JPH09501302A

JPH09501302A - 治療活性についての物質のスクリーニングのための方法及びそれにおいて利用するための方法

Info

Publication number: JPH09501302A
Application number: JP6521845A
Authority: JP
Inventors: ジョンマーシャル，クリストファー; アッシュワース，アラン; アンソニーヒュー，デビッド
Original assignee: キャンサーリサーチキャンペーンテクノロジーリミティド
Priority date: 1993-04-07
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 1997-02-10
Also published as: EP0703984A1; AU6382394A; AU677834B2; CA2157774A1; US5958721A; WO1994023039A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物 MAPキナーゼ経路に影響を及ぼす阻害剤及び活性化剤の両方の物質のスクリーニング方法を提供する。かかる作用を有するものとしてこの方法を利用して同定された方法は、癌、炎症障害、心臓血管障害又は神経障害の処置において利用するための候補薬剤である。本発明において利用するための酵母を提供する。酵母において、酵母 MAPKKキナーゼ及びMAPKキナーゼの欠陥は、哺乳動物 MAPKK及びMAPKキナーゼにより補完される。酵母MAPKは哺乳動物同族体によっても代替され、そして哺乳動物MAPKホスファターゼを導入することができうる。

Description

【発明の詳細な説明】治療活性についての物質のスクリーニングのための方法及びそれにおいて利用するための方法本発明は薬剤としての可能性についての候補物質のスクリーニングに関する。より詳しくは、本発明は哺乳動物における MAPキナーゼに影響を及ぼす能力について試験物質をスクリーンできるようにする方法を提供する。この経路の阻害又は活性化について試験物質をスクリーニングするための方法を提供する。本発明はこの方法において有用な酵母も提供する。新規薬剤の同定をもたらす薬理リサーチは、先行化合物の発見の前後において、莫大な数の候補物質のスクリーニングを一般に包括することがよく知られている。このことは、薬理リサーチを非常に経費のかかる、且つ時間のかかるものとする一因であり、従ってスクリーニング工程を補助するための方法のかなりの商業的な重要性及び有用性を有しうる。哺乳細胞において、酵素 MAPキナーゼ（MAPK）の活性化は成長因子の刺激の結果であり、且つ細胞増殖にとっての必要条件である（61）。癌遺伝子系p21rasタンパク質は細胞を形質転換せしめ、そして細胞中の正常p21rasタンパク質の阻害は成長因子のシグナリングを妨害するため、これらのタンパク質は細胞増殖の制御に関与していることが一般的に推測されている。特に、それらは成長因子レセプターから細胞質シグナル変換経路に至るシグナルの伝達に関与しているようであり、なぜならチロシンキナーゼ型成長因子レセプター及び非チロシンキナーゼ成長因子レセプターは共にMAPK活性及び細胞増殖を刺激するのに正常なp21ras機能を必要とするからである。従って、ｐ21癌遺伝子系形態は、外的成長因子シグナルにとっての必要条件からMAPKの活性化を切り離してしまうようである。細胞内タンパク質キナーゼＣ(PKC)のホルボールエステルによる活性化は、ある種の細胞タイプにおいては正常 ras機能抜きでMAPKを活性化することも見い出されている。また、静止状態の３Ｔ３細胞の中に導入された癌遺伝子系p21rasは PKCを迅速に活性化し、任意の外的刺激抜きでMAPKの活性化をもたらすことが示されている。 ras 又は PKC由来のMAPKの活性化は Rafタンパク質キナーゼ及びMAPKキナーゼ (MAPKK)を介して、本質的に次の系に沿って有効に進行すると我々は考える： MAP-キナーゼのファミリーがあり、そしてその経路は多種多様の細胞タイプに包含されていることが明らかである〔35−37〕。分子量Ｐ42^mapk及びＰ44^mapkを有する MAPキナーゼの２つの形態（それぞれ ERK−２及び−１）が繊維芽細胞から単離された〔38〕。活性化は保存型キナーゼサブドメイン８内に位置するスレオニン及びチロシン(Ｔ183,Ｙ185)の順序立ったリン酸化を必要とする〔39,40〕。酵母のMAPK−経路同族タンパク質は、交配フェロモンに対する応答を含む酵母のシグナル変換に関与する。酵母シゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharom yces pombe)の場合、MAPKタンパク質は Spk１である。２種の追加のキナーゼ By r１及び Byr２が Spk１と同じ経路に属しており、そのうち Byr１は MAPKKとある程度の配列相同性を有することが示されている。更に、Spk１における交配フェロモン経路は Rasタンパク質機能を必要とし、そして Byr１及び Byr２はこの経路において Rasの下流で作用するものと考えられている。従って、 rasがこれらのキナーゼカスケードに関与する状況は分裂酵母及び高等真核生物においてと類似である可能性がある。より詳しくは、我々はＳ．ポンベにおける経路は本質的に以下を構成するものと信じている： Ras → Byr２→ Byr１→ Spk１以下の同等タンパク質がある：Ｓ．ポンベＳ．セレビジエ(S.cerevisiae) Byr１（STE１としても公知）＝ STE７ Byr２（STE８としても公知）＝ STE11 SpK１＝ FUS３／KSS１更に、サッカロマイセス・セレビジエにおいて、 MAPキナーゼ同族体及びその哺乳動物MAPK経路におけるそれと同等の機能を有する成分を伴うその他の経路、即ち HOG１及び MPK１経路がある。 MPK１は酵母MAPKであり、そしてその経路の中に以下の成分を有する： PKC１ BCK１（≡MAPKKK） MKK１／MKK２（≡MAPKK） MPK１（≡MAPK）酵母 MAPキナーゼ HOG１はその経路の中に以下の成分を有する： PBS₂（≡MAPKK） HOG１（≡MAPK））（53）全てのケースにおいて、様々な追加の成分が、生物の外部に由来しうる刺激に応答して上流で作用しうる。驚くべきことに、Byr1又はByr2のいづれかを欠く酵母株の中に哺乳動物（ヒト）Raf 又はその欠損誘導体を MAPKKと一緒に入れたとき、その操作された株は交配し、その経路が機能していることが示唆されるが、 rafもしくは raf誘導体のみ、又は MAPKKのみの発現は、Byr1又はByr2突然変異細胞が交配することを可能にしなかった。このことは、 Rafが MAPKKを直接リン酸化、且つ活性化することを強く裏付けする。また、酵母の中での spk１のMAPKによる置換及び／又は酵母 ras の哺乳動物（ヒト）rasによる置換を我々は考えた。実用上の観点から、本実験は生体における哺乳動物MAPK経路の一部を再構築し、これは例えばこの経路のインヒビターをスクリーニングするうえで利用できる。我々はまた、 Mosタンパク質キナーゼが、酵母の中で発現される MAPKKを活性化できることも示す。ｃ-mos遺伝子はまずマウスレトロウィルス由来の形質転換遺伝子（ｖ-mos）の細胞性同族体として同定され（54）、そしてその後ｃ-mosは哺乳動物細胞も形質転換できることが示されている。ｃ-mos遺伝子生成物(Mos) は生殖細胞の中で発現されるセリン／スレオニンキナーゼである。ゼノプス（カユル）において Mosについてかなりの研究がなされており、それではプロゲステロンに対する応答における卵母細胞の減数分裂成熟にとって必要であることが示されている。 Mos 発現は一般に生殖細胞に制約されるが、 Mosの不適切な発現は MAPキナーゼ経路の活性化を通じて腫瘍形成をもたらしうる可能性がある。事実、高レベルの Mosタンパク質発現が頸部癌腫由来細胞系において検出されている（Liら、19 93）。 Mosキナーゼの阻害剤は Mosを発現する腫瘍において治療的効果を有しうる。２つの発表された研究は、 MosはゼノプスMAPKの活性化において、減数分裂の際に関与することを示唆している（56，57）。更に、細菌により発現されたマルトース−結合性タンパク質(MBP)-Mos 融合タンパク質は、精製されたホスファターゼ−不活性化MAPKK を活性化でき、 MosがMAPKKKでありうることを示唆する。しかしながら、 MBP-Mos融合タンパク質は細胞抽出物（ウサギの網状赤血球リゼート）の中でのインキュベーションにより「活性化」され、従って Mos自体でなく、 MBP-Mosに一体化した網状赤血球リゼート中のMAPKKKが MAPKK のインビトロ活性化を司る可能性を排除しにくい。実施例２に記載の研究は、 Mosが酵母の中でRaf-１と似たように MAPKKを直接リン酸化するように働くことを確証しており、従って MAPKKキナーゼ又はMAPKKK と呼ばれうる。 MAP キナーゼ経路がどのようにしてスイッチオフとなるかの全貌はまだわかっていない。脱リン酸化による MAPキナーゼ活性の下降調節が重要な鍵のようである。ヒト遺伝子 CL100〔41〕及びそのネズミ同族体3CH134〔42〕が、転写が成長因子、酸化的ストレス及びヒートショックにより刺激される遺伝子として、以前に発現されている。その後、それらは、セリン／スレオニン及びチロシンホスファターゼ活性の両者を有するポリペプチドをエンコードすることが示された〔43 −44〕。 MAPキナーゼ上のスレオニン及びチロシンの両方からのリン酸塩の除去は異常である。インビトロで発現したとき〔43−44〕、この遺伝子の生成物は M APキナーゼに対して非常に特異的であり、そしてその不活性化をもたらすことが示されている。哺乳動物細胞の中でのネズミ遺伝子3CH134及び erk2MAPキナーゼアイソフォームの同時発現は MAPキナーゼの脱リン酸化及び不活性化をもたらす〔45〕。ここに開示するのは、それぞれが MAPキナーゼ調節系に関与しているポリペプチドをエンコードするいくつかの新規の遺伝子である。公知の MAPキナーゼホスファターゼに近縁するタンパク質をエンコードするいくつかの核酸分子が発見及び単離されている。当分野におけるスペシャリストの知識を超えた洞察力により、新規遺伝子の獲得をもたらす研究手順をデザインした。利用した実際の手順を以下に詳細し、且つホスファターゼと一緒に、特許出願GB9402573. 1 において開示した。新規の核酸配列によりエンコードされるポリペプチドの配列は、公知の MAPキナーゼホスファターゼの配列とある度合いの相同性を共有し、それはホスファターゼ、特に MAPキナーゼホスファターゼとしての指標にとって十分である。 MAP キナーゼホスファターゼは細胞増殖にとってのオフ・スイッチとして働くようである。それらが多重 MAPキナーゼホスファターゼである事実は、オフ・スイッチに対するある程度の特異性があるいことを示唆している。一般的な、又は特定のファミリーの構成員に対する MAPキナーゼホスファターゼの活性化因子は抗増殖剤でありうる。ホスファターゼをエンコードする核酸の提供はかかる活性化因子についてのスクリーニングを可能にする。例えば突然変異による MAPキナーゼホスファターゼ活性の失活は無秩序な細胞増殖をもたらしうる。それ故、これらの遺伝子の一部は腫瘍抑制遺伝子であると証明されうる。本発明の第一の観点に従い、哺乳動物MAPK経路の阻害剤である物質についてのスクリーニングの方法を提供し、この方法は：酵母 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子活性を欠き、且つその欠陥が哺乳動物 M APKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完される酵母を獲得し；この酵母を、その酵母のMAPK経路の活性化を通常もたらしめるであろう条件のもとで試験物質に曝露し；そしてこの酵母MAPK経路の活性化の指標である終点を探す；ことを含んで成り、ここでその終点の阻害はこの試験物質によるMAPK経路の阻害を指標するものである。本発明の第二の観点に従い、MAPKに対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用の阻害剤である物質についてのスクリーニングの方法を提供し、この方法は： MAPKK キナーゼ及び／又は MAPKK遺伝子活性を欠き、且つその欠陥が哺乳動物 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完され、更には哺乳動物MAPK ホスホファターゼ遣伝子が発現可能である酵母を獲得し；この酵母を、その酵母のMAPK経路の活性化を通常もたらしめるであろう条件のもとで試験物質に曝露し；そしてこの酵母MAPK経路の活性化の指標である終点を探す；ことを含んで成り；ここでその終点の活性化はこの試験物質によるMAPKに及ぼすMAPKホスファターゼ作用の阻害を指標するものである。本発明の第三の観点に従い、MAPK経路に対して哺乳動物MAPKホスファターゼ作用を及ぼす物質についてのスクリーニングの方法を提供し、この方法は： MAPKK キナーゼ及び／又はMAPK活性を欠き、その欠陥が哺乳動物 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完され、更に哺乳動物MAPKホスファターゼ遺伝子が発現可能である酵母を獲得し；この酵母を、そのMAPKホスファターゼが発現され、且つ酵母MAPK経路が部分的に阻害される条件のもとで試験物質に曝露し；そしてこの酵母MAPK経路の活性化又は更なる阻害の指標である終点を探す；ことを含んで成り；ここで、この終点の活性化はこの試験物質によるMAPKホスファターゼ作用の阻害を指標するものであり、そしてこの終点の更なる阻害はこの試験物質によるMA PKホスファターゼ作用の活性化又はこの試験物質によるMAPK経路の阻害のいづれかを指標するものである。この酵母はシゾサッカロマイセス・ポンベ、サッカロマイセス・セレビジエ（例えば、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス〔 Saccharomyces carlsbergensis〕）、又はカンジダ・アルビカンス（Candida al bicans）の任意の株であってよい（この最後に挙げた酵母の無性の性質、並びにそれが、突然変異及び選別をより困難なものとする二倍体であるにもかかわらず）。MAPK同族体がカンジダ・アルビカンスより供されている（58）。シゾサッカロマイセス・ポンベにおいて、 MAPKKキナーゼ及び MAPKKはそれぞれ Byr１及び Byr２でありうる。サッカロマイセス・セレビジエにおいて、前記した通り、FU S3／KSS1経路において STE７及び STE11があることがあり、又は他のMAPK経路において同等物がありうる。 Neimanら（52）は、Ｓ．ポンベ遺伝子 byr２， byr１及び spk１の、Ｓ．セレビジエ遺伝子STE11，STE７及び FUS３との互換性を述べている。一の種における突然変異は他のものに由来する同等遺伝子の発現により補完されることができ、種間でのキナーゼの機能の保存を実証している。酵母 MAPキナーゼ遣伝子（例えば spk１）は、酵母環境の中で機能できる哺乳動物MAPK遺伝子と変換できうる。このことは、物質を、MAPK経路の MAPキナーゼホスファターゼ作用に対する効果について試験するときに特に所望されうる。Ne imanら（52）は、哺乳動物 MAPキナーゼ ERK２がＳ．ポンベの中で spk１の代わりに機能できうることを示している。同様に、 Gotohら（19）は、ゼノプスMAPK がＳ．ポンベの中で spk１の代わりに働きうることを示している。 MAPKKの上流の酵母成分、例えばRasも哺乳動物同族体により置き換えられうる。このスクリーンの終点は酵母の支配能力もしくは胞子形成能力であるか、又は公知の方法でレポーター遺伝子上に Spk１もしくはMAPKスイッチの如くの活性化成分を設けることにより獲得される人工的に構築した終点でありうる。例えば、 Spk１活性化にとってのレポーターは遣伝子のプロモーターであって、β−ガラクトシダーゼをエンコードするlacZの如くのレポーター遣伝子に融合されているmatPm(65)又はsxa2(66)の如くの交配フェロモンに対して応答性であるras-spk1経路により制御されるものでありうる。哺乳動物MAPK活性化にとって適切なレポーター系は、 GAL４オペレーターからの発現を刺激する転写因子として働くGAL4-ELK-1融合タンパク質を活性化するMAPKによるリン酸化を基礎としうる。もし GAL４オペレーターをレポーター遺伝子、例えばlacZに融合し、そして酵母の中に組込んだら、検出可能な終点ができるであろう。このレポーター遺伝子は発色生成物の如くの可視検定可能なシグナルを生成する反応を触媒する酵素をエンコードするものでありうる。β−ガラクトシダーゼ及びルシフュラーゼを含む数多くの例が公知である。β−ガラクトシダーゼ活性は基質に基づく青色の生成によりアッセイでき、そのアッセイは目で見えるか又は吸収を測定する光度計の利用による。例えばルシフェラーゼ活性の結果として生ずる蛍光は光度計を利用して定量できうる。放射能アッセイは、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを用いて行うことができうる。それは非放射能アッセイにおいても使用できうる。 Chalfieら（60）により開示されている緑色蛍光タンパク質のそれの如くの自発蛍光を利用することができうる。レポーター遺伝子の活性の生成物は、遺伝子活性を測定するため、その生成物に結合できる特異的結合性ペアーの構成員、例えば抗体を用いてアッセイすることができうる。 MAPKK キナーゼは Raf，Mos，MEKキナーゼ(Lange−Carterら1993)、又はリン酸化により MAPKKを活性化できうる任意のその他の哺乳動物タンパク質であってよい。野生型 MAPKKキナーゼ(例えば raf又はmos)，MAPKK，MAPK 又は MAPKホスファターゼ遺伝子の変異体、突然変異体又は誘導体を使用できうる。変異体及び突然変異体は野生型核酸配列に対する若干の変化を有しうる。この変化は、エンコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらさない、又はエンコードされるタンパク質において１もしくは複数のアミノ酸残基の変化を及ぼし、タンパク質の機能に影響を及ぼすもしくは及ぼさない変化をもたらす１又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換のいづれか又は複数のそれであってよい。本発明の方法は、天然の、又はインビトロで人工的に作り上げた突然変異体、変異体又は誘導体の試験を可能にする。これはMAPK経路の有用な活性化剤又は阻害剤、例えば本発明を用いることにより見い出せうるMAPKホスファターゼの幅を拡げうる。この経路の成分に影響を及ぼす物質、MAPKの阻害剤、MAPKホスファターゼの阻害剤又は活性化剤等の同定を経て、その物質は製造されうるか、又は例えば医薬品の製造において利用されうる。かかる医薬品は特に哺乳動物における増殖障害（例えば癌）の処置のため、又は MAPキナーゼがかかわっているその他の障害、例えば炎症障害（63）、心臓血管障害（64）及び神経障害（22）（神経成長因子はMAPKカスケードを活性化する）の処置のためでありうる。本発明を利用して同定した物質の製造及び利用は本発明の範囲に属する。更に、本発明は、増殖障害、炎症障害、心臓血管障害及び神経障害のうちのいづれか又は複数のそれらの処置のための医薬品として利用するための、哺乳動物 MAPK経路の阻害剤としての、又はMAPKに対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす物質（例えばこの作用の活性化剤又は阻害剤）としての物質、並びにそれらの処置のための医薬品の製造におけるかかる物質の利用にも及ぶ。本発明の別の観点に従うと、酵母 MAPKKキナーゼ及び／又は MAPKK遣伝子活性を欠き、その欠陥が哺乳動物 MAPKKキナーゼ及び MAP KK遺伝子の共発現によって補完される酵母を提供する。この酵母はシゾサッカロマイセス・ポンベ(Byr１及び／又は Byr２遺伝子活性を欠きうる)、サッカロマイセス・セレビジエ（この場合、欠陥遺伝子は STE７及び／もしくは STE11、又は他のMAPK経路における同等物）、又はカンジダ・アルビカンスでありうる。（このことの更なる詳細については、前掲を参照のこと）。酵母MAPK（例えば Spk １）は哺乳動物MAPKにより置換してもよく、そしてMAPK活性を評価するための手段が従ってデザインされる（即ち、本発明に係るスクリーニング方法のための終点）。課題の経路の上流成分(例えばRas)も哺乳動物同族体により置き換えられうる。数多くの哺乳動物MAPK経路が存在していることが知られている。特殊なケースにおいては、哺乳動物細胞においては見い出せるが酵母においては見い出せない因子が、経路、例えば MAPKKK，MAPKK,MAPKの成分のいづれかの活性にとって必要とされることがある。この場合、もしその特定の成分を本発明のスクリーニング方法のいづれかに利用するなら、その因子は、例えばそれをエンコードする遺伝子をクローニングしてその因子が発現されるように酵母の中に導入することによって酵母の中に導入する必要があるか、又はその成分をその因子にとってのその要件を排除するように突然変異させる必要がある(Raf−１は例示の通り、Ｎ− 末端ドメインの欠失により活性化できうる)。この酵母は、それより哺乳動物MAPKホスファターゼが発現可能である核酸を、 MAPKに及ぼすMAPKホスファターゼの作用を妨害する物質についてのスクリーニングを可能にするため、含む（哺乳動物又は酵母のSpk1，FuS3，KSS1，HOG1又はMP K1等）。このMAPKホスファターゼは CL100，3CH134又はここで有用とされる任意のホスファターゼであってよい。配列情報を図に示す。既に述べた通り、ホスファターゼは野生型の変異体、突然変異体又は誘導体であってよい。好ましくは、この哺乳動物MAPKホスファターゼは過剰発現される。即ち、本発明のスクリーニング方法において Spk１又は哺乳動物MAPK(Spk１の代わりに存在しているなら)に及ぼす酵母ホスファターゼの任意の作用をマスクしてしまうのに十分な高レベルで発現される。一定の環境において、哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす、酵母ホスファターゼが物質スクリーニングに及ぼしてしまうことのある任意の妨害作用を止める又は低減させるため、酵母ホスファターゼ遺伝子機能を破綻させることが所望されうる。例えば、もし哺乳動物ホスファターゼが過剰発現されず、比較的低レベルで発現されるとき、MAPKに及ぼされる哺乳動物ホスファターゼ作用に対する試験物質の任意の作用（活性化又は阻害）が検出できなくなるほどに酵母中のMAPKに作用するのは、内因性酵母ホスファターゼでありうる。遺伝子機能を破綻するための技術は公知であり、そしてFUS3／KSS1に作用するホスファターゼをエンコードするサッカロマイセス・セレビジエがクローンされている事実により促進される（５ａ）。インビトロ突然変異誘発及び相同性組換の組合せがこの遺伝子の機能を破綻するのに利用されうる。更に、酵母中のその他のホスファターゼ遺伝子もこの遺伝子に対して配列相同性を有することがあり、従ってこのクローンされた遺伝子の一部に基づく配列を有するプライマー又はプローブを用いてクローンし、次いで酵母染色体の中の野生型遺伝子を代替するように利用される別に何らかの方法で突然変異又は破綻させる。本発明に係る酵母は有用な物質の同定のための本明細書に記載の方法において有用である。哺乳動物遺伝子は酵母の中に、自己複製式プラスミド上で導入することができ、そしてここに記載の通り染色体外要素として繁殖されうる。シャトル−ベクターとして知られるこれらのベクタープラスミドは細菌及び酵母の両者における複製及び選別のための配列を含む〔46〕。その他のコントロール要素、例えばプロモーター配列及び転写終止配列が哺乳動物遺伝子の発現のために含まれている〔47−48〕。このコントロール要素は酵母に由来するか、又はその他の生物もしくはウィルスに由来しうる。他方、この哺乳動物遺伝子は酵母ゲノムの中に導入することができうる。このことはランダム非相同組換により、又はクローン酵母配列により染色体の中の所定の位置に誘導することによる相同性組換により達成されうる〔49〕。哺乳動物遺伝子の発現はプラスミドベクターにおいて用いられているものと同様にコントロール要素により調節されるであろう。哺乳動物遺伝子生成物の発現のレベルを変更するのに様々なプロモーター配列が利用されうる〔50〕。適当な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポワアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適宜その他の配列を含む適当なベクターを選択又は構築することができる。更なる詳細については、例えばMdecular Cloning：a Laboratory Manual：第２版、Sambrookら、1989，C old Spring Harbor Laboratory Press を参照のこと。本発明の方法は当該経路における成分の活性を妨害する又は２種以上の成分の互いとの相互作用を妨害する物質を同定するであろう。任意の酵素カスケードの機能は各成分の酵素活性及び各成分の他の成分と相互作用する能力の両方に依存する。本発明にとっての実験ベース及び本発明の実施態様をこれより図面を参照しながらより詳しく説明する。本明細書の中で挙げている文献は全て引用することで本明細書に組入れる。図１は、 Raf及び MAPKKの共発現による byr１突然変異体の交配欠陥の補完を示す。 MAPKKのみ（ａ），MAPKK＋ raf−１（ｂ），MAPKK＋Δ raf−１（ｃ）， raf−１のみ（ｄ）， Δ raf−１のみ（ｅ）により形質転換された byr１突然変異体及びＳ．ポンベ byr１⁺ （ｆ）の顕微鏡写真。図２は Rafを共発現するＳ．ポンベ細胞における MAPKK活性を示す。Ａ；MAPK K 及びΔ raf−１により形質転換されたbyr1突然変異株（CB53）由来の分画細胞抽出物のMAPKK 及びMAPK活性。Ｂ；ウサギMAPKK を検出するためのカラム画分のイムノブロット。図３はＳ．ポンベにおける rafによる MAPKKリン酸化の刺激を示す。Ａ； MAP KKのみ（レーン１）， MAPKK＋ raf−１（レーン２）， MAPKK＋Δ raf−１（レーン３）， raf−１のみ（レーン４）及びΔ raf−１のみ（レーン５）を発現する細胞におけるウサギMAPKK の免疫沈殿。上：リン酸ラベルMAPKK を示す燐光イメージャープリント（レーン１−３）。下：抗−MAPKK 血清による同一の免疫沈殿サンプルのイムノブロット。Ｂ：MAPKK のホスホペプチド地図。起源はＸで記した（各パネルの左下）。水平次元は電気泳動（右側に陽極）であり、そして垂直次元はクロマトグラフィーである。図４は哺乳動物MAPKK 及び Mosの共発現による byr１及び byr２突然変異体の交配欠陥の補完を示す。（ａ）〜（ｄ）MAPKKのみ((ａ)，MAPKKとMos(ｂ)，Mos のみ（ｃ）のいづれかにより形質転換された byr１突然変異体又は byr１＋（ｄ）；（ｅ）〜（ｈ）MAPKKのみ（ｅ），MAPKK＋Mos(ｆ)，Mosのみ（ｇ）のいづれかにより形質転換された byr２突然変異体又は byr２＋（ｈ）方法。マウスｃ-m os cDNA を、pREP42の誘導体であるpREP52の中にクローンした(Basiら、1993)， byr２突然変異株CB85(h⁹⁰byr２：：ura4ΔRS ade6 leu1 ura4)はJX３より誘導した(Gotohら、1993)。他のプラスミド及び byr１突然変異株CB53は既に記載されてある（Hughesら、1993）。この形質転換体を合成胞子形成用アガー(SSA)上で３日後に写真撮影した。図５は MAPKK及び Mosで発現する byr１突然変異体におけるMAPKキナーゼ活性を示す。細胞抽出物を、 MAPKKのみ、 MAPKKと Raf−１、又は MAPKKと Mosのいづれかを発現する byr１突然変異体（CB53）から調製した。各抽出物由来の全部で５μｇのタンパク質を先に記載されている通りにして MAPKK活性についてアッセイした（Hughesら、1993）。これらの抽出物中の各キナーゼの発現をイムノブロット分析により確認した（データーは示さず）。図６は新規のホスファターゼ分子の DNA配列を示す。STY2−STY4は本明細書に記載の通りにしてＡ431 細胞から生成された RNAから増幅させた PCR生成物である。 STY６は、パートａ）及びｂ）に示す STY２と STY３プローブとの混合物によるヒト肝臓cDNAライブラリーのスクリーニングにより単離したcDNAクローンの一部である。STY7-STY10はパートａ）及びｂ）に示す STY２と STY３との複合プローブによるヒト脳cDNAライブラリーのスクリーニングにより単離したcDNAクローンの一部である。 STY７及び STY10とは異なり、全ての配列が CL100との相同性を示した。これらのクローンの場合、示している配列は CL100に対する相同性は示さないが、しかしこれらのcDNAクローンは STY２／３プローブに対して強力にハイブリダイズし、これらのクローンも新規のホスファターゼ遺伝子をエンコードすることが示唆された。図６（ａ）は STY２、図６（ｂ）は STY３、図６（ｃ）は STY４、図６（ｄ）は STY５、図６（ｅ）は STY６、図６（ｆ）は STY７、図６（ｇ）は STY８）、図６（ｈ）は STY９、そして図６（ｉ）は STY10を示す。図７は CL100のアミノ酸配列と並び比べたホスファターゼクローンの推定アミノ酸配列を示す。パートａ）−ｃ）に関し、スペースは CL100と同一である残基を示し、点は決定されていない残基を示す。パートｄ）に関し、それは STYについての全長クローンと CL100との対比であり、ダッシュ（−）はその整列を最適化するあめに配列の中に導入したギャップを示す。網かけの付いた残基は STY８と CL100との間で同一である残基に該当する。示しているアミノ酸配列は、図７（ａ）に関してはSTY2，STY3，STY4及びSTY5 の残基 177−255 に、図７（ｂ）に関しては STY６の 231−302、図７（ｃ）に関しては STY９の 223−267 、そして図７（ｄ）に関しては STY８の１−367 に該当する。図８は STY８が MAPキナーゼホスファターゼ活性をエンコードすることの証明を示す。タンパク質抽出物を、細胞の EGFによる刺激の前後において様々な組換プラスミドでトランスフェクトした COS細胞から調製した。これらの抽出物を S DS／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そしてそのタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。次いでこの膜を抗 myc抗体9E10とインキュベートし、 ECL 手順により処理し、そして得られるケミルミネッセンスをＸ線フィルム上で検出した。刺激性リガンド(EGF)の非存在下で、抗 myc抗体9E10はウェスタンブロット上で一本の MAPキナーゼバンドのみを示すことが認められうる（レーン１）。 EGFの存在下では（レーン２）、はっきりとした二重バンドがあり、 MAPキナーゼの部分リン酸化を示唆する。これは親発現ベクターの発現に影響されない（レーン３及び４）。しかしながら、 EGFの存在下（レーン７−100）での CL100又は STY８の発現は EGF誘発シフトの消失を招き、これらの分子が両方とも MAPキナーゼホスファターゼをエンコードすることを示唆する。細胞がMyc-タグSTY8でトランスフェクトされているレーン５及び６は STY８タンパク質が実際に発現されたことを示す。レーン１はMAPK；レーン２はMAPK＋EGF；レーン３はMAPK＋pM７；レーン４はMAPK＋pMT ＋EGF ；レーン５はMyc-STY8；レーン６はMyc-STY8＋EGF ；レーン７はMAPK＋CL100 ；レーン８はMAPK＋CL100 ＋EGF ；レーン９はMAPK＋STY8；レーン10はMAPK＋STY8＋EFGである。実施例１まず図１に関し、ウサギ MAPKKcDNA及びＳ．ポンベbyr1⁺ をpREP41にクローンし、そしてヒト raf−１及びΔ raf−１をpREP42の中にクローンした。 raf−１クローンは全長 Raf−１タンパク質をエンコードし、ここでΔ raf−１において、最初の 324個のアミノ酸が検定されている（７）。ベクタープラスミドは nmt １プロモータープラスミド²⁹の誘導体であり、そしてＳ．セレビジエLEU2遺伝子（pREP41）又はＳ．ポンベura4⁺ 遺伝子（pREP42）のいづれかを選択マーカーとして含む³⁰。オープンリーディングフレームの0.18キロベース欠損(SpeI〜BamHI )を有するbyr1のヌル突然変異体を−工程遺伝子破綻により構築した。byr1突然変異株CB53（h⁹⁰ byr1：：ura4ΔRA ade6 leu1 ura4）を２つのプラスミド（一方はpREP41に由来し、そして他方はpREP42に由来する）で形質転換し、そして両プラスミドを担持する Leu⁺ Ura⁺ 形質転換体を選別した。形質転換体を合成胞子形成用アガー(SSA)³¹上で３日間増殖させ、次いで写真撮影した。Ｓ．ポンベにとっての分子遺伝学法は記述されている^32,33。図２に関し、細胞を最少培地(EMM)の中で約１×10⁷ 細胞／mlにまで増殖させ、遠心により回収し、次いで停止バッファー(150mMのNaCl，50mMのNaF，10mMのE DTA，１mMのNaN₃，pH8.0)の中で洗った。20μｌの50mMのトリス・Cl，pH7.3， 40mMのNa₄P₂U₇，50mM のNa F，５mMのMgCl₂，0.3mMのNaオルトバナデート、10mMのEGTA，１％のトリトンＸ −100， 20μｇ／mlのロイペプチン，20μｇ／mlのアプロチュン，１mMのPMSF中に懸濁した細胞(2.0×10⁸)を、１ｇのガラスビーズと一緒に２min ボルテックスに付入することにより破砕し、そのビーズを50容量のバッファーＡ（50mMのトリス・Cl，pH7.0，２mMのEDTA，２mMのEDTA， 0.1％のβ−メルカプトエタノール、５％のグリセロール、0.03％のBrij35， 0.3mMのNaオルトバナデート、１mMのベンズアミジン、４μｇ／mlのロイペプチン）で洗い、そしてそのリセートを E pperdorfマイクロ遠心機で 14,000rpmで 10min遠心することにより清浄化した。 0.5mlの清浄リゼート(総タンパク質1.5mg)を次いで１mlのMono−Ｑカラム(Phar macia L.K.B)に載せ、そしてそのカラムを0.35ＭのNaClに至る25mlの線形塩勾配を伴ってバッファーＡで展開した。流速は１ml／min とし、そして 0.5mlの画分を集め、そして本質的にTraverseら²⁴に記載の通りにして、 MAPKK活性につい組換 ERK２とのプレインキュベーション後（＋ERK2）、そしてMAPK活性についてはバッファーとのプレインキュベーション後（−ERK2）、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)キナーゼについてアッセイした。（Ｂ）キナーゼ活性についてアッセイした各画分のアリコートを10％のSDS-PA GEにより分解し、lmmobilon（Millipore）にエレクトロブロットし、そしてGST- ウサギMAPKK 融合タンパク質により生起させたウサギポリクローナル抗体179（A .Ashworth and C.J.Marshall，未公開）及び ECL試薬（Amersham）でプローブした。図３に関し、細胞を低リン酸塩EMM の中で対数増殖中期（約５×10⁶ 細胞／ml ）にまで増殖させ、〔³²Ｐ〕オルトリン酸塩で 3.5hにわたりラベルし、次いで溶解バッファー（25mMのトリス−Cl，pH8.0， 40mMのNa₄P₂O₇， 50mMのNaF，５ mMのMgCl₂，0.1mMのNaオルトバナデート、10mMのEDTA，１％のトリトンＸ−100、プロテアーゼインヒビター：20μｇ／mlのアプロチニン、20μｇ／mlのロイペプチン、１mMのPMSF）の中でガラスビーズにより破砕した。遠心後(15,000rpmで15min)、その上清液を 0.5 ％のナトリウム・デオキシコレート(NaDOC)、 0.1％のドデシル硫酸ナトリウム( SDS)に調整し、そしてプロテインA-sepharose に事前カップルされた抗 MAPKK血清179 と１ｈにインキュベートした。これらのビーズをバッファー(NaDOC及び S DSを有し、MgCl₂ 及びプロテアーゼインヒビターを有さない溶解バッファー)で４回洗い、 0.1mg／mlのRNase と30分ィンキュベートし、再び洗い、 Laemmliのサンプルバッファーの中に懸濁し、そして煮沸した。サンプルを10％の SDS−PA GEにより分解し、そして lmmobilonにエレクトロブロットした。オートラジオグラフィー後、MAPKを抗−MAPKK 血清 179及びアルカリホスファターゼ−コンジュゲート化第二抗体(Promega)を用いて検出した。放射能は燐光イメージャー（Mol ecular Dynamics）を用いて定量し、そしてイムノブロットしスキャニングデンシトメーター(Joyce−Loebl)でスキャンした。 lmmobilon上での MAPKKのトリプシン消化を経て、二次元ホスホペプチドマップが得られた。第一次元はセルロース薄層プレート(Kodak)上で 400Ｖで60min，pH1.9のバッファーの中での電気泳動であり；第二次元はホスホクロマトグラフィーバッファーで３ｈ展開させた上昇クロマトグラフィーである。考察哺乳動物 MAPキナーゼキナーゼ(MAPKK)は分裂酵母Ｓ．ポンベのbyr1遣伝子生成物に構造的に近縁してる。例えばウサギMAPKK は Byr１に対し、触媒ドメインにおいて55％、そして全体で38％アミノ酸配列が同一である。哺乳動物の MAPKK がbyr1突然変異欠陥を補完できるかどうかを調べるため、分裂酵母プロモーターにより誘導されたウサギMAPKK をbyr1突然変異株の中に形質転換した。 MAPKKの発現はこの株の交配欠陥を補完できなかった（図１）。 MAPKKはリン酸化により活性化されなければならないため²²、Ｓ．ポンベがかかる活性化剤を有さない可能性がある。 raf−１プロト癌遺伝子の生成物は哺乳動物細胞における MAPキナーゼ経路の活性化におそらくは MAPKKの直接活性化剤として関与しており、従って我々は Raf −１がＳ．ポンベにおいて MAPKKを活性化できるかを調べた。byr1突然変異細胞が、 Raf−１又は Raf−１の活性化誘導体であるΔ Raf−１のいづれかを、 MAP KKと一緒に共発現したとき、それは交配することができた（図１）。ただし、その交配頻度は野生型byr1⁺ 遺伝性担持する細胞のそれよりは低かった（表１）。 Raf−１もしくはΔ Raf−１のみ、又は MAPKKのみの発現はbyr1突然変異細胞を交配するようにさせず、 MAPKKと Rafの両方の発現が Byr１の代替のために必要であることを示す。Ｓ．ポンベ遺伝子 spk１は Byr１と同じ経路に関与すると考えられるタンパク質キナーゼをエンコードする^9.19。 Spk１キナーゼは脊椎動物 MAPキナーゼに、並びにＳ．セレビジエ FUS３及び KSS１に相同性であり、そしてそれらはサブドメインVIII中に調節性 TEYリン酸化部位モチーフを含むようである⁹ 。我々がここで説明する研究と一致して、他の者はゼノプス及び哺乳動物MAPKがＳ．ポンベ¹⁹ における Spk１の代わりを担うことができることを示している（52）。その他の系^21,23 との類似により、並びに遺伝的及び生化学的分析¹⁹から、Byr１は Sp k１をリン酸化及び活性化するようである。即ち、活性化 MAPKKはＳ．ポンベにおける Spk１キナーゼをリン酸化及び活性化することにより Byr１の代わりとなりうる。この仮説と一致して、 MAPKKと Rafとの共発現は spkヌル突然変異体の交配欠陥を救済しない（表１）。これらの実験は、哺乳動物MAPKK が Rafの共発現によりＳ．ポンベの中で機能できることを示す。MAPKKのキナーゼ活性が Raf依存性であるかを調べるため、細胞抽出物を、MAPKKのみ、 MAPKKとΔ Raf−１、又はΔ Raf−１のみを発現するＳ．ポンベから調製し、Mono Q （商標）イオン交換カラム上で分画し、そしてその画分をMAPキナーゼ活性又はMAPキナーゼ活性についてアッセイした（図２）。MAPKK活性はMAPKK及びΔ Raf−１を共発現する細胞においてのみ検出できた。Mono Q カラムからの活性MAPKK の溶離パターンは複雑であり、イムノブロットにおけるMAPKKとよく相関する４つの活性ビークが伴った（図２Ｂ）。Δ Raf −１を発現する細胞においては、MAPKKのピークは約100mMのNaClで免疫反応性的に溶離し（画分19）、これは最も活性な画分に該当し、そして哺乳動物細胞²⁴由来のMAPKK活性のメジャーピークの位置に類似していた。Rafの非存在下では、ほとんどのMAPKKがカラム・フロースルー画分の中で見い出せた（図２Ｂ）。どの抽出物の中でも MAPキナーゼ活性は検出できなかった。活性 MAPKKの溶離パターンは Rafを発現する細胞におけるタンパク質の多少の修飾を示唆する。Raf−１はタンパク質キナーゼであるため、我々は³²Ｐ−オルトリン酸塩による代謝ラベリングの後、Ｓ．ポンベ中の MAPKKのリン酸化部位を探した。MAPKKは Raf−１抜きでリン酸化されるが、Raf−１又はΔ Raf−１の共発現はMAPKKの過剰リン酸化を招き、それにはゲル電気泳動に基づく泳動度の低下が伴う（図２及び３）。我々は、Raf−１が MAPKKリン酸化を約４倍に刺激し、そしてΔ Raf−１は５倍以上の刺激を供すると見積った。Raf−１発現細胞において、２形態の MAPKKが類似の量で存在し、一方Δ Raf−１発現細胞においては、遅めの泳動形態が主流であった（図３）。 byr１の補完による判定に従い（表１）、Δ Raf−１はRaf−１よりもMAPKKを活性化するうえで効果的であることにより、MAP KKの遅く泳動する過剰リン酸化形態が生化学的に活性な形態のようである。ホスホアミノ酸分析は、過剰リン酸化 MAPKKはホスホセリン及びホスホスレオニンを含むが、ホスホチロシンは含まないことを示し（データーは示さず）、ゼノプス卵母細胞由来の活性 MAPKKに基づく研究と一致した²⁵。 Rafを発現するMAPKKの過剰リン酸化は、新たな部位上でのリン酸化、Rafの非存在下でリン酸化される部位上での高められたリン酸化、又は両メカニズムの組合せの結果でありうる。MAPKKリン酸化をより詳しく調べるため、免疫沈殿させた MAPKKのトリプシン処理ホスホペプチドマップを作った（図３）。Raf−１及びΔ Raf−１発現細胞由来のマップは同一であるが、MAPKKのみを発現する細胞由来のマップとは異なっていた（図３）。最も重度にラベルしたホスホペプチドは、Δ Raf−１を発現する細胞中のパプチドａであるが、Rafを有さない細胞においてはペプチドｂである。ホスホペプチドｃは Rafキナーゼを発現する細胞においてのみ認められる。Raf抜きでの MAPKKリン酸化は、インビトロで生ずることが知られている¹⁴自己リン酸化、又は内性酵母キナーゼによるリン酸化の結果でありうる。どれであろうと、この Raf非依存性リン酸化は酵素を活性化しない。Raf抜きでの MAPKKリン酸化はインビトロで生ずることが知られている¹⁴自己リン酸化、又は内性酵母キナーゼによるリン酸化の結果でありうる。どれであろうと、Raf非依存性リン酸化は酵素を活性化しない。哺乳動物細胞由来の Rafキナーゼの免疫沈殿はホスファターゼ処理した均一で純粋な MAPKK調製物をリン酸化及び再活性化することが示され⁷、そして細菌発現Ｖ−Raf も部分的に精製した MAPKKを再活性化できる⁸；しかし、これらの実験は Rafと MAPKKとの中間体を排除しない²⁶。しかしながら、Rafが発現されない限りMAPKKを活性化できないＳ．ポンベの能力は、Rafが MAPKKを直接リン酸化及び活性化することを強く裏付ける。我々は、Rafのみでなく、Raf及び MAPKKの共発現も、Byr１の上流で機能すると考えられるキナーゼ^27,28をエンコードするbyr2の交配欠陥を抑制することを見い出した（表１）。完全byr1遺伝子を含む突然変異体は Rafのみでは抑制できないことは、Rafが Byr１を活性化できないことを示す。このことは、R afが MAPKKを直接リン酸化及び活性化することの強い遺伝的論点を供し、なぜなら推定中間体は哺乳動物 MAPKKは活性化できるが、しかしＳ．ポンベのその同族体 Byr１は活性化できないからである。実施例２我々は、byr１又は byr２のいづれかを欠くＳ．ポンベ株の中で Mos及び MAPK Kを共発現させ、そしてこれらの株の交配欠陥が救済されたことを見い出した（図４）。Mos自体の発現はＳ．ポンベ突然変異体の交配能力に対して何ら作用を有さなかった。しかしながら、Mos及び MAPKKの共発現は、Ｓ．ポンベの MAPキナーゼ同族体 spk１を欠く株に対する交配を復帰させた（表２）。Mos及び MAPKKについてのこれらの結果は、Raf−１及び MAPKKについての発見と本質的に同じであり、そして Mosがインビボで MAPKKを直接活性化するという概念を強く裏付けた。MAPK Kが Mosの存在下で活性化されることを確認するため、我々は哺乳動物キナーゼを発現する byr１突然変異株から細胞抽出物を調製し、そしてそれらを MAPKK活性についてアッセイした。結果は、Mosが共発現されたとき MAPKKが実際に活性化されることを示した（図５）。Mosと共発現された MAPKKの過剰リン酸化は SD S−PAGEでの MAPKKの低められた泳動度により示唆された（データーは示さず）。MosのＳ．ポンベの中で発現されたときにMAPKKKとして機能する能力は、哺乳動物細胞抽出物を加えない限り MAPKKを活性化しない細菌から精製して MBP−Mos 融合タンパク質の能力に反する（Posadaら、1993）。Mosキナーゼ活性を活性化できる内性成分があるようである：哺乳動物細胞及びＳ．ポンベの中の Mos活性化剤の同一性は知られていない。実施例３ MAP キナーゼホスファターゼをエンコードする遺伝子の単離ヒト遣伝子CL100(３)及びそのネズミ同族性3CH134（42）はセリン／スレオニン及びチロシンホスファターゼ活性（５，６）の両方を有するポリペプチドをエンコードすることが示されている。インビトロで発現したとき、この遺伝子生成物は MAPキナーゼに対して非常に特異的であり、その失活をもたらすことが示されている。ネズミ遺伝子3CH134と erk2MAPキナーゼアイソフォームの哺乳動物細胞の中での共発現は MAPキナーゼの脱リン酸化及び失活をもたらす（７）。近縁のタンパク質アミノ酸配列を同定するため、ヒト CL100及びそのネズミ同族体3CH134、並びに未知機能の近縁Ｔ細胞特異的遺伝子であるヒトPAC-１遺伝子（42）を対比させた。タンパク質の保存領域に基づき、それは縮重 PCRプライマーをデザインすることが可能であることを証明した。これらのプライマーを、ヒトの鱗細胞系A431から単離したポリ（Ａ）⁺RNA より作ったcDNAから近縁配列を増幅するために利用した。270bpのフラグメントを精製し、そしてサブクローンした。50の個々のクローン配列のうち、６つが CL100と同一であることが証明された。更に20のクローンが、相同性ではあるが、CL100とは異なることが見い出された：STY２は６回、そして STY３は４回単離され、STY４及び STY５は一回の単離であった。更なる近縁遺伝子を同定するため、STY２及び−3PCR生成物由来の複合プローブで脳及び肝臓cDNAライブラリーをスクリーンした。いくつかのハイブリダイズ用クローンを制限エンドヌクレアーゼマッピング及び部分 DNA配列決定により更に詳しく分析した。このことは、STY１が CL100であるいくつかの更なる遺伝子ファミリー STY６−10の同定をもたらした。全部で９つの新たな遺伝子が同定され、そしてこれらを CL100アミノ酸配列と比較した（図７参照のこと）。これらの遺伝子間での高度の類似性はそれらが MAPキナーゼホスファターゼ活性を有するタンパク質をエンコードすることを示唆した。細胞培養及び RNA調製 A431細胞を、10％の胎児牛血清の添加された Eagle最少必須培地（DMEM）のDu lbecco改良物の中で増殖させた。全細胞性 RNAは、RNA_zoIB(Promega)及び Dynab eadsオリゴ（dT）25(Dynal)により単離したポリ（Ａ）＋ RNAにより調製した。CL100 近縁cDNAの単離２種の縮重オリゴヌクレオチド TA(T,C)GA(T,C)CA(A,G)GG(A,G,T)GG(T,C,G,A)CC(A,T)GT(A,G,T)GA 及び AT(G,C,T)CC(A,T)GC(T,C)TG(A,G)CA(A,G)TG(T,C,G,A)AC を、ヒトとマウスCL100 との間で保存されているアミノ酸配列YDQGGPVE及び VHC QAGI、並びにヒト PAC−１遺伝子を基礎にデザインした。A431ポリ（Ａ）−RNA( １μｇ)をSuper Script逆転写酵素(BRL−GIBCO)で転写し、そしてこれらのオリゴヌクレオチドを用いてTechne phc-1熱サイクラーで(Ashworth，1993)、以下の条件：94℃で30sec，50℃で30sec，72℃で１min、のもとで PCRにかけた。270bp のバンドがアガロースゲル電気泳動により精製され、そして p Bluescriptの中にサブクローンした。 50の個々のサブクローンを配列決定し、そしてそのうちの６が CL100であることが証明された。他に12が相同性ではあるが CL100とは同一でないことが見い出され、そしてこれらは CL100が STY１である STY２〜 STY５と命名する４種の潜在ホスファターゼとしてグループ分けした。STY cDNAの構造分析ヒトの脳から単離したcDNAクローンの一つは全長である。STY遣伝と CL100との整列は、高保存型触媒トメインのまわのアミノ酸が異なり、そして CL100と c dc25との間の２つの保存型領域が STY８においても存在していることを示した。 3CH134のゲノム構造は、転写ユニットが長さ2.8kbpであり、そして４つのエクソンに分れることを示した〔46〕。STY遣伝子のゲノム構造を推定し、そしてそのプロモーター領域が転写因子にとっての共通配列を含むかを決定することは興味深いであろう。事前研究は STY８が3CH134と類似の遺伝子構造を有することを示唆する。機能アッセイヒトCL100 及びそのネズミ反応物3CH134は即時−初期遺伝子として機能し、その転写は数分以内に迅速、且つ過渡的に誘発され、タンパク質の蓄積は成長因子刺激により１時間において見い出せる〔46，47〕。いくつかの即時−初期遺伝子の発現に関して観察されるように、成長因子レセプターチロシンキナーゼ活性の急上昇及びシグナリング分子のその後の活性化は、異常増殖を避けるために正常レベルへの復帰を必要とする。このことを成し遂げるための一の方法には、発現が外的因子により誘発され、従って一定の環境下にのみ細胞の中に存在するタンパク質ホスファターゼが関与する。 CL100 および3CH134がインビトロ〔48−50〕又はインビボ〔47〕で発現されるとき、その遣伝子生成物は、選択的脱リン酸化をｐ42^mapK（血清によるその活性化はブロックされる）、癌遺伝子系Ras 又は活性化Raf に及ぼし、一方、ホスファターゼの触媒的不活性な突然変異体は MAPキナーゼリン酸化を補助する。我々は、COS細胞過渡的発現系を用い、ホスファターゼ STY８がインビボで類似の特異性を示すかどうかを試験した。我々は Cos細胞を、レポータープラスミド pEXV3-Myc-p42^mapKと、pMT-Myc-STY8を含む様々なプラスミドとで、共トランスフェクトした。図８はかかる実験の典型例である。刺激性リガンド(EGF)の非存在下では、抗-myc抗体9E10はウェスタンブロットで一本の MAPキナーゼのみを示した（レーン１）。EGFの存在下では（レーン２）、明確な二重バンドが存在し、MAPキナーゼの部分リン酸化を示唆する。これは親発現のベクターの発現に影響されない（レーン３，４）。しかしながら、EG Fの存在下での CL100又は STY８の発現（レーン７−10）は EGF誘発シフトの消失をもたらし、両方のこれらの分子が MAPキナーゼホスファターゼをエンコードする。細胞が Mycタグ STY８でトランスフェクトされているレーン５及び６は S TY８タンパク質が実際に発現されたことを示す。 MAPキナーゼホスファターゼをエンコードする核酸の検定は、MAPキナーゼ経路の活性化剤及び阻害剤を探すため、並びに様々な成分間、特に MAPキナーゼ及び MAPKホスファターゼ間の相互作用を調べるため、前述の酵母スクリーンに組入れることを可能にする。実施例４ MAP キナーゼ経路の阻害剤の同定のための酵母株の構築及び利用Ｓ．ポンベ株を nmt１プロモーターraf-1 cDNA-nmt１ターミネーター(nmt１− raf)を染色体の中の byr２座に組込むことにより構築した。これはまずnmt1-raf配列をura4⁺ 遺伝子のコード領域の中に、その ura４コード配列が破綻され、そして非機能的となるようにクローニングして、ura4：：nmt1-rafを供するように行った。このフラグメントを次に、ura4⁺ により破綻されている byr２(byr２：：ura4⁺；Ｊ×３)〔19〕を担持するＳ．ポンベ株の中に形質転換し、そして５−フルオロオロチン酸(FOA)(これは正常ura4⁺ 遺伝子生成物を含む細胞に対して選別せしめる)に耐性な形質転換体を選別した。FOA耐性コロニーの一部は byr２座において、破綻されたura4：：nmt1-raf配列による相同組換により置き換えられているura4⁺ 遺伝子を有するであろう。この種は破綻された byr２遺伝子(byr２：：nmt1-raf)内に安定的に組込まれたnmt1-rafを有する。第二の株を、染色体の中の byr１座において組込まれた nmt１プロモーター− MAPKKcDNA−nmt1ターミネーター(nmt１−MAPKK)により構築した。これはnm t1-rafについて前記した通りに行ったが、ただしその感受性株はbyr1：：nmt1-M APKKを有する。byr2：：nmt1-rafとbyr1：：nmt1-MAPKKとをプロトプラスト融合により交雑させ、byr2：：nmt1-raf及びbyr1：：nmt1−MAPKの両方を担持している二倍胞子形成した二重突然変異株(nmt1-raf／MAPKK)をテトラド分析により同定した。 β−ガラクトシダーゼをエンコードするＥ．コリlacZ遺伝子の上流のフェロモン誘発型遺伝子matPm(これはMAPK経路の作用により誘発される)のプロモーター配列より成るレポーター構築体を次に相同性組換により、nmt1-raf／MAPKK 株の中の leu１座に組込み、スクリーニング株nmt1-raf／MAPKK ／PM−lacZを得た。コントロール株は構成プロモーター adh１をlacZ遺伝子に複合させ、そしてこの構築体を相同性組換により酵母ゲノムの中に組込むことにより作った。酵母の中で発現される Raf又は MAPKKの活性を阻害できる物質を同定するため、nmt1-raf／MAPKK ／PM−lacZ株及びコントロール株を試験物質に曝露させる、又はさせなかった。適当な時間後、曝露された及び曝露されていない培養物中の β−ガラクトシダーゼ活性を決定〔51〕及び比較した。この物質に曝露された培養物中のβ−ガラクトシダーゼ活性の阻害は、その物質を哺乳動物タンパク質キナーゼの候補インヒビターとして特定した。コントロール株におけるβ−ガラクトシダーゼ活性に及ぼす作用のなさは、その物質がβ−ガラクトシダーゼの阻害剤である可能性を排除する。実施例５酵母の中で発現されるMAPKホスファターゼ(MKP)の阻害剤又は活性化剤についてのスクリーニング byr2，byr1，spk1，ade6及びleu1座それぞれに組込まれている nmt1-raf，nmt 1-MAPKK，nmt1-MAPK，nmt1-MKP及びmatPm-lacZを抱える酵母株を上記のようにして構築した。MKPの活性を変えることのできる物質を同定するため、その株を試験物質に曝露させる又はさせないで、上記の通りにしてβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。試験物質に曝露された培養物中の高められたβ−ガラクトシダーゼは、この物質による MKPの阻害又はタンパク質キナーゼの活性化の可能性を示唆する。逆に、低められたβ−ガラクトシダーゼ活性は、この試験物質による MKPの活性化又はタンパク質キナーゼの阻害の可能性を示唆する。まとめ哺乳動物細胞におけるレセプターチロシンキナーゼ由来の細胞内シグナリングは、ｐ21^ras 及びタンパク質キナーゼｐ74^raf-1、MAPキナーゼキナーゼ及び MAP キナーゼ^1-8 を含むシグナルカスケードの活性化を包括していることが示された。酵母Ｓ．ポンベ及びＳ．セレビジエにおいて、交配フェロモンに対する応答は脊椎動物 MAPキナーゼ^9- ¹² に相同な配列を有する Spk１及びKSS1／FUS3を利用する。哺乳動物^13-15 及びカエル¹⁶の MAPキナーゼキナーゼにとってのcDNAの近年のクローニングは spk１及びKSS1／FUS3のそれぞれの上流で機能すると考えられているＳ．ポンベ Byr１¹⁷ 及びＳ．セレビジエア STE７¹⁸キナーゼに対してそれらが相同性であることを示す。我々は、哺乳動物タンパク質が酵母経路の成分を代替できることを実証した。哺乳動物 MAPキナーゼキナーゼのみの発現はＳ．ポンベの byr１突然変異体を補完できなかった。しかしながら、MAPKK キナーゼ、例えば Raf又は Mosと一緒に共発現されたとき、MAPキナーゼはリン酸化により活性化され、そしてbyr1突然変異体の交配欠陥は救済される。このことは、これらの経路が機能的に類似であることを示唆し、そして Raf及び Mosキナーゼが MAPキナーゼキナーゼを直接リン酸化及び活性化することを示す。 byr1及び／又はbyr2活性を欠き、且つその欠陥が哺乳動物MAPKK キナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完される酵母は、MAPK経路の一又は別の経路を妨害する化合物についてのスクリーニング法において有用である。MAPKホスファターゼ遺伝子及び／又は哺乳動物MAPKも酵母の中に導入できる。試験物質は様々な成分の活性化剤及び阻害剤を同定するためにスクリーンされうる。このようにして同定された活性化剤及び阻害剤は、増殖障害に対する処置において有用な潜在的な治療剤である。本発明は当分野におけるそのような研究の有用な手段を供し、物質のスクリーニング及び潜在性を有するものの同定を助長する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アッシュワース，アランイギリス国，ロンドンエスダブリュ10 ９アールエフ，ドレイトンガーデンズ 88 (72)発明者ヒュー，デビッドアンソニーイギリス国，ロンドンエスダブリュ18 １ピーエー，ワンズワース，クロムフォードロード 67エー

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物MAPK経路の阻害剤である物質についてスクリーニングする方法であって：酵母 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遣伝子活性を欠き、且つその欠陥が哺乳動物 M APKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完される酵母を獲得し；この酵母を、その酵母のMAPK経路の活性化を通常もたらしめるであろう条件のもとで試験物質に曝露し；そしてこの酵母MAPK経路の活性化の指標である終点を探す；ことを含んで成り、ここでその終点の阻害はこの試験物質によるMAPK経路の阻害を指標するものである、方法。２．前記酵母がシゾサッカロマイセス・ポンベである、請求項１記載の方法。３．前記酵母MAPKが Spk１である、請求項１記載の方法。４．前記酵母がサッカロマイセス・セレビジエである、請求項１記載の方法。５．前記終点が、酵母の交配及び／又は胞子形成する能力である、請求項１〜４のいづれか１項記載の方法。６．前記終点が検出可能な物質の生産であり、その生産がMAPKの活性化により媒介される、請求項１〜４のいづれか１項記載の方法。７．前記終点が可視検出可能シグナルをもたらすレポーター遺伝子の発現である、請求項６記載の方法。８．前記レポーター遺伝子の発現が発色生成物をもたらす、請求項７記載の方法。９．前記哺乳動物遺伝子が野生型遺伝子の変異体である、先の請求項のいづれか１項記載の方法。 10．前記発現された MAPKKキナーゼ遣伝子が野生型遺伝子の変異体である、請求項９記載の方法。 11．前記発現された MAPKKキナーゼ遣伝子が野生型遺伝子の欠損変異体である、請求項10記載の方法。 12．前記哺乳動物 MAPKKキナーゼが rafである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 13．前記哺乳動物 MAPKKキナーゼが mosである、請求項１〜11のいづれか１項記載の方法。 14．先の請求項のいづれか１項に記載の方法による哺乳動物MAPK経路阻害性物質の同定の後、その物質の製造が続く方法。 15．請求項１〜13のいづれか１項に記載の方法による哺乳動物MAPK経路阻害性物質の同定の後、その物質の医薬品の調製における利用が続く方法。 16．前記医薬品が哺乳動物の抗増殖処置のためのものである、請求項15記載の方法。 17．医薬品として利用するための、哺乳動物MAPK経路の阻害剤としての、請求項１〜13のいづれか１項記載の方法を利用して同定された物質。 18．増殖障害、炎症障害、心臓血管障害又は神経障害の処置のための医薬品の製造における、哺乳動物MAPK経路の阻害剤としての請求項１〜13のいずれか１項記載の方法を利用して同定された物質の利用。 19．酵母 MAPKKキナーゼ及び／又は MAPKK遺伝子活性を欠き、その欠陥が哺乳動物 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完される、酵母。 20．シゾサッカロマイセス・ポンベに由来する請求項19記載の酵母。 21．サッカロマイセス・セレビジエに由来する請求項19記載の酵母。 22．哺乳動物 MAPとホスファターゼが発現されることのできる核酸を含む請求項19〜21のいづれか１項記載の酵母。 23．哺乳動物MAPK物質が酵母MAPKを代替している請求項19〜22のいづれか１項記載の酵母。 24．MAPKに対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用の阻害剤である物質をスクリーニングするための方法であって： MAPKKキナーゼ及び／又は MAPKK遺伝子活性を欠き、且つその欠陥が哺乳動物 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遺伝子の共発現により補完され、更には哺乳動物MAPK ホスホファターゼ遺伝子が発現可能である酵母を獲得し；この酵母を、その酵母のMAPK経路の活性化を通常もたらしめるであろう条件のもとで試験物質に曝露し；そしてこの酵母MAPK経路の活性化の指標である終点を探す；ことを含んで成り；ここでその終点の活性化はこの試験物質によるMAPKに及ぼすMAPKホスファターゼ作用の阻害を指標するものである、方法。 25．哺乳動物MAPK経路に対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす物質についてスクリーニングするための方法であって： MAPKKキナーゼ及び／又はMAPK活性を欠き、その欠陥が哺乳動物 MAPKKキナーゼ及び MAPKK遣伝子の共発現により補完され、更に哺乳動物MAPKホスファターゼ遺伝子が発現可能である酵母を獲得し；この酵母を、そのMAPKホスファターゼが発現され、且つ酵母MAPK経路が部分的に阻害される条件のもとで試験物質に曝露し；そしてこの酵母MAPK経路の活性化又は更なる阻害の指標である終点を探す；ことを含んで成り；ここで、この終点の活性化はこの試験物質によるMAPKホスファターゼ作用の阻害を指標するものであり、そしてこの終点の更なる阻害はこの試験物質によるMA PKホスファターゼ作用の活性化又はこの試験物質によるMAPK経路の阻害のいづれかを指標するものである、方法。 26．哺乳動物MAPKが酵母MAPKを代替している、請求項24又は25記載の方法。 27．前記酵母がシゾサッカロマイセス・ポンベである、請求項24〜25のいづれか１項記載の方法。 28．前記酵母がサッカロマイセス・セレビジエである、請求項24〜25のいづれか１項記載の方法。 29．前記終点が、酵母の交配及び／又は胞子形成する能力である、請求項24〜 28のいづれか１項記載の方法。 30．前記終点が検出可能な物質の生産であり、その生産がMAPKの活性化により媒介される、請求項24〜28のいづれか１項記載の方法。 31．前記終点が可視検出可能シグナルをもたらすレポーター遺伝子の発現である、請求項30記載の方法。 32．前記レポーター遺伝子の発現が発色生成物をもたらす、請求項31記載の方法。 33．前記哺乳動物遣伝子が野生型遺伝子の変異体である、請求項24〜32のいづれか１項記載の方法。 34．前記発現された MAPKKキナーゼ遺伝子が野生型遺伝子の変異体である、請求項33記載の方法。 35．前記発現された MAPKKキナーゼ遺伝子が野生型遺伝子の欠損変異体である、請求項34記載の方法。 36．前記哺乳動物 MAPKKキナーゼが rafである、請求項24〜35のいづれか１項記載の方法。 37．前記哺乳動物 MAPKKキナーゼが mosである、請求項24〜35のいづれか１項記載の方法。 38．請求項24〜37のいづれか１項に記載の方法による、MAPKに対する哺乳動物 MAPKホスファターゼ作用の阻害剤である、又は哺乳動物MAPK経路に対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす物質の同定の後、その物質の製造が続く方法。 39．請求項24〜37のいづれか１項に記載の方法による、MAPKに対する哺乳動物 MAPKホスファターゼ作用の阻害剤である物質、又は哺乳動物MAPK経路に対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす物質の同定の後、その物質の、医薬品の調製における作用が続く方法。 40．医薬品として利用するための、MAPKに対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用の阻害剤としての、又は哺乳動物のMAPK経路に対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす物質としての、請求項24〜37のいづれか１項記載の方法を利用して同定された物質。 41．増殖障害、炎症障害、心臓血管障害又は神経障害の処置のための医薬品の製造における、MAPKに対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用の阻害剤としての、又は哺乳動物のMAPK経路に対する哺乳動物MAPKホスファターゼ作用に影響を及ぼす物質としての、請求項24〜37のいづれか１項記載の方法を利用して同定される物質の利用。