JP2002532100A - スクリーニング法 - Google Patents

スクリーニング法

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JP2002532100A JP2000588383A JP2000588383A JP2002532100A JP 2002532100 A JP2002532100 A JP 2002532100A JP 2000588383 A JP2000588383 A JP 2000588383A JP 2000588383 A JP2000588383 A JP 2000588383A JP 2002532100 A JP2002532100 A JP 2002532100A
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Abstract

(57)【要約】 （ａ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと（ｂ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等である宿主酵母細胞以外の起源に由来するタンパク質キナーゼを異なる程度で阻害する化合物を同定する方法であって、化合物を１）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現し得るが、同等のタンパク質キナーゼを発現する能力はない第１の宿主酵母細胞および２）（ａ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）宿主酵母細胞以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２の宿主酵母細胞に曝して、酵母細胞の生存能力に対する化合物の作用を測定し、第１の酵母細胞と第２の酵母細胞の生存能力に異なる作用を及ぼす化合物を同定する方法。本方法は哺乳類または真菌タンパク質キナーゼを阻害する化合物を同定するスクリーニングに有用である。これらの化合物は医薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は薬剤またはリード化合物、酵素、酵素をコードするポリヌクレオチド
のスクリーニング法、ならびに酵素およびポリヌクレオチドの使用に関する。
【０００２】 タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）［１］（ＲＡＣキナーゼとも呼ばれる［２］
）はウイルス癌遺伝子産物ｖ−Ａｋｔ［３］の哺乳類相同体であり、従ってｃ−
Ａｋｔとも呼ばれている。現在のこの酵素における関心はいくつかの知見から来
ている。第一に、これはインスリンまたは増殖因子に応答して数分内に活性化し
、この活性化はホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）３−キナーゼ阻害
剤によって阻害される［４〜６］。ＰＫＢはグルコースやアミノ酸の取り込み刺
激、グリコーゲンやタンパク質の合成および心筋の解糖作用（［７，８］に総説
）、ならびに特異的遺伝子の転写調節［９、１０］をはじめとするインスリンの
いくつかの作用を媒介する可能性があるという証拠が増えてきている。第二に、
かなりのパーセンテージの卵巣癌や膵臓癌でＰＫＢβイソ型が［１１、１２］、
またいくらかの乳癌でＰＫＢαイソ型が過剰発現する。ＰＫＢは種々の経路で誘
導されるアポトーシスから細胞を保護する生存シグナルを与えると思われる（［
８、１３］に総説）。従って遺伝子の増幅およびその他のメカニズムによるＰＫ
Ｂの活性化は細胞外生存シグナルの不在下では活発であり得る悪性腫瘍の発生の
一因である可能性がある。
【０００３】 ＰＫＢはＡｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−配列に
あるセリンおよびトレオニン残基においてタンパク質およびペプチドをリン酸化
する［１４］。インスリンのシグナル変換においてＰＫＢの２つの生理学的基質
はタンパク質キナーゼであるグリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ３）［１５
、１６］と心臓のイソ型であるホスホフルクトキナーゼ−２（ＰＦＫ２）［８、
１７］である。ＰＫＢによるリン酸化はＧＳＫ３活性を阻害して脱リン酸化、な
らびにグリコーゲン合成およびタンパク質合成阻害因子ｅＩＦＢ２の活性化をも
たらす［１８］。これらのことはそれぞれグリコーゲン合成およびタンパク質合
成のインスリン誘導性刺激に寄与すると思われる。ＰＫＢは、心臓における解糖
作用のインスリン誘導性刺激と基礎であると思われる心臓のＰＦＫ２を活性化す
る。アポトーシスに対する細胞の保護において、ＢＡＤはＰＫＢの生理学的基質
の１つであると思われる。このタンパク質はその脱リン酸型型でＢｃｌファミリ
ーに属するＢｃｌＸＬと相互作用し、それによっていくつかの細胞でアポトーシ
スを誘導する。しかしながらＰＫＢがＳｅｒ１３６でＢＡＤをリン酸化すると、
それはＢｃｌＸＬから解離し、代わりに１４−３−３タンパク質と相互作用して
アポトーシスが回避される［１９］。
【０００４】 インスリンまたは増殖因子によるＰＫＢの活性化には２つの部位でリン酸化さ
れる必要がある［２０］。サブドメインVIIとVIIIの間の触媒ドメインの「活性
化ループ」にあるＴｈｒ３０８と、シグナル変換に重要な役割を果たすいくつか
のタンパク質キナーゼに存在する疎水性Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｈｅモチーフ中でＣ末端に極めて近いＳｅｒ４７３がある［２１］。両部
位のリン酸化はＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼ阻害剤によって阻害される［２０］。
Ｔｈｒ３０８は３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１（ＰＤＫ１
）によって［２２、２３］、またＳｅｒ４７３はＰＤＫ２活性を有するタンパク
質キナーゼによってリン酸化される。例えばＰＤＫ１のキナーゼドメインがＰＤ
Ｋ１相互作用断片（ＰＩＦ）と呼ばれるタンパク質キナーゼＣ関連キナーゼ２（
ＰＲＫ２）の領域またはＰｈｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅモチーフを有するその
他のポリペプチドと相互作用する場合には、ＰＤＫ１はＰＤＫ２活性を有する。
これはＰＤＫ１をＴｈｒ３０８でＰＫＢをリン酸化する形態から、Ｔｈｒ３０８
とＳｅｒ４７３の双方でＰＫＢをリン酸化する形態へ変換する(Balendran et al
(1999) Current Biology 9, 393-404)。
【０００５】 ＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼはホスファチジルイノシチド４，５ビスホスフェー
ト（ＰｔｄＩｎｓ［４，５］Ｒ２）をＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３へ変換し
、次にこれは１以上の５’−ホスファターゼによりＰｔｄＩｎｓ［３，４］Ｐ２ へと変換される。ＰＫＢはin vitroにてＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３または
ＰｔｄＩｎｓ［３，４］Ｐ２を含む脂質小胞の存在下でＰＤＫ１によって唯一活
性化できる［２２］。これらの３−ホスホイノシチドはＰＫＢのＮ末端のプレッ
クストリン相同（ＰＨ）ドメインと結合するが［２４、２５］、これはＴｈｒ３
０８がＰＤＫ１に接近できるようにそのコンホメーションを変更すると考えられ
る。ＰＤＫ１はまた、触媒ドメインのＣ末端側にＰＨドメインを有し［２３］、
これはＰＫＢのＰＨドメインよりもＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３およびＰｔ
ｄＩｎｓ［３，４］Ｐ２といっそう強く相互作用する［２６、８３］。ＰＤＫ１
と３−ホスホイノシチドとの相互作用は、おそらくは脂質小胞でＰＤＫ１とＰＫ
Ｂの相互作用を助けることによりin vitroでＰＫＢの活性化を促進する［２７］
。
【０００６】 ＰＤＫ１は、ＰＫＢのＴｈｒ３０８と同じ位置にあるトレオニン残基をリン酸
化することによって、in vivoでｐ７０ Ｓ６キナーゼ［２８］およびＰＫＣの
イソ型［２９］などのいくつかのタンパク質キナーゼを活性化するという証拠が
ふえている。これらのタンパク質キナーゼはまたＰＤＫ１リン酸化部位の１６０
〜１６５残基Ｃ末端側にある疎水性ＰＤＫ２共通配列を含む［８］。このように
ＰＤＫ１の他の基質もまたＰＤＫ２活性を有するタンパク質キナーゼによってリ
ン酸化される可能性がある。
【０００７】 発明者らは細胞の増殖に必要であると思われ、かつ、内因性酵母タンパク質キ
ナーゼを発現する能力のない酵母細胞を救うことができる（すなわち、それらの
増殖能を回復させる）哺乳類相同体を持ち得る酵母タンパク質キナーゼを同定し
た。哺乳類タンパク質キナーゼの機能的相同体であり得るこれらの酵母タンパク
質キナーゼの同定により、哺乳類相同体が関わるシグナル伝達経路の活性を調整
し得る化合物、または抗真菌剤として有用であり得る化合物を同定する方法の改
良が可能となる。
【０００８】 発明者らはＰＤＫ１の機能的相同体であり得る非哺乳類タンパク質、ならびに
その触媒ドメインがＰＫＢと７０％同一である酵素であるヒト血清および糖質コ
ルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）を同定した。
【０００９】酵母細胞を用いたスクリーニング法 本発明の第一の面は、 （ａ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと（ｂ）宿主酵母細胞タンパク質キナ
ーゼと同等である宿主酵母細胞以外の起源に由来するタンパク質キナーゼの活性
を異なる程度で調整する（好ましくは阻害する）化合物を同定する方法であって
、 化合物を １）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現し得るが、同等のタンパク質キナ
ーゼを発現する能力はない第１の宿主酵母細胞 および ２）（ａ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）
宿主酵母細胞以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２
の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の表現型に対する化合物の作用を測定し、以下のいずれかで
あることを特徴とする方法である： （１）宿主酵母細胞が病原性酵母であり、かつ、宿主酵母細胞以外の起源が宿
主酵母細胞以外のいずれの起源であってもよい または （２）宿主酵母細胞がいずれの酵母であってもよく、かつ、宿主酵母細胞以外
の起源が哺乳類ではない。
【００１０】 第１および第２の宿主酵母細胞は、細胞が本質的に同じである特徴は除いて指
定された特徴においてのみ実質的に異なると考えられる。このことによってその
酵母細胞の表現型に対する化合物の作用を、記載のようなタンパク質キナーゼの
活性を異なる程度で調整する化合物の作用に帰すことができるという合理的な予
測が確実なものとなる。このように第１および第２の宿主酵母細胞は同じ種に由
来するものであり、指定された特徴、すなわち宿主酵母細胞タンパク質キナーゼ
発現能および宿主酵母細胞以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼの発
現能を除いて実質的に同じ遺伝子内容を有する。第１および第２の宿主酵母細胞
は第１または第２の宿主酵母細胞の形成または選択に関する遺伝子内容（例えば
、当業者に十分公知であるような組換え技術に用いられる選択マーカー遺伝子）
において異なればよいと考えられる。
【００１１】 典型的には第１の酵母細胞および第２の酵母細胞の生存能力に異なる作用を及
ぼす化合物が同定される。さらに詳しくは、このようにして同定された化合物は
さらなる研究のために選択される。
【００１２】 「活性を異なる程度で調整する（好ましくは阻害する）」とは、（１）宿主細
胞タンパク質キナーゼが調整（阻害または活性化）されるが、その宿主酵母細胞
タンパク質キナーゼと同等な宿主酵母細胞以外の起源に由来するタンパク質キナ
ーゼが調整（阻害または活性化）されない、（２）宿主酵母細胞タンパク質キナ
ーゼは調整（阻害または活性化）されないが、その宿主酵母細胞タンパク質キナ
ーゼと同等な宿主酵母細胞以外の起源に由来するタンパク質キナーゼは調整（阻
害または活性化）される、さらに（３）両タイプのタンパク質キナーゼが調整（
阻害または活性化）されるが、一方のタイプが他方よりも、または異なる程度で
調整（阻害または活性化）されるという意味を含む。
【００１３】 調整は第１および第２の酵母細胞の表現型に対する作用により判断されると考
えられる。タンパク質キナーゼに対する化合物の作用は、検出されるいずれかの
調整のために認められる表現型を変化させるに十分なものでなければならない。
好ましくは、細胞の表現型に対するタンパク質キナーゼを調整する化合物の作用
は細胞の生存能力または増殖能における変化である。このように、宿主酵母細胞
タンパク質キナーゼが細胞の生存能力または増殖能にとって望ましいまたは必須
であることが好ましい。
【００１４】 「宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等な宿主酵母細胞以外の起源に由来す
るタンパク質キナーゼ」（「同等なタンパク質キナーゼ」）とは、少なくともい
くつかの態様において（すなわち少なくとも１つの表現型の特徴に関して）例え
ば宿主酵母細胞タンパク質キナーゼが同等のタンパク質キナーゼで置き換えられ
た細胞の生存能力または増殖能によって判断されるような、宿主酵母細胞タンパ
ク質キナーゼに代わりに機能し得る宿主酵母細胞以外の起源に由来するタンパク
質キナーゼを含む。従って「同等なタンパク質キナーゼ」とは、宿主酵母細胞に
特定の野生型の表現型、例えばある条件下での増殖能を付与する際に宿主酵母細
胞タンパク質キナーゼの代わりに機能し得るタンパク質キナーゼを含む。
【００１５】 例えば、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力がない酵母細胞があ
る条件下で実質的に増殖できず、かつ、同等なタンパク質キナーゼを発現し得る
宿主酵母細胞が同じ条件下で増殖できるのが好ましい。宿主酵母細胞タンパク質
キナーゼを阻害するが同等のタンパク質キナーゼは阻害しない化合物の存在下で
は、この第１の宿主酵母細胞は実質的に増殖できないが、第２の宿主酵母細胞は
増殖できると考えられる。同様に、同等のタンパク質キナーゼを阻害するが宿主
酵母細胞タンパク質キナーゼを阻害しない化合物の存在下では、第２の宿主細胞
は実質的に増殖できないと考えられる。
【００１６】 あるいは、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現し得る酵母細胞はこの宿主
酵母細胞タンパク質キナーゼを野生型の速度で細胞が増殖するには低いレベルで
、好ましくは細胞がある条件下では実質的に増殖できないレベルでしか発現せず
、かつ、同等のタンパク質キナーゼを発現し得る宿主酵母細胞がこの同等のタン
パク質キナーゼを野生型の速度で細胞が増殖するには低いレベルで、好ましくは
細胞が同じ条件下では実質的に増殖できないレベルでしか発現しないことが好ま
しい。宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを活性化するが同等のタンパク質キナー
ゼは活性化しない化合物の存在下では、この第１の宿主酵母細胞はよりよく増殖
できるが、第２の宿主酵母細胞は実質的になお増殖できないと考えられる。同様
に、同等のタンパク質キナーゼを活性化するが宿主酵母細胞タンパク質キナーゼ
は活性化しない化合物の存在下では、この第２の宿主細胞はよりよく増殖できる
が、第１の宿主酵母細胞は実質的になお増殖できないと考えられる。従って例え
ば、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼおよび同等のタンパク質キナーゼが調節可
能なプロモーターから発現され得るが、そのプロモーターの活性が抑制される条
件下で細胞が増殖し得る。例えば、ＧＡＬ１プロモーターは使用できる。ＧＡＬ
１プロモーターは当業者に公知であるようにグルコースの存在下で抑制される。
従って実施例１に記載のようにしてグルコースの存在下で細胞を増殖させると、
ＧＡＬ１プロモーターからの発現が低下する。
【００１７】 このように、酵母宿主細胞が宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等な宿主酵
母細胞以外の起源に由来するタンパク質キナーゼを十分なレベルで発現できない
限り、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力のない酵母宿主細胞は実
質的に増殖できないと考えられる。
【００１８】 タンパク質キナーゼまたは同等のタンパク質キナーゼに直接関わりのないメカ
ニズムによって、例えば細胞の生存能力または増殖能といった表現型に作用する
化合物は第１および第２の宿主酵母細胞に異なる作用を持つとは考えにくい。従
って第１および第２の宿主酵母細胞の双方に同じ作用を持つ（例えば、いずれの
細胞種にも作用しないか、あるいは両細胞種に有毒である）化合物はこれらの該
タンパク質キナーゼまたは同等のタンパク質キナーゼの活性に作用しないと考え
られるので、さらなる研究のために選択しないのがよい。例えばこの化合物は例
えば細胞膜の完全性に作用する非特異的細胞傷害剤であり得る。
【００１９】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼおよび同等のキナーゼの活性を調整し得る化
合物は第１および第２双方の宿主酵母細胞に同等の作用を持ち得ると考えられる
が、これらのタンパク質キナーゼまたは同等のタンパク質キナーゼに直接関わり
のないメカニズムによって表現型に作用する化合物からかかる化合物を識別する
試みは不可能であるか、便宜ではないと考えられる。
【００２０】 これらのタンパク質キナーゼまたは同等のタンパク質キナーゼに直接作用し得
る化合物を、他の細胞成分に作用し得るものから識別することができれば、それ
は例えば上記に示されたように有用であると考えられる。このように、かかる識
別を可能とする本発明の第１の態様の方法は、例えば同定されたいずれかの化合
物を使用しようとする場合にも有用であり、その化合物は同等のタンパク質キナ
ーゼを阻害し得る限り宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを阻害できない（または
その逆）という極めて重要な点は考慮されない。
【００２１】 このように例えば特定のヒトタンパク質キナーゼを阻害でき、従ってこのタン
パク質キナーゼの活性の上昇によって引き起こされる疾病または症状を持つヒト
を治療するのに有用であり得る化合物を同定しようとする場合、それが酵母にお
いて同等のタンパク質キナーゼを阻害しないということは必ずしも不可欠なこと
ではない。
【００２２】 同様に特定の酵母（例えば病原性酵母）タンパク質キナーゼを阻害でき、従っ
てその病原性酵母によって引き起こされる疾病または症状を持つヒトを治療する
のに有用であり得る化合物を同定しようとする場合（その化合物は、宿主酵母細
胞が非病原性酵母細胞、例えばＳ．セレビシエ(S. cerevisae)であり、同等のタ
ンパク質キナーゼが由来する起源が病原体であり得る酵母（例えばカンジダ(Can
dida)）である本発明の第１の態様に従ってスクリーニングすることによって同
定され得る）、その化合物の医療上の有用性にとって、それがＳ．セレビシエな
どの非病原性酵母において同等のタンパク質キナーゼを阻害しないということは
、必ずしも不可欠なことではない。
【００２３】 しかしながら、その他の状況下では、その化合物の医療上または園芸上の有用
性にとって、化合物が１）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを阻害し得るが、（
２）同等のタンパク質キナーゼを阻害する能力はない（またはその逆）というこ
とが望ましいか、または不可欠であると考えられる。例えば宿主酵母細胞が病原
性酵母細胞である場合には、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼは阻害するが、ヒ
トタンパク質キナーゼまたは植物タンパク質キナーゼなどの同等のタンパク質キ
ナーゼは阻害しない化合物が、例えば抗酵母（もしくは抗菌）薬または植物保護
製品として、また抗酵母（もしくは抗菌）薬または植物保護製品の設計に有用で
あり得る。
【００２４】 本発明のさらなる態様は、（ａ）第１の起源に由来するタンパク質キナーゼと
（ｂ）第２の起源に由来するタンパク質キナーゼの活性を（両タンパク質キナー
ゼは同宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等）異なる程度で調整する化合物を
同定する方法であって、 化合物を １）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第１
の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第１の宿主酵母細胞 および ２）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第２
の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の生存能力に対する化合物の作用を測定し、第１の酵母細胞
と第２の酵母細胞に異なる作用を及ぼす化合物を同定する方法を提供する。
【００２５】 本発明の本態様の方法によれば、第１の起源の細胞には作用を有するが第２の
起源の細胞には作用しない（またはその逆）化合物が同定できる。従って、第１
の起源が哺乳類、例えばヒトであり、第２の起源が寄生体または病原体（日和見
病原体を含む）、例えばカンジダ種などの酵母病原体であれば有用である。寄生
体、病原体および日和見病原体は当業者に十分公知であり、生物、好ましくは哺
乳類、いっそう好ましくはヒトの疾病または症状を引き起こす、または原因であ
り得る起源が含まれる。
【００２６】 寄生体または病原体は植物の寄生体または病原体であってもよいと考えられる
。従って、第１の起源が植物であり、第２の起源が植物に作用する、例えばさび
病を引き起こし得る寄生体または病原体であれば有用である。このような寄生体
または病原体に侵された植物を治療するには、あるいはこのような寄生体または
病原体に侵されようとする植物を予防するには、第１の起源の細胞には作用を持
たないが第２の起源の細胞には阻害作用を持つ化合物が有用であり得る。従って
、第１または第２の起源がともに哺乳類でないか、または第１または第２の起源
のいずれかが病原性酵母細胞であるのが好ましい。
【００２７】 第１および第２の起源はともに植物であってもよいと考えられ、第１の起源の
細胞と第２の起源の細胞に異なる作用を及ぼし得る化合物が選択的除草剤または
選択的生長促進剤として有用であり得る。従って例えば、第１の起源は単子葉植
物であり、第２の起源が双子葉植物であってもよい。
【００２８】 「〜に由来するタンパク質キナーゼ」とは、そのタンパク質がその起源の核酸
、例えばゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによってコードされていることを意味する
ものとする。従って例えば、ヒトに由来するタンパク質キナーゼはヒトゲノムの
一部またはヒトｍＲＮＡからコピーされるｃＤＮＡによってコードされているタ
ンパク質キナーゼであり得る。第１および第２の起源は第１および第２の生物由
来の組織であってもよいと考えられる。第１の起源に由来するタンパク質キナー
ゼは第２の起源に由来するタンパク質キナーゼと同一でないのが好ましい。この
タンパク質キナーゼは当業者には十分公知であるが、組織特異的すなわち組織に
よって限定されるイソ型であり得る。従って本発明の方法は、ある生物の第一の
組織（第１の起源）に由来するタンパク質キナーゼを、同じ生物の第２の組織に
由来する同等の（同一でない）タンパク質キナーゼとは異なる程度で調整／阻害
し得る化合物を同定するのに用いることができる。
【００２９】 本発明の好ましい具体例には、適当な非宿主酵母細胞起源のいずれもがヒトで
ある（すなわちタンパク質キナーゼがヒトに由来する）本発明の上記態様のいず
れかに従う方法が含まれる。
【００３０】 第１および第２の起源に由来するタンパク質キナーゼが密接に関係していれば
、第１の起源に由来するタンパク質キナーゼを阻害し得るが第２の起源に由来す
るタンパク質キナーゼは阻害しない（またはその逆）化合物を同定するのが難し
いことがわかるであろう。しかしながらこれらのタンパク質キナーゼが同一でな
ければかかる化合物を同定することができると考えられる。
【００３１】 これらの、また以下に記載される本発明のその他の態様では、本発明の実施に
おいて宿主酵母細胞として、あるいは宿主酵母細胞以外の起源として有用である
と考えられる酵母属の例としては、ピキア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharom
yces)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、トルロプシス(
Torulopsis)、ハンセヌラ(Hansenula)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyc
es)、シテロミセス(Citeromyces)、パキソレン(Pachysolen)、デバロミセス(Deb
aromyces)、メチュニコウィア(Metschunikowia)、ロドスポリジウム(Rhodospori
dium)、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)、ボトリオアスカス(Botryoascus)
、スポリジオボラス(Sporidiobolus)、エンドミコプシス(Endomycopsis)などが
挙げられる。
【００３２】 病原体酵母としては、カンジダ種、ブラストミセス(Blastmyces)種、例えばＢ
．デルマチチジス(B. dermatitidis)、コクシジオイデス(Coccidioides)種、例
えばＣ．イミチス(C. immitis)、ヒストプラズマ種、例えばＨ．カプスラタム、
スポロスリックス(Sporothrix)種、例えばＳ．シェンキー(S. schenckii)、アス
ペルギルス種、例えばアスペルギルス・フミガタス、Ａ．フラバス(A. flavus)
、Ａ．ニガー(A. niger)、フィアロフォラ・コンパクタ(Phialophora compacta)
（フォンセカエア・コンパクタ(Fonsecaea compacta)）、Ｐ．ペドロソイ(P. pe
drosoi)Ｆ．ペドロシ(F. pedrosi))、Ｐ．ヴェルコサ(P. verrucosa)、クラドス
ポリウム・カリオニ(Cladosporium carrionii)、リノクラジエラ・アクアスペル
サ(Rhinocladiella aquaspersa)、クリプトコッカス種、例えばクリプトコッカ
ス・ネオホルマンス、セファロスポリウム(Cephalosporium)種、フサリウム(Fus
arium)種、ヒストプラズマ種、例えばＨ．カプスラタム、ニューモシスチス・カ
リニ(Pneumocystis carinii)、リゾプス(Rhizopus)種、リゾムコル(Rhizomucor)
種、マドレラ(Madurella)種、例えば、Ｍ．ミセトマチス(M. mycetomatis)、Ｍ
．グリセア(M. grisea)、シューダレシェリア・ボイジ(Pseudallescheria boydi
i)、パラコクシジオイデス(Paracoccidioides)種、例えばＰ．ブラシリエンシス
(P. brasiliensis)、プロトセカ(Prototheca)種、例えばＰ．ウィッカーハミ(P.
wickerhamii)、エピデルモフィトン(Epidermophyton)種、ミクロスポラム(Micr
osporum)種、トリコフィトン(Trichophyton)種、ならびにマラセジア(Malassezi
a)種、例えばＭ．フルフル(M. furfur)（ピチロスポラム・オルビクラレ(Pityro
sporum orbiculare)）、が挙げられる。
【００３３】 「酵母」には「真菌類」を含めるものとし、特にアスペルギルス属、例えばア
スペルギルス・フミガタス、クリプトコッカス属、例えばクリプトコッカス・ネ
オホルマンス、およびヒストプラズマ属、例えばＨ．カプスラタムの病原性真菌
類を含めるものとする。
【００３４】 サッカロミセス種、例えばＳ．セレビシエは病原性酵母ではないと考えられる
。シゾサッカロミセス種、例えばＳ．ポンベは病原性酵母ではないと考えられる
。
【００３５】 単純な具体例では、宿主酵母細胞は、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼをコー
ドする遺伝子の突然変異によって宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能
力がないようにしてあると考えられる。典型的にはこの突然変異は活性のあるタ
ンパク質キナーゼの発現を妨げる突然変異であり、その突然変異が例えばタンパ
ク質キナーゼをコードする遺伝子の総てまたは一部の欠失をそのままでは回復で
きないものであることが特に好ましい。
【００３６】 非宿主酵母細胞起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る宿主酵
母細胞は、好適な酵母にその同等のタンパク質キナーゼをコードし、かつ発現し
得る遺伝子構築体を導入することによって最も便宜に作出される。
【００３７】 宿主酵母細胞親株は野生型であってよいと考えられる。例えば、宿主酵母細胞
として特にＳ．セレビシエに関しては、Ａｄｅ−またはｌｅｕ−またはＵｒａ− 変異を含む突然変異株を親株として用いてプラスミドの取り込みの選択を可能と
することができる。
【００３８】 非宿主酵母細胞タンパク質キナーゼの発現には構成プロモーターまたは誘導プ
ロモーターを用いてもよいと考えられる。当業者に十分公知の構成プロモーター
の例としてはａｄｈまたはＳＶ４０プロモーターがある。上記および実施例１に
考察されるように、ＧＡＬ１プロモーターを用いてもよい。あるいは、宿主酵母
細胞タンパク質キナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターを用いて非宿主
酵母細胞タンパク質キナーゼを発現させてもよい。例えば、Ｐｋｈ１またはＰｋ
ｈ２遺伝子由来のこれらのプロモーターは実施例１に記載されたようにして使用
すればよい。
【００３９】 外生ポリヌクレオチドは酵母内で安定して維持されるのが好ましい。必ずしも
不可欠ではないが、外生ポリヌクレオチドが酵母ゲノムに安定して組み込まれる
ことがさらに好ましい。
【００４０】 細胞宿主の形質転換は十分公知の技術によって達成されが、その方法は典型的
には用いるベクターのタイプと宿主細胞によって異なる。サッカロミセスおよび
関連細胞の形質転換はSherman et al (1986) Methods in Yeast Genetics, a La
boratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている、Beggs (1978) Na
ture 275, 104-109の方法も有用であろう。シゾサッカロミセス・ポンベはＬｉ
Ｃｌ処理後に形質転換してもよいし、エレクトロポレーションによって形質転換
してもよい。
【００４１】 便宜には、Ｓ．ポンベ細胞のエレクトロポレーションにはＢｉｏ−Ｒａｄパス
ル・コントローラーを用いてもよい。酵母のエレクトロポレーション技術はBeck
er & Guarente (1990) Meth Enzymol 194, 182に開示されている。
【００４２】 Ｓ．セレビシエは例えば実施例１に記載のものと同様の方法で形質転換しても
よい。
【００４３】 本発明の第１の態様に関しては、宿主酵母細胞がタンパク質キナーゼＰｋｈ１
および／またはＰｋｈ２を発現できないことが特に好ましい。
【００４４】 従って本発明のさらに好ましい具体例は、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼが
Ｐｈｋ１および／またはＰｋｈ２である本発明の方法であり、ここで、Ｐｈｋ１
はＳ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹＤＲ４９０ｃまたはＳ．セ
レビシエ以外の酵母の同等のオープンリーディングフレームによってコードされ
るポリペプチドであって、Ｐｈｋ２はＳ．セレビシエのオープンリーディングフ
レームＹＯＬ１００ｗまたはＳ．セレビシエ以外の酵母の同等のオープンリーデ
ィングフレームによってコードされるポリペプチドである。
【００４５】 Ｓ．セレビシエ由来のＰｋｈ１は以下のアミノ酸配列を有すると考えられる：
【化１】 （７６６アミノ酸完全配列）。
【００４６】 Ｓ．セレビシエ由来のＰｋｈ１は以下のヌクレオチド配列によりコードされる
と考えられる：
【化２】 （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号９２７７４５；２３０１ｂｐ完全配列）。
【００４７】 Ｓ．セレビシエ由来のＰｋｈ２は以下のアミノ酸配列を有すると考えられる：
【化３】 （１０８１アミノ酸完全配列）。
【００４８】 Ｓ．セレビシエ由来のＰｋｈ２は以下のヌクレオチド配列によりコードされる
と考えられる：
【化４】 （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号１４１９９５２；３２４７ｂｐ完全配列）。
【００４９】 Ｓ．セレビシエ以外の同等のオープンリーディングフレームは以下に記載され
るような当業者に十分公知の方法によって同定できる。
【００５０】 シゾサッカロミセス・ポンベ由来のＫＳＧ１遺伝子（ＰＤＫ１様）は以下のア
ミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードすると考えられる：
【化５】 （＞ｇｉ｜３３４１４８８｜ｇｎｌ｜ＰＩＤ｜ｅ１３１２２５９タンパク質キナ
ーゼ Ｓ．ポンベ）。
【００５１】 Ｓ．ポンベ由来のＫＳＧ１遺伝子は以下のヌクレオチド配列を含んでなると考
えられる：
【化６】 （＞ｇｉ｜３３４１４８７｜ｅｍｂ｜Ｘ９９２８０｜ＳＰＫＳＧ１ Ｓ．ポンベ
ＫＳＧ１遺伝子（ＰＤＫ１様））。
【００５２】 Ｓ．ポンベの第２のＰＤＫ１様遺伝子（ＳＰＢＣ４Ｃ３．１１）は以下のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードすると考えられる：
【化７】 （＞ｇｉ｜２８３２８９２｜ｇｎｌ｜ＰＩＤ｜ｅ１２４９７６８推定タンパク質
キナーゼホスホリラーゼ）。
【００５３】 Ｓ．ポンベの第２のＰＤＫ１様遺伝子（ＳＰＢＣ４Ｃ３．１１）は以下のヌク
レオチド配列を含むと考えられる：
【化８】
【００５４】 Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２とは、それぞれＰＫＢ活性化キナーゼ相同体(PKB-act
ivating Kinase Homologues)１および２のことである。実施例１に記載されるよ
うに、Ｐｋｈ１またはＰｈｋ２のいずれかまたは双方を発現し得る酵母（例えば
Ｓ．セレビシエ）細胞は増殖可能であるが、Ｐｋｈ１またはＰｈｋ２をいずれも
発現できない酵母（例えばＳ．セレビシエ）細胞は増殖できない。
【００５５】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等である宿主酵母細胞以外の起源に由来
するタンパク質キナーゼ、例えばＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２はＰＤＫ１、
例えば哺乳類、好ましくはヒトＰＤＫ１であってもよい。実施例１に記載される
ように、Ｐｋ１またはＰｋ２をいずれも発現できない酵母（例えばＳ．セレビシ
エ）細胞は、ヒトＰＤＫ１を発現できるならば増殖することができよう。
【００５６】 ＰＤＫ１は植物ＰＤＫ１であってもよい。植物ＰＤＫ１の例としては以下のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る：
【化９】 （４９２アミノ酸完全配列）。
【００５７】 本発明のさらなる態様は上記アミノ酸配列またはその変異体、断片、融合体も
しくは誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体を含んでなる
実質的に純粋なポリペプチドであると考えられる。
【００５８】 このアミノ酸配列は以下の核酸配列によりコードされると考えれる：
【化１０】 （１４７６ｂｐ完全配列）。
【００５９】 本発明のさらなる態様は、上記ヌクレオチド配列を含んでなる組換えポリペプ
チド、または上記ポリペプチドをコードするまたは上記ポリペプチドを発現する
のに好適な組換えポリペプチドであると考えられる。
【００６０】 本発明のなおさらなる具体例は、宿主酵母細胞タンパク質キナーゼがＹｐｋ１
および／またはＹｐｋ２である本発明の方法である。Ｙｐｋ１およびＹｐｋ２遺
伝子の同定は参照文献４１〜４３に記載されている。
【００６１】 Ｓ．セレビシエ由来のＹｐｋ１は以下のアミノ酸配列を含むと考えられる：
【化１１】 （６８０アミノ酸完全配列）。
【００６２】 Ｓ．セレビシエ由来のＹｐｋ１は以下のヌクレオチド配列によりコードされる
と考えられる：
【化１２】 （Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号４８６２１３；２０４３ｂｐ完全配列）。
【００６３】 Ｓ．セレビシエ由来のＹｋｒ２（Ｙｐｋ２としても知られる）は以下のアミノ
酸配を含むと考えられる：
【化１３】 （６７７アミノ酸完全配列）。
【００６４】 Ｓ．セレビシエ由来のＹｋｒ２（Ｙｐｋ２としても知られる）は以下のヌクレ
オチド酸配によりコードされると考えられる：
【化１４】 （Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号８１７８６２；２０３４ｂｐ完全配列）。
【００６５】 実施例１に記載されるように、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２のいずれかまたは双方
を発現し得る酵母（例えばＳ．セレビシエ）細胞は増殖可能であるが、Ｙｐｋ１
またはＹｋｒ２をいずれも発現できない酵母（例えばＳ．セレビシエ）細胞はあ
る条件下では増殖できない。
【００６６】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等である宿主酵母細胞以外の起源に由来
するタンパク質キナーゼ、例えばＹｐｋ１またはＹｋｒ２は血清および糖質コル
チコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）、例えば哺乳類、好ましくはヒト
ＳＧＫであってもよい。実施例１に記載されるように、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２
をいずれも発現できない酵母（例えばＳ．セレビシエ）細胞は、ヒトＳＧＫを発
現できれるならば増殖することができよう。
【００６７】 ラットＳＧＫはぞれぞれ図１２および１３に示されるヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列を持ち得る。ＳＧＫとはＳＧＫのイソ型、例えばWebster et al (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 1031-2040およびKobayashi et al (1999) Biochem J 34
4 (Pt 1), 189-197ならびに受託番号ＡＡＤ４１０９１、ＡＦ１６９０３４およ
びＡＦ１６９０３５としてEMBLデータベースレコードに見られるＳＧＫ１、２お
よび３を含む。
【００６８】 Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２をいずれも発現できない酵母（例えばＳ．セレビシエ
）は高レベルのＰＫＢを発現できるならば、すなわち実施例１に記載のように、
細胞がＰＫＢを発現し得るプラスミドの高い集積を持つならば増殖可能であるの
で、ＰＫＢもＹｐｋ１またはＹｋｒ２と同等ないくらかの活性を持ち得る。ある
いは、ＰＫＢをより低いレベルでしか発現しない細胞の増殖能はＰＫＢ活性のア
クチベーターの存在下で細胞を増殖させることによって高まり得る。
【００６９】 本発明のさらなる態様は、第１の起源に由来するＰＤＫ１の活性を調整する（
阻害するまたは高める）化合物を同定する方法であって、化合物を １）（ａ）ヒトＰＤＫ１（Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２であってよい）の機能的同
等物である酵母ポリペプチドを発現する能力はないが、（ｂ）第１の起源に由来
するＰＤＫ１を発現し得る第１の宿主酵母細胞 および所望により ２）ヒトＰＤＫ１（Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２）の機能的同等物である
酵母ポリペプチドを発現し得る第２の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の生存能力に対する化合物の作用を測定し、第１の酵母細胞
の生存能力に作用する、または所望により第１の酵母細胞および第２の酵母細胞
の生存能力に違った作用を及ぼす化合物を同定する方法である。
【００７０】 本発明のさらなる態様は、第１の起源に由来するＹｐｋ１および／またはＹｋ
ｒ２の機能的同等物、例えばＳＧＫまたはＰＫＢ、好ましくはヒトＳＧＫまたは
ヒトＰＫＢの活性を調整する（阻害するまたは高める）化合物を同定する方法で
あって、 化合物を １）（ａ）Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物である酵母ポリペ
プチドを発現する能力はないが、（ｂ）第１の起源に由来するＹｐｋ１および／
またはＹｒｋ２の機能的同等物（例えば、ＳＧＫ）を発現し得る第１の宿主酵母
細胞 および所望により ２）Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物である酵母ポリペプチド
（例えば、内因性ポリペプチド）を発現し得る第２の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の生存能力に対する化合物の作用を測定して、第１の酵母細
胞の生存能力に作用する、または所望により第１の酵母細胞および第２の酵母細
胞の生存能力に違った作用を及ぼす化合物を同定する、方法。
【００７１】 本発明の第１の態様については、細胞が本質的に同じである特徴は除いて指定
された特徴においてのみ実質的に異なると考えられる。このことによってその酵
母細胞の表現型に対する化合物の作用を、記載のようなタンパク質キナーゼの活
性を異なる程度で調整する化合物の作用に帰すことができるという合理的な予測
が確実なものとなる。このように第１および第２の宿主酵母細胞は同じ種に由来
するものであり、指定された特徴、すなわち宿主酵母細胞タンパク質キナーゼ発
現能および宿主酵母細胞以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼの発現
能を除いて実質的に同じ遺伝子内容を有する。第１および第２の宿主酵母細胞は
第１または第２の宿主酵母細胞の形成または選択に関する遺伝子内容（例えば、
当業者に十分公知であるような組換え技術に用いられる選択マーカー遺伝子）に
おいて異なればよいと考えられる。
【００７２】 第１の細胞が発現し得るＰＤＫ１またはＳＧＫまたはＳＫＢは全長ＰＤＫ１ま
たはＳＧＫまたはＰＫＢではなくてもよいと考えられ、例えば適当であれば末端
切断型ＰＤＫ１またはＳＧＫであってもよい。本発明に記載のように、全長ＰＤ
Ｋ１またはＳＧＫまたはＳＫＢでないＰＤＫ１またはＳＧＫまたはＳＫＢ（活性
型または非活性型のいずれか）はいずれも全長ＰＤＫ１またはＳＧＫまたはＳＫ
Ｂ（活性型または非活性型のいずれか）の酵素活性の少なくとも１０、２０、３
０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％を有せばよい。
【００７３】 しかしながら、上記の本発明の方法においては、適切なタンパク質キナーゼ、
例えばＰＤＫ１またはＳＧＫの活性をin vivoで調整（活性化または阻害を含む
）し得る化合物を同定するのが望ましいと考えられる。このように本方法に用い
られる試薬および条件はタンパク質キナーゼとその基質および調節タンパク質／
基質の間の相互作用が実質的にin vivoと同じように選択すればよいと理解され
る。
【００７４】 本発明のこれらの方法は、本発明の第１および第２の態様に関して上記された
ものと同様して例えばＰＤＫ１、ＳＧＫまたはＰＫＢのアクチベーターを同定す
るのに使用できると考えられる。このように、第１の酵母細胞は本方法で用いら
れる増殖条件下でＹｐｋ１、Ｙｐｋ２、Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能
的同等物（例えば、ＰＤＫ１、ＳＧＫまたはＰＫＢ）を、酵母細胞が野生型細胞
のレベルで増殖できるに必要なレベルより低いレベルで、好ましくは酵母細胞が
実質的に増殖できるに必要なレベルより低いレベルで発現し得る。機能的同等物
（例えば、ＰＤＫ１、ＳＧＫまたはＰＫＢ）のアクチベーターの存在下では、こ
の機能的同等物の活性のレベルはこの酵母細胞が同じ増殖条件下でよりよく増殖
できる、好ましくは実質的に増殖できるに十分なものであればよい。上記および
実施例１で論じられるように、この機能的同等物は調節プロモーター、例えばグ
ルコースの存在下で抑制されるＧＡＬ１プロモーターから発現し得る。
【００７５】 任意の第２の酵母細胞は酵母ポリペプチド（例えば内因性ポリペプチド）のア
クチベーターが存在しなければ、同様に実質的に増殖できないと考えられる。酵
母ポリペプチドは上記および実施例１に論じられるように、異種プロモーター、
例えばＧＡＬ１プロモーターから発現してもよい。
【００７６】 上記方法において任意の第２の標的細胞の使用にはあまり重要でない標的細胞
の増殖を高める（逆に増殖を低下させる）能力に基づいて化合物を同定する際に
は「標的」ポリペプチド（例えば、Ｙｐｋ１、Ｙｋｒ２、Ｐｋｈ１および／また
はＰｋｈ２の機能的同等物（ＰＤＫ１、ＳＧＫまたはＰＫＢであり得る））に作
用しない化合物は細胞増殖を高める所望の作用を有するとは考えにくい。上記の
ように「非特異的」メカニズムによって作用する化合物は細胞増殖の低下により
作用する。
【００７７】 宿主酵母細胞および同等のタンパク質キナーゼの起源について好ましいものと
しては、本発明の上記態様に関して示されたものと同じであってよい。
【００７８】 本明細書に記載の方法（これは薬剤スクリーニングと考えられる）において、
当業者に公知の用語の化合物とは、薬剤様化合物または薬剤様化合物の開発のた
めのリード化合物であってよい。
【００７９】 「薬剤様化合物」は当業者に十分公知であり、薬剤、例えば医薬中の有効成分
として用いるのに好適なものとする特徴を有する化合物を意味するものとする。
従って例えば、薬剤様化合物は有機化学の技術により、あまり好ましくはないが
分子生物学または生化学の技術によって合成し得る分子であってよく、好ましく
は５０００ダルトン未満で水溶性である小分子である。薬剤様化合物はさらに特
定のタンパク質との選択的相互作用の特徴を示し、バイオアベラビリティーを持
ち、および／または標的細胞膜を透過する能力を持つが、これらの特徴は必ずし
も不可欠なものではないと考えられる。
【００８０】 「リード化合物」も同様に当技術分野で十分公知であり、それ自体は薬剤とし
ての使用に適さないが（例えば、意図する標的に対して弱い効力しか持たなかっ
たり、その作用が非選択的であったり、不安定であったり、溶解度が低かったり
、合成が困難であったり、またはバイオアベラビリティーが低かったりといった
理由のため）、より好ましい特徴を有するその他の化合物の設計の起点となる化
合物を意味するものとする。
【００８１】 この化合物は植物保護剤としての使用にも好適であるし、または植物保護剤と
しての使用に好適な化合物の開発のためのリード化合物でもあり得る。かかる化
合物は薬剤様化合物に関して上記されたものと同様の特徴を有するものと考えら
れる。細胞を用いて行われる方法またはスクリーニングによって同定され得る化
合物は細胞と相互作用し得る、または細胞に入り込むことができると考えられる
。
【００８２】 あるいは、これらの方法は当業者に十分公知の用語であるが「ライブラリース
クリーニング」法として用いてもよい。従って例えば本発明の方法はＹｐｋ１、
Ｙｋｒ２、Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能的同等物、例えばＰＤＫ１、
ＳＧＫまたはＰＫＢのポリペプチドアクチベーターを発現し得るポリヌクレオチ
ドを検出（および所望により同定）するのに使用してもよい。以下に記載される
ように好適なベクター中の発現ライブラリーのアリコートを、本方法で用いられ
る増殖条件下でＹｐｋ１、Ｙｋｒ２、Ｐｋｈ１および／またはＰｋ２の機能的同
等物（例えば、ＰＤＫ１、ＳＧＫまたはＰＫＢ）を、酵母細胞が野生型細胞のレ
ベルで増殖するのに必要なレベルより低いレベルで、好ましくは酵母細胞が実質
的に増殖するのに必要なレベルより低いレベルで発現する第１の酵母細胞の増殖
を増加する能力に関して試験してもよい。機能的同等物（例えば、ＰＤＫ１、Ｓ
ＧＫまたはＰＫＢ）のポリペプチドアクチベーターを発現するポリヌクレオチド
の存在下では、機能的同等物の活性のレベルはこの酵母細胞が同じ増殖条件下で
よりよく増殖できる、好ましくは実質的に増殖できるに十分なものであればよい
。上記および実施例１で論じられるように、この機能的同等物は調節プロモータ
ー、例えばグルコースの存在下で抑制されるＧＡＬ１プロモーターから発現し得
る。
【００８３】 必要とされる特性を有するポリヌクレオチドの単一種を同定するためには、必
要とされる特性を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドプール
を同定し、次ぎにこれらのポリヌクレオチドを再びスクリーニングするという数
サイクルが要されると考えられる。
【００８４】 Ｙｐｋ１、Ｙｋｒ２、Ｐｋｈ１および／またはＰｋ２の機能的同等物をコード
するポリヌクレオチドを、機能的同等物のアクチベーターをコードするポリヌク
レオチドから識別するためには、さらなる試験および／または配列解析が要され
ると考えられる。
【００８５】 ポリヌクレオチドを宿主酵母細胞へ導入する方法は当業者に十分公知である。
スクリーニングに好適な発現ライブラリーを作製する方法も当業者に十分公知で
ある。ライブラリーは好ましくは宿主酵母細胞で発現される機能的相同物と同じ
起源に由来するものであり、すなわちヒト発現ライブラリーは、ヒトＰＤＫ１、
ＳＧＫまたはＰＫＢを細胞増殖に必要とされる閾値より低いレベルで発現する酵
母細胞に対する作用に関してスクリーニングすればよい。
【００８６】 上記化合物／ライブラリースクリーニング法は便宜には９６ウェルマイクロタ
イタープレート方式で行ってよい。本発明の方法で用いられる宿主酵母細胞の特
性を有するサッカロミセス・セレビシエ細胞などの酵母細胞をピックアップして
要すれば補給した最小培地中の液体培養に入れればよい（例えば実施例１に記載
）。この培養物を増殖させ、次ぎに５９５ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）が０．０１
〜０．１となるまで希釈すればよい。次ぎにこの希釈培養物を個々の試験化合物
を含む滅菌９６ウェルマイクタイタープレートのウェルへ分注する。細胞の増殖
はＯＤ５９５が対照培養物（すなわち試験化合物の存在下で培養したもの）の約
〜０．８に達するまで経時的にモニターする。ＯＤ５９５はマイクロタイタープ
レートリーダーを用いて測定する。対照培養物は試験化合物を溶解するのに用い
た溶媒のアリコートを含む。従って例えば試験化合物はジメチルスルホキシド（
ＤＭＳＯ）に溶解してもよく、従って試験培養物および対照培養物に双方はＤＭ
ＳＯを例えば０．１〜５％の間、好ましくは約１容量％〜２容量％で含んでもよ
い。
【００８７】 あるいは、これらの細胞は固体培地で増殖させて、コロニーの有無、数および
／または大きさ（またはその他の特性）を検出してもよい。これは高処理量方式
、例えばマイクロタイタープレートに実施してもよいと考えられる。コロニーの
有無、数および／または大きさ（またはその他の特性）は目視によって検出して
もよいし、コンピューター画像解析をはじめ手動または自動技術のいずれかによ
って検出してもよい。
【００８８】 当業者に公知のように応答の測定は選択された化合物に関してなされればよい
と考えられる。
【００８９】 適当であれば、二反復の化合物プレートを特定の酵母培養物のアリコート（固
形培養物を含む）に曝してもよいし、種々の酵母培養物のアリコートに曝しても
よい。本発明の方法に記載されるように、例えば、かかるプレートの１つを野生
型（適当であればＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１、Ｙｒｋ１）酵母細胞にさらし
、かかるプレートの他のものを適当であればＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１、Ｙ
ｒｋ２に関して変異があるが、例えばヒト同等物（ＰＤＫ１はＰｋｈ１およびＰ
ｋｈ２のヒト同等物であって、ＳＧＫおよびＰＫＢはＹｐｋ１およびＹｒｋ２の
ヒト同等物である）を発現する細胞に曝してもよい。
【００９０】酵母細胞 本発明のさらなる態様は、Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２またはその機能的同等物の
いずれかを発現する能力のない酵母細胞である。かかる細胞は増殖できない、す
なわち生存能力が限定されていると考えられる。
【００９１】 本発明のさらなる態様は、内因性Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２を発現する
能力のない酵母細胞である。この酵母細胞はその酵母細胞が由来する野生型酵母
細胞に内因するＰｋｈ１またはＰｋｈ２ではないＰｋｈ１および／またはｐｋｈ
２の機能的同等物を発現し得る。この機能的同等物はヒトＰＤＫ１またはその変
異体、融合体もしくは誘導体、例えば実施例１に示されるようにＰＤＫ１−ΔＰ
Ｈであってもよい。ＰＤＫ１またはＰＤＫ１−ΔＰＨは、実施例 １に示される
ように、Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２と同じ、酵母細胞の生存能力に不可欠な標的基
質をリン酸化し得る。この細胞はＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能的同等
物を野生型の細胞生存能力に必要なレベルよりも低いレベル、例えば細胞が所定
の条件下では実質的に増殖できないレベルでは所定の条件下で発現することがで
きないと考えられる。
【００９２】 このように、酵母細胞はＳ．セレビシエ由来のＰｋｈ１を発現する能力のない
Ｓ．セレビシエ細胞、またはＳ．セレビシエ由来のＰｋｈ２を発現する能力のな
いＳ．セレビシエ細胞、またはＳ．セレビシエ由来のＰｋｈ１およびＰｋｈ２を
発現する能力のないＳ．セレビシエ細胞であってよい。あるいは、この酵母細胞
は、その酵母種の野生型細胞で発現されるＰｋｈ１（Ｓ．セレビシエ由来のＰｋ
ｈ１の内因性機能的同等物であってもよい）を発現する能力のない、またはその
酵母種の野生型細胞で発現されるＰｋｈ２（Ｓ．セレビシエ由来のＰｋｈ２の内
因性機能的同等物であってもよい）を発現する能力のない、またはその酵母種の
野生型細胞で発現されるＰｋｈ１およびＰｋｈ２を発現する能力のない（すなわ
ちＳ．セレビシエ由来のＰｋｈ１およびＰｋｈ２の内因性機能的同等物をいずれ
も発現する能力のない）種々の酵母種の細胞であってもよい。
【００９３】 Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２または内因性の機能的同等物を発現する能力のない酵
母細胞は当業者に公知の方法によって作出され得る。例えば、ＰｋｈまたはＰｋ
ｈ２のいずれかをコードするオープンリーディングフレームは、例えば実施例１
に記載されるように、選択マーカーの挿入によって分断されてもよい。
【００９４】 本発明のさらなる態様は、ＰＤＫ１の機能的同等物、例えばヒトＰＤＫ１をコ
ードする１以上の遺伝子が、（ヒト）ＰＤＫ１の機能的同等物を発現できないよ
うに変異されている酵母細胞である。ヒトＰＤＫ１の機能的同等物をコードする
かかる遺伝子は各々、酵母細胞が（ヒト）ＰＤＫ１の機能的同等物を発現できな
いように変異させてもよい。かかる（ヒト）ＰＤＫ１の機能的同等物は例えばＳ
．セレビシエ細胞のＰｋｈ１またはＰｋｈ２であってもよい。
【００９５】 Ｓ．セレビシエ以外の酵母種の細胞は、Ｓ．セレビシエ由来のＰｋｈ１および
／またはＰｋｈ２の少なくとも部分的な機能的同等物である１、２、３、４また
はそれ以上のポリペプチドを発現し得ると考えられる。さらに、本発明の酵母細
胞はこれらのポリペプチドの１、２、３、４もしくはそれ以上、または総てを発
現する能力のないかかる酵母細胞種の細胞を含むものと考えられる。
【００９６】 Ｐｋｈ、Ｐｋｈ２、およびＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能的同等物で
あるいずれかのポリペプチドは哺乳類、好ましくはヒトＰＤＫ１の機能的同等物
であり得ると考えられる。従って本発明は、ヒトＰＤＫ１の機能的同等物をコー
ドする野生型酵母細胞に存在する１以上の遺伝子が、酵母細胞がヒトＰＤＫ１の
機能的同等物を発現できないように変異されている酵母細胞を含む。ヒトＰＤＫ
１の機能的同等物をコードする野生型酵母細胞に存在するかかる遺伝子は各々、
酵母細胞がヒトＰＤＫ１の機能的同等物を発現することができないように変異さ
れている。
【００９７】 本発明の本態様の酵母細胞は、Ｐｋｈ１またはその機能的同等物および／また
はＰｋｈ２またはその機能的同等物の配列を有するポリペプチドを発現する能力
のない酵母細胞を含む。Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２の機能的同等物をいずれも発現
する能力のない酵母細胞は、野生型酵母細胞、すなわちＰｋｈ１および／または
Ｐｋｈ２の機能的同等物を発現し得る酵母細胞のように細胞増殖および／または
分裂できないと考えられる。Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能的同等物は
Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２をリン酸化し得る。ＰＤＫ１またはその適当な
変異体、誘導体、断片または融合体、あるいはＹｐｋ１および／またはＹｋｒ２
をリン酸化し得るその変異体、誘導体または断片の適当な融合体はＰｋｈ１およ
び／またはＰｋｈ２の機能的同等物であり得る。
【００９８】 本発明のさらなる態様は、野生型酵母細胞に由来するＰｋｈ１またはＰｋｈ２
ではない、すなわちＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２の内因性機能的同等物であ
るＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能的同等物を発現し得る酵母細胞である
。Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機能的同等物は哺乳類、好ましくはヒト、
ＰＤＫ１またはその適当な変異体、誘導体、断片もしくは融合体、またはＹｐｋ
１および／またはＹｋｒ２をリン酸化し得るその変異体、誘導体もしくは断片の
適当な融合体であってもよい。かかる酵母細胞は実施例１に記載されている。か
かるＰｋｈ１またはＰｋｈ２の機能的同等物は種々の酵母種、例えば病原型酵母
種由来のＰｋｈ１またはＰｋｈ２であってもよく、従ってこの酵母細胞は（１）
Ｓ．セレビシエＰｋｈ１またはＳ．セレビシエＰｋｈ２を発現する能力はないが
、（２）カンジダＰｋｈ１またはカンジダＰｋｈ２を発現し得るＳ．セレビシエ
細胞であってもよい。
【００９９】 従って本発明の酵母細胞は、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２の機能的同等物をコード
する野生型遺伝子がポリペプチドＰｋｈ１またはＰｋｈ２の機能的同等物を発現
することがでいないように変更されている酵母細胞であってもよい。従ってこの
酵母細胞は野生型酵母細胞のオープンリーディングフレームＹＤＲ４９０ｃによ
ってコードされているポリペプチドが発現することがでいないか、および／また
は野生型酵母のオープンリーディングフレームＹＯＬ１００ｗによってコードさ
れているポリペプチドが発現することができないＳ．セレビシエ細胞であっても
よい。
【０１００】 この遺伝子は選択マーカーの挿入によって分断される遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームによって改変してもよい。実施例１に記載されるように、マーカ
ーはＴＲＰ１またはＨＩＳ３であってよい。
【０１０１】 配列のさらなる態様は、ＰＤＫ１、例えば哺乳類、好ましくはヒトＰＤＫ１の
活性を調整（増強または阻害を含む）する化合物を同定する方法であり、ここで
は本発明に従う酵母細胞が用いられる。
【０１０２】 本発明のさらなる態様は、ＰＤＫ１の活性を調整（活性化または阻害）する化
合物を同定する方法における本発明の酵母細胞の使用である。
【０１０３】 ＰＤＫ１としては、哺乳類、好ましくはヒトＰＤＫ１、および別の起源、好ま
しくは哺乳類、好ましくはヒトに対して病原性であり得る起源（日和見病原体を
含む）に由来するＰＤＫ１の機能的同等物が含まれる。従って、病原性酵母、例
えばカンジダ由来のＰＤＫ１の機能的同等物が含まれる。かかる機能的同等物は
Ｓ．セレビシエにおいて同定されているＰｋｈ１またはＰｋｈ２ポリペプチドの
同等物であるポリペプチドであってよい。従ってかかる機能的同等物は実施例４
で論じられているカンジダで同定されたＰｋｈ１またはＰｋｈ２、または以下に
論じられている植物のアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)であっ
てもよい。
【０１０４】 本発明のさらなる態様は、ヒトＳＧＫまたはＰＫＢの機能的同等物をコードす
る１以上の内因性遺伝子が、酵母細胞がヒトＳＧＫまたはＰＫＢの機能的同等物
を発現することができないように変異されている酵母、例えばＳ．セレビシエま
たはカンジダまたは上記に挙げられたその他の酵母細胞である。この遺伝子はＹ
ｐｋ１またはＹｒｋ２遺伝子であってもよい。ヒトＳＧＫまたはＰＫＢの機能的
同等物をコードするかかる内因性遺伝子は各々、酵母細胞が例えばＳＧＫまたは
ＰＫＢの内因性機能的同等物を発現することができないように変異されていても
よい。
【０１０５】 本発明のさらなる態様は、ヒトＳＧＫの機能的同等物をコードする１以上の内
因性遺伝子が、酵母細胞がヒトＳＧＫの機能的同等物を発現することができない
ように変異されている酵母、例えばＳ．セレビシエまたはカンジダまたは上記に
挙げられたその他の酵母／糸状菌細胞である。
【０１０６】 実施例４で論じられるように、以下のヌクレオチド配列：３８４３６２Ｅ１１
．ｓ１．ｓｅｑ．および３８４２８６Ｅ１０．ｓ１．ｓｅｑはＳ．セレビシエＹ
ｐｋ１およびＹｒｋ２ポリペプチドに関連するポリペプチドをコードすると考え
られる。
【０１０７】 この遺伝子はＹｐｋ１が発現される遺伝子、またはＹｋｒ２が発現される遺伝
子であってもよい。
【０１０８】 本発明のさらなる態様は、ヒトＳＧＫまたはＹｐｋ１またはＹｒｋ２の機能的
同等物をコードするかかる内因性遺伝子の各々が、酵母細胞が例えばヒトＳＧＫ
またはＹｐｋ１またはＹｒｋ２の内因性機能的同等物を発現できないように変異
されている酵母細胞である。
【０１０９】 本発明のさらなる態様は、ＳＧＫ、例えば糸状菌または哺乳類、好ましくはヒ
トＳＧＫの活性を調整（活性化または阻害）する化合物（ポリペプチドまたはポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド）を同定する方法であり、ここでは本
発明の上記態様に従う酵母細胞が使用される。
【０１１０】 本発明のさらなる態様はＳＧＫの活性を調整（活性化または阻害）する化合物
を同定する方法における本発明の上記態様に従う酵母細胞の使用である。
【０１１１】Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２ 本発明のさらなる態様は、共通配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ
−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄを含んでなるポリペプチド、例えばポリペプチドクロ
スチド（アミノ酸配列ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）または実施例１の表２に示され
るポリペプチド２、８または１１をリン酸化し得る酵母由来のタンパク質キナー
ゼである。
【０１１２】 本発明のさらなる態様はＰｋｈ１またはＰｋｈ２または哺乳類、好ましくはヒ
トＰＤＫ１によってリン酸化され得る酵母細胞由来のタンパク質キナーゼである
。
【０１１３】 この酵母はＳ．セレビシエであってよい。このタンパク質キナーゼは哺乳類Ｐ
ＫＢαおよび／またはＳＧＫと機能的特徴を共有すると考えられる。酵母、例え
ばＳ．セレビシエは哺乳類ＰＫＢαまたはＳＧＫと同じ機能的特性を有すること
はこれまでには知られていなかった。
【０１１４】 このタンパク質キナーゼはＳ．セレビシエ由来のＴｐｋ１もしくはＳ．セレビ
シエ以外の酵母、例えばカンジダ種の同等のオープンリーディングフレーム、ま
たはＳ．セレビシエ由来のＹｋｒ２もしくはＳ．セレビシエ以外の酵母、例えば
カンジダ種の同等のオープンリーディングフレームであってもよい。あるいはあ
まり好ましくはないが、それは関連のポリペプチドｐｋｃ１またはｓｃｈ９また
はその他のＡＧＣ（タンパク質キナーゼＡ／タンパク質キナーゼＧ／タンパク質
キナーゼＣ）ファミリーに属するものであってもよい。
【０１１５】 本発明のさらなる態様は、Ｐｋｈ１もしくはｐｋｈ２または哺乳類、好ましく
はヒトＰＤＫ１によってリン酸化され、および／または共通配列Ａｒｇ−Ｘａａ
−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄを含んでなるポリペプチド
をリン酸化し得る本発明の従前の態様に従うタンパク質キナーゼの変異体、誘導
体、断片もしくは融合体、またはその変異体、誘導体もしくは断片の融合体であ
る。
【０１１６】 このタンパク質キナーゼはＹＰＫ１遺伝子「４１」またはＹＫＲ２／ＹＰＫ２
遺伝子［４２］によってコードされるポリペプチドであってよい。
【０１１７】Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２ 本発明のさらなる態様は、Ｓ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹ
ＤＲ４９０ｃまたはＳ．セレビシエ以外の酵母の同等のオープンリーディングフ
レームによってコードされている実質的に純粋なポリペプチド、またはその変異
体、断片、融合体もしくは誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の
融合体、あるいはＳ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹＯＬ１００
ｗまたはＳ．セレビシエ以外の酵母の同等のオープンリーディングフレームによ
ってコードされている実質的に純粋なポリペプチド、またはその変異体、断片、
融合体もしくは誘導体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体であ
り、ここでこのポリペプチドはヒトＰＤＫ１またはショウジョウバエ(Drosophil
a)ＰＤＫ１（ＤＳＴＰＫ６１）のアミノ酸配列を含まない。
【０１１８】 これらのポリペプチドはタンパク質キナーゼ、特にＰＫＢα、特にヒトＰＫＢ
αを特にＴｈｙ３０８残基においてリン酸化し得るタンパク質キナーゼであると
考えられる。それらはさらに上記のようなＹｐｋ１およびＹｋｒ２、ヒトＳＧＫ
または共通配列Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
（これはタンパク質キナーゼの保存されているサブドメインVIIおよびvIIIの間
の触媒ドメインの「活性化ループ」とともに存在すると考えられる）を有するポ
リペプチドとして知られる酵母ポリペプチドをリン酸化し得ると考えられる。
【０１１９】 上記のポリペプチドは本明細書ではＰｋｈ１（ＰＫＢ活性化キナーゼ相同体１
；例えばＳ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹＤＲ４９０ｃによっ
てコードされる）またはＰｋｈ２（ＰＫＢ活性化キナーゼ相同体２；例えばＳ．
セレビシエのオープンリーディングフレームＹＯＬ１００ｗによってコードされ
る）とも呼ばれる［４２、４３］。
【０１２０】 Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２の部分アミノ酸配列も図１に示されている。
【０１２１】 実施例４ではＳ．セレビシエＰｋｈ１およびＰｋｈ２に関連するポリペプチド
をコードし得るカンジダ・アルビカンのスヌクレオチド配列の同定が記載されて
いる。実施例４に示される方法はその他の生物、例えばその他の酵母の関連のオ
ープンリーディングフレームを同定するのに適用できる。
【０１２２】 以下のヌクレオチド配列：３８４１９４Ｆ０８．ｓ１．ｓｅｑ．および３９６
０７６Ｅ０３．ｓ２．ｓｅｑはＳ．セレビシエＰｋｈ１およびＰｋｈ２に関連す
るポリペプチドをコードすると考えられる。
【０１２３】 「実質的に純粋」とは、ポリペプチドが他のタンパク質を実質的に含まないこ
とを意味するものとする。従って、発明者らはそのポリペプチドの重量に対して
タンパク質含量が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好まし
くは少なくとも７０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは
少なくとも９５％であるいずれの組成物を含める。
【０１２４】 従って本発明はまたそのポリペプチドと夾雑物を含んでなる組成物を含み、こ
こでこの夾雑物はその組成物の７０重量％未満、好ましくはその組成物の５０重
量％未満、より好ましくはその組成物の３０重量％未満、いっそう好ましくはそ
の組成物の１０重量％未満、最も好ましくはその組成物の５重量％未満を含む。
【０１２５】 本発明はまたex vivoで他の成分と組み合わせる場合の実質的に純粋なポリペ
プチドを含み、かかる他の成分はそのポリペプチドが認められる細胞に見られる
成分の総てではない。かかる実質的に純粋なポリペプチドはさらに以下に論じら
れるように、例えば原核細胞または真核細胞において組換え核酸からの発現によ
って得られると考えられる。
【０１２６】 変異体（天然に存在するものであってもそうでなくても）は以下の組換えポリ
ヌクレオチドを用いて当業者に公知のタンパク質工学および位置指定突然変異誘
発の方法で作出すればよい。
【０１２７】 「ポリペプチドの断片」には、例えば上記のような活性、例えばタンパク質キ
ナーゼ活性を有するか、または例えば抗体作製や結合アッセイに用いられるその
他のいくつかの方法に有用である断片のいずれもを含む。
【０１２８】 「ポリペプチドの融合体」には、他のいずれかのポリペプチドと融合したポリ
ペプチドが含まれる。例えばこのポリペプチドは、このポリペプチドの精製を助
けるためにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはタンパク質
Ａなどのポリペプチドと融合させてもよい。ＧＳＴとの融合体の例は実施例１に
示されている。同様に、このポリペプチドはＨｉｓ６などのオリゴ−ヒスチジン
タグと融合させてもよいし、または十分公知のＭｙｃタグエピトープなどの抗体
によって認識されるエピトープと融合させてもよい。このポリペプチドの変異体
、断片または誘導体との融合体もまた本発明の範囲に含まれる。
【０１２９】 ポリペプチドの「変異体」には挿入、欠失および置換（保存的なものであって
も非保存的なものであってもよい）が含まれる。特にかかる変異がそのポリペプ
チドの活性（例えば、ＰＫＢα、特にヒトＰＫＢαを、特に残基Ｔｈｒ３０８で
リン酸化する能力）を実質的に変化させないポリペプチド変異体を含めるものと
する。Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２の変異体には、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヒ
トＰＤＫ１またはショウジョウバエＰＤＫ１（ＤＳＴＰＫ６１）のアミノ酸配列
を有するポリペプチドは含まない、図１参照。
【０１３０】 実質的全長Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２を含んでなる変異体は特に有用であると考
えられる。「実質的全長」とは全長ポリペプチドの配列の少なくとも８０％、好
ましくは９０％、いっそう好ましくは９５％、９８％または１００％（すなわち
総て）を含むことを意味する。
【０１３１】 「保存的置換」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；お
よびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを意図する。
【０１３２】 このポリペプチド変異体が上記のアミノ酸配列と少なくとも６５％、より好ま
しくは少なくとも７５％、いっそう好ましくは少なくとも８０％、なおいっそう
好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または９９％の
同一性を有するならば特に好ましい。
【０１３３】 ２つのポリペプチド間の配列の同一性％は好適なコンピュータープログラム、
例えばウイスコンシン大学遺伝学コンピューティンググループのＧＡＰプログラ
ムを用いて決定してもよく、同一性％は配列が最適に整列されたポリペプチドに
対して計算されると考えられる。
【０１３４】 また、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム(Thompson et al (1994) Nucl Acid Res
22, 4673-4680)を用いてアライメントを行ってもよい。用いるパラメーターは
次の通りである： 高速対合アライメントパラメーター：Ｋ組（ワード）サイズ；１、ウィンドウサ
イズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナル数；５、スコアの表
示方法：ｘパーセント。 マルチプルアライメントパラメーター：ギャップオープンペナルティー；１０、
ギャップエクステンションペナルティー；０．０５。 スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１３５】 このように、これらのパラメーターによりＰｋｈ１およびＰｋｈ２の触媒ドメ
インがそれぞれ、ヒトＰＤＫ１の触媒ドメインと５０％および４９％一致し、シ
ョウジョウバエＰＤＫ１の触媒ドメインと４１％一致していると考えられる。ヒ
トまたはショウジョウバエＰＤＫ１の非触媒ドメインとＰｋｈ１またはＰｋｈ２
のいずれかとの有意な一致はないようである。
【０１３６】 本発明の特定の具体例によれば、実質的に純粋な酵母Ｐｋｈ１ポリペプチドま
たはその天然に存在する対立遺伝子変異体が提供される。部分アミノ酸配列も図
１に示している。
【０１３７】 本発明のさらなる特定の具体例によれば、実質的に純粋なＰｋｈ２ポリペプチ
ドまたはその天然に存在する対立遺伝子変異体が提供される。
【０１３８】 必ずしも必須ではないが、そのポリペプチドの変異体、断片、誘導体もしくは
融合体、あるいは変異体、断片もしくは誘導体の融合体が、ＰＫＢα（特にヒト
ＰＫＢα）または共通配列Ｂ−Ｔ−Ｆ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｐ／Ｉ−Ｄ／Ｅ−Ｙ−Ｌ／
Ｉ／Ｍ−Ａ−Ｐ−Ｅを含んでなる他のポリペプチド、例えばＡＧＣサブファミリ
ーに属するタンパク質キナーゼ（タンパク質キナーゼＡ／Ｇ／Ｃサブファミリー
）、特に実施例１に記載し、図６に示したＳＧＫ、ｐ７０Ｓ６キナーゼまたはＰ
ＫＣζのリン酸化に関し、Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２それぞれの酵素活性の少なく
とも３０％を有していることが特に好ましい。そのポリペプチドの変異体、断片
、誘導体もしくは融合体、あるいは変異体、断片もしくは誘導体の融合体が、Ｐ
ＫＢαまたは上述の選択物のいずれの１つのリン酸化に関しても、Ｐｋｈ１およ
びＰｋｈ２の酵素活性の少なくとも５０％を有しているならばさらに好ましく、
好ましくは７０％、さらに好ましくは９０％である。しかしながら、酵素活性の
全くない変異体、融合体、誘導体もしくは断片はそれにもかかわらず、例えば、
別のポリペプチドとの相互作用により、または抗体を産生する抗原として有用で
あると考えられよう。
【０１３９】 本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチド（例えば、Ｓ．セレビ
シエ由来のＰｋｈ１またはＰｋｈ２）をコードするまたはそのポリペプチドの変
異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体
の融合体をコードする組換えポリヌクレオチドが提供される。そのポリヌクレオ
チド変異体の選択および排除については上記と同じである。
【０１４０】 本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドの発現に適当なまたは
そのポリペプチドの変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体
、断片もしくは誘導体の融合体の発現に適当な組換えポリヌクレオチドが提供さ
れる。そのポリヌクレオチド変異体の選択および排除については本発明の第１の
態様と同じである。
【０１４１】 「発現に適当な」とは、そのポリヌクレオチドが翻訳されてポリペプチド、例
えばＲＮＡを形成するポリヌクレオチドであること、または本発明のポリペプチ
ドをコードするそのポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡである）がプラスミド
などの発現ベクターに、適当な方向かつ正確な発現用リーディングフレームで挿
入されることを意味する。このポリヌクレオチドは所望の宿主によって認識され
る適当な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結してもよく、かかる制
御は発現ベクターに組み込んでもよい。
【０１４２】 このように本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドの発現に適当なま
たはそのポリペプチドの変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変
異体、断片もしくは誘導体の融合体の発現に好適な複製可能ベクターである。そ
のポリヌクレオチド変異体の選択および排除については本発明のポリペプチドの
場合と同じである。例えば、複製可能ベクターは本発明のポリペプチドの融合体
、特に例えば実施例１に記載したＧＳＴ融合体の発現に適当である。構築物が翻
訳およびその結果としてコードされた本発明のポリペプチドの発現に必要な配列
を欠いている場合、それが上記の組換えポリヌクレオチドではないと考えられる
。
【０１４３】 本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドの融合体、または変異体、断
片もしくは誘導体の融合体、特にＧＳＴ融合体をコードするポリヌクレオチドで
ある。いっそうさらなる態様は、ポリペプチド、または本発明の第１の態様に記
載したポリペプチドの変異体、断片、誘導体、もしくは融合体、あるいは変異体
、断片もしくは誘導体の融合体、特にＧＳＴ融合体をコードするポリヌクレオチ
ドを含んでなる、哺乳類／真核生物細胞における複製に適当なベクターである。
【０１４４】 哺乳類／真核生物細胞における複製に好適なベクターの特徴は当業者には十分
に公知であり、その例を下記に示している。ベクターが原核生物および真核生物
細胞の双方における複製に適当であると考えられる。
【０１４５】 本発明のポリペプチドまたは変異体、断片、融合体もしくは誘導体をコードす
る組換えポリヌクレオチドの断片を含んでなるポリヌクレオチドもまた有用であ
る。そのポリヌクレオチドは、好ましくは長さが少なくとも１０個のヌクレオチ
ド、さらに好ましくは長さが少なくとも１４個のヌクレオチド、いっそうさらに
好ましくは長さが少なくとも１８個のヌクレオチドである断片を含んでなる。か
かるポリヌクレオチドはＰＣＲプライマーとして有用である。本発明のポリペプ
チドまたは変異体、断片、融合体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド
（またはその断片）に相補的なポリヌクレオチドもまた有用である。かかる相補
ポリヌクレオチドはアンチセンスポリヌクレオチドとして当業者には十分に公知
である。
【０１４６】 本発明のポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、好ましくはＤＮＡであってよい。ポリヌクレオチドはコード配列にイントロ
ンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい；好ましくはポリヌクレオチド
はｃＤＮＡである。
【０１４７】 ポリヌクレオチドの「変異体」として、（ｉ）次ぎにそのポリヌクレオチドに
よりコードされるタンパク質と特異的に結合する抗体の産生に使用できるタンパ
ク質またはその断片を産生するのに有用なまたは（ii）遺伝子もしくはここで記
載した（ｉ）のタイプの突然変異に対応するアンチセンス配列であるものが挙げ
られる。例えば、同じアミノ酸についてコードする異なるコドンを起点コドンと
して置き換えてもよい。また、置換コドンはタンパク質の活性または免疫原性に
作用しないまたはその活性または免疫原性を増強する、そうでなければ調整する
異なるアミノ酸についてコードすると考えられる。例えば、引用することにより
本明細書の一部とされるBotstein and Shortle, "Strategies and Applications
of In Vitro Mutagenesis" Science, 229: 193-210 (1985)に記載されるように
、位置指定突然変異誘発またはその他の手法を用いて、置換、挿入、欠失および
転置などの単一または複数の変異を作出することができる。かかる改変ポリヌク
レオチドは公知の手法を本明細書に包含される教示に適用することで得られるの
で、かかる改変ポリヌクレオチドは本発明の請求の範囲内にある。
【０１４８】 さらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（またはそ
の断片）を用いて高ストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズするその他
のポリヌクレオチド配列を得ることができることも当業者には理解されよう。か
かるポリヌクレオチドにはいずれのゲノムＤＮＡもが含まれる。よって、かかる
相同ポリヌクレオチドが下記の少なくともいくつかの方法に使用することが可能
であるか、そうでなければ有用であるポリペプチドをコードするならば、本発明
のポリヌクレオチドとして本発明の方法で同定したポリヌクレオチドと少なくと
も６０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好まし
くは９０％の相同性を示すポリヌクレオチドが挙げられる。かかるポリペプチド
は本発明のポリペプチドの機能的相同物であってよい。そのポリペプチドは、例
えば本発明のポリペプチドと類似した酵素活性を有していてもよいし、または上
記のように細胞内において本発明のポリペプチドと置換し得るものと考えられる
。
【０１４９】 上記のように、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２の機能的相同物の同定にかかる方法を
用いてもよいと考えれる。
【０１５０】 ポリヌクレオチドは酵母、例えばＳ．セレビシエまたはカンジダ以外の酵母由
来であることが好ましい。ポリヌクレオチドは病原性酵母または下記のスクリー
ニングアッセイにおける宿主細胞として有用な酵母由来であることが特に好まし
い。
【０１５１】 相同率％は、例えばthe University of Wisconsin Genetic Computer Groupの
ＧＡＰプログラムにより求めることができる。
【０１５２】 ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーショ
ンを０．１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣを含有する水溶液中、５５℃〜７０℃の温度で
行ってもよい。温度を高くまたはＳＳＣ濃度を低くするほどハイブリダイゼーシ
ョン条件がよりストリンジェントになることは当技術分野では十分に公知である
。「高ストリンジェンシー」とは、発明者らは２×ＳＳＣ、６５℃としている。
１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。
高ストリンジェンシーにおいてハイブリダイズするポリヌクレオチドは本発明の
請求の範囲内に含まれる。
【０１５３】 本発明はまた本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換した宿主細
胞に関する。宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれであってもよい。細菌
細胞が好ましい原核生物宿主細胞であり、典型的には、例えばBethesda Researc
h Laboratories Inc., Bethesda, MD, USAから入手可能な大腸菌ＤＨ５株、およ
びAmerican Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA (No ATCC
31343)から入手可能なＲＲ１などの大腸菌株である。好ましい真核生物宿主細
胞には酵母、昆虫および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒ
ト繊維芽細胞株などの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞には、一般にSt
ratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手可能なＹＰＨ４
９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞
には、ATCCからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞、ATCCからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胎児細
胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびATCCからＣＲＬ１６５０として入手可能なサル腎臓由
来ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞はバキュロウイルス発現ベク
ターでトランスフェクトし得るＳｆ９細胞である。
【０１５４】 適当な宿主細胞の本発明のＤＮＡ構築物での形質転換は、典型的には用いるベ
クターのタイプにもよるが十分に公知な方法により達成される。原核生物宿主細
胞の形質転換については、例えばCohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 69, 2110およびSambrook et al (1989) Molecular Cloning; A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照。Beggs
(1978) Nature 275, 104-109の方法も有用である。脊椎動物に関して、かかる
細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびＤ
ＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤はStratagene Cloning Systemsまた
はLife Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手可能である
。
【０１５５】 エレクトロポレーションもまた細胞を形質転換および／またはトランスフェク
トするのに有用であり、当技術分野では酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊
椎動物細胞の形質転換用によく知られている。
【０１５６】 例えば、引用することにより本明細書の一部とされるLuchansky et al (1988)
Mol. Microbiol. 2, 637-646に記載された方法により多くの細菌種が形質転換
され得る。２．５×ＰＥＢに懸濁したＤＮＡ−細胞混合物を２５：ＦＤにおいて
ｃｍ当たり６２５０Ｖを用いてエレクトロポレーションした後、最大数の形質転
換細胞を一貫して回収される。
【０１５７】 エレクトロポレーションにより酵母を形質転換する方法についてはBecker & G
uarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182で開示されている。
【０１５８】 カンジダ種を形質転換する方法およびベクターについては、例えばZhou P, et
al "A system for gene cloning and manipulation in the yeast Candida gla
brata." Gene. 1994 May 3; 142 (1): 135-40; Mehra RK, et al "Cloning syst
em for Candida glabrata using elements from the metallothionein-IIa-enco
ding gene that confer autonomous replication." Gene. 1992 Aprl; 113 (1):
119-24; Ohkuma M, et al "Cloning of the C-URA3 gene and construction of
a triple auxotroph (his5, ade1, ura3) as a useful host for the genetic
engineering of Candida maltosa." Curr Genet. 1993 Mar; 23 (3): 205-10; S
akai Y, et al "Transformation system for an asporogenous methylotrophic
yeast, Candida boidinii: cloning of the orotidine-5'-phosphate decarboxy
lase gene (URA3), isolation of uracil auxotrophic mutants, and use of th
e mutants for integrative transformation." J Bacteriol. 1991 Dec; 173 (2
3): 7458-63; Haas Lo, et al "Development of an integrative DNA transform
ation system for the yeast Candida tropicalis." J Bacteriol. 1990 Aug; 1
72 (8): 4571-7; Sakai Y, et al "High-frequency transformation of a methy
lotrophic yeast, Candida boidinii, with autonomously replicating plasmid
s which are also functional in Saccharomyces cerevisiae." J Bacteriol. 1
993 Jun; 175 (11): 3556-62; Kitada K, et al "Cloning of the Candida glab
rata TRP1 and HIS3 genes, and construction of their disruptant strains b
y sequential integrative transformation." Gene. 1995 Nov 20; 165 (2): 20
3-6; Macreadie IG, et al "Heterologous gene expression and protein secre
tion from Candida glabrata." Biotechnol Appl Biochem. 1994 Jun; 19 (Pt 3
): 265-9. Hsu WH, et al "Construction of a new yeast cloning vector cont
aining autonomous replication sequences from Candida utilis." J Bacterio
l. 1983 Jun; 154 (3): 1033-9; Hanic-Joyce PJ, et al "A high-copy-number
ADE2-bearing plasmid for transformation of Candida glabrata." Gene. 1998
May 12; 211 (2): 395-400で記載されている。
【０１５９】 上手く形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含有している細
胞は十分に公知な手法により同定できる。例えば、本発明の発現構築物の導入に
より得られる細胞を増殖させて本発明のポリペプチドを得ることができる。細胞
を回収して溶解し、ＤＮＡの存在に関しては、Southern (1975) J. Mol. Biol.
98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208により記載されたものなど
の方法を用いてそれらのＤＮＡ含量を調べることができる。また、上清中のタン
パク質の存在に関しては下記の抗体を用いて検出することができる。
【０１６０】 組換えＤＮＡの存在に関する直接的アッセイに加え、組換えＤＮＡがタンパク
質の発現を支配し得る場合には、十分に公知な免疫学的方法により形質転換の成
果を確認することができる。例えば、発現ベクターで上手く形質転換した細胞に
より適当な抗原性を提示するタンパク質が得られる。形質転換されると考えられ
る細胞サンプルを回収し、適当な抗体を用いてタンパク質に関してアッセイする
。
【０１６１】 よって、それら自身の形質転換宿主細胞に加え、本発明はまた栄養培地におけ
るそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローンとして相同）培
養物、またはモノクローナル培養物由来の培養物をも意図している。
【０１６２】 本発明のさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドまたはその変異体、誘
導体、断片もしくは融合体、あるいは変異体、断片もしくは誘導体の融合体を作
製する方法であって、前記ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドま
たは複製可能ベクターを含んでなる宿主細胞を培養して、宿主細胞由来の前記ポ
リペプチドまたはその変異体、誘導体、断片もしくは融合体、あるいは変異体、
断片もしくは誘導体の融合体を単離することを含んでなる方法が提供される。宿
主細胞を培養して組換えタンパク質を単離する方法については当技術分野では十
分に公知である。
【０１６３】 本発明はまた本発明の上記の方法により得ることができるポリペプチド、また
はその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体、断片もしく
は誘導体の融合体を包含する。
【０１６４】 本発明のいっそうさらなる態様によれば、本発明のポリペプチドに対して反応
性のある抗体が提供される。かかる抗体およびかかる抗体の作製方法の例は実施
例１に示されている。
【０１６５】 本発明のポリペプチドに対して反応性のある抗体は当技術分野で十分に公知な
方法によって作製され得る。特に、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル
であってよい。
【０１６６】 ポリペプチドに対して反応性のある好適なモノクローナル抗体を公知の手法、
例えば"Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press
, 1988)および"Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applicatio
ns", SGR Hurrell (CRC Press, 1982)に開示されるものにより作製してもよい。
【０１６７】 好ましい具体例において、要すればＰｋｈ１またはＰｋｈ２のアミノ酸配列か
ら得ることができるいずれの好適なペプチド配列を用いても抗体が産生される。
ポリクローナル抗ペプチド抗体を作製する場合が好ましい。
【０１６８】 抗体が別のタンパク質キナーゼ、特に別の酵母タンパク質キナーゼとは実質的
に反応しない場合が特に好ましい。よって、他のいずれのタンパク質キナーゼに
おいても、特に酵母タンパク質キナーゼに見られるいずれのペプチドとも有意に
異なる、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２配列に基づくペプチドを用いる場合が好ましい
。また抗体がＰｋｈ１とは反応するが、Ｐｋｈ２とは実質的に反応しない場合、
またその逆の場合も好ましい。
【０１６９】 抗体を作製する手法は当業者には十分に公知であり、例えばHarlow, ED & Lan
e, D "Antibodies: a laboratory manual" (1988) New York Cold Spring Harbo
r Laboratory.に記載されている。
【０１７０】他の方法 本発明のさらなる態様は、ポリペプチドＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１または
Ｙｋｒ２の活性を調整する薬剤様化合物または薬剤様化合物開発のためのリード
化合物を同定する方法を提供し、この方法は、該ポリペプチドまたはその適当な
変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体、断片、もしくは誘
導体の融合体と化合物を接触させ、該化合物の不在下での該ポリペプチドまたは
その該変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体、断片、また
は誘導体の融合体の活性と比較して該ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性が
変化したかどうかを決定することを含む。
【０１７１】 「薬剤様化合物」および「リード化合物」とは、上記で論じられているように
当業者らには十分公知の用語である。
【０１７２】 この化合物はポリペプチドと相互作用し、「上流アクチベーター」によりその
活性を調整（例えば阻害）する。この化合物はＹｐｋ１またはＹｋｒ２と相互作
用し、「上流アクチベーター」、例えばＰｋｈ１またはＰｋｈ２によりその活性
を調整（例えば阻害）する。
【０１７３】 in vivoにおいてポリペプチドの活性を調整し得る化合物を同定することが望
ましいことは理解されるであろう。従って本方法で用いられる反応物および条件
は、該ポリペプチドとその基質との間の相互作用が、in vivoにおける酵母、例
えばＳ．セレビシエＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２とその基質と
の間の相互作用と実質上同じであるように選択すればよいことが理解されるであ
ろう。該Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２ポリペプチドの基質の例としてはＹｐｋ１また
はＹｋｒ２がある。
【０１７４】 ある具体例では、この化合物は該ポリペプチドの活性を低下させる。例えば、
化合物は実質上可逆的にまたは実質上不可逆的に該ポリペプチドの活性部位と結
合する。さらなる例では、化合物は該ポリペプチドと基質との結合を妨げるよう
に活性部位でない該ポリペプチドの一部と結合する。またさらなる例では、化合
物はアロステリック効果によって該ポリペプチドの活性を低下させるように該ポ
リペプチドの一部と結合する。このアロステリック効果は該ポリペプチドの活性
の自然調節に関係するアロステリック効果であり、例えば、Ｙｐｋ１およびＹｋ
ｒ２に対するＰｋｈ１またはＰｋｈ２などの「上流アクチベーター」による該ポ
リペプチドの活性におけるものである。
【０１７５】 さらなる具体例では、この化合物は該ポリペプチドの活性を増強する。例えば
、この化合物は、該ポリペプチドとその基質との結合を助けるように活性部位で
ない該ポリペプチドの一部と結合する。またさらなる例では、この化合物はアロ
ステリック効果によって該ポリペプチドの活性を増強するように該ポリペプチド
の一部と結合する。このアロステリック効果は、例えばＹｐｋ１およびＹｋｒ２
に対するＰｋｈ１またはＰｋｈ２などの「上流アクチベーター」による該ポリペ
プチドの活性において、該ポリペプチドの活性の自然調節に関係するアロステリ
ック効果である。
【０１７６】 便宜には本方法は、実施例１に記載したようにＰｋｈ１またはＰｋｈ２が例え
ばＹｐｋ１またはＹｋｒ２をリン酸化する、または表２に示し実施例１で論じた
ようにＹｐｋ１またはＹｋｒ２がペプチドをリン酸化するということを利用する
が、好適ないずれの基質を使用してもよい。従ってＹｐｋ１またはＹｋｒ２、ま
たはＹｐｋ１またはＹｋｒ２のペプチド基質のリン酸化は当業者らに十分公知の
技術を用いて測定すればよい。便宜には、本方法は実施例１に記載したものと実
質的に同じアッセイ、または当業者らには十分公知の高処理量スクリーニングの
ためによりアッセイをより便利なものとするのに適したアッセイを利用する。例
えば、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ；Amersham）が有用である。ポリ
ペプチド（例えば、Ｐｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２）は組換え体
であるのが好ましい。基質は組換え体または合成物であるのが好ましい。
【０１７７】 あるいは、基質の活性における変化を測定してもよい。例えば、Ｙｐｋ１また
はＹｋｒ２、またはＹｐｋ１またはＹｋｒ２の基質のタンパク質キナーゼ活性を
、上記のように測定してもよい。これは全細胞系において行ってもよいし、ある
いは精製または部分精製成分を用いて行ってもよい。Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２の
基質により調節されるプロモーターから転写したＲＮＡにコードされたタンパク
質の発現を測定してもよい。このタンパク質はＹｐｋ１またはＹｋｒ２の基質に
より生理学的に調節したものでもよいし、当業者に十分公知である「リポーター
」タンパク質であってもよい（すなわち、組換え構築物を使用してもよい）。リ
ポータータンパク質はその活性が容易にアッセイできるもの、例えばβ−ガラク
トシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはルシフェ
ラーゼ（例えばTan et al (1996)参照）であってよい。
【０１７８】 本発明のさらなる態様は、相互作用するポリペプチド、例えばＰｋｈ１、Ｐｋ
ｈ２またはＰＤＫ１により、Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物で
あるがＳＧＫ、ＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナーゼではない（すなわち非哺乳類
起源に由来する）ポリペプチドの活性化を調整、例えば阻害する化合物を同定す
る方法であって、化合物が、（ａ）ＳＧＫ、ＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナーゼ
ではない（すなわち非哺乳類起源に由来する）Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２
の機能的同等物であるポリペプチドまたはその適当な断片、変異体、誘導体もし
くは融合体、あるいは断片、変異体もしくは誘導体の適当な融合体と、（ｂ）相
互作用するポリペプチド、またはその適当な変異体、誘導体、断片もしくは融合
体、あるいは変異体、誘導体あるいは断片の適当な融合体との間の相互作用を増
強するか阻害するかを決定する、または化合物が、相互作用するポリペプチド、
またはその適当な変異体、誘導体、断片、またはそれらの融合体により、ＳＧＫ
、ＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナーゼではない（すなわち非哺乳類起源に由来す
る）Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物であるポリペプチド、また
はその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその断片、誘導体
もしくは融合体の融合体の活性化を実質的に阻害するかどうかを決定することを
含んでなる方法である。
【０１７９】 ポリペプチドの活性を調整し得る化合物をin vivoで同定することが望ましい
ことは理解されるであろう。従って本方法で用いられる反応物および条件は、例
えばＹｐｋ１および／またはＹｒｋ２の機能的同等物であるがＳＧＫ、ＰＫＢα
またはｐ７０Ｓ６キナーゼではない（すなわち非哺乳類起源に由来する）該ポリ
ペプチドと、相互作用するポリペプチド、例えばＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、ＰＤＫ１
および／またはＰＤＫ２活性を持つタンパク質キナーゼとの間の相互作用と、in
vivoでＹｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物であり、かつ天然に存
在する該ポリペプチドと、相互作用する天然に存在するポリペプチドとの間の相
互作用とが実質上同じであるように選択すればよいことが理解されるであろう。
ＰＤＫ１は、例えばすでに論じられたようにＰＩＦまたは関連するポリペプチド
と結合した場合にＰＤＫ２活性を持つポリペプチドである。
【０１８０】 Ｙｐｋ１および／またはＹｒｋ２の機能的同等物であるがＳＧＫ、ＰＫＢαま
たはｐ７０Ｓ６キナーゼではない（すなわち非哺乳類起源に由来する）ポリペプ
チドの適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいは該断片、誘導体も
しくは融合体の融合体は、ＳＧＫ、ＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナーゼでないと
考えられる。
【０１８１】 本発明のさらなる態様は、Ｙｐｋ１および／もしくはＹｋｒ２またはＳＫＧま
たはＰＫＢαであるポリペプチドあるいはその機能的同等物、またはその適当な
変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその断片、誘導体もしくは融合体
の融合体をリン酸化する、および／または活性化するための、ＰＤＫ１ではない
、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２もしくはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融
合体、あるいはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体の使用である。
【０１８２】 本発明のさらなる態様は、Ｙｐｋ１および／もしくはＹｒｋ２またはＳＫＧで
あるポリペプチドまたはＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナーゼではないその機能的
同等物、あるいはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、またはその
断片、誘導体もしくは融合体の融合体をリン酸化する、および／または活性化す
るための、ＰＤＫ１またはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あ
るいはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体の使用である。
【０１８３】 本発明のさらなる態様は、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２あるいはＳＧＫ（またはＰ
ｋｈ１、Ｐｋｈ２またはＰＤＫ１の他の基質）と結合し、Ｐｋｈ１、Ｐｋｈ２ま
たはＰＤＫ１による活性を増強するかまたは阻害する化合物を同定する方法であ
って、この方法は、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２あるいはＳＧＫ（またはＰｋｈ１、
Ｐｋｈ２またはＰＤＫ１の他の基質）もしくはその適当な断片、変異体、誘導体
または融合体、またあるいはＰｋｈ１、Ｐｋｈ２またはＰＫＤ１を有する断片、
誘導体または融合体の融合体、もしくはその適当な断片、変異体、誘導体または
融合体あるいは断片、変異体または誘導体の適当な融合体の相互作用を化合物が
増強するか阻害するかどうかを決定すること、またはその化合物がＹｐｋ１また
はＹｋｒ２あるいはＳＧＫ（またはＰｋｈ１、Ｐｋｈ２またはＰＤＫ１の他の基
質）もしくはその適当な断片、変異体、誘導体または融合体、またあるいはＰｋ
ｈ１、Ｐｋｈ２またはＰＫＤ１による断片、誘導体または融合体の適当な融合体
の活性を実質的に阻害するかどうかを決定することを含んでなる。
【０１８４】 好適なアッセイは上記と同様である。
【０１８５】 本発明のさらなる態様は、ＰＤＫ１ではない、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２もしく
はその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその断片、誘導体
もしくは融合体の融合体と相互作用するポリペプチドを同定する方法であり、こ
の方法は、１）ａ）該ポリペプチドをｂ）かかる相互作用をするポリペプチドを
含む組成物と接触させ、２）該ポリペプチドおよび相互作用をするポリペプチド
を含む複合体の存在を検出し、所望により３）該ポリペプチドと結合した相互作
用をするポリペプチドを同定することからなる。
【０１８６】 ある態様では、組成には細胞に由来する物質が含まれる。特に、細胞は以下の
タイプから選択される。（１）あまり長時間ではないが刺激に曝した後にＰｋｈ
１またはＰｋｈ２活性を持つ細胞 （２）刺激に曝した後のタイプ１の細胞。タ
イプ１またはタイプ２にだけ見られるポリペプチドに特に注目してさらなる同定
を行ってもよい。かかるペプチドはＰｋｈ１またはＰｋｈ２のアクチベーターで
あってよい。あるいは、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２のイン・アクチベーターであっ
てもよい。
【０１８７】 この方法は、例えば当業者に十分公知であるツー・ハイブリッド酵母系を用い
て、細胞内で行ってもよいと考えられる。この例では、上記の２つの細胞タイプ
から得たｍＲＮＡからコピーしたｃＤＮＡが用いられる。
【０１８８】 さらに、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２遺伝子が改変され、および／またはＰｋｈ１
またはＰｋｈ２を発現し得る組換えポリヌクレオチドが存在する細胞が、例えば
実施例１に記載のＰｋｈ１またはＰｋｈ２の基質の同定において有効であると考
えられる。
【０１８９】 本発明のさらなる態様は該方法によって同定可能なポリペプチドである。
【０１９０】 本発明のまたさらなる態様は、ＰＤＫ１ではない、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２も
しくはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその断片、誘
導体もしくは融合体の融合体の活性を「上流アクチベーター」によって調整する
化合物を同定する方法を提供する。「上流アクチベーター」とは、本発明のポリ
ペプチドと相互作用してその結果本発明のポリペプチドのタンパク質キナーゼ活
性が高まる分子を意味する。それはポリペプチドであってもよい。好ましくは、
それは天然Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２の生理学的アクチベーターである。かかるア
クチベーターは上記の方法により同定される。
【０１９１】 本発明のさらなる態様は、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２もしくはその適当な変異体
、断片、誘導体もしくは融合体の使用、あるいは、ＳＧＫまたはＰＫＢαでない
、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２もしくはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融
合体、あるいは該断片、誘導体または融合体の融合体の活性のためのその断片、
誘導体もしくは融合体の融合体の使用である。
【０１９２】 本発明のさらなる態様は、上記の方法により同定可能な相互作用する該ポリペ
プチドによる、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２もしくはその適当な変異体、断片、誘導
体もしくは融合体、あるいはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体の活性を
阻害する化合物を同定する方法であり、この方法は、（ａ）Ｐｋｈ１またはＰｋ
ｈ２と、（ｂ）相互作用する該ポリペプチドまたはその適当な変異体、誘導体、
断片または融合体、あるいは適当な変異体、誘導体または断片の融合体との間の
相互作用を化合物が増強するか阻害するかどうかを決定すること、またはその化
合物が本発明の最初の態様で定義した該ポリペプチドの活性を相互作用する該ポ
リペプチドまたはその適当な変異体、誘導体、断片または融合体によって実質的
に阻害するかどうかを決定することを含んでなる。
【０１９３】 高処理量を扱い得るスクリーニングアッセイが特に好ましいと考えられる。実
施例には細胞に基づくアッセイおよびタンパク質間の結合アッセイが含まれる。
ＳＰＡに基づく（Scintillation Proximity Assay; amersham International）
系を使用してもよい。例えば、閃光物質およびリン酸化されたポリペプチドを含
んでなるビーズを準備する。ビーズは上記のタンパク質キナーゼおよび３２Ｐ−
ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰを含有するサンプルと混合するか試験化合物と混合
すればよい。便宜にはこれを９６ウェルプレート内で行う。次にプレートを適当
なシンチレーションカウンターを用い、公知の３２Ｐ−ＡＴＰまたは３３Ｐ−Ａ
ＴＰアッセイに関するパラメータを用いて計数する。閃光物質と近接する３２Ｐ
−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰだけが、すなわちポリペプチドと結合する３２Ｐ
−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰだけが検出される。かかるアッセイの変形、例え
ば抗体と結合することを通じてポリペプチドが閃光ビーズに固定されるようなア
ッセイも使用してよい。
【０１９４】 ポリペプチドとポリペプチドとの相互作用を検出する他の方法としては、イオ
ンスプレー質量分光／ＨＰＬＣ法ともに限外濾過または他の物理的および分析的
方法が挙げられる。例えば、当業者らには十分公知である、２つの蛍光標識物質
の結合を互いに近接した場合の蛍光標識の相互作用を測定することで測定する蛍
光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法を用いてもよい。
【０１９５】医学的態様 本発明のさらなる態様は、上記本発明の方法のうちで適当な１つにより同定さ
れた、または同定され得る化合物である。
【０１９６】 本発明のまたさらなる態様は薬剤用の該化合物である。
【０１９７】 この化合物は、哺乳類、好ましくはヒトＰＤＫ１、または哺乳類、好ましくは
ヒトＳＧＫの活性を阻害するような化合物である。あるいはこの化合物は例えば
哺乳類、好ましくはヒトの病原体または日和見病原体内のＰＤＫ１またはＳＧＫ
の機能的相同体を阻害する。例えば、この化合物はカンジダ種または上記の他の
病原性酵母種内でＰＤＫ１（Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２など）またはＳＧＫ（Ｙｐ
ｋ１またはＹｋｒ２など）の機能的相同体を阻害する。かかる化合物は抗真菌剤
として有効である。
【０１９８】 この病原体または日和見病原体は、単子葉植物または双子葉植物などの植物に
作用すると考えられる。例えば、この病原体は植物のサビ病の原因となる菌類、
例えば穀類の黒サビの原因となる黒サビ病菌（Puccinia graminis）、またはジ
ャガイモを枯らす原因となる疫病菌（Phtophthora infestans）などのサビキン
群に属するものであってよい。従って、植物の病原となる酵母内でＰＤＫ１（Ｐ
ｋｈ１またはＰｋｈ２など）またはＳＧＫ（Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２など）の機
能的相同体を阻害する化合物は、植物を保護する生成物として、すなわち植物の
菌感染を治療または予防するために使用する場合の抗真菌剤として有効である。
【０１９９】 哺乳類、例えばヒトＰＤＫ１を阻害する化合物は薬剤において有効であると考
えられる。従って、本発明のさらなる態様は細胞内でＰＤＫ１（タンパク質キナ
ーゼＢまたはＳＧＫとの相互作用を含む）の活性を調整する方法であって、この
方法は本発明の化合物に該細胞を曝すことを含んでなる。この方法はin vitroま
たはin vivoで使用してもよいと考えられる。本発明の化合物が細胞内に侵入可
能であって、化合物が細胞内に侵入することが好ましい。
【０２００】 本発明のさらなる態様はＰＤＫ１の活性またはタンパク質キナーゼＢとの相互
作用を調整、望ましくは阻害する必要のある患者の治療法であって、この方法は
哺乳類、例えばヒトＰＤＫ１を阻害する本発明の化合物を効果的な量で患者に投
与することを含んでなる。
【０２０１】 ＰＫＢ、ＰＤＫ１またはＰＤＫ１によるＰＫＢの活性阻害する本発明のスクリ
ーニング法において同定可能な化合物は癌治療に有効であると考えられる。ＰＫ
Ｂは白血病に関係するｖ−ａｋｔの細胞相同体である。ＰＫＢの２つのイソ型は
卵巣癌、膵臓癌および乳癌において過剰発現する。ＰＫＢは、例えばＩＧＦ−１
により媒介されるアポトーシスに対する細胞の保護に介在すると考えられる。Ｐ
ＫＢが過剰発現するとアポトーシスの停止によって癌細胞が増殖する。アポトー
シスの促進は炎症の消散に有益である。
【０２０２】 ＰＫＢまたはＰＤＫ１の活性化をもたらす化合物は糖尿病または肥満症の治療
において有効である。かかる化合物はまた心臓術の前後または最中における患者
の処置にも有効である。かかる化合物はまたアポトーシスを減少させるのに有効
である、従って、かかる化合物はアポトーシスに対して保護が必要な患者の治療
において有効である。アポトーシスの減少は、虚血性損傷、例えば卒中または心
筋梗塞後に、および組織の修復に有効である。
【０２０３】 ＰＤＫ１（Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２であり得る）またはＳＧＫ（Ｙｐｋ１また
はＹｋｒ２であり得る）の真菌の機能的相同体を阻害する本発明の化合物は、薬
剤、例えば抗真菌剤としても有効である。これはカンジダ感染症、例えば口腔カ
ンジダ症の治療に有効である。従って、本発明のさらなる態様は、真菌感染、例
えば口腔カンジダ症の治療または予防のための薬剤の製造において、ＰＤＫ１ま
たはＳＧＫの真菌の機能的相同体を阻害する本発明の化合物の使用である。
【０２０４】 本発明の化合物によって治療される真菌感染症のさらなる実施例には、上記の
病原菌によって引き起こされる感染症が含まれる。本発明の化合物によって治療
または予防される感染症または病気のまたさらなる実施例を以下に列挙する。本
発明の化合物は、例えば上記の本発明の方法を用いて、指示された酵母属または
種のタンパク質キナーゼへの作用に関して選択されていることが好ましいと考え
られる。
【０２０５】 従って、本発明の化合物は、上記の病原菌によって引き起こされる感染症また
は以下に列挙する感染症または病気の治療または予防のための薬剤の製造に用い
られる。
【０２０６】 アスペルギルス症はコウジカビ属の菌、通常Ａ．フミガタスに起因する。ブラ
ストミセス症はブラストミセス・デルマチチジス菌に起因する。感染は肺を通じ
て起こるがこの感染は広範囲に蔓延して、皮膚、骨および尿生殖器系も感染する
。
【０２０７】 カンジダ症はカンジダ種、特にＣ．アルビカンスに起因し、通常は抗菌治療、
糖尿病、妊娠または免疫不全などの素因を要する。皮膚および粘膜のカンジダ症
は口腔カンジダ症として知られている。クロモミセス症は特に熱帯および亜熱帯
気候において、フィアロフォラ・コンパクタ、Ｐ．ペドロソイ、Ｐ．ヴェルコサ
、クラドスポリウム・カリオニおよびリノクラジェラ・アクアスペルサなどの日
和見病原体に起因し、皮膚の損傷を引き起こす。
【０２０８】 コクシジウム症（峡谷熱、砂漠熱、砂漠リウマチ）はコクシジオイデス・イミ
チスの胞子の吸入に起因し、特に北部、中央および南部アメリカの乾燥地帯およ
び半砂漠地帯で起こる。クリプトコッカス症はクリプトコッカス・ネオホルマン
ス菌に起因する。これは通常の個体にはまれであるが、免疫無防備状態の患者に
は重大で、しばしばクリプトコッカス髄膜炎として生じる。
【０２０９】 心内膜炎はアスペルギルスまたはカンジダなどの真菌類に起因し、眼感染とし
ても起こる。セファロスポリウム、フサリウム、ブラストミセス、クリプトコッ
カスおよびスポロスリックスもまた眼感染の原因となる。
【０２１０】 ヒストプラズマ症は土壌中および鳥やコウモリの排泄物中に見られるヒストプ
ラズマ・カプスラタムに起因する。これは全身感染で米国中部およびアフリカ中
部の風土病である（おもにＨ．カプスラタム・ズボアジ種）。
【０２１１】 ムコール症はリゾプス種またはリゾムコル種に起因し、通常は免疫無防備状態
の個体にのみ作用する。菌腫は、皮膚の損傷を通じて組織に侵入するマズレラ・
ミセトマチス、Ｍ．グリセアまたはシューダレセリア・ボイジに起因する熱帯お
よび亜熱帯病である。パラコクシジオイデス症は基本的には中央および南アメリ
カの疾患で、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシスに起因する。
【０２１２】 ニューモシスチス・カリニ肺炎は菌類と思われるニューモシスチス・カリニに
起因する。これは免疫無防備状態の患者、特にＡＩＤＳ患者に特に重大である。
【０２１３】 皮膚感染には水虫、癜風およびカンジダ症（すでに論じた）、ならびにアスペ
ルギルス症などのすでに論じた他の菌感染症の形態が含まれる。水虫には白癬お
よび輪癬（運動選手の足など）が含まれ、エピデルモルフィトン種、ミクロスポ
ラム種およびトリコフィトン種に起因する。癜風はマラセジア・フルフルに起因
し、温和な気候よりも熱帯に多く、日光が感染の引き金となる。
【０２１４】 スポロトリクム症はスポロスリックス・シェンキーに起因し、主にアメリカ大
陸およびアフリカに見られる。これは皮膚内部および皮膚の外側に起こる。
【０２１５】 本発明の化合物が有効となるような菌感染症に関するさらなる情報は、例えば
、Martindale Pharmacopaeia第３２版に認められる。
【０２１６】 菌感染症は免疫無防備状態の宿主、例えばＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）
の人体においてはさらに重症となると考えられる。従って、他の点では健康な個
体において病原性の低い酵母／菌でも免疫無防備状態の個体においてはより重篤
な疾患を引き起こし得る。
【０２１７】製品キット 本発明のさらなる態様は、本発明のスクリーニング法の実施に有用な手段を含
む製品キットである。
【０２１８】 従って、本発明の部品キットは、 １）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第１
の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第１の宿主酵母細胞お
よび ２）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第１
の起源以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２の宿主
酵母細胞 を含んでなる。
【０２１９】実施例１：哺乳類３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１（ＰＤＫ １）およびタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ）の機能的相同体は酵母 サッカロミセス・セレビシエにおけるシグナル伝達経路の構成要素である
【０２２０】 背景：動物細胞では、増殖因子のそれらの同族受容体への結合によるホスファ
チジルイノシトール３−キナーゼの補充および活性化により３−ホスホイノシチ
ドが生じる。これらの脂質は３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−
１（ＰＤＫ１）がタンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ）およびｐ７０Ｓ
６キナーゼをはじめとする種々の標的タンパク質キナーゼをリン酸化し、かつ活
性化するのを誘導し、その結果、適当な生理学的応答を媒介する。
【０２２１】 結果：サッカロミセス・セレビシエゲノムはその触媒ドメインが互いに７２％
同一であり、かつ、ヒトまたはショウジョウバエＰＤＫ１と５０％同一である、
２種のタンパク質キナーゼ（ＰＫＨ１およびＰＫＨ２遺伝子産物）をコードして
いる。ｐｋｈ１Δおよびｐｋｈ２Δ単一変異体は双方とも生存可能であるが、ｐ
ｋｈ１Δｐｋｈ２Δ二重変異体は生存不能であり、このことはＰｋｈ１およびＰ
ｋｈ２は必須であるが重複した機能を有しているということを示す。ヒトＰＤＫ
１の発現によりｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞の増殖が可能となる。酵母ゲノムはま
た、その触媒ドメインが互いに８８％同一であり、かつ、血清および糖質コルチ
コイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）、すなわちＰＫＢと密接に関連する
酵素（５６％同一）と５８％同一である、２種のその他のタンパク質キナーゼ（
ＹＰＫ１およびＹＫＲ２遺伝子産物）もコードしている。ｙｐｋ１Δまたはｙｋ
ｒ２Δのいずれかの単一変異体は生存可能であるが、ｙｐｋ１Δｙｐｋ２Δ二重
変異体は生存不能であり、このことはＹｐｋ１およびＹｋｒ２もまた必須である
が重複した機能を有するということを示す。ｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ細胞の増殖は
ラットＳＧＫの発現によって十分に、マウスＰＫＢによってわずかに救われるが
、ラットｐ７０Ｓ６キナーゼによっては全く救われない。２９３細胞でグルタチ
オン２−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）への融合体として発現されるＰｋｈ１は
哺乳類ＰＫＢおよびＳＧＫをリン酸化し、かつ活性化する。同様に、in vitroで
はＰｋｈ１は、ＰＤＫ１によってリン酸化されるＰＫＢおよびＳＧＫ中のものと
同等のキナーゼドメイン中の残基（Ｔ５０４）をリン酸化することによってＹｐ
ｋ１を活性化する。Ｐｋｈ１によるＹｐｋ１の活性化はホスファチジルイノシト
ール−３，４，５−トリホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３）を必
要とせず、これらの酵母タンパク質中のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインの
欠失と一致するが、他方、Ｐｋｈ１によるヒトＰＫＢの活性化はＰｔＤＩｎｓ［
３，４，５］Ｐ３に依存している。Ｙｐｋ１によるリン酸化のための最小共通配
列は、ＰＫＢについて認められるように、Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ
−Ｈｙｄ（ここで、Ｈｙｄはかさ高い疎水性残基である）である。
【０２２２】 結論：これらの結果はＰｋｈ１およびＰｋｈ２はＰＤＫ１の機能的相同体であ
り、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２はＳＧＫ（およびおそらくはＰＫＢ）の機能的相同
体であり、動物細胞におけるように、これらの酵素は細胞増殖および生存能力に
必要なタンパク質キナーゼカスケードの構成要素であるということを証明する。
【０２２３】 背景 ＲＡＣ（「ＰＫＡおよびＰＫＣに関連する」ということから）キナーゼとも呼
ばれる［２］タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）［１］はレトロウイルス発癌遺伝
子産物、ｖ−Ａｋｔ［３］の哺乳類の相同体であり、従って、ｃ−Ａｋｔとも示
される。この酵素およびその機能が現在注目されているのにはいくつかの理由が
ある。第１に、ＰＫＢはインスリンおよびその他の増殖因子に応じて数分内に活
性化され、活性化はホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）３−キナーゼ
の阻害剤によって妨げられる［４〜６］。第２に、ＰＫＢはグルコースおよびア
ミノ酸取り込みの刺激、グリコーゲンおよびタンパク質合成および心筋における
解糖（［７、８］に概説されている）、ならびに特定の遺伝子の転写誘導［９、
１０］をはじめとするインスリンのいくつかの作用を媒介するということを示す
証拠が増えつつある。第３に、ＰＫＢアイソフォームはかなりのパーセンテージ
の卵巣および膵臓癌で過剰発現されており［１１、１２］、またＰＫＢアイソフ
ォームはいくつかの乳癌でも高まっている［１３］。第４に、ＰＫＢ作用は細胞
を種々の方法で誘導されるアポトーシスから保護する生存シグナルを提供する［
１４、１５］。従って、遺伝子増幅およびその他の機構によるＰＫＢの活性化は
細胞外増殖および生存シグナルとは無関係に増殖し得る悪性細胞の発生に寄与し
得る。
【０２２４】 ＰＫＢは−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−モチーフ中にある
セリンまたはトレオニン残基でタンパク質およびペプチドをリン酸化する［１６
］。インスリンシグナル伝達では、ＰＫＢの２種の生理的基質はタンパク質キナ
ーゼであるグリコーゲンシンターゼキナーゼー３（ＧＳＫ３）［１７、１８］、
およびＰＦＫ２の心臓アイソフォーム［７、１９］であるようである。ＰＫＢに
よるリン酸化はＧＳＫ３活性を阻害し、脱リン酸化ならびにグリコーゲンシンタ
ーゼおよびタンパク質合成開始因子ｅｌＦ−２Ｂの活性化をもたらす［２０］。
これらの現象はおそらくグリコーゲン合成およびタンパク質合成それぞれのイン
スリン誘導性刺激に寄与する。ＰＫＢは心臓ＰＦＫ２を活性化するが、これは心
臓において認められる解糖のインスリン誘導性刺激の下にあると考えられる。ア
ポトーシスに対する細胞の保護では、ＢＡＤがＰＫＢの生理的基質の１つである
ようである［１４、１５］。ＢＡＤはその脱リン酸化型でＢｃｌファミリーのメ
ンバーであるＢｃｌＸＬと相互作用し、それによっていくつかの細胞においてア
ポトーシスを誘導する。しかしながら、Ｓｅｒ１３６でＰＫＢによってリン酸化
されると、ＢＡＤはＢｃｌＸＬから解離し、かわりに１４−３−３タンパク質と
相互作用し、アポトーシスが妨げられる［２１］。
【０２２５】 インスリンまたは増殖因子に応じたＰＫＢの活性化にはリン酸化が必要であり
［２２、２３］、これは２つの部位で起こる［２３］。これらは保存されたサブ
ドメインVIIとVIIIの間の触媒ドメインの「活性化ループ」内の−Ｔｈｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−モチーフ中に位置するＴｈ
ｒ３０８およびＣ末端に近い、疎水性モチーフ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｓｅ ｒ −Ｐｈｅ−中に位置するＳｅｒ４７３である。両配列モチーフはシグナル伝達
に重要な役割を果たすいくつかのタンパク質キナーゼ中に存在する［７、２４、
２５］。ＰＫＢ中の両部位のリン酸化はＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼの阻害剤によ
って妨げられる［２２］。Ｔｈｅ３０８は３−ホスホイノシチド依存性タンパク
質キナーゼ−１（ＰＤＫ１）によってリン酸化され［２６、２７］、またＳｅｒ
４７３はＰＤＫ２活性と呼ばれる別のタンパク質キナーゼ活性によってリン酸化
されるが、これはＰＤＫ１に保持されている場合もある(Balendran et al (1999
) Current Biology 9, 393-404)。
【０２２６】 ＰＫＢはin vitroではＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ［
３，４］Ｐ２を含有する脂質小胞の存在下でＰＤＫ１によってのみ活性化され得
る［２６］。前者の脂質はＰｔｄＩｎｓ［４，５］Ｐ２からＰｔｄＩｎｓ３−キ
ナーゼによって生じ、いくつかの異なるクラスの５−ホスホイノシチド５−ホス
ファターゼの１つによって後者に変換され得る［２８、２９］。３−ホスホイノ
シチドはＰＫＢのＮ末端でプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインに結合し［３０
、３１］、おそらくはそれによってコンホメーション変化を誘導し、これにより
Ｔｈｒ３０８がＰＤＫ１に接しやすくなる。ＰＤＫ１もまた触媒ドメインのＣ末
端にＰＨドメインを有し［２７］、これはＰＫＢのＰＨドメインと結合するより
もさらにより密接にＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３およびＰｔｄＩｎｓ［３，
４］Ｐ２と結合する［３２、３３］。ＰＤＫ１の３−ホスホイノシチドとの相互
作用は、おそらくは脂質小胞へのそれらの共通の結合を介してＰＤＫ１とＰＫＢ
が遭遇することが容易になることによってin vitroでＰＫＢの活性化を増強して
いる。ＰＫＢに加え、ＰＤＫ１もＰＫＢのＴｈｒ３０８と同一の配列モチーフ内
の同等の位置にあるトレオニン残基をリン酸化することによって、ｐ７０Ｓ６キ
ナーゼ［２５、３４］、特定のＰＫＣアイソフォーム［３５］、およびより最近
では、ＳＧＫ［３６］などのいくつかのその他のタンパク質キナーゼをin vivo
で活性化するという証拠が増えている。ＰＫＢ同様、これらの酵素も第２のＰＤ
Ｋ１依存性リン酸化部位の１６０〜１６５残基Ｃ末端に位置し［７］、従って、
おそらくＰＤＫ２タンパク質キナーゼ活性の基質であろう、疎水性のリン酸化共
通配列を含む。
【０２２７】 ＰＤＫ１およびＰＫＢクラスの酵素が総ての真核細胞においてシグナル伝達の
ための生命にかかわる機能を担っているとすれば、これらの分子は進化的に保存
されているはずである。これまでに本発明者らはこの経路は明らかにショウジョ
ウバエ、ショウジョウバエに存在するということを示している［２７］。本明細
書では、本発明者らはＰＤＫ１様およびＰＫＢ様タンパク質キナーゼが単細胞の
真核微生物、サッカロミセス・セレビシエ（パン酵母）にさえ存在するというこ
とを遺伝的にin vivoで、生化学的にin vitroでの双方で証明している。さらに
、本発明者らはこれらの酵素は細胞増殖および生存能力に不可欠であるというこ
とを示す。さらなる発見は動物細胞におけるように、ＰＫＢ様酵素のほかにもＰ
ＤＫ１様遺伝子産物もその他のクラスのタンパク質キナーゼの活性化において役
割を果たすようであるということを示唆する。
【０２２８】 結果 ＰＫＨ１およびＰＫＨ２は哺乳類ＰＤＫ１の相同体をコードしている 酵母サッカロミセス・セレビシエのゲノムは２つのこれまでには同定されてい
ない、その触媒ドメインが互いに７２％同一であるヒトまたはショウジョウバエ
ＰＤＫ１のいずれかと５０％のアミノ酸配列同一性を共有するタンパク質キナー
ゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＹＤＲ４９０ｃおよびＹＯＬ１
００ｗ）を含んでいる（図１Ａ）。従って、（「ＰＫＢ活性化キナーゼ相同体１
および２」ということから）これらの遺伝子座をそれぞれＰＫＨ１およびＰＫＨ
２と呼んだ。ＰＫＨ１は染色体IVの右腕に位置し［３７］、７６６個の残基のタ
ンパク質（８６ｋＤａ）をコードし；ＰＫＨ２は染色体XVの左腕に位置し［３８
］、１，０８１個の残基のタンパク質（１２１ｋＤａ）をコードする。Ｐｋｈ１
およびＰｋｈ２ポリペプチドはまたＮ末端延長および長いＣ末端延長を含み（図
１Ｂ）、これらの領域ではお互いの類似性はかなり低い（２７％の同一性）。こ
れらのドメインには、ＰＤＫ１の非触媒領域と有意な相同性はなく、またその他
の公知のタンパク質とも有意な相同性がない。特に、Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２は
ヒトおよびショウジョウバエＰＤＫ１双方のＣ末端付近に認められるＰＨドメイ
ンを欠いている。
【０２２９】ＰＫＨ１およびＰＫＨ２は機能的に重複する必須遺伝子である ＰＫＨ１およびＰＫＨ２が発現される遺伝子であるかどうか確定する手段とし
て、これらの遺伝子座における機能損失変異の表現型への作用を調べた。この目
的のために、各オープンリーディングフレームを削除し選択マーカーで置換した
。得られた対立遺伝子、ｐｋｈ１Δ：：ＴＲＰ１およびｐｋｈ２ΔＨＩＳ３を用
いて相同組換えによって正常な染色体遺伝子座を置換した。半数体ｐｋｈ１Δ：
：ＴＲＰ１変異体（ＡＣ３０１）および半数体ｐｋｈ２Δ：：ＨＩＳ３変異体（
ＡＣ３０３）は双方とも正常に増殖し、同一四分子から単離された類遺伝子性Ｐ
ＫＨ１＋およびＰＫＨ２＋半数体と区別できないほどであった。さらに、ｐｋｈ
１Δおよびｐｋｈ２Δ単一変異体は細胞が塩もしくはカフェインの高濃度、種々
の炭素源および種々の温度をはじめとする種々の条件下に曝露された場合、また
は熱ショックに付された場合にも明らかな表現型を全く示さなかった。 ＰＫＨ１およびＰＫＨ２が共通の機能を共有するかどうかを確定するために、
ＡＣ３０１株（ＭＡＴ ｐｋｈ１Δ：：ＴＲＰ１）をＡＣ３０３株（ＭＡＴａ
ｐｋｈ２Δ：：ＨＩＳ３）と交雑させた。得られた二重ヘテロ接合性二倍体（Ａ
Ｃ３０６）の胞子形成時に、解剖した３０個の四分子の大半は３個の生存可能な
胞子と１個の生存不能な胞子を生じた（図２Ａ）。生存可能な胞子を適当な選択
培地に蒔くことよって、およびＰＣＲによっての双方で分析した（図２Ｂ）。生
存可能な半数体細胞にはＴｒｐ＋かつＨｉｓ＋のものは全くなく、ｐｋｈ１Δお
よびｐｋｈ２Δ変異の双方ともは保持していなかった。生存不能胞子の顕微鏡観
察によりほとんどは出芽し、増殖がとまる前に２または３サイクルの細胞分裂が
進行していたと示された。従って、ｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ二重変異体は生存不能
であり、このことはＰＫＨ１およびＰＫＨ２が、機能的に重複し、かつ、細胞増
殖および生存に必須のいくつかの役割を共有する遺伝子コードしているというこ
とを示すものである。
【０２３０】 ｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞の致死性がＰＫＨ１またはＰＫＨ２機能がないこと
のみに起因したということを確認するために、ＡＣ３０６をＹＥｐｌａｃ１９５
−ＰＫＨ１、すなわち、その内因性プロモーターからＰＫＨ１を発現するＵＲＡ
３で標識したプラスミドまたは空のベクター（ＹＥｐｌａｃ１９５）のいずれか
で形質転換し、得られたＵｒａ＋形質転換体を胞子形成および四分子解剖に付し
た。ＹＥｐ１９５−ＰＫＨ１で形質転換された二倍体から多数のＴｒｐ１＋Ｈｉ
ｓ＋およびＵｒａ＋胞子クローンを同定できたが、空のベクターで形質転換され
たものからは同定できなかった（示されていないデータ）。従って、ｐｋｈ１Δ
ｐｋｈ２Δ二重変異体はプラスミドからＰＫＨ１を発現すれば生存できた。同様
に、ＡＣ３０６を、ＧＡＬ１プロモーターからＰＫＨ１（図３Ａ）またはＰＫＨ
２（データ省略）のいずれかを発現するＵＲＡ３で標識したプラスミド（ｐＹＥ
Ｓ２）で形質転換した場合には、細胞をグルコースで増殖させても生存可能なｐ
ｋｈ１Δｐｋｈ２Δ胞子を得ることができた（おそらくは用いた特定の構築物は
この炭素源で効果的に抑制されないために［３９］）。さらに、ｐＹＥＳ２−Ｐ
ＫＨ１（図３Ｂ）またはｐＹＥＳ２−ＰＫＨ２（データ省略）のいずれかを保持
するｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞を、機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠く細胞を選抜し［
４０］、従ってＵＲＡ３で標識したｐＹＥＳ２プラスミドの欠失を選択する、５
-フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を含有する培地に蒔いた場合には、ｐｋｈ１
Δｐｋｈ２Δ細胞はもはや増殖できなかった（図３Ｂ）。
【０２３１】ヒトＰＤＫ１はＰｋｈ１およびＰｋｈ２の機能的相同体である Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２が機能において、ならびに配列においてＰＤＫ１と相
同であるかどうかを決定するために、ＡＣ３０６を、原株のＰＫＨ１プロモータ
ーの制御下で全長ヒトＰＤＫ１またはそのＣ末端ＰＨドメインを欠くヒトＰＤＫ
１（ＰＤＫ１−ΔＰＨ）のいずれかを発現するＹＥｐｌａｃ１９５で形質転換し
た。このベクターからのＰＤＫまたはＰＤＫ１−ΔＰＨのいずれかの発現により
生存可能なｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ胞子の回収が可能となった（図４Ｂ）。さらに
、５−ＦＯＡ培地に蒔くことによるこれらのＵＲＡ３で標識したプラスミドに対
する選抜はｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ二重変異体の増殖を妨げたが、同一のプラスミ
ドを保持するｐｋｈ１Δまたはｐｋｈ２Δ単一変異体は妨げなかった（図４Ｂ）
。生存可能なｐｋｈΔｐｋｈ２Δ二重変異体の胞子はまた、ＡＣ３０６を、ＧＡ
Ｌ１プロモーターからＰＤＫ１またはＰＤＫ１−ΔＰＨのいずれかを発現するベ
クター（ｐＹＥＳ２）で形質転換した場合に、細胞をグルコース含有培地で発芽
、増殖させても回収できたが、これはおそらく用いた特定の構築物がこの炭素源
で効果的に抑制されないためであろう（データ省略）。これらの結果はＰＤＫ１
の触媒ドメインはＰｋｈ１およびＰｋｈ２の機能の代わりをするのに十分である
ということを証明し、またＰＤＫ１は酵母細胞においてＰｋｈ１およびＰｋｈ２
と同一の必須な標的基質をリン酸化し得るということを示唆する。
【０２３２】Ｐｋｈ１キナーゼ活性の精製および特性決定 ＰＫＨ１コード領域はヒト２９３細胞ではＧＳＴへの融合体として発現され、
細胞溶解物からアフィニティークロマトグラフィーによってグルタチオンセファ
ロースで精製した。得られた物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで一本のクーマシーブルー
染色によるバンドを示し、ＧＳＴ−Ｐｋｈ１融合体として予測される分子量と一
致する１１２ｋＤａ種として移動した。Ｍｇ２＋−ＡＴＰ基質、Ｐｋｈ１（Ｄ２
６７Ａ）と結合することにとって重大な意味を持つと知られている保存された残
基で変更された触媒的に不活性な（「キナーゼが働かない」）変異体も発現され
精製した。このＧＳＴ−ＫＤ−Ｐｋｈ１構築物を対照として用いた。 ＧＳＴ−Ｐｋｈ１の活性はＧＳＴ−ＰＫＢ、すなわち、ヒトＰＤＫ１の公知の
基質をリン酸化し、かつ活性化するその能力によって評価した。ＰＫＢのリン酸
化は［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有する反応で標識を組み込むことによって評価し
た。ＰＫＢの活性はそのＧＳＴ−Ｐｋｈ１とのインキュベーション後に特異的ペ
プチド基質であるクロスチド(Crosstide)をリン酸化するその能力によって測定
した［１７］。酵母Ｐｋｈ１はヒトＰＫＢを活性化することができ（図５Ａ）、
ＰＫＢのＰＨドメインと相互作用すると知られている３−ホスホイノシチドを含
有する脂質小胞が存在するということを示した。ＰＫＢのＰｋｈ１依存性リン酸
化（図５Ｂ）と認められた活性化度（図５Ａ）の間には良好な相関があった。Ｐ
ｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３もしくはＰｔｄＩｎｓ［３，４］Ｐ２を除去する
か、またはＰｔｄＩｎｓ［４，５］Ｐ２もしくはＰｔｄＩｎｓ−３Ｐで置換した
場合には、ＰＫＢの活性化またはリン酸化は全く認められなかった。ヒトＰＤＫ
１に関して認められたように（図５Ｃおよび５Ｄ）、Ｐｋｈ１は天然に存在する
ＰｔｄＩｎｓ［３，４、５］Ｐ３のステアロイルアラキドニル誘導体の存在下で
ジパルミトイル誘導体の存在下よりもより効率的にＰＫＢをリン酸化し、かつ活
性化した。ＧＳＴ−ＫＤ−Ｐｋｈ１は試験したいずれの条件下でもＰＫＢを活性
化またはリン酸化しなかった（データ省略）。
【０２３３】 ＰＫＢ中の残基がＰｋｈ１によってリン酸化されたことを確定するために、［
γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でインキュベーションを延長することによってＧＳ
Ｔ−ＰＫＢのリン酸化を完了させ、トリプシンで切断し、得られた消化物をＲＰ
−Ｃ１８カラムでＨＰＬＣによって分離した。１種の主要な標識されたリンペプ
チドのみが認められた（データ省略）。この種の溶出位置はヒトＰＤＫ１によっ
てリン酸化されたＰＫＢのトリプシン消化によって得られたリンペプチド（残基
３０８〜３２８）のものと一致していた。３２Ｐ標識した物質はＳｅｒ４７３を
含むＰＫＢペプチドに相当する位置で溶出した。Ｐｋｈ１によって標識したペプ
チドはホスホトレオニンを含んでおり（かつ、その他のホスホアミノ酸は含んで
いない）、総ての放射能は１サイクルのエドマン分解後に放出された（データ省
略）。この分析により酵母Ｐｋｈ１はＰＫＢをＴｈｒ３０８、すなわち、ヒトＰ
ＤＫ１によってリン酸化される同一の残基でリン酸化するということが証明され
る。従って、酵母およびヒトの酵素はin vitroにおいてこの基質を用いる同一の
特異性を示す。
【０２３４】ＹＰＫ１およびＹＫＲ２は哺乳類ＰＫＢの相同体をコードする ＰＫＢはタンパク質キナーゼのいわゆるＡＧＣサブファミリーの基本メンバー
の１つである。さらに、ＰＤＫ１はＰＫＢおよびこのサブファミリーの数種のそ
の他のメンバーをこれらの酵素の触媒ドメイン中の保存されたエレメントVIIとV
IIIの間に位置する、いわゆる「活性化ループ」に存在する特定のモチーフでリ
ン酸化すると知られている（図６Ａ）。さらに、これらの標的の総てはまた、も
う１つのタンパク質キナーゼ活性（ＰＤＫ２）のためにＣ末端リン酸化部位に種
々の共通配列を共有している。Ｓ．セレビシエゲノムはこれまでに同定された４
種のタンパク質キナーゼをコードするが、これらはこれらの同一モチーフの双方
を保持する（図６Ａ）。ＹＰＫ１遺伝子は哺乳類のサイクリック依存性タンパク
質キナーゼの触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡをプローブとして用いて酵
母ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって最初に同定された［４
１］。同様に、ＹＰＫ２とも呼ばれる［４２］高度に関連のあるＹＫＲ２遺伝子
が哺乳類ＰＫＣｃＤＮＡプローブを用いるライブラリースクリーニングによって
まず同定された［４３］。ＳＣＨ９遺伝子は過剰発現された場合にＲａｓの活性
化に欠陥のある細胞の致死性を救うその能力によって同定された［４４］。最後
に、ＰＫＣ１遺伝子が主要な哺乳類ＰＫＣアイソタイプの本物の酵母相同体とし
て同定された［４５］。しかしながら、これらの４種の遺伝子産物の間では、Ｙ
ｐｋ１およびＹｋｒ２の触媒ドメインは８８％の同一性、ならびにそれらのＮお
よびＣ末端延長部分の全域で広範な類似性を共有する。最も重要なことに、利用
可能なデータベース中の、哺乳類ＳＧＫ（５８％の同一性）［３６、４６］、Ｐ
ＫＢ（５４％の同一性）およびｐ７０Ｓ６キナーゼ（５２％の同一性）をはじめ
とするその他のタンパク質キナーゼ総ての間で、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の触媒
ドメインがＡＧＣサブファミリーのメンバーと最高の類似性を共有する（図６Ｂ
）。ＡＲＫ（５０％の同一性）［４７］は別のＡＧＣサブファミリーのメンバー
であるが共通リン酸化ＰＤＫ１モチーフを保持しない。この配列相同性によりＹ
ｐｋ１およびＹｋｒ２がＰｋｈ１およびＰｋｈ２の生理的基質であり得るという
可能性が高まった。
【０２３５】ＹＰＫ1およびＹＫＲ２は機能的に重複する必須遺伝子である これまでにＹｐｋ１またはＹｋｒ２のいずれかを欠く細胞は生存可能であるが
、他方、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の双方を欠く細胞は生存不能であるということ
が報告されている［４２］。この観察結果を確認し、可能性ある哺乳類相同体の
この生存不能を救う能力が容易に試験できる株を作出するために、別な方法で同
質遺伝子性ｙｐｋ１Δ：：ＨＩＳ３およびｙｋｒ２ΔＴＲＰ１半数体株（それぞ
れ、ＹＥＳ５およびＹＥＳ１）を構築し、交雑させて二重ヘテロ接合性二倍体（
ＹＥＳ７）を形成させた。この二倍体をＧＡＬ１プロモーターの厳密な制御の下
でＹＫＲ２遺伝子を発現するＬＥＵ２で標識したプラスミドで形質転換し、Ｌｅ
ｕ＋形質転換体をガラクトース含有培地での胞子形成および四分子解剖に付した
。これらの条件下で、ほとんどの四分子は４種の生存可能胞子を生じ、Ｈｉｓ＋
Ｔｒｐ＋Ｌｅｕ＋単離物が容易に回収されたが、他方、Ｌｅｕ＋形質転換体をグ
ルコースで胞子形成させた場合には、Ｈｉｓ＋Ｔｒｐ＋Ｌｅｕ＋胞子は回収でき
なかった（データ省略）。さらに、ＹＰＫ１およびＹＫＲ２機能の双方がない場
合は致死性であると予測されたように、予めガラクトース培地で維持された、ｐ
ＧＡＬ−ＹＫＲ２を保持するｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ二重変異体をグルコース培地
で画線培養した場合には細胞は増殖できなかったが、他方、そうではなく同質遺
伝子性野生型細胞または同一のプラスミドを保持するｙｐｋ１Δおよびｙｋｒ２
Δ単一変異体はグルコースで良好に増殖した（図７）。これらの結果はＹＰＫ１
およびＹＫＲ２は、機能的に重複し、かつ、細胞増殖および生存に必須であるい
くつかの役割を共有する遺伝子をコードするということを証明する。しかしなが
ら、本発明者らの思いのままに、ｙｐｋ１変異体は液体培養または固体寒天培地
のいずれかで検出可能な程度によりゆっくりと増殖するが、同質遺伝子性野生型
細胞またはｙｋｒ２Δ変異体はそうではない（データ省略）。
【０２３６】ＰＫＢ関連酵素、ＳＧＫはＹｐｋおよびＹｋｒ２の機能的相同体である 哺乳類タンパク質キナーゼのｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ二重変異体の致死性を救う
能力を試験するために、二倍体ＹＥＳ７をＵＲＡ３で標識し、かつ、内因性プロ
モーターからＹＫＲ２を発現する低コピー数（ＣＥＮ）プラスミドで形質転換し
た。Ｕｒａ＋形質転換体を胞子形成させ、解剖し、プラスミドからのＹＫＲ２の
発現によって維持されたｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ半数体を示すＨｉｓ＋Ｔｒｐ＋Ｕ
ｒａ＋胞子（ＹＰＴ２８株）を回収した。次いで、ＹＰＴ２８を空のＬＥＵで標
識した高コピー数（２μｍＤＮＡ）ベクター（ｐＡＤ４ＭもしくはＹＥｐ３５１
ＧＡＬ）またはＹＰＫ１、ＹＫＲ２、もしくはラットＳＧＫ、マウスＰＫＢ／ｃ
−ＡＫＴ、ラットｐ７０Ｓ６キナーゼ、もしくはウシβＡＲＫをコードするｃＤ
ＮＡを発現する（ＧＡＬ１プロモーターもしくは構造ＡＤＨ１プロモーター［４
８］のいずれかから）同一のベクターのいずれかで形質転換した。ラットＳＧＫ
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図１２および１３にそれぞれ示されている
。これらの株の総てはＹＫＲ２を発現するプラスミドが存在するためにガラクト
ース培地で増殖でき、このことはまた試験した異種タンパク質キナーゼの発現の
いずれも酵母細胞増殖に悪影響を及ぼさなかったということを証明する（図８Ａ
）。対照的に、それによりｐＹＫＲ２（ＵＲＡ３）プラスミドの欠失を要求する
５−ＦＯＡを含有する同一培地に蒔いた場合には、予測されたように、空のＬＥ
Ｕ２で標識したベクターを保持するｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ細胞は増殖できず、他
方、ＹＰＫ１またはＹＫＲ２のいずれかを発現するプラスミドを保持するものは
やはり生存可能であった。同様に、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の必須機能を担うこ
とができるその他のタンパク質キナーゼのいずれも５−ＦＯＡでの増殖を可能に
するはずである。試験した４種の哺乳類ｃＤＮＡのうち、ＳＧＫのみがｙｐｋ１
Δｙｐｋ１Δ二重変異体の有効な補完を示した（図８Ａ）。しかしながら、本発
明者らはまた、ＰＫＢによるわずかな補完を再現性良く認め、それでは数パーセ
ントのコロニーが生存できた（おそらくは、公知の分離効率の低さ［４９］によ
る２μｍＤＮＡプラスミドの集積に起因する極めて高いレベルのＰＫＢを発現す
る細胞を示す）。総ての哺乳類タンパク質キナーゼは酵母（ＳＣＧａｌ−Ｌｅｕ
で増殖させた）中で高レベルで産生され、適当な抗体での免役ブロッティングに
よって判断されるように、また酵母細胞の抽出物を適当な特異的基質でアッセイ
することによって判断されるように活性であった（データ省略）。従って、ｐ７
０Ｓ６キナーゼおよびβＡＲＫが補完できなかったことはそれらが発現しなかっ
たためではなかった。特にｐ７０Ｓ６キナーゼは動物細胞においてかかる複雑な
調節の下にあるので［５０］、Ｎ、ＣおよびＮおよびＣ末端双方の末端切断も同
様にして試験した。総てが発現されたが、ｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ細胞の致死性を
救うことができたものはなかった（データ省略）。
【０２３７】 哺乳類タンパク質キナーゼの補完する能力をアッセイするための独立した方法
でこれらの結果を確認するために、前記の同一のプラスミドを、ＹＫＲ２に無発
現変異（ｙｋｒ２Δ）およびＹＰＫ１に温度感受性（ｔｓ）変異（ｙｐｋ１−１ ｔｓ ）を保持するために温度条件性増殖を示す酵母株（ＹＰＴ４０）（このうち
の後者は材料および方法で詳細に記載したように作出した）に導入した。予測さ
れたように、総ての形質転換体が許容温度（２６℃）で増殖でき、他方、空のベ
クターを保持する株（ＹＥｐ３５１ＧＡＬ）は制限温度（３５℃）で生存できな
かったが、同一のベクターからＹＰＫ１を発現する株は良好に増殖した（図８Ｂ
）。これまでに認められたように、ＳＧＫを発現する細胞も３５℃で良好に増殖
でき、またＰＫＢを発現する細胞もわずかながら増殖でき、それでは微小コロニ
ーが強い最初の画線の外側に認められたが、他方、ｐ７０Ｓ６キナーゼまたはβ
ＡＲＫを発現する細胞は増殖しなかった（図８Ｂ）。
【０２３８】Ｙｐｋ１および哺乳類ＳＧＫはＰｋｈ１の有効な基質である 前記の節で記載した観察結果に基づけば、Ｙｐｋ１（および／またはＹｋｒ２
）はＰｋｈ１（および／またはＰｋｈ２）の生理的基質であるはずである。さら
に、酵母Ｐｋｈ１（および／またはＰｋｈ２）は、ＰＤＫ１がＳＧＫをリン酸化
し、かつ活性化し得るとこれまでに示されたように［３６］、in vitroで哺乳類
ＳＧＫをリン酸化し、かつ活性化し得るはずである。これらの仮説を調べるため
に、Ｙｐｋ１およびＮ末端の６０個のアミノ酸を欠くＳＧＫ［３６］を２９３細
胞中にＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製した。各精製タンパク質はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥでその予想分子量とよく一致する見かけの移動性を有する一本の
クーマシーブルーで染色されるバンドを生じた（データ省略）。いずれかのその
他の因子の不在下では、精製ＧＳＴ−Ｙｐｋ１はペプチド基質（クロスチド）に
対する検出可能な活性を示さなかった。しかしながら、精製ＧＳＴ−Ｐｋｈ１と
プレインキュベーションした後には、ＧＳＴ−Ｙｐｋ１は活性化され、ＰｔｄＩ
Ｎｓ［３，４，５］Ｐ３を含有する脂質小胞の存在または不在下で基質への容易
に検出可能なレベルの組み込みを触媒した（図９Ａ）。Ｐｋｈ１依存性リン酸化
に起因する活性化と一致して、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを反応に含む場合には、Ｇ
ＳＴ−Ｙｐｋ１への標識の組み込みが容易に検出され（図９Ｂ）、これはもっぱ
らホスホトレオニンとして存在した（データ省略）。「キナーゼが働かない」誘
導体、ＧＳＴ−ＫＤ−Ｙｐｋ１（Ｄ４８８Ａ）（材料および方法を参照）はＧＳ
Ｔ−Ｐｋｈ１によってリン酸化されたが、予想されたように、触媒的に活性では
なかった（データ省略）。また、予想されたように、ＧＳＴ−ＳＧＫはin vitro
でＧＳＴ−Ｐｋｈ１とのインキュベーション時にリン酸化および活性化の双方が
なされたが、ＧＳＴ−ＰＤＫ１によってさらにより効率的にになされた（図９Ｃ
および９Ｄ）。
【０２３９】 Ｙｐｋ１中のＰｋｈ１リン酸化部位をマッピングするための１つの手段として
、ＧＳＴ−Ｙｐｋ１（Ｔ５０４Ｄ）変異体を２９３細胞中で発現させ、精製した
。変更された残基はＰＫＢα中のＰＤＫ１標的残基（Ｔｈｒ３０８）と同等のも
のである。予想されたように、ＧＳＴ−Ｙｐｋ１（Ｔ５０４Ｄ）はＰｋｈ１によ
って検出可能な程度にはリン酸化されず（図１０）、このことはＰｋｈ１はＹｐ
ｋ１をこの残基でリン酸化するという結論と一致する。ＧＳＴ−Ｙｐｋ１（Ｔ５
０４Ｄ）は構造的に活性でなくＰＫｈ１によって活性化もされないので、この位
置のＡｓｐをホスホトレオニンで置換してこのタンパク質キナーゼを活性化する
ことはできない。Ｙｐｋ１はまた、ＰＫＢα中のＳｅｒ４７３と同等の、ＰＤＫ
２リン酸化のための推定される共通部位（Ｔｈｒ６６２）（図６Ａ）を含む。２
９３細胞から発現され、精製されたＧＳＴ−Ｙｐｋ１（Ｔ６６２Ｄ）も不活性で
あったが、このタンパク質はＧＳＴ−Ｙｐｋ１自身と同一の方法でＰｋｈ１によ
ってリン酸化され、かつ活性化された（図１０）。Ｔｈｒ５０４とＴｈｒ６６２
の双方がＡｓｐに変異されたＹｐｋ１の形態も作製した。このＧＳＴ−Ｙｐｋ１
（Ｔ５０４Ｄ Ｔ６６２Ｄ）変異体もＭｇ２＋−ＡＴＰおよびＧＳＴ−Ｐｋｈ１
とのインキュベーションの前または後でも検出可能な活性を示さなかったが、こ
のことはＰＫＢαとは異なり、これらの残基のＡｓｐへの変異体はホスホトレオ
ニンで置換して構造的に活性な酵素を生じることができないということを証明す
る。
【０２４０】Ｙｐｋ１の基質特異性はＰＫＢと同様である ＰＫＢαは最小共通配列Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｙｄ（ここ
で、Ｈｙｄはかさ高い疎水性残基である）でその基質をリン酸化する［１６］。
関連配列の数系列のペプチド基質を用いて、Ｐｋｈ１により活性化されるＹｐｋ
１によるリン酸化効率は、ＰＤＫ１によって活性化されるＰＫＢに関して認めら
れたものと全く同様であると認められた（表２）。さらに、リン酸化速度に対す
る変更の作用はほとんど同一の傾向を示した。例えば、ＰＫＢαについて認めら
れたように、ＡｒｇのＬｙｓへの、またはＰ−５Ａｒｇの不在、あるいはＰ＋１
疎水性残基の不在のいずれかを変更することは総てＹｐｋ１によるリン酸化を大
幅に減少させるかまたは完全にリン酸化させなかった。
【０２４１】 考察 本明細書で、本発明者らはＳ．セレビシエは哺乳類ＰＤＫ１およびＰＫＢファ
ミリーのメンバーと配列、in vivoでの生理的機能、およびin vitroでの生化学
的特異性の点で相同なタンパク質キナーゼを含むと示した。詳しくは、本発明者
らは、まず、２種のこれまでに同定されていない、現在はＰＫＨ１およびＰＫＨ
２遺伝子と示されるオープンリーディングフレームはＰＤＫ１様タンパク質キナ
ーゼをコードするということを証明した。いずれかの酵素がなくとも明らかな表
現型を示さないが、他方、両酵素を欠く細胞は生存不能であるのでＰｋｈ１およ
びＰｋｈ２の機能は重複していると考えられる。哺乳類ＰＤＫ１のＮ末端触媒ド
メインの発現のみで十分にｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞の致死性を克服する。この
発見と一致して、精製Ｐｋｈ１はＰＫＢおよびＳＧＫをはじめとする哺乳類ＰＤ
Ｋ１の公知の基質をリン酸化し、かつ活性化し、ならびに、分析したところＰＤ
Ｋ１と同一の残基（ＰＫＢα中のＴｈｒ３０８）をリン酸化している。
【０２４２】 次に、本発明者らはＹＰＫ１およびＹＫＲ２遺伝子産物はＰＫＢ様タンパク質
キナーゼであるということを証明した。これまでの報告［４２］と一致して、本
発明者らはＹｋｒ２の欠失は識別できる表現型を示さない、Ｙｐｋ１の不在はゆ
っくりした細胞増殖をもたらす、およびｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ二重変異体は生存
不能であるということを見出したが、これらのことはこれらのタンパク質キナー
ゼもいくらか機能的に重複しているということを示唆するものである。ＰＫＢα
に密接に関連し、明らかなＮ末端ＰＨドメインを欠くＳＧＫの発現はｙｐｋ１Δ
ｙｋｒ２Δ細胞の致死性を効率的に救う。本発明者らはＰＫＢ自身ではｙｐｋ１
Δｙｋｒ２Δ二重変異体のわずかな増殖しか維持できないということを観察した
。この後者の結果はサッカロミセス・セレビシエはＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］
Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ［３，４］Ｐ２のいずれかを生じ得る酵素機構を欠く［
５２〜５４］のでＰＫＢは酵母において不活性状態で広範に存在するという予想
と一致する。これらのリン脂質の結合はＰＫＢにおいてコンホメーションの拘束
を解放するために明らかに必要であり、それによって哺乳類ＰＤＫ１または本発
明者らが示したように、酵母Ｐｋｂ１のいずれかにとって有効な基質であること
が可能となる。この状況はおそらく、何故酵母タンパク質の４種（Ｐｋｈ１、Ｐ
ｋｈ２、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２）総てが認識できるＰＨドメインを欠くのか、
および何故Ｙｐｋ１のＰｋｈ１依存性活性がかかる３−ホスホイノシチドの存在
または不在によって影響を受けないのかということも説明するであろう。実際、
Ｐｋｈ１はこのリン脂質がＰＤＫ１と密接に結合する条件下ではＰｔｄＩｎｓ［
３，４，５］Ｐ３と結合しない（示されていない結果）。従って、ＰＫＢのＰｋ
ｈ１媒介性活性のみがＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３またはＰｔｄＩｎｓ［３
，４］Ｐ２を含有する脂質小胞の存在下で効率的に起こるという事実により、こ
れらの３−ホスホイノシチドはＰＫＢαのＰＨドメインと相互作用することのみ
によってその作用を及ぼすということが明確に確認される。Ｐｋｈ１およびＰｋ
ｈ２の活性化をもたらす、またはこれらの酵素の補充を特定の細胞下位置へ集結
するシグナルはまだわかっていない。同様に、Ｙｐｋ１およびＹｒ２のＰｋｈ１
およびＰｋｈ２との遭遇を容易にするシグナルもわかっていない。
【０２４３】 Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の触媒ドメインはまた、むしろｐ７０Ｓ６キナーゼお
よびβＡＲＫをはじめとする動物細胞由来のその他のＡＧＣサブファミリーのタ
ンパク質キナーゼと同様であるという事実にもかかわらず、これらの酵素は酵母
において活性型で発現されるもののＹｐｋ１およびＹｋｒ２を欠く細胞の検出可
能な増殖を維持することが全くできなかった。in vivoでの機能的補完に加え、
その他の結果もＹｐｋ１およびＹｋｒ２はＰＫＢ様酵素に相当すると示す。第１
に、ＰＫＢおよびＳＧＫをリン酸化し、かつ活性化するその能力同様、酵母Ｐｋ
ｈ１はin vitroでＹｐｋ１をリン酸化し、かつ活性化することができる。第２に
、突然変異生成研究によりＰｋｈ１はＹｐｋ１をＰＤＫ１によっておよびＰｋｈ
１によってリン酸化されるＰＫＢ中の位置（Ｔｈｒ３０８）に相当する残基（Ｔ
ｈｒ５０４）でリン酸化するということが示された。最後に、本発明者らは一連
の合成ペプチド基質を用いて、Ｐｋｈ１により活性化されるＹｐｋ１はin vitro
でＰＤＫ１により活性化されるＰＫＢによって示されたもの［１６］とほとんど
同一の基質特異性を有すると見出した。
【０２４４】 詳しくは、Ｙｐｋ１はＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄ
モチーフ中に存在するＳｅｒおよびＴｈｒ残基をリン酸化できた。従って、Ｙｐ
ｋ１およびＹｋｒ２の生理的基質のいくつかはこの共通配列を含み得る。しかし
ながら、哺乳類ＰＫＢαのいくつかの公知の基質の酵母相同体でこの正準部位の
完全対応物を含むものは全くない。例えば、Ｓ．セレビシエゲノム中にコードさ
れる４種のＧＳＫ相同体［５５］のうち哺乳類ＰＫＢによって標的とされるＧＳ
Ｋ３アイソフォームのＮ末端に存在するＡｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒモ
チーフを保持するものはなかった。また、酵母ＰＦＫ２はＰＦＫ２の心臓アイソ
フォームにおいて認められる２つのＣ末端Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ
モチーフを欠いている。従って、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の生理学的に関連する
基質はまだ確定されようと残っている。
【０２４５】 ひとまとめに考えると、これらの結果はＹｐｋ１（および、おそらくはＹｋｒ
２）は酵母細胞の増殖および生存の双方に必須であるタンパク質キナーゼカスケ
ードにおいてＰｋｈ１（および／またはＰｈｋ２）の下流に存在するということ
を示す。哺乳類細胞では、ＰＤＫ１はＰＫＢに加え、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、特定
のＰＫＣアイソタイプ、および最も最近ではＳＧＫをはじめとするＡＧＣサブフ
ァミリーのいくつかの異なるタンパク質キナーゼの活性化にあずかると考えられ
ており［３６］、これは本明細書で示された結果と一致する。Ｙｐｋ１およびＹ
ｋｒ２は酵母細胞の生存能力に必須であるＰｋｈ１およびＰｋｈ２の唯一の基質
であるのか？いくつかの観察結果によりＰＤＫ１については動物細胞では、Ｐｋ
ｈ１およびＰｋｈ２は複数の標的を有するということが示されている。第１に、
ヒトＰＫＢはＴ３０８Ｄ変異（ＰＤＫ１部位における）によって、またはＳ４７
３Ｄ変異（ＰＤＫ２部位における）によって部分的に活性化され、両変異が同時
に存在することによってほとんど完全に活性化され得る［２２］。それにもかか
わらず、かかるＰＫＢ（Ｔ３０８Ｄ Ｓ４７３Ｄ）変異の発現はｐｋｈ１Δｐｋ
ｈ２Δ二重変異体の栄養増殖を維持できない（ｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ胞子の出芽
に続き、かかる構築物の発現により増殖の停止が起こる前にＰＫＢ自身の発現よ
りもより多いサイクルの細胞分裂が可能となり、顕微鏡下で認識できる微小コロ
ニーが生じるものの（結果省略））。第２に、Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２がＰｋｈ
１およびＰｋｈ２の唯一の必須標的であり、かつ、Ｐｋｈ１および／またはＰｋ
ｈ２依存性リン酸化の不在下で何らかの基礎的な活性を保持しているとすれば、
これらの酵素の激しい過剰発現によりＰｋｈ１およびＰｋｈ２機能が必要である
ことは無視されるであろう。しかしながら、多コピープラスミド上にある強力な
ＧＡＬ１プロモーターからのＹｐｋ１またはＹｐｋ２のいずれかの総過剰産生（
およそ５０倍）もｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞の生存不能を救わない（示されてい
ない結果）。哺乳類ＰＫＢαと対照的に、ＰＫＢα中のＴｈｒ３０８およびＳｅ
ｒ４７３と同等の残基をＡｓｐに突然変異させることによって酵母Ｙｐｋ１また
はヒトＳＧＫ［３６］の構造的に活性な変異体を作製することが可能であるとは
まだ証明されていない。従って、本発明者らはＹｐｋ１（またはＳＧＫ）の構造
的に活性な型がｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ二重変異体の致死性を救うことができるか
どうか調べることはできなかった。第３に、１つのその他の可能性あるＰｋｈ１
およびＰｋｈ２基質であるＰｋｃ１は、適切な細胞壁生合成および高浸透圧性ス
トレス下での生存に必要なＭＡＰキナーゼ（Ｓｌｔ２／Ｍｐｋ１）を制御するタ
ンパク質キナーゼカスケードの先頭に位置するために（［５６］に概説された）
、標準的な増殖条件下での酵母細胞生存能力にとって必須であると知られている
［４５］。 しかしながら、再度、Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２が複数の必須標的を
有すると予測されたように、ＰＫＣ１の過剰発現によってｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ
細胞の致死性を救う試みも不成功であった（結果省略）。しかしながら、もう１
つの可能性あるＰｋｈ１およびＰＫｈ２標的であるＳｃｈ９は遺伝的結果を基に
３種の酵母サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットに匹
敵し、機能において大きく重複する経路においてエフェクター酵素として役立っ
ていると考えられている［４４］。実際、さらなる遺伝的結果は、ヘテロ三量体
Ｇタンパク質のαサブユニット、Ｇｐａ２の活性化はＲａｓ２の活性化ではなく
Ｓｃｈ９の活性化をもたらすということを示唆している［５７］。Ｙｐｋ１のみ
の不在と同様に、Ｓｃｈ９の欠失は明らかに細胞周期のＧ１期の延長によるゆっ
くりとした増殖を引き起こす［４４］。
【０２４６】 興味深くは、哺乳類ＰＫＢα、ｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＳＧＫと同様に、Ｙ
ｐｋ１、Ｙｋｒ２、Ｐｋｃ１およびＳｃｈ９をはじめとする酵母Ｐｋｈ１および
ＰＫｈ２の公知の、および推測される基質も総てＰＤＫ２タンパク質キナーゼ活
性によるリン酸化のための共通配列（Ｐｈｅ−Ｘ−Ｘ−Ｐｈｅ／Ｔｙｒ−Ｓｅｒ
／Ｔｈｒ−Ｐｈｅ／Ｔｙｒ）をＰｋｈ１（および、おそらくはＰｋｈ２）によっ
てリン酸化されると知られている（または推測される）Ｔｈｒに関して同様の位
置（１６０〜１６５残基Ｃ末端）に含んでいる。この保存は第１にＳ．セレビシ
エゲノムはＰＤＫ２様機能を有する１種（またはそれ以上）のタンパク質キナー
ゼコードし、第２に、この酵素は動物細胞においてＰＤＫ１およびＰＤＫ２活性
に関して認められたように、おそらくＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２であるか
、またはそれと協調的に作用していくつかの標的タンパク質キナーゼの活性化を
制御するということを強く示唆する（図１１）。
【０２４７】 結論 本発明者らは本明細書で酵母Ｓ．セレビシエは、種々の細胞外刺激に応じた哺
乳類細胞の適当な代謝調節および生存のために非常に重要な２種のエフェクター
酵素、ＰＤＫ１およびＰＫＢの機能的相同体を保持するということを証明した。
この保存はこれらの２つのクラスのタンパク質キナーゼの生理的役割は進化的に
全く古代のものであり、かつ、総ての真核細胞の増殖および生存能力の中心であ
るに違いないということを示唆する。これらのタンパク質が酵母中に存在するこ
とでＰＤＫ様酵素、Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２の上流アクチベーターおよびＰＫＢ
様酵素、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の下流基質の双方を同定するための遺伝的アプ
ローチの適用が可能となるはずである。次いで、かかる情報はこれまでには思い
も寄らない様式の哺乳類ＰＤＫ１の調節およびＰＫＢのこれまでには知られてい
なかった可能性ある標的に光を当て得る。さらに、酵母における分析は、ＰＤＫ
１とともに動物細胞におけるＰＫＢの完全な活性化に必要であり、おそらくは酵
母におけるＹｐｋ１およびＹｋｒ２の完全な活性化にも必要である、いまだ特性
決定されていないＰＤＫ２酵素の性質を明らかにすることを補助し得る。
【０２４８】 材料および方法 細胞培養 本研究に用いたＳ．セレビシエ株は表１に記載されており、ＡＹＳ９２７（Ｗ
３０３背景）またはＹＰＨ４９９（Ｓ２８８Ｃ背景）のいずれかの同質遺伝子性
誘導体であった。酵母細胞は３０℃にて１％の酵母抽出物、２％のペプトン（Di
fco）および２％のグルコースを含有する栄養豊富培地（ＹＰＤ）、または炭素
源としてガラクトース（Ｇａｌ）もしくはグルコース（Ｇｌｃ、もしくはデキス
トロースについてはＤ）のいずれかを含有し、マーカーおよびプラスミドの選抜
を維持するのに適当な栄養素を添加した合成最小培地（Ｓ）で増殖させた［５８
］。酵母の遺伝子操作のための標準的な方法［５８、５９］を用いた。大腸菌細
胞（典型的にはＤＨ５）は３７℃にて（必要であれば）プラスミド選抜のために
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するルリア−ベルターニ培地［６０］で増
殖させた。
【０２４９】 組換えＤＮＡ技術 制限酵素消化、ＤＮＡ連結およびその他の組換えＤＮＡ手順は記載されたよう
に実施した［６０］。細菌細胞の形質転換はエレクトロポレーションを用いて達
成した。酵母細胞の形質転換は酢酸リチウム法をわずかに改変した方法によって
達成した［６１、６２］。本研究に用いたＰＫＨ１およびＰＫＨ２遺伝子、なら
びにいくつかの構築物に用いたＹＰＫ１遺伝子はＡＹＳ９２７株のゲノムＤＮＡ
からExpand High Fidelity PCR系（Boehringer Mannheim）でのＰＣＲ増幅を用
いて回収し、ゲルをクリスタルゲレックスキット（Cambridge Molecular Techno
logies, Cambridge, UK）を用いて精製し、ＴＯＰＯ系（Invitrogen）を用いて
まずｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。位置指定突然変異誘
発はクイックチェンジキット（Strategene）を用い、製造業者により提供された
使用説明書に従って実施した。総てのＤＮＡ構築物は自動ＤＮＡシークエンサー
（モデル３７３,Applied Biosystems）を用いる自動ＤＮＡ配列決定によって確
認した。
【０２５０】 酵母ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅 ＰＫＨ２コード領域を増幅するために用いたプライマーは５’−ＣＧ （ＧＧ
Ａ ＴＣＣ） ＧＣＣ ＡＣＣ [ＡＴＧ] ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴＡ
ＡＧＧ ＡＴＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＧ−３’（正）および５’−ＡＴＡ ＡＧ
Ａ ＡＴ （ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣ） [ＴＴＡ] ＣＧＡ ＣＣＴ ＣＴＴ Ｃ
ＧＡ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＧ−３’（逆）であり、それぞれＢａｍＨＩおよびＮ
ｏｔ部位（イタリック体（括弧（ ）で表示）で示される）を組み込んだ。ＰＫ
Ｈ１コード領域を増幅するために用いたプライマーは５’−ＡＴＡ ＡＧＡ Ａ
Ｔ （ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣ） ＴＧＣ ＣＡＣ Ｃ [ＡＴＧ] ＧＡＧ ＣＡ Ｇ ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＣＴ ＴＧ ＧＧＡ
ＡＡＴ ＡＧＧ ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＡＧ ＡＧＧ−３’（正）および５’−
ＡＴＡ ＡＧＡ ＡＴ （ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣ） [ＴＣＡ] ＴＴＴ ＴＴＣ
ＡＴＣ ＴＧＴ ＣＣＧ ＴＧＴ Ｃ−３’（逆）であり、ＮｏｔＩ部位（イ
タリック体で示される（括弧（ ）で表示））を組み込んだ。５’−プライマー
は双方とも１０残基ｃ−Ｍｙｃエピトープタグをコードする配列（下線を引いた
）を含んでいた。ＹＰＫ１遺伝子を増幅するために用いたプライマーは５’−（
ＧＧＡ ＴＣＣ） ＧＣＣ ＡＣＣ [ＡＴＧ] ＴＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＡ Ｔ ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＴＧＧ ＡＡ
Ｇ ＴＴＴ ＡＡＧ−３’（正）および５’−（ＧＧＴ ＡＣＣ） [ＣＴＡ]
ＴＣＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＡＣＣ ＴＴＧ Ｃ−３’（逆）であり、Ｂ
ａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限部位（イタリック（括弧（ ）で表示））をそれぞ
れ組み込んだ。総てのこれらのプライマー中のイニシエーターまたは終結コドン
も示されている（太字（括弧[ ]で表示））。
【０２５１】 遺伝子分断および株の構築 ＰＫＨ１およびＰＫＨ２遺伝子の分断にはＰＣＲを基にした方法［６３］を用
いた。ｐｋｈ２Δ：：ＨＩＳ３変異体を作製するために、プライマーとして５’
−ＡＡＧ ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＡＣ ＴＡＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＴＴ ＧＴＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＡＴ
ＴＴＴ ＣＣＧ−３’（正）（ここで、下線を引いた配列はＰＫＨ２開始コドン
からのヌクレオチド−９３〜５３に相当し、プライマーの残りの部分はＨＩＳ３
の開始コドンからのヌクレオチド−３２６〜−３１１に相当する）、および５’
−ＴＡＡ ＧＴＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＡＧ ＡＴＡ ＡＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ Ａ [ＴＴＡ] ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＧＴ ＴＣＡ
ＡＧＡ Ｇ−３’（ここで、下線を引いた配列はＰＫＨ２終結コドン（太字（括
弧[ ]で表示））の直後のヌクレオチドに相当し、残りの部分はＨＩＳ終結コド
ンの後ろのヌクレオチド２０４〜１８９に相当する）を用いてＨＩＳ３をｐＲＳ
３１３［６４］から増幅した。得られた３．３ｋｂの産物を二倍体株（ＡＹＳ９
２７）のＤＮＡ媒介性形質転換に用いた。形質転換体はＳＤ−Ｈｉｓプレートで
選抜し、Ｈｉｓ＋単離体の１つから適当なプライマーを用いてＰＣＲ分析によっ
て分断を確認した。このヘテロ接合性ＰＫＨ２／ｐｋｈ２Δ：：ＨＩＳ３二倍体
（ＡＣ２００）を胞子形成させ、得られた四分子を解剖した。胞子クローンを選
択培地に蒔くことによって分析し、ＰＣＲによって確認してｐｋｈ２Δ：：ＨＩ
Ｓ３分断を含む半数体（ＡＣ３０３）を同定した。ｐｋｈ１Δ：：ＴＲＰ１変異
体を作製するために、ｐＲＳ３１４中のＴＲＰ１マーカー［６４］を５’−ＧＣ Ａ ＣＧＴ ＧＴＡ ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＧＡ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＴＡ ＣＴ Ａ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＡＡ Ｔ [ＡＴＧ] ＧＴＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＴＧ
ＣＡＣ Ｃ−３’（正）（ここで、下線を引いた配列は開始コドン（太字（括
弧[ ]で表示））のすぐ上流のヌクレオチドに相当し、残りの部分はＴＲＰ１の
開始コドンから−３００〜２８５ヌクレオチドに位置するヌクレオチドに相当す
る）、および５’−ＴＡＴ ＴＡＴ ＧＣＡ ＴＴＡ ＣＡＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＣＧ
ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡ Ｃ−３’（逆）（ここで、下線を引いたヌ
クレオチドはＰＫＨ１終結コドンの＋６９〜２５後ろに位置に相当し、プライマ
ーの残りの部分はＴＲＰ１終結コドンの＋５１〜３６ヌクレオチド後ろの位置す
る領域に相当する）を用いて増幅した。得られた２．４ｋｂの産物をＡＹＳ９２
７の形質転換に用い、形質転換体はＳＤ−Ｔｒｐプレートで選抜した。分断はＴ
ｒｐ＋単離体の１つから適当なプライマーを用いてＰＣＲ分析によって確認した
。このヘテロ接合性二倍体ＰＫＨ１／ｐｋｈ１Δ：：ＴＲＰ１（ＡＣ２０１）を
胞子形成させ、解剖し、分析し、ｐｋｈ１Δ：：ＴＲＰ１変異を含む半数体胞子
（ＡＣ３０１）を同定した。 ｙｐｋ１−Δ１：：ＨＩＳ３対立遺伝子とｙｋｒ２−Δ１：：ＴＲＰ１対立遺
伝子［６５］の双方では、両酵素の全触媒ドメインのコード配列を削除して示さ
れたマーカーで置換した。ｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ二重変異体を作製するために、
ＭＡＴαｙｐｋ１Δ株（ＹＥＳ５）をｐＹＫＲ２（ＵＲＡ３）（以下を参照）を
保持するＭＡＴａｙｋｒ２Δ株（ＹＥＳ１）にかけ合わせた。得られた二倍体を
胞子形成および四分子解剖に付し、プラスミドから生じたＹＫＲ２遺伝子を保持
することで生存しているＭＡＴａｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ細胞に相当するＨｉｓ＋
Ｔｒｐ＋Ｕｒａ＋胞子をＹＰＴ２８と呼んだ。温度条件性ｙｐｋ１−１ｔｓｙｋ
ｒ２Δ株（ＹＰＴ４０）を作出するために、まずＹＰＫ１の温度感受性対立遺伝
子を以下のように作製した。ベクター、ｐＧＥＭ３（商標）（promega）のＸｂ
ａＩ部位にクローニングされたＹＰＫ１遺伝子［４１］を含むゲノム挿入部分（
Richard A. Maurerから厚意により提供された（当時University of Iowa, Iowa
City, IAで））を４．１ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片として切り出し、ＬＥＵ
２含有ベクター、ｐＲＳ３１５［６４］に挿入してｐＲＳ３１５−ＹＰＫ１を得
た。次いで、ＹＰＫ１の触媒ドメインをコードする配列を中程度にエラーを起こ
しやすい条件下でＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer
Cetus）を用いて、鋳型としてｐＲＳ３１５−ＹＰＫ１およびヌクレオチド７８
８（ここで、ＡＴＧ開始コドンの最初の塩基が＋１である）で始まる配列に相当
する５’−プライマー（Ｐ１）、５’−ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＡ
Ｔ ＧＧＣ−３’および終結コドンの６８ｂｐ下流から始まるフランクしている
ゲノム配列に相当する３’−プライマー（Ｐ２）、５’−ＣＴＴ ＧＡＡ ＣＡ
Ｃ ＡＧＴ ＡＡＧ ＴＡＡ ＣＧＧ−３’を用いて増幅した。得られた１３５
０ｂｐの直線状のＰＣＲ産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＮｃｏＩでの消化に
よって作製し、さらにゲル精製した、ｐＲＳ３１５−ＹＰＫ１の〜９ｋｂの直線
状断片とともにＹＰＴ２８に同時形質転換した。形質転換体は２６℃にてＳＣＤ
−Ｌｅｕプレートで選抜した。この手順はＰＣＲ産物の各末端に存在する相同配
列での組換えによる裂けたプラスミドのin vivo修復を介する、親ベクター中で
の相当する配列の可能性ある変異配列での置換および環状プラスミドの再生を考
慮に入れている［６６、６７］。ＬＥＵ２含有プラスミドが２６℃で機能的ＹＰ
Ｋ１を発現したということを確定するために、続いてＬｅｕ＋形質転換体を、レ
シピエントｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ株に当初は存在するｐＹＫＲ２（ＵＲＡ３）プ
ラスミドの欠失を選抜する、５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）［３９］を含
有する−Ｌｅｕプレートでレプリカ平板培養した。ＹＰＫ１およびＬＥＵ２含有
プラスミドがＹＰＫ１の温度感受性対立遺伝子を保持するということを確定する
ために、Ｌｅｕ＋Ｕｒａ＋細胞をレプリカ平板法によって３７℃でのＳＣＤ−Ｌ
ｅｕプレートでのそれらの増殖能について調べた。１種の形質転換体がこの温度
で再現性よく増殖できないと確認された。この株（ｐｙｐｋ１ＴＳ）に保持され
るＬＥＵ２含有プラスミドを回収し［６８］、プラスミド中のＹＰＫ１オープン
リーディングフレームの直接ヌクレオチド配列分析により２つのアミノ酸置換（
Ｉ４８４ＴおよびＹ５３６Ｃ）の存在が示された。サブクローニングおよび再形
質転換によりこれらの変異が温度感受性（ｔｓ）表現型を付与するのに十分であ
るということを確認し、この対立遺伝子をｙｐｋ１−１ｔｓと呼んだ。ｙｐｋ１
−１ｔｓ対立遺伝子を用いて正常なＹＰＫ１染色体遺伝子座をｙｐｒ２Δ株（Ｙ
ＥＳ１）に以下のように転座させた。まず、ＰＣＲを用いて、ｐｙｐｋ１ＴＳ中
にＹＰＫ１コード配列の終結コドンから下流にＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ制限部
位９６および１０８ｂｐをそれぞれ含有する特製ＤＮＡ断片を作製し、この断片
を３’フランキング領域の対応するセグメントと置換してｐＩＮＴを得た。ベク
ター、ｐＲＳ３０３［６４］から切り出したＨＩＳ３遺伝子を含む２．６ｋｂの
ＳｃａＩ−ＢａｍＨＩ断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化して
おいたｐＩＮＴに挿入し、ｐＩＮＴ−ＨＩＳを得たところ、これはｌｅｕ２ｈｉ
ｓ３株、ＹＰＨ４９９［６４］にロイシンおよびヒスチジン双方の原栄養体性を
付与できた。最後に、ｙｐｋ１−１ｔｓ対立遺伝子、ＨＩＳ遺伝子、およびＨＩ
Ｓ３遺伝子をその３’部位にフランクするＹＰＫ１遺伝子座由来のさらなるゲノ
ムＤＮＡを含むｐＩＮＴ−ＨＩＳ由来の４．６ｋｂのＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片を
ゲル精製し、ＹＥＳ１の形質転換に用いた。Ｈｉｓ＋形質転換体を２６℃で選抜
し、次いで、組み込まれたｙｐｋ１−１ｔｓ対立遺伝子が存在すること（かつ正
常なＹＰＫ遺伝子座がないこと）を形質転換体から単離したＤＮＡのＰＣＲ分析
によって、およびかかる細胞が３７℃で増殖できないということを証明すること
によって確認した。これらの判断基準の総てを満たす１種のかかる単離体をＹＰ
Ｔ４０株と呼んだ。
【０２５２】 プラスミド 哺乳類２９３細胞中でのＧＳＴ融合体としてのＰＫＨ１、ＹＰＫ１の発現のた
めに、相当するコード配列を適当なｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ誘導体から切り出し
、哺乳類発現ベクター、ｐＥＢＧ−２Ｔ［６９］に挿入した。ＰＫＢ［２６］、
ＰＤＫ１［２７］およびＮ末端の６０個の残基を欠くＳＧＫ［３６］を他の文書
に記載のようにｐＥＢＧ−２Ｔベクターにサブクローニングした。酵母中でのＰ
ＫＨ１の発現のために、まず、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター中の内部Ｓｍａ
Ｉ部位（開始コドンから約２５０ｂｐ下流に位置する）からＥｃｏＲＩ部位まで
の２．１ｋｂの断片を、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化しておいた２μｍのＤ
ＮＡベクター、ＹＥｐｌａｃ１９５［７０］に挿入してＹＥｐｌａｃ１９５−２
．１ＰＫＨ１を得た。５’末端を修復するために、１Ｋｂの断片を開始コドンの
ヌクレオチド６２８〜６３４上流に相当するプライマー５’−ＧＣＴ ＴＧＡ
ＣＴＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＧＣ ＧＡＣ−３’（正）、および開始コドンの３
５０ｂｐ下流に位置する領域に相当する５’−ＡＣＡ ＴＧＣ ＴＴＡ ＧＴＴ
ＡＡＣ ＴＣＣ−３’（逆）を用いるＰＣＲによって増幅した。得られた産物
を、まず、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、次いで、これをＳｍａＩ
およびＳｐｈＩで消化して０．９Ｋｂの断片を遊離させ、これをＳｐｈＩおよび
ＳｍａＩで消化しておいたＹＥｐｌａｃ１９５−２．１ＰＫＨ１構築物に挿入し
、ＰＫＨ遺伝子の完全コード領域および０．５Ｋｂのそのプロモーター領域を含
み、選択マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を保持するＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＫＨ
１を得た。ＧＡＬ１プロモーターの制御下でＰＫＨ１を発現させるために、ｍｙ
ｃタグをつけた種類の全ＰＫＨ１コード配列を含む２．３ＫｂのＮｏｔＩ−Ｎｏ
ｔＩ断片をＵＲＡ３で標識した２μｍのＤＮＡを含有するベクター、ｐＹＥＳ２
［７１］に挿入してｐＹＥＳ２−ＰＫＨ１を得た。同様に、ＧＡＬ１プロモータ
ー制御下でＰＫＨ２を発現させるために、全ＰＫＨ２オープンリーディングフレ
ームを含む３．３ＫｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＹＥＳ２に挿入してｐＹ
ＥＳ２−ＰＫＨ２を得た。
【０２５３】 哺乳類ＰＤＫ１を酵母中でＰＫＨ１プロモーターの制御下で発現させるために
、第１に、ＰＫＨ１プロモーター領域に相当する０．７Ｋｂの断片をプライマー
５’−ＧＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＴ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＧ
Ｃ ＧＡＣ−３’（正）およびＰＤＫ１コード配列の開始部分（下線を引いた）
に相当する５’−ＣＴＴ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ Ｔ ＡＴＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＴＡ ＧＴＡ−３’（逆）を用いるＰ
ＣＲによってＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＫＨ１構築物から増幅した。第２に、ＰＤ
Ｋ１のＮ末端配列を含んでなる１．４Ｋｂの断片を、プライマーとして０．７の
ＰＣＲ増幅産物（正）およびＰＤＫ１の残基１９０〜１８４に相当する５’−Ａ
ＣＡ ＣＧＡ ＴＣＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＴＧＴ ＡＡＡ Ａ−３’（逆）を用
いてヒトＰＤＫ１ｃＤＮＡから増幅した。１．４Ｋｂの産物をＫｐｎＩ部位（イ
タリック）およびＨｉｎｄIII（これはＰＤＫ１コード配列中の内部部位で切断
する）でも切断した。得られたＫｐｎＩ−ＨｉｎｄIII断片を用いて、完全なＰ
ＤＫ１コード配列を含む構築物中のＰＤＫ１タンパク質のＮ末端をコードする０
．５Ｋｂのセグメントを置換してＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＤＫ１を得るか、また
はその触媒ドメインに相当するＰＤＫ１の最初の４０４個の残基のみを含み、そ
のＣ末端ＰＨドメインを欠く構築物中で置換してＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＤＫ１
−ΔＰＨを作製するかのいずれかとした。ヒトＰＤＫ１をＧＡＬ１プロモーター
の制御下で発現させるために、完全なＰＤＫ１コード配列を含む２．０ＫｂのＢ
ｇｌII−ＸｂａＩ断片をｐＹＥＳ２に挿入してｐＹＥＳ−ＰＤＫ１を得た。同様
に、ＰＤＫ１のキナーゼドメインを含むがＰＨドメインを欠く１．４ＫｂのＢｇ
ｌII−ＸｂａＩ断片をｐＹＥＳ２に挿入してｐＹＥＳ２−ＰＤＫ１−ΔＰＨを作
出した。
【０２５４】 ＹＫＲ２を酵母中でＬＥＵ２で標識した高コピー数（２μｍのＤＮＡに基づく
）プラスミドからＧＡＬ１プロモーターの制御下で発現させるために、全ＹＫＲ
２オープンリーディングフレーム［４３］を含むゲノムＤＮＡの２．４ＫｂのＸ
ｈｏＩ−ＨｉｎｄIII断片をｐＵＣ１８中（Shigeo Ohno、東京都臨床医学総合研
究所の分子生物学部、東京、日本から厚意により提供された）の挿入部分から切
り出し、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄIIIでの消化によって直線状にしておいたベク
ター、ＹＥｐ３５１ＧＡＬ［７２］に連結してｐＧＡＬ−ＹＫＲ２を得た。本質
的に同一のアプローチを用いてゲノムＤＮＡ断片（上記参照）から切り出したＹ
ＰＫ１を発現させ、ｐＧＡＬ−ＹＰＫ１を得た。あるいは、ＰＣＲによって作製
した、ＨＡタグをつけた種類のＹＰＫ１コード配列をコードする２．１ＫｂのＢ
ａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＹＥＳ２に挿入してｐＹＥＳ−ＹＰＫ１を得た。Ｙ
ＫＲ２遺伝子をＵＲＡ３遺伝子を保持する低コピー数（ＣＥＮ）プラスミド上の
その内因性プロモーターの制御下に配置するために、最初のｐＵＣ１８中のＹＫ
Ｒ２を含む挿入部分の２．５ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ
で直線状にしておいたベクター、ｐＲＳ３１６［６４］に連結してｐＹＫＲ２（
ＵＲＡ３）を作製した。そのＣ末端にモノクローナル抗体９Ｅ１０［７３］によ
って認識されるｃ−Ｍｙｃエピトープでタグをつけた種類のＹｐｋ１を作製する
ために、１種の鋳型としてｐＧＥＭ３にクローニングされたＹＰＫ１配列、およ
びその他の鋳型としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）にクローニングさ
れたＭｙｃエピトープとそれに続く（Ｈｉｓ）６タグの１６個の残基からなる種
類をコードする配列、および３種の適当な合成オリゴヌクレオチドプライマー：
Ｐ１；Ｔ３（Stratagene）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中の配列に相当す
る５’−ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧ−３’、およ
び「接合」プライマー（Ｐ３）、ＹＰＫ１コード配列の３’末端およびｃ−Ｍｙ
ｃエピトープの最初の数残基に相当する５’−ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ
ＣＴＴ ＴＴＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＡＣＣ ＴＴＧ
Ｃ−３’を用いて正確な遺伝子融合体を求めるＰＣＲを基にした方法［７４］
を実施した。得られた産物の２ＫｂのＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片を用いて最初のＹ
ＰＫ１含有ｐＧＥＭベクター中の相当するセグメントを置換してｐＹＰＫ１ｍｙ
ｃを得た。ｐＹＰＫ１ｍｙｃの１．２ＫｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片を用い
てｐＧＡＬ−ＹＰＫ１の相当するセグメントを置換してｐＧＡＬ−ＹＰＫ１ｍｙ
ｃを得た。
【０２５５】 ＳＧＫを酵母中で発現させるために、ラットＳＧＫｃＤＮＡ（Webster et al
(1993) Mol Cell Biol 13(4),2031-2040）をコードする１．３ＫｂのＮｃｏＩ−
ＥｃｏＲＩ断片をｄＮＴＰの存在下での大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片での処理によって平滑末端に変換し、ＳｍａＩで直線状にしておいたベ
クターｐＡＤ４Ｍ［７５］中のＡＤＨ１プロモーターの後ろに挿入した。断片の
正しい方向は適当な制限酵素消化物によって確認した。本質的に同一のアプロー
チを用いてウシβＡＲＫを発現させてｐＡＤＨ−βＡＲＫを得た（これはHenrik
Dohlman (Thormer laboratory)によって構築された）。ＰＫＢを酵母中で発現
させるために、マウスｃ−Ａｋｔをコードする１．５ＫｂのＢａｍＨＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を二重ハイブリッドおとりベクター、ｐＡＳIIＡ（Zhou Songyang, Dep
artment of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA
から提供された）中の挿入部分から切り出し、ＢａｍＨＩでの消化によって直線
状にしておいたＹＥｐ３５１ＧＡＬに連結してｐＧＡＬ−ＰＫＢを得た。あるい
は、ヒトＰＫＢｃＤＮＡ［１］をコードする２．５ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
断片をｐＹＥＳ２に挿入してｐＹＥＳ−ＰＫＢαを作製した。さらに、Ｔｈｒ３
０８およびＳｅｒ４７３がＡｓｐで置換されているＰＫＢαの構造的に活性な変
異体種［２２］を発現する１．５ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ挿入部分をｐＹＥ
Ｓ２挿入してｐＹＥＳ２−ＤＤ−ＰＫＢαを作出した。ｐ７０Ｓ６キナーゼを酵
母中で発現させるために、ラットｐ７０Ｓ６キナーゼ［７６］をコードする１．
６ＫｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片をｐ２Ｂ４（George Thomas, Friedrich Miesc
her Institute, Basel, Switzerlandから提供された）から切り出し、ＸｂａＩ
−ＳａｌＩでの消化によって直線状にしておいたＹＥｐ３５１ＧＡＬに挿入して
ｐＧＡＬ−Ｓ６Ｋを得た。さらに、ｐ７０Ｓ６キナーゼのＮ末端切断物、Ｃ末端
切断物ならびに二重ＮおよびＣ末端切断物（John Blenis, Department of Cell
Biology, Harvard Medical School, Boston, MAから厚意により提供された）（
その構築物は他の文書［５１］に詳細に記載されている）も、本質的に同一の方
法を用いて酵母発現ベクター、ＹＥｐ３５２［７８］に各々メチオニンで抑制可
能なＭＥＴ３プロモーター［７８］の制御下に挿入した。
【０２５６】 位置指定突然変異誘発 Ｐｋｈ１の触媒的に不活性な（「キナーゼが働かない」）種類（ＫＤ−Ｐｋｈ
１）を作製するために、Ａｓｐ２７６（ＧＡＴ）をＡｌａ（ＧＣＴ）に変更した
。この位置は総てのタンパク質キナーゼにおいてＭｇ２＋−ＡＴＰ基質の認識に
重大な意味を持つ保存された残基に相当する［７９］。同様に、触媒的に不活性
なＹｐｋ１誘導体（ＫＤ−Ｙｐｋ１）はＡｓｐ４８８（ＧＡＴ）をＡｌａ（ＧＣ
Ｔ）に変更することによって作製した。構造的に活性なＹＰＫ１誘導体を作製し
ようとして、Ｐｈｋ１依存性リン酸化部位（Ｔｈｒ５０４）およびＰＤＫ２タン
パク質キナーゼ活性によるリン酸化のためのコンセンサスに一致するもう１つの
推定リン酸化部位（Ｔｈｒ６６２）を双方ともＡｓｐコドンで置換した。
【０２５７】 ＧＳＴ−Ｐｋｈ１、ＧＳＴ−Ｙｐｋ１およびＧＳＴ−ＳＧＫの発現および精製 ヒト胚性腎臓細胞株２９３を４０枚の１０ｃｍシャーレで培養し、各シャーレ
を改変リン酸カルシウム法［６０］を用いて２０μｇの適当な発現構築物でトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、各シャーレの細胞を
回収し、細胞を５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１
ｍＭのＥＧＴＡ、１％（容積で）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのオルト
バナジン酸ナトリウム、１０ｍＭのβ−グリセロール−リン酸ナトリウム、５０
ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１μＭの微小シスチン−ＬＲ、
１ｍＭのベンズアミジン、０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（
ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび０．１％（容積で）の２−メ
ルカプトエタノールを含む１ｍｌの氷冷溶解バッファー中で破裂させた。４０種
の溶解物をプールし、４℃にて１０分間の１３，０００ｘｇでの遠心分離によっ
て不純物を除き、ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン−セファロースでのアフ
ィニティークロマトグラフィーによって精製した［２６］。約０．５ｍｇの各精
製ＧＳＴ融合タンパク質が得られ、スナップを液体Ｎ２中のアリコートで凍結し
て−８０℃で保存した。
【０２５８】 Ｙｐｋ１、ＳＧＫおよびＰＫＢ活性の測定 Ｙｐｋ１のアッセイを２つの段階で実施した。まず（段階１）、ＧＳＴ−Ｙｐ
ｋ１を以下のようにＧＳＴ−Ｐｋｈ１およびＭｇ２＋−ＡＴＰとのインキュベー
ションによって活性化した。２．５μＭのＰＫＩ、１μＭの微小シスチン−ＬＲ
、１０ｍＭのＭｇ酢酸塩、１００μＭの未標識ＡＴＰおよび０．６μＭのＧＳＴ
−Ｙｐｋ１を含む反応混合物（１８μｌ）をバッファーＡ［５０ｍＭのＴｒｉｓ
／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡおよび０．１％（容積で）の２−
メルカプトエタノール］で調製した。１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む
バッファーＡ中の２μｌの５０ｎＭのＧＳＴ−Ｐｋｈ１の添加によって反応を開
始し、３０℃で３０分間インキュベートした。第２に（段階２）、２．５μＭの
ＰＫＩ、１μＭの微小シスチン−ＬＲ、１０ｍＭのＭｇ酢酸塩、１００μＭの［
γ３２Ｐ］ＡＴＰ（２００〜４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）および１００μＭのクロ
スチド（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ）［１７］、すなわちペプチドリン受容体基質
を含むバッファーＡ中の３０μｌの混合物を加えることによって、活性化された
Ｙｐｋ１をアッセイした。３０℃で１５分間インキュベートした後、各反応混合
物の一部（４５μｌ）を小さな正方形のホスホセルロース紙（Whatman P81）に
スポットすることによって反応を終結させ、これを記載のように［８０］洗浄し
て分析した。ＧＳＴ−Ｙｐｋ１またはＧＳＴ−Ｐｋｈ１のいずれかを省いた対照
反応はこれらのタンパク質双方の存在下で測定された放射能の５％未満の組み込
みしかもたらさなかった。１単位のＧＳＴ−Ｙｐｋ１活性は１ｎモルのクロスチ
ドのリン酸化を１分で触媒するのに必要とされる量として規定した。ＳＧＫおよ
びＰＫＢ活性のアッセイは、アッセイの第１段階でＧＳＴ−ＳＧＫおよびＧＳＴ
−ＰＫＢαをＧＳＴ−Ｙｐｋ１に置換したという点を除いて同様に実施した。
【０２５９】 Ｐｋｈ１によるＧＳＴ−Ｙｐｋ１、ＧＳＴ−ＰＫＢおよびＧＳＴ−ＳＧＫのリ ン酸化 インキュベーションは未標識ＡＴＰの代わりに［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（５００
〜１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を用い、かつ、反応を１％の最終濃度までＳＤＳ
を添加することによって終結させたという点を除いて前記のＹｐｋ１アッセイの
段階１と同様であった。得られたサンプルを７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲルで分離し、クーマシーブルーで染色した後にオートラジオグラフィーに
よって分析した。また、注目されるＧＳＴ融合タンパク質に相当する染色された
バンドを切り出し、組み込まれた放射能量を液体シンチレーション計数によって
定量した。ＧＳＴ−Ｐｋｈ１のヒトＰＫＢαをリン酸化し、かつ活性化する能力
は、ＧＳＴ−Ｐｋｈ１による酵母Ｙｐｋ１のリン酸化および活性化に関して直前
に記載したものと、結果において記載のように反応を種々の３−ホスホイノシチ
ド［２６］を含む脂質小胞の存在下で実施したという点を除いては同一の方法を
用いて調べた。
【０２６０】 Ｙｐｋ１基質特異性の決定 ＧＳＴ−Ｙｐｋ１はＰｋｈ１を用いてin vitroで活性化し、クロスチドを結果
において詳細に論じられた１００μＭのペプチドと置き換えたという点を除いて
は前記のような、標準的なアッセイ条件下でインキュベートした。トランスフェ
クトされたＩＧＦ刺激性２９３細胞［２６］由来のＧＳＴ−ＰＫＢを平行してア
ッセイした。
【０２６１】 参照文献
【０２６２】
【０２６３】
【０２６４】
【０２６５】 表１ 用いたサッカロミセス・セレビシエ株 株 遺伝子型 起源 AYS927 MATa/MATα ade2-1/ade2-1 his3-11,15/his3-11,15 M.J.R. Stark leu2-3,112/leu2-3,112 trp1-1/trp1-1 ura3-1/ura3-1 can1-100/can1-100 ssd1-d2/ssd1-d2 AC200 AYS927 PKH2/pkh2△::HIS3 本研究 AC201 AYS927 PKH1/pkh1△::TRP1 本研究 AC303 MATa pkh2△::HIS3(AC200由来) 本研究 AC301 MAT pkh1△::TRP1(AC201由来) 本研究 AC306 MATa/MATα PKH1/pkh1△::TRP1 PKH2/pkh2△::HIS3 本研究 (AC303 X AC301) YPH499 MATa ade2-101ｏｃ his3-△200 leu2-△1 lys2-801ａｍ [64] trp1-△1 ura3-52 YPH500 MATα (他の点はYPH499と同系) [64] YES1 YPH499 ykr2-△1::TRP1 本研究 YES5 YPH500 ypk1-△1::HIS3 本研究 YES7 MATa/MATα YPK1/ypk1△::HIS3 YKR2/ykr2△::TRP1 本研究 (YES1 X YES5) YPT28 MATa ypk1△::HIS3 ykr2△::TRP1[pYKR2(URA3)] 本研究 YPT40 MATa ypk1-1１５ ykr2△ 本研究
【０２６６】 表２ 酵母Ｙｐｋ１および哺乳類ＰＫＢαの基質選択性
【表２】 ＊参照文献１６からとったデータ
【０２６７】実施例２：ヒトＰＤＫ１阻害剤のスクリーニングアッセイ 親（Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２に関して野生型）のＳ．セレビシエ細胞
および内因性Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２遺伝子が不活化され、かつＰｋｈ１プロモ
ーターの制御下でヒトＰＤＫ１が発現するＳ．セレビシエ細胞に対する化合物の
作用を比較する。ＰＤＫ１発現細胞の増殖に作用するがＰｋｈ１／Ｐｋｈ２発現
細胞（野生型）の増殖には作用しない化合物を選択し、これを用いて構造と活性
の関係（ＳＡＲ）を発見するための製造および試験のためのさらなる化合物を設
計すればよい。
【０２６８】 試験化合物は公知のキナーゼ阻害活性またはその他の公知の特性に基づいて選
択してもよいし、または「リード形成」スクリーニングプロジェクトにおいてス
クリーニングされ得る合成または天然分子のライブラリーの一部であり得る。
【０２６９】実施例３：病原性起源由来のＰＤＫ１阻害剤のスクリーニングアッセイ 親（Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２に関して野生型）のＳ．セレビシエ細胞
および内因性Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２遺伝子が不活化され、かつＰｋｈ１プロモ
ーターの制御下でカンジダＰｋｈ１またはＰｋｈ２が発現するＳ．セレビシエ細
胞に対する化合物の作用を比較する。カンジダＰｋｈ１またはＰｋｈ２を発現す
る細胞の増殖に作用するが野生型Ｐｋｈ１／Ｐｋｈ２発現細胞の増殖には作用し
ない化合物を選択し、これを用いて構造と活性の関係（ＳＡＲ）を発見するため
の製造および試験のためのさらなる化合物を設計すればよい。
【０２７０】 試験化合物は公知のキナーゼ阻害活性またはその他の公知の特性に基づいて選
択してもよいし、または「リード形成」スクリーニングプロジェクトにおいてス
クリーニングされ得る合成または天然分子のライブラリーの一部であり得る。
【０２７１】実施例４：Ｓ．セレビシエＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２遺伝子 に関連するカンジダ遺伝子の同定 カンジダ配列データベースによってはじめてカンジダデータのＤＮＡ検索が可
能となる。従って実施例１に記載の同定および特性決定された４つのＳ．セレビ
シエ配列（Ｐｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１、Ｙｋｒ２）の各々について、各Ｓ．
セレビシエ遺伝子のコード配列を用いてカンジダデータベースを検索した。 各々の場合で最良の一致を選択し、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースのタンパク質
と比較した。１つ例外があるが、この比較は２つの関連するＳ．セレビシエ遺伝
子（すなわちＰｋｈ１／Ｐｋｈ２、またはＹｐｋ１／Ｔｋｒ２）を最も関連ある
タンパク質とみなした。
【０２７２】 ４つのコード配列検索に基づいたさらなる研究のために選択されたカンジダ・
アルビカンスデータベースエントリーは： ３８４２３０Ａ１０．ｓ４．ｓｅｑ （検索１） ３８４３６２Ｅ１１．ｓ１．ｓｅｑ （検索１および検索２） ３８４２８６Ｅ１０．ｓ１．ｓｅｑ （検索１および検索２） ３９６０７６Ｅ０３．ｓ２．ｓｅｑ （検索３および検索４） ３８４１９４Ｆ０８．ｓ１．ｓｅｑ （検索３および検索４） であった。
【０２７３】 このデータベース中にはＳ．セレビシエＰｋｈ１、Ｐｋｈ２、Ｙｐｋ１および
Ｙｋｒ２に極めて密接な関連のある３つのカンジダ遺伝子断片があると思われる
。
【０２７４】 ３８４１９４Ｆ０８．ｓ１．ｓｅｑおよび３９６０７６Ｅ０３．ｓ２．ｓｅｑ
はＰｋｈ１およびＰｋｈ２に極めて密接な関連があると考えられる。
【０２７５】 ３８４３６２Ｅ１１．ｓ１．ｓｅｑおよび３８４２８６Ｅ１０．ｓ１．ｓｅｑ
はＹｐｋ１およびＹｋｒ２／Ｙｐｋ２と極めて密接な関連があると考えられる。
【０２７６】 全長コード配列は、十分公知の技術によって上記のヌクレオチド配列が由来す
る遺伝子に対して決定してもよく、これにはさらなるデータベース検索および／
または分子生物学の技術（ＰＣＲまたはライブラリーに基づくクローニング技術
が含まれる）が含まれる。
【０２７７】
【０２７８】
【０２７９】
【０２８０】
【０２８１】
【０２８２】
【０２８３】
【０２８４】
【０２８５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２とＰＤＫ１との一次構造の比較。 （ａ）ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを用いて行った、ヒトＰＤＫ１およびそ
のショウジョウバエ相同体、ＤＳＴＰＫ６１［２７］の触媒ドメインを有する酵
母Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２の推定アミノ酸配列のアライメント。同一残基を白抜
き文字、類似残基をグレーのボックスで示した。発明者らの研究では、ＰＣＲに
より得られた５つの独立したＰＫＨ１クローンはサッカロミセスゲノムデータベ
ースに保存されている配列と全く異なっており、実際にはＰｈｅ１８７（ＴＴＣ
）がＩｌｅ（ＡＴＣ）であることがわかった。（ｂ）ＰＤＫ１関連タンパク質の
構造の概略図。青色ボックスは各タンパク質キナーゼの触媒ドメインを示し、緑
色のボックスはＰＨドメインを示している。
【図２】 ＰＫＨ１およびＰＫＨ２双方の欠失により生存不能細胞が発生する。 （ａ）ＡＣ３０６（ＭＡＴａ／ＭＡＴα ＰＫＨ１／ｐｋｈ１Δ：：ＨＩＳ３
ＰＫＨ２／ｐｋｈ２Δ：：ＴＲＰ１）株由来の典型的テトラタイプ四分子から
の胞子の増殖。推定ｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ胞子は生存不能である。（ｂ）適当な
プライマーを用いたＰＣＲによる確認で推定欠失−置換対立遺伝子の存在が示さ
れた。ＰＫＨ１およびＰＫＨ２に挿入されたＨＩＳ３およびＴＲＰ１マーカーの
存在がそれぞれ、得られた産物のサイズシフト、完全な遺伝子座において０．５
ｋｂｐ〜１．２ｋｂｐ（ｐｋｈ１Δ：：ＨＩＳ３）または１．３ｋｂｐ（ｐｋｈ
２Δ：：ＴＲＰ１）により示された。
【図３】 ＰＫＨ１およびＰＫＨ２が機能的相同体であることの遺伝子による証明。 （ａ）ＵＲＡ３で標識したプラスミドｐＹＥＳ２−ＰＫＨ１で形質転換したＡ
Ｃ３０６（ＭＡＴａ／ＭＡＴα ＰＫＨ１／ｐｋｈ１Δ：：ＨＩＳ３ ＰＫＨ２
／ｐｋｈ２Δ：：ＴＲＰ１）株を胞子形成させた。誘導された２つの半数体、Ｐ
ＫＨ１ＰＫＨ２［ｐＹＥＳ２−ＰＫＨ１］（胞子Ａ）およびｐｋｈ１Δｐｋｈ２
Δ［ｐＹＥＳ２−ＰＫＨ１］（胞子Ｂ）のＰＣＲによる遺伝子型の確認。（ｂ）
総てｐＹＥＳ２−ＰＫＨ１を有する、（ａ）に記載の二倍体のテトラタイプ子嚢
由来の４つの胞子を、ウラシルを含有しない培地（右）で培養してプラスミドの
存在に関して選択するかまたは５−ＦＯＡを含有する培地（左）で培養してプラ
スミドの喪失に関して選択するかのいずれかを行った［４０］。プラスミドを有
するＰＫＨ１のコピーの不在下ではｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞は栄養増殖を続け
ることはできない。
【図４】 完全ヒトＰＤＫ１またはＰＤＫ１−ΔＰＨがｐｋｈ１Δｐｋｈ２Δ細胞の生存
不能を回復させる。 （ａ）総てＵＲＡ３で標識したＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＤＫ１、ＹＥｐｌａｃ
１９５−ＰＤＫ１−ΔＰＨまたはＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＫＨ１のいずれかで形
質転換したＡＣ３０６（ＭＡＴａ／ＭＡＴα ＰＫＨ１／ｐｋｈ１Δ：：ＨＩＳ
３ ＰＫＨ２／ｐｋｈ２Δ：：ＴＲＰ１）株の誘導体を胞子形成させた。原株の
酵母ＰＫＨ１（胞子Ａ）またはヒトＰＤＫ１（胞子Ｂ）のいずれかの発現により
維持される、誘導された２つの二重変異胞子のＰＣＲによる遺伝子型の確認。予
測されるように、ＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＤＫ１を有する半数体だけがＰＤＫ１
由来の配列を所有している。（ｂ）ＹＥｐｌａｃ１９５−ＰＤＫ１またはＹＥｐ
ｌａｃ１９５−ＰＤＫ１−ΔＰＨのいずれかを有する、（ａ）に記載の二倍体の
テトラタイプ子嚢由来の４つの胞子を、示したように、ウラシルを含有しない培
地（左上）で培養してプラスミドの存在に関して選択する（典型プレートを１つ
だけ示す）かまたは５−ＦＯＡを含有する培地（それぞれ右上および右下）で培
養してプラスミドの喪失に関して選択するかのいずれかを行った。ｐｋｈ１Δｐ
ｋｈ２Δ細胞はヒトＰＤＫ１またはＰＤＫ１−ΔＰＨを発現するプラスミドが存
在する場合にのみ増殖が可能である。
【図５】 酵母Ｐｋｈ１およびヒトＰＤＫ１はともにＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３ま
たはＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２依存様式でヒトＰＫＢをリン酸化して活性化さ
せる。 精製したＧＳＴ−ＰＫＢを１００μＭ ＡＴＰおよび１００μＭ ＰｔｄＣｈ
ｏ、１００μＭ ＰｔｄＳｅｒ、ならびに示された種々のＰｔｄ脂質を、総て最
終濃度１０μＭで含有するリン脂質小胞の存在下、ＧＳＴ−Ｐｋｈ１（ａ）また
はＧＳＴ−ＰＤＫ１（ｃ）のいずれかとともに、３０℃で３０分間インキュベー
トした。混合物を最終濃度１％（容量）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００［１７］に調
整して脂質小胞を溶解することにより反応を停止させ、次いで得られたＧＳＴ−
ＰＫＢの比活性（Ｕ／ｍｇ）の高まりを材料および方法に記載したように［γ− ３２ Ｐ］ＡＴＰの存在下で求めた。比活性の高まりはＧＳＴ−Ｐｋｈ１またはＧ
ＳＴ−ＰＤＫ１を加えない対照インキュベーションに関して得られるものである
。ＧＳＴ−Ｐｋｈ１（ｂ）またはＧＳＴ−ＰＤＫ１（ｄ）のいずれかが触媒する
ＧＳＴ−ＰＫＢへの組み込み量を測定するため、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下
で反応を行い、その溶液を最終濃度１％ＳＤＳに調整して反応を停止させた。次
いで得られた変性サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。リン酸化程度をＧＳＴ
−ＰＫＢαに相当するクーマシーブルーで染色されたバンドのオートラジオグラ
フィーにより評価した。略語：ＳＡ−ＰＩ［３，４，５］Ｐ３はｓｎ−１−ステ
アロイル，２−アラキドニル Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３であり；Ｄ
Ｐ−ＰＩ［３，４，５］Ｐ３はｓｎ−１，２−ジパルミトイル Ｄ−ＰｔｄＩｎ
ｓ［３，４，５］Ｐ３であり；ＤＰ−ＰＩ［３，４］Ｐ２はｓｎ−１，２−ジパ
ルミトイル Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ［３，４］Ｐ２であり；ＤＰ−ＰＩ［３］Ｐはｓ
ｎ−１，２−ジパルミトイル Ｄ−ＰｔｄＩｎｓ−３Ｐである。ＰＩ［４，５］
Ｐ２は脳抽出物から精製した。
【図６】 ＰＤＫ１およびＰＤＫ２依存的リン酸化の共通部位、とＹｐｋ１およびＹｋｒ
２の一次構造とそれらに最も近いヒト相同体との比較。 （ａ）ＰＤＫ１様およびＰＤＫ２様酵素によりリン酸化されると考えられる保
存モチーフを太字で表したリン酸化残基により示している。総ての場合において
推定ＰＤＫ２部位はＣ末端１５７〜１６６残基ないしＰＤＫ１部位にある。Ｇｅ
ｎＢａｎｋ登録番号：ＰＫＢα：Ｘ６５６８７；ｐ７０Ｓ６Ｋα：Ｍ６０７２５
；ＳＧＫ：Ｙ１００３２；ＰＫＣζ：Ｌ０７０３２；Ｙｐｋ１：Ｐ１２６８８；
Ｙｋｒ２：Ｐ１８９６１；Ｐｋｃ１：Ｍ３２４９１；およびＳｃｈ９：Ｕ０００
２９。（ｂ）Ｙｐｋ１およびＹｋｒ２の互いへのおよび哺乳類ＳＧＫ、ＰＫＢα
、ｐ７０Ｓ６キナーゼならびにβＡＲＫへのアライメントにおいてＹｐｋ１との
一致を白抜き文字で示す。
【図７】 Ｙｐｋ１またはＹｋｒ２のいずれかの発現が生存するには必要である。 ＬＥＵ２で標識したプラスミド、ｐＧＡＬ−ＹＫＲ２で形質転換したＹＥＳ７
（ＭＡＴａ／ＭＡＴα ＹＰＫ１／ｙｐｋ１Δ：：ＨＩＳ３ ＹＫＲ２／ｙｋｒ
２Δ：：ＴＲＰ１）株をプラスミドのＹＫＲ２の発現を誘導する条件（ガラクト
ース含有培地）下で胞子形成させた。この二倍体由来のテトラタイプ子嚢の４つ
の胞子をプラスミドの存在を必要とするロイシンを含有しない培地で回収した。
続いて、炭素源として、プラスミドを有するＹＫＲ２遺伝子の発現を抑制するグ
ルコースを含有した同一培地で行った場合にはｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ二重変異細
胞は栄養増殖を続けることはできない。これに対し、それらの正常染色体座由来
のＹＰＫ１またはＹＫＲ２のいずれか（または両方）を発現する細胞は生存能力
を維持している。
【図８】 ＳＧＫ、ＰＫＢ関連酵素がｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ細胞の生存不能を回復させる
。 （ａ）ｐＹＫＲ２を有するＹＰＴ２８（ＭＡＴａ ｙｐｋ１Δｙｋｒ２Δ）株
、そのオーセンティックプロモーターからＹＫＲ２を発現する、ＵＲＡ３で標識
したプラスミドを材料および方法に記載したように得、次いでＬＥＵ２で標識し
たエンプティベクター（ｐＡＤ４ＭまたはＹＥｐ３５１ＧＡＬ）またはＡＤＨ１
またはＧＡＬ１プロモーターのいずれかから、示したように、ＹＰＫ１、ＹＫＲ
２、ＳＧＫ、ＰＫＢα、ｐ７０Ｓ６キナーゼまたはβＡＲＫのいずれかを発現す
る同ベクターのいずれかで形質転換した。両プラスミドの存在に関して選択的な
培地で行った場合（左）、総ての形質転換細胞が十分に増殖した。しかしながら
、ＹＫＲ２を発現するＵＲＡ３標識プラスミドの喪失を必要とする５−ＦＯＡを
含有する同培地で培養した場合（右）、ＳＧＫを発現する細胞だけがｙｐｋ１Δ
ｙｐｋ１Δ細胞の正常増殖を維持することができ、オーセンティックＹＰＫ１ま
たはＹＫＲ２と同様に有効であった。ＰＫＢαを発現する細胞でいくつかのコロ
ニーの生存が再現的に観察され、極めて高レベルのＰＫＢα発現でしかＹｐｋ１
およびＹｋｒ２を欠いた細胞の継続的な増殖を支えることができないことが示さ
れた。（ｂ）条件温度株ＹＰＴ４０（ＭＡＴａ ｙｐｋ１−１１５ ｙｋｒ２Δ
）を材料および方法に記載したように構築し、次いで（ａ）に記載の指示プラス
ミドで形質転換した。次いで許容温度（左）で単離した形質転換細胞の制限温度
（右）での増殖継続能力について試験した。また、ＳＧＫはＹｐｋ１およびＹｋ
ｒ２機能に代わって用いることができ、まさにＹＰＫ１自身と同様の増殖が可能
であった。また非許容温度で極めて遅い増殖を示す微小コロニーが再現的に回収
されたことからＰＫＢによる弱い補足も見られた。
【図９】 Ｐｋｈ１は３−ホスホ−イノシチド−独立様式で酵母Ｙｐｋ１およびヒトＳＧ
Ｋをリン酸化して活性化させる。 ＧＳＴ−Ｙｐｋ１（ａ）またはＧＳＴ−ＳＧＫ（ｃ）のいずれかを、示したよ
うに、１００μＭ ＡＴＰの存在下、１００μＭ ＰｔｄＣｈｏ、１００μＭ
ＰｔｄＳｅｒおよび１０μＭのｓｎ−１−ステアロイル、２−アラキドニル Ｄ
−ＰｔｄＩｎｓ［３，４，５］Ｐ３（“ＰＴＰ３”）のＤ−鏡像異性体を含有す
るリン脂質小胞とともに、またなしで、ＧＳＴ−Ｐｋｈ１またはＧＳＴ−ＰＤＫ
１とともに３０℃で３０分間インキュベートした。反応を停止させ、図５の説明
で示したように活性化の程度を評価した。ＧＳＴ−Ｐｋｈ１またはＧＳＴ−ＰＤ
Ｋ１のいずれかが触媒するＧＳＴ−Ｙｐｋ１（ｂ）またはＧＳＴ−ＳＧＫ（ｄ）
への組み込み量を測定するため、示したように、１００Ｍ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ
の存在下で反応を行い、その産物を図５の説明で記載したようにＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、続いてオートラジオグラフィーにより解析した。
【図１０】 Ｙｐｋ１におけるＴｈｒ５０４のリン酸化はＰｋｈ１によるその活性化に必要
である。 （ａ）ＧＳＴ−Ｙｐｋ１、ＧＳＴ−Ｙｐｋ１（Ｔ５０４Ｄ）、ＧＳＴ−Ｙｐｋ
１（Ｔ６６２Ｄ）またはＧＳＴ−Ｙｐｋ１（Ｔ５０４ＤＴ６６２Ｄ）を示したよ
うに、ＡＴＰ（１００μＭ）の存在下、ＧＳＴ−Ｐｋｈ１または触媒的に不活性
な誘導体、ＧＳＴ−Ｐｋｈ１（ＫＤ）のいずれかとともに３０℃で３０分間イン
キュベートした。反応を停止させ、図５の説明で示したように活性化の程度を評
価した。ＧＳＴ−Ｙｐｋ１およびその多様な誘導体（ｂ）への組み込み量を調べ
るため、１００μＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で反応を行い、その産物を図
５の説明で記載したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィーに
より解析した。
【図１１】 動物細胞のＰＤＫ１依存的シグナリング経路と酵母のＰｋｈ１およびＰｋｈ２
依存的シグナリング経路との比較 さらなる詳細についての本明細書を参照。
【図１２】 ラットＳＧＫのヌクレオチド配列。
【図１３】 ラットＳＧＫのアミノ酸配列（ｇｉ｜４７７０９８｜ｐｉｒ｜｜Ａ４８０９４
血清および糖質コルチコイドにより制御されるキナーゼ−ラット）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 9/12 (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｒ 1:865） //(Ｃ１２Ｑ 1/48 (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:725） (Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:725） 5/00 Ａ (72)発明者 ジェレミー、ウィリアム、ソーナー アメリカ合衆国カリフォルニア州、バーク レー、アーリントン、アベニュ、701 (72)発明者 ダリオ、レナト、アレッシ イギリス国ダンディー、パース、ロード、 309 (72)発明者 パメラ、ダイアン、トランス アメリカ合衆国カリフォルニア州、バーク レー、ハースト、アベニュ、ナンバーディ ー、1814 (72)発明者 アントニオ、キャサメイヤー アメリカ合衆国コネチカット州、ニュー、 ヘイブン、クラーク、ストリート、91 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA04 DA02 DA12 EA04 FA02 GA11 GA14 HA01 HA12 HA15 4B050 CC04 DD04 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR60 QR69 QR76 QR80 QS24 QS28 4B065 AA80X AA80Y AA93X AB01 AC14 BA02 BA25 CA29 CA46 4H045 AA11 BA40 CA15 DA76 DA89 EA50 FA71

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと（ｂ）宿主酵母細胞タンパク質キナ
    ーゼと同等である宿主酵母細胞以外の起源に由来するタンパク質キナーゼの活性
    を異なる程度で調整する化合物を同定する方法であって、 化合物を １）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現し得るが、同等のタンパク質キナ
    ーゼを発現する能力はない第１の宿主酵母細胞 および ２）（ａ）宿主酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）
    宿主酵母細胞以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２
    の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の表現型に対する化合物の作用を測定し、 以下のいずれかであることを特徴とする方法： （１）宿主酵母細胞が病原性酵母であり、かつ、宿主酵母細胞以外の起源が宿
    主酵母細胞以外のいずれの起源であってもよい または （２）宿主酵母細胞がいずれの酵母であってもよく、かつ、宿主酵母細胞以外
    の起源が哺乳類ではない。
  2. 【請求項２】 （ａ）第１の起源に由来するタンパク質キナーゼと（ｂ）第２の起源に由来す
    るタンパク質キナーゼの活性を（両タンパク質キナーゼは同宿主酵母細胞タンパ
    ク質キナーゼと同等）異なる程度で調整する化合物を同定する方法であって、 化合物を １）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第１
    の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第１の宿主酵母細胞 および ２）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第２
    の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の表現型に対する化合物の作用を測定する、方法。
  3. 【請求項３】 病原性酵母である宿主酵母細胞以外の宿主酵母細胞がサッカロミセス・セレビ
    シエを含むサッカロミセス属、カンジダ・アルビカンスを含むカンジダ属、ピキ
    ア属、クルイベロミセス属、トルロプシス属、ハンセヌラ属、シゾサッカロミセ
    ス属、シテロミセス属、パキソレン属、デバロミセス属、メチュニコウィア属、
    ロドスポリジウム属、ロイコスポリジウム属、ボトリオアスカス属、スポリジオ
    ボラス属、エンドミコプシス属、アスペルギルス・フミガタスを含むアスペルギ
    ルス属、クリプトコッカス・ネオホルマンスを含むクリプトコッカス属、および
    ヒストプラズマ・カプスラタムを含むヒストプラズマ属のいずれか１つに由来す
    る、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 宿主酵母細胞が宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等である宿主酵母細胞以
    外の起源に由来するタンパク質キナーゼを発現することができなければ、宿主酵
    母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力のない宿主酵母細胞が実質的に増殖す
    ることができない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 宿主酵母細胞以外の起源に由来する少なくとも１つのタンパク質キナーゼがヒ
    トタンパク質キナーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼがＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２である（
    ここで、Ｐｋｈ１はＳ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹＤＲ４９
    ０ｃまたはＳ．セレビシエ以外の酵母の同等のオープンリーディングフレームに
    よりコードされるポリペプチドであり、かつＰｋｈ２はＳ．セレビシエのオープ
    ンリーディングフレームＹＯＬ１００ｗまたはＳ．セレビシエ以外の酵母の同等
    のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチドである）、請
    求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等のタンパク質キナーゼがＰＤＫ１であ
    る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼがＹｐｋ１および／またはＹｒｋ２である、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 宿主酵母細胞タンパク質キナーゼと同等のタンパク質キナーゼが血清および糖
    質コルチコイド誘導性タンパク質キナーゼ（ＳＧＫ）またはタンパク質キナーゼ
    Ｂ（ＰＫＢ）である、請求項１〜５および８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 第１の起源がヒトであり、第２の起源がカンジダ種、ブラストミセス種、例え
    ばＢ．デルマチチジス、コクシジオイデス種、例えばＣ．イミチス、ヒストプラ
    ズマ種、例えばＨ．カプスラタム、スポロスリックス種、例えばＳ．シェンキー
    、アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・フミガタス、Ａ．フラバス、Ａ．
    ニガー、フィアロフォラ・コンパクタ（フォンセカエア・コンパクタ）、Ｐ．ペ
    ドロソイ（Ｆ．ペドロシ）、Ｐ．ヴェルコサ、クラドスポリウム・カリオニ、リ
    ノクラジエラ・アクアスペルサ、クリプトコッカス種、例えばＣ．ネオホルマン
    ス、セファロスポリウム種、フサリウム種、ヒストプラズマ種、例えばＨ．カプ
    スラタム、ニューモシスチス・カリニ、リゾプス種、リゾムコル種、マズレラ種
    、例えば、Ｍ．ミセトマチス、Ｍ．グリセア、シューダレシェリア・ボイジ、パ
    ラコクシジオイデス種、例えばＰ．ブラシリエンシス、プロトセカ種、例えばＰ
    ．ウィッカーハミ、エピデルモフィトン種、ミクロスポラム種、トリコフィトン
    種、マラセジア種、例えばＭ．フルフル（ピチロスポラム・オルビクラレ）のい
    ずれか１つに由来する病原性酵母である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 第１の起源に由来するＰＤＫ１の活性を調整する（阻害する）化合物を同定す
    る方法であって、化合物を １）（ａ）ヒトＰＤＫ１（Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２）の機能的同等物である酵
    母ポリペプチドを発現する能力はないが、（ｂ）第１の起源に由来するＰＤＫ１
    を発現し得る第１の宿主酵母細胞 および所望により ２）ヒトＰＤＫ１（Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２）の機能的同等物である
    酵母ポリペプチドを発現し得る第２の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の生存能力に対する化合物の作用を測定し、第１の酵母細胞
    の生存能力に作用する、または所望により第１の酵母細胞および第２の酵母細胞
    の生存能力に違った作用を及ぼす化合物を同定する、方法。
  12. 【請求項１２】 第１の起源に由来するＹｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物の活性
    を調整する（阻害する）化合物を同定する方法であって、 化合物を １）（ａ）Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物である酵母ポリペ
    プチドを発現する能力はないが、（ｂ）第１の起源に由来するＹｐｋ１および／
    またはＹｒｋ２の機能的同等物（例えば、ＳＧＫ）を発現し得る第１の宿主酵母
    細胞 および所望により ２）Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物である酵母ポリペプチド
    （例えば、内因性ポリペプチド）を発現し得る第２の宿主酵母細胞 に曝して、酵母細胞の生存能力に対する化合物の作用を測定して、第１の酵母細
    胞の生存能力に作用する、または所望により第１の酵母細胞および第２の酵母細
    胞の生存能力に違った作用を及ぼす化合物を同定する、方法。
  13. 【請求項１３】 Ｐｋｈ１およびＰｋｈ２またはそのいずれの機能的同等物も発現する能力のな
    い、酵母細胞。
  14. 【請求項１４】 内因性Ｐｋｈ１および／またはＰｋｈ２を発現する能力のない、酵母細胞。
  15. 【請求項１５】 内因性Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２ではないＰｋｈ１および／またはＰｋｈ２の機
    能的同等物を発現し得る、請求項１４に記載の酵母細胞。
  16. 【請求項１６】 機能的同等物がヒトＰＤＫ１またはその変異体、融合体もしくは誘導体である
    、請求項１５に記載の酵母細胞。
  17. 【請求項１７】 Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２をコードするオープンリーディングフレームが選択マ
    ーカーの挿入により分断されている、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の
    酵母細胞。
  18. 【請求項１８】 ヒトＰＤＫ１の機能的同等物をコードする１以上の遺伝子が、酵母細胞がヒト
    ＰＤＫ１の機能的同等物を発現できないように変異されている、酵母細胞。
  19. 【請求項１９】 ヒトＰＤＫ１の機能的同等物をコードするかかる遺伝子各々を、酵母細胞がヒ
    トＰＤＫ１の機能的同等物を発現できないように変異されている、請求項１８に
    記載の酵母細胞。
  20. 【請求項２０】 ＰＤＫ１の活性を調整する（阻害する）化合物を同定する方法であって、請求
    項１３〜１９のいずれか１項に記載の酵母細胞を用いる、方法。
  21. 【請求項２１】 ＰＤＫ１の活性を調整する（阻害する）化合物を同定する方法における、請求
    項１３〜１９のいずれか１項に記載の酵母細胞の使用。
  22. 【請求項２２】 ＰＤＫ１が哺乳類ＰＤＫ１である、請求項２０に記載の方法、または請求項２
    １に記載の使用。
  23. 【請求項２３】 ＰＤＫ１が酵母ＰＤＫ１、例えばカンジダＰＤＫ１である、請求項２０に記載
    の方法、または請求項２１に記載の使用。
  24. 【請求項２４】 共通配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｈ
    ｙｄを含んでなるポリペプチドをリン酸化し得る、酵母由来のタンパク質キナー
    ゼ。
  25. 【請求項２５】 Ｐｋｈ１もしくはＰｋｈ２またはＰＤＫ１によりリン酸化され得る、酵母由来
    のタンパク質キナーゼタンパク質キナーゼ。
  26. 【請求項２６】 タンパク質キナーゼがＳ．セレビシエ由来のＹｐｋ１もしくはＳ．セレビシエ
    以外の酵母、例えばカンジダ種の同等のオープンリーディングフレーム、または
    Ｓ．セレビシエ由来のＹｋｒ２もしくはＳ．セレビシエ以外の酵母、例えばカン
    ジダ種の同等のオープンリーディングフレームである、請求項２４または２５に
    記載のタンパク質キナーゼ。
  27. 【請求項２７】 Ｐｋｈ１もしくはＰｋｈ２または哺乳類、好ましくはヒト、ＰＤＫ１によりリ
    ン酸化され、および／または共通配列Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ
    −Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｈｙｄを含んでなるポリペプチドをリン酸化し得る請求項２
    ６に記載のタンパク質キナーゼの変異体、誘導体、断片もしくは融合体、あるい
    は変異体、誘導体もしくは断片の融合体。
  28. 【請求項２８】 ヒトＳＧＫの機能的同等物をコードする１以上の内因性遺伝子が、酵母細胞が
    ヒトＳＧＫの機能的同等物を発現できないように変異されている、酵母、例えば
    Ｓ．セレビシエまたはカンジダ細胞。
  29. 【請求項２９】 前記遺伝子がＹｐｋ１またはＹｒｋ２である、請求項２８に記載の酵母細胞。
  30. 【請求項３０】 ヒトＳＧＫまたはＹｐｋ１もしくはＹｒｋ２の機能的同等物をコードするかか
    る内因性遺伝子各々が、酵母細胞が、例えばヒトＳＧＫまたはＹｐｋ１もしくは
    Ｙｒｋ２の内因性機能的同等物を発現できないように変異されている、請求項２
    ７または２９に記載の酵母細胞。
  31. 【請求項３１】 相互作用するポリペプチド、例えばＰｋｈ１、Ｐｋｈ２またはＰＤＫ１により
    、Ｙｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物であるがＳＧＫ、ＰＫＢαま
    たはｐ７０Ｓ６キナーゼではないポリペプチドの活性化を阻害する化合物を同定
    する方法であって、化合物が、（ａ）ＳＧＫ、ＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナー
    ゼではないＹｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能的同等物であるポリペプチド
    またはその適当な断片、変異体、誘導体もしくは融合体、あるいは断片、変異体
    もしくは誘導体の適当な融合体と、（ｂ）相互作用するポリペプチド、またはそ
    の適当な変異体、誘導体、断片もしくは融合体、あるいは変異体、誘導体あるい
    は断片の適当な融合体との間の相互作用を増強するか阻害するかを決定するか、
    あるいは化合物が、相互作用するポリペプチド、またはその適当な変異体、誘導
    体、断片、またはそれらの融合体によりＹｐｋ１および／またはＹｋｒ２の機能
    的同等物であるポリペプチド、またはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは
    融合体、あるいはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体の活性化を実質的に
    阻害するかどうかを決定することを含んでなる、方法。
  32. 【請求項３２】 Ｙｐｋ１および／もしくはＹｋｒ２またはＳＫＧまたはＰＫＢαであるポリペ
    プチドあるいはその機能的同等物、またはその適当な変異体、断片、誘導体もし
    くは融合体、またはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体をリン酸化する、
    および／または活性化するための、ＰＤＫ１ではない、Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２
    もしくはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその断片、
    誘導体もしくは融合体の融合体の使用。
  33. 【請求項３３】 Ｙｐｋ１および／もしくはＹｒｋ２またはＳＫＧであるポリペプチドまたはそ
    の機能的同等物、あるいはその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、ま
    たはその断片、誘導体もしくは融合体の融合体をリン酸化する、および／または
    活性化するための、ＰＫＢαまたはｐ７０Ｓ６キナーゼではない、ＰＤＫ１また
    はその適当な変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその断片、誘導体
    もしくは融合体の融合体の使用。
  34. 【請求項３４】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法の実施に有効な手段を含んでなる
    製品キット。
  35. 【請求項３５】 １）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第１
    の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第１の宿主酵母細胞 および ２）（ａ）酵母細胞タンパク質キナーゼを発現する能力はないが、（ｂ）第１
    の起源以外の起源に由来する同等のタンパク質キナーゼを発現し得る第２の宿主
    酵母細胞 を含んでなる、請求項３４に記載の製品キット。
  36. 【請求項３６】 本明細書において開示されるいずれもの新規なタンパク質キナーゼ。
  37. 【請求項３７】 請求項１〜１２、２０、２２、２３または３１のいずれか１項に記載の方法に
    より同定され得る化合物。
  38. 【請求項３８】 哺乳類ＰＤＫ１またはＳＧＫを阻害し得る、請求項３７に記載の化合物。
  39. 【請求項３９】 真菌類のＰＤＫ１の機能的同等物（Ｐｋｈ１またはＰｋｈ２であり得る）また
    はＳＧＫ（Ｙｐｋ１またはＹｒｋ２であり得る）を阻害し得る、請求項３７に記
    載の化合物。
  40. 【請求項４０】 医薬に用いる、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の化合物。
  41. 【請求項４１】 真菌類、例えばカンジダ感染症（例えば、口腔カンジダ症）の治療のための医
    薬の製造における、請求項３９に記載の化合物の使用。
  42. 【請求項４２】 癌の治療のための医薬の製造における、請求項３８に記載の化合物の使用。
  43. 【請求項４３】 Ｓ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹＤＲ４９０ｃまたはＳ．セ
    レビシエ以外の酵母の同等のオープンリーディングフレームによりコードされる
    実質的に純粋なポリペプチド、またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体
    、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体、または Ｓ．セレビシエのオープンリーディングフレームＹＯＬ１００ｗまたはＳ．セ
    レビシエ以外の酵母の同等のオープンリーディングフレームによりコードされる
    実質的に純粋なポリペプチド、またはその変異体、断片、融合体もしくは誘導体
    、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体の融合体（ただし、このポリペプチ
    ドはヒトＰＤＫ１またはショウジョウバエＰＤＫ１（ＤＳＴＰＫ６１）のアミノ
    酸配列は含まない）。
  44. 【請求項４４】 請求項４３に記載のポリペプチドの発現に好適な組換えポリヌクレオチド。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
  46. 【請求項４６】 ポリペプチドまたはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその
    変異体、断片もしくは誘導体の融合体を作製する方法であって、前記ポリペプチ
    ドまたはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体、断片
    もしくは誘導体の融合体を発現する、請求項４５に記載の宿主細胞を培養して、
    前記ポリペプチドまたはその変異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはそ
    の変異体、断片もしくは誘導体の融合体を単離することを含んでなる、方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４６に記載の方法により得ることができるポリペプチド、またはその変
    異体、断片、誘導体もしくは融合体、あるいはその変異体、断片もしくは誘導体
    の融合体。
  48. 【請求項４８】 請求項４３または４７に記載のポリペプチドに対して反応性のある抗体。
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