-Synuklein-Polypeptid exprimiert. Darüber hinaus hat in einer Ausführungsform diese Hefezelle auch einen genetischen Hintergrund, der verursacht, dass die Hefezelle als Ergebnis des Exprimierens des Polypeptids, das Alpha-Synuklein umfasst, in Kombination mit dem genetischem Hintergrund, verringerte Wachstumsraten oder kein Wachstum aufweist. In einem Beispiel hat die Hefezelle ein mutiertes Hsp40-Gen. Eine Verringerung oder Inhibition des Wachstums zeigt die Toxizität des Alpha-Synuklein umfassenden Polypeptids in der Hefezelle als Ergebnis einer gewissen Veränderung in der Expression oder Aktivität von anderen Proteinen oder zellulären Faktoren, die mit dem Polypeptid aufgrund der Veränderung im genetischen Hintergrund Wechselwirken, an. Dieses cytotoxische Profil ist mit dem neurodegenerativen Zustand des Menschen und/oder anderen Säugetiers korreliert. Daher kann man, wenn solch eine Hefezelle einer Kandidaten Substanz ausgesetzt wird, nach dem Potenzial der Verbindung, die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität zu verringern, durchmustern. Tabelle 1. Krankheiten mit anormaler Proteinablagerung
    Störung Protein Zelluläre Lokalisation der Aggregate
    Parkinson-Krankheit α-Synuklein Cytoplasmatisch
    Alzheimer-Krankheit Amyloid-β Extrazellulär
    Alzheimer-Krankheit Tau Intrazellulär
    Prion-Krankheiten PrP Extrazellulär
    Chorea Huntington Huntingtin Variabel intrazellulär
    Spinozerebelläre Ataxie 1 Ataxin-1 Nukleär
    Spinozerebelläre Ataxie 2 Ataxin-2 NV*
    Spinozerebelläre Ataxie 3 Ataxin-3 Nukleär, perinukleär
    Spinozerebelläre Ataxie 6 Kalziumkanal Cytoplasmatisch
    Spinozerebelläre Ataxie 7 Ataxin-7 Nukleär
    Spinale und bulbäre Muskelatrophie Androgenrezeptor Nukleär
    Dentatorubrale-Pallidolysiane Atrophie Atrophin-1 Nukleär
    Amyotrophe Lateralsklerose SOD1 Cytoplasmatisch
    Primäre systemische Amyloidose Leichte Kette von Immunglobulinen NV
    Familiäre amyloide Polyneuropathie Transthyretin Extrazellulär
    Senile systemische Amyloidose Transthyretin Extrazellulär
    Sekundäre systemische Amyloidose Serumamyloid A NV
    Diabetes Typ 2 Amylin („Islet amyloid polypeptide") NV
    Tabelle 1. (Fortsetzung)
    Injektionslokalisierte Amyloidose Insulin NV
    Störung Protein Zelluläre Lokalisation der Aggregate
    Amyloidose in Zusammenhang mit Hämodialyse β2-Microglobulin NV
    Erbliche zerebrale amyloide Angiopathie Cystatin-C NV
    Finnische erbliche systemische Amyloidose Gelsolin NV
    Erbliche nicht-neuropathische Lysozym NV
    • *NV, nicht verfügbar
  • In einer alternativen Ausführungsform wird die Hefezelle, die das Alpha-Synuklein umfassende Protein oder Polypeptid exprimiert, einer Anzahl an Wachstumsbedingungen ausgesetzt, die verursachen, dass die Hefezelle verringertes oder gar kein Wachstum aufweist. Beispielsweise kann man die Hefezelle mit Eisen oder einem Erzeuger von freien Radikalen in Verbindung bringen, der oxidativen Stress in der Zelle verursacht. Nochmals, eine Kandidatensubstanz kann mit dieser Hefezelle in Kontakt gebracht werden, um nach potentiellen Verbindungen zu durchmustern, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringern können.
  • Obwohl der Wirkmechanismus der so identifizierten Wirkstoffe irrelevant ist, schließen einige mögliche Mechanismen die Regulation der Proteinfaltung, die Inhibition der Proteinaggregation, das In-Lösung-Bringen von Fibrillen oder Aggregaten, etc., mit ein. Die auf Hefe beruhenden Durchmusterungssysteme der vorliegenden Erfindung stellen Hochdurchsatz- und kostengünstige Durchmusterungsverfahren zur Verfügung, die die Identifizierung von Verbindungen erlauben, die nützlich dabei sind, die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität zu verringern.
  • A. Hefezellen
  • Hefezellen stellen ein mächtiges System dar, um die molekulare Grundlage von Erkrankungen zu studieren, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen. Es ist gut bekannt, dass genetische und chemische Durchmusterungen in Hefe einfach durchgeführt werden können, da der Organismus leicht zu manipulieren ist. Hefezellen sind erfolgreich bei der Untersuchung mehrerer anderer mit Krankheiten in Verbindung stehenden menschlichen Proteinen verwendet worden, beispielsweise bei CFTR und Frataxin, die entsprechende Homologe in Hefe haben. Frataxin ist ein Protein, das an einer neurodegenerative Erkrankung beteiligt ist. Daher stellt Hefe aufgrund des Vorliegen von entsprechenden menschlichen Homologen ein ideales System zur Verfügung, um Proteine und Gene zu studieren, die an einer menschlichen Erkrankung beteiligt sind. Daher können in Hefezellen Erkrankungen, die mit Amyloid und Amyloidähnlicher Vermehrung und Spezifität in Verbindung stehen und die eine Hauptklasse der Krankheiten mit Proteinfalschfaltung bilden, untersucht werden. Zusätzlich haben Hefezellen einen nicht nach Mendel vererbten Erbfaktor, [PSI+], der sich über einen Prion-ähnlichen Mechanismus vermehrt, cm Phänomen, das ausführlich untersucht worden ist.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann jeder Hefestamm verwendet werden. Einige Beispiele für Hefezellstämme, die im vorliegenden Verfahren verwendet werden können, schließen Saccharomyces uvae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp.. Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp. und Geotrichum fermentans mit ein. Der bevorzugte Hefestamm ist Saccharomyces cerevisiae.
  • Da die Erfindung Durchmusterungsverfahren nach einer Verbindung, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringert, betrifft, ist eine Sorge, dass Hefezellen für einige der Kandidatenverbindungen nicht permeabel sind, oder einige der Kandidatenverbindungen nicht durch Hefezellen aufgenommen werden, oder sobald sie in die Hefezelle eintreten rasch metabolisiert werden oder aus der Hefezelle gepumpt werden. Die vorliegenden Erfinder erwägen, geeignete Mutationen von Hefestämmen zu verwenden, die entworfen worden, um diese Probleme auszuschließen. In einem Beispiel wird die Verwendung eines Hefestamms, der Mutationen in drei Genen trägt, die auf die Membran-Ausfluss-Pumpen Einfluss nehmen, nämlich das erg6-Gen, das pdr1-Gen und das pdr3-Gen, und das Erhöhen der Permeabilität für Arneimittel in Erwägung gezogen. Dieser besondere Stamm ist erfolgreich in der Krebsforschung verwendet worden, um Wachstumsregulatoren zu identifizieren (für Details siehe Webseite: http://dtp.nci.nih.gov).
  • B. Hitzeschock-Proteine
  • Hitzeschock-Proteine (HSPs), die mehrere in der Evolution konservierte Proteinfamilien umfassen, werden in einer physiologischen und biochemischen Reaktion auf abrupte Temperaturanstiege oder nach Exposition gegenüber einer Vielzahl anderer metabolischer Schadstoffe einschließlich Schwermetallen, oxidativem Stress, Toxinen, und Aminosäureanaloga, induziert. Diese Reaktion tritt in allen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen auf und ist gekennzeichnet durch die Unterdrückung der normalen Proteinsynthese und die Initiation der Transkription von HSP-kodierenden Genen. HSPs sind eine Klasse molekularer Chaperone und unter normalen Bedingungen erleichtern konstitutiv exprimierte HSPs die saubere Proteinfaltung und -Reifung, fördern die Proteintranslokation über Membranen, und regulieren die Hormonrezeptor- und Proteinkinase-Aktivität. HSPs erreichen dies in dem sie mit zellulären Proteinen assoziieren und deren Konformation regulieren.
  • Alle der wichtigsten HSPs, einschließlich jener, die konstitutiv exprimiert werden und jener, die in sehr hohen Konzentrationen als Reaktion auf Hitze und anderen Stress exprimiert werden, haben verwandte Funktionen; sie verringern Probleme, die durch die Falschfaltung und Aggregation von Proteinen verursacht werden. Allerdings hat jede wichtige HSP-Familie einen einzigartigen Wirkmechanismus. Einige fördern den Abbau von falsch gefalteten Proteinen (beispielsweise Lon, Ubiquitin und verschiedene Ubiquitin-konjugierende Enzyme); andere binden an verschiedene Typen von Faltungsintermediaten und hindern sie daran zu aggregieren (beispielsweise wirken die HSP70er dadurch, dass sie Proteine in einer ungefalteten Konformation halten, wohingegen HSP60/GroEL-Komplexe dadurch wirken, dass sie die Proteinfaltung erleichtern), wieder andere haben eine Reifungs- oder Regulationsfunktion gegenüber Molekülen, die Steroidhormonrezeptoren einschließen (beispielsweise die HSP90er), und wieder ein anderes HSP fördert die Reaktivierung von Proteinen, die bereits aggregiert sind (Hsp100) (Parsell und Lindquist, 1993; Parsell und Lindquist, 1994b).
  • Kleinere HSPs können die Aggregation und Hitze-Inaktivierung verschiedener Proteine, einschließlich Aktin, unterdrücken. Hsp40, das Säugerhomolog des bakteriellen DnaJ-Hitzeschock-Proteins, bindet an neue Polypeptidketten während sie von Ribosomen synthetisiert werden und vermittelt ihre richtige Faltung. Es ist kürzlich gezeigt worden, dass mit Polyglutamin erweitertes verkürztes Huntingtin-Protein mit Mitgliedern der Hsp40- und Hsp70-Chaperonfamilien in Abhängigkeit von der Polyglutaminlänge wechselwirkt (Krobitsch und Lindquist, 2000; Jana et al, 2000).
  • Viele Hsp40-Proteine sind sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen entdeckt worden, mit mindestens 16 Proteinen in Hefe und mehr als 10 Proteinen in tierischen Zellen (siehe Tabelle 2). Diese Proteine haben diverse zelluläre Lokalisationen und Funktionen entwickelt und sind in Abhängigkeit vom Vorliegen bestimmter konservierter Aminosäuren in der J-Domäne und dem Vorliegen verschiedener anderer Domänen in drei Untergruppen unterteilt worden. Sequenzalignments der verschiedenen Hsp40-Homologe aus Hefe zum Hsp40-Protein der Säugetiere, HDJ-1, deuten an, dass Sis1 mit einer Aminosäureidentität von 40% das am stärksten homologe ist. Das Sis1 aus Hefe und das HDJ-1 der Säugetiere sind beide Mitglieder der Klasse II. Sie enthalten eine N-terminale J-Domäne gefolgt von einem Glycin-Phenylalanin-reichen Bereich (GF-Bereich) und einen C-terminalen Bereich. Sowohl HDJ-1 als auch Sis1 fehlt das Zinkfingermotiv zwischen dem GF-Bereich und der C-terminalen Domäne.
  • Beide sind durch Hitze induzierbar und befinden sich im Nukleus und im Cytoplasma. Tabelle 2. Hitzeschock-Proteine
    Klasse 1 Klasse 2 Klasse 3
    Eubacteria DnaJ CbpA NolC DjqA
    Hefe Ydj1 Mdj1 Scj1 Xdj1 Sis1, Zuotin Caj1, Hlj1 Yir004w, Yjr097w Sec63, Jem1, Yj1162c, Yn1227c Yfr041c
    Tiere Hdj2 Tid56 Hsj1a&bp Hdj1 58ipk Mtj1, Auxilin Csp, Mida1
  • Für die vorliegende Erfindung wurde aufgrund der Verfügbarkeit mehrfach isogener Hefestämme mit verschiedenen Chaperon-Aktivitäten das Hefe-Modellsystem Saccharomyces cerevisiae verwendet. Jedoch kann, wie es auch der Fachmann erkennen wird, jeder andere Hefestamm ebenfalls verwendet werden kann. In einem Beispiel, das nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst wird, wurden Wildtyp-Hefestämme gentechnisch verändert, damit sie den N-terminalen Bereich des Huntingtins (Ht), ein Protein mit variabler Länge an Polyglutamat (poly-Q), einschließlich 25, 47, 72 oder 103 Resten, herstellt, die an das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) fusioniert waren. Die Herstellung der N-terminalen Fragmente von Ht ist ein zentrales Ereignis bei Chorea Huntington (HD), das dann sowohl in Menschen als auch in transgenen Tiermodellen zur Bildung von Ht-Aggregaten in den betroffenen Neuronen während des natürlichen Fortschreitens der Erkrankung führt. Die Expression des Ht-Proteins wurde mittels GFP-Fluoreszenz Analyse unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, überwacht. Proteine mit 25 Glutaminen (HtQ25) zeigten diffuse Fluoreszenz, wohingegen Proteine mit längeren Glutamingebieten (HtQ47, HtQ72, oder HtQl03) eine proportional größere Tendenz zur Aggregation aufwiesen. Differenzieller Sedimentationsanalyse der Zelllysate offenbarte, dass HtQ25 und HtQ47 vollkommen löslich waren, wohingegen HtQ72 und HtQ103 weitestgehend unlöslich waren. Diese Befunde zeigten, dass in Hefezellen, ebenso wie in Zellen von Säugetieren, die Aggregation von Ht-Fragmenten von der Länge des Polyglutaminabschnitts abhängt.
  • Die vorliegenden Erfinder haben dann die Wirkung von Regulatoren des Proteinabbaus auf die Polyglutamin-abhängige Aggregation untersucht. Dafür wurden Stämme mit drei verschiedenen, einen Teilverlust der Funktion bewirkenden Mutationen im Proteasom/Ubiquitinierungs-Stoffwechselweg (das Ubiquitin-aktivierende Enzym; die katalytische Untereinheit des 20 S- Proteasoms; oder eine Untereinheit des regulatorischen Komplexes des 19 S Proteasoms) verwendet und es wurde kein Unterschied in der Fluoreszenz oder im Sedimentationsmuster beobachtet.
  • Die Veränderung der Expressionsniveaus der meisten Chaperone hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die Aggregat-Bildung. Jedoch modulierte die Überexpression von Sis1 (das Hefe-Homolog zum Hdj-1 der Säugetiere), Hsp70 oder Hsp104 die Aggregation von HtQ72 und HtQl03. In Hsp104-defizienten Hefezellen blieben HtQ72 oder HtQ103 vollkommen löslich. Obwohl bei keinem dieser Fragmente, mit oder ohne Aggregation, Toxizität beobachtet wurde, haben die Erfinder gezeigt, dass die Aggregation von Huntingtin in Hefezellen von einem Gleichgewicht der Chaperon-Aktivitäten in der Zelle abhängt.
  • Da man von Sis1, das das Hefe-Homolog von Hsp40 ist, weiß, dass es den Aggregationszustand von Huntingtin beeinflusst und essenziell für polyQ-induzierte Toxizität in verschiedenen Modellsystemen ist, haben die vorliegenden Erfinder eine detaillierte Analyse von Sis1 durchgeführt. Hefestämme, die technisch so hergestellt worden waren, dass sie verschiedene Bereiche des Sis1-Proteins exprimieren, wurden mit den Huntingtin-GFP-Fusionskonstrukten transformiert. Die Aggregationsmuster von HtQ72 und HtQ103 wurden durch die Herstellung von mutierten Sis1-Proteinen merklich verändert. Anstelle einer kleinen Anzahl an großen Aggregaten lag eine große Anzahl an kleineren Aggregaten vor. Vor allem wurde in einem Sis1-Konstrukt die Veränderung der Aggregation von einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Hefezelle begleitet. Die Erfinder fanden heraus, dass diese Sis-1-induzierte Toxizität durch Co Expression von Hsp104 verringert wird. Hsp104 verringert ebenfalls sowohl die Aggregatsbildung als auch den Zelltod in einem Säugetierzell-Modell für die Huntingtin-Toxizität und in einem C. elegans-Modell unter Einsatz einfacher polyQ-GFP-Fusionen. Daher korreliert die durch Sis1-Veränderungen induzierte Toxizität von Huntingtin in Hefe mit der Ht-Toxizität im Menschen.
  • Daher haben die vorliegenden Erfinder Systeme entwickelt, die Hefe als ein Modellsystem für die Analyse von Proteinen nutzen, die an der Bildung von Fibrillen und/oder Proteinen beteiligt sind, die unlösliche Ablagerungen bilden, beispielhaft vertreten durch Proteine wie Huntingtin. Der Fachmann wird erkennen, dass Huntingtin lediglich ein nicht-beschränkendes Beispiel ist. Das hierin entwickelte System und die hierin entwickelten Verfahren erlauben die Identifizierung von Wirkstoffen, die den Konformationszustand solcher Proteine in einer lebenden Zelle ohne potentiellen Komplikationen mit Toxizität (beispielsweise der Induktion von Stressantworten, dem Auftreten von Suppressormutationen, etc.) beeinflussen.
  • Um potentielle pharmazeutische und therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, die Proteine beeinflussen, die an der Bildung von Fibrillen und/oder Proteinen beteiligt sind, die aggregieren und unlösliche Ablagerungen bilden, zogen die Erfinder Experimente in Erwägung, in denen ein Hefestamm eingesetzt wird, der ein verkürztes Sis1-Protein und ein aggregierendes Protein oder Fibrillen bildendes Protein, das Toxizität verursacht, beispielsweise HtQ103, exprimiert. Für das Beispiel der Ht-Proteine ziehen die Erfinder die Verwendung von Hefestämmen mit mutiertem Sis1-Hintergrund in Erwägung, die HtQ25 (Kontrolle, nicht toxisch), HtQ47 oder HtQ72 (nicht toxisch, aber potentiell schon), oder HtQl03 (toxisch) exprimieren. Diese Hefezellen werden in serieller Verdünnung auf Selektionsmedium mit oder ohne den Testwirkstoffen aufgetragen. Eine erhöhte Wachstumsrate auf den Testplatten im Vergleich zu Kontrollplatten wird Verbindungen mit einem Potenzial, die Toxizität zu reduzieren, identifizieren; eine verringertes Wachstum wird Verbindungen, die die Toxizität erhöhen könnten, identifizieren. Die Mikroskopanalyse wird entscheiden, ob diese Wirkstoffe auch die Aggregatbildung beeinflussen und wird GFP-Fusionsproteine verwenden. Diese Durchmusterung wird auch mit Hefestämmen durchgeführt werden, die nur den N-terminalen Bereich von Ht, nicht an GFP fusioniert, exprimieren. Zusätzlich ziehen die Erfinder in Erwägung, eine Bibliothek von bei der FDA für die Verwendung am Menschen zugelassener Verbindungen zu durchmustern, um für Erkrankungen, die eine anomale Proteinablagerung, und/oder Fibrillogenese, und/oder Amyloidose, und/oder unlösliche Ablagerungen bildende Protein-Aggregation mit sich bringen, therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren. Die Erfinder ziehen auch in Erwägung eine großformatige kombinatorische chemische Bibliothek und genomische und cDNA-Bibliotheken zu durchmustern, um chemische und genetische Wirkstoffe zu identifizieren, die einen therapeutischen Nutzen zur Verfügung stellen können. Ähnliche Experimente werden für anderen Fibrillen bildende/Aggregat bildende Proteine in Erwägung gezogen, wie jene, die in Tabelle 1 aufgeführt sind.
  • Daher können Mutationen in den HSPs zu Erkrankungen führen, die im Ergebnis unter anderem von Protein-Falschfaltung und Proteinaggregation verursacht werden. In der vorliegenden Erfindung sind Hefezellen mit Mutationen in HSP-Genen verwendet worden, um rekombinante Proteine zu exprimieren, die an Krankheiten beteiligt sind, die mit der Falschfaltung von Proteinen in Verbindung stehen. Dies führt zu Hefezellen, die geringere oder gar keine Wachstumsraten haben, was cytotoxische Effekte aufgrund der Falschfaltung des rekombinanten Proteins in der Zelle, der die Fähigkeit, die Falschfaltung zu korrigieren, fehlt, anzeigt. Diese Hefezellen sind verwendet worden, um Durchmusterungsverfahren für die Identifizierung von Wirkstoffen zu entwickeln, die die Proteinfaltung korrigieren können und dadurch einen therapeutischen oder prophylaktischen Nutzen für Erkrankungen zur Verfügung stellen, die auf einer Protein-Falschfaltung beruhen.
  • C. Andere Toxizität-induzierende Wirkstoffe
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung wurde für Alpha-Synuklein gezeigt, dass es toxische Auswirkungen hat, wenn die Hefezelle anderen Toxizität-induzierenden Wirkstoffen ausgesetzt wird. Die Toxizität-induzierenden Wirkstoffe können eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein Salz, ein Metall, ein chemotherapeutischer Wirkstoff, ein Alkohol, ein Translationsinhibitor, NSAID, eine DNA-interkalierender Substanz, eine chelatbildende Substanz, ein Liposom, ein Antibiotikum, ein Vitamin, ein Proteasom-Inhibitor, ein Antioxidationsmittel, oder ein reduzierender Wirkstoff sein (siehe in Tabelle 3 aufgeführt einige nicht beschränkende Beispiele). Daher verursachen beispielsweise Veränderungen in den Wachstumsbedingungen durch Exposition gegenüber einem der oben aufgeführten Wirkstoffe Toxizität in Hefezellen. Die Toxizität kann auf oxidativen Stress oder Bedingungen, die die Stressreaktionswege der Hefezelle verändern, zurückgehen. Oxidativer Stress ist hier definiert als jeder Prozess, der den Oxidations-/Atmungsmechanismus einer Zelle beeinflusst. Dies kann ein Ergebnis der Erzeugung freier Radikale oder von Giften für Atmungs(ketten)enzyme sein. Tabelle 3. Mutmaßliche Toxizität-induzierende Wirkstoffe
    Kohlenstoffquellen
    YPD
    Dextrose 2% (SD) pH 4,9
    Dextrose 2% (SD) pH 6,0
    Dextrose 2% (SD) pH 6,8
    Fermentierbar
    Galaktose 2%
    Maltose
    Melibiose
    Raffinose
    Saccharose
    Ölsäure
    Laurylsäure
    Arabinose 2%
    Nicht-Fermentierbar
    K-Acetat 3%
    Ethanol 3%
    Glycerin 2%
    Glycerin 20%
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    Stickstoffquellen
    Allantoin 1 mg ml-1
    Ammonium (NH4Cl) 1 mg ml-1
    Glutamat 1 mg ml-1
    Glutamin 1 mg ml-1
    Ornithin 1 mg ml-1
    Prolin 1 mg ml-1
    Serin 1 mg ml-1
    Threonin 1 mg ml-1
    Salze und Metalle
    A1F3 1 mM
    BaCl2 50 mM
    CaCl2 0,5 M
    CdCl2 20 μM
    CdCl2 50 μM
    CoCl2 750 μM
    CoCl2 300 μM
    CsCl 0,1 M
    CsCl 25 mM
    CuSO4 0,5 mM
    CuSO4 2,5 mM
    CuSO4 5 mM
    Fe2(SO4)3 8,5 mM
    Fe2(SO4)4 20 mM
    FeCl2 10 mM
    FeCl2 23 mM
    FeCl2 50 mM
    FeCl3 20 mM
    FeCl3 8,5 mM
    FeSO4 50 mM
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    FeSO4 23 mM
    KI
    LiCl 0,3 M
    MgCl2 0,5 M
    MgSO4 0,5 M
    MnCl2 4 mM
    NaCl 0,3 M
    NaCl 0,7 M
    NH4Cl 0,9 M
    NiCl2 850 μM
    RbCl 0,2 M
    ZnCl2, 2,5 mM
    ZnCl2 10 mM
    ZnCl2 5 mM
    Inhibitoren
    1,10-Phenanthrolin 30 μg/ml
    2,2-Dipyridil 50 μg/ml
    4-NQO 2,5 μg/ml
    4-NQO 2,5 μg.ml
    5-Azacytidin 100 μg/ml (toxisch)
    5-Fluorcytosin 0,02 mg/ml
    5-Fluoruracil
    6-Azauracil 30 μg/ml
    8-Hydroxyquinolin 26 μg/ml
    Actinomycin D 45 μg/ml (kein DMSO)
    Actinomycin D DMSO
    Anisomycin 20 μg/ml
    Anisomycin 50 μg/ml
    Antimycin A 1 μg/ml
    Aspirin (Acetylsalicylsäure)
    Aurintricarbonsäure 100 μM
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    BAPTA 20 mM
    Benomyl 1 μg/ml (37°C)
    Benomyl 10 μg/ml (37°C)
    Benomyl 20 μg/ml (37°C)
    Benomyl 40 μg/ml
    Bleomycin 10 μg/ml
    Brefeldin A 100 μg/ml
    Koffein 1 mM
    Koffein 10 mM
    Calcofluor Weiß (Fluoreszenz B28) 1 mg/ml
    Camptothecin 0,1 μg/ml
    Camptothecin 5 μg/ml
    Canavanin 30 μM (SD-arg)
    Carbonyl-Cyanid m-Chlorphenylhydrazon 1–3 μM
    Cercosporamid 5 μg/ml
    Cerulenin 0,5 μg/ml
    Chlorambucil 3 mM)
    Cyklopyroxolamin
    Cinnarizin 100 μg/ml
    Cycloheximid 0,2 μg ml-1 (toxisch & gefährlich für die Umwelt)
    Cycloheximid 3 μg m 1-1
    Daunomycin 0,05 mg/ml
    D-his 0,5 mM (L-pro)
    Diamid 1 mM
    Diamid 2 mM
    Diltiazemhydrochlorid 2 mg/ml
    Distamycin A SD 80–400 μM
    DL-C-Allylglycin 0,025 mg/ml
    EDTA 1 mg/ml
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    EGTA 10 mM
    Emetin 2 μg/ml mg/ml
    Erythromycin 200 μg/ml
    Ethanol 10%
    Ethanol 6%
    Ethidiumbromid 25 μg/ml
    Ethidiumbromid 50 μg/ml
    Etoposid
    Fenpropinorph 0,3 μM
    Flufenaminsäure
    Formamid 2%
    Formamid 3%
    Griseofulvin 100 μg/ml
    GuHCl 20 mM
    GuHCl 5 mM
    Hydroxyharnstoff 10 mg/ml
    Hydroxyharnstoff 5 mg/ml
    Ibruprofen
    L-Ethionin 1 μg/ml
    Menadion 20 bis 50 μM
    Mevinolin 400 μg/ml
    Micocystin-LR 0,2 und 1 μM
    Na-ortho-Vanadat 3 mM
    Nalidixinsäure; verwende 200 μg/ml
    NBQX
    NEM 0,01 mM
    Neomycin 5 mg/ml
    Nikotinsäure
    Nocodazol 1 μg/ml
    Nocodazol 50 μg/ml
    Nocodazol 10 μg/ml
    Nystatin 2 μg/ml
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    o-DNB 175 μM
    Oligomycin 1 μg/ml (YPGE)
    Oligomycin 2,5 μg/ml (YPGE)
    Oligomicin 5 μg/ml (YPGE)
    Papulacandin B 20 μg/ml
    Paracetamol
    Paraquat 1 mM (Methylviologen)
    Paraquat 10 mM
    Paraquat 5 mM
    Paromomycin 100 μg/ml
    Paromomycin 200 μg/ml
    Paromomycin Sulfat 2 mg/ml
    Phenylethanol 2 mg/ml
    Phenylethanol 5 mg/ml
    PMSF 4–5 mM
    Protaminsulfat 750 μM
    Protaminsulfat 250 μM
    Quinolinsäure
    Rapamycin 0,1 μg/ml
    SD-arg 1 μg/ml Canavanin
    SD-arg 30 μg/ml Canavanin
    Natriumfluorid 5 mM
    Staurosporin 0,1 μg/ml (37°C)
    Staurosporin 1 μg/ml (37°C)
    Streptonigrin 1 μg/ml
    Thiamin
    Thiolutin 3 bis 9 μg/ml
    Trifluoperazin 20 μM
    Tunicamycin 2,5 μg/ml
    Vanadat 1 mM
    Vanadat 0,1 mM
    Vanadat 2 mM
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    Vanadat 4 mM
    Vanadat 7 mM + KCl
    Vanadat kein KCl
    Verapamilhydrochlorid 100 μg/ml
    Verrucarin A 2,45 μg/ml
    Liposomen
    DOSPA (Lipofectamin)
    DOSPER
    DOGS (Transfektam)
    DDAB
    DOPE
    Antibiotika
    Ampicillin
    Amphothericin B (Fungizone) 0,045 μg/ml
    Amphothericin B 45 μg/ml
    Chloramphenicol
    Cyclosporin A
    Kanamycin
    Vitamine
    Vitamin A
    Vitamin B12
    Vitamin C (Ascorbat)
    Vitamin D
    Vitamin E (Tocopherol)
    Vitamin K
    Proteasom-Inhibitoren
    ALLN 50 μM
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    E64d 100 μM
    LLM 50 μM
    MG132 50 μM
    Quinacrin 2 μM
    Chloroquin 4,2 μM
    Chloroquin 10 μM
    Clioquinol 5 μM
    (R)-(-)-3-Hydroxybutyrat***
    D-beta-Hydroxybutyrat
    DOPAMIN
    L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA)
    Amyloid-bezogen
    Kongo Rot 5 μM
    Thiflavin S
    Thioflavin T
    Chrysamin G 1,0 μM (3 bis 30 μM in cos-Zellen)
    Direct Orange 6 μM
    Direct Yellow 20 0,5 μM
    N,N'-Terephtalylidenbis-(4-aminosalicylsäure) > 100 μM
    4,4'-bis-(Carboxyphenylamino)-3,3'-dimethoxybiphenyl > 100 μM
    Myo-Inositol 1,5 mg/ml
    Epi-Inositol 1,5 mg/ml
    Scyllo-Inostol 1,5 mg/ml
    Desoxycorticosteron
    Antioxidationsmittel
    6-Hydroxydopamin
    Carvedilol
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    Deferoxaminmesilat
    Ferritin
    Estradiol
    Gluthation
    NO
    Reduzierende Wirkstoffe
    2-Mercaptoethanol
    DTT
    Sonstige
    K-Acetat + PB
    UV
    Osmotischer Stress
    KCl 1,3 M
    Sorbitol 1,5 M
    Temperatur °C
    30
    38
    RT
    14
    Thermotoleranz
    Ethanolgradient
    Osmolyte
    Trehalose
    Glycerin 20%
    Tabelle 3. (Fortsetzung)
    Kontrollplatten für Lösungsmittel/Zusatzstoffe
    0,5 M KCl
    Aceton 1%
    Chloroform
    DMF
    DMSO 5%
    DMSO 1%
    DMSO/EtOH
    Methanol 5%
  • D. Nukleinsäuren
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es, Nukleinsäuren, die für ein Protein oder Polypeptid kodieren, das Alpha-Synuklein umfasst, in eine Hefezelle zu übertragen, so dass die Hefezelle das Protein exprimiert. In einer Ausführungsform kodieren die Nukleinsäuren für ein Protein oder Polypeptid voller Länge, im wesentlichen voller Länge oder für eine funktionell äquivalente Form des Proteins oder Polypeptids. In zusätzlichen Ausführungsformen wird einer Hefezelle ein verkürztes Polypeptid oder ein Polypeptid mit internen Deletionen zur Verfügung gestellt. In anderen Ausführungsformen ist das Polypeptid ein menschliches oder aus anderen Säugetieren stammendes Homolog.
  • In anderen Ausführungsformen kann die Hefezelle mit einem Hitzeschock-Protein transfiziert werden. In wieder anderen Aspekten zieht die Erfindung die Ko-Transfektion der Hefezelle mit jedem Protein in Erwägung, das daran beteiligt ist, mit anderen zellulären Proteinen zu Wechselwirken und bei der Proteinfaltung, Proteinaggregation etc., zu helfen.
  • Daher bringt in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Entwicklung des auf Hefe beruhenden Durchmusterungssystems die Transfektion einer Hefezelle mit einem Expressionskonstrukt mit sich, das für ein Protein oder Polypeptid, das Alpha-Synuklein umfasst, kodiert.
  • Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen mindestens eine Nukleinsäure, die für ein Protein oder Polypeptid, das Alpha-Synuklein umfasst, oder ein Hitzeschock-Protein oder ein Protein, das an Wechselwirkungen mit anderen Proteinen beteiligt ist, kodiert. In bestimmten Aspekten umfasst die Nukleinsäure eine wildtypische oder mutierte Nukleinsäure. In besonderen Aspekten kodiert die Nukleinsäure für mindestens eine transkribierte Nukleinsäure. In besonderen Aspekten kodiert die Nukleinsäure, die für ein Protein oder Polypeptid, das Alpha-Synuklein umfasst, oder ein Hitzeschock-Protein oder ein Protein, das an Wechselwirkungen mit anderen Proteinen beteiligt ist, kodiert, für mindestens ein Protein, Polypeptid oder Peptid, oder biologisch funktionelles Äquivalent davon. In weiteren Aspekten kodiert die für ein Protein oder Polypeptid, das Alpha-Synuklein umfasst, kodierende Nukleinsäure für mindestens ein Nukleinsäuresegment von SEQ ID NO: 1 (Alpha-Synuklein), oder mindestens ein biologisch funktionelles Äquivalent davon. In einem weiteren Aspekt kodiert die für ein Hitzeschock-Protein kodierende Nukleinsäure für mindestens ein Nukleinsäure Segment von SEQ ID NO: 7 (HSP40-Homolog der Hefezelle, in Hefezellen auch Sis1 genannt) oder für mindestens ein biologisch funktionelles Äquivalent davon.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch durch Anwendung von Nukleinsäure-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann bekannt sind oder hierin beschrieben sind, die Isolierung oder Schaffung von mindestens einem rekombinanten Konstrukt oder mindestens einer rekombinanten Wirtszelle. Das rekombinante Konstrukt oder die rekombinante Wirtszelle kann mindestens eine Nukleinsäure, die für ein Protein oder Polypeptid, das Alpha-Synuklein umfasst, kodiert, umfassen, und kann mindestens ein Protein, Polypeptid, oder Peptid, das Alpha-Synuklein umfasst, oder zumindest ein biologisch funktionelles Äquivalent davon, exprimieren.
  • In einigen Ausführungsformen bezieht sich die Erfindung auf DNA-Sequenzen, die durch Datenbank-Zugangsnummern identifiziert werden: Genbank NC_001146, was die Zugangsnummer für das Chromosom ist, auf dem sich das SIS1-Gen befindet und wo SIS1 durch SGD ID S0004952 ausgewiesen wird; Genbank NM_000345 für Alpha-Synuklein; und Genbank NT_006081 für die Zugangsnummer für Chromosom 4, wo sich das Huntingtin-Gen befindet.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "wildtypisch" auf die natürlich auftretende Sequenz einer Nukleinsäure an einem genetisch Locus im Genom eines Organismus, sowie Sequenzen, die von solch einer Nukleinsäure transkribiert oder translatiert werden. Daher kann sich der Begriff "wildtypisch" auch auf die Aminosäuresequenz, die von der Nukleinsäure kodiert wird, beziehen. Da ein Genlocus mehr als eine Sequenz oder Allele in einer Population von Individuen haben kann, umfasst der Begriff "wildtypisch" alle solchen natürlich vorkommenden Allele. Wie hierin verwendet meint der Begriff "polymorph", dass an einem Genlocus in den Individuen einer Population Variation auftritt (d. h. zwei oder mehr Allele existieren). Wie hierin verwendet bezieht sich "mutiert" auf eine Veränderung in der Sequenz einer Nukleinsäure oder seinem kodierten Protein, Polypeptid, oder Peptid, die das Ergebnis von DNA-Rekombinationstechniken ist.
  • Eine Nukleinsäure kann mittels jeder Technik, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, hergestellt werden. Nicht-beschränkende Beispiele für eine synthetische Nukleinsäure, insbesondere ein synthetisches Oligonukleotid, schließen eine mittels chemischer in vitro Synthese unter Verwendung von Phosphotriester, Phosphit oder Phosphoramidit -Chemie und Festphasen-Techniken wie beschrieben in EP 266,032 , oder über Desoxynucleosid H-Phosphonat-Intermediate wie von Froehler et al, 1986, und U.S. Patent Seriennummer 5,705,629 beschrieben, hergestellte Nukleinsäure mit ein. Ein nicht-beschränkendes Beispiel für eine enzymatisch hergestellte Nukleinsäure schließt diejenigen mit ein, die durch Enzyme in Vervielfältigungsreaktionen wie PCRTM (siehe beispielsweise U.S. Patent 4,683,202 und U.S. Patent 4,682,195 ) oder die in U.S. Patentnummer 5,645,897 beschriebene Oligonukleotidsynthese hergestellt werden. Ein nicht-beschränkendes Beispiel für eine biologisch hergestellte Nukleinsäure schließt die rekombinante Nukleinsäureherstellung in lebenden Zellen, beispielsweise die Herstellung in Bakterien über einen rekombinanten DNA-Vektor mit ein (siehe beispielsweise Sambrook et al 1989).
  • Eine Nukleinsäure kann auf Polyacrylamidgelen, mit Cäsiumchloridzentrifugationsgradienten oder mit jedem anderen Mittel, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, gereinigt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al 1989).
  • Der Begriff "Nukleinsäure" wird sich im Allgemeinen auf mindestens ein Molekül oder einen Strang DNA, RNA oder ein Derivat oder Nachahmerstoff („mimic") davon beziehen, das/der mindestens eine Nukleobase, wie zum Beispiel eine natürlich auftretende Purin- oder Pyrimidinbase, die man in DNA findet (z. B. Adenin „A", Guanin „G", Thymin „T" und Cytosin „C"), oder RNA (z. B. A, G, Uracil „U", und C) beziehen. Der Begriff "Nukleinsäure" umfasst die Begriffe "Oligonukleotid" und "Polynukleotid". Der Begriff "Oligonukleotid" bezieht sich auf mindestens ein Molekül mit einer Länge zwischen etwa 3 und etwa 100 Nukleobasen. Der Begriff „Polynukleotid" bezieht sich auf mindestens ein Molekül mit einer Länge von mehr als etwa etwa 100 Nukleobasen. Diese Definitionen werden sich im Allgemeinen auf mindestens ein einzelsträngiges Molekül beziehen, umfassen aber in spezifischen Ausführungsformen auch mindestens einen zusätzlichen Strang, der teilweise, im Wesentlichen oder vollständig komplementär zu dem mindestens einen einzelsträngigen Molekül ist. Daher kann eine Nukleinsäure mindestens ein doppelsträngiges Molekül oder mindestens ein drei-strängiges Molekül umfassen, das einen oder mehrere komplementäre Stränge oder "Komplemente" einer bestimmten einen Strang des Moleküls umfassenden Sequenz, umfasst.
  • In bestimmten Ausführungsformen bezieht sich ein "Gen" auf eine Nukleinsäure, die transkribiert wird. Wie hierin verwendet ist ein "Gensegment" ein Nukleinsäuresegment eines Gens. In bestimmten Aspekten schließt das Gen regulatorische Sequenzen, die an der Transkription, oder Botschaftsherstellung oder -Zusammenstellung beteiligt sind, mit ein. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Gen transkribierte Sequenzen, die für ein Protein, Polypeptid oder Peptid kodieren. Um bei der hier beschriebenen Terminologie zu bleiben, kann ein "isoliertes Gen" transkribierte Nukleinsäure, regulatorische Sequenzen, kodierende Sequenzen oder dergleichen, im Wesentlichen von jeder anderen solchen Sequenz isoliert, beispielsweise anderen natürlich auftretenden Genen, regulatorischen Sequenzen, Polypeptid- oder Peptid-kodierenden Sequenzen, etc., umfassen. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "Gen" der Einfachheit halber verwendet, um auf eine Nukleinsäure zu verweisen, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die transkribiert wird, und das Komplement dazu. In bestimmten Aspekten umfasst die transkribierte Nukleotidsequenz mindestens eine funktionelle, für ein Protein, Polypeptid und/oder Peptid kodierende Einheit. Wie der Fachmann verstehen wird, schließt dieser funktionelle Ausdruck "Gen" sowohl genomische Sequenzen, RNA- oder cDNA-Sequenzen, oder kleinere technisch erzeugte Nukleinsäuresegmente, einschließlich Nukleinsäuresegmente von nicht-transkribierten Teilen eines Gens, einschließlich aber nicht beschränkt auf die nicht transkribierten Promotor- oder Enhancer-Bereiche eines Gens, mit ein. Kleinere technisch erzeugte Gen-Nukleinsäuresegmente können Proteine, Polypeptide, Domänen, Peptide, Fusionsproteine, Mutanten und/oder dergleichen exprimieren, oder können unter Verwendung von Nukleinsäuremanipulationstechnologie angepasst worden sein, um diese zu exprimieren. Daher bezieht sich ein "verkürztes Gen" auf eine Nukleinsäuresequenz, der ein Abschnitt zusammenhängender Nukleinsäurereste fehlt, der für einen Teil eines an der Proteinaggregation und/oder Fibrillenbildung beteiligten Proteins voller Länge bzw. Polypeptids kodiert. Beispielsweise kann ein verkürztes Gen die Nukleinsäuresequenz für den N-terminalen Bereich des Proteins oder Polypeptids, das an der Proteinaggregation und/oder Fibrillenbildung beteiligt ist, oder eines Hitzeschock-Protein-Gens nicht enthalten.
  • "Im wesentlichen isoliert von anderen kodierenden Sequenzen" bedeutet, dass das Gen von Interesse, in diesem Fall das Gen, das entweder für ein Protein oder Polypeptid, das an der Proteinaggregation und/oder Fibrillenbildung beteiligt ist; oder ein Hitzeschock-Protein; oder jedes andere molekulare Chaperon-Protein kodiert, den wesentlichen Teil des kodierenden Bereichs der Nukleinsäure bildet, oder dass die Nukleinsäure große Teile natürlich auftretender kodierender Nukleinsäuren, beispielsweise große Chromosomenfragmente, andere funktionelle Gene, RNA oder cDNA-kodierende Bereiche, nicht enthält. Natürlich bezieht sich das auf die ursprünglich isolierte Nukleinsäure, und schließt nicht Gene oder kodierende Bereiche aus, die später zu der Nukleinsäure mittels Nukleinsäure-Rekombinationstechniken hinzugefügt werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure ein Nukleinsäuresegment. Wie der Begriff hier verwendet wird, sind "Nukleinsäuresegmente" kleinere Fragmente einer Nukleinsäure, wie z. B. als nicht-beschränkendes Beispiel jene, die nur einen Teil einer an der Proteinaggregation und/oder Fibrillenbildung beteiligen Peptid- oder Polypeptidsequenz kodieren. Daher kann ein „Nukleinsäuresegment" jeden Teil der Gensequenz von etwa zwei Nukleotiden bis zur vollen Länge des kodierenden Bereichs umfassen. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das "Nukleinsäuresegment" die Gensequenz voller Länge.
  • Ausgehend von einer bestimmten Nukleinsäuresequenz können verschiedene Nukleinsäuresegmente entworfen werden, und sie können jede Länge haben. Durch die Zuordnung von numerischen Werten zu einer Sequenz, beispielsweise ist der erste Rest 1, der zweite Rest 2, etc., kann ein Algorithmus erzeugt werden, der alle Nukleinsäuresegmente definiert: n bis n + ywobei n eine ganze Zahl von 1 bis zur letzten Nummer der Sequenz und y die Länge des Nukleinsäuresegments minus eins ist, wobei n + y nicht die letzte Zahl der Sequenz übersteigt. Daher entsprechen für ein 10-mer die Nukleinsäuresegmente den Basen 1 bis 10, 2 bis 11, 3 bis 12, ... und/oder so weiter. Für ein 15-mer entsprechen die Nukleinsäuresegmente den Basen 1 bis 15, 2 bis 16, 3 bis 17, ... und/oder so weiter. Für ein 20-mer entsprechen die Nukleinsäuresegmente den Basen 1 bis 20, 2 bis 21, 3 bis 22, ... und/oder so weiter. In bestimmten Ausführungsformen kann das Nukleinsäuresegment eine Sonde oder ein Primer sein.
  • Die Nukleinsäure(n) der vorliegenden Erfindung, die entweder ein Protein oder Polypeptid, das Alpha-Synuklein umfasst; oder ein Hitzeschock-Protein; oder jedes andere molekulare Chaperon-Protein kodiert/kodieren, kann/können unabhängig von der Länge der Sequenz selbst, mit anderen Nukleinsäuresequenzen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, mit Promotoren, Enhancern, Polyadenylierungssignalen, Restriktionsenzymschnittstellen, Mehrfachklonierungsstellen, kodierenden Segmenten, und dergleichen kombiniert werden, um eine oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte zu erzeugen. Die Gesamtlänge kann zwischen den Nukleinsäurekonstrukten erheblich variieren. Daher kann ein Nukleinsäuresegment beinahe jeder Länge eingesetzt werden, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise von der Erleichterung der Zubereitung oder Verwendung in dem geplanten Nukleinsäurerekombinationsprotokoll beschränkt wird.
  • (a) Nukleinsäurevektoren für die Expression von Komponenten des Durchmusterungsverfahrens in Hefezellen
  • Ein Gen, das eine Komponente des Assaysystems der Erfindung kodiert, beispielsweise Alpha-Synuklein oder ein Hitzeschock-Protein; oder jedes andere molekulare Chaperon; oder sogar eine Kandidatensubstanz, die einen therapeutischen Wert für mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität hat, kann in eine Hefezelle unter Verwendung eines Nukleinsäurevektors, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Plasmiden, linearen Nukleinsäuremolekülen, artifiziellen Chromosomen und episomalen Vektoren, transfiziert werden. Hefeplasmide sind natürlich bevorzugt und drei Systeme, die für die rekombinante Plasmidexpression und -Replikation in Hefe verwendet wurden, schließen ein:
    • 1. Integrierende Plasmide: Ein Beispiel für solch ein Plasmid ist YIp, das in einer Kopie pro haploidem Genom beibehalten wird, und nach Mendel vererbt wird. Solch ein Plasmid, das ein Gen von Interesse, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein selektionierbares Gen enthält (üblicherweise einen Antibiotika-Resistenz-Marker) wird in Bakterien hergestellt. Der gereinigte Vektor wird innerhalb des selektionierbaren Gens linearisiert und verwendet, um kompetente Hefezellen zu transformieren. Unabhängig vom verwendeten Plasmidtyp, werden Hefezellen üblicherweise mittels chemischer Verfahren (z. B. wie in Rose et al, 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. beschrieben) transformiert. Die Zellen werden üblicherweise mit Lithiumacetat behandelt, um Transformationseffizienzen von etwa 104 Kolonie-bildenden Einheiten (transformierten Zellen)/μg an DNA zu erhalten. Hefen führen homologe Rekombination so durch, dass der geschnittene, selektionierbare Marker mit dem mutierten (üblicherweise eine Punktmutation oder eine kleine Deletion) Wirtsgen rekombiniert, um die Funktion wiederherzustellen. Transformierte Zellen werden dann auf Selektionsmedium isoliert.
    • 2. ARS-CEN mit niedriger Kopienzahl: Ein Beispiel ist YCp und solche Plasmide enthalten die autonom sich replizierende Sequenz (ARS1), eine Sequenz von ungefähr 700 bp Länge, die, wenn sie auf einem Plasmid liegt, die Replikation in Hefe gestattet, und eine Centromersequenz (CEN4), wobei Letztere die mitotische Stabilität gewährleistet. Diese liegen normalerweise in 1–2 Kopien pro Zelle vor. Die Entfernung der CEN-Sequenz ergibt ein YRp-Plasmid, das üblicherweise in 100–200 Kopien pro Zelle vorliegt; jedoch ist dieses Plasmid sowohl mitotisch als auch meiotisch instabil.
    • 3. 2p Ringe mit hoher Kopienzahl: Diese Plasmide enthalten eine Sequenz von ungefähr 1 Kb Länge, die 2μ-Sequenz, die als Hefe-Replikon wirkt, was zu höheren Plasmidkopienummern führt; diese Plasmide sind jedoch instabil und bedürfen für die Aufrechterhaltung der Selektion. Die Kopienzahl wird erhöht indem man auf dem Plasmid ein Selektionsgen hat, das operativ mit einem verkrüppelten Promotor verknüpft ist. Das ist üblicherweise das LEU2-Gen mit einem verkürzten Promotor (LEU2-d), so dass niedrige Konzentrationen des Leu2p-Proteins hergestellt werden; daher zwingt die Selektion auf einem Leucin-depletierten Medium zu einer Erhöhung der Kopienzahl, um eine für das Zellwachstum ausreichende Menge an Leu2p herzustellen.
  • Beispiele für Hefeplasmide, die für die Erfindung nützlich sind, schließen die YRp-Plasmide (beruhen auf autonom sich replizierenden Sequenzen, oder ARS) und die YEp-Plasmide (beruhen auf dem 2μ-Ring) mit ein, für die YEp24- und die YEplac-Plasmidserien Beispiele sind (Gietz und Sugino, 1988). (Siehe Sikorski, „Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae" in Plasmid, A Practical Approach, Hrsg. K. G. Hardy, IRL Press, 1993; und Yeast Cloning Vectors and Genes, Current Protocols in Molecular Biology, Abschnitt II, Einheit 13.4, Hrsg. Ausubel et al, 1994).
  • Zusätzlich zu einem Hefe-Replikationsursprung umfassen Hefe-Plasmidsequenzen üblicherweise ein Antibiotikumsresistenzgen, einen bakteriellen Replikationsursprung (für die Vermehrung in Bakterienzellen) und ein Hefe-Ernährungsgen („yeast nutritional gene") für die Aufrechterhaltung in Hefezellen. Am häufigsten ist das Hefe-Ernährungsgen (oder "auxotropher Marker") eines der folgenden: TRP1 (Phosphoribosylanthranilat-Isomerase, die ein Bestandteil des Tryptophan-Biosynthesewegs ist); URA43 (Orotidin-5'-phosphat-Decarboxylase, die am Uracil-Biosyntheseweg teilnimmt); LEU2 (3-Isopropylmalat-Dehydrogenase, die am Leucin-Biosyntheseweg beteiligt ist); HIS3 (Imidazolglycinphosphat-Dehydratase, oder IGP-Dehydratase); oder LYS2 (α-Aminoadipat-Semialdehyd-Dehydrogenase, ein Teil des Lysin-Biosynthesewegs).
  • (b) Promotoren und Enhancer
  • Ein "Promotor" ist eine Kontrollsequenz, die ein Bereich einer Nukleinsäuresequenz ist, an der die Initiation und Transkriptionsrate kontrolliert werden. Er kann genetische Elemente enthalten, an denen regulatorische Proteine und Moleküle binden können, beispielsweise RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren, um die spezifische Transkription einer Nukleinsäuresequenz zu initiieren. Die Begriffe "operativ positioniert", "operativ verknüpft", "unter Kontrolle", und "unter transkriptioneller Kontrolle" bedeuten, dass sich ein Promotor an der korrekten funktionellen Stelle und/oder Orientierung bezüglich einer Nukleinsäuresequenz befindet, um die transkriptionelle Initiation und/oder Expression der Sequenz zu kontrollieren.
  • Ein Promotor umfasst im Allgemeinen eine Sequenz, die so wirkt, dass sie die Startstelle für die RNA-Synthese positioniert. Das am besten bekannte Beispiel dafür ist die TATA-Box, aber einigen Promotoren fehlt eine TATA-Box, zum Beispiel beim Promotor für das Terminale-Desoxynucleotidyl-Transferase-Gen der Säuger und dem Promotor für die späten SV40-Gene, ein diskretes Element, das die Startstelle selbst überlagert, hilft dabei, den Ort der Initiation zu fixieren. Zusätzliche Promoterelemente regulieren die Frequenz der Transkriptionsinitiation. Typischerweise befinden sich diese im Bereich von 30–110 bp stromaufwärts der Startstelle, obwohl für eine Anzahl von Promotoren gezeigt worden ist, dass sie funktionelle Elemente stromabwärts der Startstelle ebenfalls enthalten. Um eine kodierende Sequenz "unter die Kontrolle" eines Promotors zu bringen, positioniert man das 5'-Ende der Transkriptionsinitiationsstelle des Transkriptionsleserrasters "stromabwärts” (d. h. 3') des ausgewählten Promotors. Der "stromaufwärts gelegene" Promotor stimuliert die Transkription der DNA und fördert die Expression der kodierten RNA.
  • Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion beibehalten wird, wenn die Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt werden. Im tk-Promotor kann der Abstand zwischen den Promotorelementen auf 50 bp voneinander getrennt erhöht werden, bevor die Aktivität abzusinken beginnt. Es scheint so, dass in Abhängigkeit vom Promotor die individuellen Elemente entweder kooperativ oder unabhängig voneinander wirken können, um die Transkription zu aktivieren. Ein Promotor kann, muss aber nicht, in Verbindung mit einem "Enhancer" verwendet werden, was sich auf eine cis-wirkende regulatorische Sequenz bezieht, die an der transkriptionellen Aktivierung einer Nukleinsäuresequenz beteiligt ist.
  • Ein Promotor kann einer sein, der natürlich mit einer Nukleinsäuresequenz assoziiert ist, und der durch Isolieren der 5'-nicht-kodierenden Sequenzen erhalten werden kann, die sich stromaufwärts des kodierenden Segments und/oder Exons befinden. Solch ein Promotor kann als "endogen" bezeichnet werden. Auf ähnliche Weise kann ein Enhancer einer sein, der natürlicherweise mit einer Nukleinsäuresequenz assoziiert ist, der sich entweder stromabwärts oder stromaufwärts der Sequenz befindet. Alternativ wird man bestimmte Vorteile erhalten, wenn man das Segment der kodierenden Nukleinsäure unter die Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors positioniert, was sich auf einen Promotor bezieht, der normalerweise nicht mit einer Nukleinsäuresequenz in seiner natürlichen Umgebung assoziiert ist. Ein rekombinanter oder heterologer Enhancer bezieht sich ebenfalls auf einen Enhancer, der normalerweise mit einer Nukleinsäuresequenz in ihrer natürlichen Umgebung nicht assoziiert ist. Solche Promotoren oder Enhancer können Promotoren oder Enhancer von anderen Genen einschließen, und Promotoren oder Enhancer, die aus jedem anderen Virus, oder aus einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle isoliert wurden, und Promotoren oder Enhancer, die nicht "natürlich vorkommen", das heißt verschiedene Elemente von verschiedenen transkriptionsregulatorischen Bereichen, und/oder Mutationen, die die Expression verändern, enthalten. Beispielsweise sind Promotoren, die sehr häufig bei der Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden β-Lactamase-(Penicillinase), Laktose- und Tryptophan (trp)-Promotorsysteme. Zusätzlich zur synthetischen Herstellung von Nukleinsäuresequenzen von Promotoren und Enhancer können Sequenzen unter Verwendung rekombinanter Klonierung und/oder Nukleinsäure-Vervielfältigungstechniken, einschließlich PCRTM in Verbindung mit den hierin offenbarten Zusammensetzungen hergestellt werden (siehe U.S. Patente 4,683,202 und 5,928,906 , beide hierin durch Verweis aufgenommen). Des Weiteren wird in Erwägung gezogen, dass ebenfalls die Kontrollsequenzen, die die Transkription und/oder Expression der Sequenzen innerhalb nicht-nukleärer Organellen steuern, beispielsweise in Mitochondrien, Chloroplasten, und dergleichen, eingesetzt werden können. Kontrollesequenzen, die Promotoren, Enhancer und andere Locus- oder Transkriptions-kontrollierende/modulierende Elemente umfassen, werden auch als "Transkriptionskassetten" bezeichnet.
  • Natürlich wird es wichtig sein, einen Promotor und/oder Enhancer einzusetzen, der wirksam die Expression des DNA-Segments in dem für die Expression ausgewählten Organell, Zelltyp, Gewebe, Organ oder Organismus steuert. Der molekularbiologische Fachmann weiß in der Regel um die Verwendung von Promotoren, Enhancern, und Zelltyp-Kombinationen für die Proteinexpression (siehe z. B. Sambrook et al 1989). Die eingesetzten Promotoren können konstitutiv, gewebspezifisch, induzierbar, und/oder nützlich unter den geeigneten Bedingungen sein, um hohe Expressionsniveaus des eingeführten DNA-Segments anzusteuern, wie es für die Gentherapie oder für Anwendungen wie die Herstellung von rekombinanten Proteinen und/oder Peptiden im großen Maßstab vorteilhaft ist. Der Promotor kann heterolog oder endogen sein.
  • Die Verwendung eines T3, T7 oder SP6 cytoplasmatischen Expressionssystems ist eine andere mögliche Ausführungsform. Eukaryotische Zellen können die cytoplasmatische Transkription von bestimmten bakteriellen Promotoren unterstützen, wenn die geeignete bakterielle Polymerase zur Verfügung gestellt wird, entweder als Teil des Zufuhrkomplexes oder als ein zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt.
  • Es gibt zahlreiche induzierbare Elemente/Promotoren/Enhancer, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, um die Expression einer RNA zu regulieren. Induzierbare Elemente sind Bereiche einer Nukleinsäuresequenz, die in Reaktion auf einen spezifischen Stimulus aktiviert werden können. Einige Beispiele für Hefe spezifische Promotoren schließen induzierbare Promotoren wie Gall-10, Gal1, GalL, GalS, den reprimierbaren Promotor Met25, und konstitutive Promotoren wie den Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Promotor (GPD), den Alkohol-Dehydrogenase-Promotor (ADH), den Translationselongationsfaktor-1-Alpha-Promotor (TEF), den Cytochrom c-Oxidase-Promotor (CYC1), MRP7, etc., mit ein. Es wurde auch von autonom sich replizierenden Expressionsvektoren der Hefe berichtet, die Promotoren enthalten, die durch Glykokortikoidhormone induzierbar sind (Picard et al, 1990); diese schließen das Glykokortikoid reagierende Element mit ein („glucorticoid responsive element”, GRE). Diese und andere Beispiele sind in Mumber et al., 1995; Ronicke et al., 1997; Pinkhaus, 2000 beschrieben. Wieder andere Hefevektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, beispielsweise Alphafaktor, Alkohol-Oxidase, und PGH, können verwendet werden. Für Übersichtsartikel siehe Ausubel et al und Grant et al, 1987. Darüber hinaus kann jede Promotor/Enhancer-Kombination (gemäß der eukaryotischen Promotordatenbank EPDB) ebenfalls verwendet werden, um die Expression der Gene anzutreiben.
  • Die Identität der gewebe-spezifischen Promotoren oder Elemente, sowie die Assays um ihre Aktivität zu charakterisieren, sind dem Fachmann gut bekannt. Nicht-beschränkende Beispiele für solche Bereiche schließen das menschliche LIMK2-Gen (Nomoto et al, 1999), das Somatostatin-Rezeptor-2-Gen (Kraus et al, 1998), das Epididymale Retinsäure-Binde-Gen der Maus (Lareyre et al, 1999), das menschliche CD4 (Zhao-Emonet et al, 1998), Alpha2 (XI)-Kollagen der Maus (Tsumaki et al, 1998), das D1A Dopamin-Rezeptor-Gen (Lee et al, 1997), den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor II (Wu et al, 1997), und das menschliche Blutplättchen-Endothelzelladhäsionsmolekül-1 („Platelet endothelial cell adhesion molecule-1"; Almendro et al, 1996) mit ein.
  • Typische Promotoren und Enhancer, die die Transkription von für Proteine kodierenden Genen in eukaryotischen Zellen kontrollieren, setzen sich aus mehrfachen genetischen Elementen zusammen. Die zelluläre Maschinerie ist in der Lage die von jedem Element beigetragene regulierende Information zu sammeln und zu integrieren, was den verschiedenen Genen erlaubt, unterschiedliche, oft komplexe Transkriptionsregulationsmuster zu entwickeln.
  • Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription von einem Promotor erhöhen, der sich an einer entfernten Position auf dem gleichen DNA-Molekül befindet. Diese Fähigkeit, über eine große Distanz zu wirken, hatte kaum Vorgänger in den klassischen Studien der prokaryotischen Transkriptionsregulation. Sich anschließende Arbeiten zeigten, dass DNA-Bereiche mit Enhancer-Aktivität ähnlich wie Promotoren organisiert sind. Das heißt, sie setzen sich aus vielen individuellen Elementen zusammen, von denen jedes ein oder mehrere Transkriptionsproteine bindet.
  • Die grundlegende Unterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren liegt in ihrer Funktionsweise. Ein Enhancerbereich als Ganzes muss in der Lage sein, die Transkription über eine Distanz zu stimulieren; dies muss für einen Promotorbereich oder seine Bestandteilselemente nicht zutreffen. Auf der anderen Seite muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente haben, die die Initiation der RNA-Synthese an eine bestimmte Stelle und in eine bestimmten Orientierung lenkt, wohingegen Enhancer diese Spezifität fehlt. Neben dieser funktionellen Unterscheidung sind Enhancer und Promotoren sehr ähnliche Strukturen.
  • Promotoren und Enhancer haben die gleiche allgemeine Funktion, die Transkription in der Zelle zu aktivieren. Sie überlappen oft und hängen zusammen, oft mit dem Anschein eine sehr ähnliche modulare Organisation zu haben. Zusammen genommen legen diese Überlegungen nahe, dass Enhancer und Promotoren homologe Strukturen sind und dass die Transkriptionsaktivatorproteine, die an diese Sequenzen gebunden sind, mit der zellulären Transkriptionsmaschinerie grundlegend in der gleichen Weise Wechselwirken können.
  • Ein Signal, das sich als nützlich erweisen kann, ist ein Polyadenylierungssignal (hGH, BGH, SV40). Die Verwendung von internen Ribosomenbindestellen (IRES)-Elementen wird genutzt, um multigene, oder polycistronische Botschaften zu erzeugen. IRES-Elemente sind in der Lage, das Ribosomenabtastungsmodell der 5'-methylierten Cap-abhängigen Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen (Pelletier und Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picornavirusfamilie (Polio und Encephalomyocarditis) sind beschrieben worden (Pelletier und Sonenberg, 1988), ebenso wie eine IRES von einer Säugerbotschaft (Macejak und Sarnow, 1991). IRES-Elemente können an heterologe offene Leseraster gekoppelt werden. Mehrfache offene Leseraster können zusammen transkribiert werden, jedes getrennt durch eine IRES, was polycistronische Botschaften erzeugt. Dank des IRES-Elementes ist jedes offene Leseraster für Ribosomen für die effiziente Translation zugänglich. Mehrfache Gene können effizient unter Verwendung eines einzigen Promotors/Enhancers exprimiert werden, um eine einzelne Botschaft zu transkribieren.
  • Ein spezifisches Initiationssignal kann für die effiziente Translation einer kodierenden Sequenz notwendig sein. Diese Signale schließen das ATG-Initiationscodon oder benachbarte Sequenzen mit ein. Exogene Translationskontrollsignale, einschließlich des ATG-Initiationscodons, müssen eventuell zur Verfügung gestellt werden. Der Durchschnittsfachmann wird leicht in der Lage sein, dies zu bestimmen, und die notwendigen Signale zur Verfügung zu stellen. Es ist bekannt, dass das Initiationscodon "im Raster" mit dem Leseraster der gewünschten kodierenden Sequenz sein muss, um die Translation des gesamten Einsatzstücks sicherzustellen. Die exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können entweder natürlich oder synthetisch sein. Die Expressionseffizienz kann durch die Aufnahme geeigneter Transkriptionsenhancerelemente verstärkt werden.
  • (c) Mehrfachklonierungsstellen
  • Vektoren, die verwendet werden, um in der vorliegenden Erfindung Hefezellen zu transformieren, können eine Mehrfachklonierungsstelle (MCS) enthalten, was ein Nukleinsäurebereich ist, der mehrfach Restriktionsenzymschnittstellen enthält, von denen jede in Verbindung mit Standard-Rekombinationstechniken zum Verdau von Vektoren verwendet werden kann (siehe beispielsweise Carbonelli et al, 1999, Levenson et al, 1998 und Cocea, 1997). "Restriktionsenzymverdau" bezieht sich auf die katalytische Spaltung eines Nukleinsäuremoleküls mit einem Enzym, das nur an spezifischen Orten in einem Nukleinsäuremoleküle wirkt. Viele dieser Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich. Die Verwendung solcher Enzyme ist dem Fachmann gut bekannt. Häufig wird ein Vektor unter Verwendung eines Restriktionsenzyms, das innerhalb der MCS schneidet, linearisiert oder fragmentiert, um es zu ermöglichen, exogene Sequenzen in den Vektor zu ligieren. "Ligation" bezieht sich auf den Vorgang der Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei Nukleinsäurefragmenten, die zusammenhängen können, aber nicht müssen. Techniken, die Restriktionsenzyme und Ligationsionsreaktionen miteinbeziehen, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Rekombinationstechnik wohlbekannt.
  • (d) Spleißstellen
  • Die meisten transkribierten eukaryotischen RNA-Moleküle durchlaufen RNA-Spleißen, um Introns aus den Primärtranskripten zu entfernen. Vektoren, die genomische eukaryotische Sequenzen enthalten, können Donor- und/oder Akzeptor-Spleißstellen benötigen, um die saubere Verarbeitung des Transkripts für die Proteinexpression sicherzustellen (siehe beispielsweise Chandler et al, 1997).
  • (e) Terminationssignale
  • Die Vektoren oder Konstrukte der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen mindestens ein Terminationssignal umfassen. Ein "Terminationssignal" oder "Terminator" wird von den DNA-Sequenzen umfasst, die an der spezifischen Termination eines RNA-Transkripts durch eine RNA-Polymerase beteiligt sind. Daher wird in bestimmten Ausführungsformen ein Terminationssignal in Erwägung gezogen, das die Herstellung eines RNA-Transkripts beendet.
  • Ein Terminator kann in vivo notwendig sein, um wünschenswerte Botschaftskonzentration zu erreichen.
  • In eukaryotischen Systemen kann der Terminatorbereich auch spezifische DNA-Sequenzen umfassen, die die ortsspezifische Spaltung des neuen Transkripts erlauben, um dadurch eine Polyadenylierungsstelle freizulegen. Dies signalisiert einer spezialisierten endogenen Polymerase einen Abschnitt von etwa 200 A-Resten (polyA) an das 3'-Ende des Transkripts anzuhängen. RNA-Moleküle, die mit diesem polyA-Schwanz modifiziert wurden, scheinen stabiler zu sein und werden effizienter translatiert. Daher wird es in anderen Ausführungsformen, die Eukaryoten miteinbeziehen, bevorzugt, dass der Terminator ein Signal für die Spaltung der RNA umfasst, und es ist noch bevorzugter, wenn das Terminationssignal die Polyadenylierung der Botschaft fördert. Die Terminator- und/oder Polyadenylierungsstellen-Elemente können dazu dienen, die Botschaftsspiegel zu verstärken und das Durchlesen von der Kassette in andere Sequenzen zu minimieren.
  • Terminatoren, die für die Verwendung in der Erfindung in Erwägung gezogen werden, schließen jeden bekannten hierin beschriebenen oder dem Fachmann bekannten Transkriptionsterminator mit ein, beispielsweise einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Terminationssequenzen von Genen, wie zum Beispiel der Wachstumshormonterminator des Rinds oder virale Terminationssequenzen, wie beispielsweise der SV40-Terminator. In bestimmten Ausführungsformen kann das Terminationssignal ein Fehlen transkribierbarer oder translatierbarer Sequenzen sein, beispielsweise aufgrund einer Sequenzverkürzung.
  • (f) Polyadenylierungssignale
  • Für die eukaryotische Genexpression wird man üblicherweise ein Polyadenylierungssignal miteinbeziehen, um die saubere Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Die Natur des Polyadenylierungssignals wird nicht als kritisch erachtet, um die Erfindung erfolgreich auszuüben, und jede solche Sequenz kann eingesetzt werden. Einige Beispiele schließen das SV40-Polyadenylierungssignal oder das Polyadenylierungssignal des Wachstumshormons des Rinds mit ein, die bequem zu nutzen sind und von denen man weiß, dass sie gut in verschiedenen Zielzellen funktionieren. Die Polyadenylierung kann die Stabilität des Transkripts erhöhen oder kann den cytoplasmatischen Transport erleichtern.
  • (g) Replikationsursprünge
  • Um einen Vektor der Erfindung in einer Wirtszelle zu vermehren, kann er eine oder mehrere Replikationsursprungsstellen (oft "ori" genannt) enthalten, was eine spezifische Nukleinsäuresequenz ist, an der die Replikation initiiert wird. Alternativ kann eine sich autonom replizierende Sequenz (ARS) eingesetzt werden, wenn die Wirtszelle Hefe ist.
  • (h) Selektionierbare und durchmusterbare Marker
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können Hefezellen, die mit den Konstrukten der vorliegenden Erfindung transduziert wurden, in vitro oder in vivo durch Einbeziehung eines Markers in den Expressionsvektor identifiziert werden. Solche Marker würden eine identifizierbare Veränderung auf die transduzierte Zelle übertragen, was die einfache Identifizierung von Zellen erlaubt, die den Expressionsvektor enthalten. Im Allgemeinen ist ein selektionierbarer Marker einer, der eine Eigenschaft mit sich bringt, die die Selektion erlaubt. Ein positiv selektionierbarer Marker ist einer, bei dem das Vorliegen des Markers seine Selektion erlaubt, wohingegen ein negativ selektionierbarer Marker einer ist, bei dem sein Vorliegen die Selektion verhindert. Ein Beispiel für einen positiv selektionierbaren Marker ist ein Arzneimittel-Resistenzmarker.
  • Üblicherweise wird die Einbeziehung eines Arzneimittel-Selektionsmarkers bei der Klonierung und Identifizierung von Transformanten helfen; beispielsweise sind genetische Konstrukte, die Resistenz gegenüber Kanamycin, Neomycin, Puromycin, Hygromycin, DHFR, GPT, Zeocin und Histidinol vermitteln, nützliche Selektionsmarker. Zusätzlich zu den Marker, die einen Phänotyp vermitteln, der die Diskriminierung von Transformanten beruhend auf der Anwendung von Bedingungen erlaubt, werden andere Markentypen einschließlich durchmusterbarer Marker wie GFP, dessen Basis die Fluoreszenzanalyse ist, in Erwägung gezogen. Anderer Reporter-Polypeptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, schließen Sup35p oder andere Hefe-Prionen mit ein. Darüber hinaus auxotrophe Marker wie leu, ura, trp, his, und dergleichen für die Selektion auf verschiedenen Medien. Alternativ können durchmusterbare Enzyme wie Herpes simplex Virus-Thymidin-Kinase (tk) oder Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) verwendet werden. Der Fachmann würde auch wissen, wie immunologische Marker einzusetzen sind, möglicherweise in Verbindung mit der FACS-Analyse. Der verwendete Marker wird nicht als wichtig erachtet, solange er in der Lage ist simultan mit der Nukleinsäure, die für ein Genprodukt kodiert, exprimiert zu werden. Weitere Beispiele für selektionierbare und durchmusterbare Marker sind dem Fachmann bekannt.
  • (i) Oligonukleotid-Sonden und -Primer
  • Natürlich umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Segmente, die komplementär, oder im Wesentlichen komplementär zu den Sequenzen sind, die für Proteine oder Polypeptide, die Alpha-Synuklein umfassen oder Hitzeschock-Proteine kodieren, beispielsweise jene, die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 7 dargelegt sind. Nukleinsäuresequenzen, die "komplementär" sind, sind jene, die in der Lage sind, gemäß den Standard Watson-Crick Komplementaritätsregeln Basenpaarungen einzugehen. Wie hierin verwendet meint der Begriff "komplementäre Sequenzen" Nukleinsäuresequenzen, die im wesentlichen komplementär sind, was über denselben, oben dargelegten Nukleotidvergleich bewertet werden kann, oder er wird definiert als Fähigkeit, mit dem Nukleinsäuresegment, das für Proteine oder Polypeptide, die Alpha-Synuklein umfassen, oder Hitzeschockproteine kodiert, unter relativ stringenten Bedingungen wie jenen, die hierin beschrieben werden, zu hybridisieren. Solche Sequenzen können für das gesamte Alpha-Synuklein oder die Hitzeschock-Proteine kodieren oder können ein Fragment davon sein.
  • Die hierin beschriebenen Nachweistechniken für Nukleinsäuren und Bedingungen dienen sowohl dazu, funktionell äquivalente Nukleinsäuren der Erfindung, wie sie strukturell oben skizziert wurden, zu definieren, als auch um bestimmte Verfahren zu beschreiben, mittels derer Hefezellen, die mit Proteinen oder Polypeptiden, die Alpha-Synuklein Sequenzen umfassen, oder Hitzeschock-Proteinsequenzen transformiert wurden, durchmustert, ausgewählt und charakterisiert werden können.
  • Hybridisierungsfragmente sollten von ausreichender Länge sein, um eine spezifische Hybridisierung an eine RNA- oder DNA-Gewebeprobe zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung einer Hybridisierungssonde zwischen etwa 10–14 oder 15–20 und etwa 100 Nukleotiden Länge erlaubt die Bildung eines Duplex-Moleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, die komplementäre Sequenzen über Abschnitte mit einer Länge größer als 20 Basen haben, werden im Allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und den Grad bestimmter erhaltener Hybridmoleküle zu verbessern.
  • Sequenzen mit einer Länge von 17 Basen sollten nur einmal im menschlichen Genom auftreten und daher ausreichen, um eine einzigartige Zielsequenz zu spezifizieren. Obwohl kürzere Oligomere einfacher zu machen sind und die in vivo Zugänglichkeit erhöhen, sind zahlreiche andere Faktoren bei der Bestimmung der Spezifität der Hybridisierung beteiligt. Sowohl die Bindungsaffinität an als auch die Sequenzspezifität eines Oligonukleotids für sein komplementäres Ziel erhöhen sich mitzunehmender Länge. Es wird in Erwägung gezogen, dass beispielhaft Oligonukleotide mit 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 oder mehr Basenpaaren verwendet werden, obwohl andere ebenfalls in Erwägung gezogen werden. Längere Oligonukleotide, die 250, 300, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200 und länger kodieren, werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Solche Oligonukleotide werden beispielsweise als Sonden bei Southern- und Northern Blots und als Primer in Vervielfältigungsreaktionen Anwendung finden Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen aufgrund ihrer Fähigkeit selektive Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von Genen oder RNAs zu bilden verwendet werden, oder um Primer für die Vervielfältigung von DNA oder RNA aus Geweben zur Verfügung zu stellen. In Abhängigkeit von der geplanten Anwendung wird man sich wünschen, verschiedene Hybridisierungsbedingungen einzusetzen, um verschiedene Selektivitätsgrade der Sonde gegenüber der Zielsequenz zu erreichen.
  • Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität brauchen, wird man sich üblicherweise wünschen, relativ stringente Bedingungen für die Bildung von Hybriden einzusetzen; zum Beispiel wird man relativ niedrige Salz- und/oder Hochtemperaturbedingungen auswählen, wie sie durch etwa 0,02 M bis etwa 0,10 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 70°C zur Verfügung gestellt werden. Solch hoch stringente Bedingungen tolerieren, wenn überhaupt, wenig, Fehlpaarungen zwischen der Sonde und der Matrize oder dem Zielstrang, und waren besonders geeignet für die Isolierung spezifischer Gene oder das Nachweisen spezifischer mRNA-Transkripte. Es wird im Allgemeinen begrüßt, dass die Bedingungen durch den Zusatz von zunehmenden Mengen an Formamid stringenter gemacht werden können.
  • Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise die Substitution von Aminosäuren mittels ortsgerichteter Mutagenese, wird es anerkannt, dass Bedingungen mit niedrigerer Stringenz benötigt werden. Unter diesen Bedingungen kann Hybridisierung auftreten, obwohl die Sequenzen der Sonde und des Zielstrangs nicht perfekt komplementär sind, sondern an einer oder mehreren Positionen fehlpaaren. Die Bedingungen können durch Erhöhung der Salzkonzentration und Verringerung der Temperatur weniger stringent gemacht werden. Beispielsweise kann eine Bedingung mittlerer Stringenz durch etwa 0,1 bis 0,25 M NaCl bei Temperaturen von etwa 37°C bis etwa 55°C zur Verfügung gestellt werden, wohingegen eine Bedingung niedriger Stringenz durch etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20°C bis etwa 55°C zur Verfügung gestellt werden könnte. Daher können die Hybridisierungsbedingungen einfach manipuliert werden und werden daher generell in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen ein Verfahren der Wahl sein.
  • In anderen Ausführungsformen kann die Hybridisierung beispielsweise unter den Bedingungen 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol, bei Temperaturen zwischen ungefähr 20°C bis etwa 37°C. Andere verwendete Hybridisierungsbedingungen könnten ungefähr 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 μM MgCl2 bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 40°C bis etwa 72°C einschließen.
  • Ein Verfahren die Sonden und Primer der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist es, sie bei der Suche nach Genen, die mit Alpha-Synuklein-Protein verwandt sind, oder, insbesondere, nach Homologen des Alpha-Synuklein-Proteins aus anderen Spezies zu verwenden. Normalerweise wird die Ziel-DNA eine genomische oder cDNA-Bibliothek sein, obwohl die Durchmusterung die Analyse von RNA-Molekülen miteinbeziehen kann. Durch die Variation der Hybridisierungsstringenz und des Bereichs der Sonde können verschiedene Homologiegrade entdeckt werden.
  • Ein anderer Weg die Sonden und Primer der vorliegenden Erfindung auszunutzen ist bei der ortsgerichteten, oder ortsspezifischen Mutagenese. Die ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, die bei der Zubereitung individueller Peptide oder biologisch funktionell äquivalenter Proteine oder Peptide durch spezifische Mutagenese der zugrunde liegenden DNA nützlich ist. Die Technik stellt ferner eine einfache Fähigkeit zur Verfügung, um Sequenzvarianten zuzubereiten und zu testen, die eine oder mehrere der vorangegangenen Überlegungen verkörpern, durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsequenzveränderung in der DNA. Die ortsspezifische Mutagenese erlaubt die Herstellung von Mutanten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodieren, sowie eine ausreichende Anzahl an benachbarten Nukleotiden, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität zur Verfügung zu stellen, um ein stabiles Duplex auf beiden Seiten der zu überbrückenden Deletionsstelle zu bilden. Üblicherweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 17 bis 25 Nukleotiden mit etwa 5 bis 10 Resten auf beiden Seiten der Stelle der zu verändernden Sequenz bevorzugt.
  • Die Technik setzt typischerweise einen Bakteriophagenvektor ein, der sowohl in einer einzelsträngigen Form als auch in einer doppelsträngigen Form existiert. Typische Vektoren, die nützlich bei der ortsgerichteten Mutagenese sind, schließen Vektoren wie den M13-Phagen mit ein. Diese Phagenvektoren sind kommerziell erhältlich und ihre Verwendung ist dem Fachmann gut bekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenfalls routinemäßig bei der ortsgerichteten Mutagenese eingesetzt, was den Schritt des Transferierens des Gens von Interesse von einem Phagen auf ein Plasmid eliminiert.
  • Im Allgemeinen wird die ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, indem man zuerst einen einzelsträngigen Vektor erhält, oder zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors schmilzt, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für das gewünschte Protein kodiert. Ein Oligonukleotid-Primer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird synthetisch zubereitet. Dieser Primer wird dann an die einzelsträngige DNA-Zubereitung angelagert, wobei bei der Auswahl der Hybridisierungsbedingungen der Grad an Fehlpaarungen berücksichtigt wird, und DNA polymerisierenden Enzymen wie dem Polymerase I Klenow-Fragment aus E. coli unterworfen, um die Synthese des mutationstragenden Stranges zu vervollständigen. Daher wird ein Heteroduplex gebildet, in dem ein Strang die originäre nicht-mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen zu transformieren, beispielsweise E. coli-Zellen, und dann werden Klone ausgewählt, die die rekombinanten Vektoren, die die mutierte Sequenzanordnung tragen, einschließen.
  • Die Zubereitung von Sequenzvarianten des ausgewählten Gens unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese wird als ein Mittel zur Herstellung potentiell nützlicher Spezies zur Verfügung gestellt und ist nicht als beschränkend gedacht, da es andere Wege gibt, über die Sequenzvarianten von Genen erhalten werden können. Beispielsweise können rekombinante Vektoren, die für das gewünschte Gen kodieren, mit mutagenen Wirkstoffen wie Hydroxylamin behandelt werden, um die Sequenzvarianten zu erhalten.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, beispielsweise einer Markierung, einzusetzen, um die Hybridisierung zu bestimmen. Eine große Vielzahl geeigneter Indikatormittel sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich fluoreszierender, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, beispielsweise Avidin/Biotin, die nachgewiesen werden können.
  • In bestimmten Ausführungsformen möchte man vielleicht eine fluoreszierende Markierung, Elektrolumineszenz oder eine Enzymmarkierung wie Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase anstelle von radioaktiven oder anderen umweltunfreundlichen Reagenzien einsetzen. Im Falle von Enzymmarkierungen sind colorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die eingesetzt werden können, um ein Nachweismittel zur Verfügung zu stellen, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um eine spezifische Hybridisierung in Proben, die komplementäre Nukleinsäuren enthalten, zu identifizieren.
  • Im Allgemeinen stellt man sich vor, das die hierin beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagenzien bei der Hybridisierung in Lösung, beispielsweise bei der PCRTM für den Nachweis der Expression von entsprechenden Genen, sowie in Ausführungsformen, die eine Festphase einsetzen, nützlich sein werden. In Ausführungsformen, die eine Festphase miteinbeziehen, wird die Test-DNA (oder RNA) auf einer ausgewählten Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder auf andere Art und Weise befestigt. Diese fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird er dann der Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter gewünschten Bedingungen unterworfen.
  • Die ausgewählten Bedingungen werden von den besonderen Umständen auf Basis der benötigten spezifischen Kriterien (abhängig beispielsweise vom G+C-Gehalt, Art der Ziel-Nukleinsäure, Nukleinsäurequelle, Größe der Hybridisierungssonde, etc.) abhängen. Im Anschluss an das Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nicht-spezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die Hybridisierung mittels der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert.
  • E. Protein, Polypeptide, und Peptide
  • Die Erfindung fasst die Verwendung eines Polypeptids oder eines Proteins, das für Alpha-Synuklein oder ein Hitzeschock-Protein kodiert, ins Auge. In einigen Ausführungsformen kann ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein/-Polypeptid oder Hitzeschock-Protein voller Länge oder im wesentlichen voller Länge verwendet werden. Der Begriff "volle Länge" bezieht sich auf ein falsch gefaltetes Krankheitspolypeptid oder ein Hitzeschock-Protein, das mindestens all diejenigen Aminosäuren, die von der cDNA des falsch gefalteten Krankheitsproteins oder der cDNA des Hitzeschock-Proteins kodiert werden, enthält. Der Begriff "im wesentlichen voller Länge" im Kontext eines falsch gefalteten Krankheitsproteins bezieht sich auf ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein/-Polypeptid, das mindestens 80% der zusammenhängenden Aminosäuren des falsch gefalteten Krankheitsproteins/-polypeptids voller Länge enthält. Jedoch wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein/-Polypeptid oder Hitzeschock-Protein, das mindestens etwa 85%, 90%, und 95% von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 8 enthält, innerhalb des Umfangs der Erfindung ein falsch gefaltetes Krankheitsprotein/-polypeptid "im wesentlichen voller Länge" sind.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können verschiedene Längen der Proteine/Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können nur funktionell aktive Domänen der Proteine verwendet werden. Daher kann ein Protein-/Polypeptidsegment beinahe jeder Länge eingesetzt werden.
  • In einem nicht-beschränkenden Beispiel kann ein oder können mehrere Proteine oder Polypeptide zubereitet werden, das/die einen zusammenhängenden Aminosäurenabschnitt identisch zu oder komplementär mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, oder SEQ ID NO: 9 einschließt/einschließen. Solche Aminosäureabschnitte können etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9, etwa 10, etwa 15, etwa 20, etwa 25, etwa 30, etwa 35, etwa 40, etwa 45, etwa 50, etwa 55, etwa 60, etwa 65, etwa 70, etwa 75, etwa 80, etwa 85, etwa 90, etwa 95, etwa 100, etwa 105, etwa 110, etwa 115, etwa 120, etwa 125, etwa 130, etwa 135, etwa 140, etwa 145, etwa 150, etwa 155, etwa 160, etwa 165, etwa 170, etwa 175, etwa 180, etwa 185, etwa 190, etwa 195, etwa 200, etwa 210, etwa 220, etwa 230, etwa 240, etwa 250, etwa 260, etwa 270, etwa 280, etwa 290, etwa 300, etwa 310, etwa 320, etwa 330, etwa 340, etwa 350, etwa 360, etwa 370, etwa 380, etwa 390, etwa 400, etwa 410, etwa 420, etwa 430, etwa 440, etwa 450, etwa 460, etwa 470, etwa 480, etwa 490, etwa 500, etwa 510, etwa 520, etwa 530, etwa 540, etwa 550, etwa 560, etwa 570, etwa 580, etwa 590, etwa 600, etwa 610, etwa 620, etwa 630, etwa 640, etwa 650, etwa 660, etwa 670, etwa 680, etwa 690, etwa 700 Aminosäuren lang oder länger sein, einschließlich aller dazwischen liegender Längen und dazwischen liegender Bereiche. Es ist leicht zu verstehen, dass "dazwischen liegende Längen" und "dazwischen liegende Bereiche", wie hierin verwendet, jede Länge oder jeden Bereich meint, einschließlich oder zwischen den angegebenen Werten (d. h. alle ganzen Zahlen, die solche Werte einschließen und zwischen solchen Werten).
  • Es wird auch ins Auge gefasst, dass im Fall von Polyglutamin (pQ)-haltigen Polypeptidsequenzen die numerische Reihenfolge der Aminosäuren nicht von der Anzahl der pQ-Repeats verändert wird. Für das Beispiel eines Huntingtin-Polypeptids, das von Exon 1 kodiert wird, setzt sich das Polypeptid aus 68 Aminosäuren exklusive pQ-Repeats zusammen. Die pQ-Repeats beginnen typischerweise an Position 18. SEQ ID NO: 9 ist ein Beispiel, in dem es keine pQ-Repeats gibt. Jedoch liegen in anderen Beispielen eine variable Anzahl an pQ-Repeats vor, beispielsweise hat SEQ ID NO: 4 103 pQ-Repeats, und SEQ ID NO: 6 hat 25 pQ-Repeats. Die numerische Reihenfolge der Aminosäuren 1–68 von Exon 1 wird jedoch nicht durch die Anzahl der pQ-Repeats verändert. Ferner wird erwogen, dass diese und andere pQ-umfassenden Polypeptide der Erfindung zwischen 10 bis 150 pQ-Repeats haben. Dies schließt 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 1317, 13, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 pQ-Repeats mit ein.
  • F. Biologisch funktionelle Äquivalente
  • Man kann auch die Sequenz jedes Proteins, das an der Fibrillenbildung und/oder der Proteinaggregation beteiligt ist; oder eines Hitzeschock-Proteins; oder eines molekularen Chaperon-Proteins, mittels Aminosäuresubstitutionen, Austauschen, Insertionen, Deletionen, Verkürzungen und anderen Mutationen modifizieren, um Fibrillen inhibierende und/oder -abbauende Eigenschaften zu erhalten. Diese Modifikation kann funktionell äquivalente Polypeptide erzeugen, die so erhalten werden können. Das nun folgende ist eine Diskussion, die auf der Veränderung der Aminosäuren eines Proteins oder Polypeptids beruht, um ein Äquivalent oder sogar ein verbessertes Molekül der zweiten Generation zu erzeugen. Beispielsweise können bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur substituiert werden ohne nennenswerten Verlust an Wechselwirkungsbindungskapazität mit Strukturen wie beispielsweise Antigen-bindenden Bereichen von Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen. Da es die Wechselwirkungskapazität und Natur eines Proteins ist, die die biologische Funktionsaktivität eines Proteins definieren, können bestimmte Aminosäuresubstitutionen in einer Proteinsequenz, und in der ihr zu Grunde liegen kodierenden DNA-Sequenz gemacht werden, und dabei trotzdem ein Protein mit den gleichen Eigenschaften herstellen (siehe Tabelle 4). Es wird daher von den Erfindern erwogen, dass verschiedene Veränderungen in den Polypeptidsequenzen der Proteine, die an der Fibrillenbildung und/oder der Proteinaggregation beteiligt sind; oder einem Hitzeschock-Protein; oder einem molekularen Chaperon-Protein gemacht werden können, ohne dabei die normale Aktivität des Polypeptids zu verändern.
  • Bei der Schaffung solcher Veränderungen kann der Hydropathie-Index berücksichtigt werden. Die Bedeutung des Aminosäure-Hydropathie-Indexes bei der Übertragung interaktiver biologischer Funktionen an ein Protein wird im Allgemeinen im Stand der Technik verstanden (Kyte & Doolittle, 1982). Es wird akzeptiert, dass der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zur Sekundärstruktur des resultierenden Proteins beiträgt, was wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen, beispielsweise Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen bestimmt.
  • Man weiß im Stand der Technik auch, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren wirksam auf Grundlage der Hydrophilie durchgeführt werden kann. U.S. Patent 4,554,101 behauptet, dass die größte örtliche durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren geregelt wird, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
  • Wie in U.S. Patent 4,554,101 detailliert dargelegt, wurden die folgenden Hydrophilie-Werte den Aminosäureresten zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin*–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4).
  • Es versteht sich, dass man eine Aminosäure durch eine andere mit ähnlichem Hydrophilie-Wert substituieren und immer noch ein biologisch äquivalentes und immunologisch äquivalentes Protein herstellen kann. Bei solchen Veränderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Wert innerhalb von ± 2 liegt, bevorzugt, diejenigen die innerhalb ± 1 liegen, sind besonders bevorzugt, und jene, die innerhalb ± 0,5 liegen, werden sogar noch mehr bevorzugt.
  • Wie oben umrissen beruhen Aminosäuresubstitutionen im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäurenseitenkettensubstituenten, beispielsweise ihrer Hydrophobizität, Hydrophilie, Ladung, Größe und dergleichen. Beispielhafte Substitutionen, die die verschieden vorangegangenen Charakteristika berücksichtigen, sind dem Fachmann bekannt und schließen ein: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin. Tabelle 4. Kodon-Tabelle
    Figure 00510001
  • Eine andere Ausführungsform für die Zubereitung von Polypeptiden oder Proteinen, die Alpha-Synuklein umfassen; oder eines Hitzeschock-Proteins; oder eines molekularen Chaperon-Proteins ist die Verwendung von Peptidomimetika. Mimetika sind peptidhaltige Moleküle, die Elemente der Sekundärstruktur der Proteine imitieren. Die zu Grunde liegende Überlegung hinter der Verwendung von Peptidomimetika ist, dass das Peptidrückgrat von Proteinen hauptsächlich existiert, um Aminosäureseitenketten in solch einer Weise zu orientieren, dass sie die molekularen Wechselwirkungen erleichtern, beispielsweise jene von Antikörper und Antigen. Für ein Peptidomimetikum erwartet man, dass es molekulare Wechselwirkungen ähnlich dem natürlichen Molekül erlaubt.
  • G. Fusionsproteine
  • Ein Fusionsprotein oder chimäres Protein ist eine spezialisierte Art von Proteinvariante, die eine Insertionsvariante ist. Dieses Molekül ist im Allgemeinen vollständig oder in einem wesentlichen Teil des nativen Moleküls am N- oder C-Terminus, oder sogar an anderen Stellen des Proteins, an ein vollständiges zweites Polypeptid oder einen Teil davon gekoppelt. In der vorliegenden Erfindung sind Fusionsproteine generiert wurden, die Bereiche/Teile der Proteine, die Alpha-Synuklein umfassen; oder eines Hitzeschock-Proteins; oder eines molekularen Chaperon-Proteins umfassen, die entweder unter Verwendung einer Fluoreszenzmessmethode, eines Durchmusterungsassays, oder eines funktionellen Assays identifiziert werden können. Beispielsweise werden Fusionen beschrieben, die einen Bereich eines Alpha-Synuklein-Proteins, eines Huntingtin-Proteins, etc. gekoppelt an ein grünes Fluoreszenzprotein (GFP) umfassen. Einige der GFP-Chimären sind N-terminale Chimären. Beinahe jede Art von Fusions-/chimärem Protein kann zubereitet werden, wo der GFP-Bereich an andere Teile des Proteins von Interesse gekoppelt werden kann. Andere nützliche Chimären schließen das Koppeln funktionaler Domänen, beispielsweise der katalytischen Zentren von Enzymen, oder von Epitopen, die von Antikörper erkannt werden, mit ein. Diese Fusionsproteine stellen Verfahren für den raschen und einfachen Nachweis und die Identifizierung der rekombinanten Wirtszellen, hierin beispielhaft der Hefezelle, zur Verfügung.
  • H. Erfindungsgemäße Durchmusterungsverfahren
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Durchmusterung nach Kandidatensubstanzen zur Verfügung, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringern. Unabhängig vom exakten Wirkungsmechanismus werden die durch die erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren identifizierten Wirkstoffe einen therapeutischen Nutzen für Erkrankungen zur Verfügung stellen, an denen die Falschfaltung von Proteinen oder anormale Proteinablagerung beteiligt sind. Einige dieser Störungen sind in Tabelle 1 aufgeführt und schließen als nicht-beschränkende Beispiele neurodegenerative Erkrankungen wie Corea Huntington, Parkinson, Alzheimer, Prion-Erkrankungen, etc. sowie andere nicht-neuronale Erkrankungen, beispielsweise Diabetes vom Typ II, mit ein.
  • Die erfindungsgemäßen Durchmusterungsverfahren verwenden Hefezellen, die technisch so hergestellt sind, dass sie Proteine exprimieren, die die mit Alpha-Synuklein in Verbindung stehende Toxizität verringern. Die Hefezelle braucht auch eine der zwei Bedingungen, die unten für das Durchmusterungsverfahren beschrieben sind. In einem Modul hat die Hefezelle einen mutierten genetischen Hintergrund, beispielsweise Mutationen in HSP-Genen oder anderen für molekulare Chaperone kodierenden Genen, beispielsweise Mutationen in dem HSP40-Gen. Alternativ kann die Hefezelle, die ein Protein exprimiert, das an der Fibrillenbildung und/oder der Proteinaggregation beteiligt ist, Änderungen in den Wachstumsbedingungen unterworfen werden, die zu Stress führen, beispielsweise zu oxidativem Stress, indem man beispielsweise die Zelle einem Erzeuger freier Radikale, oder Eisen etc. aussetzt. Jede dieser Bedingungen vermittelt einen toxischen Phänotyp an diejenigen Hefezellen, die Proteine exprimieren, die an der Fibrillenbildung und/oder der Proteinaggregation beteiligt sind. Das In-Kontakt-Bringen solch einer Hefezelle mit einer Kandidatensubstanz erlaubt die Identifizierung von Wirkstoffen, die den toxischen Phänotyp der Hefezelle retten können. Der toxische Phänotyp manifestiert sich als Cytotoxizität oder als Wachstumsinhibition. Die Toxizität in Hefe korreliert mit der cytotoxischen Wirkung des Proteins in einer menschlichen Zelle, die die Pathologie verursacht, die mit der Erkrankung, die durch die Proteinakkumulation verursacht wird, in Verbindung steht. Beispielsweise führt die Expression des Huntingtin-Proteins in einer Hefezelle, die zusätzlich einen mutierten HSP40-Hintergrund hat, in der Hefezelle zu einer erheblichen Wachstumsverzögerung. Das In-Kontakt-Bringen solcher Hefezellen mit Kandidatensubstanzen erlaubt die Identifizierung von Wirkstoffen, die die Wachstumsverzögerung in den Hefezellen umkehren kann und daher sollte der Wirkstoff auch die Akkumulation von Huntingtin in einer menschlichen Zelle verhindern. Da die Huntingtin-Aggregation an Corea Huntington beteiligt ist, stellt dieses Durchmusterungsverfahren therapeutische Wirkstoffe zur Verfügung, um Corea Huntington zu verhindern und zu behandeln.
  • (a) Kandidatensubstanzen
  • Wie hierin verwendet ist eine "Kandidatensubstanz" jede Substanz mit einem Potenzial, die Akkumulation/Aggregation von Proteinablagerungen in Geweben zu verringern, abzumildern, zu verhindern, oder umzukehren. Zahlreiche Typen von Kandidatensubstanzen können mittels der erfindungsgemäßen Verfahren durchmustert werden. Genetische Wirkstoffe können durchmustert werden, indem die Hefezelle mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das für ein Gen kodiert, in Kontakt gebracht wird. Beispielsweise kann man cDNA-Bibliotheken, die eine Vielzahl von Genen exprimieren, durchmustern, um therapeutische Gene für die hierin beschriebenen Erkrankungen zu identifizieren. In anderen Beispielen kann man die Hefezelle mit anderen Proteinen oder Polypeptiden in Kontakt bringen, die eventuell den therapeutischen Effekt vermitteln.
  • Daher schließen Kandidatensubstanzen, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren durchmustert werden können, jene mit ein, die für Chaperon-Moleküle, Hitzeschock-Proteine, Rezeptoren, Enzyme, Liganden, regulatorische Faktoren, und Strukturproteine kodieren, mit ein. Kandidatensubstanzen schließen auch nukleäre Proteine, cytoplasmatische Proteine, mitochondriale Proteine, sekretierte Proteine, Plasmalemma-assoziierte Proteine, Serumproteine, virale Antigene, bakterielle Antigene, Protozoen-Antigene und parasitäre Antigene mit ein. Kandidatensubstanzen umfassen zusätzlich Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Phosphoproteine und Nukleinsäuren (beispielsweise RNAs wie Ribozyme oder Antisense-Nukleinsäuren). Proteine oder Polypeptide, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren durchmustert werden können, schließen Chaperon-Proteine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneimittel, Onkogene, Tumorantigene, Tumorsuppresoren, Strukturproteine, virale Antigene, parasitäre Antigene und bakterielle Antigene mit ein. Zusätzlich werden momentan zahlreiche Verfahren für die zufällige und/oder direkte Peptidsynthese verwendet, und auf Nukleinsäuren basierende Verbindungen. Die Nukleinsäure oder Proteinsequenzen schließen die Zufuhr von DNA-Expressionskonstrukten, die für sie kodieren, mit ein.
  • Darüber hinaus können die Kandidatensubstanzen aus großen Bibliotheken für synthetische oder natürliche Verbindungen durchmustert werden. Ein Beispiel ist eine von der FDA zugelassene Verbindungsbibliothek, die für Menschen verwendet werden kann. Darüber hinaus sind synthetische Verbindungsbibliotheken kommerziell von einer Anzahl an Firmen erhältlich, einschließlich Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, N. J.), Brandon Associates (Merrimack, N. H.), und Microsource (New Milford, Conn.) und eine Bibliothek für seltene Chemikalien ist von Aldrich (Milwaukee, Wis.) erhältlich. Kombinatorische Bibliotheken sind erhältlich und können zubereitet werden. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten ebenfalls erhältlich, beispielsweise von Pan Laboratories (Bothell, Wash.) oder MycoSearch (N. C.) oder können einfach mittels den im Stand der Technik bekannten Verfahren zubereitet werden. Es wird vorgeschlagen, dass aus natürlichen Quellen isolierte Verbindungen, wie aus Tieren, Bakterien, Pilzen, Pflanzenquellen, einschließlich Blättern und Rinde, und Meeresproben als Kandidaten für das Vorliegen potentiell nützlicher pharmazeutischer Wirkstoffe bewertet werden können. Es versteht sich, dass die zu durchmusternden pharmazeutischen Wirkstoffe auch von chemischen Zusammensetzungen oder von von Menschenhand hergestellten Verbindungen abgeleitet oder synthetisiert werden könnten.
  • Andere geeignete Modulatoren schließen Antisense-Moleküle, Ribozyme, und Antikörper (einschließlich Einzelketten-Antikörpern) mit ein, von denen jeder spezifisch für das Zielmolekül wäre. Solche Verbindungen sind detaillierter anderswo in diesem Dokument beschrieben. Beispielsweise wären ein Antisense-Molekül, das an eine Translations- oder Transkriptionsstartstelle oder an Spleißstellen gebunden hat, ideale Kandidateninhibitoren. Darüber hinaus können natürliche und synthetische hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert werden.
  • Die Durchmusterung solcher Bibliotheken, einschließlich kombinatorisch erzeugter Bibliotheken (z. B. Peptidbibliotheken), ist eine rasche und effiziente Möglichkeit, um eine große Anzahl verwandter (und nicht verwandter) Verbindungen nach Aktivität zu durchmustern. Kombinatorische Herangehensweisen eignen sich auch für die rasche Entwicklung potentieller Arzneimittel durch die Erzeugung von Verbindungen der zweiten, dritten und vierten Generation, die aus aktiven, ansonsten aber unerwünschten Verbindungen geformt werden.
  • Nützliche Verbindungen finden sich innerhalb zahlreicher chemischer Klassen, obschon sie üblicherweise organische Verbindungen sind, einschließlich kleiner organischer Verbindungen. Kleine organische Verbindungen haben ein Molekulargewicht von mehr als 50, jedoch weniger als etwa 2500 Dalton, vorzugsweise weniger als etwa 750, noch bevorzugter weniger als etwa 350 Dalton. Beispielhafte Klassen schließen Heterocyclen, Peptide, Saccharide, Steroide, triterpenoide Verbindungen, und dergleichen mit ein. Die strukturelle Identifizierung eines Wirkstoffs kann verwendet werden, um zusätzliche Wirkstoffe zu identifizieren, zu erzeugen oder zu durchmustern. Beispielsweise können da, wo Peptid-Wirkstoffe identifiziert worden sind, sie auf eine Vielzahl von Wegen modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen, beispielsweise unter Verwendung unnatürliche Aminosäuren wie einer D-Aminosäure, insbesondere von D-Alanin, durch Funktionalisierung ihrer Amino- oder Carboxytermini, beispielsweise für die Aminogruppe Acetylierung oder Alkylierung, und für die Carboxylgruppe Veresterung oder Amidifizierung oder dergleichen.
  • (b) Durchmusterung mit FREI und FACS
  • In einer Ausführungsform zieht die Erfindung Durchmusterungsassays in Erwägung, die Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FREI) nutzen. In einem Beispiel wird Alpha-Synuklein an cyanfarbenes Fluoreszenzprotein (CFP) und an gelbes Fluoreszenzprotein (YFP) fusioniert und in das Hefegenom unter der Regulation eines Gal1-10-Promotors integriert. Die Zellen werden in Galaktose kultiviert, um die Expression zu induzieren. Nach der Induktion stellen die Zellen die Fusionsproteine her, diese aggregieren und bringen dadurch das CFP und YFP nahe zusammen. Weil die Proteine in den Aggregaten dicht gepackt sind, ist der Abstand zwischen dem CFP und dem YFP weniger als der kritische Wert von 100°A, der für das Auftreten eines Energietransfers (FREI) notwendig ist. In diesem Fall wird die durch die Emission von CFP freigesetzte Energie das YFP anregen, das wiederum bei seiner charakteristischen Wellenlänge emittieren wird. Die vorliegenden Erfinder ziehen die Verwendung von auf FREI beruhender Durchmusterung in Erwägung, um Kandidatenverbindungen einschließlich Arzneimitteln, Genen oder anderen Faktoren zu identifizieren, die die Wechselwirkung von CFP und YFP unterbrechen kännen, indem die Proteine in einem Zustand gehalten werden, der das Auftreten von Aggregation nicht erlaubt.
  • Die Zellen werden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierungs (FACS)-Analyse sortiert, einer Technik, die dem Fachmann gut bekannt ist. Die Erfinder stellen sich vor, dass dieses Durchmusterungsverfahren auch die Untersuchung von toxischen Intermediaten erlaubt, die im Wege der Aggregation gebildet werden und schließlich ein besseres Verständnis dafür erlauben, wie Intermediate zu unlöslichen Proteinen aggregieren, die oft gekennzeichnet sind durch Plaques und Tangels.
  • FACS, Durchflusszytometrie oder Flußmikrofluorometrie stellt das Mittel zur Abtastung von individuellen Zellen auf die Anwesenheit eines fluoreszierend markierten Bestandteils zur Verfügung. Das Verfahren setzt Instrumente ein, die in der Lage sind, die Anregungsemissionen markierter Zellen in einem flüssigen Medium zu aktivieren und nachzuweisen. FACS ist einzigartig in seiner Fähigkeit, eine rasche, verlässliche, quantitative und Mehrparameter-Analyse für entweder lebende oder fixierte Zellen zur Verfügung zu stellen. Die erfindungsgemäßen, falsch gefalteten Krankheitsproteine stellen geeignet markiert ein nützliches Werkzeug für die Analyse und Quantifizierung der Proteinaggregation und Fibrillen- und/oder Aggregatsbildung als Ergebnis anderer genetischer Bedingungen oder von Wachstumsbedingungen für individuelle Hefezellen wie oben beschrieben zur Verfügung.
  • (c) RNA Aptamerdurchmusterung
  • In einer weiteren Ausführungsform zieht die Erfindung Durchmusterungsassays in Erwägung, die RNA-Aptamere nutzen. RNA ist eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, in Abhängigkeit von ihrer Primärsequenz eine große Vielzahl an Sekundärstruktur einzunehmen. Es ist daher möglich technisch RNA-Moleküle mit spezifischen Längen zu konstruieren, so dass sie die Eigenschaft haben, andere Moleküle auf sehr spezifischer Weise und mit sehr hoher Affinität zu binden. Das ähnelt dem Phänomen der Antigen-Antikörper-Assoziierung.
  • Die vorliegenden Erfinder ziehen in Erwägung die Eigenschaften von RNA-Molekülen zu nutzen, um RNA-Moleküle zu identifizieren, die therapeutische Kandidatenwirkstoffe für Erkrankungen mit falsch gefaltetem Protein sind, beispielsweise für neurodegenerative Erkrankungen. Dies beruht auf der Fähigkeit von RNA-Molekülen, falsch gefaltete Krankheitsproteine, beispielsweise die Amyloidfasern oder andere Zwischenstufen auf dem Weg zur Aggregat-/Fibrillenbildung, zu erkennen und zu binden.
  • Das hier entwickelte auf Hefe beruhende Durchmusterungssystem ist für solche Durchmusterungen zugänglich, und man kann direkt Verbindungen identifizieren, die die Toxizität von falsch gefalteten Krankheitsproteinen verringern. Darüber hinaus kann man Verbindungen identifizieren, die die Wechselwirkung zwischen gebildeten, zur Aggregation solcher Proteine führenden Intermediaten unterbrechen. Es wird in Erwägung gezogen, dass man nach Verbindungen durchmustern kann, die die Toxizität verschlimmern oder die Proteinaggregation fördern.
  • (d) Behandlungen
  • Anfängliche Tests und Behandlung von Tiermodellen mit Testverbindungen, die mittels erfindungsgemäßer Durchmusterungen identifiziert wurden, werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Geeignete Tiermodelle für Krankheiten mit falsch gefaltetem Protein werden ausgewählt werden und die Behandlung wird die Verabreichung der Verbindung in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung an das Tier mit sich bringen. Die Verabreichung wird über irgendeinen Weg erfolgen, der zu klinischen oder nicht-klinischen Zwecke verwendet werden könnte, einschließlich aber nicht beschränkt auf orale, nasale, buccale oder sogar topische Verabreichung. Alternativ kann die Verabreichung über intratracheale Einflößung, bronchiale Einflößung, intradermale, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, oder intravenöse Injektion erfolgen. Verabreichungswege, die insbesondere in Erwägung gezogen werden, sind die systemische intravenöse Injektion, die örtliche Verabreichung über Blut- oder Lymphversorgung, oder direkt an der betroffenen Stelle. Die Bestimmung der Wirksamkeit einer Verbindung in vivo kann eine Vielzahl verschiedener Kriterien miteinbeziehen. Auch kann die Toxizitätsmessung und die Dosisreaktion in Tieren in aussagekräftigerer Weise durchgeführt werden als in in vitro oder in cyto Assays.
  • I. Immunnachweis
  • Es wird auch ins Auge gefasst, dass man die Expression des falsch gefalteten Krankheitsproteins in den konstruierten Hefezellen mittels immunologischer Verfahren unter Verwendung geeigneter Antikörper gegen falsch gefaltete Krankheitsproteine nachweisen kann. Man kann auch Antikörper gegen Hitzeschock-Protein(e) oder andere Antikörper gegen Chaperone verwenden, um den spezifischen in einer Hefezelle vorliegenden Typ an genetischer Mutation nachzuweisen. Die Proteine und/oder Polypeptide, die nachgewiesen werden können, schließen mutierte Versionen mit ein.
  • In wieder einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher Nachweisverfahren für die Bindung, Reinigung, Entfernung, Quantifizierung oder einen anderweitig allgemeinen Nachweis für biologische Bestandteile. Die Schritte verschiedener nützlicher Immunnachweisverfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben worden, wie beispielsweise in Nakamura et al (1987). Immunassays sind in ihrem einfachsten und direktesten Sinne Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunassays sind die verschiedenen Typen des enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISAs), Radioimmunassays (RIA) Immunkügelcheneinfangassay („Immunobead Capture Assay"). Der immunhistochemische Nachweis unter Verwendung von Gewebsschnitten ist ebenfalls ganz besonders nützlich. Jedoch wird man es wirklich zu schätzen wissen, dass der Nachweis nicht auf solche Techniken beschränkt ist und Western Blots, Dot Blots, FACS-Analysen und dergleichen könne ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Im Allgemeinen schließen Immunbindeverfahren das Beschaffen einer Hefezelle, die mit einem Expressionskonstrukt transformiert ist, das ein Protein oder Peptid exprimiert, und das In- Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper gegen das Protein oder Peptid in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls unter Bedingungen, die wirksam sind um die Bildung von Immunkomplexen zu erlauben, mit ein.
  • Die erfindungsgemäßen Immunbindeverfahren schließen Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung der Menge eines reaktiven Bestandteils in einer Probe mit ein, wobei das Verfahren des Nachweises oder der Quantifizierung irgendeines Immunkomplexes, der während des Bindungsprozesses gebildet wurde, bedarf. Hier würde man eine Hefezelle beschaffen, die mit einem Expressionskonstrukt transformiert ist, dass ein erfindungsgemäßes Protein oder Peptid exprimiert, und die Probe mit einem Antikörper in Kontakt bringen und dann die Menge an unter den spezifischen Bedingungen gebildeten Immunkomplexen nachweisen oder quantifizieren.
  • Das In-Kontakt-Bringen der ausgewählten biologischen Probe mit dem Protein, Peptid oder Antikörper unter wirksamen Bedingungen und für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bildung von Immunkomplexen (primäre Immunkomplexe) zu erlauben, ist im Allgemeinen eine Sache des einfachen Zusetzens der Zusammensetzung zu der Probe und des Inkubierens des Gemischs für einen Zeitraum, der für den Antikörper lang genug ist, um Immunkomplexe mit irgendeinem vorliegenden Antigen zu bilden, d. h. daran zu binden, beispielsweise an Antigene, die falsch gefalteten Krankheitsproteinen entsprechen. Nach dieser Zeit wird die Probe-Antikörper-Zusammensetzung, beispielsweise ein Gewebeschnitt, eine ELISA-Platte, ein Dot Blot oder ein Western Blot, im Allgemeinen gewaschen werden, um jede Art von nicht-spezifisch gebundenem Antikörper zu entfernen, was es gestattet nur jene Antikörpern nachzuweisen, die spezifisch innerhalb des primären Immunkomplexes gebunden sind.
  • Im Allgemeinen ist der Nachweis der Bildung von Immunkomplexen im Stand der Technik bekannt und kann durch die Anwendung einer Vielzahl von Herangehensweisen erreicht werden. Diese Verfahren beruhen im Allgemeinen auf dem Nachweis einer Markierung oder eines Markers, beispielsweise irgendeines radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder enzymatischen Tags oder Markierung, der/die routinemäßig im Stand der Technik verwendet wird. US-Patente, die die Verwendung solcher Markierungen betreffen, schließen 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 und 4,366,241 mit ein. Natürlich kann man zusätzliche Vorteile durch die Verwendung eines sekundären Bindeliganden, beispielsweise eines sekundären Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Ligandenbindungsanordnung, wie es im Stand der Technik bekannt ist, herausfinden.
  • Das kodierte Protein, Peptid oder der beim Nachweis eingesetzte entsprechende Antikörper können selbst an eine nachweisbare Markierung gekoppelt sein, wobei man dann einfach diese Markierung nachweisen würde, was es erlaubt, die Menge der primären Immunkomplexe in der Zusammensetzung zu bestimmen.
  • Alternativ wird der zuerst zugefügte Bestandteil, der innerhalb des primären Immunkomplexes gebunden wird, mittels eines zweiten Bindungsliganden nachgewiesen, der eine Bindungsaffinität für das kodierte Protein, Peptid oder den entsprechenden Antikörper hat. In diesen Fällen kann der zweite Bindungsligand an eine nachweisbare Markierung gekoppelt sein. Der zweite Bindungsligand selbst ist oft ein Antikörper, der daher als "sekundärer" Antikörper bezeichnet werden kann. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten, sekundären Bindungsliganden, oder Antikörper, unter wirksamen Bedingungen und für einen ausreichenden Zeitraum, der die Bildung sekundärer Immunkomplexe gestattet, in Kontakt gebracht. Die sekundären Immunkomplexe werden dann im Allgemeinen gewaschen, um jede Art von nichtspezifisch gebundenem sekundären Antikörper oder Liganden zu entfernen, und dann wird die in den sekundären Immunkomplexen verbleibende Markierung nachgewiesen.
  • Weitere Verfahren schließen den Nachweis primärer Immunkomplexe mittels einer aus zwei Schritten bestehenden Herangehensweise mit ein. Ein zweiter Bindungsligand, beispielsweise ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität für das kodierte Protein, Peptid oder entsprechenden Antikörper hat, wird verwendet, um sekundäre Immunkomplexe wie oben beschrieben zu bilden. Nach dem Waschen werden die sekundären Immunkomplexe mit einem dritten Bindungsliganden oder einem Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den sekundären Antikörper hat, erneut unter wirksamen Bedingungen und für einen ausreichenden Zeitraum, die/der die Bildung von Immunkomplexen gestattet (tertiäre Immunkomplexe), in Kontakt gebracht. Der dritte Ligand oder Antikörper ist an eine nachweisbare Markierung gekoppelt, die den Nachweis der so gebildeten tertiären Immunkomplexe erlaubt. Dieses System kann, falls gewünscht, eine Signalverstärkung zur Verfügung stellen.
  • J. Beispiele
  • BEISPIEL 1
  • Materialien und Methoden für die Ht-Expression in Hefe
  • Plasmidkonstruktion
  • Die Plasmide, die für Fusionen zwischen GFP und dem N-terminalen Bereich von Ht kodieren, waren das freundliche Geschenk der Hereditary Disease Foundation. Um Hefe-Expressionsplasmide für HtQ25 oder HtQ103 zu erzeugen, wurden die DNAs mit XhoI und XbaI verdaut, und die resultierenden XhoI/XbaI-Fragmente wurden in den pYES Vektor (Invitrogen) ligiert, um die Plasmide pYES/PQ25 bzw. pYES/PQ103 zu erhalten. Diese DNAs wurden mit SalI verdaut und die Enden wurden mit Klenow-Enzym aufgefüllt. Danach wurden die DNAs mit EcoRI verdaut und die resultierenden Fragmente wurden in den p426 Hochkopien(2μ)-Expressionsvektor für die konstitutive Expression bzw. in p426GAL für die Galaktose-Induktion subkloniert (Mumberg et al, 1994; Mumberg et al, 1995).
  • Um Niedrigkopie(CEN)-Expressionsplasmide mit entweder konstitutiven (GPD) oder Galaktose (GAL) induzierbaren Promoter-DNAs zu erzeugen, wurden p426/PQ25 oder p426/PQ103 mit XhoI verdaut. Die resultierenden XhoI-Fragmente wurden in p416 bzw. p416GAL subkloniert (Mumberg et al, 1994; Mumberg et al, 1995).
  • Um denselben Satz an Hefe-Expressionsplasmiden für HtQ47 oder HtQ72 zu erzeugen, wurden die DNAs zweifach mit Acc 65I und XbaI verdaut, die Fragmente mit Klenow-Enzym geglättet und in einen mit ClaI geglätteten p426-Vektor für die konstitutive Expression subkloniert. Um Niedrigkopie-Expressionsplasmide mit konstitutiver Expression (GPD) zu erzeugen wurden die DNAs p426/PQ47 oder p426/PQ72 mit SpeI und XhoI verdaut, und die resultierenden Fragmente wurden in p416 subkloniert.
  • Die Expressionsplasmide, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 5 aufgeführt (Kimura et al, 1995; Nathan et al, 1995; Vogel et al, 1995). Tabelle 5. Verwendete Plasmide
    Plasmid Promotor Kopienzahl Literaturverweis
    p416 GPD CEN, niedrig Mumberg, 1995
    p416/PQ25 GPD CEN, niedrig diese Studie
    p416/PQ47 GPD CEN, niedrig diese Studie
    p416/PQ72 GPD CEN, niedrig diese Studie
    p416/PQ103 GPD CEN, niedrig diese Studie
    p426 GPD 2μ, hoch Mumberg, 1995
    p426/PQ25 GPD 2μ, hoch diese Studie
    p426/PQ47 GPD 2μ, hoch diese Studie
    p426/PQ72 GPD 2μ, hoch diese Studie
    p426/PQ103 GPD 2μ, hoch diese Studie
    p416GAL GAL CEN, niedrig Mumberg, 1994
    p416Gal/PQ25 GAL CEN, niedrig diese Studie
    p416Gal/PQ103 GAL CEN, niedrig diese Studie
    p426GAL GAL 2μ, hoch Mumberg, 1994
    p426Gal/PQ25 GAL 2μ, hoch diese Studie
    p426Gal/PQ103 GAL 2μ, hoch diese Studie
    pTVSIS1 GPD 2μ, hoch unveröffentlicht
    pRSYDJ1 GPD CEN, niedrig Kimura et al., 1995
    pLH101 GPD 2μ, hoch unveröffentlicht
    pTGpd/P82 GPD CEN, niedrig Nathan & Lindquist, 1995
    p2HG(104) GPD 2μ, hoch Vogel et al., 1995
  • Hefetransformationen wurden unter Verwendung eines standardmäßigen Lithium/PEG-Verfahrens (Ito et al, 1983) durchgeführt.
  • Hefestämme, Transformation und Kultivierung
  • In dieser Studie verwendeten wir fünf isogene Serien an Hefestämmen, und zwar mit den Hintergründen: W303 (MATa can1-100 ade2-1 his3-11, 15 trp1-1 ura3-1 leu2-3, 112), YPH499 (MATa ade2-101ochre his3-Δ200 leu2-Δ1 lys2-801amber trp-Δ63 ura3-52), MHY810 (MATa his3-Δ200 leu2-Δ1 lys1-1 met14 ura3-Δ1::TRP1 trp1-Δ1), MHY501 (MATa his3-Δ200 leu2-3, 112 ura3-52 lys2-801 trp1-1) and MHY803 (MHY501 Derivat: MATa his3-Δ200 leu2-3, 112 ura3-52 lys2-801 trp1-1 (doa3::HIS3+) (Ycplac22-Doa3-His6)). Die MHY-Stämme waren das freundliche Geschenk von Mark Hochstrasser. Die verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 6 aufgeführt. TABELLE 6. Aggregation von mutiertem Huntingtin in verschiedenen Hefestämmen
    2μ Plasmide Aggregation von CEN Plasmide von Aggregation
    Q25 Q47 Q72 Q103 Q25 Q47 Q72 Q103
    Stamm
    MHY810 Wildtyp – –/+ + ++
    MHY898 sen3-1 – –/+ + ++ – + ++
    MHY803 Wildtyp – –/+ + ++ + ++
    MHY792 doa3-1 – –/+ + ++ – + ++
    MHY501 Wildtyp – –/+ + ++
    MHY1408 uba1 – –/+ + ++
    YPH499 Wildtyp – –/+ + ++
    DYJ1 Δydj1 – –/+ + ++
    W303 Wildtyp – –/+ + ++ – –/+ + ++
    LP6-2 Δhsp26 – –/+ + ++
    LP8-1 Δhsp35 – –/+ + ++
    SL314-A1 Δssa1ssa2 – –/+ + ++ + ++
    SL318-2A Δssa3ssa4 – –/+ + ++
    CLD82a Δhsc82 – –/+ + ++ + ++
    iLEP1α Δhsc82 – –/+ + ++
    SL304A Δhsp104 – – – – – – – –
    Überexpression
    Wildtyp YDJ1 – + ++
    Wildtyp SIS1 – + ++
    Wildtyp SSA1 – + +
    Wildtyp HSP82 – + ++
    Wildtyp HSP104 – + +
    Δhsp104 YDJ1 – – –
    Δhsp104 SIS1 – – –
  • Leerer Platz es wurde keine Transformation durchgeführt
    • – keine Fokusfluoreszenz
    • –/+ eine Minderheit an Zellen hat einen kleinen Fokus
    • + ein oder mehr Fokusse, mit erheblicher Hintergrundfluoreszenz
    • ++ ein oder zwei intensive Fluoreszenzfokusse, mit geringerer Hintergrundfluoreszenz
  • Hefetransformationen wurden unter Verwendung eines standardmäßigen Lithium/PEG-Verfahrens (Ito et al, 1983) durchgeführt.
  • Die Hefezellen wurden in reichhaltigem Medium (YPD) oder in einem Glukose/Raffinose/Galaktose-Minimalmedium (Adams et al, 1997), das defizient für die für die Plasmidselektion benötigten Aminosäuren ist, kultiviert. Zu experimentellen Zwecken wurden die Zellen über Nacht bei 25°C bis zur Log-, späten Log- oder frühen stationären Phase kultiviert.
  • Sedimentationsanalyse
  • Die Hefezellen wurden mittels Zentrifugation bei 1500 × g für 5 min bei Raumtemperatur geerntet und einmal in 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gewaschen. Die Zellen wurden in Sphäroblastierpuffer (1 M Sorbitol, 0,1 M EDTA, 0,5 mg/ml Zymolase 100T (Seikagaku Corporation), 50 mM Dithiothreitol, pH 7,5) resuspendiert und für 2 h bei 30°C inkubiert. Danach wurden die Sphäroblasten mittels milder Zentrifugation bei 325 × g für 5 min bei 4°C geerntet und in 1×TNE lysiert, der einen Protease-Inhibitor-Cocktail enthielt (Complete Mini-Tabletten, Boehringer Mannheim). Nach der Inkubation in 1×TNE + 2% Sarcosyl für 5 min auf Eis wurden die Proben auf ein 5%iges (w/v) Saccharosekissen (1 M Saccharose, 100 mM NaCl, 0,5% Sulfobetain) geladen und eine Zentrifugation bei 315.000 × g für 1 h bei 4°C durchgeführt. Danach wurden die Überstands- und Pelletfraktionen einer 8% SDS-PAGE (Novex) unterworfen und auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (Millipore Corporation) übertragen. Die Membranen wurden mit 5% fettfreiem, entwässertem Milchpulver in Phosphat gepufferter Saline (PBS) für 1 h blockiert. Die Inkubation mit dem primären Antikörper wurde über Nacht bei 4°C durchgeführt. Nach der Inkubation mit Protein A-Peroxidase (1:5000, Boehringer Mannheim) wurden die Immunkomplexe durch Behandlung der Membranen mit ECL-Reagenz (Amersham) visualisiert. Der Antikörper αGFP wurde 1:100 eingesetzt (Clontech).
  • Mikroskopie
  • Den Hefezellen wurde es gestattet, sich auf Polylysin behandelten Objektträgern für 10 min anzuheften. Für die Nukleus-Färbung wurden die Zellen mit 1% Formaldehyd für 5 min fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Nach der Behandlung mit 4',6-Diaminidin-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI, Sigma) für 5 min, wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Die Mikroskopie wurde mit einem Axioplan 2-Mikroskop (Zeiss) durchgeführt und die Mikroskopiebilder wurden bei einer Vergrößerung von 100× aufgenommen.
  • BEISPIEL 2
  • Koaleszenz von mutiertem Ht in Hefe
  • Um Ht in Hefe zu untersuchen, wurde der N-terminale Bereich (Aminosäuren 1–68 des Wildtyp-Proteins) mit einer wildtypischen polyQ (Polyglutamin)-Repeatlänge von 25 Resten oder mit mutierten Repeatlängen von 47, 72 oder 103 Resten an GFP fusioniert. Jeder davon wurde unter die Kontrolle von GPD, einem starken konstitutiven Hefe-Promotor, auf einem Einzelkopie-Plasmid (1) gesetzt. Homopolymere Gebiete an CAG, das natürlich vorkommenden Glutamin-Codon in Ht, sind inhärent instabil und das insbesondere in Hefe (Moore et al, 1999; Schweitzer et al, 1997). Dieses Problem wurde aufgrund der Tatsache reduziert, dass Glutamin sowohl durch CAG als auch durch CAA kodiert wird und dass gemischte Kodon-Repeats erheblich stabiler sind (Kazantsev et al, 1999). Um die Instabilitätsprobleme zu minimieren, wurden alle hier berichteten Experimente mit gemischten polyQ Kodon-Repeats durchgeführt und alle Arbeiten wurden mit frischen Transformanten durchgeführt, unter Verwendung von mindestens zwei unabhängigen Kolonien für jeden Fall, und wurden mindestens zweimal wiederholt.
  • Die Fluoreszenz von GFP-Fusionsproteinen, die wildtypische Polyglutamin-Gebiete enthielten (25 Reste; HtQ25) war immer diffus über die ganze Zelle verteilt (1, Mitte). HtQ47-Fluoreszenz war ebenfalls diffus verteilt, obwohl Koaleszenzfokusse in einem kleinen Prozentsatz der Zellen beobachtet wurden (weniger als 2%). Mehr als die Hälfte der Zellen, die HtQ72 exprimierten, wiesen einen einzigen intensiven Fluoreszenzfleck vor einem diffusen Fluoreszenzhintergrund auf. Nahezu alle Zellen, die HtQl03 exprimierten, wiesen einen einzigen intensiven Fluoreszenzfleck mit weit weniger Hintergrundfluoreszenz auf als bei den anderen Varianten beobachtet wurde. Als dieselben Konstrukte von Hochkopie-Plasmiden (p426-Serie, Tabelle 5) exprimiert wurden, war die Fluoreszenzintensität viel größer, aber das Fluoreszenzmuster war sehr ähnlich. Immunblotten des gesamten zellulären Proteins zeigte an, dass alle vier Varianten auf gleichem Niveau exprimiert wurden. Daher hängt der von N-terminalen Fragmenten von Ht ausgeübte Koaleszenzgrad mehr von der Länge der Polyglutamingebiete als von der exprimierten Proteinkonzentration ab.
  • BEISPIEL 3
  • Neu induziertes mutiertes Ht aggregiert in allen Zellen
  • Zellen, die verschiedene Q-Repeatvarianten exprimierten, wiesen dieselbe Frequenz an Plasmid-Verlust auf (bestimmt durch Ausplattieren der Zellen auf nicht-selektives und selektives Medium) und wuchsen mit ähnlichen Raten, mit nur einem leichten Defizit bei Zellen, die HtQ103 exprimierten. Die letztendlichen Dichten lagen üblicherweise bei 0,7–0,8 für Zellen, die HtQ25, HtQ47 oder HtQ72 exprimierten, und bei 0,5–0,7 für Zellen, die HtQ103 exprimierten. Daher waren die langen polyQ-Ht-Fragmente nicht übermäßig toxisch in Hefe. Weil die Proteine von einem konstitutiven Promotor exprimiert wurden, war es jedoch möglich, das während der Transformation eine Untergruppe von Zellen, die in der Lage war, in Gegenwart von polyQ-Proteinen zu wachsen, selektiert worden waren. In diesem Fall könnte die Selektion den Aggregationszustand der Proteine beeinflusst haben. Um zu bestimmen, ob die Koaleszenz von expandiertem Glutamin eine inhärente Eigenschaft des Proteins widerspiegelte oder das Ergebnis eines Selektionsprozesses war, wurden die Ht-GFP-Konstrukte unter die Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors gebracht (Tabelle 5). Die Transformanten wurden auf Glukoseplatten selektioniert, um das Konstrukt stark reprimiert zu halten. Um die Induktion zu initiieren, wurden die Zellen zuerst für das Ausschalten der Glukoserepression in Raffinose-Medium über Nacht kultiviert, und dann für die Induktion der Ht-Expression in Galaktose-Medium überführt.
  • Nach 4 Stunden wurde eine helle GFP-Fluoreszenz beobachtet, aber für alle drei getesteten Varianten, HtQ25, HtQ72, und HtQl03, war die Fluoreszenz diffus verteilt. Mit fortdauernder Expression begann die Koaleszenz von HtQ72 und HtQ103 in einigen Zellen nach 9 Stunden (zwei Verdoppelungen) aufzutreten. Nach 24 Stunden war die Koaleszenz nicht mehr unterscheidbar von der, die in Kulturen beobachtet worden war, die Ht-Varianten konstitutiv exprimierten, und alle Kulturen hatten ähnliche Dichten erreicht. Daher tritt Koaleszenz von expandierten Glutamin-Repeats in den meisten, wenn nicht allen, Zellen in Kultur auf, aber viele Stunden der Expression werden benötigt, damit sie auftritt.
  • BEISPIEL 4
  • Mutiertes Ht bildet cytoplasmatische Aggregate in Hefe
  • Die gleichzeitige Färbung von Zellen mit DAPI, einem DNA-bindenden Farbstoff, der blau fluoresziert, zeigte, dass die Fokusse der Ht-Koaleszenz sich im cytoplasmatischen Kompartiment, aber nicht im Nukleus befanden. Um zu bestimmen, ob diese Fokusse die Absonderung von Ht-GFP-Fusionen in ein Membran-gebundenes Kompartiment oder die Bildung von Proteinkomplexen höherer Ordnung widerspiegeln, wurden die Zellwände entfernt und die Zellen in Gegenwart des Detergens Sarkosyl (2%) lysiert. Nach der Sedimentation wurden die Überstands- und die Pellet-Fraktionen in Probenpuffer mit 5% SDS für 10 Minuten gekocht und mittels Immunblot analysiert.
  • HtQ25 und HtQ47 wurden nur in den Überstandsfraktionen nachgewiesen. HtQ72 war zwischen den Überstands- und Pellet-Fraktionen verteilt, wohingegen HtQ103-Protein nahezu vollständig in der Pellet-Fraktion gefunden wurde. Man beachte, dass nach der Gelelektrophorese eine große Fraktion von HtQ103 oben am Gel verblieb. Offensichtlich war die durch GFP-Fluoreszenz nachgewiesene Koaleszenz auf die Bildung von komplexen höherer Ordnung zurückzuführen. Für HtQ103 und in geringerem Maße für HtQ72 widerstanden diese Komplexe der Solubilisierung mittels Kochen in 5% SDS.
  • BEISPIEL 5
  • Die Aggregate sind in Proteasom-defizienten Zellen unverändert
  • Weil Ht-Aggregate (Saudou et al, 1998) und andere Glutamin-Repeat-Proteine, die mit Erkrankungen in Verbindung stehen, beispielsweise SBMA (Stenoien et al, 1999), SCA3 (Chai et al, 1999) und SCA 1 (Cummings et al, 1998), in Säugetierzellen ubiquitiniert werden und mit Bestandteilen des Proteasoms in Verbindung stehen, ist vorgeschlagen worden, dass der Ubiquitin/Proteasom-Weg an der Aggregatsbildung beteiligt sein könnte. Ubiqutinierte Ht-Proteine wurden in Hefezellen nicht nachgewiesen. Jedoch kann es sogar für Proteine, von denen man weiß, dass sie über diesen Weg umgesetzt werden, schwierig sein, Ubiquitin-Konjugate nachzuweisen. Um dieser Frage genauer nachzugehen, wurde eine genetische Herangehensweise versucht. Es wurden drei Stämme eingesetzt, von denen jeder eine Läsion in einem anderen Bestandteil des Ubiquitin/Proteasom-Abbauwegs enthielt: 1) uba1, das Ubiquitin aktivierende Enzym (M. Hochstrasser), 2) doa3, eine katalytische Untereinheit des 20S-Proteasoms (Chen et al, 1995), und 3) sen3, eine Untereinheit des 19S-Proteasom regulierenden Komplexes (DeMarini et al, 1995). Da jedes dieser Gene essenziell ist, wurden Mutationen mit einem Teilfunktionsverlust verwendet, die diesen Weg erheblich stören. In jedem dieser Stämme verhielten sich die Ht-Varianten in der gleichen Art und Weise wie sie es in Wildtyp-Zellen getan hatten. Es gab weder Veränderungen in der Anzahl an Zellen, die Koaleszenz-Fokusse enthielten, noch in der Größe oder intrazellulären Verteilung jener Fokusse (Tabelle 6).
  • BEISPIEL 6
  • Molekulare Chaperone beeinflussen die Aggregation von Ht
  • Chaperon-Proteine sind eine hochkonservierte aber diverse Proteingruppe, die die Faltung anderer Proteine durch die Wechselwirkung mit verschiedenen Typen an Faltungsintermediaten und fehlgeleiteten Faltungsprodukten kontrollieren (Gething, 1997). Sie haben tief greifende Auswirkungen auf die Aggregation anormaler Proteine. Um zu bestimmen, wie Veränderungen in der Konzentration der Chaperon-Proteine die Koaleszenz der Ht-polyQ-Varianten beeinflusst, wurde eine isogene Serie von Stämmen erzeugt, die Deletionsmutationen oder Überexpressionsplasmide für verschiedenen Chaperon-Proteine enthielten, und die wildtypische oder polyQ expandierte Ht Fragmente herstellten. Man beachte, dass einige der Chaperon-Deletionen nicht getestet werden konnten, da sie lethal sind.
  • Die meisten der getesteten Änderungen an den Chaperon-Proteinen hatten keinen bemerkenswerten Effekt auf die intrazelluläre Verteilung der Ht-Varianten, wie mittels GFP-Fluoreszenz bestimmt wurde (Tabelle 6), und keine signifikante Auswirkungen auf die Art, in der die Ht-Fragmente zwischen den Überstands und Pellet-Fraktionen nach der Sedimentation aufgeteilt waren. Diese Kategorie schloss Mutationen mit ein, die die Expression des größeren kleinen Hsp („major small Hsp", in Hefe Hsp26) ausschalteten (Petko et al, 1986), 2) die die Expression von Hsp90 (in Hefe Hsc/p82) um ein Mehrfaches erhöhten (Borkovich et al, 1989) oder die Expression von Hsp90 um das 10- bis 15-fache verringerten (Nathan et al, 1999), 3) die die Expression verschiedener Mitglieder der essenziellen cytosolischen Hsp70-Familie (konstitutive Mitglieder Ssa1 und Ssa2 (Parsell et al, 1994), und die Stress induzierbaren Mitglieder Ssa3 und Ssa4) ausschalteten, und 4) die die Expression von Ydj1 (ein Mitglied der Hsp40-Familie) erhöhten oder ausschalten (Kimura et al, 1995). Eine Deletion von Hsp35 wurde ebenfalls untersucht. Dieses durch Hitze induzierbare Protein ist ein Mitglied der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Familie und von ihm wird behauptet, dass es ein Chaperon ist, weil es sowohl Hitze-induzierbar ist als auch eines der häufigsten Proteine in Hefe (Boucherie et al, 1995). Die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase der Säugetiere weist eine von der Glutaminlänge abhängige Assoziation mit Ht auf (Burke et al, 1906 90).
  • Die Überexpression der drei Chaperon hatte erhebliche Auswirkungen. Sis1, ein Mitglied der Hsp40-Familie, verursachte, dass zwei intensive Aggregationsfokusse in den meisten Zellen mit HtQ72 und HtQ103 erschienen, anstelle des einzelnen Koaleszenzfokus, der in beinahe allen Wildtyp-Zellen beobachtet wird. In den Zellen, die Hsp70 (Ssa1) exprimierten, war die HtQ72- und HtQ103-Fluoreszenz viel variabler als in den Wildtyp-Zellen. Mehrfachfluoreszenzfokusse wurden in vielen Zellen beobachtet, und viele enthielten auch eine höhere diffuse Hintergrundfluoreszenz. Diese Variabilität spiegelt wahrscheinlich Unterschiede in der Plasmidkopienzahl wieder, die üblicherweise bei Hsp70-Expressionsplasmiden beobachtet wird (Stone et alle, 1990). Die Überexpression von Hsp 104 erhöhte ebenfalls die Anzahl der Fluoreszenzfokusse und die Hintergrundfluoreszenz, die für die Ht-Varianten HtQ72 und HtQ103 beobachtet wird (Tabelle 6). Sie erhöhte auch die relativen Mengen an HtQ72 und HtQ103, die man in den Überstandsfraktionen nach der Zentrifugation findet. Seltsamerweise war in drei von drei Experimenten wenig Protein in der Pelletfraktion, obwohl HtQ72-Protein in diesen Zellen zumindest teilaggregiert erschien. Das Protein könnte etwas loser gepackt sein oder sich in einem Sarcosyl-löslichen Zustand befinden.
  • Von allen getesteten Chaperon-Veränderungen hatte eine Deletion des HSP104-Gens die dramatischste Auswirkung. In diesen Stämmen wiesen alle Ht-Variantenfragmente eine diffuse Fluoreszenz auf. Dieselben Ergebnisse wurden sowohl mit den Hochkopie- als auch mit den Niedrigkopie-Ht-Expressionskonstrukten erhalten (Tabelle 6). Darüber hinaus wurden bei der Sedimentation alle Proteine nur in den Überstandsfraktionen nachgewiesen.
  • BEISPIEL 7
  • Hsp40 änderte die Aggregation von Ht-Varianten
  • Die Tatsache, dass Sis1 (in Hefe ein Klasse II Hsp40-Protein) den Aggregationszustand von Huntingtin beeinflusste und dass Hsp40-Proteine, insbesondere HDJ-1, eine wesentliche Rolle bei der polyQ-induzierten Toxizität in mehreren Modellsystemen zu spielen scheinen, führte zu einer detaillierteren Analyse von Sis1. Hefe-Stämme, die technisch so konstruiert worden waren, dass sie verschiedene Bereiche des Sis1-Proteins exprimierten, wurden mit den Huntingtin-GFP-Fusionskonstrukten, die in den obigen Beispielen beschrieben wurden, transformiert. Das Aggregationsmuster von HtQ72 und HtQ103 wurde durch die Herstellung von mutierten Sis1-Proteinen erheblich verändert. Anstelle einer kleinen Zahl großer Aggregate lag eine große Anzahl kleinerer Aggregate vor. Besonders bemerkenswert ist, dass bei einem Sis1-Konstrukt diese Veränderung in der Aggregation von einer Verringerung der Lebensfähigkeit begleitet wurde. Diese Sis1-induzierten Toxizität kann durch Koexpression von Hsp104 verringert werden. Hsp 104 verringert auch sowohl die Aggregatsbildung als auch den Zelltod in einem Säugerzellenmodelle für Huntingtin-Toxizität und in einem C. elegans Modell, das einfache polyQ-GFP-Fusionen einsetzt. Diese erstaunlichen Beobachtungen legen nahe, dass man die in Hefe durch Sis1-Veränderungen induzierte Toxizität von Huntingtin als in direktem Zusammenhang stehend mit seiner Toxizität im Menschen erachten kann.
  • BEISPIEL 8
  • Verbindungen, die die Huntingtin-Toxizität in Hefe beeinflussen
  • Mittels des Stammes, der ein verkürztes Sis1-Protein und HtQ103 (toxisch) exprimiert, wurden Durchmusterungen unter Verwendung des in den Beispielen 9 und 10 unten beschriebenen „Spotting Assays" durchgeführt. Weitere Durchmusterungen mit anderen Kandidatenwirkstoffen werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Diese Durchmusterungen erlauben die Identifizierung von Wirkstoffen, die die Huntingtin-Aggregation in der lebenden Zelle beeinflussen, selbst aber nicht toxisch sind.
  • Insbesondere wurden Hefestämme mit dem mutierten Sis1-Hintergrund, die HtQ25 (Kontrolle, nicht toxisch) oder HtQ72 (nicht toxisch, aber potentiell schon) oder HtQ103 (toxisch) exprimierten, in seriellen Verdünnungen auf Selektionsmedien mit oder ohne Testverbindungen aufgetragen. HtQ47 wird auch in seriellen Verdünnungen auf Selektionsmedien mit oder ohne Testverbindungen in ähnlichen Experimenten aufgetragen werden. Erhöhte Wachstumsrate auf den Testplatten im Vergleich zu Kontrollplatten identifiziert Verbindungen mit einem Potenzial, die Toxizität zu verringern; ein verringertes Wachstum identifiziert Verbindungen, die die Toxizität erhöhen können. Die Mikroskopanalyse bestimmt mittels der GFP-Fusionsproteine, ob diese Wirkstoffe auch die Aggregatsbildung beeinflussen. Diese Durchmusterung wird auch mit Hefestämmen durchgeführt werden, die nur den N-terminalen Bereich von Huntingtin, aber nicht an GFP fusioniert, exprimieren.
  • Spotting Assays zeigen, dass verschiedene Verbindungen, einschließlich mehrerer in Tabelle 3 aufgeführter Verbindungen, die Toxizität in den Hefestämmen, die W303, hsp104 und Sis1-Mutanten umfassen, induzieren.
  • Eine Sorge bei Hefe-Durchmusterungen ist, dass einige der Wirkstoffe nicht in der Lage sein könnten, in die Hefezelle einzutreten, von ihr aufgenommen zu werden, oder rasch metabolisiert werden, oder aus der Zelle gepumpt werden. Um diese Möglichkeit zu beseitigen, werden Hefestammvarianten, die entworfen wurden, um dieses Problem zu beseitigen, eingesetzt werden. Ein Stamm, der in drei Genen mutiert ist (erg6, pdr1, und pdr3), die die Membranausflusspumpen beeinflussen (Cummings et al, 1998) und die Permeabilität für Arzneimittel erhöhen (Chen et al, 1995), werden in den anfänglichen Studien verwendet werden.
  • Diese besonderen Stämme sind in der Krebsforschung sehr erfolgreich verwendet worden, um Wachstumsregulatoren zu identifizieren (siehe Website: http://dtp.nci.nih.gov).
  • BEISPIEL 9
  • Materialien und Methoden für Toxizität in Hefe, die falsch gefaltete Krankheitsproteine exprimiert
  • Plasmidkonstruktionen
  • Wildtyp (WT), A53T und A30P Alpha-Synuklein cDNAs waren ein freundliches Geschenk von Dr. Peter Lansbury. WT, A53T, and A30P Sequenzen wurden in p426GPD, p416GPD, p423GPD und p425GPD mittels standardmäßigen molekularbiologischen Vorgehensweisen subkloniert (Mumberg et al., 1995). GFP-, CFP- und YFP-Fusionen, die Fusionen von Alpha-Synuklein im Leseraster mit GFP, CFP oder YFP sind, wurden konstruiert, in dem die kodierende Sequenz von XFP (wobei X für G, C oder Y steht) im Leseraster mit Alpha-Synuklein in dieselben Vektoren eingesetzt wurde. Die XFP-Fusionen wurden auch in pRS306 und pRS304 unter der Regulation eines GAL1-10-Promotors und mit einem Cyc1-Terminatorbereich subkloniert.
  • Hefetechniken
  • Die Hefestämme wurden gemäß Standardvorgehensweisen kultiviert und manipuliert (siehe Guthrie und Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press).
  • Spotting Experimente
  • Die Hefezellen wurden routinemäßig über Nacht bei 30°C oder bei Raumtemperatur in Selektionsmedium kultiviert, bis sie die Log- oder späte Log-Phase erreichten. Die Zellen wurden mittels eines Hämocytometers gezählt und auf 1 × 106 Zellen/ml verdünnt. Es wurden fünf serielle Verdünnungen (fünffach) hergestellt und die Zellen wurden auf ein Medium aufgetragen, das zu durchmusternde Chemikalien/Arzneimittel enthielt.
  • BEISPIEL 10
  • Alpha-Synuklein bildet Fluoreszenzfokusse im Cytoplasma von Hefe
  • Mittels der GFP-Fusionen wurde die Bildung von über das Cytoplasma verteilten Fluoreszenzfokussen nachgewiesen. Diese Einschlüsse waren beim WT und bei der A53T-Mutante auffälliger als bei der A30P-Mutante. Bei Verwendung dieser Art von Assay kann die Bildung von Einschlüssen durch A30P nicht ausgeschlossen werden, aber in diesem Fall muss eine andere Art von Aggregat erwartet werden, da das GFP-Fluoreszenzmuster anders aussieht.
  • BEISPIEL 11
  • Bedingungen, die die Toxizität von Alpha-Synuklein erhöhen
  • Unter Verwendung der Spotting-Experimente wurden verschiedene Chemikalienkategorien als Wirkstoffe identifiziert, die in der Lage sind, die Toxizität von Alpha-Synuklein Überexpression zu verschlimmern oder die Toxizität von Huntingtin-Expression zu induzieren. Von denen in Tabelle 3 getesteten Verbindungen hatten die folgenden eine negative Auswirkung auf das Wachstum von Hefezellen, die WT Alpha-Synuklein überexprimierten: Kohlenstoffquellen (Arabinose 2%); Stickstoffquellen (Harnstoff 1 mg/ml); Salze und Metalle (CaCl2 0.5 M, CoCl2 750 μM, CsCl 0.1 M, CuSo4 2.5 mM, CuSo4 5 mM, Fe2(SO4)3 8.5 mM, FeSO4 20 mM, FeCl2 10 mM, FeCl2 15 mM, FeCl2 23 mM, FeCl2 50 mM, MgCl2 0.5 M, MgSO4 0.5 M, RbCl 0.2 M, SrCl2 0.5 M); und allgemeine Inhibitoren (6-Azauracil 30 μg/ml, Aurintricarbonsäure 100 μM, Bleomycin 1 μg/ml, Brefeldin A 100 μg/ml, Camptothecin 5 μg/ml, Chlorambucil 3 mM, Ethidiumbromid 50 μg/ml, Formamid 2%, GuHCl 20, Hydroxyharnstoff 5 mg/ml, Menadion 20-50 μM, Paraquat 1 mM (Methylviogen), Vanadat 1 mM, Vanadat 0.1 mM, Vanadat 2 mM, Vanadat 4 mM, Vanadat 7 mM + KCl.
  • Einige Verbindungen wiesen in einer vorläufigen Studie die Fähigkeit auf, die Toxizität, die durch Alpha-Synuklein Überexpression verursacht wird, zu verringern. Diese schließen mit ein: Stickstoffquelle (Serin 1 mg/ml); allgemeine Inhibitoren (Camptothecin 0.1 μg/ml, DL-C-Allylglycin 0.025 mg/ml, Hygromycin B 50 μg/ml, L-Ethionin 1 μg/ml, Paromomycin 200 μg/ml, Protaminsulphat 250 μM); Vitamine (B12); Proteasominhibitoren (Chloroquin 4.2 μM, Clioquinol 5 μM, (R)-(-)-3-Hydroxybutyrat, L-DOPA); Amyloid-verwandte Verbindungen (Kongo Rot 5 μM, Chrysamin G 1.0 μM, Desoxycorticosteron); und Antioxidationsmittel (Glutathion).
  • BEISPIEL 12
  • Durchmusterung mit FREI und FACS
  • An CFP und an YFP fusioniertes Alpha-Synuklein wurde in das Hefegenom unter der Regulation eines Gal1-10-Promotors integriert (4). Die Zellen wurden in Galaktose kultiviert, um die Expression zu induzieren. Nach der Induktion werden die Zellen die Fusionsproteine herstellen, die dann aggregieren und CFP und YFP nahe zusammenbringen.
  • Weil die Proteine in den Aggregaten dicht gepackt sind, wird der Abstand zwischen dem CFP und dem YFP weniger als den kritische Wert von 100 Angström betragen, der für das Auftreten eines Energietransfers (FREI) notwendig ist. In diesem Fall wird die durch die Emission von CFP freigesetzte Energie YFP anregen, das wiederum bei seiner charakteristischen Wellenlänge emittieren wird. Daher kann dieses Phänomen verwendet werden, um Arzneimittel, Gene oder andere Faktoren zu identifizieren, die diese Wechselwirkung unterbrechen können, indem sie die Proteine in einem Zustand halten, der den Eintritt von Aggregation nicht erlaubt. Diese Faktoren werden durch das Sortieren der Zellen mittels der FACS-Analyse analysiert werden. Das erlaubt die Untersuchung von toxischen Intermediaten im Aggregationsprozess, und adressiert daher, ob die Aggregate oder andere Intermediate den Zelltod verursachen.
  • BEISPIEL 13
  • RNA-Aptamer Durchmusterung
  • RNA-Aptamere werden durchmustert werden, um diejenigen zu identifizieren, die aufgrund ihrer Fähigkeit, Amyloidfasern oder andere intermediäre Spezies in diesem Stoffwechselweg zu erkennen und zu binden, eine potentielle Anwendung als Therapeutika für neurodegenerative Erkrankungen hätten. Das Hefesystem wäre dann für die Durchführung dieser Durchmusterungen sehr zugänglich, entweder indem man direkt nach Molekülen schaut, die die Toxizität von Alpha-Synuklein Überexpression verringern, oder indem man nach Molekülen schaut, die die Wechselwirkung zwischen denjenigen Spezies unterbricht, die zu der Aggregation des Proteins führen. Es wäre auch interessant, einige Moleküle herauszufinden, die die Toxizität verschlimmern oder die Aggregation fördern, da dies Einblicke in die Epitope geben würde, die für die Fibrillogenese/Aggregation dieses und anderer Proteine, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, notwendig sind.
  • LITERATURVERZEICHNIS
  • Die folgenden Literaturangaben stellen zu den hierin vorgebrachten ergänzend beispielhafte Details zur Vorgehensweise oder andere Details zur Verfügung. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00740001
    Figure 00750001
    Figure 00760001
    Figure 00770001
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    Figure 00790001
    Figure 00800001
    Figure 00810001
    Figure 00820001

Claims (13)

  1. Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung, die die mit Alpha-Synnuklein verbundene Toxizität verringert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer Hefezelle mit einer Kandidatenverbindung, wobei die Hefezelle ein Polypeptid exprimiert, das Alpha-Synnuklein umfasst; b) In-Kontakt-Bringen der Hefezelle mit einem toxizitätsinduzierenden Wirkstoff; und c) Bewerten der Lebensfähigkeit der Hefezelle, wobei die Lebensfähigkeit anzeigt, dass die Kandidatenverbindung die mit Alpha-Synnuklein verbundene Toxizität verringert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der toxizitätsinduzierende Wirkstoff eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein Salz, ein Metall, ein chemotherapeutischer Wirkstoff, ein Alkohol, ein Translationsinhibitor, NSAID, ein DNA-Interkalierer, eine chelatierende Verbindung, ein Liposom, ein Antibiotikum, ein Vitamin, ein Proteasominhibitor, ein Antioxidationsmittel, oder ein reduzierender Wirkstoff ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der toxizitätsinduzierende Wirkstoff ein Metall oder ein Salz ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der toxizitätsinduzierende Wirkstoff eine Verbindung ist, die oxidativen Stress verursacht.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Verbindung, die oxidativen Stress verursacht, Menadion ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alpha-Synnuklein ein Wildtyp-Alpha-Synnuklein ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alpha-Synnuklein eine A53T-Mutation umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Alpha-Synnuklein eine A30P-Mutation umfasst.
  9. Verfahren zum Durchmustern nach einer Verbindung, die die mit Alpha-Synnuklein verbundene Toxizität verringert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Zur-Verfügung-Stellen einer Hefezelle, die technisch so konstruiert wurde, dass sie ein Polypeptid exprimiert, das Alpha-Synnuklein umfasst; b) In-Kontakt-Bringen der Hefezelle mit einer Kandidatenverbindung; und c) Bewerten der Lebensfähigkeit der Hefezelle, wobei eine Zunahme der Lebensfähigkeit der Hefezelle im Vergleich zur Lebensfähigkeit der Hefezelle in Abwesenheit der Kandidatenverbindung anzeigt, dass die Kandidatenverbindung die mit Alpha-Synnuklein verbundene Toxizität verringert.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Hefezelle einen genetischen Hintergrund hat, der verursacht, dass die Hefezelle als Ergebnis des Exprimierens des Polypeptids, das Alpha-Synnuklein umfasst, eine verringerte Wachstumsrate oder gar keine Wachstumsrate hat.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Alpha-Synnuklein Wildtyp-Alpha-Synnuklein ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Alpha-Synnuklein eine A53T-Mutation umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Alpha-Synnuklein eine A30P-Mutation umfasst.
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