JP2008259509A - タンパク質の折り畳みに影響する薬剤の酵母スクリーニング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】上記課題は遺伝子的スクリーニング方法および化学的スクリーニング方法は、酵母系を用いて解決される。本発明の方法は、多くの神経変性疾患(パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病)、および非神経疾患(例えば、2型糖尿病を含む)を含む、タンパク質の誤った折り畳みおよび/またはタンパク質の原線維形成および/またはタンパク質の凝集を防止する化合物をスクリーニングするための迅速かつコスト効果の高い方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は一般的に、遺伝的および化学的スクリーニングの分野およびタンパク質の誤った折り畳みに関連する疾患に関連する。より具体的には、タンパク質の誤った折り畳みに関連する様々な疾患に治療的価値を提供する物質をスクリーニングするために使用し得る、酵母に基づくシステムの開発に関する。本発明の酵母システムを使用して遺伝的および化学的スクリーニングを行なう方法も提供される。本発明の方法によって利益を受ける1つの大きな疾患の種類は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病等を含む神経変性疾患である。
(2.関連する技術の説明)
タンパク質の正しい折り畳みは、適当な生物学的機能を達成するために重要な出来事である。正しい折り畳みは、タンパク質の特徴的なコンフォメーションを導き、それはタンパク質の活性、凝集、分解、および機能を決定する。いくつかのタンパク質が、特にパーキンソン病(PD)、伝染性海綿状脳症(TSE)、アルツハイマー病(AD)、家族性アミロイド多発性神経障害(FAP)、プリオン病、およびハンティングトン病(HD)のような神経変性疾患に関係している。これらのタンパク質は、別の折り畳みメカニズムによって異常な凝集を形成する。これらの誤って折り畳まれたタンパク質の凝集物は、不溶性の原線維を形成し、それは次いで組織に沈着する。原線維発生は、神経変性に関与する様々な病理の原因である。組織における不溶性原線維の沈着は、病状が進行するにつれて、斑およびもつれの形成、そして最終的に細胞変性を引き起こす。原線維形成タンパク質にアミノ酸配列相同性は無いにもかかわらず、原線維はいくつかの共通する形態学的特徴を有する。例えば、アミロイド線維(アミロイドタンパク質によって形成される)のいくつかの共通する形態学的特徴は、交差するβ構造、同様の大きさ、偏光下で観察した場合コンゴレッドで染色時に緑色複屈折の提示、チオフラビンT結合等を含む。
誤って折り畳まれたタンパク質に関与する疾患が、哺乳類で同定された(「誤って折り畳まれたタンパク質疾患」)。これらの疾患は、パーキンソン病;プリオン病(クロイツフェルト−ヤコブ病(CJD)、致死性家族性不眠症(FFI)、ゲルストマン−シュトロイスラー−Scheinker病(GSS)、狂牛病、スクレイピーおよびクールーを含む);家族性アミロイド多発性神経障害、タウオパシー(ピック病、肺葉萎縮症、および前頭側頭痴呆を含む);トリヌクレオチド疾患(ハンティングトン病、脊髄小脳性運動失調(SCA)、歯状核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、ぜい弱X症候群、筋緊張性ジストロフィー、Haw River症候群、遺伝性運動失調、マチャドジョセフ病、およびケネディ病(脊髄延髄筋萎縮症、SBMA)を含む)を含む。
(1) ハンティングトン病に対する治療剤をスクリーニングする方法であって:
a)酵母細胞と候補化合物とを接触させる工程であって、該酵母細胞は、ハンティングトンポリペプチドを含むポリペプチドを発現し、野生型Hsp−40を発現しない、工程;
b)該酵母細胞の生存率を評価する工程であって、生存率は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含する、方法。
(2) 前記ハンティングトンポリペプチドが、N末端領域を含む、項目1に記載の方法。
(3) 前記N末端領域が、ポリQ反復を含む、項目2に記載の方法。
(4) 前記ポリQ反復が、70残基を含む、項目3に記載の方法。
(5) 前記ポリQ反復が、100残基を含む、項目4に記載の方法。
(6) 前記ポリペプチドが、融合タンパク質である、項目1に記載の方法。
(7) 前記ポリペプチドが、レポーターポリペプチドをさらに含む、項目6に記載の方法。
(8) 前記レポーターポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質である、項目7に記載の方法。
(9) 前記レポーターポリペプチドが、Sup35である、項目7に記載の方法。
(10) 前記酵母細胞が、短縮型Hsp40ポリペプチドを発現する、項目1に記載の方法。
(11) 前記Hsp40ポリペプチドが、C末端欠失を有する、項目10に記載の方法。
(12) 前記C末端欠失が、配列番号8のアミノ酸173〜352を含む、項目10に記載の方法。
(13) 前記C末端欠失が、配列番号8のアミノ酸122〜352を含む、項目12に記載の方法。
(14) 前記Hsp40ポリペプチドが、少なくとも1つの内部欠失を有する、項目10に記載の方法。
(15) 前記酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、項目1に記載の方法。
(16) 前記酵母の染色体Hsp40遺伝子が、変異を含む、項目1に記載の方法。
(17) 前記変異が欠失である、項目16に記載の方法。
(18) 前記酵母細胞と毒性誘導薬剤とを接触させる工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(19) 前記毒性誘導薬剤が、炭素源、窒素源、塩、金属、リポソーム、抗生物質、アニソマイシン、ブレオマイシン、カフェイン、カンプトテシン、カルボニル−シアニド、ダウノマイシン、エタノール、ホルムアミド、GuHCL、またはNEMである、項目18に記載の方法。
(20) 前記毒性誘導薬剤が炭素源である、項目18に記載の方法。
(21) 前記炭素源が、アラビノースまたは酢酸カリウムである、項目20に記載の方法。
(22) 前記毒性誘導薬剤が、塩または金属である、項目18に記載の方法。
(23) 前記塩または金属が、CdCl2、CoCl2、CsCl、FeCl2、LiCl、NH4Cl、RbCl、またはZnCl2である、項目22に記載の方法。
(24) 前記候補化合物が低分子である、項目1に記載の方法。
(25) 前記候補化合物が核酸である、項目1に記載の方法。
(26) 生存率が、候補化合物との接触の48時間後より後で評価される、項目1に記載の方法。
(27) 前記a)からの酵母細胞の生存率と、前記候補化合物と接触されそして野生型Hsp−40を発現する酵母細胞の生存率とを比較する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(28) 前記a)からの酵母細胞の生存率と、前記候補化合物に曝されておらずそして野生型Hsp40を発現しない酵母細胞の生存率とを比較する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(29) ハンティングトン病に対する治療剤をスクリーニングする方法であって:
a)酵母細胞と候補化合物とを接触させる工程であって、該酵母細胞は、少なくとも70残基のポリQ領域を有するハンティングトンポリペプチド含むポリペプチドを発現し、そして野生型Hsp−40を発現しない、工程;
b)該酵母細胞の生存率を評価する工程であって、生存率は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含する、方法。
(30) パーキンソン病に対する治療剤をスクリーニングする方法であって:
a)アルファシヌクレインポリペプチドを含むポリペプチドを発現する酵母細胞と、毒性誘導薬剤を含む組成物とを接触させる工程;
b)該酵母細胞と候補化合物とを接触させる工程;および
c)該酵母細胞の生存率を評価する工程であって、生存率は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含する、方法。
(31) 前記アルファシヌクレインポリペプチドが野生型である、項目30に記載の方法。
(32) 前記アルファシヌクレインポリペプチドが変異している、項目30に記載の方法。
(33) 前記アルファシヌクレインポリペプチドが、A53T変異を含む、項目32に記載の方法。
(34) 前記アルファシヌクレインポリペプチドが、A30P変異を含む、項目32に記載の方法。
(35) 前記ポリペプチドが融合タンパク質である、項目30に記載の方法。
(36) 前記ポリペプチドが、レポーターポリペプチドをさらに含む、項目35に記載の方法。
(37) 前記レポーターポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質である、項目36に記載の方法。
(38) 前記レポーターポリペプチドがSup35である、項目36に記載の方法。
(39) 前記酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae細胞である、項目30に記載の方法。
(40) 前記毒性誘導薬剤が、炭素源、窒素源、塩、金属、アザウラシル、アウリントリカルボン酸、ブレフェルジンA、カンプトテシン、クロラムブシル、エチジウムブロミド、ホルムアミド、GuHCl、ヒドロキシ尿素、メナジオン、パラコート、またはバナデートである、項目30に記載の方法。
(41) 前記毒性誘導薬剤が炭素源である、項目40に記載の方法。
(42) 前記炭素源が、アラビノース、エタノール、またはグリセロールである、項目41に記載の方法。
(43) 前記毒性誘導薬剤が窒素源である、項目40に記載の方法。
(44) 前記窒素源が尿素である、項目43に記載の方法。
(45) 前記毒性誘導薬剤が、塩または金属である、項目40に記載の方法。
(46) 前記塩または金属が、CaCl2、CoCl2、CsCl、または鉄、マグネシウム、RbCl、もしくはSrCl2である、項目45に記載の方法。
(47) 前記候補化合物が低分子である、項目30に記載の方法。
(48) 前記候補化合物が核酸である、項目30に記載の方法。
(49) 生存率が、候補化合物との接触の48時間後より後で評価される、項目30に記載の方法。
(50) ハンティングトン病患者を処置する方法であって、該患者に有効量の治療剤を投与する工程を包含し、該治療剤は、以下:
a)酵母細胞と候補化合物とを接触させる工程であって、該酵母細胞は、ハンティングトンポリペプチドを含むポリペプチドを発現し、野生型Hsp−40を発現しない、工程;
b)該酵母細胞の生存率を評価する工程であって、生存率は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含するプロセスにより同定された、方法。
(51) パーキンソン病患者を処置する方法であって、該患者に有効量の治療剤を投与する工程を包含し、該治療剤は、以下:
a)アルファシヌクレインポリペプチドを含むポリペプチドを発現する酵母細胞と、毒性誘導薬剤を含む組成物とを接触させる工程;
b)該酵母細胞と候補化合物とを接触させる工程;および
c)該酵母細胞の生存率を評価する工程であって、生存率は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含するプロセスにより同定された、方法。
(52) ハンティングトン病に対する治療剤をスクリーニングする方法であって:
a)酵母細胞と候補化合物を接触させる工程であって、該酵母細胞は、ハンティングトンポリペプチドを含むポリペプチドを発現する、工程;
b)該ポリペプチドの凝集を可能にする条件下で該酵母細胞をインキュベートする工程;
c)該ポリペプチドの凝集を測定する工程;および該凝集レベルと、該候補化合物と接触させていない酵母細胞における凝集レベルとを比較する工程、
を包含する、方法。
(53) パーキンソン病に対する治療剤をスクリーニングする方法であって:
a)酵母細胞と候補化合物を接触させる工程であって、該酵母細胞が、アルファシヌクレインポリペプチドを含むポリペプチドを発現する、工程;
b)該ポリペプチドの凝集を可能にする条件下で該酵母細胞をインキュベートする工程;
c)該ポリペプチドの凝集を測定する工程;および
d)該凝集レベルと、該候補化合物と接触させていない酵母細胞における凝集レベルとを比較する工程であって、該候補化合物と接触させた該酵母細胞における凝集レベルの相対的な減少は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含する、方法。
(54) タンパク質の誤った折り畳みによる疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法であって:
a)酵母細胞と候補化合物とを接触させる工程であって、該酵母細胞が、誤って折り畳まれた疾患タンパク質を含むポリペプチドを発現する、工程;
b)該酵母細胞と毒性誘導薬剤とを接触させる工程;
c)該酵母細胞の生存率を評価する工程であって、ここで生存率は、該候補化合物が候補治療剤であることを示す、工程、
を包含する、方法。
(55) 前記タンパク質の誤った折り畳みによる疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン疾患、家族性アミロイドポリニューロパシー、タウオパシー、またはトリヌクレオチド疾患である、項目54に記載の方法。
(56) 前記タンパク質の誤った折り畳みによる疾患が、トリヌクレオチド疾患である、項目54に記載の方法。
(57) 前記トリヌクレオチド疾患が、ハンティングトン病である、項目56に記載の方法。
(58) 前記誤って折り畳まれた疾患タンパク質が、ハンティングトン、β−アミロイド、PrP、アルファシヌクレイン、シンフィリン、トランスチレチン、タウ、アタキシン1、アタキシン3、アトロフィン、またはアンドロゲン受容体である、項目54に記載の方法。
(59) 前記誤って折り畳まれた疾患タンパク質が、ハンティングトンまたはアルファシヌクレインである、項目58に記載の方法。
(60) 前記毒性誘導薬剤が、炭素源、窒素源、塩、金属、化学療法剤、アルコール、翻訳阻害剤、NSAID、DNAインターカレーター、キレート化剤、リポソーム、抗生物質、ビタミン、プロテオソーム阻害剤、抗酸化剤、または還元剤である、項目54に記載の方法。
(61) 前記毒性誘導薬剤が、金属または塩である、項目60に記載の方法。
(62) 以下:
項目1に記載の治療剤についてスクリーニングする工程であって、前記候補化合物が候補治療剤である、工程、および
該候補治療剤を生成する工程、
を包含するプロセスにより生成される、ハンティングトン病に対する治療剤。
(63) 以下:
項目30に記載の治療剤についてスクリーニングする工程であって、前記候補化合物が候補治療剤である、工程、および
該候補治療剤を生成する工程、
を包含するプロセスにより生成される、パーキンソン病に対する治療剤。
(64) ハンティングトン病患者を処置する方法であって:
a)項目1に記載の治療剤についてスクリーニングする工程であって、前記候補化合物が候補治療剤である、工程;および
b)治療的利益を達成するのに有効な量の該治療剤を該患者に投与する工程、
を包含する、方法。
(65) 前記スクリーニング方法が、前記酵母細胞と毒性誘導薬剤とを接触させる工程をさらに包含する、項目64に記載の方法。
(66) ハンティングトン病患者を処置する方法であって:
a)項目29に記載の治療剤についてスクリーニングする工程であって、前記候補化合物が候補治療剤である、工程;および
b)治療的利益を達成するのに有効な量の該治療剤を該患者に投与する工程、
を包含する、方法。
(67) パーキンソン病患者を処置する方法であって:
a)項目30に記載の治療剤についてスクリーニングする工程であって、前記候補化合物が候補治療剤である、工程;および
b)治療的利益を達成するのに有効な量の該治療剤を該患者に投与する工程、
を包含する、方法。
(68) ハンティングトン病患者を処置する方法であって:
b)治療的利益を達成するのに有効な量の項目62に記載の治療剤を該患者に投与する工程、
を包含する、方法。
組織における不溶性の原線維タンパク質の沈着は、タンパク質の誤った折り畳みに関連する疾患に特徴的である。これらの最もよくあるものは、神経変性疾患および同様に2型糖尿病のような疾患である(タンパク質の誤った折り畳みに関連する疾患のリストについては表1を参照のこと)。現在までに、これらのタンパク質沈着を溶解し得る治療または処置は知られていない。従って、タンパク質凝集および原線維形成を予防し得る薬剤が活発に探索されている。しかし、可能性のある候補物質を同定する方法は、当該分野に存在しない。
酵母細胞は、タンパク質の誤った折り畳みに関連する疾患の分子的基礎を研究するために強力な系を提供する。この生物は操作が容易であるので、酵母において遺伝的スクリーニングおよび化学的スクリーニングを容易に行ない得ることが周知である。酵母細胞をうまく使用して、いくつかの他の疾患関連ヒトタンパク質、例えば酵母において対応するホモログを有するCFTRおよびフラタキシンが研究された。フラタキシンは、神経変性疾患に関与するタンパク質である。従って、酵母は、対応するヒトホモログの存在に起因して、ヒト疾患に関与するタンパク質および遺伝子を研究する理想的な系を提供する。従って、タンパク質の誤った折り畳みの疾患の主要なクラスを構成するアミロイドおよびアミロイド様の増殖および特異性に関連する疾患を、酵母細胞で研究し得る。さらに、酵母細胞は、広範囲に研究された現象である、プリオン様メカニズムによって増殖する非メンデル遺伝因子[PSI+]を有する。
いくつかの進化的に保存されたタンパク質ファミリーを構成する熱ショックタンパク質(HSP)が、温度の急激な上昇、または重金属、酸化ストレス、毒素およびアミノ酸アナログを含む、様々な他の代謝傷害に対する曝露に対する生理学的応答および生化学的応答において誘導される。この応答は全ての原核生物細胞および真核生物細胞において起こり、そして正常タンパク質合成の抑制およびHSPをコードする遺伝子の転写開始によって特徴付けられる。HSPは、分子シャペロンの1つのクラスであり、そして正常な条件下では、構成的に発現したHSPが適切なタンパク質折り畳みおよび成熟を促進し、膜を越えるタンパク質の移動を促進し、そしてホルモン受容体およびタンパク質キナーゼ活性を調節する。HSPは、細胞タンパク質と結合し、そしてそのコンフォメーションを調節することによってこれを達成する。
本発明の他の実施形態において、酵母細胞を他の毒性誘導薬剤に供した場合に、いくつかの原線維形成/凝集形成タンパク質が、毒性効果を有することが示された。毒性誘導薬剤は、炭素源、窒素源、塩、金属、化学療法剤、アルコール、翻訳阻害剤、NSAID、DNAインターカレーター、キレート化剤、リポソーム、抗生物質、ビタミン、プロテアソーム阻害剤、抗酸化剤、または還元剤であり得る(表3に列挙したいくつかの非限定的な例を参照のこと)。従って、例えば上記で列挙した薬剤の1つに曝露することによる、増殖条件の変化は、酵母細胞において毒性を引き起こす。その毒性は、酸化ストレスまたは酵母細胞における他のストレス応答経路を変化させる条件に起因するものであり得る。酸化ストレスは、本明細書中で、細胞の酸化/呼吸メカニズムに影響を与えるあらゆるプロセスとして定義される。これは、フリーラジカルまたは呼吸酵素毒の産生の結果であり得る。
本発明の1つの実施態様は、誤って折り畳まれた疾患タンパク質のような、タンパク質凝集および/または原線維形成に関与するタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を、酵母細胞へ輸送して、その酵母細胞にそのタンパク質を発現させることである。例えば、アルファシヌクレイン(synuclein)、ハンティングトン、トランスサイレチン、β2−ミクログロブリン、またはβ−アミロイド、αミロイド、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド等のような任意のアミロイドタンパク質(他の制限しない例に関して表1を参照のこと)を発現し得る。1つの実施態様において、核酸は全長の、実質的に全長の、または機能的に等価な形式のそのようなタンパク質またはポリペプチドをコードする。さらなる実施態様において、短縮ポリペプチドまたは内部欠失を有するポリペプチドが、酵母細胞に提供される。他の実施態様において、ポリペプチドはヒトまたは他の哺乳動物ホモログである。
nからn+y
ここでnは1から配列の最後の番号までの整数、そしてyは核酸フラグメントの長さ−(マイナス)1であり、ここでn+yは配列の最後の番号を超えない。従って、10マーについては、核酸フラグメントは、塩基1〜10、2〜11、3〜12…等に対応する。15マーについては、核酸フラグメントは塩基1〜15、2〜16、3〜17…等に対応する。20マーについては、核酸フラグメントは塩基1〜20、2〜21、3〜22…等に対応する。ある実施態様において、核酸フラグメントはプローブまたはプライマーであり得る。
誤って折り畳まれた疾患タンパク質;または熱ショックタンパク質;または任意の他の分子シャペロン;またはさらに、タンパク質の誤った折り畳みの疾患に対する治療的価値を有する候補物質のような、本発明のアッセイシステムの成分をコードする遺伝子を、プラスミド、直線状核酸分子、人工染色体、およびエピソームベクターを含むがこれに限らない核酸ベクターを用いて酵母細胞にトランスフェクトし得る。当然酵母プラスミドが好ましく、そして酵母における組換えプラスミドの発現および複製に使用される3つのシステムは以下のものを含む:
1.組込みプラスミド:そのようなプラスミドの例はYIpであり、それはハプロイドゲノムあたり1コピーが維持され、そしてメンデルの様式で遺伝する。目的のある遺伝子、細菌の複製起点、および選択可能な遺伝子(典型的には抗生物質耐性マーカー)を含むそのようなプラスミドを、細菌で産生する。精製したベクターを選択可能な遺伝子内で直線状にし、そしてコンピテントな酵母細胞を形質転換するのに使用する。使用するプラスミドの型にかかわらず、酵母細胞を典型的には化学的方法によって形質転換する(例えば、Roseら、1990、Methods in Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.によって記載されているように)。細胞を典型的には酢酸リチウムで処理して、DNA 1μgあたり約104コロニー形成ユニット(形質転換細胞)の形質転換効率を達成する。酵母は、相同的組換えを起こし、その結果、切断、選択マーカーが変異(通常、点突然変異または小さな欠失)宿主遺伝子と組換えして機能を回復する。次いで形質転換した細胞を選択培地で単離する。
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される、核酸配列の領域である制御配列である。それは、核酸配列の特異的な転写を開始するために、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝エレメントを含み得る。「作動可能に位置する」「作動可能に連結する」「制御下」および「転写制御下」という語句は、その配列の転写開始および/または発現を制御するために、その核酸配列と関連して、プロモーターが正しい機能的位置および/または方向であることを意味する。
本発明において酵母細胞を形質転換するのに使用するベクターは、マルチクローニング部位(MCS)を含み得、それは複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、それらのいずれもベクターを消化する標準的組換え技術と組み合せて使用し得る(例えば、本明細書中で参考として援用される、Carbonelliら、1999、Levensonら、1998、およびCocea、1997を参照のこと)。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の部位でのみ機能する酵素による、核酸分子の触媒的切断を指す。これら制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。多くの場合、外来性配列のベクターへのライゲーションを可能にするために、MCS内で切断する制限酵素を用いてベクターを直線化またはフラグメント化する。「ライゲーション」は、お互いに連続的であってもよいし、そうでなくてもよい2つの核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程を差す。制限酵素およびライゲーション反応を含む技術は、組換え技術の当業者に周知である。
ほとんどの転写された真核生物細胞RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するRNAスプライシングを受ける。ゲノム真核生物細胞配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを保証するために、ドナースプライシング部位および/またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る(例えば、本明細書中で参考として援用される、Chandlerら、1997を参照のこと)。
本発明のベクターまたは構築物は一般的に、少なくとも1つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写の特異的終止に関与するDNAから構成される。従って、特定の実施形態において、RNA転写物の産生を終了する終止シグナルが企図される。インビボにおいて望ましいメッセージレベルを達成するために、ターミネーターが必要であり得る。
真核生物細胞遺伝子発現において、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を実行するために、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に決定的ではないと考えられ、そしてあらゆるそのような配列を採用し得る。いくつかの例は、簡便であり、そして様々な標的細胞においてよく機能することが知られている、SV40ポリアデニル化シグナル、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増加させ得る、または細胞質輸送を促進し得る。
宿主細胞において本発明のベクターを増殖させるために、複製が開始される特異的核酸配列である、1以上の複製起点(多くの場合「ori」と呼ばれる)を含み得る。あるいは、宿主細胞が酵母であるなら、自律複製配列(ARS)を採用し得る。
本発明の特定の実施形態において、本発明の構築物で形質導入した酵母細胞を、発現ベクター中にマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで同定し得る。そのようなマーカーは、形質導入細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであるが、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を防止するものである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
当然、本発明はまた、タンパク質凝集および/もしくは原線維形成に関与するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列、または熱ショックタンパク質をコードする配列、例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5、および配列番号7で記載されたものに相補的な、または実質的に相補的なDNAセグメントを含む。「相補的な」核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性ルールによって、塩基対を形成し得るものである。本明細書中で使用される「相補配列」という用語は、上記で述べた同じヌクレオチド比較によって評価し得るように、または本明細書中で記載したような比較的ストリンジェントな条件下で、タンパク質凝集および/もしくは原線維形成に関与するタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸セグメントまたは熱ショックタンパク質をコードする核酸セグメントにハイブリダイズし得ることで定義されるように、実質的に相補的で特定の核酸配列を意味する。そのような配列は、タンパク質凝集および/もしくは原線維形成に関与するタンパク質または熱ショックタンパク質全体をコードし得るか、またはそのフラグメントであり得る。
本発明は、誤って折り畳まれた疾患タンパク質または熱ショックタンパク質をコードする、ポリペプチドまたはタンパク質の使用を企図する。いくつかの実施形態において、全長または実質的に全長の誤って折り畳まれた疾患タンパク質/ポリペプチドまたは熱ショックタンパク質を使用し得る。「全長」という用語は、誤って折り畳まれた疾患タンパク質cDNAまたは熱ショックタンパク質cDNAによってコードされる少なくとも全てのアミノ酸を含む、誤って折り畳まれた疾患ポリペプチドまたは熱ショックタンパク質を指す。誤って折り畳まれた疾患タンパク質の文脈で「実質的に全長」という用語は、全長誤って折り畳まれた疾患タンパク質/ポリペプチドの連続的なアミノ酸のうちの少なくとも80%を含む誤って折り畳まれた疾患タンパク質/ポリペプチドを指す。しかし、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、または配列番号9の少なくとも約85%、90%、および95%を含む、誤って折り畳まれた疾患タンパク質/ポリペプチドまたは熱ショックタンパク質が、「実質的に全長の」誤って折り畳まれた疾患タンパク質/ポリペプチドとして本発明の範囲内であることもまた企図される。
原線維形成および/またはタンパク質凝集に関与するあらゆるタンパク質;または熱ショックタンパク質;または分子シャペロンタンパク質の配列を、アミノ酸の置換(substitution)、置換(replacement)、挿入、欠失、短縮および他の変異によって改変して、原線維阻害特性および/または分解特性を得ることもできる。これらの改変は、機能的に等価なポリペプチドを産生し得る。以下は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸を変化させて、等価または改善さえした、第2世代分子を作製することに基づく議論である。例えば、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位のような、構造との相互作用結合能力の測定できる損失なしに、タンパク質構造においてあるアミノ酸を他のアミノ酸と置換し得る。タンパク質の生物学的機能的活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能力および性質であるので、タンパク質配列において、およびその基礎となるDNAコード配列において、あるアミノ酸置換を行ない、そしてそれにも関わらず同様の性質を有するタンパク質を産生し得る(表4を参照のこと)。従って、ポリペプチドの通常の活性に変化なく、原線維形成および/またはタンパク質凝集に関与するタンパク質;または熱ショックタンパク質;または分子シャペロンタンパク質のポリペプチド配列において、様々な変化を起こし得ることが、本発明者らによって企図される。
融合タンパク質またはキメラタンパク質は、挿入改変体である、特殊化した種類のタンパク質改変体である。この分子は一般的に、2番目のポリペプチドの全てまたは一部分に、タンパク質のN末端もしくはC末端または他の部分でも連結した、天然分子の全てまたはかなりの部分を有する。本発明において、原線維形成および/またはタンパク質凝集に関与するタンパク質;または熱ショックタンパク質;または分子シャペロンタンパク質の領域/部分を含み、蛍光測定法、スクリーニングアッセイ、または機能的アッセイのいずれかを用いて同定し得る、融合タンパク質を産生した。例えば、グリーン蛍光タンパク質(GFP)に連結した、アルファシヌクレインタンパク質、ハンティングトンタンパク質などの領域を含む、融合物を記載する。いくつかのGFPキメラはN末端キメラである。GFP領域を目的のタンパク質の他の部分に連結し得る、ほとんどあらゆる型の融合タンパク質を調製し得る。他の有用なキメラは、酵素の活性部位、または抗体によって認識/キメラタンパク質を調製し得る。他の有用なキメラは、機能的ドメイン(例えば、酵素の活性部位、または抗体によって認識され得るエピトープ)の連結を含む。これらの融合タンパク質は、本明細書中で酵母細胞によって例示される、組換え宿主細胞の迅速および容易な検出および同定方法を提供する。
本発明は、誤って折り畳まれたタンパク質疾患および/またはタンパク質原線維発生および/または組織におけるタンパク質沈着の蓄積を防止する、候補物質のスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施形態において、これらの薬剤はタンパク質の誤った折り畳みを防止する。正確な作用メカニズムに関係なく、本発明のスクリーニング方法によって同定された薬剤は、タンパク質の誤った折り畳みまたは異常なタンパク質沈着が関与する疾患に対する、治療的利益を提供する。これらの疾患のいくつかが、表1に列挙され、そしてそれらとしては、制限しない例として、神経変性疾患(例えば、ハンティングトン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病など)および他の非神経疾患(例えば2型糖尿病)が挙げられる。
本明細書中で使用される「候補物質」は、組織におけるタンパク質様沈着物の蓄積/凝集を低減、改善、予防、または逆転する可能性のある、あらゆる物質である。様々な型の候補物質を、本発明の方法によってスクリーニングし得る。酵母細胞を、遺伝子をコードする核酸構築物と接触させることによって、遺伝的薬剤をスクリーニングし得る。例えば、様々な遺伝子を発現するcDNAライブラリーをスクリーニングして、本明細書中で記載された疾患の治療的遺伝子を同定し得る。他の例において、酵母細胞を、治療的効果を与え得る他のタンパク質またはポリペプチドと接触させ得る。
1つの実施形態において、本発明は蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用いたスクリーニングアッセイを企図する。1つの例において、アルファシヌクレインをシアン蛍光タンパク質(CFP)および黄色蛍光タンパク質(YFP)に融合し、そしてGal1−10プロモーターの調節下で酵母ゲノムに組み込む。細胞をガラクトース中で増殖させて発現を誘導する。誘導時に、細胞は融合タンパク質を産生し、それは凝集してCFPおよびYFPを互いに近づける。凝集物中のタンパク質はきつく固まっているので、CFPおよびYFP間の距離は、エネルギー転移(FRET)が起こるのに必要な100。Aの臨界値より低い。この場合、CFPの発光によって放出されたエネルギーがYFPを励起し、それが今度はその特徴的な波長で発光する。本発明者は、タンパク質を、凝集を起こさない状態に維持することによって、CFPおよびYFPの相互作用を妨害し得る薬物、遺伝子、または他の因子を含む候補化合物を同定するために、FRETに基づくスクリーニングを利用することを企図する。
別の実施形態において、本発明はRNAアプタマーを使用するスクリーニングアッセイを企図する。RNAは、その1次配列に依存して非常に多くの2次構造をとり得る核酸である。従って、特定の長さのRNA分子を、他の分子に非常に特異的な様式で、かつ非常に高い親和性で結合する性質を持つように、操作することが可能である。これは、抗原−抗体結合の現象に類似する。
本発明のスクリーニングによって同定された試験化合物を用いた、動物モデルの最初の試験および処置も企図される。タンパク質の誤った折り畳みの疾患の適切な動物モデルを選択し、そして処置は、動物への適切な薬剤学的処方における化合物の投与を含む。投与は、経口、鼻腔内、バッカル、または局所さえ含むがこれに限らない、臨床目的または非臨床目的のために利用し得る任意の経路による。あるいは、投与は気管内滴注、気管支滴注、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射によるものであり得る。特に企図される経路は、全身性静脈内注射、血液またはリンパ液供給を介するか、または影響される部位に対して直接的な局所投与である。インビボで化合物の有効性を決定することは、様々な異なる基準を含み得る。また、毒性および用量反応性の測定を、動物において、インビトロアッセイまたはインサイト(in cyto)アッセイよりもより意味のある様式で行ない得る。
適切な抗誤った折り畳み疾患タンパク質抗体を用いた免疫学的方法によって、操作された酵母細胞における誤って折り畳まれた疾患タンパク質の発現を検出し得ることも企図される。酵母細胞に存在する遺伝的変異の特定の型を検出するために、抗熱ショックタンパク質抗体または他の抗シャペロン抗体も使用し得る。検出し得るタンパク質および/またはポリペプチドは変異したバージョンを含む。
以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態を示すために挙げる。以下の実施例で開示される技術は、発明者によって、本発明の実施においてよく機能することが発見された技術を表し、そして従って、その実施のために好ましいモードを構成すると考えられ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示された特定の実施形態において多くの変化がなされ得、そして依然として本発明の意図および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることを認識する。
(酵母におけるHt発現の材料および方法)
(プラスミドの構築)
GFPとHtのN−末端領域との間の融合物をコードするプラスミドは、Hereditary Disease Foundationから寄贈された。HtQ25またはHtQ103の酵母発現プラスミドを産生するために、DNAをXhoIおよびXbaIで消化し、そして得られたXhoI/XbaIフラグメントを、ベクターpYES(Invitrogen)にライゲーションし、それぞれプラスミドpYES/PQ25またはpYES/PQ103を得た。これらのDNAをSalIで消化し、そして末端をクレノウ酵素で埋めた。その後DNAをEcoRIで消化し、そして得られたフラグメントを、構成的発現のために高コピー(2μ)発現ベクターp426に、またはガラクトース誘導のためにp426GALにそれぞれサブクローニングした(Mumbergら、1994;Mumbergら、1995)。
本研究において、本発明者らは5つの同系シリーズの酵母株を使用した、バックグラウンドは以下のようであった:W303(MATa can1−100 ade2−1 his3−11、15 trp1−1 ura3−1 leu2−3、112)、YPH499(MATa ade2−101ochre his3−△200 leu2−△1 lys2−801amber trp−△63 ura3−52)、MHY810(MATa his3−△200 leu2−△1 lys1−1 met14 ura3−△1::TRP1 trp1−△1)、MHY501(MATa his3−△200 leu2−3、112 ura3−52 lys2−801 trp1−1)およびMHY803(MHY501誘導体:MATa his3−△200 leu2−3、112 ura3−52 lys2−801 trp1−1(doa3::HIS3+)(Ycplac22−Doa3−His6))。MHY株は、Mark Hochstrasserから寄贈された。使用した酵母株を表6に列挙する。
− 蛍光の焦点がない
−/+ 少数の細胞が1つの小さな焦点を有する
+ 1つまたはそれ以上の焦点、かなりのバックグラウンド蛍光を伴う
++ 1つまたは2つの濃い蛍光焦点、低いバックグラウンド蛍光を伴う
標準的なリチウム/PEG方法を用いて、酵母の形質転換を行なった(Itoら、1983)。
酵母細胞を、室温、1500×gで5分間遠心することによって回収し、そして10mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で1回洗浄した。細胞をスフェロプラスト緩衝液(1Mのソルビトール、0.1MのEDTA、0.5mg/mlのザイモリアーゼ100T(Seikagaku Corporation)、50mMのジチオトレイトール、pH7.5)に再懸濁し、そして30℃で2時間インキュベートした。その後、スフェロプラストを4℃、325×gで5分間のおだやかな遠心によって回収し、そしてプロテアーゼ阻害剤カクテル(完全Mini−tablets、Boehringer Mannheim)を含む1×TNE中で溶解した。1×TNE+2%のサルコシル中で、氷上で5分間インキュベートした後、サンプルを5%(w/v)のスクロースクッション(sucrose cushion)(1Mのスクロース、100mMのNaCl、0.5%のスルホベタイン(sulfobetaine))にロードし、そして4℃、315,000×gで1時間遠心を行なった。その後、上清およびペレット画分を8%のSDS−PAGE(Novex)に供し、そしてポリビニリデンジフルオリド膜(Millipore Corporation)に転写した。膜アウリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中5%の脱脂粉乳で1時間ブロックした。一次抗体とのインキュベーションを、4℃で一晩行なった。プロテインA−ペルオキシダーゼ(1:5000、Boehringer Mannheim)と共にインキュベートした後、膜をECL試薬(Amersham)で処理することによって、免疫複合体を視覚化した。抗体αGFPを1:100で使用した(Clontech)。
酵母細胞を、ポリリシン処理スライドに10分間接着させた。核染色のために、細胞を1%のホルムアルデヒドで5分間固定し、そしてPBSで3回洗浄した。4’,6−ジアミジン−2−フェニルインドール−ジヒドロクロリド(DAPI、Sigma)で5分間処理した後、細胞をPBSで3回洗浄した。Axioplan2顕微鏡(Zeiss)で顕微鏡検査を行い、そして顕微鏡写真を100×の倍率で撮った。
(酵母における変異体Htの融合)
酵母においてHtを調査するために、25残基の反復長の野生型ポリQ(ポリグルタミン)を有する、または47、72、または103残基の反復長の変異体を有するN−末端領域(野生型タンパク質のアミノ酸1−68)を、GFPに融合した。それぞれ、単一コピープラスミドにおいて強力な構成的酵母プロモーターであるGPDの調節下においた(図1)。Htにおいて天然に存在するグルタミンコドンであるCAGのホモポリマー領域は、遺伝的に不安定であり、そして酵母において特にそうである(Mooreら、1999;Schweitzerら、1997)。この問題は、グルタミンはCAGおよびCAAの両方によってコードされ、そして混合コドン反復はかなりより安定である(Kazantsevら、1999)という事実によって減少した。不安定性の問題を最小限にするために、本明細書中で報告する全ての実験は、混合コドンポリQ反復を用いて行い、そして全ての研究は、各場合に少なくとも2つの独立したコロニーを使用して、新規の形質転換体を用いて行い、そして少なくとも2回繰り返した。
(全ての細胞における新規に誘導された変異体Ht凝集)
異なるQ反復改変体を発現する細胞は、HtQ103を発現する細胞においてわずかに劣るのみで、同じプラスミド損失の頻度(細胞を非選択培地および選択培地にプレートすることによって決定する)を示し、そして同様の速度で増殖した。最終的な密度は、典型的にはHtQ25、HtQ47またはHtQ72を発現する細胞で0.7−0.8、そしてHtQ103を発現する細胞で0.5−0.7であった。従って、長いポリQHtフラグメントは、酵母において過度に毒性ではなかった。しかし、タンパク質は構成的プロモーターから発現しているので、ポリQタンパク質の存在下で増殖する細胞成分のサブセットが形質転換の間に選択された可能性があった。もしそうなら、選択もまた、タンパク質の凝集状態に影響を与えたかもしれない。延長したグルタミンの融合が、タンパク質の遺伝性性質を反映したのか、または選択過程の結果であったのか決定するために、Ht−GFP構築物をガラクトース−誘導性プロモーターの調節下に移動した(表5)。形質転換体をグルコースプレートで選択し、構築物をきつく抑制したまま保った。誘導を開始するために、細胞をまずラフィノース培地で一晩増殖させ、グルコース抑制を除去し、次いで、ガラクトース培地に移してHt発現を誘導した。
(変異体Htは、酵母において細胞質凝集体を形成する)
青色の蛍光を発するDNA結合色素であるDAPIによる細胞の同時染色は、Ht結合の焦点は核ではなく細胞質区画にあることを示した。これらの焦点がHt−GFP融合物の膜結合区画への隔離または高次のタンパク質複合体の形成を反映するか否かを決定するために、細胞壁を除去し、そして細胞を界面活性剤サルコシル(2%)の存在下で溶解した。沈降の後、上清およびペレット画分を、5%のSDSを含むサンプル緩衝液中で10分間沸騰させ、そしてイムノブロッティングによって分析した。
(凝集はプロテアソーム欠損細胞において変化しない)
Ht(Saudouら、1998)、ならびにSBMA(Stenoienら、1999)、SCA3(Chaiら、1999)、およびSCA1(Cummingsら、1998)のような疾患に関連する他のグルタミン反復タンパク質は、哺乳類細胞においてユビキチン化され、そしてプロテアソームの成分と結合するので、ユビキチン/プロテアソーム経路が凝集の形成の関与し得ることが示唆された。ユビキチン化Htタンパク質は、酵母細胞において検出されなかった。しかし、この経路によって変換されることが知られているタンパク質でさえ、ユビキチン結合体は検出が困難であり得る。この問題をより厳密に調査するために、遺伝的アプローチに着手した。それぞれユビキチン/プロテアソーム分解経路の異なる成分:1)uba1、ユビキチン活性化酵素(M.Hochstrasser)、2)doa3、20Sプロテアソームの触媒サブユニット(Chenら、1995)、および3)sen3、19Sプロテアソーム調節複合体のサブユニット(DeMariniら、1995)に損傷を含む3つの系統を採用した。これらの遺伝子はそれぞれ必須であるので、この経路をひどく損なう部分的機能損失変異体を使用した。それぞれの系統において、Ht変異体は野生型細胞と同じ様式の挙動を示した。結合焦点を含む細胞の数、またはそれら焦点の大きさもしくは細胞内分布に変化はなかった(表6)。
(分子シャペロンはHtの凝集に影響を与える)
シャペロンタンパク質は、異なる型の折り畳み中間体および経路外折り畳み産物と相互作用することによって、他のタンパク質の折り畳みを調節する、高度に保存された、しかし多様なグループのタンパク質である(Gething、1997)。それらは、異常なタンパク質の凝集に大きく影響する。シャペロンタンパク質レベルの変化がどのようにHtポリQ変異体の結合に影響を与えるか決定するために、様々なシャペロンタンパク質の欠失変異または過剰発現プラスミドを含む、同系シリーズの系統を作製し、それは野生型またはポリQ延長Htフラグメントを産生した。いくつかのシャペロン欠失は、それらが致死的であるために試験できなかったことに注意する。
(Hsp40は、Ht変異体の凝集を変化させる)
Sis1(クラスII酵母Hsp40タンパク質)は、ハンティングトンの凝集状態に影響を与えたこと、およびHsp40タンパク質、特にHDJ−1は、いくつかのモデル系におけるポリQ誘導毒性において重要な役割を果たしているようであることが、Sis1のより詳細な分析へ導いた。Sis1タンパク質の異なる領域を発現するように遺伝子操作した酵母系統を、上記の実施例で記載したハンティングトンGFP融合構築物で形質転換した。HtQ72およびHtQ103の凝集パターンは、変異Sis1タンパク質の産生によって著しく変化した。少数の大きな凝集の代わりに、多数のより小さい凝集が存在した。最も著しくは、1つのSis1構築物において、この凝集における変化は、生存能力の減少を伴った。このSis1−誘導毒性は、Hsp104の同時発現によって減少され得る。Hsp104はまた、ハンティングトン毒性の哺乳類細胞モデル、および単純なポリQ−GFP−融合を採用するC.elegansモデルにおける凝集の形成および細胞死の両方を減少させる。これらの印象的な観察は、酵母においてSis1の変化によって誘導されるハンティングトンの毒性は、そのヒトにおける毒性と直接関連すると考え得られることを示唆する。
(酵母においてハンティングトン毒性に影響を与える化合物)
短縮Sis1タンパク質およびHtQ103(毒性)を発現する系統を用いて、下記の実施例9および10で記載されるスポッティングアッセイを用いてスクリーニングを行なった。他の候補薬剤を用いたさらなるスクリーニングも企図される。これらのスクリーニングは、生きた細胞においてハンティングトンの凝集に影響を与えるが、それ自身は無毒性である薬剤の同定を可能にする。
(誤った折り畳みによる疾患タンパク質を発現する酵母における毒性についての材料および方法)
(プラスミド構築)
野生型(WT)、A53T、およびA30P アルファシヌクレインcDNAは、Dr.Peter Lansburyから親切にも寄贈していただいた。WT、A53T、およびA30P配列を、標準的な分子生物学手順によって、p426GPD、p416GPD、p423GPD、およびp425GPDにサブクローニングした(Mumbergら、1995)。GFP、CFPまたはYFPとアルファシヌクレインのインフレーム融合物である、GFP、CFP、およびYFP融合物を、同じベクターにおいてアルファシヌクレインとインフレームでXFP(XはG、C、またはYを意味する)コード配列を挿入することによって構築した。XFP融合物も、GAL1−10プロモーターの調節下で、そしてCyc1ターミネーター領域と共に、pRS306およびpRS304にサブクローニングした。
標準的な手順に従って、酵母系統を増殖および操作した(GuthrieおよびFink、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Academic Pressを参照のこと)。
酵母細胞を、対数または対数後期に達するまで選択培地中で、30℃または室温で一晩慣用的に増殖させた。細胞を、血球計を用いて計測し、そして1×106細胞/mlに希釈した。5連続希釈(5倍)を作成し、そして細胞をスクリーニングするために化学物質/薬剤を含む培地にスポットした。
(アルファシヌクレインは、酵母細胞質において蛍光焦点を形成する)
GFP融合物を用いて、細胞質全体に分散する蛍光焦点の形成が検出された。これらは、WTおよびA53T変異体で、A30Pよりも顕著に含まれた。この種類のアッセイを用いて、A30Pによるこれらの形成は排除され得ないが、この場合は、GFP蛍光パターンが異なって見えることから、異なる種類の凝集が予期される。
(アルファシヌクレインの毒性を増加させる条件)
スポッティング実験を用いて、異なるカテゴリーの化学物質が、アルファシヌクレイン過剰発現の毒性を悪化させ得る、またはハンティングトン発現の毒性を誘導し得る薬剤として同定された。表3の試験した化合物のうち、以下のものがWT アルファシヌクレインを過剰発現する酵母細胞の増殖に負の影響を有した:炭素源(アラビノース2%);窒素源(尿素1mg/ml);塩および金属(CaCl2 0.5M、CoCl2 750μM、CsCl 0.1M、CuSo4 2.5mM、CuSo4 5mM、Fe2(SO4)3 8.5mM、FeSO4 20mM、FeCl2 10mM、FeCl2 15mM、FeCl2 23mM、FeCl2 50mM、MgCl2 0.5M、MgSO4 0.5M、RbCl 0.2M、SrCl2 0.5M);ならびに一般的な阻害剤(6−アザウラシル30μg/ml、アウリントリカルボン酸100μM、ブレオマイシン 1μg/ml、ブレフェルジンA100μg/ml、カンプトテシン5μg/ml、クロラムブシル3mM、臭化エチジウム50μg/ml、ホルムアミド2%、GuHCl20、ヒドロキシ尿素5mg/ml、メナジオン20−50μM、パラコート1mM(メチルビオゲン(methyl viogen))、バナジン酸塩1mM、バナジン酸塩0.1mM、バナジン酸塩2mM、バナジン酸塩4mM、バナジン酸塩7mM+KCl)。
(FRETおよびFACSによるスクリーニング)
CFPおよびYFPに融合したアルファシヌクレインを、Gal1−10プロモーターの調節下で酵母ゲノムに組み込んだ(図4)。細胞をガラクトース中で増殖させて発現を誘導する。誘導により、細胞は融合タンパク質を産生し、それは凝集してCFPおよびYFPを近くに持ってくる。凝集物中のタンパク質はきつく固まっているので、CFPとYFPとの間の距離は、エネルギー転移(FRET)が起こるのに必要な100Åの臨界値より近い。この場合、CFPの発光によって放出されたエネルギーがYFPを励起し、それが今度はその特徴的な波長で発光する。従って、この現象を使用して、凝集が起こることを可能にしない状態にタンパク質を維持することによってこの相互作用を妨害し得る薬剤、遺伝子または他の因子を同定し得る。これらの因子を、FACS分析によって細胞を分取することによって分析する。これは、凝集経路における毒性中間体の調査を可能にし、そして従って凝集物または他の中間体が細胞死を引き起こすか否かに取り組むことを可能にする。
(RNAアプタマースクリーニング)
RNAアプタマーをスクリーニングして、アミロイド線維またはこの経路における他の中間体種を認識および結合する能力によって、神経変性疾患の治療薬として潜在的な適用を有するものを同定する。従って酵母系は、アルファシヌクレイン過剰発現の毒性を減少させる分子を直接探すことによって、およびタンパク質の凝集を引き起こす種間の相互作用を妨害する分子を探すことによって、このスクリーニングを行なうのに非常に敏感である。これはヒト疾患に関与するこのタンパク質および他のタンパク質の原線維発生/凝集に必要なエピトープに対する洞察を与え得るので、毒性を悪化させるまたは凝集を促進するいくつかの分子が見出されることもまた興味深い。
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---|---|---|---|---|
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ATE382704T1 (de) * | 2001-02-15 | 2008-01-15 | Univ Chicago | Verfahren zum nachweis in hefe für mittels die proteinfaltung beeinflussen |
AU2003304173A1 (en) | 2002-05-04 | 2005-01-04 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth |
NZ538145A (en) * | 2002-08-07 | 2008-05-30 | Univ Delaware | Compositions and methods for the treatment of diseases exhibiting protein misassembly and aggregation |
FR2846008B1 (fr) * | 2002-10-18 | 2006-06-02 | Centre Nat Rech Scient | Criblage de molecules a activite anti-prion:kits, methodes et molecules criblees |
FR2846009B1 (fr) * | 2002-10-18 | 2007-10-12 | Centre Nat Rech Scient | Criblage de molecules a activite anti-prion:kits, methodes et molecules criblees |
CA2522497A1 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Yeast ectopically expressing abnormally processed proteins and uses therefor |
WO2004110360A2 (en) * | 2003-05-16 | 2004-12-23 | Acorda Therapeutics, Inc. | Proteoglycan degrading mutants for treatment of cns |
US7959914B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of reducing extravasation of inflammatory cells |
WO2005005640A1 (en) * | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Remynd Nv | A yeast model for amyloidogenic protein toxicity |
US7452670B2 (en) | 2003-12-04 | 2008-11-18 | University Of Washington | Methods of identifying agents that diminish cellular toxicity associated with an α-synuclein polypeptide of Parkinson's disease in yeast |
WO2005108599A2 (en) * | 2004-05-05 | 2005-11-17 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Compositions and methods for treatment of protein misfolding diseases |
JP4926962B2 (ja) | 2004-05-18 | 2012-05-09 | アコーダ セラピューティクス、インク. | コンドロイチン分解酵素とその安定な製剤の精製法 |
CA2568644C (en) * | 2004-06-03 | 2015-11-24 | Phylogica Limited | Peptide modulators of cellular phenotype and bi-nucleic acid fragment library |
NZ588431A (en) | 2004-09-17 | 2012-02-24 | Whitehead Biomedical Inst | Using Benzimidazole or Indole compounds with a 1,2-diazole group to Inhibit Alpha-Synuclein Toxicity |
US7618793B2 (en) * | 2004-10-20 | 2009-11-17 | The Regents Of The University Of Washington | Identifying agents for decreasing cellular toxicity associated with huntingin polypeptide |
US7504227B2 (en) * | 2004-10-20 | 2009-03-17 | University Of Washington | Drug targets for the treatment of neurodegenerative disorders |
CA2589700A1 (en) | 2004-12-01 | 2006-07-13 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modulators of alpha-synuclein toxicity |
WO2006124892A2 (en) | 2005-05-13 | 2006-11-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modulators of alpha-synuclein toxicity |
WO2007046882A2 (en) * | 2005-06-06 | 2007-04-26 | University Of Maryland, Baltimore County | Devices and methods for profiling enzyme substrates |
ES2393748T3 (es) | 2005-09-26 | 2012-12-27 | Acorda Therapeutics, Inc. | Composiciones y métodos de uso de condroitinasa ABCI mutantes |
US20100273776A1 (en) * | 2006-03-29 | 2010-10-28 | FOLDRx PHARMACEUTICALS, INC | Inhibition of alpha-synuclein toxicity |
GB0610792D0 (en) * | 2006-06-02 | 2006-07-12 | Remynd Nv | Methods and tools for the screening of factors affecting protein misfolding |
WO2008045970A2 (en) | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants |
US8975063B2 (en) | 2006-10-19 | 2015-03-10 | California Institute Of Technology | Compositions and methods for producing benzylisoquinoline alkaloids |
US8323952B2 (en) * | 2007-12-13 | 2012-12-04 | Archer Daniels Midland Company | Alcoholic xylose fermentation at high temperatures by the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha |
US8501465B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-08-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modulators of alpha-synuclein toxicity |
EP2262895B1 (en) | 2008-02-15 | 2013-08-14 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Yeast cells expressing tar dna-binding protein 43 and uses therefor |
ES2418459B1 (es) * | 2008-10-09 | 2014-08-12 | Universitat Autònoma De Barcelona | Relacionando agregación proteica con supervivencia de levadura |
WO2010111587A1 (en) * | 2009-03-26 | 2010-09-30 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modulators of tdp-43 mediated toxicity |
EP2524040B1 (en) * | 2010-01-12 | 2017-03-15 | The Whitehead Institute for Biomedical Research | Yeast cells expressing amyloid beta and uses therefor |
CN101858910B (zh) * | 2010-03-25 | 2013-03-27 | 辽宁大学 | 一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法 |
EP3238724A3 (en) * | 2012-06-01 | 2018-01-17 | Oxalys Pharmaceuticals | Chemical suppressors of neurotoxicity in synucleinopathic diseases |
US10642376B2 (en) | 2012-11-28 | 2020-05-05 | Intel Corporation | Multi-function stylus with sensor controller |
AU2014228241B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-09-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloids (BIA) producing microbes, and methods of making and using the same |
JP7182852B2 (ja) * | 2013-03-15 | 2022-12-05 | ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 神経変性疾患のための細胞性発見プラットフォーム |
WO2015066642A1 (en) | 2013-11-04 | 2015-05-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
CH709681A1 (de) | 2014-05-21 | 2015-11-30 | Explo Engineering Ag | Pulsdetonationsantrieb. |
JP6655557B2 (ja) | 2014-06-13 | 2020-02-26 | ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ | アミロイドベータ発現構築物およびその使用 |
CA2954738A1 (en) * | 2014-07-29 | 2016-02-04 | Neurimmune Holding Ag | Human-derived anti-huntingtin (htt) antibodies and uses thereof |
EP3842514A1 (en) | 2014-09-12 | 2021-06-30 | Whitehead Institute for Biomedical Research | Cells expressing apolipoprotein e and uses thereof |
US20170253898A1 (en) | 2014-11-17 | 2017-09-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Noscapinoid-producing microbes and methods of making and using the same |
US10752903B2 (en) | 2015-05-04 | 2020-08-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Benzylisoquinoline alkaloid (BIA) precursor producing microbes, and methods of making and using the same |
ES2945359T3 (es) | 2015-05-08 | 2023-06-30 | Univ Leland Stanford Junior | Métodos para producir epimerasas y alcaloides de bencilisoquinolina |
WO2017147536A1 (en) * | 2016-02-24 | 2017-08-31 | The Rockefeller University | Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof |
KR102573778B1 (ko) | 2017-02-17 | 2023-08-31 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 알파-시뉴클레인에 대한 항체 및 그의 용도 |
BR112020002050A2 (pt) | 2017-08-03 | 2020-09-08 | Antheia, Inc. | epimerases engenheiradas alcaloides benzilisoquinolina e métodos de produção de alcaloides benzilisoquinolina |
US10550550B2 (en) * | 2017-09-13 | 2020-02-04 | Dominic P. Ismert | Modular two-part sillcock |
US10649550B2 (en) | 2018-06-26 | 2020-05-12 | Intel Corporation | Predictive detection of user intent for stylus use |
CN117693682A (zh) * | 2021-07-14 | 2024-03-12 | 复旦大学 | 筛选用于治疗或预防mHTT相关的神经退行性疾病的化合物的方法,靶蛋白,以及化合物 |
WO2023137286A1 (en) * | 2022-01-12 | 2023-07-20 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Methods and related aspects of quantifying protein stability and misfolding |
CN114990049B (zh) * | 2022-04-26 | 2024-01-16 | 鼎康(武汉)生物医药有限公司 | 一种同时调节细胞表达产物的糖型和电荷异质性的方法 |
DE202022107272U1 (de) | 2022-12-28 | 2023-01-30 | Centurion University of Technology and Management | Ein System zur Analyse der Infektion mit Pseudomonas Syringae durch gezielte Ansprache von Cochaperonen, die eine J-Domäne enthalten |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991004339A1 (en) * | 1989-09-18 | 1991-04-04 | California Biotechnology Inc. | Assays and reagents for amyloid deposition |
US5547841A (en) * | 1987-10-08 | 1996-08-20 | The Mclean Hospital Corporation | In vitro method for screening for drugs that inhibit production or degradation of human A4-amyloid |
US5652092A (en) * | 1992-05-01 | 1997-07-29 | American Cyanamid Company | Amyloid precursor proteins and method of using same to assess agents which down-regulate formation of β-amyloid peptide |
WO1999029891A1 (en) * | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Arch Development Corporation | Methods for identifying factors controlling amyloid protein aggregation |
WO2001006989A2 (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-01 | Abgenix, Inc. | Methods and compositions for inhibiting polypeptide accumulation associated with neurological disorders |
JP2001501802A (ja) * | 1995-11-09 | 2001-02-13 | ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー | ハンチンチン(huntingtin)結合蛋白質 |
WO2001023412A2 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of screening for agents which inhibit aggregation of polypeptides |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4554101A (en) | 1981-01-09 | 1985-11-19 | New York Blood Center, Inc. | Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4682195A (en) | 1985-09-30 | 1987-07-21 | General Electric Company | Insulated gate device with configured emitter contact pad |
EP0266032A1 (en) | 1986-08-29 | 1988-05-04 | Beecham Group Plc | Modified fibrinolytic enzyme |
GB8921791D0 (en) | 1989-09-27 | 1989-11-08 | Imp Cancer Res Tech | Disease gene |
EP0600951A4 (en) * | 1991-08-01 | 1996-10-30 | Paul H Voorheis | Diagnostic method for alzheimer's disease. |
DE4204650C1 (ja) | 1992-02-15 | 1993-07-08 | Hoffmeister, Helmut, Dr., 4400 Muenster, De | |
KR940021073A (ko) * | 1993-03-02 | 1994-10-17 | 미야베 요시가즈 | 알쯔하이머병의 예방 또는 치료제, 그 스크리닝 방법 및 인간 유래의 타우 단백질 키나아제 i |
CA2116280A1 (en) * | 1993-03-05 | 1994-09-06 | Marcy E. Macdonald | Huntingtin dna, protein and uses thereof |
US5643562A (en) * | 1993-03-29 | 1997-07-01 | Queen's University Of Kingston | Method for treating amyloidosis |
JPH09501302A (ja) * | 1993-04-07 | 1997-02-10 | キャンサー リサーチ キャンペーン テクノロジー リミティド | 治療活性についての物質のスクリーニングのための方法及びそれにおいて利用するための方法 |
GB9316727D0 (en) * | 1993-08-12 | 1993-09-29 | Inst Of Psychiatry | Models of alzheimers's disease |
US5705629A (en) | 1995-10-20 | 1998-01-06 | Hybridon, Inc. | Methods for H-phosphonate synthesis of mono- and oligonucleotides |
US5928906A (en) | 1996-05-09 | 1999-07-27 | Sequenom, Inc. | Process for direct sequencing during template amplification |
US7078191B1 (en) | 1997-08-01 | 2006-07-18 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation |
US5952217A (en) * | 1997-09-23 | 1999-09-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Recombinant yeast cell and assay using same |
US20010006793A1 (en) * | 1998-03-20 | 2001-07-05 | Mary-Ann Bjornsti | Modulators of eukaryotic caspases |
AU4322999A (en) | 1998-06-01 | 1999-12-20 | Advanced Research And Technology Institute, Inc. | Methods and compositions for diagnosing tauopathies |
WO2001002552A2 (en) | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Double transgenic animals as models for neurodegenerative disease |
MXPA02007796A (es) * | 2000-02-21 | 2003-12-08 | Pharmexa As | Metodo novedoso para la disminucion de cuerpos amiloides. |
IT1317922B1 (it) | 2000-10-24 | 2003-07-15 | S I S S A Scuola Internaz Supe | Metodo per identificare in vivo epitopi intracellulari. |
ATE382704T1 (de) * | 2001-02-15 | 2008-01-15 | Univ Chicago | Verfahren zum nachweis in hefe für mittels die proteinfaltung beeinflussen |
GB0104685D0 (en) * | 2001-02-26 | 2001-04-11 | Leuven K U Res & Dev | Tau-opathy model |
AU2002310497A1 (en) * | 2001-06-20 | 2003-01-08 | Caprion Pharmaceuticals Inc. | Protein aggregation assays and uses thereof |
WO2005005640A1 (en) | 2003-07-11 | 2005-01-20 | Remynd Nv | A yeast model for amyloidogenic protein toxicity |
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2013
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2016
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5547841A (en) * | 1987-10-08 | 1996-08-20 | The Mclean Hospital Corporation | In vitro method for screening for drugs that inhibit production or degradation of human A4-amyloid |
WO1991004339A1 (en) * | 1989-09-18 | 1991-04-04 | California Biotechnology Inc. | Assays and reagents for amyloid deposition |
US5652092A (en) * | 1992-05-01 | 1997-07-29 | American Cyanamid Company | Amyloid precursor proteins and method of using same to assess agents which down-regulate formation of β-amyloid peptide |
JP2001501802A (ja) * | 1995-11-09 | 2001-02-13 | ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー | ハンチンチン(huntingtin)結合蛋白質 |
WO1999029891A1 (en) * | 1997-12-09 | 1999-06-17 | Arch Development Corporation | Methods for identifying factors controlling amyloid protein aggregation |
WO2001006989A2 (en) * | 1999-07-27 | 2001-02-01 | Abgenix, Inc. | Methods and compositions for inhibiting polypeptide accumulation associated with neurological disorders |
WO2001023412A2 (en) * | 1999-09-27 | 2001-04-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of screening for agents which inhibit aggregation of polypeptides |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6010037419; Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.97,No.4(2000)p.1589-1594 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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