DE60120942T2

DE60120942T2 - Verbessertes verfahren für reverses n-hybrid-screening

Info

Publication number: DE60120942T2
Application number: DE60120942T
Authority: DE
Inventors: Richard North Perth HOPKINS; Ilya Philadelphia SEREBRIISKII; Michael Paul Mount Claremont WATT; Erica Oreland GOLEMIS
Original assignee: Phylogica Ltd
Current assignee: Phylogica Ltd
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2021-03-09
Also published as: EP1268842B1; WO2001066787A1; ATE331038T1; DE60120942D1; CA2402111A1; EP1268842A1; EP1268842A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein verbessertes reverses n-Hybrid-Screening-Verfahren zur Identifikation von Antagonisten oder Inhibitoren biologischer Interaktionen, wobei mehrfache Reportergene verwendet werden, um die Antagonisten oder Inhibitoren einer Interaktion von den Antagonisten oder Inhibitoren anderer Interaktionen zu unterscheiden, wobei z. B. jede der Interaktionen eine oder mehrere identische Interaktionspartner involviert. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel bereit, durch die eine große Zahl peptidbasierter therapeutischer, prophylaktischer und diagnostischer Reagenzien entwickelt werden können.
ALLGEMEINES
Der Fachmann wird erkennen, dass die hier beschriebene Erfindung anderen Variationen und Modifikationen als den hier spezifisch beschriebenen zugänglich ist. Es ist zu verstehen, dass die hier beschriebene Erfindung alle solchen Variationen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung umfasst auch alle solchen Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen oder die in dieser Beschreibung angezeigt werden, einzeln oder kollektiv, und jede Kombination und alle Kombinationen von zwei oder mehr beliebigen unter diesen Schritten oder Merkmalen.
In dieser gesamten Beschreibung bezeichnen, sofern nicht der Kontext ein anderes erfordert, das Wort „umfassen" und Variationen wie „umfasst" und „umfassend", den Einschluss einer genannten Entität oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Entitäten oder Schritten, aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen Entität oder irgendeines anderen Schrittes oder irgendeiner anderen Gruppe von Entitäten oder Schritten. Der Bereich der vorliegenden Erfindung wird durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen, die nur dem Zweck der Exemplifikation dienen sollen, nicht begrenzt. Funktionell gleichwertige Produkte, Zusammensetzungen und Verfahren sind eindeutig innerhalb des hier beschriebenen Bereichs der Erfindung.
Die bibliographischen Details der Publikationen, auf die der Autor in dieser Beschreibung Bezug nimmt, sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst. Hier auf den Stand der Technik genommene Bezüge, einschließlich von einem oder mehreren Dokumenten aus dem Stand der Technik, sind nicht als Anerkennung oder Vorschlag zu verstehen, dass dieser Stand der Technik in Australien Allgemeinwissen sei oder in Australien zum Allgemeinwissen gehöre.
Hier ist der Ausdruck „gewonnen aus" dahingehend zu verstehen, dass eine bestimmte Entität oder Gruppe von Entitäten von der genannten Spezies stammt, aber nicht notwendigerweise direkt aus der genannten Quelle erhalten worden ist.
Diese Beschreibung enthält unter Verwendung des Programms Patentln Version 3.0 hergestellte Nukleotidsequenzinformationen, in der vorliegenden Schrift nach den Ansprüchen dargestellt. In dem Sequenzprotokoll wird jede Nukleotidsequenz durch den numerischen Indikator <210>, gefolgt von dem Sequenzidentifikator (z. B. <210>1, <210>2 usw.) identifiziert. Die Länge, die Art der Sequenz [DNA, Protein (PRT) usw.] und der Ursprungsorganismus jeder Nukleotidsequenz werden durch die in den numerischen Indikatorfeldern <211>, <212> bzw. <213> bereitgestellten Informationen bezeichnet. Nukleotidsequenzen, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird, sind durch den Ausdruck „SEQ ID NO:", gefolgt von der Sequenznummer [z. B. bezieht sich SEQ ID NO:1 auf die Sequenz in dem als <400>1 bezeichneten Sequenzprotokoll], definiert.
Die Nukleotidrestbezeichnungen, auf die hier Bezug genommen wird, sind die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlenen, wobei A für Adenin, C für Cytosin, G für Guanin, T für Thymidin, Y für einen Pyrimidinrest, R für einen Purinrest, M für Adenin oder Cytosin, K für Guanin oder Thymidin, S für Guanin oder Cytosin, W für Adenin oder Thymidin, H für ein anderes Nukleotid als Guanin, B für ein anderes Nukleotid als Adenin, V für ein anderes Nukleotid als Thymidin, D für ein anderes Nukleotid als Cytosin und N für einen beliebigen Nukleotidrest steht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biologische Interaktionen, wie z. B. eine Protein-Protein-Interaktion oder eine Protein-Nukleinsäure-Interaktion, sind an einer großen Vielzahl von Prozessen, die in lebenden Zellen stattfinden, beteiligt. Zum Beispiel kann die agonistische oder antagonistische Beeinflussung eines Rezeptors durch einen spezifischen Liganden, wie z. B. ein Pharmakon, ein Hormon, ein Second-messenger-Molekül usw., einen oder mehrere aus einer Vielzahl biologischer Prozesse beeinflussen, darunter Genexpression, Zelldifferenzierung, Wachstum, Enzymaktivität, Metabolitenfluss oder Metabolitenverteilung zwischen zellulären Kompartimenten. Protein-Protein-Interaktionen, DNA-Protein-Interaktionen und RNA-Protein-Interaktionen sind wohlbekannt für ihre Wirkungen in der Regulation solcher biologischen Prozesse sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen, überdies kritisch für die DNA-Replikation und im Fall von RNA-Viren für die RNA-Replikation.
Unerwünschte oder unpassende Genexpression und/oder zelluläre Differenzierung, unerwünschtes oder unpassendes zelluläres Wachstum und unerwünschter oder unpassender Metabolismus können zumindest in vielen Fällen biologischen Interaktionen zuzuschreiben sein, an denen die Bindung und/oder die Aktivität proteinöser Moleküle beteiligt sind, wie z. B. von Transkriptionsfaktoren, Peptidhormonen, Rezeptormolekülen oder Enzymen. In einem Beispiel kodieren mehrere in lymphoiden Malignanzen durch chromosomale Translokationen aktivierte Gene Transkriptionsfaktoren, z. B. MYC, LYL-1 und SCL, die über Protein-Protein-Interaktionen zu wirken scheinen. In normalen Zellen stehen diese Proteine mit ihren Interaktionspartnern in einem angemessenen Gleichgewicht, das als eine Folge der Onkogen-Aktivierung gestört wird und von dem vermutet wird, dass es zur Transkription von Zielgenen führt, die normalerweise in anderen Zellen oder Linien exprimiert werden. Diese Transkriptionsfaktoren können auch die Funktion nahe verwandter endogener Proteine ersetzen oder antago nisieren und dadurch die für die normale Wachstumskontrolle essentielle Genexpression stören.
Peptide stellen potentielle therapeutische und prophylaktische Wirkstoffe für viele menschliche und tierische Krankheiten, biochemische Störungen und Medikamentennebenwirkungen dar, da sie hochspezifisch mit anderen Molekülen interagieren können. Z. B. wurde berichtet, dass mimetische Peptide die Proteininteraktionen und/oder enzymatischen Funktionen inhibieren. Zu den spezifischeren Beispielen gehört ein von der Ribonukleotidreduktase des Herpes-simplex-Virus abgeleitetes Nonapeptid, das zur Übertragung in Zellen über seinen Rezeptor mit einer Enterotoxin-Untereinheit verbunden ist. Es wurde gefunden, dass das Peptidkonjugat die Replikation von Herpes-simplex-I in ruhenden Vero-Zellen inhibiert (Marcello et al., 1994). Unter Verwendung detaillierter Kenntnis der PCNA-Interaktionsdomäne von p21^WAF1 wurde ein Peptid entworfen, das die Interaktion wirksam blockierte. Dieses 20-gliedrige Peptid band mit hinreichender Affinität, um die Replikation von SV40 zu blockieren (Warbrick et al., 1996). Es wurde gefunden, dass eine von p16 abgeleitete 20-gliedrige Peptidsequenz mit cdk4 und cdk6 interagiert und die Phosphorylierung von pRB und das Fortschreiten des Zellzyklus inhibiert (Fahraeus 1996). Es wurde sogar gezeigt, dass Peptide als Inhibitoren in Tiermodellen fungieren. Z. B. wurde gezeigt, dass ein auf die ICE-Protease gerichtetes Peptid bei der Maus ein wirksamer protektiver Inhibitor gegen durch TNF-α ausgelöste Leber-Apoptose ist (Rouquet et al, 1996). RNA-Protein-Interaktionen wie z. B. die TAT/TAR-Interaktion von HIV oder die Interaktion von RNA mit den Proteinuntereinheiten der Telomerase stellen attraktive Ziele für die Therapie dar.
Konventionelle vorwärtsgerichtete n-Hybrid-Screenings haben sich zur Identifikation von Proteinen, die spezifisch mit einem Zielprotein von Interesse in einer Zelle interagieren, als nützlich erwiesen. In solchen Assays wird das Protein von Interesse im Allgemeinen als Fusionsprotein mit der DNA-Bindungsdomäne (DBD) eines Transkriptionsfaktors exprimiert, und eine Transkriptionsaktivatordomäne (AD) wird getrennt davon als Fusion mit jedem Mitglied einer Liste von Peptiden exprimiert. Wenn in der Zelle die passende Assoziation zwischen den Bindungspartnern stattfindet, wird ein funktionsfähiger Transkriptionsfaktor wiederhergestellt, und es findet die Expression eines unter der Kontrolle des wiederhergestellten Transkriptionsfaktors stehenden Reportergens statt. Die den passenden Bindungspartner exprimierende Zelle kann dann isoliert werden, was die Identifikation des Bindungspartners ermöglicht. Typischerweise ist das verwendete Selektionssystem ein auf positiver Selektion beruhendes, in dem die Expression des Reportergens durch die Interaktion zwischen den Bindungspartnern gesteigert wird.
In Umkehrung hiervon stellen reverse n-Hybrid-Screening-Technologien ein direktes Mittel zur Isolation von Antagonisten oder „Peptidinhibitoren" einer bestimmten RNA-Protein-, DNA-Protein- oder Protein-Protein-Interaktion bereit. Solche Screeningverfahren unterscheiden sich von den kanonischen vorwärtsgerichteten n-Hybrid-Screening-Verfahren dadurch, dass sie eine Selektion gegen die Interaktion bereitstellen. Dies wird z. B. dadurch erreicht, dass man ein gegenselektierbares Reportergen verwendet, das, wenn es in der Zelle exprimiert wird, ein letales Produkt kodiert, oder alternativ, das ein Enzym kodiert, das ein ungiftiges Substrat in ein giftiges Produkt umwandelt. Zu den zu diesem Zweck geeigneten gegenselektierbaren Reportergenen gehören z. B. das URA3-Strukturgen der Hefe, das für Hefezellen tödlich ist, wenn es in Gegenwart von 5-Fluororotsäure (5-FOA) exprimiert wird; das CYH2-Gen der Hefe, das tödlich ist, wenn es in Gegenwart des Pharmakons Cycloheximid exprimiert wird; und das LYS2-Gen der Hefe, das in Gegenwart des Pharmakons α-Aminoadipat (α-AA) tödlich ist. Reverse n-Hybrid-Screenings, die solche gegenselektierbaren Reportergene verwenden, sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO 99/35282) detailliert beschrieben, die insbesondere ein reverses n-Hybrid-Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz zur Durchmusterung von Zufallspeptid-(d. h. Aptamer-) Bibliotheken in vivo beschreibt.
Die Verwendbarkeit reverser 2-Hybrid-Ansätze zum Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Pharmakonmoleküle wurde vor kurzem auch von Huang und Schreiber (1997) und von Young et al. (1998) beschrieben, jedoch nicht im Hinblick auf das Durchmustern von Aptamer-Bibliotheken.
Viele voneinander verschiedene biologische Interaktionen bei komplexen Organismen verwenden einander überschneidende Untergruppen von Interaktionspartnern, oder Partner, die in große Proteinfamilien organisiert sind, die auf dem Aminosäuresequenzniveau, insbesondere in den Regionen, die für die Proteinbindungsaktivität oder die Nukleinsäurebindungsaktivität erforderlich sind, hochkonserviert sind. Z. B. sind die GTPasen Ras und Krev-1 zu 56 % identisch, und es ist bekannt, dass sie mit überschneidenden Gruppen von Proteinpartnern interagieren, wiewohl mit unterschiedlichen Affinitäten, nämlich Raf, an das Ras bevorzugt bindet, Krit-1, an das Krev-1 vorzugsweise bindet, und das Rai-Guanin-Dissoziations-Stimulatorprotein (RaiGDS), an das beide Proteine binden (Serebdiskii et al., 1999). In gleicher Weise interagiert der Transkriptionsfaktor SCL, der in malignen lymphoiden Zellen exprimiert wird, mit den Proteinen LMO1, LMO2, DRG, mSin3a und E47 (Mahajan et al., 1996).
Trotz der Nützlichkeit reverser n-Hybrid-Screenings zur Identifikation potentiell nützlicher therapeutischer Moleküle, die eine einfache Interaktion in einer Zelle antagonistisch beeinflussen, können solche Screenings außerstande sein, zwischen mehrfachen Interaktionen in der Zelle, die Bindungspartner mit gleichen oder nah verwandten Partnerbindungsdomänen involvieren, wie den oben beschriebenen, zu unterscheiden. Bekannte reverse 2-Hybrid- oder reverse 3-Hybrid-Screenings stellen kein Mittel bereit, um vorzugsweise eine Interaktion zwischen 2 oder mehr Bindungspartnern gegenüber einer anderen Protein-Protein-Interaktion, die einen oder mehrere der gleichen Bindungspartner oder nah verwandte Bindungspartner involviert, zu selektieren. Demgemäß haben die existierenden Technologien den Nachteil, bei dem Durchmusterungsprozess falsch-positive Ergebnisse zu liefern, was zusätzliche Zeit und zusätzlichen Aufwand notwendig macht, um die wahren Bindungspartner herauszufinden.
In einem Versuch, Probleme mit der Identifikation von falschen Positiven zu überwinden, beschreibt WO 99/14319 ein Verfahren, das mehrfache Reportermoleküle verwendet, um die Fähigkeit eines Testproteins, mit einem ersten Protein, aber nicht mit einem zweiten Protein zu interagieren, zu bestimmen. Während das Verfahren zur Identifikation spezifischer Proteininteraktionen verwendbar ist, ist es bei der Identifikation eines Inhibitors (z. B. eines inhibitorischen Peptids), der zwischen mehrfachen Interaktionen unterscheidet (d. h. eines selektiven Inhibitors), von geringem Nutzen.
US 5,965,368 beschreibt ein ähnliches Verfahren zur Identifikation eines Proteins, das imstande ist, mit einem zweiten Protein, jedoch nicht mit einem dritten Protein zu interagieren. Jedoch verwendet in diesem Fall das beschriebene Verfahren einen gegenselektierbaren Marker. Das beschriebene Verfahren selektiert spezifisch gegen Interaktionen, an denen mehrfache Bindungspartner beteiligt sind, was es zur Bestimmung eines Inhibitors, der zwischen mehrfachen Interaktionen unterscheidet, ungeeignet macht.
Überdies sind existierende reverse 2-Hybrid-Screenings und reverse 3-Hybrid-Screenings aufgrund des Mangels eines geeigneten Shuttle-Vektors oder geeigneter Wirtszellstämme für Hochdurchsatzanwendungen nicht ideal geeignet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der zu der vorliegenden Erfindung führenden Arbeit versuchten die Erfinder, reverse n-Hybrid-Screenings zu entwickeln, die verglichen mit konventionellen reversen n-Hybrid-Screenings erhöhte Spezifität bei der Detektion von interagierenden Bindungspartnern besitzen sollten und die insbesondere die Fähigkeit haben sollten, zwischen Interaktionen zu unterscheiden, die einen oder mehrere Bindungspartner gemeinsam hatten.
Hier ist der Begriff „Interaktion" so zu verstehen, dass er sich auf eine direkte oder indirekte physikalische Assoziation zwischen zwei oder mehr Molekülen oder „Partnern" bezieht, wobei diese Assoziation an einem zellulären Prozess beteiligt ist, oder alternativ, die erforderlich ist, damit dieser zelluläre Prozess stattfinden kann. An der „Assoziation" kann die Bildung eines induzierten magnetischen oder paramagnetischen Feldes, die Bildung einer kovalenten Bindung wie z. B. einer Disulfidbrückenbildung zwischen Polypeptidmolekülen, eine ionische Interaktion, wie sie z. B. in einem Salzgitter vorliegt, eine Wasserstoffbrücke oder alternativ eine Van-der-Waals-Interaktion wie eine Dipol-Dipol-Interaktion, eine durch einen Dipol induzierte Dipol-Interaktion, eine durch einen induzierten Dipol induzierte Dipol-Interaktion oder eine abstoßende Interaktion oder irgendeine Kombination der angeführten Anziehungskräfte beteiligt sein.
Z. B. kann in einem reversen 2-Hybrid-Assay an der Interaktion zwischen den proteinösen Bindungspartnern deren direkte physikalische Assoziation beteiligt sein (d. h. ohne ein Molekül dazwischen). In ähnlicher Weise ist in einem reversen 3-Hybrid-Assay die Interaktion zwischen einigen der Bindungspartner, insbesondere die Interaktion zwischen den zwei Ködern und die Interaktion zwischen einem der Köder und der Beute eine direkte physikalische Assoziation. In einem 3-Hybrid-Assay sind jedoch der konstante Köder und die Beute eindeutig indirekt miteinander assoziiert, da der nichtkonstante Köder (z. B. ein RNA-Köder im Fall einer RNA-Protein-Interaktion) eine „Brücke" zwischen diesen Partnern bildet. Demgemäß sind zu den Zwecken der vorliegenden Erfindung in dem Bereich des Begriffes „Interaktion" eindeutig solche direkten und indirekten Assoziationen zwischen den verschiedenen Bindungspartnern inbegriffen, und infolgedessen werden keine ungenannten Bindungspartner übergangen.
Hier bezieht sich der Begriff „n-Hybrid" auf die Anzahl der Bindungspartner außer dem Peptidinhibitor, die an einer Interaktion beteiligt sind, die gemessen wird. Demgemäß gibt es in einem konventionellen reversen 2-Hybrid-Screening zwei Bindungspartner, in einem konventionellen reversen 3-Hybrid-Screening drei Bindungspartner usw.
Demgemäß stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifikation eines Peptids, das eine Zielinteraktion zwischen zwei oder mehr Bindungspartnern in einer Wirtszelle teilweise oder vollständig inhibiert, das aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen einigen, aber nicht allen dieser Bindungspartner nicht inhibiert, bereit, wobei dieses Verfahren umfasst:

(i) Expression in einem zellulären Wirt: (a) der Bindungspartner der Zielinteraktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer Reportergene in den zellulären Wirt kontrollieren, wobei diese Expression durch eine Störung der Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird; (b) der Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei diese Expression durch eine Störung der Nicht-Ziel-Interaktion teilweise oder vollständig inhibiert wird, und das Reportergen von dem unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten Reportergen oder den unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten Reportergenen verschieden ist; und (c) eines Kandidatenpeptids, wobei eines oder mehrere der auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergene gegenselektierbare Reportergene sind, die dem Wirt konditionale Letalität vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert wird, die Expression von einem oder mehreren der Bindungspartner in Abhängigkeit von Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem die Expression unter die Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der regulatorische Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfasst;
(ii) Wachstum des zellulären Wirts unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression jedes Reportergens bzw. aller Reportergene in (a) von der Expression des Reportergens bzw. der Reportergene in (b) zu unterscheiden; und
(iii) Detektion derjenigen Wirtszellen, in denen die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehenden Reportergens/Reportergene teilweise oder vollständig inhibiert wird und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergens/Reportergene nicht inhibiert wird, wobei die detektierten Zellen ein Peptid exprimieren, das die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert.

Dieser Aspekt der Erfindung schließt in seinen Bereich eindeutig sowohl reverse 2-Hybrid- als auch reverse 3-Hybrid-Assays oder beliebige reverse n-Hybrid-Assays kraft des Begriffs „Interaktion", wie oben definiert, ein. Wie dem Fachmann bekannt sein wird, ist der einzige Unterschied zwischen dem reversen 2-Hybrid-Format und den Formaten höherer Ordnung der Zusatz weiterer Bindungspartner, die die relativen physikalischen Assoziationen zwischen allen dieser Bindungspartner verändern können, während jedoch das allgemeine Prinzip für alle reversen n-Hybrid-Assay-Formate das gleiche ist.
Die Wirtszelle kann eine beliebige Zelle sein, die imstande ist, die Expression exogener DNA zu unterstützen, wie z. B. eine Bakterienzelle, eine Insektenzelle, eine Hefezelle, eine Säugerzelle oder eine Pflanzenzelle. Vorzugsweise ist die Zelle eine Bakterienzelle, eine Säugerzelle oder eine Hefezelle. Vorzugsweise hat eine Hefezelle den Genotyp MATα, ura3, trp1, his3, cyh2^R, IexAop-URA3, IexAop-CYH2, ade2. Ein solcher Hefestamm kann unter Verwendung spontaner Cycloheximid-resistenter Derivate von YPH252 (Sikorski et al., 1989) oder EGY40 (Golemis und Brent, 1992; Gyuris et al. 1993) hergestellt werden.
Alternativ kann der Hefestamm PRT 473 sein, ein Cycloheximid-resistentes Derivat des Stammes SKY 473, mit dem Genotyp (MAT-a, cyh2^R his3, trp1, lexAop-LEU2, lexAop-CYH2ade2::ZEO^R, lexAop-URA3his5::G418^R, clop-LYS).
Der Begriff „Zielinteraktion" bezeichnet die Interaktion in den zellulären Wirt, gegen die ein spezifischer Antagonist oder Peptidinhibitor gesucht wird.
Eine „Nicht-Ziel-Interaktion" bedeutet eine Interaktion, an der mindestens ein mit der Zielinteraktion gemeinsamer Bindungspartner, wie oben definiert, beteiligt ist, gegen die jedoch kein spezifischer Antagonist gesucht wird. Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diejenigen Peptide auszuschließen, die sowohl die Zielinteraktion als auch die Nicht-Ziel-Interaktion in dem zellulären Wirt antagonisieren, und vorzugsweise diejenigen Peptide zu selektieren, die nur die Zielinteraktion in dem zellulären Wirt antagonisieren oder die die Zielinteraktion mit höherer Affinität antagonisieren als die Nicht-Ziel-Interaktion.
Der Begriff „teilweise oder vollständige Inhibition" bedeutet, dass die Expression des Reportergens unter der Kontrolle der Zielinteraktion auf ein Maß verringert wird, das die Fähigkeit, zwischen der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, wie oben definiert, zu unterscheiden, nicht beeinträchtigt.
Der Begriff „Bindungspartner" ist hier dahingehend zu verstehen, dass er ein Protein oder eine Nukleinsäure bezeichnet, das bzw. die an ein anderes Protein oder eine andere Nukleinsäure in einer Zelle bindet – einschließlich eines vollständigen Proteins oder Gens – oder die Dimerisierungsregion eines Proteins oder eine cis-wirksame Nukleotidsequenz, die an eine Nukleinsäure oder ein Protein bindet. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind an jeder biologi schen Interaktion in einer Zelle mindestens zwei Bindungspartner beteiligt. Der Begriff „Dimerisierungsregion" bedeutet denjenigen Teil eines Proteins, der physikalisch in Bezug zu einem Bindungspartner steht. Der Begriff „cis-wirksame Nukleotidsequenz" ist dahingehend zu verstehen, dass er eine Nukleotidsequenz bedeutet, die kraft der Bindung eines Repressorproteins oder Aktivatorproteins dafür die Genexpression reguliert, einschließlich der minimalen Nukleotidsequenz, die die Fähigkeit hat, an dieses Repressorprotein oder dieses Aktivatorprotein zu binden.
Demgemäß ist es dem Fachmann klar, dass hier jeder Bezug auf einen gemeinsamen Bindungspartner einen Bezug auf homologe Proteine oder Gene einschließt, die eine oder mehrere Dimerisierungsregionen bzw. cis-wirksame Nukleotidsequenzen mit einem bekannten Bindungspartner gemeinsam haben, der an einer Interaktion beteiligt ist, gegen die das erfindungsgemäße reverse Hybridscreening gerichtet ist (d. h. an der Zielinteraktion).
Somit ist es in Fällen großer Proteinfamilien oder großer Multigenfamilien eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Peptid zu selektieren, das eine Zielinteraktion zwischen zwei oder mehreren Bindungspartnern in einer Wirtszelle teilweise oder vollständig inhibiert, aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen mehreren, aber nicht allen dieser Bindungspartner nicht inhibiert, wie z. B. zwischen beliebigen Homologa dieser Bindungspartner, die sich gemeinsame Dimerisierungsregionen oder cis-wirksame Sequenzen teilen, oder alternativ zwischen identischen Bindungspartnern, die ihrerseits mit einer Anzahl verschiedener Bindungspartner interagieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind einer oder mehrere der Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion mit einem Bindungspartner der Zielinteraktion identisch.
Die Erfindung wird weder durch die Natur der zu untersuchenden Zielinteraktion noch durch die Natur der Nicht-Ziel-Interaktion begrenzt, da der Fachmann auf der Basis der hierin enthaltenen Offenbarung alle Formate ohne weiteres ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand bestimmt. Vorzugsweise umfasst der eine oder mehrere der Bindungspartner Aminosäuren wie z. B. ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Enzymmolekül, oder alternativ umfasst er Nukleinsäure, wie z. B. DNA, RNA oder ein DNA/RNA-Hybrid. Besonders bevorzugt ist/sind die Ziel- und/oder Nicht-Ziel-Interaktionen Protein/Protein-Interaktionen oder Protein/Nukleinsäure-Interaktionen.
Vorzugsweise ist die Anzahl der an jeder Interaktion beteiligten Bindungspartner mindestens zwei. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes reverses 2-Hybrid-Assay bereit, wobei:

(i) die Bindungspartner der Zielinteraktion aus zwei Fusionsproteinen bestehen, wobei (a) ein Fusionsprotein die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen Fusionsprotein der Zielinteraktion dimerisiert, umfasst; und (b) ein Fusionsprotein die Transkriptionsaktivatordomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen Protein der Zielinterakti on dimerisiert, umfasst; und wobei die Dimerisierung zwischen diesen Fusionsproteinen einen Proteinkomplex hervorbringt, der an die cis-wirksame Sequenz bindet und die Expression des Reportergens oder der Reportergene aktiviert, wenn die Zielinteraktion in der Wirtszelle stattfindet; und
(ii) die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion aus zwei Fusionsproteinen bestehen, wobei (a) ein Fusionsprotein die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion dimerisiert, umfasst; und (b) ein Fusionsprotein die Transkriptionsaktivatordomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen Protein der Nicht-Ziel-Interaktion dimerisiert, umfasst, und wobei die Dimerisierung zwischen diesen Fusionsproteinen einen Proteinkomplex hervorbringt, der an die cis-wirksame Sequenz bindet und die Expression der Reportergene bzw. des Reportergens aktiviert, wenn die Nicht-Ziel-Interaktion in der Wirtszelle stattfindet.

Diese Ausführungsform der Erfindung ist insofern vielseitig, als die Natur der Bindungspartner der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion austauschbar sind, sofern die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion erhalten bleibt.
Z. B. können die Fusionsproteine der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, identisch sein oder die gleichen Aktivierungseigenschaften besitzen. In einem solchen Fall sind die Fusionsproteine der Ziel- und der Nicht-Ziel-Interaktionen, die DNA-Bindungsdomänen umfassen, verschieden, und ebenso die ciswirksamen Sequenzen, an die sie binden. Alternativ können die Proteine der Ziel- oder der Nicht-Ziel-Interaktion, die DNA-Bindungsdomänen umfassen, identisch, aber mit verschiedenen DNA-Bindungsdomänen fusioniert sein, die an verschiedene cis-wirksame Elemente stromaufwärts des Reportergens oder der Reportergene binden.
Alternativ können die Fusionsproteine der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen, die DNA-Bindungsdomänen umfassen, identisch sein oder die gleichen Bindungsaffinitäten besitzen. In einem solchen Fall sind auch die cis-wirksamen Sequenzen der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktion identisch oder funktional äquivalent, jedoch werden sich die Fusionsproteine der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, unterscheiden.
Wie dem Fachmann bekannt ist, erfordern reverse n-Hybrid-Screenings die funktionsfähige Verbindung der zu untersuchenden Interaktion mit der Expression eines Reportergens in der Zelle, wobei gegen die Expression des Reporters selektiert wird, um die Detektion eines Antagonisten für die Interaktion zu erleichtern. Die vorliegende Erfindung entwickelt diese Technik weiter, indem sie eine Möglichkeit zur Selektion gegen die Zielinteraktion bereitstellt, parallel zu der Selektion auf oder gegen die Nicht-Ziel-Interaktion.
Zu den besonders bevorzugten Zielinteraktionen, die dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich sind, gehören die Interaktionen zwischen SCL oder der Dimerisierungsregion von SCL und einem Protein ausgewählt unter LMO1, LMO2, DRG, mSin3A, E47, einer Dimerisierungsregion von LMO1, einer Dimerisierungsregion von LMO2, einer Dimerisierungsregion von DRG, einer Dimerisierungsregion von mSin3A und einer Dimerisierungsregion von E47.
Alternativ ist das erfindungsgemäße Verfahren imstande, die Interaktion zwischen LMO2 oder der Dimerisierungsregion von LMO2 und einem Protein ausgewählt unter SCL, LMO1, DRG, mSin3A, E47, einer Dimerisierungsregion von SCL, einer Dimerisierungsregion von LMO1, einer Dimerisierungsregion von DRG, einer Dimerisierungsregion von mSin3A und einer Dimerisierungsregion von E47 zu detektieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform findet die Interaktion zwischen der Dimerisierungsregion von SCL und der Dimerisierungsregion von LMO2 oder der Dimerisierungsregion von E47 oder der Dimerisierungsregion von LMO1 statt.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform findet die Interaktion zwischen der Dimerisierungsregion von LMO2 und der Dimerisierungsregion von E47 oder der Dimerisierungsregion von mSin3A statt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform findet die Interaktion zwischen der Dimerisierungsregion von E47 und der Dimerisierungsregion von mSin3A statt.
Die Transkriptionsaktivatordomäne ist vorzugsweise die GAL4-Aktivatordomäne.
Die DNA-Bindungsdomäne ist vorzugsweise ausgewählt unter der LexA-Operator-Bindungsdomäne, der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und der cl-Operator-Bindungsdomäne.
Wie hier anhand von Beispielen dargestellt, zeigen die gegenwärtigen Erfinder, dass ein erfindungsgemäßes Zwei-Hybrid-Screening imstande ist, zwischen Interaktionen in derselben Zelle zu unterscheiden, an denen (i) SCL und LMO2; und (ii) SCL und die Proteine LMO1, mSin3A oder E47 beteiligt sind. Zusätzlich zu der Unterscheidung zwischen diesen Interaktionen wendet das Verfahren reverse n-Hybrid-Screeningtechniken an, um Peptidaptamere zu identifizieren, die solche Interaktionen blockieren, und die infolgedessen eine potentielle Verwendbarkeit als therapeutische oder diagnostische Reagenzien besitzen.
In einem weiteren Beispiel unterscheidet das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren wirksam zwischen Interaktionen zwischen einem RNA-Molekül und einem Protein in derselben Zelle. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung gleichermaßen auf die Detektion von Inhibitoren sowohl von Protein- als auch von Nukleinsäure-Interaktionen in Zellen anwendbar.
Die hier beschriebenen verbesserten reversen Zwei-Hybrid- oder reversen Drei-Hybrid-Screenings erfordern die Expression der folgenden Entitäten in einer einzelnen Zelle:

(i) der Bindungspartner einer Zielinteraktion, so dass ihre Interaktion die Expression von einem oder mehreren Reportergenen in dieser Zelle erhöht und diese Expression durch die Störung dieser Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird;
(ii) der Bindungspartner einer Nicht-Ziel-Interaktion, so dass ihre Interaktion die Expression von einem oder mehreren Reportergenen in dieser Zelle erhöht und diese Expression durch die Störung dieser Nicht-Ziel-Interaktion teilweise oder vollständig inhibiert wird, wobei das letztere Reportergen bzw. die letzteren Reportergene von dem oder den unter der Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten Reportergen oder Reportergenen verschieden ist/sind; und
(iii) eines auf inhibitorische Wirkung zu testende Kandidatenpeptids; wobei eines oder mehrere der Reportergene, die funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehen, gegenselektierbare Reportergene sind, die dem zellulären Wirt konditionale Letalität vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert wird, die Expression von einem oder mehreren der besagten Bindungspartner in Abhängigkeit von Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem man diese Expression unter die Kontrolle eines Promotors stellt, der regulatorische Elemente des GAL1- oder des CUP1-Promotors umfasst.

Der Fachmann wird verstehen, dass der Ausdruck „Expression" die Transkription eines Gens zur Bildung von mRNA mit oder ohne posttranskriptionelles Prozessieren des Primärtranskripts, wie z. B. mRNA-Spleißen oder Anfügen einer Polyadenylatsequenz, wodurch translatierbare mRNA gebildet wird, umfasst. Zur Expression gehört weiterhin die Transkription mit nachfolgender Translation der mRNA zur Bildung eines Peptids oder Proteins mit oder ohne posttranslationelle Modifikationen des Proteins, die erforderlich sind, um seine Aktivität zu modulieren, wie z. B. Glykosylierung, Prozessierung, Spaltung oder Transport.
Der Fachmann erkennt anhand der hier gegebenen Beschreibung, dass das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen auf das Hochdurchsatz-Screening einer Reihe von Kandidatenpeptiden auf inhibitorische Aktivität anwendbar ist. Z. B. kann eine Bibliothek von Klonen, die Kandidatenpeptide exprimieren, hergestellt werden, und jedes Mitglied dieser Bibliothek kann in Zellen eingeführt werden, in denen die Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen gemessen werden können. Es werden diejenigen Zellen, in denen die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird, selektiert, wobei jede selektierte Zelle einen Klon besitzt, der die Zielinteraktion in der Zelle inhibiert.
Demgemäß umfasst der Ausdruck „Expression eines Kandidatenpeptids", wie hier verwendet, eindeutig die Expression mehrerer Mitglieder einer Bibliothek von Klonen, in der jedes Mitglied ein einzelnes Kandidatenpeptid exprimiert.
Der Begriff „Bibliothek" bezeichnet hier eine Gruppe verschiedener Nukleotidsequenzen, die eine Gruppe von Aminosäuresequenzen kodieren, wobei diese Nukleotidsequenzen vorzugsweise in einem geeigneten Vektor, Kosmid, Bakteriophagen oder Virus-Vektormolekül, der bzw. das sich zur Erhaltung und/oder Replikation in einem zellulären Wirt eignet, enthalten sind. Der Begriff „Bibliothek" schließt eine Bibliothek von synthetischen Zufallspeptiden ein, in der das Ausmaß der Diversität zwischen den Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen erheblich ist, und ebenso eine begrenzte Peptidbibliothek, in der es zwischen diesen Sequenzen ein geringeres Maß an Diversität gibt. Der Begriff „Bibliothek" deckt weiterhin verschiedene Aminosäuresequenzen, die aus einer zellulären Quelle gewonnen sind, ab, wie z. B. genomische Fragmente, die z. B., unter anderen Ansätzen, durch Scherung oder teilweisen Verdau genomischer DNA unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen erhalten worden sind. Eine „Peptidbibliothek" umfasst weiterhin Zellen, Viruspartikel und Bakteriophagenpartikel, die die einzelnen Aminosäuresequenzen oder Nukleotidsequenzen der diversen Gruppe enthalten.
Bevorzugte Bibliotheken gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung sind „repräsentative Bibliotheken", die eine Gruppe von Aminosäuresequenzen oder dieselben kodierenden Nukleotidsequenzen umfassen, die alle für eine festgelegte Länge von Peptid- bzw. Nukleinsäuremolekülen möglichen Kombinationen von Aminosäuren oder Nukleotidsequenzen einschließen.
Die Diversität von Peptidbibliotheken, insbesondere von aus genomischen Quellen erlangten Peptidbibliotheken, kann durch den Fachmann bekannte Mittel gesteigert werden, wie z. B. Zufallsmutagenese oder andere Mutagenese. In einem Beispiel dieser Ausführungsform werden aus der Expression genomischer DNA gewonnene Peptidbibliotheken in bakteriellen Stämmen, die einen Defekt in der Epsilon (ε) -Untereinheit der DNA Polymerase 3 (d. h. den dnaQ- und mutD-Allelen) und/oder in der Reparatur von fehlgepaarten Basen haben, amplifiziert oder vermehrt. Escherichia coli-Mutator-Stämme mit den mutY und/oder mutM und/oder mutD und/oder mutT und/oder mutA und/oder mutC und/oder mutS-Allelen sind für solche Anwendungen besonders nützlich. Bakterienstämme, die solche Mutationen tragen, sind dem Fachmann ohne weiteres verfügbar und sind z. B. in Akiyama et al 1989; Fijalkowska und Schaaper, 1995; Frick et al., 1995; Lu et al, 1995; Maki und Sekiguchi, 1992; Miller, 1992; Miller und Michaels, 1996; Moriya und Gollman, 1992; Schaape und Cornacchio, 1992; Slupska et al., 1996; und Tajiri et al., 1995 vollständig beschrieben worden.
Das exprimierte Kandidatenpeptid kann eine beliebige Aminosäuresequenz von mindestens ungefähr 1 bis 60 Aminosäuren Länge umfassen, und es kann aus der Expression von Nukleotidsequenzen stammen, die durch ein beliebiges aus einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, wie z. B. Zufallssynthese, oder unter Verwendung natürlich vorkommender Genome, wie hier beispielhaft dargestellt.
Das Peptid ist vorzugsweise ein Peptid aus 20 Aminosäuren. Die Verwendung größerer Fragmente, insbesondere unter Verwendung zufallsgescherter Nukleinsäuren, die aus bakteriellen, aus Hefe- oder aus Tiergenomen stammen, wird nicht ausgeschlossen.
Alternativ oder zusätzlich wird das Kandidatenpeptid als Fusionsprotein mit einem Kernimportmotiv exprimiert, das imstande ist, den Import dieses Peptids in den Kern der Wirtszelle, wo die Transkription erfolgt, zu ermöglichen, insbesondere mit dem in Hefe funktionsfähigen Kernlokalisationssignal von SV40.
Alternativ oder zusätzlich wird das Kandidatenpeptid als Fusionsprotein mit einer Peptidsequenz exprimiert, die imstande ist, die Aufnahme des Peptids durch eine isolierte Zelle zu erhöhen, wie z. B. wenn das jeweilige Peptid ex vivo synthetisiert und isolierten Zellen in der Kultur zugesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Peptidsequenz, die imstande ist, das Eindringen in oder die Aufnahme durch die Zellen zu verbessern, zu erhöhen oder zu unterstützen, in Insektenzellen oder Säugerzellen funktionsfähig, z. B. die Penetratin-Targetingsequenz von Drosophila.
Das Kandidatenpeptid kann auch in einer konformationell gespannten Form exprimiert werden. Aminosäuresequenzen, die in einer konformationell gespannten Form exprimiert werden, können innerhalb eines zweiten Polypeptids als Fusionsprotein exprimiert werden, so dass sie wirksam in die Sekundärstruktur des zweiten Polypeptids „hineinverschachtelt" sind. Alternativ kann das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid innerhalb von einer Schleife von Disulfidbrücken zirkularisiert werden, um die Vielfalt der Konformationen zu reduzieren, z. B. durch Expression des Peptids flankiert von oxydierten Cysteinresten. Dies kann von besonderem Vorteil sein, wenn die Aminosäuresequenzen innerhalb einer oberflächenexponierten oder funktionalen Stelle eines Proteins verschachtelt sind, so dass sie der Interaktion von Interesse zugänglich sind. Z. B. kann das Peptid innerhalb einer Thioredoxin-(TRX)-Polypeptidschleife exprimiert werden.
Die Bindungspartner können von getrennten DNA-Molekülen oder Vektoren exprimiert werden. Alternativ können sie von einem einzigen DNA-Molekül oder Vektor exprimiert werden. Die einzige Anforderung an die Expression der Bindungspartner ist die, dass beide Bindungspartner zur gleichen Zeit wie das zu untersuchende Kandidatenpeptid in einer Zelle exprimiert werden. Weiterhin werden die Bindungspartner unter Bedingungen exprimiert, die hinreichend sind, um die Expression des Reportergens, mit dem sie in der Zelle funktionsfähig verbunden sind, zu modulieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eindeutig auch Interaktionen höherer Ordnungen, an denen drei oder vier oder mehr Bindungspartner der Ziel- oder der Nicht-Ziel-Interaktion beteiligt sind.
Die Bindungspartner werden vorzugsweise als Fusionsproteine mit einer Kernlokalisationssequenz exprimiert, um ihren Transport an den Ort der Transkription in einer eukaryontischen Zelle (d. h. im Kern) zu ermöglichen, wie z. B. mit dem Kernlokalisationssignal aus dem „Large T Antigen" von SV40.
Eine Erfordernis an ein geeignetes Reportergen ist seine Fähigkeit, auf eine Weise exprimiert zu werden, die ohne weiteres detektiert werden kann, wie z. B. aufgrund des Phänotyps, den die Expression einer Zelle vermittelt (z. B. Auxotrophie oder Prototrophie für einen bestimmten Metaboliten, oder konditionale Letalität in Gegenwart eines bestimmten Substrats), oder alternativ durch Expression einer enzymatischen Aktivität, oder eines Proteins, das durch ein Immunassay, durch kolorimetrische Detektion oder aufgrund der Fluoreszenz detektierbar ist. Wie oben gesagt, ist mindestens eines der Reportergene im Verfahren ein gegenselektierbares Reportergen.
Zu den geeigneten Reportergenen gehören die Gene für das β-Galaktosidase-Enzym von Escherichia coli, für das Luciferase-Protein des Glühwürmchens (Ow et al., 1986; Thompson et al., 1991), für das grüne Fluoreszenz-Protein (Prasher et al., 1992; Chalfie et al., 1994; Inouye und Tsuji, 1994; Cormack et al., 1996; Haas et al., 1996, siehe auch Genbank-Zugangs nummer U55762), und die roten Fluoreszenzproteine von Discosoma (Matz et al., 1999) oder Propionibacterium freudenreichii (Wildt und Deuschle, 1999). Weiterhin können auch das HIS3-Gen [Larson, R.C. et al (1996); Condorelli, G.L. et al. (1996); Hsu, H.L. et al. (1991); Osada et al. (1995)] und das LEU2-Gen (Mahajan, M.A. et al., 1996) verwendet werden.
Mindestens ein Reportergen ist ein gegenselektierbares Reportergen (d. h., es vermittelt der Zelle konditionale Letalität). Zu anderen Reportergenen können Gene gehören, die fluoreszierende Proteine kodieren, und es kann eine Kombination von gegenselektierbaren Reportergenen und fluoreszenzproteinkodierenden Genen verwendet werden. Beide Arten von Reportergenen sind für Hochdurchsatz-Anwendungen geeignet, bei denen große Zahlen von Proben chargenweise durchmustert werden. Die Fluoreszenz kann ohne weiteres durch Fluorometrie oder fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) gemessen werden, welche Techniken dem Fachmann bekannt sind.
Sofern ein funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehendes Reportergen ein Fluoreszenzprotein kodiert, wird die Detektion der Reportergenexpression bewerkstelligt, indem man diejenigen Zellen identifiziert, die fluoreszieren, wenn das Reportergen exprimiert wird. Alternativ wird die Inhibition der Reportergenexpression bestimmt, indem man diejenigen Zellen identifiziert, die nicht fluoreszieren oder die im Vergleich zu der Situation bei Expression des Reportergens eine verringerte Fluoreszenz zeigen.
Zu den bevorzugten Reportergenen, die Fluoreszenzproteine kodieren, gehören das gfp-Gen, das cobA-Gen und die Fragmente oder Varianten des gfp-Gens oder cobA-Gens, die fluoreszierende Proteine kodieren.
Sofern ein funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehendes Reportergen ein gegenselektierbares Reportergen ist, das der Zelle konditionale Letalität vermittelt, wird die Detektion der Reportergenexpression dadurch bewerkstelligt, dass man diejenigen Zellen identifiziert, die ihr Wachstum einstellen oder sterben, wenn das Reportergen unter den Bedingungen, die Letalität vermitteln, exprimiert wird. Alternativ wird die Inhibition der Reportergenexpression dadurch festgestellt, dass man diejenigen Zellen identifiziert, die ihr Wachstum nicht einstellen, wenn das Reportergen exprimiert wird, oder die unter Bedingungen, die Letalität vermitteln, nicht sterben.
Bevorzugte gegenselektierbare Reportergene sind diejenigen Gene, die ein Polypeptid kodieren, das imstande ist, ein ungiftiges Substrat in ein toxisches Produkt umzuwandeln, insbesondere gegenselektierbare Reportergene ausgewählt unter: CAN, URA3, CYH2 und LYS2.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Kombination der URA3- und CYH2-Gene, funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion, bevorzugt. Alternativ oder zusätzlich ist die Verwendung des LYS2-Gens, funktionsfähig unter der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion, besonders bevorzugt.
In einer alternativen Ausführungsform stehen mehrfache Reportergene auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion, wobei diese Reportergene mindestens ein gegenselektierbares Reportergen und mindestens ein ein Fluoreszenzprotein kodierendes Gen umfassen, so dass die Detektion es umfasst, diejenigen Zellen zu identifizieren, die wachsen oder überleben und nicht fluoreszieren oder im Vergleich zu der Situation bei Expression des Reportergens eine verringerte Fluoreszenz zeigen, wenn das Reportergen nicht exprimiert wird.
Auf ähnliche Weise können mehrfache Reportergene in funktionsfähiger Weise unter die Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion gestellt werden, und diese Gene umfassen mindestens ein gegenselektierbares Reportergen und mindestens ein Gen, das ein Fluoreszenzprotein kodiert.
Der Fachmann weiß, wie er ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand genetische Sequenzen, die solche Reportermoleküle kodieren, zur Ausführung der hier beschriebenen Erfindung verwenden kann. Z. B. kann die kodierende Sequenz des ein solches Reportermolekül kodierenden Gens in Übereinstimmung mit bekannten Präferenzen bei der Verwendung von Codons zur Verwendung in der Zelllinie von Interesse (z. B. Menschenzellen, Hefezellen) angepasst werden. Weiterhin kann die Translationseffizienz von aus nicht-eukaryontischen Quellen gewonnenen mRNAs erhöht werden, indem man die entsprechenden Gensequenzen mutiert oder auf andere Weise in dieses Gen eine Kozak-Translationsinitiations-Konsensussequenz einführt (Kozak, 1987).
Um die Reportergenexpression mit der Zielinteraktion oder umgekehrt mit der Nicht-Ziel-Interaktion zu verbinden, sollte das Reportergen eine oder mehrere cis-wirksame Sequenzen umfassen, an die sich einer der Bindungspartner dieser Interaktion binden oder anlagern kann. Solche Merkmale sind dem Fachmann bekannt.
Die cis-wirksame Sequenz der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion ist vorzugsweise ausgewählt unter dem LexA-Operator, der GAL4-Bindungsstelle und dem cl-Operator. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der Erfindung ist es für einen Bindungspartner, der eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, bevorzugt, imstande zu sein, an diese cis-wirksame Sequenz zu binden, in welchem Fall diese DNA-Bindungsdomäne ausgewählt ist unter der LexA-Operator-Bindungsdomäne, der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und der cl-Operator-Bindungsdomäne.
Der Fachmann weiß, dass die Expression einer Entität in einer Zelle es erfordert, Nukleinsäure in funktionsfähiger Weise mit einer in der Zelle funktionsfähigen Promotorsequenz zu verbinden.
Wird hier auf einen „Promotor" Bezug genommen, so ist dies im weitesten Sinne zu verstehen und umfasst die Transkriptionsregulationssequenzen eines klassischen genomischen Gens einschließlich der TATA-Box, die zur präzisen Transkriptionsinitiation in Eukaryontenzellen erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz und zusätzliche regulatorische Elemente (z. B. stromaufwärts gelegene aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer). Promotoren können auch eines TATA-Box-Motivs ermangeln, jedoch ein oder mehrere „Initiatorelemente" umfassen oder, wie es bei aus Hefe gewonnenen Promotorsequenzen der Fall ist, eine oder mehrere stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen oder „UAS"-Elemente (upstream activator sequences) umfassen. Zur Expression in prokaryontischen Zellen, wie z. B. Bakterien, sollte der Promotor mindestens die -35-Box- und -10-Box-Sequenzen enthalten.
Ein Promotor ist normalerweise stromaufwärts oder 5'-wärts von einem Strukturgen gelegen, dessen Expression er reguliert. Weiterhin liegen die einen Promotor umfassenden regulatorischen Elemente normalerweise in einem Bereich von etwa 2 kb um die Transkriptionsinitiationsstelle des Gens.
Im gegenwärtigen Kontext wird der Begriff „Promotor" auch verwendet, um ein synthetisches Molekül oder ein Fusionsmolekül oder ein Derivat davon zu beschreiben, das die Expression des jeweiligen Reportermoleküls in einer Zelle vermittelt, aktiviert oder steigert.
Promotoren können zusätzliche Kopien von einem oder mehreren spezifischen regulatorischen Elementen enthalten, um die Expression des Gens weiter zu steigern und/oder die räumliche Expression und/oder die zeitliche Expression zu verändern. Beispielsweise können regulatorische Elemente, die die gesteigerte Expression eines Gens durch Galaktose oder Glukose oder Kupfer erleichtern, angrenzend an eine heterologe Promotorsequenz, die die Expression des Gens antreibt, platziert sein. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Promotoren, die regulatorische Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfassen, zur Titration der Expression von einem oder mehreren Bindungspartnern in Reaktion auf Galaktose bzw. Kupfer in dem Kulturmedium, in dem die Wirtszelle wächst, verwendet.
Ein Gen in funktionsfähiger Weise unter die Kontrolle einer Promotorsequenz zu stellen, bedeutet, dieses Gen so zu positionieren, dass seine Expression von der Promotorsequenz kontrolliert wird. Promotoren sind im Allgemeinen 5'-wärts (stromaufwärts) der Gene, die sie kontrollieren, gelegen. Bei der Konstruktion heterologer Promotor/Strukturgen-Kombinationen ist es allgemein bevorzugt, den Promotor in einer Entfernung von der Transkriptionsinitiationsstelle des Gens zu positionieren, die ungefähr der Entfernung zwischen diesem Promotor und dem Gen, das es in seinem natürlichen Kontext kontrolliert, das heißt, dem Gen, von dem der Promotor gewonnen ist, gleicht. Wie im Stand der Technik beschrieben, wird eine gewisse Variation dieser Entfernung ohne Verlust der Promotorfunktion toleriert. In ähnlicher Weise wird die bevorzugte Position eines regulatorischen Sequenzelements im Bezug auf ein heterologes Gen, das unter seine Kontrolle gestellt werden soll, durch die Position des Elements in seinem natürlichen Kontext, d. h. durch die Gene, von denen es gewonnen ist, definiert. Wiederum kann, wie im Stand der Technik beschrieben, eine gewisse Variation dieser Entfernung eintreten.
Zu Beispielen für Promotoren, die zur Regulation der Expression des Reportermoleküls und/oder des Kandidatenpeptids und/oder eines proteinösen Bindungspartners geeignet sind, gehören Virus-, Pilz-, Hefe-, Insekten-, Tier- und Pflanzenpromotoren, insbesondere solche, die die Expression in einer eukaryontischen Zelle vermitteln können, wie z. B. in einer Hefezelle oder einer Säugerzelle.
Zu den besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Promotoren gehören diejenigen natürlich vorkommenden synthetischen Promotoren, die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren enthalten, besonders bevorzugt für Helix-Schleife-Helix-Transkriptionsfaktoren, Zinkfingerproteine, Leucin-Reißverschlussproteine und dergleichen. Bevorzugte Promotoren können auch synthetische Sequenzen sein, die eine oder mehrere stromaufwärts gelegene Operatorsequenzen umfassen, wie z. B. LexA-Operatorsequenzen oder von irgendeinem der hier erwähnten Promotoren abgeleitete aktivierende Sequenzen wie z. B. GAL4-DNA-Bindungsstellen.
Der Fachmann erkennt, dass die Auswahl des Promotors von der Natur der zu transformierenden Zelle und dem zu exprimierenden Molekül abhängt. Der Fachmann ist ohne weiteres imstande, für Zelltypen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, funktionale Kombinationen von Minimalpromotorsequenzen und -Operatoren zu bestimmen.
Obwohl die Erfindung vorzugsweise in Hefezellen durchgeführt wird, ziehen die Erfinder eindeutig auch Abwandlungen in Betracht, bei denen die Erfindung vollständig in Bakterien- oder Säugerzellen durchgeführt wird, wobei sie geeignete, darin funktionsfähige Promotoren verwenden, um die Expression der verschiedenen Assay-Bestandteile in solchen Zellen anzutreiben. Solche Ausführungsformen liegen innerhalb der Reichweite des Fachmanns.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein Hefepromotor, ein Säugerpromotor, ein Bakterienpromotor oder ein Bakteriophagenpromotor, ausgewählt unter den Promotorsequenzen von MYC, GAL1, CUP1, PGK1, ADH1, ADH2, PHO4, PHO5, HIS4, HIS5, TEF1, PRB1, GUT1, SPO13, CMV, SV40, LAC, TEF, EM7, SV40 und T7.
Zur Expression in Säugerzellen ist es bevorzugt, wenn der Promotor die CMV-Promotorsequenz ist, insbesondere bevorzugt der CMV-IE-Promotor, oder alternativ der SV40-Promotor und insbesondere die späte Promotorsequenz von SV40. Diese Promotoren und andere zur Expression von Genen in Säugerzellen geeignete Promotorsequenzen sind im Stand der Technik beschrieben.
Zu den Beispielen für die Säugerzellen, die hier als zur Expression geeignet betrachtet werden, gehören COS, VERO, HeLa, Maus-C127, Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), WI-38, embryonale Hamsterniere (BHK) oder MDCK-Zelllinien und andere. Solche Zelllinien sind dem Fachmann ohne weiteres verfügbar.
Das Erfordernis zur Herstellung intakter Polypeptide in Bakterienzellen und insbesondere in Escherichia coli-Zellen ist die Verwendung eines starken Promotors mit einer wirksamen Ribosomen-Bindungsstelle, wie z. B. einer Shine-Dalgarno-Sequenz, die in Expressionsvektoren, die die erste und zweite Nukleotidsequenz tragen, oder in andere genetische Konstrukte, die zur Ausführung der verschiedenen alternativen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, eingebaut werden kann. Zu den typischen zur Expression in Bakterienzellen wie z. B. E. coli geeigneten Promotoren gehören der lacz-Promotor, die temperatursensitiven λ_L- oder λ_R-Promotoren, der T7-Promotor oder der IPTG-induzierbare tac-Promotor, ohne darauf beschränkt zu sein. Eine Anzahl anderer Vektorsysteme zur Expression von Nukleinsäure in E. coli sind im Stand der Technik gut beschrieben und z. B. in Ausubel et al. (1987) oder Sambrook et al. (1989) dargestellt. Zahlreiche Quellen für zur Expression in Bakterien geeignete Sequenzen sind auch in verschiedenen Vektorkonstrukten allgemein verfügbar, wie z. B. pKC30 (λ_L: Shimatake und Rosenberg, 1981), pKK173-3 (tac: Amann und Brosius, 1985), pET- 3 (T7: Studier und Moffat, 1986) oder der pQE-Expressionsvektorserie (Quiagen, CA) und anderen.
Wenn es beabsichtigt ist, dass der Promotor die Expression des Reportermoleküls reguliert, ist es besonders bevorzugt, dass der Promotor eine oder mehrere Erkennungssequenzen für die Bindung einer DNA-Bindungsdomäne umfasst, die von einem Transkriptionsfaktor abgeleitet sind, z. B. eine GAL4-Bindungsstelle oder eine LexA-Operatorsequenz.
In Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die die oben genannten Komponenten exprimierenden Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die hinreichend sind, um es den Bindungspartnern der Zielinteraktion mindestens zu erlauben, sich zu assoziieren. Auch die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion können sich unter solchen Bedingungen gegebenenfalls assoziieren. Jedoch unterscheiden sich die Bildung der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion kraft der funktionsfähigen Verbindung der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion mit unterschiedlichen Reportergenen, die in Abhängigkeit von den verwendeten Reportergenen gleichzeitig oder getrennt gemessen werden können. Z. B. können verschiedene gegenselektierbare Reportergene verwendet werden, um die Ziel- und die Nicht-Ziel-Interaktion zu messen, in welchem Fall diese Interaktionen anhand des Überlebens oder Wachstums der Zellen auf bestimmten Substraten unterschieden werden können. Wie hier beispielhaft dargestellt, zeigen die gegenwärtigen Erfinder, dass es möglich ist, zwischen einer Zielinteraktion, die funktionsfähig sowohl mit dem URA3- als auch mit dem CYH2-Gen verbunden ist, und einer Nicht-Ziel-Interaktion, die mit dem LYS2-Gen verbunden ist, zu unterscheiden. In dieser Ausführungsform sind die Zellen, in denen die Zielinteraktion, aber nicht die Nicht-Ziel-Interaktion, inhibiert wird, detektierbar, da sie gegenüber Fluororotsäure (5-FOA) und Cycloheximid resistent sind, kein Lysin für ihr Wachstum benötigen und/oder gegen ihr Wachstum auf α-Aminoadipat (α-AA) enthaltenden Medien empfindlich sind. Umgekehrt sind Zellen, in denen die Zielinteraktion, aber nicht die Nicht-Ziel-Interaktion die Reportergenexpression aktiviert, detektierbar, da sie gegenüber Fluororotsäure (5-FOA) und Cycloheximid empfindlich sind, für ihr Wachstum exogenes Lysin benötigen und/oder gegenüber Wachstum auf α-Aminoadipat (α-AA) enthaltenden Medien resistent sind. In ähnlicher Weise haben die gegenwärtigen Erfinder gezeigt, dass es möglich ist, vermittelst einer Detektion der verschiedenen Emissionswellenlängen der exprimierten Proteine zwischen einer Zielinteraktion und Nicht-Ziel-Interaktion, die funktionsfähig mit verschiedenen Fluoreszenzproteinen kodierenden Reportergenen verbunden sind, zu unterscheiden. Jedoch erfordert das erfindungsgemäße Verfahren, dass mindestens ein Reportergen unter der Kontrolle der Ziel- oder der Nicht-Ziel-Interaktion ein gegenselektierbares Reportergen ist.
Da die beispielhaft dargestellten Reportergene für die Nicht-Ziel-Interaktionspaare LYS2 und CobA sind (1–4), wird die durch Blockade erreichte Spezifität der Inhibition dadurch bestimmt, dass man Klone aus dem primären Screening auf Medien, denen Lysin fehlt, replikaplattiert und unter Anregung mit UV-Licht auf die Gegenwart roter Fluoreszenz testet, was die fehlende Inhibition der Zielinteraktion anzeigt. Die „Interaction-mating-Technik" von Finley und Brent (1994) kann verwendet werden, um schnell zu bestimmen, ob aus dem oben genannten Screening isolierte Peptidinhibitoren für die Zielinteraktion spezifisch sind. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändiger, weil er die Rückgewinnung des Kandidatenpeptidinhibitorplasmids aus dem diploiden Stamm und seine Rücktransformation in den haploiden Stamm vom geeigneten Paarungstyp, dem das ursprüngliche Köderplasmid fehlt, erfordert, bevor er mit Stämmen gepaart wird, der die spezifischen Kontrollen enthält. Ein Vorteil eines mit einer anderen DNA-Bindungsdomäne verbundenen endogenen Nicht-Ziel-Köders besteht in der Fähigkeit, die Spezifität des Peptidaptamers für eine bestimmte Interaktion direkt, in demselben Stamm, in dem der Peptidinhibitor exprimiert wird, zu bestätigen. Diese Effizienzzunahme ist für Hochdurchsatzanwendungen der Technologie von Bedeutung.
Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise Selektion und Wachstum der detektierten Zellen. Eine solche Selektion kann auch auf der Detektion des/der verwendeten Reportergen/s(e) aufgebaut werden, und sie kann unter Verwendung von im Stand der Technik anerkannten Prozeduren ohne weiteres durchgeführt werden. Kulturverfahren zur Haltung von Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellen sind gleichfalls aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
Die das Kandidatenpeptid, ein oder mehrere Reportergene oder einen oder mehrere Bindungspartner kodierende Nukleinsäure ist vorzugsweise in einem Vektor enthalten, der ausgewählt ist unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9) und pRT2 (SEQ ID NO:10). Noch bevorzugter ist es, wenn eine das Kandidatenpeptid kodierende Nukleinsäure in dem in einem der SEQ ID NOs: 1 bis 9 dargestellten Vektor enthalten ist; eine Nukleinsäure, die bis zu drei der Bindungspartner kodiert, in pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8) enthalten ist; und eine zwei Fluoreszenzreportergene kodierende Nukleinsäure in dem Vektor pRT2 (SEQ ID NO:10) enthalten ist.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den weiteren Schritt, in den zellulären Wirt ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle einzuführen, die einen oder mehrere Polypeptidbindungspartner kodieren, die an der Interaktion beteiligt sind, funktionsfähig unter die Kontrolle eines oder mehrerer geeigneter Promotorsequenzen gestellt. Demgemäß kann das erfindungsgemäße Verfahren abgewandelt werden, indem man in den zellulären Wirt eine oder mehrere Nukleinsäuren einführt, die ausgewählt sind unter:

(i) einer Nukleinsäure, die in exprimierbarem Format einen Bindungspartner der Zielinteraktion kodiert;
(ii) einer Nukleinsäure, die in einem exprimierbaren Format einen Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion kodiert;
(iii) einer Nukleinsäure, die in exprimierbarem Format das Kandidatenpeptid kodiert;
(iv) einer Nukleinsäure, die in exprimierbarem Format eine cis-wirksame Sequenz und ein Reportergen umfasst; und
(v) einer Nukleinsäure, die in exprimierbarem Format eine cis-wirksame Sequenz und ein gegenselektierbares Reportergen umfasst.

Zu den Verfahren zur Einfügung der Nukleinsäure in den zellulären Wirt gehört die Konjugation derjenigen Zellen, die eine oder mehrere dieser Nukleinsäuren besitzen, so dass hinreichend Nukleinsäuren in einer einzelnen Zelle kombiniert werden, um diejenigen Wirtszellen zu selektieren, die wachsen oder überleben, wenn die funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehenden gegenselektierbaren Reportergene exprimiert werden. Alternativ können Standardverfahren der Transformation oder Transfektion verwendet werden, um einzelne Gene in die Zellen einzuführen. In der Tat kann zu ihrer Einführung jedes standardmäßige Verfahren einschließlich von Zellkonjugations-, Transformations- oder Transkriptionsverfahren verwendet werden.
In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Identifikation eines Peptids, das eine Zielinteraktion zwischen zwei oder mehr Bindungspartnern in einer Hefezelle teilweise oder vollständig inhibiert, aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen einigen, aber nicht allen dieser Bindungspartner nicht inhibiert, wobei diese Methode die folgenden Schritte umfasst:

(i) Transformation einer Hefezelle mit einem Vektor ausgewählt unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-32 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9), wobei der Vektor weiterhin eine Nukleinsäure umfasst, die ein auf inhibitorische Aktivität zu testendes Kandidatenpeptid kodiert;
(ii) Einführung einer Nukleinsäure in die so transformierte Hefezelle, kodierend: (a) die Bindungspartner der Zielinteraktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer gegenselektierbarer Reportergene oder fluoreszenzproteinkodierender Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei die Expression durch Störung der Zielinteraktion vollständig oder teilweise inhibiert wird; und (b) die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer gegenselektierbarer Reportergene oder fluoreszenzproteinkodierender Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei die Expression durch Störung der Nicht-Ziel-Interaktion teilweise oder vollständig inhibiert wird und wobei dieses Reportergen sich von dem oder den unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimiertem/exprimierten Reportergen oder Reportergenen unterscheidet; wobei ein oder mehrere der funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergene gegenselektierbare Reportergene sind, die dem zellulären Wirt konditionale Letalität vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert wird, die Expression von einem oder mehreren der Bindungspartner in Abhängigkeit von Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem die Expression unter die Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der regulatorische Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfasst;
(iii) Selektion der Rekombinanten;
(iv) Wachstum der Rekombinanten unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression jedes Reportergens bzw. aller Reportergene in (a) von der Expression des Reportergens bzw. der Reportergene in (b) zu unterscheiden; und
(v) Detektion derjenigen Wirtszellen, in denen die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehende(n) Reportergens/Reportergene teilweise oder vollständig inhibiert wird, und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehende(n) Reportergens/Reportergene teilweise oder vollständig inhibiert wird, und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergens/Reportergene nicht inhibiert wird, wobei die detektierten Zellen ein Peptid exprimieren, das die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert.

Die fluoreszenzproteinkodierenden Reportergene werden vorzugsweise in die Zelle eingeführt, indem man die Zelle mit dem Vektor pRT2 (SEQ ID NO:10) transformiert.
Alternativ oder zusätzlich wird eine Nukleinsäure, die einen oder mehrere der Bindungspartner der Zielinteraktion und/oder der Nicht-Ziel-Interaktion kodiert, in die Zelle eingeführt, indem man die Zelle mit einem Derivat eines Vektors transformiert, der ausgewählt ist unter pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9), wobei dieses Derivat eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Bindungspartner kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäure, die bis zu drei Bindungspartner der Zielinteraktion und/oder der Nicht-Ziel-Interaktion kodiert, in die Zelle eingeführt, indem man die Zelle mit einem Derivat des Vektors pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:9) transformiert, wobei dieses Derivat Nukleotidsequenzen enthält, die diese Bindungspartner kodieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren außerdem den Schritt, das dritte Nukleinsäuremolekül aus der Wirtszelle zu isolieren, das Nukleinsäuremolekül zu sequenzieren und die von ihm kodierte Aminosäuresequenz zu gewinnen. Basierend auf der so gewonnenen Aminosäuresequenz können synthetische Peptide hergestellt werden. Techniken für solche Verfahren sind unter anderem z. B. von Ausubel et al. (1987) beschrieben worden. Der Fachmann ist mit solchen Techniken vertraut.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform werden aus solchen Screenings isolierte hochspezifische Peptide, bevor man sie einer Kultur von Eukaryontenzellen zuführt, exprimiert oder alternativ synthetisiert. Die Wirkung eines solchen Peptids auf die Expression einer Reihe von Genen oder auf die Entwicklung eines Phänotyps wird relativ zu Zellen, denen das Peptid fehlt, bestimmt. Beispielsweise kann das Expressionsprofil der Zelle unter Verwendung von dem Fachmann bekannter Microarray-Technologie kontrolliert werden. Demgemäß kann ein unter Verwendung des erfindungsgemäßen verbesserten reversen n-Hybrid-Assays identifiziertes inhibitorisches Peptid als dominant-negative Sonde für einen genetischen Weg dienen. Solche Wege sperren sich normalerweise gegen Analyse durch standardmäßige genetische Mittel. Überdies können die Sonden die Validierung von Pharmakonrezeptorkandidaten oder die Identifikation neuer Ziele unter Verwendung von Ersatzmarkern erleichtern.
Ein Peptid kann durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert werden, wobei die Peptide eine inhibitorische Aktivität gegenüber der Zielinteraktion haben, gegenüber der Nicht-Ziel-Interaktion hingegen eine verringerte inhibitorische Aktivität oder keine inhibitorische Aktivität. Es kann eine pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt werden, die das inhibitorische Peptid und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff und/oder ein Verdünnungsmittel umfasst.
Das Peptid antagonisiert oder inhibiert vorzugsweise eine Interaktion, die in eukaryontischen Zellen, insbesondere in Menschen- oder Tierzellen, eine oder mehrere schädliche Wirkungen hervorruft. Bevorzugter antagonisiert oder inhibiert das Peptid Interaktionen, an denen ein oder mehrere Onkoproteine beteiligt sind.
Erfindungsgemäß identifizierte inhibitorische Peptide können zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Menschen oder Tieren verwendet werden. Dies kann ihre Verwendung in Peptidtherapie-Schemata wie z. B. in Behandlungsprotokollen für Patienten mit Leukämie und/oder soliden Tumoren einschließen. Ihre Verwendung in Behandlungsprotokollen für diese Patienten umfasst ihre Verabreichung als Mittel zur Blockade der Zellteilung der malignen Zellen, wobei z. B. auf das SCL-Onkoprotein gezielt wird, um die maligne Zellteilung des Patienten zu stoppen. Die spezifische Ansteuerung von Onkoproteinen durch Arzneimittel, die diese Peptide enthalten, verringert die von den Patienten erlebten Nebenwirkungen im Vergleich zu denjenigen, die mit konventioneller Chemotherapie erlebt werden.
Solche inhibitorischen Peptide können auch verwendet werden, um andere Störungen zu behandeln, die sich aus schädlicher Expression aberranter biologischer Moleküle ergeben, die die normalen zellulären Funktionen beeinträchtigen.
Zu den für die Injektion geeigneten Arzneimittelformen gehören sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver zur Ad-hoc-Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. Ferner können sie die Form einer Salbe oder eine andere zur lokalen Anwendung geeignete Form haben. Alternativ können injizierbare Lösungen in Liposomen verkapselt zugeführt werden, um ihren Transport durch die Zellmembran zu unterstützen. Alternativ oder zusätzlich können solche Zubereitungen Bestandteile selbstorganisierender Porenstrukturen enthalten, um den Transport durch die Zellmembran zu erleichtern. Sie müssen unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein, um den Transport durch die Zellmembran zu erleichtern. Sie müssen unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und gegen die kontaminierenden/destruktiven Wirkungen von Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien und Pilzen, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerol, Polypropylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle enthält. Die richtigen Fließeigenschaften können erhalten werden, indem man z. B. eine Beschichtung wie z. B. Lecithin verwendet bzw. durch die erforderliche Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch oberflächenaktive Substanzen. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird erreicht, indem man antibakterielle und/oder Antipilzmittel zusetzt, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbitsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel einzubeziehen, z. B. Zucker oder Natriumchlorid. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem man in den Zusammensetzungen absorptionsverzögernde Mittel verwendet. z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem man die aktiven Substanzen in den erforderlichen Mengen mit verschiedenen anderen der oben genannten Inhaltsstoffe, wie erforderlich, einem geeigneten Lösungsmittel zusetzt, gefolgt von Filtersterilisation. Dispersionen werden grundsätzlich hergestellt, indem man die verschiedenen sterilisierten aktiven Inhaltsstoffe einem sterilen Exzipienten zusetzt, der das grundlegende Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe unter den oben aufgezählten enthält. Im Fall steriler Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, um ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs zusätzlich beliebiger gewünschter Zusatzinhaltsstoffe aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung zu erhalten.
Wenn die aktiven Inhaltsstoffe angemessen geschützt sind, können sie oral verabreicht werden, z. B. mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem essbaren Trägerstoff, oder sie können in Hart- oder Weichgelatinekapseln eingeschlossen, zu Tabletten komprimiert oder direkt dem Nahrungsmittel der Diät zugesetzt sein. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Substanz mit Exzipienten vermischt sein und in Form von schluckbaren Tabletten, Buccaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Waffeln und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten mindestens 1 Gew.-% an aktiver Substanz enthalten. Der prozentuale Anteil an den Zusammensetzungen und Zubereitungen kann natürlich variiert werden und kann passenderweise von etwa 5 bis etwa 80 Gew.-% der Einheit betragen. Die Menge der aktiven Verbindung in solchen therapeutisch verwendbaren Zubereitungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erreicht wird. Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen oder Zubereitungen werden so hergestellt, dass eine Einzeldosisform zwischen ungefähr 0,1 μg und 20 g der aktiven Substanz enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch Bindemittel enthalten wie z. B. Gummi, Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine. Sie können auch einen Exzipienten wie z. B. Dicalciumphosphat enthalten. Sie können auch ein Zerfallmittel wie z. B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen enthalten. Sie können auch ein Schmiermittel wie z. B. Magnesiumstearat enthalten. Sie können auch ein Süßmittel wie z. B. Saccharose, Lactose oder Saccharin enthalten. Sie können ein Geschmacksmittel wie z. B. Pfefferminz, Immergrünöl oder Kirschenaroma enthalten.
Wenn die Einzeldosisform eine Kapsel ist, kann sie, zusätzlich zu den Stoffen oben genannter Art, einen flüssigen Trägerstoff enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorliegen oder zu anderweitigen Modifikationen der physikalischen Form der Dosiseinheit. Z. B. können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beiden beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Substanz, Saccharose als Süßmittel, Methyl- und Propylparaben als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und Geschmacksstoffe, wie z. B. Kirschen- oder Orangenaroma, enthalten. Natürlich sollte jedes zur Herstellung irgendeiner Einzeldosisform verwendete Material von pharmazeutischer Reinheit und in den verwendeten Mengen im Wesentlichen ungiftig sein. Überdies ist es möglich, die aktive(n) Substanz(en) in Retardzubereitungen und -formulierungen zu inkorporieren.
Zu den Formen, die sich zur lokalen Anwendung eignen, gehören z. B. Salben, Lotionen und Gele.
Zu den pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln gehören beliebige und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, gegen Bakterien und/oder Pilze wirksame Substanzen, Isotonisierungsmittel, Absorptionsverzögerer und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Ihre Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen wird in Betracht gezogen, ausgenommen soweit irgendwelche herkömmlichen Medien oder Mittel mit den aktiven Inhaltsstoffen inkompatibel sind. Auch ergänzende aktive Inhaltsstoffe können in die Zusammensetzungen mit einbezogen werden.
Es ist im Interesse einer leichten Verabreichung und einheitlichen Dosierung besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Einzeldosisform zu formulieren. Der Begriff „Einzeldosisform" bezeichnet hier eine physisch eigenständige Einheit, die als Einzeldosierung für die zu behandelnden Säuger geeignet ist, wobei jede einzelne Einheit eine vorher festgelegte Menge aktiven Materials enthält, die berechnet ist, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Trägerstoff den gewünschten therapeutischen Effekt hervorzurufen. Die erfindungsgemäßen Einzeldosisformen werden diktiert und hängen direkt ab von (a) den individuellen Charakteristika des aktiven Stoffs und dem speziellen zu erreichenden therapeutischen Effekt und (b) den Begrenzungen, die der Kunst innewohnen, solch ein aktives Material zur Behandlung einer Krankheit bei Lebewesen zuzubereiten, die einen Krankheitszustand haben, in dem die körperliche Gesundheit, wie nachfolgend detailliert offenbart, beeinträchtigt ist.
Der aktive Hauptinhaltsstoff wird zur bequemen und wirksamen Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger in Einzeldosisform vermischt. Eine Einzeldosisform kann den aktiven Inhaltsstoff z. B. in Mengen im Bereich von 0,5 μg bis ungefähr 2000 mg enthalten. In Anteilen ausgedrückt, liegt die aktive Substanz im Allgemeinen mit von 0,5 μg bis ungefähr 2000 mg pro ml Trägerstoff vor. Im Fall von Zusammensetzungen, die ergänzende aktive Inhaltsstoffe enthalten, werden die Dosierungen durch Bezug auf die normale Dosis und Art der Verabreichung der Inhaltsstoffe festgelegt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch genetische Moleküle umfassen, wie z. B. einen Vektor, der imstande ist, Zielzellen zu transfizieren, wobei dieser Vektor ein Nukleinsäuremolekül trägt, das imstande ist, solche schädlichen biologischen Interaktionen zu inhibieren. Der Vektor kann z. B. ein viraler Vektor sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann einen Vektor zur Expression von einem oder mehreren Peptiden und/oder Bindungspartnern in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle einsetzen, wobei der Vektor die Merkmale eines Vektors enthält, der ausgewählt ist unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9). Die spezifischen Merkmale solcher Shuttle-Vektoren gehen für den Fachmann aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung und den dazugehörigen Zeichnungen und dem Sequenzprotokoll hervor.
Das Verfahren kann weiterhin einen Vektor zur Expression multipler Fluoreszenzreportergene in einer Hefezelle verwenden, wobei dieser Vektor umfasst:

(i) eine ein grünes Fluoreszenzprotein exprimierende Kassette, umfassend das gfp-Gen, auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle eines in Hefe funktionsfähigen chimären LexA/GAL1-Promotors mit mehrfachen LexA-Operatorstellen stehend; und
(ii) eine ein rotes Fluoreszenzprotein exprimierende Kassette, umfassend das cobA-Gen, auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle eines in Hefe funktionsfähigen chimären cl/GAL1-Promotors mit mehrfachen cl-Operatorstellen stehend.

Die spezifischen Merkmale solch eines Vektors gehen für den Fachmann aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung und den dazugehörigen Zeichnungen und dem Sequenzprotokoll hervor.
Aus der Beschreibung hier geht hervor, dass die Wirksamkeit beliebiger, durch das erfindungsgemäße reverse n-Hybrid-Screening identifizierter Peptide auf verschiedene Weisen, grundsätzlich durch einen Vergleich der Wirkung der Peptide auf Zielzellen von Interesse, überprüft werden kann. Z. B. wird die ausschließliche Rückgewinnung von Hefepeptidbibliotheksplasmiden aus positiven blockierenden Klonen schnell erreicht, indem man in Bakterien auf den einzigartigen Marker auf den pBLOCK-Vektor (z. B. die Blasticidin-Resistenz) selektiert. Die das Peptid kodierende DNA kann dann sequenziert werden. Für aus sequenzierten natürlichen Genomen gewonnene Peptidbibliotheken ist es nicht notwendig, den inhibitorischen Peptidklon zu sequenzieren. Statt dessen werden die positiven Klone lediglich, z. B. automatisch, in Master-Stocks übertragen, und die peptidkodierenden DNA-Inserts werden unter Verwendung von PCR amplifiziert, um Proben zu erhalten, die mit Oligonukleotid-Mikroarrays hybridisiert werden können. Solche Arrays repräsentieren die gesamten Genome, die verwendet wurden, um die Bibliothek herzustellen. Die genomische Position eines gegebenen Kandidaten für einen Blocker kann dann durch Bezug auf die Koordinaten des DNA-Mikroarrays abgeleitet werden. Die rückgewonnene DNA wird dann in einer geeigneten Zelllinie exprimiert, um ihre Wirkung auf den Phänotyp oder das Expressionsprofil der Zelle zu bestimmen. Eine solche Information ist nützlich, um die inhibitorische Aktivität, therapeutische Aktivität oder prophylaktische Aktivität des Peptids in vivo zu bestätigen, oder um neue Bindungspartner oder pharmazeutische Ziele in den gleichen biochemischen bzw. Signalübertragungs-Wegen wie der Partner der Zielinteraktion zu identifizieren.
Demgemäß kann ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung eines Peptids für eine eukaryontische Zelle umfassen:

(i) Isolation einer Nukleotidsequenz, die einen durch das hier beschriebene Verfahren identifizierten Peptidinhibitor kodiert;
(ii) Transfektion der eukaryontischen Zelle mit der isolierten Nukleinsäure; und
(iii) Vergleich des Phänotyps oder Expressionsmusters der transfizierten eukaryontischen Zelle mit dem Phänotypen oder Expressionsmuster einer ansonsten isogenen nicht-transfizierten Zelle, wobei ein abweichender Phänotyp oder ein abweichendes Expressionsmuster zeigt, dass das Peptid eine Wirkung auf die Zelle hat.

Vorzugsweise wird solch ein Verfahren an einer Säugerzelle durchgeführt.
Das Expressionsmuster der transfizierten eukaryontischen Zelle kann mit dem Expressionsmuster einer ansonsten isogenen nicht-transfizierten Zelle verglichen werden, indem man ein Array von Proteinen oder Nukleinsäuren herstellt, die von den transfizierten und von den nicht-transfizierten Zellen exprimiert werden, und diese Proteine oder Nukleinsäuren vergleicht. Array-Technologien bieten einen beträchtlichen Vorteil, indem sie schnelle Hochdurchsatz-Messreihen von Daten liefern, was die Identifikation neuer Bindungspartner für das inhibitorische Peptid erleichtert, wobei diese Bindungspartner Nukleinsäure oder Proteine sein können. Weiterhin können die neuartigen Bindungspartner auch zuvor unbekannte Bindungspartner für einen oder mehrere der Bindungspartner der Zielinteraktion, gemessen in Übereinstimmung mit dem hier beschriebenen erfinderischen Verfahren, sein.
Weiterhin ist, wenn dieses Verfahren an einer erkrankten Zelle, wie zum Beispiel einer Leukämiezelle oder einer anderen Krebszelle, durchgeführt wird, die aus dem modifizierten Expressionsmuster der transfizierten Zelle oder dem modifizierten Phänotyp dieser Zelle gewonnene Information nützlich, um neue prophylaktische oder therapeutische Pharmaka zu entwerfen. Insbesondere kann die Fähigkeit eines bestimmten Peptids, den erkrankten Phänotyp (z. B. tumorösen Phänotyp) teilweise oder vollständig zu revertieren oder korrigieren, bestimmt werden.
Demgemäß kann ein Verfahren zur Identifikation eines Peptids zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung eines Säugers die folgenden Schritte umfassen:

(i) Isolation einer Nukleotidsequenz, die einen durch das hier beschriebene Verfahren identifizierten Peptidinhibitor kodiert;
(ii) Transfektion der eukaryontischen Zelle mit der isolierten Nukleinsäure;
(iii) Vergleich des Phänotyps oder Expressionsmusters der transfizierten eukaryontischen Zelle mit dem Phänotyp oder Expressionsmuster einer ansonsten isogenen nicht-transfizierten Zelle, wobei ein abweichender Phänotyp oder ein abweichendes Expressionsmuster zeigt, dass das Peptid eine Wirkung auf die Zelle hat; und
(iv) Selektion eines Peptids, das den Phänotyp oder das Expressionsprofil der transfizierten Zelle revertiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung eines verallgemeinerten reversen 2-Hybrid-Screenings für Peptide, die spezifisch die Interaktion zwischen zwei hypothetischen Proteinen (in der Figur als X und Y bezeichnet) antagonisieren, jedoch die Interaktionen zwischen einem dieser hypothetischen Proteine (in der Figur als X bezeichnet) und einem anderen hypothetischen Protein (in der Figur als Z bezeichnet) nicht blockieren.
Feld A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Abwesenheit des Antagonismus der X/Y-Zielinteraktion und der X/Z-Nicht-Zielinteraktion. Die „Beute" (in der Figur als „Beute-X" plus „AD" bezeichnet) sowohl für die Zielinteraktion (obere beide Reihen) als auch die Nicht-Zielinteraktion (untere Reihe) umfasst das als Fusionsprotein mit der Aktivationsdomäne (AD) eines Transkriptionsfaktors exprimierte Protein X. Der „Köder" für die Zielinteraktion (obere beide Reihen) umfasst ein Fusionsprotein zwischen Protein Y und der DNA-Bindungsdomäne des LexA-Bindungsproteins (in der Figur „LexA-Y" bezeichnet). Die Reportergene für die Zielinteraktion (obere beide Reihen) bestehen aus den chimären gegenselektierbaren Reportergenen URA3 und CYH2 und dem das grüne Fluoreszenzprotein kodierenden gfp-Gen („GFP"; Prasher et al., 1992; Chalfie et al., 1994; Inouye und Tsuji, 1994), umfassend eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen (LexAop), an die der Köder binden kann. Der Nicht-Ziel-Köder umfasst ein Fusionsprotein zwischen dem Protein Z und dem cl-Repressorprotein (gepunktete Box, „cl-Z" markiert). Das Reportergen für die Nicht-Ziel-Interaktion besteht aus dem chimären LYS2-Gen und dem chimären cobA-Gen, von welchen jedes eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen umfasst (gepunktete Boxen, „clop" markiert), an die der Nicht-Ziel-Köder binden kann. Das cobA-Gen kodiert ein rotes Fluoreszenzprotein (Wildt und Deuschle, 1999). Schwarze Flaggen mit Totenschädel und gekreuzten Knochen bezeichnen die Expression der gegenselektierbaren Reportergene. Sonnensymbole bezeichnen die Expression der gfp- und cobA-Reportergene, die grünes bzw. rotes Fluoreszenzprotein exprimieren. Demgemäß ist der Hefestamm infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Ziel-Köder und den Beute-Fusionsproteinen, die an eine LexA-Operatorstelle oder -stellen der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 gebunden sind, gegenüber 5-FOA und Cycloheximid empfindlich; und er ist für die Lysin-Biosynthese prototroph infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und dem Beute-Fusionsprotein, die an die cl-Operatorstellen (clop) des LYS2-Reportergens gebunden sind, welche Prototrophie eine auxotrophe LYS2-Mutation in Hefe komplementieren kann. Der Stamm kann auch die gfp- und cobA-Gene unter der Kontrolle verschiedener stromaufwärts gelegener Promotorelemente exprimieren, und infolgedessen fluoresziert er bei Wellenlängen für grünes und/oder rotes Licht. Die Aktivierung dieser nicht letalen Reportergene kann verwendet werden, um die Stärke der Reportergenaktivierung unter Verwendung von nicht gegenselektierbaren Bedingungen zu quantifizieren.
Feld B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (mit einem „Peptidinhibitor" bezeichneten Pfeil markiertes Protein), das spezifisch die X/Y-Zielinteraktion (obere beide Reihen), aber nicht die X/Z-Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe) blockiert. Die Merkmale der Reportergen-Bindungspartner sind wie oben beschrieben. Die Sonnensymbole bezeichnen die Expression des cobA-Reportergens, das ein rotes Fluoreszenzprotein kodiert. Wie dargestellt, verhindert das inhibitorische Peptid (Peptidinhibitor) die Interaktion zwischen dem Köder der Zielinteraktion (LexA-Y) und der Beute (Beute-X/AD), so dass es in der Zelle keine Expression der gegenselektierbaren Reportergene URA3 oder CYH2 oder des gfp-Reportergens der X/Y-Zielinteraktion gibt. Demgemäß erlangt der Hefestamm Resistenz gegenüber 5-FOA und Cycloheximid, aber fluoresziert nicht mehr grün. Weiterhin kann das inhibitorische Peptid (Peptidinhibitor) die Interaktion zwischen der Beute (Beute-X/AD) und dem Köder der Nicht-Ziel-Interaktion (cl-Z) nicht inhibieren, und infolgedessen bleiben die Zellen für Lysin-Biosynthese prototroph infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und dem Beute-Fusionsprotein, die an die cl-Operatorstellen (clop) des LYS2-Reportergens gebunden sind, welche Prototrophie eine auxotrophe LYS2-Mutation in Hefe komplementieren kann. Außerdem exprimiert der Stamm weiterhin das cobA-Gen und fluoresziert infolgedessen rot.
2 ist eine schematische Darstellung eines reversen 2-Hybrid-Screenings für Peptide, die spezifisch die SCL/LMO2-Interaktion in Hefezellen antagonisieren, die SCUE47-Interaktion jedoch nicht blockieren.
Feld A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Abwesenheit eines Antagonismus der SCL/LMO2-Zielinteraktion und der SCL/E47-Nicht-Ziel-Interaktion. Die „Beute" sowohl für die Zielinteraktion (obere Reihe) als auch für die Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe) umfasst als Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne (Act) eines Transkriptionsfaktors exprimiertes SCL (d. h. mit SCL und Act markierte verbundene Boxen). Der „Köder" für die Zielinteraktion (obere Reihe) umfasst ein Fusionsprotein zwischen LMO2 und der DNA-Bindungsdomäne des LexA-Proteins (d. h. „LMO2" und „LexA" markierte verbundene Boxen). Die Reportergene für die Zielinteraktion (obere Reihe) bestehen aus chimären URA3- und CYH2-Genen, die eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfassen, an die der Köder binden kann. Der Nicht-Ziel-Köder umfasst ein Fusionsprotein zwischen E47 (als E47 markierte Box) und dem cl-Repressorprotein (als „cl" markierter Kreis). Das Reportergen für die Nicht-Ziel-Interaktion besteht aus einem chimären LYS2-Gen, das eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen umfasst, an die der Nicht-Ziel-Köder binden kann. Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Demgemäß ist der Hefestamm infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Ziel-Köder und dem an die LexA-Operatorstelle oder -stellen der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 gebundenen Beute-Fusionsproteine gegenüber 5-FOA und Cycloheximid empfindlich; und er ist infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und dem an die cl-Operatorstelle (clop) des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsprotein für die Lysin-Biosynthese prototroph, welche Prototrophie eine auxotrophe LYS2-Mutation bei Hefe komplementieren kann.
Feld B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (Δ), das spezifisch die SCL/LMO2-Zielinteraktion blockiert (obere Reihe), aber nicht die SCL/E47-Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe). Die Merkmale der Reportergene und Bindungspartner sind wie oben beschrieben. Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Stumpfendige Linien (}) bezeichnen die Abwesenheit einer detektierbaren Reportergenexpression.
Demgemäß ist nach Einführung eines inhibitorischen Peptidaptamers in die Zellen des Feldes A der Phänotyp des Stammes infolge der Inhibition der aktivierenden Interaktion zwischen dem an die LexA-Operatorstelle(n) der gegenselektierbaren Reportergene (URA3 und CYH2) gebundenen Zielköder und dem Beute-Fusionsprotein in 5-FOA-resistent und Cycloheximid-resistent umgewandelt; und infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und dem an die cl-Operatorstelle (clop) des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsprotein in prototroph für die Lysin-Biosynthese, welche Prototrophie bei Hefe eine auxotrophe LYS2-Mutation komplementieren kann, umgewandelt.
3 ist eine schematische Darstellung eines reversen 2-Hybrid-Screenings für Peptide, die die SCL/LMO2-Interaktion in Hefezellen spezifisch antagonisieren, die SCL/LMO1-Interaktion jedoch nicht blockieren.
Feld A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Abwesenheit eines Antagonismus der SCL/LMO2-Zielinteraktion und der SCL/E47-Nicht-Ziel-Interaktion. Die „Beute" sowohl für die Zielinteraktion (obere Reihe) als auch die Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe) ist wie für 1 oben beschrieben. Auch der „Köder" und die Reportergene für die Zielinteraktion (obere Reihe) und die Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe) sind wie für 1 oben beschrieben. Der Nicht-Ziel-Köder umfasst ein Fusionsprotein zwischen LMO1 („LMO1" markierte Box) und dem cl-Repressorprotein („cl" markierter Kreis). Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Demgemäß ist der Hefestamm infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Ziel-Köder und den an die LexA-Operatorstelle(n) der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 gebundenen Beute-Fusionsproteine empfindlich gegenüber 5-FOA und Cycloheximid; und prototroph für die Lysin-Biosynthese infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den an die cl-Operatorstellen (clop) des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsproteinen, welche Prototrophie bei Hefe eine auxotrophische Lys2-Mutation komplementieren kann.
Feld B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (Δ), das spezifisch die SCL/LMO2-Zielinteraktion (obere Reihe) blockiert, jedoch nicht die SCL/LMO1-Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe). Die Merkmale der Reportergene und Bindungspartner sind wie oben und in der Legende zu 1 beschrieben. Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Stumpfendige Linien (}) bezeichnen ein Fehlen detektierbarer Reportergenexpression. Demgemäß ist nach Einführung eines inhibitorischen Peptidaptamers in die Zelle des Feldes A der Phänotyp des Stammes in 5-FOA-resistent und Cycloheximid-resistent umgewandelt, aufgrund der Inhibition der aktivierenden Interaktion zwischen dem an die LexA-Operatorstelle(n) der gegenselektierbaren Reportergene (URA3 und CYH2) gebundenen Zielköder und dem Beute-Fusionsprotein; prototroph für die Lysin-Biosynthese infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den an die cl-Operatorstelle (clop) der LYS2-Reportergene gebundenen Beute-Fusionsproteinen, welche Prototrophie bei Hefe eine auxotrophe LYS2-Mutation komplementieren kann.
4 ist eine schematische Darstellung eines reversen 3-Hybrid-Screenings für Peptide, die spezifisch die Interaktion zwischen Nukleinsäuren und Proteinen in Hefezellen inhibieren.
Feld A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Abwesenheit eines Antagonismus der Zielinteraktion. Die Nicht-Ziel-Interaktion ist in der Figur nicht bezeichnet. Die „Beute" sowohl für die Zielinteraktion (als auch für jede Nicht-Ziel-Interaktion, nicht bezeichnet) ist ein RNA-bindendes Protein (TAT), das als Fusionsprotein mit der Aktivatordomäne eines Transkriptionsfaktors exprimiert wird. Das Assay verwendet zwei „Köder" für die Zielinteraktion, umfassend die Folgenden: (i) ein hybrides MS2/TAR RNA-Molekül, das mindestens die proteinbindenden Regionen der das MS2 Hüllprotein kodierenden RNA und der TAR-kodierenden RNA, die an TAT bindet, umfasst; und (ii) ein Fusionsprotein zwischen MS2 und der DNA-Bindungsdomäne des LexA-Proteins (d. h. mit MS2 und LexA markierte verbundene Boxen). Die Reportergene für die Zielinteraktion bestehen aus chimären URA3 und CYH2-Genen, die eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfassen, an die der Köder binden kann. Der Nicht-Ziel-Köder (nicht dargestellt) umfasst ein Fusionsprotein zwischen irgendeinem anderen Protein, an das die MS2/TAR-Hybrid-RNA binden kann (entweder durch den MS2-bindenden Nukleotidsequenzteil oder die TAT-bindende Sequenz) und dem cl-Repressorprotein. Das Reportergen für die Nicht-Ziel-Interaktion (nicht gezeigt) besteht aus einem chimären LYS2-Gen, das eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen umfasst, an die der Nicht-Ziel-Köder binden kann. Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Demgemäß ist der Hefestamm aufgrund der Interaktion zwischen den Ziel-Ködern (LexA/MS2-Protein und MS2/TAR-RNA) und den Beute-Fusionsproteinen (d. h. der TAT-Aktivator-Fusion) an den LexA-Operatorstelle(n) gegenüber 5-FOA und Cycloheximid empfindlich, welche Interaktionen der Expression der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 aktiviert. Überdies ist der Stamm prototroph für Lysin-Biosynthese aufgrund der Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den an die cl-Operatorstellen gebundene Beute-Fusionsproteine (nicht gezeigt), welche Interaktion die Expression des LYS2-Reportergens aktiviert.
Feld B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (
), das spezifisch die RNA/Protein-Zielinteraktion blockiert, aber nicht die Nicht-Ziel-RNA/Protein-Interaktion (nicht dargestellt). Die Merkmale der Reportergene und Bindungspartner sind wie oben beschrieben. Stumpfendige Linien (}) bezeichnen ein Fehlen detektierbarer Reportergenexpression. Demgemäß ist nach Einführung eines inhibitorischen Peptidaptamers in die Zelle des Feldes A der Phänotyp des Stammes infolge der Inhibition der aktivierenden Interaktion zwischen dem Beute-TAT-Aktivator-Fusionsprotein und der Ziel-MS2/TAR-Köder-RNA in 5-FOA-resistent und Cycloheximid-resistent umgewandelt, wobei diese Inhibition die Expression der gegenselektierbaren Reportergene (URA3 und CYH2) verhindert. Der Stamm ist auch prototroph für die Lysin-Biosynthese infolge der fortgesetzten aktivierenden Interaktion zwischen den Nicht-Ziel-Ködern und dem Beute-Fusionsprotein an den cl-Operatorstellen des LYS2-Reportergens.
5 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, umfassend:

(i) eine Expressionskassette, umfassend: (a) einen Polylinker mit Restriktionsschnittstellen für EcoRI, Acc651, KpnI, MfeI, AgeI, RsrII, XmaI, SrfI, KspI und SacII zur Einfügung einer das Peptid kodierenden Nukleotidsequenz, wobei der Polylinker an eine Sequenz angrenzt, die das V5-Epitop-Tag und die Kernlokalisierungssequenz von SV40 (nicht gezeigt) kodiert, so dass ein das Peptid, das Epitop-Tag und die Kernlokalisierungssequenz umfassendes Fusionspolypeptid exprimiert werden kann; (b) die Tandempromotoren T7, ADH1 und CMV zur Regulation der Expression des Polypeptids in Bakterien-, Hefe- bzw. Säugerzellen; und (c) eine Terminatorsequenz (ADH TT) zwischen dem Polylinker und einer XbaI-Schnittstelle, distal von den Tandempromotoren;
(ii) ein selektierbares Markergen (Bsd), das Hefe und Bakterien Blasticidinresistenz vermittelt und auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle von tandemförmigen Hefe- und in Bakterien funktionsfähigen Promotoren TEF1 und EM7 steht und stromaufwärts von dem in Hefe funktionsfähigen Transkriptionsterminator CYC1 (CYC TT) liegt;
(iii) ein selektierbares Markergen (Ampicillin), das Bakterien Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vermittelt, und das funktionsfähig oder der Kontrolle des bla-Promotors steht;
(iv) einen bakteriellen Replikationsursprung (pMB1 ori); und
(v) einen eukaryontischen Replikationsursprung (2μ Ori).

6 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben umfasst, ausgenommen dass der Polylinker die Restriktionsschnittstellen EcoRI, Acc651, KpnI, MfeI, AgeI, RsrII, Acc651, KpnI, XmaI, SrfI, KspI und SacII besitzt und von Integrationsstellen für den Bakteriophagen λ (attL1 und attL2) flankiert wird, die an eine Sequenz angrenzen, die das V5-Epitop-Tag kodiert, so dass ein Fusionspolypeptid, das dieses Peptid und dieses Epitop-Tag umfasst, exprimiert werden kann und eine das Peptid exprimierende Nukleinsäure (das Fusionspolypeptid nicht kodierend) nachfolgend durch homologe Rekombination im Bereich der Integrationsstellen ausgeschnitten werden kann.
7 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben umfasst, ausgenommen dass die Expressionskassette das gegenselektierbare Reportergen ccdB, zwischen den RsrII- und XmaI-Schnittstellen des Polylinkers einkloniert und in funktionsfähiger Verbindung mit einem stromaufwärts von den EcoRI-, RsrII-Abschnitt des Polylinkers gelegenen gelegenen Lac-Promotor umfasst. Dementsprechend ist der Vektor in Bakterienzellen konditionell letal, solange nicht das chimäre LacccdB-Gen durch die Einfügung von das zu exprimierende Peptid kodierenden Nukleotidsequenzen in dem EcoRI-RsrII-Abschnitt des Polylinkers unterbrochen wird.
8 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3) wie in der Legende zu 7 beschrieben umfasst, ausgenommen dass (i) der Polylinker zur Einfügung der Peptid-kodierenden Sequenz die einzelnen Restriktionsschnittstellen EcoRI, MfeI, ClaI, AgeI und RsrII trägt; und (ii) das chimäre lac-ccdB-Gen von Integrationsstellen für den Bakteriophagen λ (attL1 und attL2) zwischen der das V5-Epitop-Tag (V5) kodierenden Sequenz und dem ADH-Terminator (ADSH TT) flankiert ist, um das Ausschneiden zu ermöglichen.
9 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4) wie in der Legende zu 8 beschrieben umfasst und weiterhin (i) ein einen Einzelkettenantikörper kodierendes Gen (SCAG), das funktionsfähig unter der Kontrolle des SV40-Promotors steht; und (ii) eine zwischen dem EM7-Promotor und dem Bsd-Gen gelegene interne Ribosomeneintrittsstellensequenz (IRES) umfasst.
10 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4) wie in der Legende zu 8 beschrieben umfasst, jedoch sind die Integrationsstellen für den Bakteriophagen λ (attL1 und attL2) aus pBLOCK-3.6 durch LoxP-Stellen ersetzt, um ein Cre/loxPvermitteltes Ausschneiden des chimären Lac-ccdB-Gens zu ermöglichen.
11 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3) wie in der Legende zu 7 beschrieben umfasst.
12 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8) zur gleichzeitigen Expression von bis zu drei verschiedenen Peptiden in der gleichen Zelle und von dem gleichen Vektor, wobei dieser Vektor die Merkmale von pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben umfasst, jedoch in jedem der drei möglichen Vor wärts-Leseraster ATG-Translationsstartcodons enthält, die im richtigen Raster mit Sequenzen, die das Epitop und die SV40-Kernlokalisierungsdomänen kodieren, verbunden sind. Insbesondere sind die Epitop-kodierenden Sequenzen in den Leserastern 1 bis 3 c-myc, FLAG bzw. V5.
13 ist eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9) zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben umfasst, ausgenommen dass das die Blasticidinresistenz kodierende Gen (Bsd) durch eine Sequenz (G418) ersetzt ist, die ein Protein kodiert, die Resistenz gegen Kanamycin bei Bakterien oder Resistenz gegen Gentamycin bei Eukaryontenzellen vermittelt.
14 ist eine schematische Darstellung des Vektors pRT2 (SEQ ID NO:10), der die folgenden Merkmale umfasst:

(i) eine erste Fluoreszenzreportergenkassette, die das das grüne Fluoreszenz kodierende gfp-Gen operativ unter der Kontrolle eines chimären, in Hefe funktionsfähigen LexA/GAL1-Promotors mit 8 LexA-Operatorstellen stehend und stromaufwärts von dem Hefe-ADH1-Terminator gelegen umfasst;
(ii) eine zweite Fluoreszenzreportergenkassette, die das ein rotes Fluoreszenzprotein kodierende cobA-Gen, operationsfähig unter der Kontrolle eines chimären cl/GAL1-Promotors mit 3 cl-Operatorstellen stehend, umfasst;
(iii) ein in Hefe vom Wildtyp funktionsfähig selektierbares Markergen (ADE2), das den Zellen, die dieses Gen exprimieren, Adeninauxotrophie vermittelt;
(iv) ein selektierbares Markergen, das Bakterien Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin vermittelt;
(v) einen bakteriellen Replikationsursprung (colE1); und
(vi) einen eukaryontischen Replikationsursprung (2 μ Ori).

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf die Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Vektoren zur Identifikation neuer Pharmaka, wie z. B. Antibiotika oder inhibitorischer Mittel. Tatsächlich ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich in Pharmaka-Screening-Protokollen zur Identifikation von Kandidaten für Agonisten und Antagonisten für beliebige biologische Interaktionen. Z. B. können bakterielle Expressionssysteme in Hochdurchsatz-Screenings auf neue Antibiotika oder andere inhibitorische Mittel, die spezielle Protein: DNA oder Protein: Protein-Interaktionen ansteuern, verwendet werden. Die hier beschriebene pBLOCK-Vektorserie ist in solchen Anwendungen von besonderem Nutzen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung stellt ein gegenüber dem in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO 99/35282) abgewandeltes reverses 2-Hybrid-Screening bereit. Insbesondere wird, während das reverse 2-Hybrid-Screening auf Peptide, die eine Zielinteraktion zwischen zwei proteinösen Bindungspartnern inhibieren, wie zuvor beschrieben durchgeführt werden kann, eine zusätzliche Selektion auf Peptide durchgeführt, die eine Nicht-Ziel- Interaktion zwischen einem dieser proteinösen Bindungspartner und einem anderen Bindungspartner nicht inhibieren. Dies bedeutet, dass die Köder- und Beute-Konstrukte und die Reportergen-Konstrukte zur Messung der Zielinteraktionen beliebige von den zuvor beschriebenen sein können. Jedoch muss die Wirtszelle zur Messung der Nicht-Ziel-Interaktion ein zusätzliches „Köder"-Konstrukt und Reportergen-Konstrukt enthalten, die sich von den zur Messung der Zielinteraktionen verwendeten unterscheiden.
Weiterhin ist es zur Verringerung des Hintergrundes besonders bevorzugt, wenn duale Reportergene funktionsfähig und getrennt voneinander mit der Zielinteraktion in der Wirtszelle verbunden sind. Z. B. können zwei gegenselektierbare Reportergene für die Zielinteraktionen verwendet werden, um den möglichen Hintergrund von 5-FOA-resistenten Kolonien auszuschalten, die aus Mutationen in den URA3-Reportergenen hervorgehen.
Der Hefestamm wird vorzugsweise modifiziert, um die Einführung eines zusätzlichen Plasmids zu erlauben, das ein Kandidatenpeptid exprimiert, das auf inhibitorische Aktivität gegenüber der Zielinteraktion, aber nicht gegenüber der Nicht-Ziel-Interaktion untersucht wird.
Die Entwicklung neuer und verbesserter reverser n-Hybrid-Screenings, die zum Hochdurchsatz-Screening von Peptid-Aptamer-Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen besonders nützlich sind, wird nachfolgend beschrieben. Die hier gegebene detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen dient nur zu Beispielzwecken und sollte nicht als die gegenwärtig beschriebene Erfindung begrenzend verstanden werden.
BEISPIEL 1
Verallgemeinertes Schema des verbesserten reversen 2-Hybrid-Screening-Verfahrens
Ein verallgemeinertes Schema für das erfindungsgemäße reverse 2-Hybrid-Screening ist in 1 dargestellt. In dieser Ausführungsform werden Genkonstrukte für die Partner der Zielinteraktion (in 1 als X und Y bezeichnet) auf der Basis der für die Verwendung mit dem lexA-basierten 2-Hybrid-System beschriebenen Vektoren pJG4-5 und pGilda (Gyuris et al., 1993; Ausubel, 1989) hergestellt. Die kodierende Region der Beute, Protein-X, wird als Fusion mit einer Aktivationsdomäne exprimiert. Die kodierende Region des Ziel-Köders, Protein-Y, wird als LexA-Fusion exprimiert. In diesem Schema wird auch eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen der Beute, Protein-X, und einem Nicht-Ziel-Köder, Protein-Z (in 1 als „Z" bezeichnet), gemessen. Der Nicht-Ziel-Köder, Protein-Z, wird als cl-Repressor-Fusionsprotein von pGMS13 exprimiert, einem Derivat von pGMS12 (Serebriiskii, 1999), das HIS5 an der Stelle des G418-selektierbaren Markergens enthält.
Zu den alternativen cl-Köder-Vektoren gehören pGKS8, pGMS12 (Serebriiskii, 1999) oder pcIAuri (ein Derivat des pAUR112-CEN/ARS-Vektors (Panvera Corporation), der einen GAL1-Promotor-cl-Repressor und einen ADH1-Terminator an Stelle des URA3-Gens enthält). Sie können ebenfalls verwendet werden. Diese Vektoren enthalten alternative Marker, die die Selektion auf Zeocin-, G418- bzw. Auriobasidin-Resistenz erlauben.
Die Reportergene für die Zielinteraktion zwischen Protein-X und Protein-Y bestehen aus zwei chimären gegenselektierbaren Reportergenen URA3 und CYH2 und dem das grüne Fluoreszenzprotein kodierenden gfp-Gen (Prasher et al, 1992; Chalfie et al., 1994; Inouye und Tsuji, 1994), wovon jedes eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfasst, an die der Zielköder binden kann. Es wird daran erinnert, dass die Selektion mit CYH2 einen cycloheximidresistenten Hefehintergrund, der das CYH2^R-Allel enthält, erfordert. Zu den Reportergenen für die Nicht-Ziel-Interaktion gehören das einzelne chimäre gegenselektierbare Reportergen LYS2 und das ein rotes Fluoreszenzprotein kodierende cobA-Gen (Wildt und Deuschle, 1999), wovon jeder eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen enthält, an die der Nicht-Ziel-Köder binden kann.
Die Hefezellen werden mit Genkonstrukten transformiert, die die Beute, den Zielköder, die Nicht-Ziel-Köder und alle Reportergenkonstrukte exprimieren, und diese Merkmale werden dann durch Massenpaarung (Feilotter et al., 1994) in einzelne Zellen rekombiniert. Die Beute und die Ziel- und Nicht-Ziel-Köder werden alle von den CEN/ARS-basierten GAL1-Expressionsvektoren pGilda oder pcIAuri exprimiert. Dieses Verfahren ist eindeutig nicht auf die Expression des Köders von solchen Plasmidvektoren beschränkt, da die Expressionskassetten ohne nachteilige Wirkungen ins Genom integriert werden könnten.
Mit TRP1, HIS3 und HIS5 markierte Vektoren, die die Beute, den Zielköder und die Nicht-Ziel-Köder kodieren, werden in den Hefestamm PRT473 transformiert, einen cycloheximidresistenten Abkömmling des Stammes SKY473 mit dem Genotyp (MAT-a, cyh2^R his3, trp1, IexAop-LEU2, IexAop-CYH2ade2::ZEO^R, lexAop-URA3his5::G418^R, clop-LYS). Die Rekombinanten werden parallel auf die interagierenden Ziel- und Nicht-Ziel-Partner durchmustert.
Da die Bindungspartner der Zielinteraktion unter der Kontrolle des Galaktose-induzierbaren GAL1-Promotors exprimiert werden, ist es möglich, ihre Expression relativ zur Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid im Zellwachstumsmedium fein zu justieren. Das zur Auslösung von Letalität erforderliche minimale Ausmaß an Induktion wird wie folgt festgestellt: Man testet den diploiden SKY48/SKY473-Stamm, der die interagierenden Zielköder und Beute-Fusionsproteine enthält, auf sein Wachstum auf einer Reihe von Selektionsmedien, die 2 % (Gew./Vol.) Raffinose (die im Hinblick auf die GAL1-Induktion neutral ist), vorher festgelegte Konzentrationen an Cycloheximid und 5-FOA und eine Galaktosemenge im Bereich von 0% (Gew./Vol.) an Galaktose bis 2 % (Gew./Vol.) an Galaktose enthalten. Die für komplette Letalität dieses Stammes in Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid erforderliche minimale Galaktosekonzentration wird dann bestimmt.
In Abwesenheit jeglicher Inhibition ist der Hefestamm empfindlich gegenüber der Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid im Wachstumsmedium nach erfolgter Induktion durch Galaktose, eine Folge der Interaktion zwischen dem Zielköder und den Beute-Fusionsproteinen, die an die LexA-Operatorstelle(n) der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 gebunden sind. Die gleiche Interaktion lässt in Folge der Expression des gfp-Gens die Hefezelle grün fluoreszieren. Weiterhin macht die Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und der Beute die Zelle für die Lysin-Biosynthese prototroph, eine Folge der LYS2-Genexpression.
Schließlich fluoresziert die Zelle infolge der Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den Beute-Fusionsproteinen, die die cobA-Reportergenexpression aktivieren, auch rot. Der Phänotyp der Zelle in Abwesenheit jeglicher Inhibition wird in Feld A der 1 dargestellt.
Zur Durchmusterung auf spezifische Peptidinhibitoren der Zielinteraktion modifiziert man ein weiteres Genkonstrukt, insbesondere irgendeines aus der pBLOCK-3-Vektorserie, die in 5–12 dargestellt ist, oder den pBLOCK-4.0-Vektor, der in 13 dargestellt ist, so dass ein Peptidaptamer exprimiert wird. Vorzugsweise wird eine Bibliothek von Peptidaptameren unter Verwendung solcher Vektoren hergestellt. Einzelne rekombinante DNAs der Bibliothek werden getrennt in PRT48 eingeführt, einen Cycloheximid-resistenten Hefestamm, der von dem Stamm SKY48 abgeleitet ist (Serebriiskii, 1999) und den Genotyp (MAT-a, leu2, ade2, ura3, his3, his5 lys2, trp1, cyh2^R) hat. Die Transformanten werden bis zur Verwendung eingefroren.
Die Bibliothek wird durch Massenpaarung in die rekombinanten PRT-473-Stämme, die die Bindungspartner exprimieren (siehe oben), eingeführt. Aus der Massenpaarung von Rekombinanten, die von den Stämmen PRT 473 und PRT 48 abgeleitet sind, entstehende diploide Hefezellen werden auf Minimalmedium selektiert, das Blasticidin (pBLOCK-3-Vektorserie) oder G418 (pBLOCK-4.0-Vektor) und Zeocin enthält, dem aber Leucin, Tryptophan und Histidin fehlen, und sie werden als Glycerol-Stocks eingefroren.
Das Screening der Bibliothek wird dann durchgeführt, indem man die Hefestämme beim Zehnfachen der ursprünglichen Bibliothekskomplexität auf Minimalmedium ausplattiert, dem Leucin, Tryptophan und Histidin fehlen, aber das Blasticidin (Derivate der pBLOCK-3.0-Vektorserie) oder G418 (pBLOCK-4.0-Vektorenderivate), 5-FOA und/oder Cycloheximid enthält. Die Induktion der Genexpression wird erreicht, indem man die passende Menge Galaktose, wie oben bestimmt, dem Wachstumsmedium zusetzt.
Das Feld B der 1 zeigt die erwarteten Expressionsprofile und Selektionsmerkmale der transformierten Hefezellen, die Peptidaptamere exprimieren. Wo das inhibitorische Peptidaptamer die Interaktion zwischen dem Zielköder und der Beute inhibiert, wird nach Galaktoseinduktion keine Expression der gegenselektierbaren Reportergene URA3 oder CYH2 oder des gfp-Reportergens detektiert. Demgemäß wird der Hefestamm resistent gegenüber 5-FOA und Cycloheximid, aber fluoresziert nicht mehr grün. Andererseits überleben Zellen, die kein im Hinblick auf die Zielinteraktion inhibitorisches Peptid exprimieren, auf Medium, das 5-FOA und/oder Cycloheximid enthält, nicht.
Wenn das inhibitorische Peptid die Interaktion zwischen der Beute und dem Nicht-Ziel-Köder nicht inhibieren kann, bleiben die überlebenden Zellen aufgrund der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den an die cl-Operatorstellen des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsproteinen prototroph für die Lysin-Biosynthese, welche Prototrophie bei der Hefe eine auxotrophe lys2-Mutation komplementieren kann. Der Stamm setzt auch weiterhin die Expression des cobA-Gens fort und fluoresziert infolgedessen rot. Wenn hin gegen das inhibitorische Peptid auch die Nicht-Ziel-Interaktion inhibiert, wachsen die überlebenden Zellen auf Medium, das kein Lysin enthält, nicht, und sie fluoreszieren nicht rot.
Demgemäß wird die Spezifität der Inhibition der Reportergenexpression bestimmt, indem man die Kolonien auf gleiches Medium und auf Medium ohne Lysin replikaplattiert. Kolonien, die in Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid wachsen, jedoch auf Medium ohne Lysin nicht wachsen können, exprimieren Peptidinhibitoren, die sowohl die Ziel- als auch die Nicht-Ziel-Interaktionen inhibieren. Kolonien, die in Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid und auch auf Medium ohne Lysin wachsen, exprimieren Peptidinhibitoren, die spezifisch die Zielinteraktion inhibieren.
BEISPIEL 2
Reverses 2-Hybrid-Assay für Peptidinhibitoren der SCL/LMO2-Interaktion
Der Fachmann erkennt, wie er das im vorangehenden Beispiel bereitgestellte Protokoll variieren kann, um unter Verwendung des erfindungsgemäßen reversen 2-Hybrid-Screenings Peptidinhibitoren einer bestimmten Protein-Protein-Interaktion zu messen. An dem vorangegangenen Beispiel werden die folgenden Veränderungen vorgenommen.
Man führt zwei parallele reverse 2-Hybrid-Screenings durch, wie in den 2 und 3 dargestellt. Das erste Screening (2) identifiziert Peptidinhibitoren einer Zielinteraktion zwischen der Beute, SCL, und einem Zielköder, LMO2, die eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen dieser Beute und einem Nicht-Ziel-Köder, E47, nicht inhibieren. Die Interaktion zwischen SCL und E47 wurde zuvor von Mahajan et al. (1996) beschrieben. Das zweite Screening (3) identifiziert die Peptidinhibitoren der gleichen Zielinteraktion, die eine andere Nicht-Ziel-Interaktion zwischen der Beute, SCL, und dem Nicht-Ziel-Köder, LMO1, nicht inhibieren. Demgemäß können beide Nicht-Ziel-Interaktionen von der Zielinteraktion unterschieden werden. Auch Klone, die Peptidinhibitoren nur der Zielinteraktion oder der Zielinteraktion und einer oder beider der Nicht-Ziel-Interaktionen inhibieren, können ebenfalls identifiziert werden.
Die SCL-Beute ist ein existierendes Fusionsprotein aus Aktivationsdomäne und SCL, das die bHLH-Domäne (Reste 176-245) von SCL enthält, die in der Interaktion mit LMO2 benannt wurden (Wadman et al., 1994).
In jedem 2-Hybrid-Screening werden drei gegenselektierbare Reportergene verwendet. Die ersten beiden Reportergene, URA3 und CYH2, stehen unter der Kontrolle von LexA-Operatoren und hängen daher von der Zielinteraktion ab. Diese Abhängigkeit beruht darauf, dass der Zielköder, LMO2, in beiden Screenings als LexA-Fusionsprotein exprimiert wird (2 und 3). Wie im vorigen Beispiel nutzen diese Screenings jeweils die Toxizität des URA3-Genprodukts in Gegenwart des Pharmakons 5-Fluororotsäure (5-FOA) und die Toxizität des Wildtyp-CYH2-Genprodukts in Gegenwart des Pharmakons Cycloheximid. Demgemäß wird in Gegenwart der Pharmaka 5-FOA und Cycloheximid gegen jede Aktivierung einer Reportergenexpression selektiert, die aus der Zielinteraktion zwischen SCL und LMO2 resultiert, wie im vorigen Beispiel beschrieben.
Das gegenselektierbare Reportergen zur Detektion von Nicht-Ziel-Interaktionen (d. h. SCL/E47 und SCL/LMO1) ist das LYS2-Gen, das unter der Kontrolle von cl-Operatorsequenzen steht (2 und 3). Die Expression des LYS2-Reportergens hängt von der Bindung der Nicht-Ziel-Köderproteine E47 (2) und LMO1 (3) ab, welche Bindung durch Expression dieser Nicht-Ziel-Köder als Fusionsproteine mit cl-Operator-DNA-Bindungsdomänen erreicht wird.
In jedem der beiden Screenings sind die Hefestämme, in denen jede Inhibition von SCL und LMO2-Bindung fehlt und nachfolgend die Expression der Reportergene URA3 und CYH2 inhibiert wird, nach Induktion durch Galaktose gegen 5-FOA und Cycloheximid empfindlich. Im Gegensatz hierzu wird, wenn ein inhibitorisches Peptidaptamer die Interaktion zwischen SCL und LMO2 verhindert, nach Galaktoseinduktion keine Expression der gegenselektierbare Reportergene URA3 oder CYH2 detektiert, und infolgedessen wird der Hefestamm gegen 5-FOA und Cycloheximid resistent. Zellen, die kein im Hinblick auf die Zielinteraktion inhibitorisches Peptid exprimieren, überleben auf Medium, das 5-FOA und/oder Cycloheximid enthält, nicht.
Die Zellen aus beiden Screenings, die auf 5-FOA und Cycloheximid überleben, werden weiterhin auf ihr Lysinbedürfnis untersucht, wie im vorigen Beispiel beschrieben. In Abwesenheit einer Inhibition der SCL/E47-Interaktion (2) oder der SCL/LMO1-Interaktion (3) sind die Zellen für Lysin prototroph. Demgemäß wird in denjenigen Zellen, die auf 5-FOA und Cycloheximid überleben, und die auch für die Lysin-Biosynthese prototroph sind, die Interaktion zwischen SCL und E47 (2) oder zwischen SCL und LMO1 (3) nicht inhibiert, und das inhibitorische Peptid ist für die Zielinteraktion zwischen SCL und LMO2 spezifisch. Die Hefestämme hingegen, die in einem der Parallelscreenings auf 5-FOA und Cycloheximid wachsen, die aber auf Medium ohne Lysin nicht wachsen, exprimieren ein inhibitorisches Peptid, das auch die besondere Nicht-Ziel-Interaktion in Betracht (d. h. die SCL/E47-Interaktion oder die SCL/LMO1-Interaktion) inhibiert. Demgemäß ist es möglich, diejenigen Peptidaptamere zu bestimmen, die eine oder zwei oder drei der gemessenen Interaktionen, an denen SCL beteiligt ist, inhibieren. Der Fachmann kann ohne weiteres weitere Interaktionen, in denen das SCL-Protein beteiligt ist, messen, indem er auf die hier beschriebene Weise weitere Screenings durchführt, wobei jedes einen unterschiedlichen Nicht-Ziel-Köder besitzt.
BEISPIEL 3
Reverses 3-Hybrid-Screening auf Peptidinhibitoren einer RNA/Protein-Interaktion
Reverse 3-Hybrid-Screenings sind in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO 99/35282) beschrieben.
Für das hier beschriebene reverse 3-Hybrid-Verfahren ist ein konstantes Köder-Konstrukt erforderlich, das eine DNA-Bindungsdomäne wie z. B. GAL4 oder LexA als Fusion im gleichen Leseraster mit einem RNA-Bindungsprotein wie z. B. dem Hüllprotein MS2 (Invitrogen), das einen RNA-bindenden Spalt enthält, exprimiert. Dieses Konstrukt ist vorzugsweise integriert (Invitrogen). Es ist besonders bevorzugt, wenn das Konstrukt in einem Hefeplasmid enthalten ist, das den 2 Micron- oder den CEN/ARS-Replikationsursprung enthält.
Weiterhin ist ein zweites RNA-Köder-Konstrukt erforderlich, das eine Hybrid-RNA exprimiert, die ein RNA-Ziel und den Liganden für das RNA-Bindungsprotein des konstanten Köders umfasst. Z. B. kann ein eine hybride RNA kodierendes Gen, das MS2-RNA-Sequenzen umfasst, verwendet werden, um eine MS2-Hüllprotein-Domäne des konstanten Köders zu binden. Zu Beispielen für solche RNA-Köder-Konstrukte gehören die Vektoren pRH3' und pRH5' (Invitrogen).
Weiterhin ist auch ein spezifisches Beute-Konstrukt erforderlich, das das Protein exprimiert, das mit der Ziel-RNA von Interesse interagiert, mit einer Transkriptionsaktivatordomäne fusioniert. Das Beutekonstrukt hat eine Standardform, wie für 2-Hybrid-Screenings, wie z. B. pJG4-5 oder pYESTrp2 oder pACT2. Vorzugsweise ist das Beutekonstrukt pJG4-5. Bevorzugter ist es, wenn das Beutekonstrukt pYESTrp2 ist.
In anderer Hinsicht sind die Prinzipien für die Durchführung von reversen 3-Hybrid-Screenings im Wesentlichen wie hier für reverse 2-Hybrid-Screenings beschrieben.
Zur Durchmusterung auf Kandidaten für Peptidinhibitoren der RNA/Protein-Interaktion kann eine von einem Vektor wie der hier beschriebenen pBLOCK-3-Vektorserie (5–12) oder pBLOCK-4.0 (13) exprimierte Peptidbibliothek verwendet werden. Die rekombinante Bibliothek wird in einen Hefestamm transformiert, der das konstante Köderprotein, den RNA-Köder und das Beuteprotein auf die in den vorangehenden Beispielen beschriebene Weise exprimiert.
Ein nicht begrenzendes Beispiel des erfindungsgemäßen reversen 3-Hybrid-Screenings ist in 4 dargestellt. Bei diesem Screening werden Inhibitoren der Zielinteraktion zwischen dem TAT-Protein und der das TAR-Protein kodierenden RNA identifiziert und vorzugsweise gegenüber Peptiden selektiert, die nur an Nicht-Ziel-Interaktionen unter Beteiligung von TAT-Protein, das TAR-Protein kodierender RNA, MS2-RNA oder MS2-Protein binden.
Für beide Zielinteraktionen (und alle Nicht-Ziel-Interaktionen, nicht dargestellt) ist ein RNA-Bindungsprotein (TAT), das als Fusionsprotein mit einer Aktivatordomäne, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, exprimiert wird, die Beute. Der RNA-Köder ist ein hybrides MS2/TAR-RNA-Molekül, das mindestens den RNA-bindenden Spalt der das MS2-Hüllprotein kodierenden RNA und die an TAT bindende TAR-kodierende RNA umfasst. Der konstante Köder ist ein Fusionsprotein zwischen dem MS2-Protein und der DNA-Bindungsdomäne des LexA-Proteins. Die Reportergene für die Zielinteraktion bestehen aus chimären URA3- und CYH2-Genen, die eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfassen, an die der Köder binden kann, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben.
Der Nicht-Ziel-Köder umfasst ein Fusionsprotein zwischen irgendeinem anderen Protein, an das die MS2-TAR-Hybrid-RNA binden kann (entweder durch den MS2-bindenden Nukleotidsequenzanteil oder durch die TAT-bindende Sequenz), sowie das cl-Repressorprotein. Das Reportergen für die Nicht-Ziel-Interaktion besteht aus einem chimären LYS2-Gen, das eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen umfasst, an die der Nicht-Ziel-Köder binden kann, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben.
Die Expression der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 erfordert die Bildung eines Komplexes zwischen dem LexA-Operator und dem LexA-MS2-Fusionsprotein und der MS2-TAR-Hybrid- und dem TAT-Aktivatordomänen-Fusionsprotein. Demgemäß macht diese Interaktion die Zellen nach Galaktoseinduktion der Expression des LexA-MS2-Fusionsproteins und/oder des TAT-Aktivatordomänen-Fusionsproteins gegenüber 5-FOA und Cycloheximid empfindlich. In ähnlicher Weise macht die Expression des LYS2-Gens die Zellen, wenn eine Nicht-Ziel-Interaktion in de Zelle stattfindet, für Lysin prototroph. Demgemäß ist in Abwesenheit jeder Inhibition der Bildung des oben beschriebenen Komplexes der Hefestamm gegenüber 5-FOA und Cycloheximid empfindlich und für die Lysin-Biosynthese prototroph.
Die Inhibition der Zielinteraktion zwischen dem TAT-Protein und der TAR-kodierenden RNA vermittelt der Zelle Resistenz gegenüber 5-FOA und Cycloheximid. Solche Zellen exprimieren ein Peptid, das die Zielinteraktion inhibiert. Das Peptid inhibiert auch eine Nicht-Ziel-Interaktion, die normalerweise die Expression des Reportergens LYS2 aktiviert, wenn die Zellen Lysin für ihr Wachstum benötigen. Das Peptid ist hingegen für die Zielinteraktion spezifisch, wenn die Zellen für Lysin prototroph bleiben.
BEISPIEL 4
Konstruktion neuer Vektoren zur Expression von Inhibitorpeptidkandidaten
Wir stellten eine Serie von Vektoren her, die zur Expression von Peptidaptameren geeignet sind, die in den hier beschriebenen reversen n-Hybrid-Assays durchmustert werden können. Die hier beschriebene pBLOCK-3-Vektorserie umfasst die folgenden Vektoren: pBLOCK-3.0 (5 und SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (6 und SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (7 und SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (8 und SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (9 und SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (10 und SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (11 und SEQ ID NO:7); und pBLOCK-3.11 (12 und SEQ ID NO:8).
Diese Vektoren enthalten viele Merkmale, die für die Vektoren pBLOCK-1 und pBLOCK-2 beschrieben wurden, wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO 99/35282) beschrieben, einschließlich der Tandempromotormerkmale zur Expression des Kandidatenpeptids sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen, und der Gegenwart sowohl von E. coli- als auch von Hefe-Replikationsursprüngen, um ihre Verwendung sowohl in bakteriellen als auch in Hefezellen zu ermöglichen. Wie bei pBLOCK-1 und pBLOCK-2 treibt der konstitutive starke ADH-Promotor die Expression der Kandidatenpeptide an, um eine von der Kohlenstoffquelle unabhängige Expression auf hohem Niveau zu ermöglichen. Die Kernlokalisationssequenz von SV40 ist gleichfalls zugegen, um das Kandidatenpeptid in den Zellkern zu lenken. Wie bei pBLOCK-1 und pBLOCK-2 wird das Peptid als Fusion mit einem Epitop-Tag (V5) exprimiert, um die Immunpräzipitation oder das Western Blotting des exprimierten Kandidatenpeptids zu erleichtern.
Weiterhin sind die hier beschriebenen Vektoren klein (ungefähr 6 Kilobasenpaare), um die Herstellung komplexer Bibliotheken zu erleichtern.
Alle Vektoren der pBLOCK-3-Serie enthalten das Bsd-Gen, das Hefe- und Bakterienzellen Resistenz gegenüber dem Pharmakon Blasticidin vermittelt. Das Gen wird sowohl von bakteriellen als auch von Hefe-Transkriptionskontrollsequenzen flankiert, was die schnelle, spezifische Rückgewinnung von Bibliotheksplasmiden ermöglicht, die Inhibitorpeptidkandidaten kodieren, indem man sie in E. coli transformiert und auf Blasticidin-haltigem Vollmedium selektiert.
Besondere Derivate von pBLOCK-3.0 enthalten eine Anzahl zusätzlicher Merkmale, wie in den nachfolgenden Figurenlegenden beschrieben:

(i) ein funktionsfähig unter der Kontrolle des SV40-Promotors (Vektor pBLOCK-3.8) stehendes Einzelkettenantikörpergen (SCAG) erlaubt die Detektion transfizierter eukaryontischer Zellen unter der Verwendung von Antikörpern.
(ii) Ortsspezifische Rekombinasestellen (z. B. frt, att, loxP, res), die die in den Vektoren pBLOCK-3.6, pBLOCK-3.8 und pBLOCK-3.9 die das Kandidatenpeptid kodierenden Sequenzen flankieren, ermöglichen den raschen Transfer von Inserts von diesem Vektor in einen anderen Vektor mittels ortsspezifischer Rekombination, die durch die entsprechenden Rekombinaseenzyme vermittelt wird (z. B. Flp-Rekombinase, Lambda-Integrase, Cre-Rekombinase bzw. Transposon-Resolvase).
(iii) Die positiven Selektionsgene, die toxische Produkte kodieren, insbesondere das ccdB-Gen, das funktionsfähig unter der Kontrolle des Lac-Promotors steht (Vektoren pBLOCK-3.4, pBLOCK-3.6, pBLOCK-3.8, pBLOCK-3.9, pBLOCK-3.10 und pBLOCK-3.11), ermöglichen Klonierung und/oder Transfer des Inserts durch Rekombination.

Weiterhin ist der Vektor pBLOCK-4.0 (13 und SEQ ID NO:9) mit dem Vektor pBLOCK-3.4 identisch, ausgenommen, dass das Bsd-Gen durch das G418-Gen ersetzt wurde, das bei Bakterien Kanamycin-Resistenz und bei eukaryontischen Zellen Gentamycinresistenz vermittelt.
Die Merkmale aller Plasmide sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Weitere hervorstechende oder einzigartige Merkmale jedes dieser Plasmide gehen aus dem Sequenzprotokoll und den Zeichnungen hervor.
Es ist dem Fachmann klar, dass die Nützlichkeit der Shuttle-Vektoren wie derer der pBLOCK-Familie nicht auf reverses 2-Hybrid-Screening beschränkt ist. Sie sind auch zur Klonierung einer Reihe von DNA-Molekülen für eine Vielfalt von dem Fachmarn vertrauten Zwecken geeignet, darunter Klonierung von cDNA, genomischer DNA, PCR-Klonierung und Oligonukleotidklonierung (Ausubel et al., 1989). Untergeordnete Modifikationen an den Sequenzen dieser pBLOCK-Vektoren vermittels kleiner Deletionen, Insertionen und/oder Transitionen oder Transversionen üben keinen wesentlichen Effekt auf die Funktion dieser Vektoren aus und stellen auch keinen erfinderischen Schritt dar. Demgemäß können alle solcher äquivalenten Vektoren (d. h. Varianten oder Derivate) in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. TABELLE 1
BEISPIEL 5
Konstruktion von Zufallspeptid-Aptamer-Bibliotheken
Konventionelle 2-Hybrid-Bibliotheken werden mit einer Transkriptionsaktivatordomäne fusioniert und sind für reverse n-Hybrid-Screenings nicht geeignet, da sie die Klonierung verschiedener Typen von Peptidinhibitoren nicht erlauben, bei denen einige Bestandteile der Bib liothek die Transkription aktivieren und dadurch dem Screening entgehen, unabhängig davon, ob sie die Zielinteraktion blockieren oder nicht. Weiterhin sind ein zusätzlicher selektierbarer Marker in dem Hefevektor und ein geeigneter Stamm für seine Selektion bevorzugt.
Bisherige rationale Designansätze versuchen, Kandidaten für therapeutische Peptide auf der Basis von Homologien mit natürlichen inhibitorischen Peptiden in den Datenbanken zu modellieren (z. B. Tiozzo et al., 1998). Solche bisherigen Ansätze konzentrieren sich auf Peptide/Polypeptide, die zuvor aufgrund ihrer inhibitorischen Eigenschaften aus ihrer natürlichen Quelle identifiziert wurden. Im Gegensatz zu den hier beschriebenen Screenings bestimmen sie auf empirische Weise die geeignetsten Peptide aus einer großen Anzahl von von einer genomischen Expressionsbibliothek kodierten Kandidatenpeptiden. Die Gegenwart von Klonen in allen Leserastern erlaubt es bei Verwendung eines Vektors wie pBLOCK-3.11 auch, Zufallspeptide, die in Leserastern, die nicht in der Natur vorkommen, exprimiert werden, gleichzeitig zu durchmustern, zusammen mit einer Vielzahl von natürlichen Peptiddomänen, die im geeigneten Leseraster kloniert worden sind.
Trx-präsentierte Zufallspeptidbibliotheken sind für das reverse 2-Hybrid-Screening bevorzugt. Die Herstellung der innerhalb der Trx-Schleife eingespannten Zufallsinserts ist mit der von Colas (1996) beschriebenen identisch, mit der Ausnahme, dass der bevorzugte Vektor für Hochdurchsatz-Anwendungen optimiert ist, wie z. B. ein hier beschriebener pBLOCK-Vektor.
Zur Steigerung des Anteils richtig gefalteter Domänen in den für das Screening verfügbaren Repertoires werden Peptidbibliotheken unter Verwendung von zufällig ausgewählten Sequenzen, die aus phylogenetisch diversen kompakten Genomen gewonnen worden sind, in der im vorigen Beispiel beschriebenen pBLOCK-Vektorserie hergestellt. Um die Vielfalt des Pools zu erhöhen, wird die relative Konzentration der DNA aus größeren Genomen in dem Pool im Verhältnis zu der gesamten haploiden Genomgröße gesteigert. Solche Bibliotheken werden durch Standardmethodologie (Ausubel, 1989) unter Verwendung der höchsteffizienten verfügbaren kompetenten Zellen hergestellt, z. B. XL10-Gold (Stratagene), um Komplexitäten von mehr als 10⁷ unabhängigen Klonen zu gewährleisten.
Um die Diversität des Pools potentiell inhibitorischer Peptidaptamere zu maximieren und zugleich die auf natürliche Weise evoluierten Gensequenzen vorliegende Strukturinformation auszunutzen, werden die Bibliotheken inhibitorischer Peptide vorzugsweise aus natürlichen Genomen als Quellen hergestellt. Dieser Ansatz versucht, den Evolutionsprozess zu beschleunigen, indem er Domänen aus verschiedenen Genomen, bei denen eine Koevolution unwahrscheinlich ist, künstlich kombiniert. Um dieses Ziel zu erreichen, werden genomische Expressionsbibliotheken aus einander evolutionär fern stehenden Organismen hergestellt, wie z. B. Fugu rubripes (Elgar, 1996a, 1996b), Caenorhabditis elegans (Plasterk, 1999) und Saccharomyces cerevisiae. Alternativ werden die Bibliotheken unter Verwendung von gepoolter genomischer DNA aus diesen Organismen oder aus auf dem genetischen Niveau charakterisierten Mikroorganismen hergestellt. Während die durch einen solchen Ansatz erreichte potentielle Diversität theoretisch geringer ist als die, die erreicht wird, indem man direkt aus der Umwelt gereinigte DNA kloniert und exprimiert (Short, 1997), bietet er mehrere deutliche Vorteile.
Z. B. ist eine Annäherung an die wahre Diversität und systematische Abweichung der Bibliothek leichter zu erreichen, was dem Experimentator erlaubt, die Domänendiversität zu maximieren und die systematische Abweichung zugunsten der Genome dominanter Spezies zu minimieren.
Weiterhin erlaubt es ein künstliches Poolen von DNA, die aus verschiedenen bekannten Organismen gewonnen ist, auf einzigartige Weise, verschiedene Genome zu überblicken. Z. B. werden die Genome bestimmter Archaebakterien gleichzeitig mit denen obligater Parasiten, wie z. B. Mycoplasmen, und/oder verschiedener grampositiver und/oder gramnegativer Organismen durchmustert.
Überdies wird die Diversität solcher Domänenbibliotheken durch Mutation weiter gesteigert. Z. B. wird die Plasmidbibliothek in Bakterienstämmen amplifiziert, die Defizienzen in der Reparatur von Basenfehlpaarungen aufweisen (z. B. Stämmen mit der mutS-Mutation), was zur Erzeugung von Mutationen führt.
BEISPIEL 6
Das LexA-reaktive gegenselektierbare Reportergen CYH2
Es wurde eine Gruppe von Konstrukten hergestellt, die bis zu 8 LexA-Operator-DNA-Bindungsdomänen (DBD) in einen GAL10/GAL1-Basalpromotor eingebettet enthielten, der so konfiguriert war, dass er die Expression eines CYH2-Reportergens in Hefe antrieb. Unmittelbar stromabwärts von CYH2 ist in reverser Orientierung ein Zeocin-Resistenzgen (ZEO) eingefügt. Die Promotoren und Transkriptionsterminatoren sowohl der Hefe als auch der Bakterien lenken die Expression des ZEO-Gens. Die Konstrukte wurden unter Verwendung von Primern, die mit dem ADE2-Gen homologe 3'-Markierungen enthielten, durch PCR amplifiziert, was ihre gerichtete Integration in Genkonstrukte mit dem ADE2-Gen ermöglichte. Die stabilen Integranten wurden auf Zeocin-Resistenz selektiert und nach roter Pigmentierung (Adenosinauxotrophie) durchmustert.
BEISPIEL 7
Das LexA-reaktive gegenselektierbare Reportergen URA3
Es wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die bis zu 8 LexA-Operator-DNA-Bindungsdomänen (DBD) in einen GAL10/GAL1-Basalpromotor eingebettet enthielten, der so konfiguriert war, dass er die Expression eines URA3-Reportergens in Hefe antrieb. Unmittelbar stromaufwärts von dem GAL10/1-Promotor ist das G418-Gen eingefügt. Die G418-Expression wird von dem TEF1-Promotor kontrolliert; der sowohl in Hefe als auch Bakterien funktioniert. Die Konstrukte wurden unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die mit dem HIS5-Gen homologe 3'-Markierungen enthielten, und in Hefe transformiert. Stabile Integranten wurden auf G418-Resistenz selektiert und auf Histidinauxotrophie durchmustert.
Es gibt die Möglichkeit des unbeabsichtigten Zelltodes bei Gegenselektion, verursacht durch unspezifische Aktivierung der mit den Reportergenen verbundenen Basalpromotoren durch Interaktion mit von den pBLOCK-3-Serien-Vektoren exprimierten Bibliotheksprodukten. Der Einfluss solcher Interaktionen wird durch Verwendung verschiedener Basalpromotor-Reportergen-Fusionen im gleichen 2-Hybrid-System begrenzt, da die Wahrscheinlichkeit sehr gering ist, dass das gleiche exprimierte Bibliotheksprodukt verschiedene Promotoren aktiviert. Daher zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung unterschiedlicher Basalpromotoren anstelle von GAL1/GAL10, um den gegenselektierbaren Reporter URA3 anzutreiben, in Betracht. Demgemäß werden LexAop-URA3-Reportergene hergestellt, die entweder SPO13 (Vidal et al., 1996a, b) oder CUP1-URA3-Fusionsgene enthalten. In diese basalen Promotoren sind bis zu 8 LexA-Operatorsequenzen eingebettet. Die Konstrukte werden am HIS5-Lokus über ein doppeltes Crossover-Rekombinationsereignis in das SKY473-Genom integriert (Huang und Schreiber, 1997).
BEISPIEL 8
Der Doppelfluoreszenzreportergenvektor pRT2
Ein neuartiger Doppelfluoreszenzreportergenvektor wurde hergestellt. Dieser Vektor, pRT2 bezeichnet (14 und SEQ ID NO:10), ist von pRG64 abgeleitet, der einen GAL 10/GAL1-Basalpromotor mit drei funktionsfähig mit der Expression des β-Glucuronidase-Reportergens (Gluc) verbundenen cl-Bindungsstellen enthält.
Zur Herstellung des intermediären Vektors pRT1 wurde das Plasmid pRG64 mit HindIII verdaut, die Enden wurden aufgefüllt und religiert, um eine einzelne NheI-Schnittstelle unmittelbar stromabwärts des gegenselektierbaren Reportergens URA3 zu schaffen. Ein eine minimale komplementierende Region des genomischen Hefelokus ADE2 enthaltenes Fragment von 2276 Basenpaaren Länge wurde unter Verwendung von PCR amplifiziert und in diese Nhel-Schnittstelle eingefügt. Das URA3-Gen wurde unter Verwendung von NotI und BsaI deletiert, und ein DNA-Fragment, das einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit 6 funktionsfähig mit der Expression des CobA-Gens verbundenen cl-Bindungsstellen enthielt, wurde in dieselben Stellen eingefügt.
Zur Herstellung von pRT2 (14) wurde das Plasmid pRT1 unmittelbar 5'-wärts von dem GAL-Gluc-Reporter mit BamHI geschnitten, die Enden wurden aufgefüllt und das stumpfendige Fragment wurde religiert, um eine Clal-Schnittstelle zu schaffen. Das gesamte GAL-Gluc-Reportergen wurde durch Verdau mit ClaI ausgeschnitten, und ein 1800 Basenpaar langes Fragment, das einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit 8 funktionsfähig mit der Expression des CobA-Gens verbundenen LexA-Bindungsstellen enthielt, wurde in die Clal-Schnittstelle eingefügt.
Der Vektor enthält doppelte Fluoreszenzreportergene, die die Echtzeitmessung der Reportergenaktivierung ohne die Notwendigkeit von Substraten ermöglichen. Der Vektor erlaubt auch die Messung der Reportergenaktivierung über mit LexA und/oder cl-DNA- Bindungsdomänen (DBDs) fusionierte Köder. Die Inkorporation beider fluoreszierender Reportergene, von denen jedes von anderen DBDs abhängt, in einen einzelnen Vektor beseitigt störende Effekte, die infolge einer Variation der Plasmidzahl, wie sie beobachtet wird, wenn verschiedene Plasmide exprimiert werden, mit Variabilität der Reportergenexpression assoziiert sind.
Das Doppelfluoreszenzreporterkonstrukt wird in Hefestämme transformiert, die für Adenin auxotroph sind (ADE2), wodurch auf Erhaltung des Vektors selektiert wird. Die Transformation der genannten Stämme mit Beute und Ködern, wobei die letzteren mit LexA und/oder cl-DBDs fusioniert sind, erlaubt die Aktivierung der fluoreszierenden Reporter. Im Fall eines vorwärtsgerichteten 2-Hybrid-Hefe-Screenings führt die erfolgreiche Interaktion zwischen Beuten und Ködern zur Aktivierung des relevanten fluoreszierenden Reportergens, die durch dem Fachmann geläufige Fluoreszenz-basierte Detektionssysteme gemessen wird. Das Entgegengesetzte gilt für reverses Hybrid-Screening, wo man eine Herunterregulation der Reportergenexpression sucht, die sich aus der Inhibition der Interaktion zwischen Köder- und Beuteproteinen ergibt.
BEISPIEL 9
Der doppelt kolorimetrische Reportergenvektor pRT3
Das Doppelreporterplasmid pRT3 ist von pDR8 abgeleitet, das einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit drei cl-Bindungsstellen, der die Expression des Gluc-Reportergens lenkt, und einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit 8 LexA-Bindungsstellen, der die Expression eines LacZ-Reportergens lenkt, enthält.
Der in pDR8 enthaltene selektierbare Macker URA3 wird durch das ADE2-Gen ersetzt, indem man das Plasmid mit HindIII verdaut, die Enden auffüllt und das stumpfendige Fragment religiert, um eine einzelne Nhel-Schnittstelle zu schaffen. Ein das URA3-Gen enthaltendes DNA-Fragment wird nach Verdau mit NheI und BsaI ausgeschnitten, und ein 2276 langes Basenpaar langes PCR-Fragment, das eine minimale komplementierende Region des genomischen Hefelokus ADE2 enthält, wird an den gleichen Stellen eingefügt, wodurch pRT3 entsteht.
BEISPIEL 10
Wirtsstämme
Der Ausgangs-Wirtsstamm SKY473 enthält das cl-reaktive Reportergen LYS2. Er hat den Genotyp (MAT-a, his3, trp1, IexAop-Leu2, clop-LYS2).
In den vorhergehenden Beispielen beschriebene besondere Konstrukte werden in ein Cycloheximid-resistentes Derivat von SKY 473 (MAT-a, his3, trp1, IexAop-Leu2, clop-LYS2, cyh2^R) transformiert, wodurch der Stamm PRT 473 entsteht (MAT-a, cyh2^R his3, trp1, IexAop-LEU2, IexAop-CYH2ade2::ZEO^R, IexAop-URA3his5::G418^R, clop-LYS). Bei Verwendung des gleichen Ausgangsstamms führen verschiedene Genkonstrukte zu dem Stamm PRT 475 (MAT- a, cyh2^R his3, trp1, ade2, IexAop-GAL1-LEU2, IexAop-GAL1/10-CYH2, IexAop-CUP1-URA3 und clop-GAL1-LYS2).
Der Stamm PRT 474 unterscheidet sich von dem Stamm PRT 475 nur durch die Auswahl des reprimierbaren Promotors, der die Expression von URA3 antreibt. Der CUP1-Promotor hat den Vorteil, kupferinduzierbar zu sein, was die Titration der Repression durch Veränderung der Kupferkonzentration im Medium ermöglicht. Verfahren zu solcher Titration des Ausmaßes der Repression des CUP1-Promotors sind dem Fachmann bekannt (Schneider, 1991).
BEISPIEL 11
Einstellung der Selektionsschwelle durch Galaktosetitration
Das erfindungsgemäße reverse 2-Hybrid-Screeningsystem ermöglicht die primäre Einstellung der Stringenzschwelle für beliebige Expressionspartner, die von dem GAL1-Promotor aus exprimiert werden. Da sowohl die Beute- als auch die Köder-Interaktoren unter der Kontrolle des GAL1-Promotors exprimiert werden, wird die Expression dieser Proteine in der Zelle durch Modifikation des Galaktosespiegels im Medium zwischen dem Fehlen von Galaktose und 2 % (Gew./Vol.) Galaktose variiert. Die Konzentration des neutralen Zuckers Raffinose wird konstant bei einer Konzentration von 2 % (Gew./Vol.) gehalten.
Das Galaktoseinduktionssystem erleichtert die Bestimmung der Minimalkonzentration der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, um ein gegenselektierbares Reportergen in einem Maß zu exprimieren, das bei vorher festgelegten Konzentrationen von 5-FOA oder Cycloheximid den Zelltod verursacht. Dies überwindet das Problem der Selbstaktivierung einiger Köderkonstrukte, die in der Abwesenheit eines Interaktionspartners den Zelltod verursacht.
Das Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Galaktosekonzentration zur Induktion der Expression der Bindungspartner ist in Beispiel 1, oben, beschrieben.
BEISPIEL 12
Identifikation hochaffiner Peptidinhibitoren unter Verwendung von Oberflächen-Plasmonresonanz
Die Oberflächen-Plasmonresonanz ist rasch zu der Referenztechnik für die physikalische Messung biomolekularer Interaktionen geworden. Das Instrument verwendet ein infinitesimales Wellenphänomen zur Erzeugung eines detektierbaren Signals aus sehr subtilen Veränderungen des Brechungsindex auf der Oberfläche eines Mikrochips, wie z. B. eines Biosensorchips. Demgemäß wird die Bindung oder Dissoziation selbst einiger weniger Proteinmoleküle an ein Partnerproteinmolekül, das an die Mikrochip-Oberfläche gebunden ist, in Echtzeit gemessen. Dies erleichtert die Herleitung von Echtzeit-Assoziations- und Dissoziations-Konstanten. Daher ist die Plasmonresonanz für das Studium der Interaktionen von in reversen n-Hybrid-Screenings identifizierten Proteinen ideal geeignet.
Weiterhin erlaubt die Empfindlichkeit der Oberflächen-Plasmonresonanz-Instrumente (z. B. BIAcore2000, Pharmacia) die Identifikation von Komponenten in Rohzellextrakten, die mit der Zielinteraktion kompetieren, auf einer Mikrochip-Oberfläche gemessen. Z. B. wird SCL, unter Verwendung des Vektors pTYB1 (New England Biolabs) als Fusion mit einem Chitin-Bindungsprotein gereinigt, als Ausgangsmaterial verwendet. In einer Anpassung des in Beispiel 2 beschriebenen Screenings wird gereinigtes SCL kovalent an die Mikrochip-Oberfläche gekoppelt, gereinigtes LMO2, DRG oder E47, als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) exprimiert, wird über die Chipoberfläche geleitet, und die Bindung wird unter Verwendung des BIAcore2000 gemessen. Hefeextrakte, die Peptidaptamere exprimieren, oder ein Trx-Polypeptid als Vektorkontrolle, werden dann über den Chip geleitet, und die Fähigkeit jedes einzelnen Aptamers, die Assoziation der zugehörigen Partner mit SCL zu inhibieren, wird durch eine Veränderung des Brechungsindex, die von dem BIAcore2000 gemessen wird, bestimmt. Die Veränderung des Brechungsindex wird gemessen, wenn der Peptidinhibitor an SCL oder sein Partnerprotein oder an beide Proteine bindet. Da das produzierte Signal proportional zur Größe des interagierenden Proteins ist, kann der Unterschied zwischen der Bindung des zugehörigen Partners von SCL und dem wesentlich kleineren künstlichen Aptamer, sollte dieses direkt mit SCL interagieren, detektiert werden.
Der reverse 2-Hybrid-Assay wird unter Verwendung nicht verwandter Paare von Proteinen wiederholt, um die Spezifität der Interaktion sicherzustellen.
Diejenigen Peptidaptamere, die die Interaktion mit der höchsten Affinität und Spezifität inhibieren, werden über ihre Trx-Domäne oder andere Epitop-Domäne immungereinigt und auf direkte Interaktionen mit den Bindungspartnern geprüft. Es werden dann ihre Dissoziationskonstanten und Sequenzen bestimmt.
Die inhibitorische Wirkung von Peptidaptameren wird ursprünglich getestet, indem man sie in die Trx-Polypeptidschleife eingespannt in Zelllinien exprimiert. Die 20-gliedrigen Peptide werden als mit dem Drosophila-Penetratinmotiv fusionierte zyklische Peptide synthetisiert. Ein solcher Ringschluss wird erreicht, indem man flankierende Cysteinreste in die synthetischen Peptide einbezieht. Dies bewahrt eine hohe Affinität, indem es die Peptide konformationell spannt (Giebel et al., 1995). Eine Fusion mit dem Penetratinmotiv erleichtert die Verabreichung der Peptide ins Medium einer Zelle oder in den extrazellulären Raum. Dieser Ansatz hat bereits mehrere biologisch aktive Peptidinhibitoren erbracht.
BEISPIEL 13
Vorläufige ex-vivo-Validierung des Pharmakonscreening-Ansatzes
Es werden Transfektions-Assays verwendet, um festzustellen, ob die Expression von Peptiden, die die SCL/LMOS-Interaktion in vitro inhibieren, auch die zelluläre Proliferation auf negativ-dominante Weise inhibiert. Die Peptide werden in einer konformationell gespannten Form als Fusionen mit der „Penetratin"-Zielsteuerungssequenz von Drosophila synthetisiert, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben. Alternativ oder zusätzlich werden die Proteine als Fusionen mit dem VP22-Protein des Herpes-simplex-Virus vom Typ 1 exprimiert (Phelan et al., 1998). Diese zyklischen Peptide werden nachfolgend direkt an Leukämiezellen in Kultur verab reicht, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, das Wachstum oder die Proliferation der Zellen zu inhibieren.
In der hier beschriebenen Ausführungsform werden die folgenden Verfahren verwendet. Die Leukämiezellen werden in RPMI mit 10 % FCS kultiviert und durch Elektroporation gemäß Standardprotokollen mit Plasmiden transfiziert, die Kandidaten für inhibitorische Peptide exprimieren. Die transfizierten Zellen werden unter Verwendung von magnetischen Beads mittels des Einzelkettenantikörpers gegen das Hapten phOx, den der Vektor pHOOK-2 (Invitrogen) exprimiert, gereinigt. Man lässt die gereinigten Transfektanten in Gegenwart von G418 auswachsen. Es werden routinemäßig Standardverfahren zur Bestimmung des Wachstums durch Aufnahme von ³H-Thymidin aus dem Medium und klonogene Koloniebildungs-Assays verwendet. Die Zählung lebender und toter Zellen wird unter Verwendung eines Satzes Sonden von Molecular Probes (#L03224) durchgeführt.
Expression von Peptidinhibitoren in aus Leukämiepatienten gewonnenen Zelllinien: Ein Modell für die Inhibition des Leukämiezellwachstums
Plasmide der hier beschriebenen pBLOCK-Vektorserie ermöglichen das direkte Bioassay von Kandidaten für blockierende Peptide in Säugerzellen. Die Klone werden aus Hefekulturen durch Transformation von Bakterien wie z. B. E. coli unter Verwendung von Hefelysaten und Selektion auf Antibiotikumsresistenz zurückgewonnen. Die Selektion des pBLOCK-Plasmids unter anderen in der Hefezelle gegenwärtigen Plasmiden wird dadurch erleichtert, dass man sicherstellt, dass der Antibiotikumsresistenzmarker für dieses Plasmid einzigartig ist.
Alternativ werden vielversprechende hochaffine Peptidinhibitoren im Kontext der Thioredoxinschleife in den Säugerexpressionsvektor pHOOK2 (Invitrogen) unter Kontrolle des CMV-Promotors kloniert. Dieser Vektor enthält auch einen selektierbaren Marker für Säugerzellen (NEO) und exprimiert konstitutiv einen Einzelkettenantikörper gegen das Hapten phOx. Wenn das Empfängerplasmid passende flankierende Sequenzen für die ortsspezifische Rekombination enthält, erlauben die Plasmide (z. B. pBLOCK-3.2, pBLOCK-3.6 und pBLOCK-3.8) alternativ die schnelle Übertragung von Inserts aus der Bibliothek in das gewünschte Expressionsplasmid unter Verwendung einer Rekombinasereaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Schritt in den Vektoren der pBLOCK-Familie eliminiert, die bereits Gene enthalten, die Einzelkettenantikörper zur physikalischen Selektion über ihre zugehörigen Epitope/Haptene enthalten. Vorzugsweise werden die Peptidinhibitor-exprimierenden Konstrukte durch Lipofektion oder Elektroporation in die folgenden Zelllinien transfiziert:

(i) Erythroleukämische K562-Zellen, die LMO2, DRG, E47 und SCL exprimieren;
(ii) die Zelllinie PER-255 (Kees et al., 1989), die DRG, E47 und SCL exprimiert;
(iii) die Zelllinie PER-117 (Kees et al., 1987), die SCL, DRG und E47 exprimiert; und
(iv) die Zelllinie PER-550 (Kees et al., unveröffentlicht), die LMO2, SCL, E47 und DRG exprimiert.

Als Kontrolle wird die Verwendung der T-Zelllinie MOLT-4 oder der B-Zelllinie Raji, die SCL nicht exprimieren, aber sowohl DRG als auch E47 exprimieren (Green et al., 1991a, b), in Betracht gezogen.
Zusätzlich wird als Negativkontrolle der Expressionsvektor allein in jede der oben genannten Zelllinien transfiziert.
Nach Transfektion und 24-stündigem Wachstum wird die transfizierte Zellpopulation unter Verwendung von magnetischen Beads, die mit dem phOx-beschichteten Hapten beschichtet sind, gereinigt. Gleiche Anzahlen selektierter Zellen und Kontrollzellen werden in Kultur genommen und in G418-enthaltendem Medium wachsen gelassen. Die Zellzahlen werden nach 24, 48 und 72 Stunden gemessen. Die Proliferation wird durch Messung der ³H-Thymidin-Aufnahme sowie durch Durchführung klonogener Koloniebildungsassays bestimmt, wozu Standardverfahren verwendet werden. Die Lebensfähigkeit wird durch Zählung lebender und toter Zellen unter Verwendung von Sonden, die für die Detektion mit Durchflusscytometrie oder FACS geeignet sind, gemessen.
Einführung von Peptiden in Leukämie-Zelllinien
Die in diesem Experiment verwendeten Peptide wurden zuvor in vitro auf hochaffine Inhibition der SCL/LMO2-Interaktion selektiert (Beispiel 2). Inhibitorische Peptide und als Kontrolle dienende „durcheinandergeworfene" Peptide gleicher Länge werden als Fusionen mit der Drosophila-Penetratinsequenz und mit oxidierbaren flankierenden Cysteinresten zur Erleichterung des Ringschlusses synthetisiert.
Die Peptidinhibition des SCL-abhängigen Wachstums und der Zielgeninaktivierung werden durch direkte Zugabe der interagierenden Peptide (und einer nicht interagierenden Kontrolle) zu Kulturen von K562-, PER-255-, PER-550-, PER-117-, MOLT-4- und Raji-Zellen und Beobachtung der Wirkung über einen Zeitraum von 72 Stunden wie oben beschrieben bestimmt. Peptide, die Interaktionen in vivo inhibieren, blockieren das SCL-abhängige Wachstum. Im Gegensatz dazu haben die Kontrollpeptide oder die Peptide mit Affinität für ein nicht exprimiertes Partnerprotein keine Wirkung auf das SCL-abhängige Wachstum.
BEISPIEL 14
Entwurf von Peptiden, die Onkoprotein-Interaktionen inhibieren
Konsensus-Alignments von Sequenzinformationen, die von vielversprechenden Peptidinhibitoren der SCL/LMO2-Interaktion gewonnen worden sind, helfen bei der Aufklärung möglicher natürlich vorkommender Bindungspartner für ein Kern-Onkoprotein. Insbesondere definieren die im Alignment gefundenen Sequenzen die Konsensusmotive für hochaffine Bindungspartner.
In einem Ansatz werden aus T-ALL-Zelllinien (oben) konstruierte cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Oligonukleotiden durchmustert, die ein oder mehrere Konsensus-Inter aktionsmotive kodieren, um eine cDNA zu identifizieren, die ein natürlich vorkommendes Onkoprotein kodiert, das das Interaktionsmotiv oder die Interaktionsmotive besitzt.
Alternativ können aus den gepoolten Genomen sequenzierter Organismen konstruierte Bibliotheken durchmustert und die Sequenzen positiv hybridisierender Klone dem Alignment unterzogen werden. Während das Alignment von aus einem Screening gewonnenen Sequenzen Konsensusmotive erkennen lässt, werden andere mögliche verwandte Motive ausgeschlossen, wenn sie nicht aus irgendeinem einzelnen Genom identifiziert werden, in dem sie theoretisch vorkommen, trotz erschöpfenden Durchmusterns bei einer Komplexität, die laut Vorsage sämtliche möglichen Domänen, die das Genom oder die Genome kodieren, abdecken sollte. Demgemäß sind die im Alignment erhaltenen Sequenzen aus der Durchmusterung gepoolter Genome verwendbar zum Entwurf optimaler Peptide, die die in dem biologischen Screening identifizierten Konsensusmotive imitieren, während ihnen alternative Reste strukturell verwandter Peptide fehlen, die in die erschöpfende Durchmusterung eines einzelnen Genoms eingeschlossen wurden.
BEISPIEL 15
Peptidsynthese
38-gliedrige Peptide werden in der Form von Cys-(interagierendes 20-mer)-Cys(Penetratin 16-mer) hergestellt. Die Sequenz des Penetratin-Motivs wird von Derossi (1994) bereitgestellt. Die Peptide (von Chiron Mimotopes, Australien, synthetisiert) werden durch Oxidation der flankierenden Cysteinreste unter Verwendung von 10 mM K₃Fe(CN)₆ bei pH 8,4 zyklisiert und durch Reverse-phase-HPLC nach Koivunen (1994) gereinigt.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifikation eines Peptids, das eine Zielinteraktison zwischen zwei oder mehr Bindungspartnern in einer Wirtszelle teilweise oder vollständig inhibiert, aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen einigen, aber nicht allen dieser Bindungspartner nicht inhibiert, umfassend: (I) Expression in einem zellulären Wirt: (A) der Bindungspartner der Zielinteraktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei diese Expression durch eine Störung der Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird; (B) der Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei diese Expression durch eine Störung der Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird und das Reportergen von dem/den unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten Reportergen/Reportergenen verschieden ist; und (C) eines Kandidatenpeptids; wobei eines oder mehrere der auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergene gegenselektierbare Reportergene sind, die dem Wirt konditionale Letalität vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert wird, die Expression von einem oder mehreren der Bindungspartner in Abhängigkeit von Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem die Expression unter die Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der regulatorische Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfasst; (II) Wachstum des zellulären Wirts unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression jedes Reportergens bzw. aller Reportergene in (A) von der Expression des Reportergens bzw. der Reportergene in (B) zu unterscheiden; und (III) Detektion derjenigen Wirtszellen, in denen die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehende(n) Reportergens/Reportergene teilweise oder vollständig inhibiert wird und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter der Kontrolle der Nicht-Ziel- Interaktion stehenden Reportergens/Reportergene nicht inhibiert wird, wobei die detektierten Zellen ein Peptid exprimieren, das die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei: (I) das eine oder die mehreren gegenselektierbaren Reportergene CYH2 und URA3 sind; (II) die Expression von einem oder mehreren Bindungspartnern unter der Kontrolle des GAL1-Promotors steht, um die Bestimmung der minimalen Konzentration der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare Reportergen auf einem bei einer vorher festgelegten Konzentration von 5-FOA oder Cycloheximid den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert wird, zu erleichtern.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expression eines oder mehrerer interagierender Bindungspartner unter der Kontrolle eines Promotors steht, der regulatorische Elemente des GAL1-Promotors umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Expression der interagierenden Bindungspartner verändert wird, indem man die Galaktosekonzentration im Medium zwischen keiner Galaktose und 2% (Gewicht/Volumen) Galaktose variiert und die Raffinosekonzentration bei 2% (Gewicht/Volumen) hält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei: (I) an der Zielinteraktion zwei oder mehr proteinöse Bindungspartner beteiligt sind, wobei einer dieser Partner an eine Nukleinsäure bindet, die eine cis-wirksame Sequenz umfasst, und der andere dieser Partner die Transkription des Reportergens bzw. der Reportergene der Zielinteraktion aktiviert, wenn die Zielinteraktion in der Wirtszelle stattfindet; (II) an der Nicht-Ziel-Interaktion zwei oder mehr proteinöse Bindungspartner beteiligt sind, wobei einer dieser Partner an eine Nukleinsäure bindet, die eine ciswirksame Sequenz umfasst, und der andere dieser Partner die Transkription des Reportergens bzw. der Reportergene der Nicht-Ziel-Interaktion aktiviert, wenn die Nicht-Ziel-Interaktion in der Wirtszelle stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zielinteraktion zwischen zwei proteinösen Bindungspartnern erfolgt, deren jeder eine RNA-Bindungsdomäne und ein hybrides RNA-Molekül, das an diese RNA-Bindungsdomäne zu binden vermag, umfasst, wobei einer der proteinösen Bindungspartner an Nukleinsäuren bindet, die eine ciswirksame Sequenz umfassen, und der andere der proteinösen Bindungspartner die Transkription des gegenselektierbaren Reportergens bzw. der gegenselektierbaren Reportergene der Zielinteraktion aktiviert, wenn die Zielinteraktion in der Wirtszelle stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin als ersten Schritt die Einführung einer oder mehrerer Nukleinsäuren in den zellulären Wirt umfasst, die eine Sequenz enthalten, die ausgewählt ist unter: (I) einer Sequenz, die einen Bindungspartner der Zielinteraktion in exprimierbarer Form codiert; (II) einer Sequenz, die einen Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion in exprimierbarer Form codiert; (III) einer Sequenz, die eine Aktivierungsdomäne der Zielinteraktion in exprimierbarer Form codiert; (IV) einer Sequenz, die eine Aktivierungsdomäne der Nicht-Ziel-Interaktion in exprimierbarer Form codiert; (V) einer Sequenz, die eine DNA-Bindungsdomäne der Zielinteraktion in exprimierbarer Form codiert; (VI) einer Sequenz, die eine DNA-Bindungsdomäne der Nicht-Ziel-Interaktion in exprimierbarer Form codiert; (VII) einer Sequenz, die das Kandidatenpeptid in exprimierbarer Form codiert; (VIII) einer Sequenz, die eine cis-wirksame Sequenz und ein Reportergen in exprimierbarer Form codiert; und (IX) einer Sequenz, die eine cis-wirksame Sequenz und ein gegenselektierbares Reportergen in exprimierbarer Form codiert.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin eine Paarung derjenigen Zellen, die eine oder mehrere der Nukleinsäuren enthalten, umfasst, so dass auseichend Nukleinsäuren in einer einzelnen Zelle kombiniert werden, um diejenigen Wirtszellen zu selektieren, die wachsen oder überleben, wenn die auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehenden gegenselektierbaren Reportergene exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine Nukleinsäure, die einen Bindungspartner oder ein Kandidatenpeptid codiert, auch ein Kernlokalisationssignal (KLS) codiert, um die Kernlokalisation des Bindungspartners oder des Kandidatenpeptids zu erleichtern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei eine oder mehrere der Nukleinsäuren auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle eines Promotors stehen, der ausgewählt ist unter MYC, GAL1, CUP1, PGK1, ADH1, ADN2, PHO4, PHO5, HIS4, HIS5, TEF1, PRB1, GUT1, SPO13, CMV, SV40, LAC, EM7, SV40 und T7.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei eine oder mehrere der Nukleinsäuren in einem Vektor enthalten sind, der ausgewählt ist unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9); und pRT2 (SEQ ID NO:10).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der zelluläre Wirt eine Hefezelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hefezelle den Genotyp MATα, ura3, trp1, his3, cyh2R, lexAop-URA3, IexAop-CYH2, ade2 oder den Genotyp MAT-a, cyh2^R, his3, trp1, lexAop-LEU2, IexAop-CYH2, ade2::ZEO^R, lexAop-URA3, his5::G418^R, clop-LYS besitzt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, umfassend: (I) Transformation einer Hefezelle mit einem Vektor, ausgewählt unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9), wobei dieser Vektor weiterhin eine Nukleinsäure umfasst, die ein Kandidatenpeptid codiert, das auf inhibitorische Wirkung getestet wird; (II) Einführung einer Nukleinsäure, codierend: (A) die Bindungspartner der Zielinteraktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer gegenselektierbarer Reportergene oder fluoreszenzproteincodierender Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei die Expression teilweise oder vollständig durch Störung der Zielinteraktion behindert wird; und (B) die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines oder mehrerer gegenselektierbarer Reportergene oder fluoreszenzproteincodierender Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren, wobei die Expression teilweise oder vollständig durch Störung der Nicht-Ziel-Interaktion behindert wird und dieses Reportergen sich von dem/den unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten Reportergen/Reportergenen unterscheidet; in diese transformierte Hefezelle; (III) Selektion der Rekombinanten; (IV) Wachstum der Rekombinanten unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression jedes Reportergens bzw. aller Reportergene in (A) von der Expression des Reportergens bzw. der Reportergene in (B) zu unterscheiden; und (V) Detektion derjenigen Wirtszellen, in denen die Expression der auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehenden Reportergene teilweise oder vollständig inhibiert wird und die Expression der auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergene nicht inhibiert wird, wobei die Zellen ein Peptid exprimieren, das die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Nukleinsäure in (II) durch Transformation eingeführt wird und die in (III) selektierten Rekombinanten die durch diese Transformation hervorgebrachten Transformanten sind, oder wobei die Nukleinsäure in (II) durch zelluläre Paarung eingeführt wird und die in (III) selektierten Rekombinanten die aus dieser Zellpaarung entstehenden Diploiden sind.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die fluoreszenzproteincodierenden Reportergene durch Transformation mit dem Vektor pRT2 (SEQ ID NO:11) oder durch Paarung der Zelle mit einer Hefezelle, die diesen Vektor enthält, eingeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die einen oder mehrere der Bindungspartner der Zielinteraktion und/oder der Nicht-Ziel-Interaktion codierende Nukleinsäure in die Zelle eingeführt wird, indem man die Zelle mit einem Derivat eines Vektors transformiert, der ausgewählt ist unter pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8); und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9), wobei das Derivat eine Nukleotidsequenz enthält, die diesen Bindungspartner codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bindungspartner der Zielinteraktion auf funktionsfähige Weise und gleichzeitig die Expression zweier verschiedener Reportergene in dem zellulären Wirt kontrollieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei einer oder mehrere der Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion mit einem Bindungspartner der Zielinteraktion identisch sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei: (I) die proteinösen Bindungspartner der Zielinteraktion aus zwei Fusionsproteinen bestehen, wobei (A) ein Fusionsprotein die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäurensequenz, die mit dem anderen Fusionsprotein der Zielinteraktion dimerisiert, umfasst; und (B) ein Fusionsprotein die Transkriptionsaktivatordomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäurensequenz, die mit dem anderen Fusionsprotein der Zielinteraktion dimerisiert, umfasst, und wobei die Dimerisierung zwischen diesen Fusionsproteinen zur Bildung eines Proteinkomplexes führt, der an die cis-wirksame Sequenz bindet und die Expression des Reportergens oder der Reportergene aktiviert, wenn die Zielinteraktion in der Wirtszelle stattfindet; und (II) die proteinösen Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion aus zwei Fusionsproteinen bestehen, wobei (A) ein Fusionsprotein die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäurensequenz, die mit dem anderen Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion dimerisiert, umfasst; und (B) ein Fusionsprotein die Transkriptionsaktivatordomäne eines Transkriptionsfaktors und eine Aminosäurensequenz, die mit dem anderen Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion dimerisiert, umfasst, und wobei die Dimerisierung zwischen diesen Fusionsproteinen zur Bildung eines Proteinkomplexes führt, der an die cis-wirksame Sequenz bindet und die Expression des Reportergens oder der Reportergene aktiviert, wenn die Nicht-Ziel-Interaktion in der Wirtszelle stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei: (I) die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, identisch sind; (II) die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine DNA-Bindungsdomäne umfassen, verschieden sind; und (III) die cis-wirksamen Sequenzen der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei: (I) die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine DNA-Bindungsdomäne umfassen, identisch sind; (II) die cis-wirksamen Sequenzen der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen identisch sind; und (III) die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei: (I) die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, identisch sind; (II) die cis-wirksamen Sequenzen der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen verschieden sind; und (III) die Proteine der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, die mit einer DNA-Bindungsdomäne fusioniert sind, identisch sind und jedes dieser Proteine mit einer anderen DNA-Bindungsdomäne fusioniert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die cis-wirksame Sequenz der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion ausgewählt ist unter: LexA-Operator, GAL4-Bindungsstelle und cl-Operator, und wobei die DNA- Bindungsdomäne der Zielinteraktion und/oder der Nicht-Ziel-Interaktion ausgewählt ist unter: LexA-Operator-Bindungsdomäne, GAL4-DNA-Bindungsdomäne und cl-Operator-Bindungsdomäne.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei die Transkriptionsaktivatordomäne die GAL4-Aktivatordomäne ist.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, auch eine Dimerisierungsregion des SCL-Proteins umfassen, und wobei die Fusionsproteine der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion, die DNA-Bindungsdomänen umfassen, jeweils eine Dimerisierungsregion eines unter LMO1, LMO2, DRG, mSin3A und E47 ausgewählten anderen Proteins umfassen.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Fusionsprotein der Zielinteraktion die Dimerisierungsregion von LMO2 umfasst und das Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion die Dimerisierungsregion von E47 oder mSin3A umfasst, oder wobei das Fusionsprotein der Zielinteraktion die Dimerisierungsregion von E47 umfasst und das Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion die Dimerisierungsregion von LMO2 oder mSin3A umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Fusionsproteine der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, die eine DNA-Bindungsdomäne umfassen, auch eine Dimerisierungsregion des SCL-Proteins umfassen, und wobei die Fusionsproteine der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, die Transkriptionsaktivatordomänen umfassen, jeweils eine Dimerisierungsregion eines unter LMO1, LMO2, DRG, mSin3A und E47 ausgewählten anderen Proteins umfassen.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Fusionsprotein der Zielinteraktion die Dimerisierungsregion von LMO2 umfasst, und wobei das Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion die Dimerisierungsregion von E47 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei ein auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehendes Reportergen entweder (I) ein Fluoreszenzprotein codiert und die Detektion die Identifikation derjenigen Zellen umfasst, die nicht fluoreszieren oder eine verringerte Fluoreszenz zeigen, wenn das Reportergen nicht exprimiert wird, verglichen zur Situation bei Expression des Reportergens; oder (II) ein gegenselektierbares Reportergen ist, das ein Polypeptid codiert, das im Stande ist, ein ungiftiges Substrat in ein giftiges Produkt umzuwandeln, und die Detektion die Identifikation derjenigen Zellen umfasst, die überleben oder wachsen, wenn das Reportergen nicht exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Reportergen das GFP-Gen oder das cobA-Gen oder eine Variante oder ein Fragment des GFP-Gens oder des cobA-Gens ist, das bzw. die ein Fluoreszenzprotein codiert, oder ein unter URA3, CYH2 und LYS2 ausgewähltes gegenselektierbares Reportergen ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei ein gegenselektierbares Reportergen, das auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion steht, LYS2 oder LEU2 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zwei gegenselektierbare Reportergene, bestehend aus URA3 und CYH, aus URA3 und LYS2, oder aus LYS2 und CYH2, in funktionsfähiger Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei mehrfache Reportergene in funktionsfähiger Weise unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehen und mindestens ein gegenselektierbares Reportergen und mindestens ein ein Fluoreszenzprotein codierendes Gen umfassen, so dass die Detektion die Identifikation derjenigen Zellen umfasst, die überleben oder wachsen und nicht fluoreszieren oder eine verringerte Fluoreszenz zeigen, wenn das Reportergen nicht exprimiert wird, verglichen zur Situation bei Expression des Reportergens.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei mehrfache Reportergene in funktionsfähiger Weise unter der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion stehen und wobei die Reportergene mindestens ein gegenselektierbares Reportergen und mindestens ein ein Fluoreszenzprotein codierendes Gen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 35, wobei das Kandidatenpeptid in einer konformationell gespannten Form innerhalb einer Trx-Polypeptidschleife exprimiert wird oder oxydierte flankierende Cysteinreste umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36, weiterhin umfassend Selektion und Wachstum der detektierten Zellen.
Verwendung eines Hefe-Shuttlevektors, der im Stande ist, einen Kandidaten für ein inhibitorisches Peptid im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37 zu exprimieren, wobei der Vektor ortsspezifische Rekombinasestellen umfasst, die eine das Kandidatenpeptid codierende Sequenz flankieren.
Verwendung eines Vektors, der eine wie in einer unter SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:10 ausgewählten Sequenz angegebene Nukleotidsequenz umfasst, im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 38.
Verwendung eines Vektors zur Expression roter und grüner Fluoreszenzproteine in Hefe im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 37, wobei dieser Vektor (I) eine ein grünes Fluoreszenzprotein exprimierende Kassette, umfassend das gfp-Gen, auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle eines in Hefe funktionsfähigen chimären LexA/GAL1-Promotors mit mehrfachen LexA-Operatorstellen stehend; und (II) eine ein rotes Fluoreszenzprotein exprimierende Kassette, umfassend das cobA-Gen, auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle eines in Hefe funktionsfähigen chimären cl/GAL1-Promotors mit mehrfachen cl-Operatorstellen stehend, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei der Vektor die Strukturmerkmale zur Expression des im Vektor pRT2 (SEQ ID NO:10) enthaltenen Fluoreszenzproteins besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 41, zusätzlich umfassend: (IV) Isolierung einer Nukleotidsequenz, die einen Peptidinhibitor codiert, der teilweise oder vollständig die Zielinteraktion inhibiert; (V) Transfektion der eukaryontischen Zelle mit der isolierten Nukleinsäure; und (VI) Vergleich des Phänotyps oder Expressionsmusters der transfizierten eukaryontischen Zelle mit dem Phänotyp oder Expressionsmuster einer ansonsten isogenen untransfizierten Zelle, wobei ein unterschiedlicher Phänotyp oder ein unterschiedliches Expressionsmuster anzeigt, dass das Peptid eine Wirkung auf die Zelle hat.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, wobei der Vergleich des Expressionsmusters der transfizierten eukaryontischen Zelle mit dem Expressionsmuster der ansonsten isogenen untransfizierten Zelle durchgeführt wird, indem man ein Array der von den transfizierten und der von den untransfizierten Zellen gebildeten Proteine oder Nukleinsäuren herstellt und diese Proteine oder Nukleinsäuren vergleicht.
Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei der Phänotyp der transfizierten Zelle mit dem Phänotyp der untransfizierten Zelle verglichen wird.
Verfahren zur Identifikation eines Peptids zur vorbeugenden oder therapeutischen Behandlung eine Säugers, wobei man das Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 45 an einer erkrankten Zelle durchführt und ein Peptid selektiert, das den Phänotyp oder das Expressionsprofil der transfizierten Zelle revertiert.
Verfahren zur Identifikation eines Bindungspartners oder pharmakologischen Ziels, wobei man das Verfahren nach Anspruch 44 durchführt und die Nukleinsäure oder das Protein, die oder das in der transfizierten Zelle verändert ist, identifiziert.