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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein verbessertes reverses
n-Hybrid-Screening-Verfahren zur Identifikation von Antagonisten
oder Inhibitoren biologischer Interaktionen, wobei mehrfache Reportergene verwendet
werden, um die Antagonisten oder Inhibitoren einer Interaktion von
den Antagonisten oder Inhibitoren anderer Interaktionen zu unterscheiden,
wobei z. B. jede der Interaktionen eine oder mehrere identische Interaktionspartner
involviert. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel bereit, durch
die eine große
Zahl peptidbasierter therapeutischer, prophylaktischer und diagnostischer
Reagenzien entwickelt werden können.
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ALLGEMEINES
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Der
Fachmann wird erkennen, dass die hier beschriebene Erfindung anderen
Variationen und Modifikationen als den hier spezifisch beschriebenen
zugänglich
ist. Es ist zu verstehen, dass die hier beschriebene Erfindung alle
solchen Variationen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung umfasst auch
alle solchen Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen,
auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen oder die in dieser
Beschreibung angezeigt werden, einzeln oder kollektiv, und jede
Kombination und alle Kombinationen von zwei oder mehr beliebigen
unter diesen Schritten oder Merkmalen.
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In
dieser gesamten Beschreibung bezeichnen, sofern nicht der Kontext
ein anderes erfordert, das Wort „umfassen" und Variationen wie „umfasst" und „umfassend", den Einschluss
einer genannten Entität
oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Entitäten oder Schritten, aber nicht
den Ausschluss irgendeiner anderen Entität oder irgendeines anderen
Schrittes oder irgendeiner anderen Gruppe von Entitäten oder
Schritten. Der Bereich der vorliegenden Erfindung wird durch die
hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen, die nur dem Zweck
der Exemplifikation dienen sollen, nicht begrenzt. Funktionell gleichwertige
Produkte, Zusammensetzungen und Verfahren sind eindeutig innerhalb
des hier beschriebenen Bereichs der Erfindung.
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Die
bibliographischen Details der Publikationen, auf die der Autor in
dieser Beschreibung Bezug nimmt, sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst.
Hier auf den Stand der Technik genommene Bezüge, einschließlich von
einem oder mehreren Dokumenten aus dem Stand der Technik, sind nicht
als Anerkennung oder Vorschlag zu verstehen, dass dieser Stand der
Technik in Australien Allgemeinwissen sei oder in Australien zum
Allgemeinwissen gehöre.
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Hier
ist der Ausdruck „gewonnen
aus" dahingehend
zu verstehen, dass eine bestimmte Entität oder Gruppe von Entitäten von
der genannten Spezies stammt, aber nicht notwendigerweise direkt
aus der genannten Quelle erhalten worden ist.
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Diese
Beschreibung enthält
unter Verwendung des Programms Patentln Version 3.0 hergestellte
Nukleotidsequenzinformationen, in der vorliegenden Schrift nach
den Ansprüchen
dargestellt. In dem Sequenzprotokoll wird jede Nukleotidsequenz
durch den numerischen Indikator <210>, gefolgt von dem Sequenzidentifikator
(z. B. <210>1, <210>2
usw.) identifiziert. Die Länge,
die Art der Sequenz [DNA, Protein (PRT) usw.] und der Ursprungsorganismus
jeder Nukleotidsequenz werden durch die in den numerischen Indikatorfeldern <211>, <212> bzw. <213> bereitgestellten Informationen
bezeichnet. Nukleotidsequenzen, auf die in der Beschreibung Bezug
genommen wird, sind durch den Ausdruck „SEQ ID NO:", gefolgt von der
Sequenznummer [z. B. bezieht sich SEQ ID NO:1 auf die Sequenz in
dem als <400>1 bezeichneten Sequenzprotokoll],
definiert.
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Die
Nukleotidrestbezeichnungen, auf die hier Bezug genommen wird, sind
die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlenen,
wobei A für
Adenin, C für
Cytosin, G für
Guanin, T für
Thymidin, Y für
einen Pyrimidinrest, R für
einen Purinrest, M für
Adenin oder Cytosin, K für
Guanin oder Thymidin, S für
Guanin oder Cytosin, W für
Adenin oder Thymidin, H für
ein anderes Nukleotid als Guanin, B für ein anderes Nukleotid als
Adenin, V für
ein anderes Nukleotid als Thymidin, D für ein anderes Nukleotid als
Cytosin und N für
einen beliebigen Nukleotidrest steht.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Biologische
Interaktionen, wie z. B. eine Protein-Protein-Interaktion oder eine
Protein-Nukleinsäure-Interaktion,
sind an einer großen
Vielzahl von Prozessen, die in lebenden Zellen stattfinden, beteiligt.
Zum Beispiel kann die agonistische oder antagonistische Beeinflussung
eines Rezeptors durch einen spezifischen Liganden, wie z. B. ein
Pharmakon, ein Hormon, ein Second-messenger-Molekül usw.,
einen oder mehrere aus einer Vielzahl biologischer Prozesse beeinflussen,
darunter Genexpression, Zelldifferenzierung, Wachstum, Enzymaktivität, Metabolitenfluss
oder Metabolitenverteilung zwischen zellulären Kompartimenten. Protein-Protein-Interaktionen, DNA-Protein-Interaktionen
und RNA-Protein-Interaktionen sind wohlbekannt für ihre Wirkungen in der Regulation
solcher biologischen Prozesse sowohl in prokaryontischen als auch
in eukaryontischen Zellen, überdies
kritisch für
die DNA-Replikation und im Fall von RNA-Viren für die RNA-Replikation.
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Unerwünschte oder
unpassende Genexpression und/oder zelluläre Differenzierung, unerwünschtes oder
unpassendes zelluläres
Wachstum und unerwünschter
oder unpassender Metabolismus können
zumindest in vielen Fällen
biologischen Interaktionen zuzuschreiben sein, an denen die Bindung
und/oder die Aktivität
proteinöser
Moleküle
beteiligt sind, wie z. B. von Transkriptionsfaktoren, Peptidhormonen,
Rezeptormolekülen
oder Enzymen. In einem Beispiel kodieren mehrere in lymphoiden Malignanzen
durch chromosomale Translokationen aktivierte Gene Transkriptionsfaktoren,
z. B. MYC, LYL-1 und SCL, die über
Protein-Protein-Interaktionen
zu wirken scheinen. In normalen Zellen stehen diese Proteine mit
ihren Interaktionspartnern in einem angemessenen Gleichgewicht,
das als eine Folge der Onkogen-Aktivierung
gestört
wird und von dem vermutet wird, dass es zur Transkription von Zielgenen
führt,
die normalerweise in anderen Zellen oder Linien exprimiert werden.
Diese Transkriptionsfaktoren können
auch die Funktion nahe verwandter endogener Proteine ersetzen oder
antago nisieren und dadurch die für
die normale Wachstumskontrolle essentielle Genexpression stören.
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Peptide
stellen potentielle therapeutische und prophylaktische Wirkstoffe
für viele
menschliche und tierische Krankheiten, biochemische Störungen und
Medikamentennebenwirkungen dar, da sie hochspezifisch mit anderen
Molekülen
interagieren können.
Z. B. wurde berichtet, dass mimetische Peptide die Proteininteraktionen
und/oder enzymatischen Funktionen inhibieren. Zu den spezifischeren
Beispielen gehört
ein von der Ribonukleotidreduktase des Herpes-simplex-Virus abgeleitetes
Nonapeptid, das zur Übertragung
in Zellen über
seinen Rezeptor mit einer Enterotoxin-Untereinheit verbunden ist.
Es wurde gefunden, dass das Peptidkonjugat die Replikation von Herpes-simplex-I
in ruhenden Vero-Zellen inhibiert (Marcello et al., 1994). Unter Verwendung
detaillierter Kenntnis der PCNA-Interaktionsdomäne von p21WAF1 wurde
ein Peptid entworfen, das die Interaktion wirksam blockierte. Dieses
20-gliedrige Peptid band mit hinreichender Affinität, um die
Replikation von SV40 zu blockieren (Warbrick et al., 1996). Es wurde
gefunden, dass eine von p16 abgeleitete 20-gliedrige Peptidsequenz
mit cdk4 und cdk6 interagiert und die Phosphorylierung von pRB und
das Fortschreiten des Zellzyklus inhibiert (Fahraeus 1996). Es wurde
sogar gezeigt, dass Peptide als Inhibitoren in Tiermodellen fungieren.
Z. B. wurde gezeigt, dass ein auf die ICE-Protease gerichtetes Peptid
bei der Maus ein wirksamer protektiver Inhibitor gegen durch TNF-α ausgelöste Leber-Apoptose
ist (Rouquet et al, 1996). RNA-Protein-Interaktionen wie z. B. die
TAT/TAR-Interaktion von HIV oder die Interaktion von RNA mit den Proteinuntereinheiten
der Telomerase stellen attraktive Ziele für die Therapie dar.
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Konventionelle
vorwärtsgerichtete
n-Hybrid-Screenings haben sich zur Identifikation von Proteinen, die
spezifisch mit einem Zielprotein von Interesse in einer Zelle interagieren,
als nützlich
erwiesen. In solchen Assays wird das Protein von Interesse im Allgemeinen
als Fusionsprotein mit der DNA-Bindungsdomäne (DBD) eines Transkriptionsfaktors
exprimiert, und eine Transkriptionsaktivatordomäne (AD) wird getrennt davon
als Fusion mit jedem Mitglied einer Liste von Peptiden exprimiert.
Wenn in der Zelle die passende Assoziation zwischen den Bindungspartnern
stattfindet, wird ein funktionsfähiger
Transkriptionsfaktor wiederhergestellt, und es findet die Expression
eines unter der Kontrolle des wiederhergestellten Transkriptionsfaktors
stehenden Reportergens statt. Die den passenden Bindungspartner
exprimierende Zelle kann dann isoliert werden, was die Identifikation
des Bindungspartners ermöglicht.
Typischerweise ist das verwendete Selektionssystem ein auf positiver
Selektion beruhendes, in dem die Expression des Reportergens durch
die Interaktion zwischen den Bindungspartnern gesteigert wird.
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In
Umkehrung hiervon stellen reverse n-Hybrid-Screening-Technologien
ein direktes Mittel zur Isolation von Antagonisten oder „Peptidinhibitoren" einer bestimmten
RNA-Protein-, DNA-Protein- oder Protein-Protein-Interaktion bereit.
Solche Screeningverfahren unterscheiden sich von den kanonischen
vorwärtsgerichteten
n-Hybrid-Screening-Verfahren dadurch, dass sie eine Selektion gegen
die Interaktion bereitstellen. Dies wird z. B. dadurch erreicht,
dass man ein gegenselektierbares Reportergen verwendet, das, wenn
es in der Zelle exprimiert wird, ein letales Produkt kodiert, oder
alternativ, das ein Enzym kodiert, das ein ungiftiges Substrat in
ein giftiges Produkt umwandelt. Zu den zu diesem Zweck geeigneten
gegenselektierbaren Reportergenen gehören z. B. das URA3-Strukturgen
der Hefe, das für
Hefezellen tödlich
ist, wenn es in Gegenwart von 5-Fluororotsäure (5-FOA) exprimiert wird;
das CYH2-Gen der Hefe, das tödlich
ist, wenn es in Gegenwart des Pharmakons Cycloheximid exprimiert
wird; und das LYS2-Gen
der Hefe, das in Gegenwart des Pharmakons α-Aminoadipat (α-AA) tödlich ist.
Reverse n-Hybrid-Screenings,
die solche gegenselektierbaren Reportergene verwenden, sind in der
Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO 99/35282)
detailliert beschrieben, die insbesondere ein reverses n-Hybrid-Screening-Verfahren
mit hohem Durchsatz zur Durchmusterung von Zufallspeptid-(d. h.
Aptamer-) Bibliotheken in vivo beschreibt.
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Die
Verwendbarkeit reverser 2-Hybrid-Ansätze zum Hochdurchsatz-Screening
von Bibliotheken kleiner Pharmakonmoleküle wurde vor kurzem auch von
Huang und Schreiber (1997) und von Young et al. (1998) beschrieben,
jedoch nicht im Hinblick auf das Durchmustern von Aptamer-Bibliotheken.
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Viele
voneinander verschiedene biologische Interaktionen bei komplexen
Organismen verwenden einander überschneidende
Untergruppen von Interaktionspartnern, oder Partner, die in große Proteinfamilien
organisiert sind, die auf dem Aminosäuresequenzniveau, insbesondere
in den Regionen, die für
die Proteinbindungsaktivität
oder die Nukleinsäurebindungsaktivität erforderlich
sind, hochkonserviert sind. Z. B. sind die GTPasen Ras und Krev-1
zu 56 % identisch, und es ist bekannt, dass sie mit überschneidenden
Gruppen von Proteinpartnern interagieren, wiewohl mit unterschiedlichen
Affinitäten,
nämlich
Raf, an das Ras bevorzugt bindet, Krit-1, an das Krev-1 vorzugsweise
bindet, und das Rai-Guanin-Dissoziations-Stimulatorprotein (RaiGDS), an
das beide Proteine binden (Serebdiskii et al., 1999). In gleicher
Weise interagiert der Transkriptionsfaktor SCL, der in malignen
lymphoiden Zellen exprimiert wird, mit den Proteinen LMO1, LMO2,
DRG, mSin3a und E47 (Mahajan et al., 1996).
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Trotz
der Nützlichkeit
reverser n-Hybrid-Screenings zur Identifikation potentiell nützlicher
therapeutischer Moleküle,
die eine einfache Interaktion in einer Zelle antagonistisch beeinflussen,
können
solche Screenings außerstande
sein, zwischen mehrfachen Interaktionen in der Zelle, die Bindungspartner
mit gleichen oder nah verwandten Partnerbindungsdomänen involvieren,
wie den oben beschriebenen, zu unterscheiden. Bekannte reverse 2-Hybrid-
oder reverse 3-Hybrid-Screenings stellen kein Mittel bereit, um
vorzugsweise eine Interaktion zwischen 2 oder mehr Bindungspartnern
gegenüber
einer anderen Protein-Protein-Interaktion, die einen oder mehrere
der gleichen Bindungspartner oder nah verwandte Bindungspartner
involviert, zu selektieren. Demgemäß haben die existierenden Technologien
den Nachteil, bei dem Durchmusterungsprozess falsch-positive Ergebnisse
zu liefern, was zusätzliche
Zeit und zusätzlichen
Aufwand notwendig macht, um die wahren Bindungspartner herauszufinden.
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In
einem Versuch, Probleme mit der Identifikation von falschen Positiven
zu überwinden,
beschreibt WO 99/14319 ein Verfahren, das mehrfache Reportermoleküle verwendet,
um die Fähigkeit
eines Testproteins, mit einem ersten Protein, aber nicht mit einem
zweiten Protein zu interagieren, zu bestimmen. Während das Verfahren zur Identifikation
spezifischer Proteininteraktionen verwendbar ist, ist es bei der
Identifikation eines Inhibitors (z. B. eines inhibitorischen Peptids),
der zwischen mehrfachen Interaktionen unterscheidet (d. h. eines
selektiven Inhibitors), von geringem Nutzen.
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US 5,965,368 beschreibt
ein ähnliches
Verfahren zur Identifikation eines Proteins, das imstande ist, mit
einem zweiten Protein, jedoch nicht mit einem dritten Protein zu
interagieren. Jedoch verwendet in diesem Fall das beschriebene Verfahren
einen gegenselektierbaren Marker. Das beschriebene Verfahren selektiert spezifisch
gegen Interaktionen, an denen mehrfache Bindungspartner beteiligt
sind, was es zur Bestimmung eines Inhibitors, der zwischen mehrfachen
Interaktionen unterscheidet, ungeeignet macht.
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Überdies
sind existierende reverse 2-Hybrid-Screenings und reverse 3-Hybrid-Screenings aufgrund des
Mangels eines geeigneten Shuttle-Vektors oder geeigneter Wirtszellstämme für Hochdurchsatzanwendungen
nicht ideal geeignet.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
der zu der vorliegenden Erfindung führenden Arbeit versuchten die
Erfinder, reverse n-Hybrid-Screenings zu entwickeln, die verglichen
mit konventionellen reversen n-Hybrid-Screenings erhöhte Spezifität bei der
Detektion von interagierenden Bindungspartnern besitzen sollten
und die insbesondere die Fähigkeit
haben sollten, zwischen Interaktionen zu unterscheiden, die einen
oder mehrere Bindungspartner gemeinsam hatten.
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Hier
ist der Begriff „Interaktion" so zu verstehen,
dass er sich auf eine direkte oder indirekte physikalische Assoziation
zwischen zwei oder mehr Molekülen
oder „Partnern" bezieht, wobei diese
Assoziation an einem zellulären
Prozess beteiligt ist, oder alternativ, die erforderlich ist, damit
dieser zelluläre
Prozess stattfinden kann. An der „Assoziation" kann die Bildung
eines induzierten magnetischen oder paramagnetischen Feldes, die
Bildung einer kovalenten Bindung wie z. B. einer Disulfidbrückenbildung
zwischen Polypeptidmolekülen,
eine ionische Interaktion, wie sie z. B. in einem Salzgitter vorliegt,
eine Wasserstoffbrücke
oder alternativ eine Van-der-Waals-Interaktion wie eine Dipol-Dipol-Interaktion,
eine durch einen Dipol induzierte Dipol-Interaktion, eine durch
einen induzierten Dipol induzierte Dipol-Interaktion oder eine abstoßende Interaktion
oder irgendeine Kombination der angeführten Anziehungskräfte beteiligt
sein.
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Z.
B. kann in einem reversen 2-Hybrid-Assay an der Interaktion zwischen
den proteinösen
Bindungspartnern deren direkte physikalische Assoziation beteiligt
sein (d. h. ohne ein Molekül
dazwischen). In ähnlicher
Weise ist in einem reversen 3-Hybrid-Assay die Interaktion zwischen
einigen der Bindungspartner, insbesondere die Interaktion zwischen
den zwei Ködern
und die Interaktion zwischen einem der Köder und der Beute eine direkte
physikalische Assoziation. In einem 3-Hybrid-Assay sind jedoch der
konstante Köder
und die Beute eindeutig indirekt miteinander assoziiert, da der
nichtkonstante Köder
(z. B. ein RNA-Köder
im Fall einer RNA-Protein-Interaktion) eine „Brücke" zwischen diesen Partnern bildet. Demgemäß sind zu
den Zwecken der vorliegenden Erfindung in dem Bereich des Begriffes „Interaktion" eindeutig solche
direkten und indirekten Assoziationen zwischen den verschiedenen
Bindungspartnern inbegriffen, und infolgedessen werden keine ungenannten
Bindungspartner übergangen.
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Hier
bezieht sich der Begriff „n-Hybrid" auf die Anzahl der
Bindungspartner außer
dem Peptidinhibitor, die an einer Interaktion beteiligt sind, die
gemessen wird. Demgemäß gibt es
in einem konventionellen reversen 2-Hybrid-Screening zwei Bindungspartner,
in einem konventionellen reversen 3-Hybrid-Screening drei Bindungspartner
usw.
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Demgemäß stellt
ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifikation
eines Peptids, das eine Zielinteraktion zwischen zwei oder mehr
Bindungspartnern in einer Wirtszelle teilweise oder vollständig inhibiert,
das aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen einigen, aber nicht
allen dieser Bindungspartner nicht inhibiert, bereit, wobei dieses
Verfahren umfasst:
- (i) Expression in einem
zellulären
Wirt:
(a) der Bindungspartner der Zielinteraktion, so dass
sie auf funktionsfähige
Weise die Expression eines oder mehrerer Reportergene in den zellulären Wirt
kontrollieren, wobei diese Expression durch eine Störung der
Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird;
(b)
der Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion, so dass sie auf
funktionsfähige
Weise die Expression eines oder mehrerer Reportergene in dem zellulären Wirt
kontrollieren, wobei diese Expression durch eine Störung der
Nicht-Ziel-Interaktion teilweise oder vollständig inhibiert wird, und das
Reportergen von dem unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten
Reportergen oder den unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimierten
Reportergenen verschieden ist; und
(c) eines Kandidatenpeptids,
wobei
eines oder mehrere der auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle
der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergene
gegenselektierbare Reportergene sind, die dem Wirt konditionale
Letalität
vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration
der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare
Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert
wird, die Expression von einem oder mehreren der Bindungspartner
in Abhängigkeit von
Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem die Expression unter
die Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der regulatorische
Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfasst;
- (ii) Wachstum des zellulären
Wirts unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression
jedes Reportergens bzw. aller Reportergene in (a) von der Expression
des Reportergens bzw. der Reportergene in (b) zu unterscheiden;
und
- (iii) Detektion derjenigen Wirtszellen, in denen die Expression
des bzw. der funktionsfähig
unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehenden Reportergens/Reportergene
teilweise oder vollständig
inhibiert wird und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter
der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergens/Reportergene
nicht inhibiert wird, wobei die detektierten Zellen ein Peptid exprimieren,
das die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert.
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Dieser
Aspekt der Erfindung schließt
in seinen Bereich eindeutig sowohl reverse 2-Hybrid- als auch reverse
3-Hybrid-Assays oder beliebige reverse n-Hybrid-Assays kraft des
Begriffs „Interaktion", wie oben definiert,
ein. Wie dem Fachmann bekannt sein wird, ist der einzige Unterschied
zwischen dem reversen 2-Hybrid-Format und den Formaten höherer Ordnung
der Zusatz weiterer Bindungspartner, die die relativen physikalischen
Assoziationen zwischen allen dieser Bindungspartner verändern können, während jedoch
das allgemeine Prinzip für
alle reversen n-Hybrid-Assay-Formate das gleiche ist.
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Die
Wirtszelle kann eine beliebige Zelle sein, die imstande ist, die
Expression exogener DNA zu unterstützen, wie z. B. eine Bakterienzelle,
eine Insektenzelle, eine Hefezelle, eine Säugerzelle oder eine Pflanzenzelle.
Vorzugsweise ist die Zelle eine Bakterienzelle, eine Säugerzelle
oder eine Hefezelle. Vorzugsweise hat eine Hefezelle den Genotyp
MATα, ura3,
trp1, his3, cyh2R, IexAop-URA3, IexAop-CYH2,
ade2. Ein solcher Hefestamm kann unter Verwendung spontaner Cycloheximid-resistenter
Derivate von YPH252 (Sikorski et al., 1989) oder EGY40 (Golemis
und Brent, 1992; Gyuris et al. 1993) hergestellt werden.
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Alternativ
kann der Hefestamm PRT 473 sein, ein Cycloheximid-resistentes Derivat
des Stammes SKY 473, mit dem Genotyp (MAT-a, cyh2R his3,
trp1, lexAop-LEU2, lexAop-CYH2ade2::ZEOR, lexAop-URA3his5::G418R,
clop-LYS).
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Der
Begriff „Zielinteraktion" bezeichnet die Interaktion
in den zellulären
Wirt, gegen die ein spezifischer Antagonist oder Peptidinhibitor
gesucht wird.
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Eine „Nicht-Ziel-Interaktion" bedeutet eine Interaktion,
an der mindestens ein mit der Zielinteraktion gemeinsamer Bindungspartner,
wie oben definiert, beteiligt ist, gegen die jedoch kein spezifischer
Antagonist gesucht wird. Demgemäß ist es
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diejenigen Peptide auszuschließen, die
sowohl die Zielinteraktion als auch die Nicht-Ziel-Interaktion in dem zellulären Wirt
antagonisieren, und vorzugsweise diejenigen Peptide zu selektieren,
die nur die Zielinteraktion in dem zellulären Wirt antagonisieren oder
die die Zielinteraktion mit höherer
Affinität
antagonisieren als die Nicht-Ziel-Interaktion.
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Der
Begriff „teilweise
oder vollständige
Inhibition" bedeutet,
dass die Expression des Reportergens unter der Kontrolle der Zielinteraktion
auf ein Maß verringert
wird, das die Fähigkeit,
zwischen der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion, wie
oben definiert, zu unterscheiden, nicht beeinträchtigt.
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Der
Begriff „Bindungspartner" ist hier dahingehend
zu verstehen, dass er ein Protein oder eine Nukleinsäure bezeichnet,
das bzw. die an ein anderes Protein oder eine andere Nukleinsäure in einer
Zelle bindet – einschließlich eines
vollständigen
Proteins oder Gens – oder
die Dimerisierungsregion eines Proteins oder eine cis-wirksame Nukleotidsequenz,
die an eine Nukleinsäure
oder ein Protein bindet. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind an jeder
biologi schen Interaktion in einer Zelle mindestens zwei Bindungspartner
beteiligt. Der Begriff „Dimerisierungsregion" bedeutet denjenigen
Teil eines Proteins, der physikalisch in Bezug zu einem Bindungspartner
steht. Der Begriff „cis-wirksame
Nukleotidsequenz" ist
dahingehend zu verstehen, dass er eine Nukleotidsequenz bedeutet,
die kraft der Bindung eines Repressorproteins oder Aktivatorproteins
dafür die
Genexpression reguliert, einschließlich der minimalen Nukleotidsequenz,
die die Fähigkeit
hat, an dieses Repressorprotein oder dieses Aktivatorprotein zu
binden.
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Demgemäß ist es
dem Fachmann klar, dass hier jeder Bezug auf einen gemeinsamen Bindungspartner
einen Bezug auf homologe Proteine oder Gene einschließt, die
eine oder mehrere Dimerisierungsregionen bzw. cis-wirksame Nukleotidsequenzen
mit einem bekannten Bindungspartner gemeinsam haben, der an einer Interaktion
beteiligt ist, gegen die das erfindungsgemäße reverse Hybridscreening
gerichtet ist (d. h. an der Zielinteraktion).
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Somit
ist es in Fällen
großer
Proteinfamilien oder großer
Multigenfamilien eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Peptid
zu selektieren, das eine Zielinteraktion zwischen zwei oder mehreren
Bindungspartnern in einer Wirtszelle teilweise oder vollständig inhibiert,
aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen mehreren, aber nicht allen
dieser Bindungspartner nicht inhibiert, wie z. B. zwischen beliebigen
Homologa dieser Bindungspartner, die sich gemeinsame Dimerisierungsregionen
oder cis-wirksame Sequenzen teilen, oder alternativ zwischen identischen
Bindungspartnern, die ihrerseits mit einer Anzahl verschiedener
Bindungspartner interagieren.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind einer oder mehrere der Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion
mit einem Bindungspartner der Zielinteraktion identisch.
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Die
Erfindung wird weder durch die Natur der zu untersuchenden Zielinteraktion
noch durch die Natur der Nicht-Ziel-Interaktion begrenzt, da der
Fachmann auf der Basis der hierin enthaltenen Offenbarung alle Formate
ohne weiteres ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand bestimmt.
Vorzugsweise umfasst der eine oder mehrere der Bindungspartner Aminosäuren wie
z. B. ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Enzymmolekül, oder
alternativ umfasst er Nukleinsäure,
wie z. B. DNA, RNA oder ein DNA/RNA-Hybrid. Besonders bevorzugt
ist/sind die Ziel- und/oder Nicht-Ziel-Interaktionen Protein/Protein-Interaktionen
oder Protein/Nukleinsäure-Interaktionen.
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Vorzugsweise
ist die Anzahl der an jeder Interaktion beteiligten Bindungspartner
mindestens zwei. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein verbessertes reverses 2-Hybrid-Assay
bereit, wobei:
- (i) die Bindungspartner der
Zielinteraktion aus zwei Fusionsproteinen bestehen, wobei (a) ein
Fusionsprotein die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors
und eine Aminosäuresequenz,
die mit dem anderen Fusionsprotein der Zielinteraktion dimerisiert,
umfasst; und (b) ein Fusionsprotein die Transkriptionsaktivatordomäne eines
Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen
Protein der Zielinterakti on dimerisiert, umfasst; und wobei die
Dimerisierung zwischen diesen Fusionsproteinen einen Proteinkomplex
hervorbringt, der an die cis-wirksame Sequenz bindet und die Expression
des Reportergens oder der Reportergene aktiviert, wenn die Zielinteraktion
in der Wirtszelle stattfindet; und
- (ii) die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion aus zwei
Fusionsproteinen bestehen, wobei (a) ein Fusionsprotein die DNA-Bindungsdomäne eines
Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen
Fusionsprotein der Nicht-Ziel-Interaktion dimerisiert, umfasst;
und (b) ein Fusionsprotein die Transkriptionsaktivatordomäne eines
Transkriptionsfaktors und eine Aminosäuresequenz, die mit dem anderen
Protein der Nicht-Ziel-Interaktion dimerisiert, umfasst, und wobei
die Dimerisierung zwischen diesen Fusionsproteinen einen Proteinkomplex
hervorbringt, der an die cis-wirksame Sequenz bindet und die Expression
der Reportergene bzw. des Reportergens aktiviert, wenn die Nicht-Ziel-Interaktion
in der Wirtszelle stattfindet.
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Diese
Ausführungsform
der Erfindung ist insofern vielseitig, als die Natur der Bindungspartner
der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion austauschbar
sind, sofern die Fähigkeit
zur Unterscheidung zwischen der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion
erhalten bleibt.
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Z.
B. können
die Fusionsproteine der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion,
die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen, identisch sein
oder die gleichen Aktivierungseigenschaften besitzen. In einem solchen
Fall sind die Fusionsproteine der Ziel- und der Nicht-Ziel-Interaktionen,
die DNA-Bindungsdomänen
umfassen, verschieden, und ebenso die ciswirksamen Sequenzen, an
die sie binden. Alternativ können die
Proteine der Ziel- oder der Nicht-Ziel-Interaktion, die DNA-Bindungsdomänen umfassen,
identisch, aber mit verschiedenen DNA-Bindungsdomänen fusioniert
sein, die an verschiedene cis-wirksame Elemente stromaufwärts des
Reportergens oder der Reportergene binden.
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Alternativ
können
die Fusionsproteine der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen, die
DNA-Bindungsdomänen umfassen,
identisch sein oder die gleichen Bindungsaffinitäten besitzen. In einem solchen
Fall sind auch die cis-wirksamen Sequenzen der Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktion
identisch oder funktional äquivalent,
jedoch werden sich die Fusionsproteine der Zielinteraktion und der
Nicht-Ziel-Interaktion, die eine Transkriptionsaktivatordomäne umfassen,
unterscheiden.
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Wie
dem Fachmann bekannt ist, erfordern reverse n-Hybrid-Screenings
die funktionsfähige
Verbindung der zu untersuchenden Interaktion mit der Expression
eines Reportergens in der Zelle, wobei gegen die Expression des
Reporters selektiert wird, um die Detektion eines Antagonisten für die Interaktion
zu erleichtern. Die vorliegende Erfindung entwickelt diese Technik
weiter, indem sie eine Möglichkeit
zur Selektion gegen die Zielinteraktion bereitstellt, parallel zu
der Selektion auf oder gegen die Nicht-Ziel-Interaktion.
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Zu
den besonders bevorzugten Zielinteraktionen, die dem hier beschriebenen
erfindungsgemäßen Verfahren
zugänglich
sind, gehören
die Interaktionen zwischen SCL oder der Dimerisierungsregion von
SCL und einem Protein ausgewählt
unter LMO1, LMO2, DRG, mSin3A, E47, einer Dimerisierungsregion von LMO1,
einer Dimerisierungsregion von LMO2, einer Dimerisierungsregion
von DRG, einer Dimerisierungsregion von mSin3A und einer Dimerisierungsregion
von E47.
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Alternativ
ist das erfindungsgemäße Verfahren
imstande, die Interaktion zwischen LMO2 oder der Dimerisierungsregion
von LMO2 und einem Protein ausgewählt unter SCL, LMO1, DRG, mSin3A,
E47, einer Dimerisierungsregion von SCL, einer Dimerisierungsregion
von LMO1, einer Dimerisierungsregion von DRG, einer Dimerisierungsregion
von mSin3A und einer Dimerisierungsregion von E47 zu detektieren.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
findet die Interaktion zwischen der Dimerisierungsregion von SCL
und der Dimerisierungsregion von LMO2 oder der Dimerisierungsregion
von E47 oder der Dimerisierungsregion von LMO1 statt.
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In
einer alternativen bevorzugten Ausführungsform findet die Interaktion
zwischen der Dimerisierungsregion von LMO2 und der Dimerisierungsregion
von E47 oder der Dimerisierungsregion von mSin3A statt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
findet die Interaktion zwischen der Dimerisierungsregion von E47
und der Dimerisierungsregion von mSin3A statt.
-
Die
Transkriptionsaktivatordomäne
ist vorzugsweise die GAL4-Aktivatordomäne.
-
Die
DNA-Bindungsdomäne
ist vorzugsweise ausgewählt
unter der LexA-Operator-Bindungsdomäne, der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und der
cl-Operator-Bindungsdomäne.
-
Wie
hier anhand von Beispielen dargestellt, zeigen die gegenwärtigen Erfinder,
dass ein erfindungsgemäßes Zwei-Hybrid-Screening
imstande ist, zwischen Interaktionen in derselben Zelle zu unterscheiden,
an denen (i) SCL und LMO2; und (ii) SCL und die Proteine LMO1, mSin3A
oder E47 beteiligt sind. Zusätzlich
zu der Unterscheidung zwischen diesen Interaktionen wendet das Verfahren
reverse n-Hybrid-Screeningtechniken an, um Peptidaptamere zu identifizieren,
die solche Interaktionen blockieren, und die infolgedessen eine potentielle
Verwendbarkeit als therapeutische oder diagnostische Reagenzien
besitzen.
-
In
einem weiteren Beispiel unterscheidet das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren
wirksam zwischen Interaktionen zwischen einem RNA-Molekül und einem
Protein in derselben Zelle. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung
gleichermaßen
auf die Detektion von Inhibitoren sowohl von Protein- als auch von
Nukleinsäure-Interaktionen
in Zellen anwendbar.
-
Die
hier beschriebenen verbesserten reversen Zwei-Hybrid- oder reversen
Drei-Hybrid-Screenings
erfordern die Expression der folgenden Entitäten in einer einzelnen Zelle:
- (i) der Bindungspartner einer Zielinteraktion,
so dass ihre Interaktion die Expression von einem oder mehreren
Reportergenen in dieser Zelle erhöht und diese Expression durch
die Störung
dieser Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert wird;
- (ii) der Bindungspartner einer Nicht-Ziel-Interaktion, so dass
ihre Interaktion die Expression von einem oder mehreren Reportergenen
in dieser Zelle erhöht
und diese Expression durch die Störung dieser Nicht-Ziel-Interaktion
teilweise oder vollständig
inhibiert wird, wobei das letztere Reportergen bzw. die letzteren
Reportergene von dem oder den unter der Kontrolle der Zielinteraktion
exprimierten Reportergen oder Reportergenen verschieden ist/sind;
und
- (iii) eines auf inhibitorische Wirkung zu testende Kandidatenpeptids;
wobei
eines oder mehrere der Reportergene, die funktionsfähig unter
der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion
stehen, gegenselektierbare Reportergene sind, die dem zellulären Wirt
konditionale Letalität
vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration
der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare
Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert
wird, die Expression von einem oder mehreren der besagten Bindungspartner
in Abhängigkeit
von Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem man diese Expression
unter die Kontrolle eines Promotors stellt, der regulatorische Elemente
des GAL1- oder des CUP1-Promotors umfasst.
-
Der
Fachmann wird verstehen, dass der Ausdruck „Expression" die Transkription
eines Gens zur Bildung von mRNA mit oder ohne posttranskriptionelles
Prozessieren des Primärtranskripts,
wie z. B. mRNA-Spleißen
oder Anfügen
einer Polyadenylatsequenz, wodurch translatierbare mRNA gebildet
wird, umfasst. Zur Expression gehört weiterhin die Transkription
mit nachfolgender Translation der mRNA zur Bildung eines Peptids
oder Proteins mit oder ohne posttranslationelle Modifikationen des
Proteins, die erforderlich sind, um seine Aktivität zu modulieren,
wie z. B. Glykosylierung, Prozessierung, Spaltung oder Transport.
-
Der
Fachmann erkennt anhand der hier gegebenen Beschreibung, dass das
erfindungsgemäße Verfahren
gleichermaßen
auf das Hochdurchsatz-Screening einer Reihe von Kandidatenpeptiden
auf inhibitorische Aktivität
anwendbar ist. Z. B. kann eine Bibliothek von Klonen, die Kandidatenpeptide
exprimieren, hergestellt werden, und jedes Mitglied dieser Bibliothek
kann in Zellen eingeführt
werden, in denen die Ziel- und Nicht-Ziel-Interaktionen gemessen
werden können.
Es werden diejenigen Zellen, in denen die Zielinteraktion teilweise
oder vollständig
inhibiert wird, selektiert, wobei jede selektierte Zelle einen Klon
besitzt, der die Zielinteraktion in der Zelle inhibiert.
-
Demgemäß umfasst
der Ausdruck „Expression
eines Kandidatenpeptids",
wie hier verwendet, eindeutig die Expression mehrerer Mitglieder
einer Bibliothek von Klonen, in der jedes Mitglied ein einzelnes
Kandidatenpeptid exprimiert.
-
Der
Begriff „Bibliothek" bezeichnet hier
eine Gruppe verschiedener Nukleotidsequenzen, die eine Gruppe von
Aminosäuresequenzen
kodieren, wobei diese Nukleotidsequenzen vorzugsweise in einem geeigneten
Vektor, Kosmid, Bakteriophagen oder Virus-Vektormolekül, der bzw.
das sich zur Erhaltung und/oder Replikation in einem zellulären Wirt
eignet, enthalten sind. Der Begriff „Bibliothek" schließt eine
Bibliothek von synthetischen Zufallspeptiden ein, in der das Ausmaß der Diversität zwischen
den Aminosäure-
oder Nukleotidsequenzen erheblich ist, und ebenso eine begrenzte
Peptidbibliothek, in der es zwischen diesen Sequenzen ein geringeres
Maß an
Diversität
gibt. Der Begriff „Bibliothek" deckt weiterhin
verschiedene Aminosäuresequenzen,
die aus einer zellulären
Quelle gewonnen sind, ab, wie z. B. genomische Fragmente, die z.
B., unter anderen Ansätzen,
durch Scherung oder teilweisen Verdau genomischer DNA unter Verwendung
von Restriktionsendonukleasen erhalten worden sind. Eine „Peptidbibliothek" umfasst weiterhin
Zellen, Viruspartikel und Bakteriophagenpartikel, die die einzelnen
Aminosäuresequenzen
oder Nukleotidsequenzen der diversen Gruppe enthalten.
-
Bevorzugte
Bibliotheken gemäß dieser
Ausführungsform
der Erfindung sind „repräsentative
Bibliotheken", die
eine Gruppe von Aminosäuresequenzen
oder dieselben kodierenden Nukleotidsequenzen umfassen, die alle
für eine
festgelegte Länge
von Peptid- bzw. Nukleinsäuremolekülen möglichen
Kombinationen von Aminosäuren
oder Nukleotidsequenzen einschließen.
-
Die
Diversität
von Peptidbibliotheken, insbesondere von aus genomischen Quellen
erlangten Peptidbibliotheken, kann durch den Fachmann bekannte Mittel
gesteigert werden, wie z. B. Zufallsmutagenese oder andere Mutagenese.
In einem Beispiel dieser Ausführungsform
werden aus der Expression genomischer DNA gewonnene Peptidbibliotheken
in bakteriellen Stämmen,
die einen Defekt in der Epsilon (ε)
-Untereinheit der DNA Polymerase 3 (d. h. den dnaQ- und mutD-Allelen)
und/oder in der Reparatur von fehlgepaarten Basen haben, amplifiziert
oder vermehrt. Escherichia coli-Mutator-Stämme mit den mutY und/oder mutM
und/oder mutD und/oder mutT und/oder mutA und/oder mutC und/oder
mutS-Allelen sind für
solche Anwendungen besonders nützlich.
Bakterienstämme,
die solche Mutationen tragen, sind dem Fachmann ohne weiteres verfügbar und
sind z. B. in Akiyama et al 1989; Fijalkowska und Schaaper, 1995;
Frick et al., 1995; Lu et al, 1995; Maki und Sekiguchi, 1992; Miller,
1992; Miller und Michaels, 1996; Moriya und Gollman, 1992; Schaape
und Cornacchio, 1992; Slupska et al., 1996; und Tajiri et al., 1995
vollständig
beschrieben worden.
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Das
exprimierte Kandidatenpeptid kann eine beliebige Aminosäuresequenz
von mindestens ungefähr 1
bis 60 Aminosäuren
Länge umfassen,
und es kann aus der Expression von Nukleotidsequenzen stammen, die
durch ein beliebiges aus einer Vielzahl von Verfahren hergestellt
werden, wie z. B. Zufallssynthese, oder unter Verwendung natürlich vorkommender
Genome, wie hier beispielhaft dargestellt.
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Das
Peptid ist vorzugsweise ein Peptid aus 20 Aminosäuren. Die Verwendung größerer Fragmente, insbesondere
unter Verwendung zufallsgescherter Nukleinsäuren, die aus bakteriellen,
aus Hefe- oder aus Tiergenomen stammen, wird nicht ausgeschlossen.
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Alternativ
oder zusätzlich
wird das Kandidatenpeptid als Fusionsprotein mit einem Kernimportmotiv exprimiert,
das imstande ist, den Import dieses Peptids in den Kern der Wirtszelle,
wo die Transkription erfolgt, zu ermöglichen, insbesondere mit dem
in Hefe funktionsfähigen
Kernlokalisationssignal von SV40.
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Alternativ
oder zusätzlich
wird das Kandidatenpeptid als Fusionsprotein mit einer Peptidsequenz
exprimiert, die imstande ist, die Aufnahme des Peptids durch eine
isolierte Zelle zu erhöhen,
wie z. B. wenn das jeweilige Peptid ex vivo synthetisiert und isolierten
Zellen in der Kultur zugesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Peptidsequenz, die imstande ist, das Eindringen in oder
die Aufnahme durch die Zellen zu verbessern, zu erhöhen oder zu
unterstützen,
in Insektenzellen oder Säugerzellen
funktionsfähig,
z. B. die Penetratin-Targetingsequenz von Drosophila.
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Das
Kandidatenpeptid kann auch in einer konformationell gespannten Form
exprimiert werden. Aminosäuresequenzen,
die in einer konformationell gespannten Form exprimiert werden,
können
innerhalb eines zweiten Polypeptids als Fusionsprotein exprimiert
werden, so dass sie wirksam in die Sekundärstruktur des zweiten Polypeptids „hineinverschachtelt" sind. Alternativ
kann das Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid innerhalb von einer
Schleife von Disulfidbrücken
zirkularisiert werden, um die Vielfalt der Konformationen zu reduzieren,
z. B. durch Expression des Peptids flankiert von oxydierten Cysteinresten.
Dies kann von besonderem Vorteil sein, wenn die Aminosäuresequenzen
innerhalb einer oberflächenexponierten
oder funktionalen Stelle eines Proteins verschachtelt sind, so dass
sie der Interaktion von Interesse zugänglich sind. Z. B. kann das Peptid
innerhalb einer Thioredoxin-(TRX)-Polypeptidschleife exprimiert
werden.
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Die
Bindungspartner können
von getrennten DNA-Molekülen
oder Vektoren exprimiert werden. Alternativ können sie von einem einzigen
DNA-Molekül
oder Vektor exprimiert werden. Die einzige Anforderung an die Expression
der Bindungspartner ist die, dass beide Bindungspartner zur gleichen
Zeit wie das zu untersuchende Kandidatenpeptid in einer Zelle exprimiert
werden. Weiterhin werden die Bindungspartner unter Bedingungen exprimiert,
die hinreichend sind, um die Expression des Reportergens, mit dem
sie in der Zelle funktionsfähig
verbunden sind, zu modulieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eindeutig auch Interaktionen höherer Ordnungen,
an denen drei oder vier oder mehr Bindungspartner der Ziel- oder
der Nicht-Ziel-Interaktion beteiligt sind.
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Die
Bindungspartner werden vorzugsweise als Fusionsproteine mit einer
Kernlokalisationssequenz exprimiert, um ihren Transport an den Ort
der Transkription in einer eukaryontischen Zelle (d. h. im Kern)
zu ermöglichen,
wie z. B. mit dem Kernlokalisationssignal aus dem „Large
T Antigen" von SV40.
-
Eine
Erfordernis an ein geeignetes Reportergen ist seine Fähigkeit,
auf eine Weise exprimiert zu werden, die ohne weiteres detektiert
werden kann, wie z. B. aufgrund des Phänotyps, den die Expression
einer Zelle vermittelt (z. B. Auxotrophie oder Prototrophie für einen
bestimmten Metaboliten, oder konditionale Letalität in Gegenwart
eines bestimmten Substrats), oder alternativ durch Expression einer
enzymatischen Aktivität,
oder eines Proteins, das durch ein Immunassay, durch kolorimetrische
Detektion oder aufgrund der Fluoreszenz detektierbar ist. Wie oben
gesagt, ist mindestens eines der Reportergene im Verfahren ein gegenselektierbares
Reportergen.
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Zu
den geeigneten Reportergenen gehören
die Gene für
das β-Galaktosidase-Enzym
von Escherichia coli, für
das Luciferase-Protein des Glühwürmchens
(Ow et al., 1986; Thompson et al., 1991), für das grüne Fluoreszenz-Protein (Prasher
et al., 1992; Chalfie et al., 1994; Inouye und Tsuji, 1994; Cormack
et al., 1996; Haas et al., 1996, siehe auch Genbank-Zugangs nummer
U55762), und die roten Fluoreszenzproteine von Discosoma (Matz et
al., 1999) oder Propionibacterium freudenreichii (Wildt und Deuschle,
1999). Weiterhin können
auch das HIS3-Gen
[Larson, R.C. et al (1996); Condorelli, G.L. et al. (1996); Hsu,
H.L. et al. (1991); Osada et al. (1995)] und das LEU2-Gen (Mahajan,
M.A. et al., 1996) verwendet werden.
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Mindestens
ein Reportergen ist ein gegenselektierbares Reportergen (d. h.,
es vermittelt der Zelle konditionale Letalität). Zu anderen Reportergenen
können
Gene gehören,
die fluoreszierende Proteine kodieren, und es kann eine Kombination
von gegenselektierbaren Reportergenen und fluoreszenzproteinkodierenden Genen
verwendet werden. Beide Arten von Reportergenen sind für Hochdurchsatz-Anwendungen
geeignet, bei denen große
Zahlen von Proben chargenweise durchmustert werden. Die Fluoreszenz
kann ohne weiteres durch Fluorometrie oder fluoreszenzaktiviertes
Zellsortieren (FACS) gemessen werden, welche Techniken dem Fachmann
bekannt sind.
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Sofern
ein funktionsfähig
unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion
stehendes Reportergen ein Fluoreszenzprotein kodiert, wird die Detektion
der Reportergenexpression bewerkstelligt, indem man diejenigen Zellen
identifiziert, die fluoreszieren, wenn das Reportergen exprimiert
wird. Alternativ wird die Inhibition der Reportergenexpression bestimmt,
indem man diejenigen Zellen identifiziert, die nicht fluoreszieren
oder die im Vergleich zu der Situation bei Expression des Reportergens
eine verringerte Fluoreszenz zeigen.
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Zu
den bevorzugten Reportergenen, die Fluoreszenzproteine kodieren,
gehören
das gfp-Gen, das cobA-Gen und die Fragmente oder Varianten des gfp-Gens
oder cobA-Gens, die fluoreszierende Proteine kodieren.
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Sofern
ein funktionsfähig
unter der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion
stehendes Reportergen ein gegenselektierbares Reportergen ist, das
der Zelle konditionale Letalität
vermittelt, wird die Detektion der Reportergenexpression dadurch
bewerkstelligt, dass man diejenigen Zellen identifiziert, die ihr
Wachstum einstellen oder sterben, wenn das Reportergen unter den
Bedingungen, die Letalität
vermitteln, exprimiert wird. Alternativ wird die Inhibition der
Reportergenexpression dadurch festgestellt, dass man diejenigen
Zellen identifiziert, die ihr Wachstum nicht einstellen, wenn das
Reportergen exprimiert wird, oder die unter Bedingungen, die Letalität vermitteln,
nicht sterben.
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Bevorzugte
gegenselektierbare Reportergene sind diejenigen Gene, die ein Polypeptid
kodieren, das imstande ist, ein ungiftiges Substrat in ein toxisches
Produkt umzuwandeln, insbesondere gegenselektierbare Reportergene
ausgewählt
unter: CAN, URA3, CYH2 und LYS2.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Kombination der URA3- und CYH2-Gene, funktionsfähig unter
der Kontrolle der Zielinteraktion, bevorzugt. Alternativ oder zusätzlich ist
die Verwendung des LYS2-Gens, funktionsfähig unter der Kontrolle der
Nicht-Ziel-Interaktion,
besonders bevorzugt.
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In
einer alternativen Ausführungsform
stehen mehrfache Reportergene auf funktionsfähige Weise unter der Kontrolle
der Zielinteraktion, wobei diese Reportergene mindestens ein gegenselektierbares
Reportergen und mindestens ein ein Fluoreszenzprotein kodierendes
Gen umfassen, so dass die Detektion es umfasst, diejenigen Zellen
zu identifizieren, die wachsen oder überleben und nicht fluoreszieren
oder im Vergleich zu der Situation bei Expression des Reportergens
eine verringerte Fluoreszenz zeigen, wenn das Reportergen nicht
exprimiert wird.
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Auf ähnliche
Weise können
mehrfache Reportergene in funktionsfähiger Weise unter die Kontrolle
der Nicht-Ziel-Interaktion gestellt werden, und diese Gene umfassen
mindestens ein gegenselektierbares Reportergen und mindestens ein
Gen, das ein Fluoreszenzprotein kodiert.
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Der
Fachmann weiß,
wie er ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand genetische Sequenzen,
die solche Reportermoleküle
kodieren, zur Ausführung
der hier beschriebenen Erfindung verwenden kann. Z. B. kann die
kodierende Sequenz des ein solches Reportermolekül kodierenden Gens in Übereinstimmung
mit bekannten Präferenzen
bei der Verwendung von Codons zur Verwendung in der Zelllinie von
Interesse (z. B. Menschenzellen, Hefezellen) angepasst werden. Weiterhin
kann die Translationseffizienz von aus nicht-eukaryontischen Quellen
gewonnenen mRNAs erhöht
werden, indem man die entsprechenden Gensequenzen mutiert oder auf
andere Weise in dieses Gen eine Kozak-Translationsinitiations-Konsensussequenz
einführt
(Kozak, 1987).
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Um
die Reportergenexpression mit der Zielinteraktion oder umgekehrt
mit der Nicht-Ziel-Interaktion
zu verbinden, sollte das Reportergen eine oder mehrere cis-wirksame
Sequenzen umfassen, an die sich einer der Bindungspartner dieser
Interaktion binden oder anlagern kann. Solche Merkmale sind dem
Fachmann bekannt.
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Die
cis-wirksame Sequenz der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion
ist vorzugsweise ausgewählt
unter dem LexA-Operator, der GAL4-Bindungsstelle und dem cl-Operator.
In Übereinstimmung
mit dieser Ausführungsform
der Erfindung ist es für
einen Bindungspartner, der eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, bevorzugt, imstande
zu sein, an diese cis-wirksame Sequenz zu binden, in welchem Fall
diese DNA-Bindungsdomäne
ausgewählt
ist unter der LexA-Operator-Bindungsdomäne, der GAL4-DNA-Bindungsdomäne und der cl-Operator-Bindungsdomäne.
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Der
Fachmann weiß,
dass die Expression einer Entität
in einer Zelle es erfordert, Nukleinsäure in funktionsfähiger Weise
mit einer in der Zelle funktionsfähigen Promotorsequenz zu verbinden.
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Wird
hier auf einen „Promotor" Bezug genommen,
so ist dies im weitesten Sinne zu verstehen und umfasst die Transkriptionsregulationssequenzen
eines klassischen genomischen Gens einschließlich der TATA-Box, die zur
präzisen
Transkriptionsinitiation in Eukaryontenzellen erforderlich ist,
mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz und zusätzliche regulatorische Elemente
(z. B. stromaufwärts
gelegene aktivierende Sequenzen, Enhancer und Silencer). Promotoren
können
auch eines TATA-Box-Motivs ermangeln, jedoch ein oder mehrere „Initiatorelemente" umfassen oder, wie
es bei aus Hefe gewonnenen Promotorsequenzen der Fall ist, eine
oder mehrere stromaufwärts
gelegene Aktivatorsequenzen oder „UAS"-Elemente (upstream activator sequences)
umfassen. Zur Expression in prokaryontischen Zellen, wie z. B. Bakterien,
sollte der Promotor mindestens die -35-Box- und -10-Box-Sequenzen
enthalten.
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Ein
Promotor ist normalerweise stromaufwärts oder 5'-wärts
von einem Strukturgen gelegen, dessen Expression er reguliert. Weiterhin
liegen die einen Promotor umfassenden regulatorischen Elemente normalerweise
in einem Bereich von etwa 2 kb um die Transkriptionsinitiationsstelle
des Gens.
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Im
gegenwärtigen
Kontext wird der Begriff „Promotor" auch verwendet,
um ein synthetisches Molekül oder
ein Fusionsmolekül
oder ein Derivat davon zu beschreiben, das die Expression des jeweiligen
Reportermoleküls
in einer Zelle vermittelt, aktiviert oder steigert.
-
Promotoren
können
zusätzliche
Kopien von einem oder mehreren spezifischen regulatorischen Elementen
enthalten, um die Expression des Gens weiter zu steigern und/oder
die räumliche
Expression und/oder die zeitliche Expression zu verändern. Beispielsweise
können
regulatorische Elemente, die die gesteigerte Expression eines Gens
durch Galaktose oder Glukose oder Kupfer erleichtern, angrenzend
an eine heterologe Promotorsequenz, die die Expression des Gens
antreibt, platziert sein. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Promotoren,
die regulatorische Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfassen,
zur Titration der Expression von einem oder mehreren Bindungspartnern
in Reaktion auf Galaktose bzw. Kupfer in dem Kulturmedium, in dem
die Wirtszelle wächst,
verwendet.
-
Ein
Gen in funktionsfähiger
Weise unter die Kontrolle einer Promotorsequenz zu stellen, bedeutet,
dieses Gen so zu positionieren, dass seine Expression von der Promotorsequenz
kontrolliert wird. Promotoren sind im Allgemeinen 5'-wärts (stromaufwärts) der
Gene, die sie kontrollieren, gelegen. Bei der Konstruktion heterologer
Promotor/Strukturgen-Kombinationen ist es allgemein bevorzugt, den
Promotor in einer Entfernung von der Transkriptionsinitiationsstelle
des Gens zu positionieren, die ungefähr der Entfernung zwischen
diesem Promotor und dem Gen, das es in seinem natürlichen
Kontext kontrolliert, das heißt,
dem Gen, von dem der Promotor gewonnen ist, gleicht. Wie im Stand
der Technik beschrieben, wird eine gewisse Variation dieser Entfernung
ohne Verlust der Promotorfunktion toleriert. In ähnlicher Weise wird die bevorzugte
Position eines regulatorischen Sequenzelements im Bezug auf ein
heterologes Gen, das unter seine Kontrolle gestellt werden soll,
durch die Position des Elements in seinem natürlichen Kontext, d. h. durch
die Gene, von denen es gewonnen ist, definiert. Wiederum kann, wie
im Stand der Technik beschrieben, eine gewisse Variation dieser Entfernung
eintreten.
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Zu
Beispielen für
Promotoren, die zur Regulation der Expression des Reportermoleküls und/oder
des Kandidatenpeptids und/oder eines proteinösen Bindungspartners geeignet
sind, gehören
Virus-, Pilz-, Hefe-, Insekten-, Tier- und Pflanzenpromotoren, insbesondere
solche, die die Expression in einer eukaryontischen Zelle vermitteln
können,
wie z. B. in einer Hefezelle oder einer Säugerzelle.
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Zu
den besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Promotoren gehören diejenigen
natürlich
vorkommenden synthetischen Promotoren, die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren
enthalten, besonders bevorzugt für
Helix-Schleife-Helix-Transkriptionsfaktoren, Zinkfingerproteine,
Leucin-Reißverschlussproteine und
dergleichen. Bevorzugte Promotoren können auch synthetische Sequenzen
sein, die eine oder mehrere stromaufwärts gelegene Operatorsequenzen
umfassen, wie z. B. LexA-Operatorsequenzen oder von irgendeinem
der hier erwähnten
Promotoren abgeleitete aktivierende Sequenzen wie z. B. GAL4-DNA-Bindungsstellen.
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Der
Fachmann erkennt, dass die Auswahl des Promotors von der Natur der
zu transformierenden Zelle und dem zu exprimierenden Molekül abhängt. Der
Fachmann ist ohne weiteres imstande, für Zelltypen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren
durchgeführt
wird, funktionale Kombinationen von Minimalpromotorsequenzen und
-Operatoren zu bestimmen.
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Obwohl
die Erfindung vorzugsweise in Hefezellen durchgeführt wird,
ziehen die Erfinder eindeutig auch Abwandlungen in Betracht, bei
denen die Erfindung vollständig
in Bakterien- oder
Säugerzellen
durchgeführt
wird, wobei sie geeignete, darin funktionsfähige Promotoren verwenden,
um die Expression der verschiedenen Assay-Bestandteile in solchen
Zellen anzutreiben. Solche Ausführungsformen
liegen innerhalb der Reichweite des Fachmanns.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist der Promotor ein Hefepromotor, ein Säugerpromotor, ein Bakterienpromotor
oder ein Bakteriophagenpromotor, ausgewählt unter den Promotorsequenzen von
MYC, GAL1, CUP1, PGK1, ADH1, ADH2, PHO4, PHO5, HIS4, HIS5, TEF1,
PRB1, GUT1, SPO13, CMV, SV40, LAC, TEF, EM7, SV40 und T7.
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Zur
Expression in Säugerzellen
ist es bevorzugt, wenn der Promotor die CMV-Promotorsequenz ist, insbesondere bevorzugt
der CMV-IE-Promotor, oder alternativ der SV40-Promotor und insbesondere die späte Promotorsequenz
von SV40. Diese Promotoren und andere zur Expression von Genen in
Säugerzellen
geeignete Promotorsequenzen sind im Stand der Technik beschrieben.
-
Zu
den Beispielen für
die Säugerzellen,
die hier als zur Expression geeignet betrachtet werden, gehören COS,
VERO, HeLa, Maus-C127, Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO),
WI-38, embryonale Hamsterniere (BHK) oder MDCK-Zelllinien und andere.
Solche Zelllinien sind dem Fachmann ohne weiteres verfügbar.
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Das
Erfordernis zur Herstellung intakter Polypeptide in Bakterienzellen
und insbesondere in Escherichia coli-Zellen ist die Verwendung eines
starken Promotors mit einer wirksamen Ribosomen-Bindungsstelle, wie
z. B. einer Shine-Dalgarno-Sequenz, die in Expressionsvektoren,
die die erste und zweite Nukleotidsequenz tragen, oder in andere
genetische Konstrukte, die zur Ausführung der verschiedenen alternativen
Ausführungsformen
der Erfindung verwendet werden, eingebaut werden kann. Zu den typischen
zur Expression in Bakterienzellen wie z. B. E. coli geeigneten Promotoren
gehören
der lacz-Promotor, die temperatursensitiven λL- oder λR-Promotoren,
der T7-Promotor oder der IPTG-induzierbare tac-Promotor, ohne darauf
beschränkt
zu sein. Eine Anzahl anderer Vektorsysteme zur Expression von Nukleinsäure in E.
coli sind im Stand der Technik gut beschrieben und z. B. in Ausubel
et al. (1987) oder Sambrook et al. (1989) dargestellt. Zahlreiche
Quellen für
zur Expression in Bakterien geeignete Sequenzen sind auch in verschiedenen
Vektorkonstrukten allgemein verfügbar,
wie z. B. pKC30 (λL: Shimatake und Rosenberg, 1981), pKK173-3
(tac: Amann und Brosius, 1985), pET- 3 (T7: Studier und Moffat, 1986) oder
der pQE-Expressionsvektorserie (Quiagen, CA) und anderen.
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Wenn
es beabsichtigt ist, dass der Promotor die Expression des Reportermoleküls reguliert,
ist es besonders bevorzugt, dass der Promotor eine oder mehrere
Erkennungssequenzen für
die Bindung einer DNA-Bindungsdomäne umfasst, die von einem Transkriptionsfaktor
abgeleitet sind, z. B. eine GAL4-Bindungsstelle oder eine LexA-Operatorsequenz.
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In Übereinstimmung
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
werden die die oben genannten Komponenten exprimierenden Wirtszellen
unter Bedingungen kultiviert, die hinreichend sind, um es den Bindungspartnern
der Zielinteraktion mindestens zu erlauben, sich zu assoziieren.
Auch die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion können sich
unter solchen Bedingungen gegebenenfalls assoziieren. Jedoch unterscheiden
sich die Bildung der Zielinteraktion und die der Nicht-Ziel-Interaktion
kraft der funktionsfähigen
Verbindung der Zielinteraktion und der Nicht-Ziel-Interaktion mit
unterschiedlichen Reportergenen, die in Abhängigkeit von den verwendeten
Reportergenen gleichzeitig oder getrennt gemessen werden können. Z.
B. können
verschiedene gegenselektierbare Reportergene verwendet werden, um
die Ziel- und die Nicht-Ziel-Interaktion
zu messen, in welchem Fall diese Interaktionen anhand des Überlebens
oder Wachstums der Zellen auf bestimmten Substraten unterschieden
werden können.
Wie hier beispielhaft dargestellt, zeigen die gegenwärtigen Erfinder, dass
es möglich
ist, zwischen einer Zielinteraktion, die funktionsfähig sowohl
mit dem URA3- als auch mit dem CYH2-Gen verbunden ist, und einer
Nicht-Ziel-Interaktion, die mit dem LYS2-Gen verbunden ist, zu unterscheiden.
In dieser Ausführungsform
sind die Zellen, in denen die Zielinteraktion, aber nicht die Nicht-Ziel-Interaktion,
inhibiert wird, detektierbar, da sie gegenüber Fluororotsäure (5-FOA)
und Cycloheximid resistent sind, kein Lysin für ihr Wachstum benötigen und/oder
gegen ihr Wachstum auf α-Aminoadipat
(α-AA) enthaltenden
Medien empfindlich sind. Umgekehrt sind Zellen, in denen die Zielinteraktion,
aber nicht die Nicht-Ziel-Interaktion die Reportergenexpression
aktiviert, detektierbar, da sie gegenüber Fluororotsäure (5-FOA)
und Cycloheximid empfindlich sind, für ihr Wachstum exogenes Lysin
benötigen
und/oder gegenüber
Wachstum auf α-Aminoadipat
(α-AA) enthaltenden
Medien resistent sind. In ähnlicher
Weise haben die gegenwärtigen
Erfinder gezeigt, dass es möglich
ist, vermittelst einer Detektion der verschiedenen Emissionswellenlängen der
exprimierten Proteine zwischen einer Zielinteraktion und Nicht-Ziel-Interaktion,
die funktionsfähig
mit verschiedenen Fluoreszenzproteinen kodierenden Reportergenen
verbunden sind, zu unterscheiden. Jedoch erfordert das erfindungsgemäße Verfahren,
dass mindestens ein Reportergen unter der Kontrolle der Ziel- oder
der Nicht-Ziel-Interaktion ein gegenselektierbares Reportergen ist.
-
Da
die beispielhaft dargestellten Reportergene für die Nicht-Ziel-Interaktionspaare
LYS2 und CobA sind (1–4), wird
die durch Blockade erreichte Spezifität der Inhibition dadurch bestimmt,
dass man Klone aus dem primären
Screening auf Medien, denen Lysin fehlt, replikaplattiert und unter
Anregung mit UV-Licht auf die Gegenwart roter Fluoreszenz testet,
was die fehlende Inhibition der Zielinteraktion anzeigt. Die „Interaction-mating-Technik" von Finley und Brent
(1994) kann verwendet werden, um schnell zu bestimmen, ob aus dem
oben genannten Screening isolierte Peptidinhibitoren für die Zielinteraktion
spezifisch sind. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändiger,
weil er die Rückgewinnung
des Kandidatenpeptidinhibitorplasmids aus dem diploiden Stamm und
seine Rücktransformation
in den haploiden Stamm vom geeigneten Paarungstyp, dem das ursprüngliche
Köderplasmid
fehlt, erfordert, bevor er mit Stämmen gepaart wird, der die spezifischen
Kontrollen enthält.
Ein Vorteil eines mit einer anderen DNA-Bindungsdomäne verbundenen endogenen Nicht-Ziel-Köders besteht
in der Fähigkeit,
die Spezifität
des Peptidaptamers für
eine bestimmte Interaktion direkt, in demselben Stamm, in dem der
Peptidinhibitor exprimiert wird, zu bestätigen. Diese Effizienzzunahme
ist für
Hochdurchsatzanwendungen der Technologie von Bedeutung.
-
Weiterhin
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
vorzugsweise Selektion und Wachstum der detektierten Zellen. Eine
solche Selektion kann auch auf der Detektion des/der verwendeten
Reportergen/s(e) aufgebaut werden, und sie kann unter Verwendung
von im Stand der Technik anerkannten Prozeduren ohne weiteres durchgeführt werden.
Kulturverfahren zur Haltung von Bakterien-, Hefe- oder Säugerzellen
sind gleichfalls aus dem Stand der Technik wohlbekannt.
-
Die
das Kandidatenpeptid, ein oder mehrere Reportergene oder einen oder
mehrere Bindungspartner kodierende Nukleinsäure ist vorzugsweise in einem
Vektor enthalten, der ausgewählt
ist unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4
(SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5);
pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11
(SEQ ID NO:8); pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9) und pRT2 (SEQ ID NO:10).
Noch bevorzugter ist es, wenn eine das Kandidatenpeptid kodierende
Nukleinsäure
in dem in einem der SEQ ID NOs: 1 bis 9 dargestellten Vektor enthalten
ist; eine Nukleinsäure,
die bis zu drei der Bindungspartner kodiert, in pBLOCK-3.11 (SEQ
ID NO:8) enthalten ist; und eine zwei Fluoreszenzreportergene kodierende
Nukleinsäure
in dem Vektor pRT2 (SEQ ID NO:10) enthalten ist.
-
In
einer alternativen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
den weiteren Schritt, in den zellulären Wirt ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle einzuführen, die einen
oder mehrere Polypeptidbindungspartner kodieren, die an der Interaktion
beteiligt sind, funktionsfähig unter
die Kontrolle eines oder mehrerer geeigneter Promotorsequenzen gestellt.
Demgemäß kann das
erfindungsgemäße Verfahren
abgewandelt werden, indem man in den zellulären Wirt eine oder mehrere
Nukleinsäuren
einführt,
die ausgewählt
sind unter:
- (i) einer Nukleinsäure, die
in exprimierbarem Format einen Bindungspartner der Zielinteraktion
kodiert;
- (ii) einer Nukleinsäure,
die in einem exprimierbaren Format einen Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion
kodiert;
- (iii) einer Nukleinsäure,
die in exprimierbarem Format das Kandidatenpeptid kodiert;
- (iv) einer Nukleinsäure,
die in exprimierbarem Format eine cis-wirksame Sequenz und ein Reportergen
umfasst; und
- (v) einer Nukleinsäure,
die in exprimierbarem Format eine cis-wirksame Sequenz und ein gegenselektierbares
Reportergen umfasst.
-
Zu
den Verfahren zur Einfügung
der Nukleinsäure
in den zellulären
Wirt gehört
die Konjugation derjenigen Zellen, die eine oder mehrere dieser
Nukleinsäuren
besitzen, so dass hinreichend Nukleinsäuren in einer einzelnen Zelle
kombiniert werden, um diejenigen Wirtszellen zu selektieren, die
wachsen oder überleben, wenn
die funktionsfähig
unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehenden gegenselektierbaren
Reportergene exprimiert werden. Alternativ können Standardverfahren der
Transformation oder Transfektion verwendet werden, um einzelne Gene
in die Zellen einzuführen.
In der Tat kann zu ihrer Einführung
jedes standardmäßige Verfahren
einschließlich
von Zellkonjugations-, Transformations- oder Transkriptionsverfahren
verwendet werden.
-
In
einer Ausführungsform
ist das erfindungsgemäße Verfahren
ein Verfahren zur Identifikation eines Peptids, das eine Zielinteraktion
zwischen zwei oder mehr Bindungspartnern in einer Hefezelle teilweise
oder vollständig
inhibiert, aber eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen einigen, aber
nicht allen dieser Bindungspartner nicht inhibiert, wobei diese
Methode die folgenden Schritte umfasst:
- (i)
Transformation einer Hefezelle mit einem Vektor ausgewählt unter:
pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-32 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (SEQ
ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9
(SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8);
und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9), wobei der Vektor weiterhin eine Nukleinsäure umfasst,
die ein auf inhibitorische Aktivität zu testendes Kandidatenpeptid
kodiert;
- (ii) Einführung
einer Nukleinsäure
in die so transformierte Hefezelle, kodierend: (a) die Bindungspartner
der Zielinteraktion, so dass sie auf funktionsfähige Weise die Expression eines
oder mehrerer gegenselektierbarer Reportergene oder fluoreszenzproteinkodierender
Reportergene in dem zellulären
Wirt kontrollieren, wobei die Expression durch Störung der
Zielinteraktion vollständig
oder teilweise inhibiert wird; und (b) die Bindungspartner der Nicht-Ziel-Interaktion,
so dass sie auf funktionsfähige
Weise die Expression eines oder mehrerer gegenselektierbarer Reportergene
oder fluoreszenzproteinkodierender Reportergene in dem zellulären Wirt
kontrollieren, wobei die Expression durch Störung der Nicht-Ziel-Interaktion
teilweise oder vollständig
inhibiert wird und wobei dieses Reportergen sich von dem oder den
unter Kontrolle der Zielinteraktion exprimiertem/exprimierten Reportergen
oder Reportergenen unterscheidet; wobei ein oder mehrere der funktionsfähig unter
der Kontrolle der Zielinteraktion oder der Nicht-Ziel-Interaktion
stehenden Reportergene gegenselektierbare Reportergene sind, die
dem zellulären
Wirt konditionale Letalität
vermitteln, und wobei zur Bestimmung der minimalen Konzentration
der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, damit das gegenselektierbare
Reportergen auf einem den Zelltod bewirkenden Niveau exprimiert
wird, die Expression von einem oder mehreren der Bindungspartner
in Abhängigkeit
von Galaktose oder Kupfer titriert wird, indem die Expression unter
die Kontrolle eines Promotors gestellt wird, der regulatorische
Elemente der GAL1- oder CUP1-Promotoren umfasst;
- (iii) Selektion der Rekombinanten;
- (iv) Wachstum der Rekombinanten unter Bedingungen, die ausreichend
sind, um die Expression jedes Reportergens bzw. aller Reportergene
in (a) von der Expression des Reportergens bzw. der Reportergene
in (b) zu unterscheiden; und
- (v) Detektion derjenigen Wirtszellen, in denen die Expression
des bzw. der funktionsfähig
unter der Kontrolle der Zielinteraktion stehende(n) Reportergens/Reportergene
teilweise oder vollständig
inhibiert wird, und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter
der Kontrolle der Zielinteraktion stehende(n) Reportergens/Reportergene
teilweise oder vollständig
inhibiert wird, und die Expression des bzw. der funktionsfähig unter
der Kontrolle der Nicht-Ziel-Interaktion stehenden Reportergens/Reportergene
nicht inhibiert wird, wobei die detektierten Zellen ein Peptid exprimieren,
das die Zielinteraktion teilweise oder vollständig inhibiert.
-
Die
fluoreszenzproteinkodierenden Reportergene werden vorzugsweise in
die Zelle eingeführt,
indem man die Zelle mit dem Vektor pRT2 (SEQ ID NO:10) transformiert.
-
Alternativ
oder zusätzlich
wird eine Nukleinsäure,
die einen oder mehrere der Bindungspartner der Zielinteraktion und/oder
der Nicht-Ziel-Interaktion kodiert, in die Zelle eingeführt, indem
man die Zelle mit einem Derivat eines Vektors transformiert, der
ausgewählt
ist unter pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4
(SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9
(SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8);
und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9), wobei dieses Derivat eine Nukleotidsequenz
umfasst, die den Bindungspartner kodiert.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine Nukleinsäure,
die bis zu drei Bindungspartner der Zielinteraktion und/oder der
Nicht-Ziel-Interaktion kodiert, in die Zelle eingeführt, indem
man die Zelle mit einem Derivat des Vektors pBLOCK-3.11 (SEQ ID
NO:9) transformiert, wobei dieses Derivat Nukleotidsequenzen enthält, die
diese Bindungspartner kodieren.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
außerdem den
Schritt, das dritte Nukleinsäuremolekül aus der
Wirtszelle zu isolieren, das Nukleinsäuremolekül zu sequenzieren und die von
ihm kodierte Aminosäuresequenz
zu gewinnen. Basierend auf der so gewonnenen Aminosäuresequenz
können
synthetische Peptide hergestellt werden. Techniken für solche
Verfahren sind unter anderem z. B. von Ausubel et al. (1987) beschrieben
worden. Der Fachmann ist mit solchen Techniken vertraut.
-
In
einer alternativen bevorzugten Ausführungsform werden aus solchen
Screenings isolierte hochspezifische Peptide, bevor man sie einer
Kultur von Eukaryontenzellen zuführt, exprimiert
oder alternativ synthetisiert. Die Wirkung eines solchen Peptids
auf die Expression einer Reihe von Genen oder auf die Entwicklung eines
Phänotyps
wird relativ zu Zellen, denen das Peptid fehlt, bestimmt. Beispielsweise
kann das Expressionsprofil der Zelle unter Verwendung von dem Fachmann
bekannter Microarray-Technologie kontrolliert werden. Demgemäß kann ein
unter Verwendung des erfindungsgemäßen verbesserten reversen n-Hybrid-Assays identifiziertes
inhibitorisches Peptid als dominant-negative Sonde für einen
genetischen Weg dienen. Solche Wege sperren sich normalerweise gegen
Analyse durch standardmäßige genetische
Mittel. Überdies
können die
Sonden die Validierung von Pharmakonrezeptorkandidaten oder die
Identifikation neuer Ziele unter Verwendung von Ersatzmarkern erleichtern.
-
Ein
Peptid kann durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert
werden, wobei die Peptide eine inhibitorische Aktivität gegenüber der
Zielinteraktion haben, gegenüber
der Nicht-Ziel-Interaktion
hingegen eine verringerte inhibitorische Aktivität oder keine inhibitorische
Aktivität.
Es kann eine pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt werden,
die das inhibitorische Peptid und einen pharmazeutisch akzeptablen
Trägerstoff
und/oder ein Verdünnungsmittel
umfasst.
-
Das
Peptid antagonisiert oder inhibiert vorzugsweise eine Interaktion,
die in eukaryontischen Zellen, insbesondere in Menschen- oder Tierzellen,
eine oder mehrere schädliche
Wirkungen hervorruft. Bevorzugter antagonisiert oder inhibiert das
Peptid Interaktionen, an denen ein oder mehrere Onkoproteine beteiligt
sind.
-
Erfindungsgemäß identifizierte
inhibitorische Peptide können
zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Menschen
oder Tieren verwendet werden. Dies kann ihre Verwendung in Peptidtherapie-Schemata
wie z. B. in Behandlungsprotokollen für Patienten mit Leukämie und/oder
soliden Tumoren einschließen.
Ihre Verwendung in Behandlungsprotokollen für diese Patienten umfasst ihre
Verabreichung als Mittel zur Blockade der Zellteilung der malignen
Zellen, wobei z. B. auf das SCL-Onkoprotein gezielt wird, um die maligne
Zellteilung des Patienten zu stoppen. Die spezifische Ansteuerung
von Onkoproteinen durch Arzneimittel, die diese Peptide enthalten,
verringert die von den Patienten erlebten Nebenwirkungen im Vergleich
zu denjenigen, die mit konventioneller Chemotherapie erlebt werden.
-
Solche
inhibitorischen Peptide können
auch verwendet werden, um andere Störungen zu behandeln, die sich
aus schädlicher
Expression aberranter biologischer Moleküle ergeben, die die normalen
zellulären Funktionen
beeinträchtigen.
-
Zu
den für
die Injektion geeigneten Arzneimittelformen gehören sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder
Dispersionen und sterile Pulver zur Ad-hoc-Herstellung steriler
injizierbarer Lösungen
oder Dispersionen. Ferner können
sie die Form einer Salbe oder eine andere zur lokalen Anwendung
geeignete Form haben. Alternativ können injizierbare Lösungen in
Liposomen verkapselt zugeführt
werden, um ihren Transport durch die Zellmembran zu unterstützen. Alternativ
oder zusätzlich
können
solche Zubereitungen Bestandteile selbstorganisierender Porenstrukturen
enthalten, um den Transport durch die Zellmembran zu erleichtern.
Sie müssen
unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein, um
den Transport durch die Zellmembran zu erleichtern. Sie müssen unter
Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und gegen die
kontaminierenden/destruktiven Wirkungen von Mikroorganismen, wie
z. B. Bakterien und Pilzen, konserviert sein. Der Träger kann
ein Lösungsmittel
oder Dispersionsmedium sein, das z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (z.
B. Glycerol, Polypropylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und
dergleichen), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle enthält. Die
richtigen Fließeigenschaften
können
erhalten werden, indem man z. B. eine Beschichtung wie z. B. Lecithin
verwendet bzw. durch die erforderliche Partikelgröße im Fall
einer Dispersion und durch oberflächenaktive Substanzen. Die
Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
wird erreicht, indem man antibakterielle und/oder Antipilzmittel
zusetzt, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbitsäure, Thimerosal
und dergleichen. In vielen Fällen
ist es bevorzugt, isotonische Mittel einzubeziehen, z. B. Zucker
oder Natriumchlorid. Eine verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden,
indem man in den Zusammensetzungen absorptionsverzögernde Mittel
verwendet. z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
-
Sterile
injizierbare Lösungen
werden hergestellt, indem man die aktiven Substanzen in den erforderlichen
Mengen mit verschiedenen anderen der oben genannten Inhaltsstoffe,
wie erforderlich, einem geeigneten Lösungsmittel zusetzt, gefolgt
von Filtersterilisation. Dispersionen werden grundsätzlich hergestellt,
indem man die verschiedenen sterilisierten aktiven Inhaltsstoffe
einem sterilen Exzipienten zusetzt, der das grundlegende Dispersionsmedium
und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe unter den oben aufgezählten enthält. Im Fall
steriler Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind
die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung,
um ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs zusätzlich beliebiger gewünschter
Zusatzinhaltsstoffe aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung zu
erhalten.
-
Wenn
die aktiven Inhaltsstoffe angemessen geschützt sind, können sie oral verabreicht werden,
z. B. mit einem inerten Verdünnungsmittel
oder einem essbaren Trägerstoff,
oder sie können
in Hart- oder Weichgelatinekapseln eingeschlossen, zu Tabletten
komprimiert oder direkt dem Nahrungsmittel der Diät zugesetzt sein.
Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Substanz
mit Exzipienten vermischt sein und in Form von schluckbaren Tabletten,
Buccaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Waffeln
und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen
sollten mindestens 1 Gew.-% an aktiver Substanz enthalten. Der prozentuale
Anteil an den Zusammensetzungen und Zubereitungen kann natürlich variiert
werden und kann passenderweise von etwa 5 bis etwa 80 Gew.-% der
Einheit betragen. Die Menge der aktiven Verbindung in solchen therapeutisch
verwendbaren Zubereitungen ist so, dass eine geeignete Dosierung
erreicht wird. Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen oder Zubereitungen
werden so hergestellt, dass eine Einzeldosisform zwischen ungefähr 0,1 μg und 20
g der aktiven Substanz enthält.
-
Die
Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch
Bindemittel enthalten wie z. B. Gummi, Akaziengummi, Maisstärke oder
Gelatine. Sie können
auch einen Exzipienten wie z. B. Dicalciumphosphat enthalten. Sie
können
auch ein Zerfallmittel wie z. B. Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen
enthalten. Sie können
auch ein Schmiermittel wie z. B. Magnesiumstearat enthalten. Sie
können auch
ein Süßmittel
wie z. B. Saccharose, Lactose oder Saccharin enthalten. Sie können ein
Geschmacksmittel wie z. B. Pfefferminz, Immergrünöl oder Kirschenaroma enthalten.
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Wenn
die Einzeldosisform eine Kapsel ist, kann sie, zusätzlich zu
den Stoffen oben genannter Art, einen flüssigen Trägerstoff enthalten. Verschiedene
andere Materialien können
als Beschichtungen vorliegen oder zu anderweitigen Modifikationen
der physikalischen Form der Dosiseinheit. Z. B. können Tabletten,
Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beiden beschichtet
sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Substanz, Saccharose
als Süßmittel,
Methyl- und Propylparaben als Konservierungsmittel, einen Farbstoff
und Geschmacksstoffe, wie z. B. Kirschen- oder Orangenaroma, enthalten.
Natürlich
sollte jedes zur Herstellung irgendeiner Einzeldosisform verwendete
Material von pharmazeutischer Reinheit und in den verwendeten Mengen
im Wesentlichen ungiftig sein. Überdies
ist es möglich,
die aktive(n) Substanz(en) in Retardzubereitungen und -formulierungen
zu inkorporieren.
-
Zu
den Formen, die sich zur lokalen Anwendung eignen, gehören z. B.
Salben, Lotionen und Gele.
-
Zu
den pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln
gehören
beliebige und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Beschichtungen, gegen Bakterien und/oder Pilze
wirksame Substanzen, Isotonisierungsmittel, Absorptionsverzögerer und
dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch
wirksame Substanzen ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Ihre
Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen wird in Betracht
gezogen, ausgenommen soweit irgendwelche herkömmlichen Medien oder Mittel
mit den aktiven Inhaltsstoffen inkompatibel sind. Auch ergänzende aktive Inhaltsstoffe
können
in die Zusammensetzungen mit einbezogen werden.
-
Es
ist im Interesse einer leichten Verabreichung und einheitlichen
Dosierung besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in
Einzeldosisform zu formulieren. Der Begriff „Einzeldosisform" bezeichnet hier
eine physisch eigenständige
Einheit, die als Einzeldosierung für die zu behandelnden Säuger geeignet
ist, wobei jede einzelne Einheit eine vorher festgelegte Menge aktiven
Materials enthält,
die berechnet ist, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen
Trägerstoff
den gewünschten
therapeutischen Effekt hervorzurufen. Die erfindungsgemäßen Einzeldosisformen
werden diktiert und hängen
direkt ab von (a) den individuellen Charakteristika des aktiven
Stoffs und dem speziellen zu erreichenden therapeutischen Effekt
und (b) den Begrenzungen, die der Kunst innewohnen, solch ein aktives
Material zur Behandlung einer Krankheit bei Lebewesen zuzubereiten,
die einen Krankheitszustand haben, in dem die körperliche Gesundheit, wie nachfolgend
detailliert offenbart, beeinträchtigt
ist.
-
Der
aktive Hauptinhaltsstoff wird zur bequemen und wirksamen Verabreichung
in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen
Träger
in Einzeldosisform vermischt. Eine Einzeldosisform kann den aktiven
Inhaltsstoff z. B. in Mengen im Bereich von 0,5 μg bis ungefähr 2000 mg enthalten. In Anteilen ausgedrückt, liegt
die aktive Substanz im Allgemeinen mit von 0,5 μg bis ungefähr 2000 mg pro ml Trägerstoff vor.
Im Fall von Zusammensetzungen, die ergänzende aktive Inhaltsstoffe
enthalten, werden die Dosierungen durch Bezug auf die normale Dosis
und Art der Verabreichung der Inhaltsstoffe festgelegt.
-
Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann auch genetische Moleküle umfassen,
wie z. B. einen Vektor, der imstande ist, Zielzellen zu transfizieren,
wobei dieser Vektor ein Nukleinsäuremolekül trägt, das
imstande ist, solche schädlichen
biologischen Interaktionen zu inhibieren. Der Vektor kann z. B.
ein viraler Vektor sein.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann einen Vektor zur Expression von einem oder mehreren Peptiden
und/oder Bindungspartnern in einer prokaryontischen oder eukaryontischen
Zelle einsetzen, wobei der Vektor die Merkmale eines Vektors enthält, der
ausgewählt
ist unter: pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4
(SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5);
pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7); pBLOCK-3.11
(SEQ ID NO:8); und pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9). Die spezifischen Merkmale
solcher Shuttle-Vektoren gehen für
den Fachmann aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung und
den dazugehörigen
Zeichnungen und dem Sequenzprotokoll hervor.
-
Das
Verfahren kann weiterhin einen Vektor zur Expression multipler Fluoreszenzreportergene
in einer Hefezelle verwenden, wobei dieser Vektor umfasst:
- (i) eine ein grünes Fluoreszenzprotein exprimierende
Kassette, umfassend das gfp-Gen,
auf funktionsfähige
Weise unter der Kontrolle eines in Hefe funktionsfähigen chimären LexA/GAL1-Promotors
mit mehrfachen LexA-Operatorstellen stehend; und
- (ii) eine ein rotes Fluoreszenzprotein exprimierende Kassette,
umfassend das cobA-Gen,
auf funktionsfähige
Weise unter der Kontrolle eines in Hefe funktionsfähigen chimären cl/GAL1-Promotors
mit mehrfachen cl-Operatorstellen stehend.
-
Die
spezifischen Merkmale solch eines Vektors gehen für den Fachmann
aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung und den dazugehörigen Zeichnungen
und dem Sequenzprotokoll hervor.
-
Aus
der Beschreibung hier geht hervor, dass die Wirksamkeit beliebiger,
durch das erfindungsgemäße reverse
n-Hybrid-Screening identifizierter Peptide auf verschiedene Weisen,
grundsätzlich
durch einen Vergleich der Wirkung der Peptide auf Zielzellen von
Interesse, überprüft werden
kann. Z. B. wird die ausschließliche
Rückgewinnung
von Hefepeptidbibliotheksplasmiden aus positiven blockierenden Klonen
schnell erreicht, indem man in Bakterien auf den einzigartigen Marker
auf den pBLOCK-Vektor (z. B. die Blasticidin-Resistenz) selektiert.
Die das Peptid kodierende DNA kann dann sequenziert werden. Für aus sequenzierten
natürlichen
Genomen gewonnene Peptidbibliotheken ist es nicht notwendig, den
inhibitorischen Peptidklon zu sequenzieren. Statt dessen werden
die positiven Klone lediglich, z. B. automatisch, in Master-Stocks übertragen, und
die peptidkodierenden DNA-Inserts werden unter Verwendung von PCR
amplifiziert, um Proben zu erhalten, die mit Oligonukleotid-Mikroarrays
hybridisiert werden können.
Solche Arrays repräsentieren
die gesamten Genome, die verwendet wurden, um die Bibliothek herzustellen.
Die genomische Position eines gegebenen Kandidaten für einen
Blocker kann dann durch Bezug auf die Koordinaten des DNA-Mikroarrays
abgeleitet werden. Die rückgewonnene
DNA wird dann in einer geeigneten Zelllinie exprimiert, um ihre
Wirkung auf den Phänotyp
oder das Expressionsprofil der Zelle zu bestimmen. Eine solche Information
ist nützlich,
um die inhibitorische Aktivität,
therapeutische Aktivität
oder prophylaktische Aktivität
des Peptids in vivo zu bestätigen, oder
um neue Bindungspartner oder pharmazeutische Ziele in den gleichen
biochemischen bzw. Signalübertragungs-Wegen
wie der Partner der Zielinteraktion zu identifizieren.
-
Demgemäß kann ein
Verfahren zur Bestimmung der Wirkung eines Peptids für eine eukaryontische Zelle
umfassen:
- (i) Isolation einer Nukleotidsequenz,
die einen durch das hier beschriebene Verfahren identifizierten
Peptidinhibitor kodiert;
- (ii) Transfektion der eukaryontischen Zelle mit der isolierten
Nukleinsäure;
und
- (iii) Vergleich des Phänotyps
oder Expressionsmusters der transfizierten eukaryontischen Zelle
mit dem Phänotypen
oder Expressionsmuster einer ansonsten isogenen nicht-transfizierten
Zelle, wobei ein abweichender Phänotyp
oder ein abweichendes Expressionsmuster zeigt, dass das Peptid eine
Wirkung auf die Zelle hat.
-
Vorzugsweise
wird solch ein Verfahren an einer Säugerzelle durchgeführt.
-
Das
Expressionsmuster der transfizierten eukaryontischen Zelle kann
mit dem Expressionsmuster einer ansonsten isogenen nicht-transfizierten
Zelle verglichen werden, indem man ein Array von Proteinen oder Nukleinsäuren herstellt,
die von den transfizierten und von den nicht-transfizierten Zellen
exprimiert werden, und diese Proteine oder Nukleinsäuren vergleicht.
Array-Technologien bieten einen beträchtlichen Vorteil, indem sie
schnelle Hochdurchsatz-Messreihen
von Daten liefern, was die Identifikation neuer Bindungspartner für das inhibitorische
Peptid erleichtert, wobei diese Bindungspartner Nukleinsäure oder
Proteine sein können. Weiterhin
können
die neuartigen Bindungspartner auch zuvor unbekannte Bindungspartner
für einen
oder mehrere der Bindungspartner der Zielinteraktion, gemessen in Übereinstimmung
mit dem hier beschriebenen erfinderischen Verfahren, sein.
-
Weiterhin
ist, wenn dieses Verfahren an einer erkrankten Zelle, wie zum Beispiel
einer Leukämiezelle oder
einer anderen Krebszelle, durchgeführt wird, die aus dem modifizierten
Expressionsmuster der transfizierten Zelle oder dem modifizierten
Phänotyp
dieser Zelle gewonnene Information nützlich, um neue prophylaktische
oder therapeutische Pharmaka zu entwerfen. Insbesondere kann die
Fähigkeit
eines bestimmten Peptids, den erkrankten Phänotyp (z. B. tumorösen Phänotyp) teilweise
oder vollständig
zu revertieren oder korrigieren, bestimmt werden.
-
Demgemäß kann ein
Verfahren zur Identifikation eines Peptids zur prophylaktischen
oder therapeutischen Behandlung eines Säugers die folgenden Schritte
umfassen:
- (i) Isolation einer Nukleotidsequenz,
die einen durch das hier beschriebene Verfahren identifizierten
Peptidinhibitor kodiert;
- (ii) Transfektion der eukaryontischen Zelle mit der isolierten
Nukleinsäure;
- (iii) Vergleich des Phänotyps
oder Expressionsmusters der transfizierten eukaryontischen Zelle
mit dem Phänotyp
oder Expressionsmuster einer ansonsten isogenen nicht-transfizierten
Zelle, wobei ein abweichender Phänotyp
oder ein abweichendes Expressionsmuster zeigt, dass das Peptid eine
Wirkung auf die Zelle hat; und
- (iv) Selektion eines Peptids, das den Phänotyp oder das Expressionsprofil
der transfizierten Zelle revertiert.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
1 ist
eine schematische Darstellung eines verallgemeinerten reversen 2-Hybrid-Screenings für Peptide,
die spezifisch die Interaktion zwischen zwei hypothetischen Proteinen
(in der Figur als X und Y bezeichnet) antagonisieren, jedoch die
Interaktionen zwischen einem dieser hypothetischen Proteine (in
der Figur als X bezeichnet) und einem anderen hypothetischen Protein
(in der Figur als Z bezeichnet) nicht blockieren.
-
Feld
A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Abwesenheit des Antagonismus der X/Y-Zielinteraktion
und der X/Z-Nicht-Zielinteraktion. Die „Beute" (in der Figur als „Beute-X" plus „AD" bezeichnet) sowohl für die Zielinteraktion
(obere beide Reihen) als auch die Nicht-Zielinteraktion (untere
Reihe) umfasst das als Fusionsprotein mit der Aktivationsdomäne (AD)
eines Transkriptionsfaktors exprimierte Protein X. Der „Köder" für die Zielinteraktion
(obere beide Reihen) umfasst ein Fusionsprotein zwischen Protein
Y und der DNA-Bindungsdomäne
des LexA-Bindungsproteins (in der Figur „LexA-Y" bezeichnet). Die Reportergene für die Zielinteraktion
(obere beide Reihen) bestehen aus den chimären gegenselektierbaren Reportergenen
URA3 und CYH2 und dem das grüne
Fluoreszenzprotein kodierenden gfp-Gen („GFP"; Prasher et al., 1992; Chalfie et al.,
1994; Inouye und Tsuji, 1994), umfassend eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen
(LexAop), an die der Köder
binden kann. Der Nicht-Ziel-Köder
umfasst ein Fusionsprotein zwischen dem Protein Z und dem cl-Repressorprotein
(gepunktete Box, „cl-Z" markiert). Das Reportergen
für die Nicht-Ziel-Interaktion
besteht aus dem chimären
LYS2-Gen und dem chimären
cobA-Gen, von welchen jedes eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen
umfasst (gepunktete Boxen, „clop" markiert), an die
der Nicht-Ziel-Köder binden
kann. Das cobA-Gen kodiert ein rotes Fluoreszenzprotein (Wildt und
Deuschle, 1999). Schwarze Flaggen mit Totenschädel und gekreuzten Knochen
bezeichnen die Expression der gegenselektierbaren Reportergene.
Sonnensymbole bezeichnen die Expression der gfp- und cobA-Reportergene,
die grünes bzw.
rotes Fluoreszenzprotein exprimieren. Demgemäß ist der Hefestamm infolge
der aktivierenden Interaktion zwischen dem Ziel-Köder und
den Beute-Fusionsproteinen, die an eine LexA-Operatorstelle oder
-stellen der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 gebunden
sind, gegenüber
5-FOA und Cycloheximid empfindlich; und er ist für die Lysin-Biosynthese prototroph
infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und
dem Beute-Fusionsprotein, die an die cl-Operatorstellen (clop) des
LYS2-Reportergens gebunden sind, welche Prototrophie eine auxotrophe
LYS2-Mutation in
Hefe komplementieren kann. Der Stamm kann auch die gfp- und cobA-Gene
unter der Kontrolle verschiedener stromaufwärts gelegener Promotorelemente
exprimieren, und infolgedessen fluoresziert er bei Wellenlängen für grünes und/oder
rotes Licht. Die Aktivierung dieser nicht letalen Reportergene kann
verwendet werden, um die Stärke
der Reportergenaktivierung unter Verwendung von nicht gegenselektierbaren
Bedingungen zu quantifizieren.
-
Feld
B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (mit einem „Peptidinhibitor" bezeichneten Pfeil
markiertes Protein), das spezifisch die X/Y-Zielinteraktion (obere
beide Reihen), aber nicht die X/Z-Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe)
blockiert. Die Merkmale der Reportergen-Bindungspartner sind wie
oben beschrieben. Die Sonnensymbole bezeichnen die Expression des
cobA-Reportergens, das ein rotes Fluoreszenzprotein kodiert. Wie
dargestellt, verhindert das inhibitorische Peptid (Peptidinhibitor)
die Interaktion zwischen dem Köder
der Zielinteraktion (LexA-Y) und der Beute (Beute-X/AD), so dass
es in der Zelle keine Expression der gegenselektierbaren Reportergene
URA3 oder CYH2 oder des gfp-Reportergens der X/Y-Zielinteraktion
gibt. Demgemäß erlangt
der Hefestamm Resistenz gegenüber
5-FOA und Cycloheximid, aber fluoresziert nicht mehr grün. Weiterhin
kann das inhibitorische Peptid (Peptidinhibitor) die Interaktion
zwischen der Beute (Beute-X/AD) und dem Köder der Nicht-Ziel-Interaktion
(cl-Z) nicht inhibieren, und infolgedessen bleiben die Zellen für Lysin-Biosynthese
prototroph infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und
dem Beute-Fusionsprotein, die an die cl-Operatorstellen (clop) des
LYS2-Reportergens gebunden sind, welche Prototrophie eine auxotrophe
LYS2-Mutation in Hefe komplementieren kann. Außerdem exprimiert der Stamm
weiterhin das cobA-Gen und fluoresziert infolgedessen rot.
-
2 ist
eine schematische Darstellung eines reversen 2-Hybrid-Screenings
für Peptide,
die spezifisch die SCL/LMO2-Interaktion in Hefezellen antagonisieren,
die SCUE47-Interaktion jedoch nicht blockieren.
-
Feld
A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Abwesenheit eines Antagonismus der SCL/LMO2-Zielinteraktion
und der SCL/E47-Nicht-Ziel-Interaktion.
Die „Beute" sowohl für die Zielinteraktion
(obere Reihe) als auch für
die Nicht-Ziel-Interaktion
(untere Reihe) umfasst als Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne (Act)
eines Transkriptionsfaktors exprimiertes SCL (d. h. mit SCL und
Act markierte verbundene Boxen). Der „Köder" für
die Zielinteraktion (obere Reihe) umfasst ein Fusionsprotein zwischen
LMO2 und der DNA-Bindungsdomäne
des LexA-Proteins (d. h. „LMO2" und „LexA" markierte verbundene
Boxen). Die Reportergene für
die Zielinteraktion (obere Reihe) bestehen aus chimären URA3-
und CYH2-Genen, die eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfassen,
an die der Köder
binden kann. Der Nicht-Ziel-Köder
umfasst ein Fusionsprotein zwischen E47 (als E47 markierte Box)
und dem cl-Repressorprotein (als „cl" markierter Kreis). Das Reportergen
für die Nicht-Ziel-Interaktion
besteht aus einem chimären LYS2-Gen,
das eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen
umfasst, an die der Nicht-Ziel-Köder
binden kann. Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene.
Demgemäß ist der
Hefestamm infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Ziel-Köder und
dem an die LexA-Operatorstelle oder -stellen der gegenselektierbaren
Reportergene URA3 und CYH2 gebundenen Beute-Fusionsproteine gegenüber 5-FOA
und Cycloheximid empfindlich; und er ist infolge der aktivierenden
Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und dem an die cl-Operatorstelle
(clop) des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsprotein für die Lysin-Biosynthese
prototroph, welche Prototrophie eine auxotrophe LYS2-Mutation bei
Hefe komplementieren kann.
-
Feld
B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (Δ), das spezifisch
die SCL/LMO2-Zielinteraktion blockiert (obere Reihe), aber nicht
die SCL/E47-Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe). Die Merkmale
der Reportergene und Bindungspartner sind wie oben beschrieben.
Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Stumpfendige
Linien (}) bezeichnen die Abwesenheit einer detektierbaren Reportergenexpression.
-
Demgemäß ist nach
Einführung
eines inhibitorischen Peptidaptamers in die Zellen des Feldes A
der Phänotyp
des Stammes infolge der Inhibition der aktivierenden Interaktion
zwischen dem an die LexA-Operatorstelle(n) der gegenselektierbaren
Reportergene (URA3 und CYH2) gebundenen Zielköder und dem Beute-Fusionsprotein
in 5-FOA-resistent und Cycloheximid-resistent umgewandelt; und infolge
der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und dem an die cl-Operatorstelle
(clop) des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsprotein in prototroph für die Lysin-Biosynthese,
welche Prototrophie bei Hefe eine auxotrophe LYS2-Mutation komplementieren
kann, umgewandelt.
-
3 ist
eine schematische Darstellung eines reversen 2-Hybrid-Screenings
für Peptide,
die die SCL/LMO2-Interaktion in Hefezellen spezifisch antagonisieren,
die SCL/LMO1-Interaktion jedoch nicht blockieren.
-
Feld
A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Abwesenheit eines Antagonismus der SCL/LMO2-Zielinteraktion
und der SCL/E47-Nicht-Ziel-Interaktion.
Die „Beute" sowohl für die Zielinteraktion
(obere Reihe) als auch die Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe)
ist wie für 1 oben beschrieben.
Auch der „Köder" und die Reportergene
für die
Zielinteraktion (obere Reihe) und die Nicht-Ziel-Interaktion (untere
Reihe) sind wie für 1 oben
beschrieben. Der Nicht-Ziel-Köder
umfasst ein Fusionsprotein zwischen LMO1 („LMO1" markierte Box) und dem cl-Repressorprotein
(„cl" markierter Kreis).
Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Demgemäß ist der
Hefestamm infolge der aktivierenden Interaktion zwischen dem Ziel-Köder und
den an die LexA-Operatorstelle(n) der gegenselektierbaren Reportergene URA3
und CYH2 gebundenen Beute-Fusionsproteine empfindlich gegenüber 5-FOA
und Cycloheximid; und prototroph für die Lysin-Biosynthese infolge
der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den
an die cl-Operatorstellen (clop) des LYS2-Reportergens gebundenen
Beute-Fusionsproteinen, welche Prototrophie bei Hefe eine auxotrophische
Lys2-Mutation komplementieren kann.
-
Feld
B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (Δ), das spezifisch
die SCL/LMO2-Zielinteraktion (obere Reihe) blockiert, jedoch nicht die
SCL/LMO1-Nicht-Ziel-Interaktion (untere Reihe). Die Merkmale der
Reportergene und Bindungspartner sind wie oben und in der Legende
zu 1 beschrieben. Die Pfeile bezeichnen die Expression
der Reportergene. Stumpfendige Linien (}) bezeichnen ein Fehlen
detektierbarer Reportergenexpression. Demgemäß ist nach Einführung eines
inhibitorischen Peptidaptamers in die Zelle des Feldes A der Phänotyp des
Stammes in 5-FOA-resistent
und Cycloheximid-resistent umgewandelt, aufgrund der Inhibition
der aktivierenden Interaktion zwischen dem an die LexA-Operatorstelle(n)
der gegenselektierbaren Reportergene (URA3 und CYH2) gebundenen
Zielköder
und dem Beute-Fusionsprotein; prototroph für die Lysin-Biosynthese infolge
der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und
den an die cl-Operatorstelle (clop) der LYS2-Reportergene gebundenen
Beute-Fusionsproteinen, welche Prototrophie bei Hefe eine auxotrophe
LYS2-Mutation komplementieren kann.
-
4 ist
eine schematische Darstellung eines reversen 3-Hybrid-Screenings
für Peptide,
die spezifisch die Interaktion zwischen Nukleinsäuren und Proteinen in Hefezellen
inhibieren.
-
Feld
A zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Abwesenheit eines Antagonismus der Zielinteraktion.
Die Nicht-Ziel-Interaktion ist in der Figur nicht bezeichnet. Die „Beute" sowohl für die Zielinteraktion
(als auch für
jede Nicht-Ziel-Interaktion, nicht bezeichnet) ist ein RNA-bindendes Protein
(TAT), das als Fusionsprotein mit der Aktivatordomäne eines
Transkriptionsfaktors exprimiert wird. Das Assay verwendet zwei „Köder" für die Zielinteraktion,
umfassend die Folgenden: (i) ein hybrides MS2/TAR RNA-Molekül, das mindestens
die proteinbindenden Regionen der das MS2 Hüllprotein kodierenden RNA und der
TAR-kodierenden RNA, die an TAT bindet, umfasst; und (ii) ein Fusionsprotein
zwischen MS2 und der DNA-Bindungsdomäne des LexA-Proteins (d. h.
mit MS2 und LexA markierte verbundene Boxen). Die Reportergene für die Zielinteraktion
bestehen aus chimären
URA3 und CYH2-Genen, die eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen
umfassen, an die der Köder
binden kann. Der Nicht-Ziel-Köder
(nicht dargestellt) umfasst ein Fusionsprotein zwischen irgendeinem
anderen Protein, an das die MS2/TAR-Hybrid-RNA binden kann (entweder
durch den MS2-bindenden Nukleotidsequenzteil oder die TAT-bindende
Sequenz) und dem cl-Repressorprotein. Das Reportergen für die Nicht-Ziel-Interaktion
(nicht gezeigt) besteht aus einem chimären LYS2-Gen, das eine oder
mehrere cl-Operatorsequenzen umfasst, an die der Nicht-Ziel-Köder binden
kann. Die Pfeile bezeichnen die Expression der Reportergene. Demgemäß ist der
Hefestamm aufgrund der Interaktion zwischen den Ziel-Ködern (LexA/MS2-Protein
und MS2/TAR-RNA) und den Beute-Fusionsproteinen (d. h. der TAT-Aktivator-Fusion)
an den LexA-Operatorstelle(n)
gegenüber
5-FOA und Cycloheximid empfindlich, welche Interaktionen der Expression
der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 aktiviert. Überdies
ist der Stamm prototroph für
Lysin-Biosynthese aufgrund der Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und den an die cl-Operatorstellen
gebundene Beute-Fusionsproteine (nicht gezeigt), welche Interaktion
die Expression des LYS2-Reportergens aktiviert.
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Feld
B zeigt das erwartete Expressionsprofil und die Selektionsmerkmale
der Zelle in Gegenwart eines inhibitorischen Peptids (
),
das spezifisch die RNA/Protein-Zielinteraktion blockiert, aber nicht
die Nicht-Ziel-RNA/Protein-Interaktion (nicht dargestellt). Die
Merkmale der Reportergene und Bindungspartner sind wie oben beschrieben.
Stumpfendige Linien (}) bezeichnen ein Fehlen detektierbarer Reportergenexpression.
Demgemäß ist nach
Einführung
eines inhibitorischen Peptidaptamers in die Zelle des Feldes A der
Phänotyp
des Stammes infolge der Inhibition der aktivierenden Interaktion
zwischen dem Beute-TAT-Aktivator-Fusionsprotein und der Ziel-MS2/TAR-Köder-RNA
in 5-FOA-resistent und Cycloheximid-resistent umgewandelt, wobei
diese Inhibition die Expression der gegenselektierbaren Reportergene
(URA3 und CYH2) verhindert. Der Stamm ist auch prototroph für die Lysin-Biosynthese
infolge der fortgesetzten aktivierenden Interaktion zwischen den
Nicht-Ziel-Ködern
und dem Beute-Fusionsprotein an den cl-Operatorstellen des LYS2-Reportergens.
-
5 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1)
zur Expression eines Peptids in einer Zelle, umfassend:
- (i) eine Expressionskassette, umfassend: (a) einen Polylinker
mit Restriktionsschnittstellen für
EcoRI, Acc651, KpnI, MfeI, AgeI, RsrII, XmaI, SrfI, KspI und SacII
zur Einfügung
einer das Peptid kodierenden Nukleotidsequenz, wobei der Polylinker
an eine Sequenz angrenzt, die das V5-Epitop-Tag und die Kernlokalisierungssequenz
von SV40 (nicht gezeigt) kodiert, so dass ein das Peptid, das Epitop-Tag
und die Kernlokalisierungssequenz umfassendes Fusionspolypeptid
exprimiert werden kann; (b) die Tandempromotoren T7, ADH1 und CMV
zur Regulation der Expression des Polypeptids in Bakterien-, Hefe-
bzw. Säugerzellen;
und (c) eine Terminatorsequenz (ADH TT) zwischen dem Polylinker
und einer XbaI-Schnittstelle, distal von den Tandempromotoren;
- (ii) ein selektierbares Markergen (Bsd), das Hefe und Bakterien
Blasticidinresistenz vermittelt und auf funktionsfähige Weise
unter der Kontrolle von tandemförmigen
Hefe- und in Bakterien funktionsfähigen Promotoren TEF1 und EM7
steht und stromaufwärts
von dem in Hefe funktionsfähigen
Transkriptionsterminator CYC1 (CYC TT) liegt;
- (iii) ein selektierbares Markergen (Ampicillin), das Bakterien
Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vermittelt, und das
funktionsfähig
oder der Kontrolle des bla-Promotors steht;
- (iv) einen bakteriellen Replikationsursprung (pMB1 ori); und
- (v) einen eukaryontischen Replikationsursprung (2μ Ori).
-
6 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.2 (SEQ ID NO:2)
zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von
pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben
umfasst, ausgenommen dass der Polylinker die Restriktionsschnittstellen
EcoRI, Acc651, KpnI, MfeI, AgeI, RsrII, Acc651, KpnI, XmaI, SrfI,
KspI und SacII besitzt und von Integrationsstellen für den Bakteriophagen λ (attL1 und
attL2) flankiert wird, die an eine Sequenz angrenzen, die das V5-Epitop-Tag
kodiert, so dass ein Fusionspolypeptid, das dieses Peptid und dieses
Epitop-Tag umfasst, exprimiert werden kann und eine das Peptid exprimierende
Nukleinsäure
(das Fusionspolypeptid nicht kodierend) nachfolgend durch homologe
Rekombination im Bereich der Integrationsstellen ausgeschnitten
werden kann.
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7 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3)
zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von
pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben
umfasst, ausgenommen dass die Expressionskassette das gegenselektierbare
Reportergen ccdB, zwischen den RsrII- und XmaI-Schnittstellen des
Polylinkers einkloniert und in funktionsfähiger Verbindung mit einem
stromaufwärts
von den EcoRI-, RsrII-Abschnitt des Polylinkers gelegenen gelegenen
Lac-Promotor umfasst. Dementsprechend ist der Vektor in Bakterienzellen
konditionell letal, solange nicht das chimäre LacccdB-Gen durch die Einfügung von
das zu exprimierende Peptid kodierenden Nukleotidsequenzen in dem EcoRI-RsrII-Abschnitt
des Polylinkers unterbrochen wird.
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8 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4)
zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von
pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3) wie in der Legende zu 7 beschrieben
umfasst, ausgenommen dass (i) der Polylinker zur Einfügung der
Peptid-kodierenden Sequenz die einzelnen Restriktionsschnittstellen
EcoRI, MfeI, ClaI, AgeI und RsrII trägt; und (ii) das chimäre lac-ccdB-Gen
von Integrationsstellen für
den Bakteriophagen λ (attL1
und attL2) zwischen der das V5-Epitop-Tag (V5) kodierenden Sequenz
und dem ADH-Terminator (ADSH TT) flankiert ist, um das Ausschneiden zu
ermöglichen.
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9 ist
eine schematische Darstellung des Vektors pBLOCK-3.8 (SEQ ID NO:5)
zur Expression eines Peptids in einer Zelle, der die Merkmale von
pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4) wie in der Legende zu 8 beschrieben
umfasst und weiterhin (i) ein einen Einzelkettenantikörper kodierendes
Gen (SCAG), das funktionsfähig
unter der Kontrolle des SV40-Promotors steht; und (ii) eine zwischen
dem EM7-Promotor und dem Bsd-Gen gelegene interne Ribosomeneintrittsstellensequenz
(IRES) umfasst.
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10 ist eine schematische Darstellung des Vektors
pBLOCK-3.9 (SEQ ID NO:6) zur Expression eines Peptids in einer Zelle,
der die Merkmale von pBLOCK-3.6 (SEQ ID NO:4) wie in der Legende
zu 8 beschrieben umfasst, jedoch sind die Integrationsstellen
für den
Bakteriophagen λ (attL1
und attL2) aus pBLOCK-3.6 durch LoxP-Stellen ersetzt, um ein Cre/loxPvermitteltes
Ausschneiden des chimären Lac-ccdB-Gens
zu ermöglichen.
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11 ist eine schematische Darstellung des Vektors
pBLOCK-3.10 (SEQ ID NO:7) zur Expression eines Peptids in einer
Zelle, der die Merkmale von pBLOCK-3.4 (SEQ ID NO:3) wie in der
Legende zu 7 beschrieben umfasst.
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12 ist eine schematische Darstellung des Vektors
pBLOCK-3.11 (SEQ ID NO:8) zur gleichzeitigen Expression von bis
zu drei verschiedenen Peptiden in der gleichen Zelle und von dem
gleichen Vektor, wobei dieser Vektor die Merkmale von pBLOCK-3.0
(SEQ ID NO:1) wie in der Legende zu 5 beschrieben
umfasst, jedoch in jedem der drei möglichen Vor wärts-Leseraster
ATG-Translationsstartcodons enthält,
die im richtigen Raster mit Sequenzen, die das Epitop und die SV40-Kernlokalisierungsdomänen kodieren,
verbunden sind. Insbesondere sind die Epitop-kodierenden Sequenzen
in den Leserastern 1 bis 3 c-myc, FLAG bzw. V5.
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13 ist eine schematische Darstellung des Vektors
pBLOCK-4.0 (SEQ ID NO:9) zur Expression eines Peptids in einer Zelle,
der die Merkmale von pBLOCK-3.0 (SEQ ID NO:1) wie in der Legende
zu 5 beschrieben umfasst, ausgenommen dass das die
Blasticidinresistenz kodierende Gen (Bsd) durch eine Sequenz (G418)
ersetzt ist, die ein Protein kodiert, die Resistenz gegen Kanamycin
bei Bakterien oder Resistenz gegen Gentamycin bei Eukaryontenzellen
vermittelt.
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14 ist eine schematische Darstellung des Vektors
pRT2 (SEQ ID NO:10), der die folgenden Merkmale umfasst:
- (i) eine erste Fluoreszenzreportergenkassette,
die das das grüne
Fluoreszenz kodierende gfp-Gen operativ unter der Kontrolle eines
chimären,
in Hefe funktionsfähigen
LexA/GAL1-Promotors mit 8 LexA-Operatorstellen stehend und stromaufwärts von
dem Hefe-ADH1-Terminator gelegen umfasst;
- (ii) eine zweite Fluoreszenzreportergenkassette, die das ein
rotes Fluoreszenzprotein kodierende cobA-Gen, operationsfähig unter
der Kontrolle eines chimären
cl/GAL1-Promotors mit 3 cl-Operatorstellen stehend, umfasst;
- (iii) ein in Hefe vom Wildtyp funktionsfähig selektierbares Markergen
(ADE2), das den Zellen, die dieses Gen exprimieren, Adeninauxotrophie
vermittelt;
- (iv) ein selektierbares Markergen, das Bakterien Resistenz gegen
das Antibiotikum Kanamycin vermittelt;
- (v) einen bakteriellen Replikationsursprung (colE1); und
- (vi) einen eukaryontischen Replikationsursprung (2 μ Ori).
-
Die
vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf die Verwendung
der hier beschriebenen Verfahren und Vektoren zur Identifikation
neuer Pharmaka, wie z. B. Antibiotika oder inhibitorischer Mittel.
Tatsächlich ist
die vorliegende Erfindung besonders nützlich in Pharmaka-Screening-Protokollen
zur Identifikation von Kandidaten für Agonisten und Antagonisten
für beliebige
biologische Interaktionen. Z. B. können bakterielle Expressionssysteme
in Hochdurchsatz-Screenings auf neue Antibiotika oder andere inhibitorische
Mittel, die spezielle Protein: DNA oder Protein: Protein-Interaktionen
ansteuern, verwendet werden. Die hier beschriebene pBLOCK-Vektorserie
ist in solchen Anwendungen von besonderem Nutzen.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
Erfindung stellt ein gegenüber
dem in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO
99/35282) abgewandeltes reverses 2-Hybrid-Screening bereit. Insbesondere
wird, während
das reverse 2-Hybrid-Screening auf Peptide, die eine Zielinteraktion
zwischen zwei proteinösen
Bindungspartnern inhibieren, wie zuvor beschrieben durchgeführt werden
kann, eine zusätzliche
Selektion auf Peptide durchgeführt, die
eine Nicht-Ziel- Interaktion
zwischen einem dieser proteinösen
Bindungspartner und einem anderen Bindungspartner nicht inhibieren.
Dies bedeutet, dass die Köder-
und Beute-Konstrukte und die Reportergen-Konstrukte zur Messung
der Zielinteraktionen beliebige von den zuvor beschriebenen sein
können.
Jedoch muss die Wirtszelle zur Messung der Nicht-Ziel-Interaktion
ein zusätzliches „Köder"-Konstrukt und Reportergen-Konstrukt
enthalten, die sich von den zur Messung der Zielinteraktionen verwendeten
unterscheiden.
-
Weiterhin
ist es zur Verringerung des Hintergrundes besonders bevorzugt, wenn
duale Reportergene funktionsfähig
und getrennt voneinander mit der Zielinteraktion in der Wirtszelle
verbunden sind. Z. B. können zwei
gegenselektierbare Reportergene für die Zielinteraktionen verwendet
werden, um den möglichen
Hintergrund von 5-FOA-resistenten Kolonien auszuschalten, die aus
Mutationen in den URA3-Reportergenen hervorgehen.
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Der
Hefestamm wird vorzugsweise modifiziert, um die Einführung eines
zusätzlichen
Plasmids zu erlauben, das ein Kandidatenpeptid exprimiert, das auf
inhibitorische Aktivität
gegenüber
der Zielinteraktion, aber nicht gegenüber der Nicht-Ziel-Interaktion
untersucht wird.
-
Die
Entwicklung neuer und verbesserter reverser n-Hybrid-Screenings,
die zum Hochdurchsatz-Screening von Peptid-Aptamer-Inhibitoren von
Protein-Protein-Interaktionen besonders nützlich sind, wird nachfolgend
beschrieben. Die hier gegebene detaillierte Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
dient nur zu Beispielzwecken und sollte nicht als die gegenwärtig beschriebene
Erfindung begrenzend verstanden werden.
-
BEISPIEL 1
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Verallgemeinertes Schema
des verbesserten reversen 2-Hybrid-Screening-Verfahrens
-
Ein
verallgemeinertes Schema für
das erfindungsgemäße reverse
2-Hybrid-Screening ist in 1 dargestellt.
In dieser Ausführungsform
werden Genkonstrukte für
die Partner der Zielinteraktion (in 1 als
X und Y bezeichnet) auf der Basis der für die Verwendung mit dem lexA-basierten
2-Hybrid-System beschriebenen Vektoren pJG4-5 und pGilda (Gyuris
et al., 1993; Ausubel, 1989) hergestellt. Die kodierende Region
der Beute, Protein-X, wird als Fusion mit einer Aktivationsdomäne exprimiert.
Die kodierende Region des Ziel-Köders,
Protein-Y, wird als LexA-Fusion exprimiert. In diesem Schema wird
auch eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen der Beute, Protein-X,
und einem Nicht-Ziel-Köder,
Protein-Z (in 1 als „Z" bezeichnet), gemessen. Der Nicht-Ziel-Köder, Protein-Z,
wird als cl-Repressor-Fusionsprotein von pGMS13 exprimiert, einem
Derivat von pGMS12 (Serebriiskii, 1999), das HIS5 an der Stelle
des G418-selektierbaren
Markergens enthält.
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Zu
den alternativen cl-Köder-Vektoren
gehören
pGKS8, pGMS12 (Serebriiskii, 1999) oder pcIAuri (ein Derivat des
pAUR112-CEN/ARS-Vektors (Panvera Corporation), der einen GAL1-Promotor-cl-Repressor
und einen ADH1-Terminator an Stelle des URA3-Gens enthält). Sie
können
ebenfalls verwendet werden. Diese Vektoren enthalten alternative
Marker, die die Selektion auf Zeocin-, G418- bzw. Auriobasidin-Resistenz
erlauben.
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Die
Reportergene für
die Zielinteraktion zwischen Protein-X und Protein-Y bestehen aus
zwei chimären
gegenselektierbaren Reportergenen URA3 und CYH2 und dem das grüne Fluoreszenzprotein
kodierenden gfp-Gen (Prasher et al, 1992; Chalfie et al., 1994;
Inouye und Tsuji, 1994), wovon jedes eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen
umfasst, an die der Zielköder
binden kann. Es wird daran erinnert, dass die Selektion mit CYH2
einen cycloheximidresistenten Hefehintergrund, der das CYH2R-Allel enthält, erfordert. Zu den Reportergenen
für die
Nicht-Ziel-Interaktion gehören
das einzelne chimäre
gegenselektierbare Reportergen LYS2 und das ein rotes Fluoreszenzprotein
kodierende cobA-Gen (Wildt und Deuschle, 1999), wovon jeder eine
oder mehrere cl-Operatorsequenzen enthält, an die der Nicht-Ziel-Köder binden
kann.
-
Die
Hefezellen werden mit Genkonstrukten transformiert, die die Beute,
den Zielköder,
die Nicht-Ziel-Köder
und alle Reportergenkonstrukte exprimieren, und diese Merkmale werden
dann durch Massenpaarung (Feilotter et al., 1994) in einzelne Zellen
rekombiniert. Die Beute und die Ziel- und Nicht-Ziel-Köder werden
alle von den CEN/ARS-basierten GAL1-Expressionsvektoren pGilda oder
pcIAuri exprimiert. Dieses Verfahren ist eindeutig nicht auf die
Expression des Köders
von solchen Plasmidvektoren beschränkt, da die Expressionskassetten
ohne nachteilige Wirkungen ins Genom integriert werden könnten.
-
Mit
TRP1, HIS3 und HIS5 markierte Vektoren, die die Beute, den Zielköder und
die Nicht-Ziel-Köder kodieren,
werden in den Hefestamm PRT473 transformiert, einen cycloheximidresistenten
Abkömmling
des Stammes SKY473 mit dem Genotyp (MAT-a, cyh2R his3,
trp1, IexAop-LEU2, IexAop-CYH2ade2::ZEOR,
lexAop-URA3his5::G418R, clop-LYS). Die Rekombinanten
werden parallel auf die interagierenden Ziel- und Nicht-Ziel-Partner
durchmustert.
-
Da
die Bindungspartner der Zielinteraktion unter der Kontrolle des
Galaktose-induzierbaren GAL1-Promotors exprimiert werden, ist es
möglich,
ihre Expression relativ zur Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid
im Zellwachstumsmedium fein zu justieren. Das zur Auslösung von
Letalität
erforderliche minimale Ausmaß an
Induktion wird wie folgt festgestellt: Man testet den diploiden
SKY48/SKY473-Stamm, der die interagierenden Zielköder und
Beute-Fusionsproteine enthält,
auf sein Wachstum auf einer Reihe von Selektionsmedien, die 2 %
(Gew./Vol.) Raffinose (die im Hinblick auf die GAL1-Induktion neutral
ist), vorher festgelegte Konzentrationen an Cycloheximid und 5-FOA
und eine Galaktosemenge im Bereich von 0% (Gew./Vol.) an Galaktose
bis 2 % (Gew./Vol.) an Galaktose enthalten. Die für komplette
Letalität
dieses Stammes in Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid erforderliche
minimale Galaktosekonzentration wird dann bestimmt.
-
In
Abwesenheit jeglicher Inhibition ist der Hefestamm empfindlich gegenüber der
Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid im Wachstumsmedium nach erfolgter
Induktion durch Galaktose, eine Folge der Interaktion zwischen dem
Zielköder
und den Beute-Fusionsproteinen, die an die LexA-Operatorstelle(n)
der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 gebunden sind.
Die gleiche Interaktion lässt
in Folge der Expression des gfp-Gens die Hefezelle grün fluoreszieren.
Weiterhin macht die Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und
der Beute die Zelle für
die Lysin-Biosynthese prototroph, eine Folge der LYS2-Genexpression.
-
Schließlich fluoresziert
die Zelle infolge der Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und
den Beute-Fusionsproteinen, die die cobA-Reportergenexpression aktivieren,
auch rot. Der Phänotyp
der Zelle in Abwesenheit jeglicher Inhibition wird in Feld A der 1 dargestellt.
-
Zur
Durchmusterung auf spezifische Peptidinhibitoren der Zielinteraktion
modifiziert man ein weiteres Genkonstrukt, insbesondere irgendeines
aus der pBLOCK-3-Vektorserie, die in 5–12 dargestellt
ist, oder den pBLOCK-4.0-Vektor, der in 13 dargestellt
ist, so dass ein Peptidaptamer exprimiert wird. Vorzugsweise wird
eine Bibliothek von Peptidaptameren unter Verwendung solcher Vektoren
hergestellt. Einzelne rekombinante DNAs der Bibliothek werden getrennt
in PRT48 eingeführt,
einen Cycloheximid-resistenten Hefestamm, der von dem Stamm SKY48
abgeleitet ist (Serebriiskii, 1999) und den Genotyp (MAT-a, leu2,
ade2, ura3, his3, his5 lys2, trp1, cyh2R)
hat. Die Transformanten werden bis zur Verwendung eingefroren.
-
Die
Bibliothek wird durch Massenpaarung in die rekombinanten PRT-473-Stämme, die
die Bindungspartner exprimieren (siehe oben), eingeführt. Aus
der Massenpaarung von Rekombinanten, die von den Stämmen PRT
473 und PRT 48 abgeleitet sind, entstehende diploide Hefezellen
werden auf Minimalmedium selektiert, das Blasticidin (pBLOCK-3-Vektorserie)
oder G418 (pBLOCK-4.0-Vektor) und Zeocin enthält, dem aber Leucin, Tryptophan
und Histidin fehlen, und sie werden als Glycerol-Stocks eingefroren.
-
Das
Screening der Bibliothek wird dann durchgeführt, indem man die Hefestämme beim
Zehnfachen der ursprünglichen
Bibliothekskomplexität
auf Minimalmedium ausplattiert, dem Leucin, Tryptophan und Histidin
fehlen, aber das Blasticidin (Derivate der pBLOCK-3.0-Vektorserie)
oder G418 (pBLOCK-4.0-Vektorenderivate), 5-FOA und/oder Cycloheximid
enthält.
Die Induktion der Genexpression wird erreicht, indem man die passende
Menge Galaktose, wie oben bestimmt, dem Wachstumsmedium zusetzt.
-
Das
Feld B der 1 zeigt die erwarteten Expressionsprofile
und Selektionsmerkmale der transformierten Hefezellen, die Peptidaptamere
exprimieren. Wo das inhibitorische Peptidaptamer die Interaktion
zwischen dem Zielköder
und der Beute inhibiert, wird nach Galaktoseinduktion keine Expression
der gegenselektierbaren Reportergene URA3 oder CYH2 oder des gfp-Reportergens
detektiert. Demgemäß wird der
Hefestamm resistent gegenüber
5-FOA und Cycloheximid, aber fluoresziert nicht mehr grün. Andererseits überleben
Zellen, die kein im Hinblick auf die Zielinteraktion inhibitorisches
Peptid exprimieren, auf Medium, das 5-FOA und/oder Cycloheximid
enthält,
nicht.
-
Wenn
das inhibitorische Peptid die Interaktion zwischen der Beute und
dem Nicht-Ziel-Köder nicht
inhibieren kann, bleiben die überlebenden
Zellen aufgrund der aktivierenden Interaktion zwischen dem Nicht-Ziel-Köder und
den an die cl-Operatorstellen des LYS2-Reportergens gebundenen Beute-Fusionsproteinen
prototroph für
die Lysin-Biosynthese, welche Prototrophie bei der Hefe eine auxotrophe
lys2-Mutation komplementieren kann. Der Stamm setzt auch weiterhin
die Expression des cobA-Gens fort und fluoresziert infolgedessen
rot. Wenn hin gegen das inhibitorische Peptid auch die Nicht-Ziel-Interaktion
inhibiert, wachsen die überlebenden
Zellen auf Medium, das kein Lysin enthält, nicht, und sie fluoreszieren
nicht rot.
-
Demgemäß wird die
Spezifität
der Inhibition der Reportergenexpression bestimmt, indem man die
Kolonien auf gleiches Medium und auf Medium ohne Lysin replikaplattiert.
Kolonien, die in Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid wachsen, jedoch
auf Medium ohne Lysin nicht wachsen können, exprimieren Peptidinhibitoren,
die sowohl die Ziel- als auch die Nicht-Ziel-Interaktionen inhibieren. Kolonien,
die in Gegenwart von 5-FOA und Cycloheximid und auch auf Medium
ohne Lysin wachsen, exprimieren Peptidinhibitoren, die spezifisch
die Zielinteraktion inhibieren.
-
BEISPIEL 2
-
Reverses 2-Hybrid-Assay
für Peptidinhibitoren
der SCL/LMO2-Interaktion
-
Der
Fachmann erkennt, wie er das im vorangehenden Beispiel bereitgestellte
Protokoll variieren kann, um unter Verwendung des erfindungsgemäßen reversen
2-Hybrid-Screenings Peptidinhibitoren einer bestimmten Protein-Protein-Interaktion
zu messen. An dem vorangegangenen Beispiel werden die folgenden Veränderungen
vorgenommen.
-
Man
führt zwei
parallele reverse 2-Hybrid-Screenings durch, wie in den 2 und 3 dargestellt. Das
erste Screening (2) identifiziert Peptidinhibitoren
einer Zielinteraktion zwischen der Beute, SCL, und einem Zielköder, LMO2,
die eine Nicht-Ziel-Interaktion zwischen dieser Beute und einem
Nicht-Ziel-Köder, E47,
nicht inhibieren. Die Interaktion zwischen SCL und E47 wurde zuvor
von Mahajan et al. (1996) beschrieben. Das zweite Screening (3)
identifiziert die Peptidinhibitoren der gleichen Zielinteraktion,
die eine andere Nicht-Ziel-Interaktion zwischen der Beute, SCL,
und dem Nicht-Ziel-Köder,
LMO1, nicht inhibieren. Demgemäß können beide
Nicht-Ziel-Interaktionen von der Zielinteraktion unterschieden werden.
Auch Klone, die Peptidinhibitoren nur der Zielinteraktion oder der
Zielinteraktion und einer oder beider der Nicht-Ziel-Interaktionen
inhibieren, können
ebenfalls identifiziert werden.
-
Die
SCL-Beute ist ein existierendes Fusionsprotein aus Aktivationsdomäne und SCL,
das die bHLH-Domäne
(Reste 176-245) von SCL enthält,
die in der Interaktion mit LMO2 benannt wurden (Wadman et al., 1994).
-
In
jedem 2-Hybrid-Screening werden drei gegenselektierbare Reportergene
verwendet. Die ersten beiden Reportergene, URA3 und CYH2, stehen
unter der Kontrolle von LexA-Operatoren und hängen daher von der Zielinteraktion
ab. Diese Abhängigkeit
beruht darauf, dass der Zielköder,
LMO2, in beiden Screenings als LexA-Fusionsprotein exprimiert wird
(2 und 3). Wie im vorigen Beispiel
nutzen diese Screenings jeweils die Toxizität des URA3-Genprodukts in Gegenwart
des Pharmakons 5-Fluororotsäure
(5-FOA) und die Toxizität
des Wildtyp-CYH2-Genprodukts
in Gegenwart des Pharmakons Cycloheximid. Demgemäß wird in Gegenwart der Pharmaka
5-FOA und Cycloheximid gegen jede Aktivierung einer Reportergenexpression
selektiert, die aus der Zielinteraktion zwischen SCL und LMO2 resultiert,
wie im vorigen Beispiel beschrieben.
-
Das
gegenselektierbare Reportergen zur Detektion von Nicht-Ziel-Interaktionen
(d. h. SCL/E47 und SCL/LMO1) ist das LYS2-Gen, das unter der Kontrolle
von cl-Operatorsequenzen steht (2 und 3).
Die Expression des LYS2-Reportergens hängt von der Bindung der Nicht-Ziel-Köderproteine
E47 (2) und LMO1 (3) ab,
welche Bindung durch Expression dieser Nicht-Ziel-Köder als
Fusionsproteine mit cl-Operator-DNA-Bindungsdomänen erreicht wird.
-
In
jedem der beiden Screenings sind die Hefestämme, in denen jede Inhibition
von SCL und LMO2-Bindung fehlt und nachfolgend die Expression der
Reportergene URA3 und CYH2 inhibiert wird, nach Induktion durch
Galaktose gegen 5-FOA und Cycloheximid empfindlich. Im Gegensatz
hierzu wird, wenn ein inhibitorisches Peptidaptamer die Interaktion
zwischen SCL und LMO2 verhindert, nach Galaktoseinduktion keine
Expression der gegenselektierbare Reportergene URA3 oder CYH2 detektiert,
und infolgedessen wird der Hefestamm gegen 5-FOA und Cycloheximid
resistent. Zellen, die kein im Hinblick auf die Zielinteraktion inhibitorisches
Peptid exprimieren, überleben
auf Medium, das 5-FOA und/oder Cycloheximid enthält, nicht.
-
Die
Zellen aus beiden Screenings, die auf 5-FOA und Cycloheximid überleben,
werden weiterhin auf ihr Lysinbedürfnis untersucht, wie im vorigen
Beispiel beschrieben. In Abwesenheit einer Inhibition der SCL/E47-Interaktion
(2) oder der SCL/LMO1-Interaktion (3)
sind die Zellen für
Lysin prototroph. Demgemäß wird in
denjenigen Zellen, die auf 5-FOA und Cycloheximid überleben,
und die auch für
die Lysin-Biosynthese prototroph sind, die Interaktion zwischen
SCL und E47 (2) oder zwischen SCL und LMO1 (3)
nicht inhibiert, und das inhibitorische Peptid ist für die Zielinteraktion
zwischen SCL und LMO2 spezifisch. Die Hefestämme hingegen, die in einem
der Parallelscreenings auf 5-FOA und Cycloheximid wachsen, die aber
auf Medium ohne Lysin nicht wachsen, exprimieren ein inhibitorisches
Peptid, das auch die besondere Nicht-Ziel-Interaktion in Betracht
(d. h. die SCL/E47-Interaktion oder die SCL/LMO1-Interaktion) inhibiert.
Demgemäß ist es
möglich,
diejenigen Peptidaptamere zu bestimmen, die eine oder zwei oder
drei der gemessenen Interaktionen, an denen SCL beteiligt ist, inhibieren.
Der Fachmann kann ohne weiteres weitere Interaktionen, in denen
das SCL-Protein
beteiligt ist, messen, indem er auf die hier beschriebene Weise
weitere Screenings durchführt,
wobei jedes einen unterschiedlichen Nicht-Ziel-Köder besitzt.
-
BEISPIEL 3
-
Reverses 3-Hybrid-Screening
auf Peptidinhibitoren einer RNA/Protein-Interaktion
-
Reverse
3-Hybrid-Screenings sind in der Internationalen Patentanmeldung
Nr. PCT/AU99/00018 (WO 99/35282) beschrieben.
-
Für das hier
beschriebene reverse 3-Hybrid-Verfahren ist ein konstantes Köder-Konstrukt
erforderlich, das eine DNA-Bindungsdomäne wie z. B. GAL4 oder LexA
als Fusion im gleichen Leseraster mit einem RNA-Bindungsprotein
wie z. B. dem Hüllprotein
MS2 (Invitrogen), das einen RNA-bindenden Spalt enthält, exprimiert.
Dieses Konstrukt ist vorzugsweise integriert (Invitrogen). Es ist
besonders bevorzugt, wenn das Konstrukt in einem Hefeplasmid enthalten
ist, das den 2 Micron- oder den CEN/ARS-Replikationsursprung enthält.
-
Weiterhin
ist ein zweites RNA-Köder-Konstrukt
erforderlich, das eine Hybrid-RNA exprimiert, die ein RNA-Ziel und
den Liganden für
das RNA-Bindungsprotein des konstanten Köders umfasst. Z. B. kann ein
eine hybride RNA kodierendes Gen, das MS2-RNA-Sequenzen umfasst,
verwendet werden, um eine MS2-Hüllprotein-Domäne des konstanten
Köders
zu binden. Zu Beispielen für
solche RNA-Köder-Konstrukte
gehören
die Vektoren pRH3' und
pRH5' (Invitrogen).
-
Weiterhin
ist auch ein spezifisches Beute-Konstrukt erforderlich, das das
Protein exprimiert, das mit der Ziel-RNA von Interesse interagiert,
mit einer Transkriptionsaktivatordomäne fusioniert. Das Beutekonstrukt hat
eine Standardform, wie für
2-Hybrid-Screenings, wie z. B. pJG4-5 oder pYESTrp2 oder pACT2.
Vorzugsweise ist das Beutekonstrukt pJG4-5. Bevorzugter ist es,
wenn das Beutekonstrukt pYESTrp2 ist.
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In
anderer Hinsicht sind die Prinzipien für die Durchführung von
reversen 3-Hybrid-Screenings
im Wesentlichen wie hier für
reverse 2-Hybrid-Screenings beschrieben.
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Zur
Durchmusterung auf Kandidaten für
Peptidinhibitoren der RNA/Protein-Interaktion kann eine von einem
Vektor wie der hier beschriebenen pBLOCK-3-Vektorserie (5–12)
oder pBLOCK-4.0 (13) exprimierte Peptidbibliothek
verwendet werden. Die rekombinante Bibliothek wird in einen Hefestamm
transformiert, der das konstante Köderprotein, den RNA-Köder und das Beuteprotein auf
die in den vorangehenden Beispielen beschriebene Weise exprimiert.
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Ein
nicht begrenzendes Beispiel des erfindungsgemäßen reversen 3-Hybrid-Screenings
ist in 4 dargestellt. Bei diesem Screening
werden Inhibitoren der Zielinteraktion zwischen dem TAT-Protein
und der das TAR-Protein kodierenden RNA identifiziert und vorzugsweise
gegenüber
Peptiden selektiert, die nur an Nicht-Ziel-Interaktionen unter Beteiligung
von TAT-Protein,
das TAR-Protein kodierender RNA, MS2-RNA oder MS2-Protein binden.
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Für beide
Zielinteraktionen (und alle Nicht-Ziel-Interaktionen, nicht dargestellt)
ist ein RNA-Bindungsprotein (TAT), das als Fusionsprotein mit einer
Aktivatordomäne,
wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, exprimiert wird,
die Beute. Der RNA-Köder
ist ein hybrides MS2/TAR-RNA-Molekül, das mindestens den RNA-bindenden
Spalt der das MS2-Hüllprotein
kodierenden RNA und die an TAT bindende TAR-kodierende RNA umfasst.
Der konstante Köder
ist ein Fusionsprotein zwischen dem MS2-Protein und der DNA-Bindungsdomäne des LexA-Proteins.
Die Reportergene für
die Zielinteraktion bestehen aus chimären URA3- und CYH2-Genen, die
eine oder mehrere LexA-Operatorsequenzen umfassen, an die der Köder binden
kann, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben.
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Der
Nicht-Ziel-Köder
umfasst ein Fusionsprotein zwischen irgendeinem anderen Protein,
an das die MS2-TAR-Hybrid-RNA binden kann (entweder durch den MS2-bindenden
Nukleotidsequenzanteil oder durch die TAT-bindende Sequenz), sowie
das cl-Repressorprotein. Das Reportergen für die Nicht-Ziel-Interaktion
besteht aus einem chimären
LYS2-Gen, das eine oder mehrere cl-Operatorsequenzen umfasst, an
die der Nicht-Ziel-Köder
binden kann, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben.
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Die
Expression der gegenselektierbaren Reportergene URA3 und CYH2 erfordert
die Bildung eines Komplexes zwischen dem LexA-Operator und dem LexA-MS2-Fusionsprotein
und der MS2-TAR-Hybrid- und dem TAT-Aktivatordomänen-Fusionsprotein. Demgemäß macht
diese Interaktion die Zellen nach Galaktoseinduktion der Expression
des LexA-MS2-Fusionsproteins
und/oder des TAT-Aktivatordomänen-Fusionsproteins gegenüber 5-FOA
und Cycloheximid empfindlich. In ähnlicher Weise macht die Expression
des LYS2-Gens die Zellen, wenn eine Nicht-Ziel-Interaktion in de
Zelle stattfindet, für
Lysin prototroph. Demgemäß ist in
Abwesenheit jeder Inhibition der Bildung des oben beschriebenen
Komplexes der Hefestamm gegenüber
5-FOA und Cycloheximid empfindlich und für die Lysin-Biosynthese prototroph.
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Die
Inhibition der Zielinteraktion zwischen dem TAT-Protein und der
TAR-kodierenden RNA vermittelt der Zelle Resistenz gegenüber 5-FOA
und Cycloheximid. Solche Zellen exprimieren ein Peptid, das die
Zielinteraktion inhibiert. Das Peptid inhibiert auch eine Nicht-Ziel-Interaktion, die
normalerweise die Expression des Reportergens LYS2 aktiviert, wenn
die Zellen Lysin für
ihr Wachstum benötigen.
Das Peptid ist hingegen für die
Zielinteraktion spezifisch, wenn die Zellen für Lysin prototroph bleiben.
-
BEISPIEL 4
-
Konstruktion neuer Vektoren
zur Expression von Inhibitorpeptidkandidaten
-
Wir
stellten eine Serie von Vektoren her, die zur Expression von Peptidaptameren
geeignet sind, die in den hier beschriebenen reversen n-Hybrid-Assays
durchmustert werden können.
Die hier beschriebene pBLOCK-3-Vektorserie umfasst die folgenden
Vektoren: pBLOCK-3.0
(5 und SEQ ID NO:1); pBLOCK-3.2 (6 und
SEQ ID NO:2); pBLOCK-3.4 (7 und
SEQ ID NO:3); pBLOCK-3.6 (8 und
SEQ ID NO:4); pBLOCK-3.8 (9 und
SEQ ID NO:5); pBLOCK-3.9 (10 und
SEQ ID NO:6); pBLOCK-3.10 (11 und SEQ
ID NO:7); und pBLOCK-3.11 (12 und
SEQ ID NO:8).
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Diese
Vektoren enthalten viele Merkmale, die für die Vektoren pBLOCK-1 und
pBLOCK-2 beschrieben wurden,
wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU99/00018 (WO
99/35282) beschrieben, einschließlich der Tandempromotormerkmale
zur Expression des Kandidatenpeptids sowohl in prokaryontischen als
auch in eukaryontischen Zellen, und der Gegenwart sowohl von E.
coli- als auch von Hefe-Replikationsursprüngen, um ihre Verwendung sowohl
in bakteriellen als auch in Hefezellen zu ermöglichen. Wie bei pBLOCK-1 und
pBLOCK-2 treibt der konstitutive starke ADH-Promotor die Expression
der Kandidatenpeptide an, um eine von der Kohlenstoffquelle unabhängige Expression
auf hohem Niveau zu ermöglichen.
Die Kernlokalisationssequenz von SV40 ist gleichfalls zugegen, um
das Kandidatenpeptid in den Zellkern zu lenken. Wie bei pBLOCK-1
und pBLOCK-2 wird das Peptid als Fusion mit einem Epitop-Tag (V5)
exprimiert, um die Immunpräzipitation
oder das Western Blotting des exprimierten Kandidatenpeptids zu
erleichtern.
-
Weiterhin
sind die hier beschriebenen Vektoren klein (ungefähr 6 Kilobasenpaare),
um die Herstellung komplexer Bibliotheken zu erleichtern.
-
Alle
Vektoren der pBLOCK-3-Serie enthalten das Bsd-Gen, das Hefe- und
Bakterienzellen Resistenz gegenüber
dem Pharmakon Blasticidin vermittelt. Das Gen wird sowohl von bakteriellen
als auch von Hefe-Transkriptionskontrollsequenzen flankiert, was
die schnelle, spezifische Rückgewinnung
von Bibliotheksplasmiden ermöglicht,
die Inhibitorpeptidkandidaten kodieren, indem man sie in E. coli
transformiert und auf Blasticidin-haltigem Vollmedium selektiert.
-
Besondere
Derivate von pBLOCK-3.0 enthalten eine Anzahl zusätzlicher
Merkmale, wie in den nachfolgenden Figurenlegenden beschrieben:
- (i) ein funktionsfähig unter der Kontrolle des
SV40-Promotors (Vektor pBLOCK-3.8) stehendes Einzelkettenantikörpergen
(SCAG) erlaubt die Detektion transfizierter eukaryontischer Zellen
unter der Verwendung von Antikörpern.
- (ii) Ortsspezifische Rekombinasestellen (z. B. frt, att, loxP,
res), die die in den Vektoren pBLOCK-3.6, pBLOCK-3.8 und pBLOCK-3.9
die das Kandidatenpeptid kodierenden Sequenzen flankieren, ermöglichen den
raschen Transfer von Inserts von diesem Vektor in einen anderen
Vektor mittels ortsspezifischer Rekombination, die durch die entsprechenden
Rekombinaseenzyme vermittelt wird (z. B. Flp-Rekombinase, Lambda-Integrase, Cre-Rekombinase
bzw. Transposon-Resolvase).
- (iii) Die positiven Selektionsgene, die toxische Produkte kodieren,
insbesondere das ccdB-Gen,
das funktionsfähig
unter der Kontrolle des Lac-Promotors steht (Vektoren pBLOCK-3.4,
pBLOCK-3.6, pBLOCK-3.8, pBLOCK-3.9, pBLOCK-3.10 und pBLOCK-3.11), ermöglichen
Klonierung und/oder Transfer des Inserts durch Rekombination.
-
Weiterhin
ist der Vektor pBLOCK-4.0 (13 und
SEQ ID NO:9) mit dem Vektor pBLOCK-3.4 identisch, ausgenommen, dass
das Bsd-Gen durch das G418-Gen ersetzt wurde, das bei Bakterien
Kanamycin-Resistenz und bei eukaryontischen Zellen Gentamycinresistenz
vermittelt.
-
Die
Merkmale aller Plasmide sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Weitere
hervorstechende oder einzigartige Merkmale jedes dieser Plasmide
gehen aus dem Sequenzprotokoll und den Zeichnungen hervor.
-
Es
ist dem Fachmann klar, dass die Nützlichkeit der Shuttle-Vektoren
wie derer der pBLOCK-Familie nicht auf reverses 2-Hybrid-Screening
beschränkt
ist. Sie sind auch zur Klonierung einer Reihe von DNA-Molekülen für eine Vielfalt
von dem Fachmarn vertrauten Zwecken geeignet, darunter Klonierung
von cDNA, genomischer DNA, PCR-Klonierung und Oligonukleotidklonierung
(Ausubel et al., 1989). Untergeordnete Modifikationen an den Sequenzen
dieser pBLOCK-Vektoren vermittels kleiner Deletionen, Insertionen
und/oder Transitionen oder Transversionen üben keinen wesentlichen Effekt
auf die Funktion dieser Vektoren aus und stellen auch keinen erfinderischen
Schritt dar. Demgemäß können alle
solcher äquivalenten
Vektoren (d. h. Varianten oder Derivate) in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. TABELLE
1
-
BEISPIEL 5
-
Konstruktion von Zufallspeptid-Aptamer-Bibliotheken
-
Konventionelle
2-Hybrid-Bibliotheken werden mit einer Transkriptionsaktivatordomäne fusioniert
und sind für
reverse n-Hybrid-Screenings nicht geeignet, da sie die Klonierung
verschiedener Typen von Peptidinhibitoren nicht erlauben, bei denen
einige Bestandteile der Bib liothek die Transkription aktivieren
und dadurch dem Screening entgehen, unabhängig davon, ob sie die Zielinteraktion
blockieren oder nicht. Weiterhin sind ein zusätzlicher selektierbarer Marker
in dem Hefevektor und ein geeigneter Stamm für seine Selektion bevorzugt.
-
Bisherige
rationale Designansätze
versuchen, Kandidaten für
therapeutische Peptide auf der Basis von Homologien mit natürlichen
inhibitorischen Peptiden in den Datenbanken zu modellieren (z. B.
Tiozzo et al., 1998). Solche bisherigen Ansätze konzentrieren sich auf
Peptide/Polypeptide, die zuvor aufgrund ihrer inhibitorischen Eigenschaften
aus ihrer natürlichen
Quelle identifiziert wurden. Im Gegensatz zu den hier beschriebenen
Screenings bestimmen sie auf empirische Weise die geeignetsten Peptide
aus einer großen
Anzahl von von einer genomischen Expressionsbibliothek kodierten
Kandidatenpeptiden. Die Gegenwart von Klonen in allen Leserastern
erlaubt es bei Verwendung eines Vektors wie pBLOCK-3.11 auch, Zufallspeptide, die
in Leserastern, die nicht in der Natur vorkommen, exprimiert werden,
gleichzeitig zu durchmustern, zusammen mit einer Vielzahl von natürlichen
Peptiddomänen,
die im geeigneten Leseraster kloniert worden sind.
-
Trx-präsentierte
Zufallspeptidbibliotheken sind für
das reverse 2-Hybrid-Screening bevorzugt. Die Herstellung der innerhalb
der Trx-Schleife eingespannten Zufallsinserts ist mit der von Colas
(1996) beschriebenen identisch, mit der Ausnahme, dass der bevorzugte
Vektor für
Hochdurchsatz-Anwendungen optimiert ist, wie z. B. ein hier beschriebener
pBLOCK-Vektor.
-
Zur
Steigerung des Anteils richtig gefalteter Domänen in den für das Screening
verfügbaren
Repertoires werden Peptidbibliotheken unter Verwendung von zufällig ausgewählten Sequenzen,
die aus phylogenetisch diversen kompakten Genomen gewonnen worden
sind, in der im vorigen Beispiel beschriebenen pBLOCK-Vektorserie
hergestellt. Um die Vielfalt des Pools zu erhöhen, wird die relative Konzentration
der DNA aus größeren Genomen
in dem Pool im Verhältnis
zu der gesamten haploiden Genomgröße gesteigert. Solche Bibliotheken
werden durch Standardmethodologie (Ausubel, 1989) unter Verwendung
der höchsteffizienten verfügbaren kompetenten
Zellen hergestellt, z. B. XL10-Gold (Stratagene), um Komplexitäten von
mehr als 107 unabhängigen Klonen zu gewährleisten.
-
Um
die Diversität
des Pools potentiell inhibitorischer Peptidaptamere zu maximieren
und zugleich die auf natürliche
Weise evoluierten Gensequenzen vorliegende Strukturinformation auszunutzen,
werden die Bibliotheken inhibitorischer Peptide vorzugsweise aus
natürlichen
Genomen als Quellen hergestellt. Dieser Ansatz versucht, den Evolutionsprozess
zu beschleunigen, indem er Domänen
aus verschiedenen Genomen, bei denen eine Koevolution unwahrscheinlich
ist, künstlich
kombiniert. Um dieses Ziel zu erreichen, werden genomische Expressionsbibliotheken
aus einander evolutionär
fern stehenden Organismen hergestellt, wie z. B. Fugu rubripes (Elgar,
1996a, 1996b), Caenorhabditis elegans (Plasterk, 1999) und Saccharomyces
cerevisiae. Alternativ werden die Bibliotheken unter Verwendung
von gepoolter genomischer DNA aus diesen Organismen oder aus auf
dem genetischen Niveau charakterisierten Mikroorganismen hergestellt.
Während
die durch einen solchen Ansatz erreichte potentielle Diversität theoretisch
geringer ist als die, die erreicht wird, indem man direkt aus der
Umwelt gereinigte DNA kloniert und exprimiert (Short, 1997), bietet
er mehrere deutliche Vorteile.
-
Z.
B. ist eine Annäherung
an die wahre Diversität
und systematische Abweichung der Bibliothek leichter zu erreichen,
was dem Experimentator erlaubt, die Domänendiversität zu maximieren und die systematische
Abweichung zugunsten der Genome dominanter Spezies zu minimieren.
-
Weiterhin
erlaubt es ein künstliches
Poolen von DNA, die aus verschiedenen bekannten Organismen gewonnen
ist, auf einzigartige Weise, verschiedene Genome zu überblicken.
Z. B. werden die Genome bestimmter Archaebakterien gleichzeitig
mit denen obligater Parasiten, wie z. B. Mycoplasmen, und/oder verschiedener
grampositiver und/oder gramnegativer Organismen durchmustert.
-
Überdies
wird die Diversität
solcher Domänenbibliotheken
durch Mutation weiter gesteigert. Z. B. wird die Plasmidbibliothek
in Bakterienstämmen
amplifiziert, die Defizienzen in der Reparatur von Basenfehlpaarungen
aufweisen (z. B. Stämmen
mit der mutS-Mutation), was zur Erzeugung von Mutationen führt.
-
BEISPIEL 6
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Das LexA-reaktive gegenselektierbare
Reportergen CYH2
-
Es
wurde eine Gruppe von Konstrukten hergestellt, die bis zu 8 LexA-Operator-DNA-Bindungsdomänen (DBD)
in einen GAL10/GAL1-Basalpromotor eingebettet enthielten, der so
konfiguriert war, dass er die Expression eines CYH2-Reportergens
in Hefe antrieb. Unmittelbar stromabwärts von CYH2 ist in reverser
Orientierung ein Zeocin-Resistenzgen (ZEO) eingefügt. Die
Promotoren und Transkriptionsterminatoren sowohl der Hefe als auch
der Bakterien lenken die Expression des ZEO-Gens. Die Konstrukte
wurden unter Verwendung von Primern, die mit dem ADE2-Gen homologe
3'-Markierungen
enthielten, durch PCR amplifiziert, was ihre gerichtete Integration
in Genkonstrukte mit dem ADE2-Gen ermöglichte. Die stabilen Integranten
wurden auf Zeocin-Resistenz selektiert und nach roter Pigmentierung
(Adenosinauxotrophie) durchmustert.
-
BEISPIEL 7
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Das LexA-reaktive gegenselektierbare
Reportergen URA3
-
Es
wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt, die bis zu 8 LexA-Operator-DNA-Bindungsdomänen (DBD)
in einen GAL10/GAL1-Basalpromotor eingebettet enthielten, der so
konfiguriert war, dass er die Expression eines URA3-Reportergens
in Hefe antrieb. Unmittelbar stromaufwärts von dem GAL10/1-Promotor
ist das G418-Gen eingefügt.
Die G418-Expression wird von dem TEF1-Promotor kontrolliert; der
sowohl in Hefe als auch Bakterien funktioniert. Die Konstrukte wurden
unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die mit dem HIS5-Gen
homologe 3'-Markierungen
enthielten, und in Hefe transformiert. Stabile Integranten wurden auf
G418-Resistenz selektiert und auf Histidinauxotrophie durchmustert.
-
Es
gibt die Möglichkeit
des unbeabsichtigten Zelltodes bei Gegenselektion, verursacht durch
unspezifische Aktivierung der mit den Reportergenen verbundenen
Basalpromotoren durch Interaktion mit von den pBLOCK-3-Serien-Vektoren
exprimierten Bibliotheksprodukten. Der Einfluss solcher Interaktionen
wird durch Verwendung verschiedener Basalpromotor-Reportergen-Fusionen
im gleichen 2-Hybrid-System begrenzt, da die Wahrscheinlichkeit
sehr gering ist, dass das gleiche exprimierte Bibliotheksprodukt
verschiedene Promotoren aktiviert. Daher zieht die vorliegende Erfindung
die Verwendung unterschiedlicher Basalpromotoren anstelle von GAL1/GAL10,
um den gegenselektierbaren Reporter URA3 anzutreiben, in Betracht.
Demgemäß werden
LexAop-URA3-Reportergene hergestellt, die entweder SPO13 (Vidal
et al., 1996a, b) oder CUP1-URA3-Fusionsgene enthalten. In diese
basalen Promotoren sind bis zu 8 LexA-Operatorsequenzen eingebettet.
Die Konstrukte werden am HIS5-Lokus über ein doppeltes Crossover-Rekombinationsereignis
in das SKY473-Genom integriert (Huang und Schreiber, 1997).
-
BEISPIEL 8
-
Der Doppelfluoreszenzreportergenvektor
pRT2
-
Ein
neuartiger Doppelfluoreszenzreportergenvektor wurde hergestellt.
Dieser Vektor, pRT2 bezeichnet (14 und
SEQ ID NO:10), ist von pRG64 abgeleitet, der einen GAL 10/GAL1-Basalpromotor
mit drei funktionsfähig
mit der Expression des β-Glucuronidase-Reportergens (Gluc)
verbundenen cl-Bindungsstellen enthält.
-
Zur
Herstellung des intermediären
Vektors pRT1 wurde das Plasmid pRG64 mit HindIII verdaut, die Enden
wurden aufgefüllt
und religiert, um eine einzelne NheI-Schnittstelle unmittelbar stromabwärts des
gegenselektierbaren Reportergens URA3 zu schaffen. Ein eine minimale
komplementierende Region des genomischen Hefelokus ADE2 enthaltenes
Fragment von 2276 Basenpaaren Länge
wurde unter Verwendung von PCR amplifiziert und in diese Nhel-Schnittstelle eingefügt. Das
URA3-Gen wurde unter Verwendung von NotI und BsaI deletiert, und
ein DNA-Fragment, das einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit 6 funktionsfähig mit
der Expression des CobA-Gens verbundenen cl-Bindungsstellen enthielt,
wurde in dieselben Stellen eingefügt.
-
Zur
Herstellung von pRT2 (14) wurde das Plasmid pRT1
unmittelbar 5'-wärts von
dem GAL-Gluc-Reporter mit BamHI geschnitten, die Enden wurden aufgefüllt und
das stumpfendige Fragment wurde religiert, um eine Clal-Schnittstelle
zu schaffen. Das gesamte GAL-Gluc-Reportergen
wurde durch Verdau mit ClaI ausgeschnitten, und ein 1800 Basenpaar
langes Fragment, das einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit 8 funktionsfähig mit
der Expression des CobA-Gens verbundenen LexA-Bindungsstellen enthielt,
wurde in die Clal-Schnittstelle eingefügt.
-
Der
Vektor enthält
doppelte Fluoreszenzreportergene, die die Echtzeitmessung der Reportergenaktivierung
ohne die Notwendigkeit von Substraten ermöglichen. Der Vektor erlaubt
auch die Messung der Reportergenaktivierung über mit LexA und/oder cl-DNA- Bindungsdomänen (DBDs)
fusionierte Köder.
Die Inkorporation beider fluoreszierender Reportergene, von denen
jedes von anderen DBDs abhängt,
in einen einzelnen Vektor beseitigt störende Effekte, die infolge
einer Variation der Plasmidzahl, wie sie beobachtet wird, wenn verschiedene
Plasmide exprimiert werden, mit Variabilität der Reportergenexpression
assoziiert sind.
-
Das
Doppelfluoreszenzreporterkonstrukt wird in Hefestämme transformiert,
die für
Adenin auxotroph sind (ADE2), wodurch auf Erhaltung des Vektors
selektiert wird. Die Transformation der genannten Stämme mit
Beute und Ködern,
wobei die letzteren mit LexA und/oder cl-DBDs fusioniert sind, erlaubt die Aktivierung der
fluoreszierenden Reporter. Im Fall eines vorwärtsgerichteten 2-Hybrid-Hefe-Screenings
führt die
erfolgreiche Interaktion zwischen Beuten und Ködern zur Aktivierung des relevanten
fluoreszierenden Reportergens, die durch dem Fachmann geläufige Fluoreszenz-basierte
Detektionssysteme gemessen wird. Das Entgegengesetzte gilt für reverses
Hybrid-Screening, wo man eine Herunterregulation der Reportergenexpression sucht,
die sich aus der Inhibition der Interaktion zwischen Köder- und
Beuteproteinen ergibt.
-
BEISPIEL 9
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Der doppelt kolorimetrische
Reportergenvektor pRT3
-
Das
Doppelreporterplasmid pRT3 ist von pDR8 abgeleitet, das einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit drei
cl-Bindungsstellen, der die Expression des Gluc-Reportergens lenkt,
und einen GAL10/GAL1-Basalpromotor mit 8 LexA-Bindungsstellen, der
die Expression eines LacZ-Reportergens lenkt, enthält.
-
Der
in pDR8 enthaltene selektierbare Macker URA3 wird durch das ADE2-Gen
ersetzt, indem man das Plasmid mit HindIII verdaut, die Enden auffüllt und
das stumpfendige Fragment religiert, um eine einzelne Nhel-Schnittstelle
zu schaffen. Ein das URA3-Gen enthaltendes DNA-Fragment wird nach
Verdau mit NheI und BsaI ausgeschnitten, und ein 2276 langes Basenpaar
langes PCR-Fragment, das eine minimale komplementierende Region
des genomischen Hefelokus ADE2 enthält, wird an den gleichen Stellen
eingefügt,
wodurch pRT3 entsteht.
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BEISPIEL 10
-
Wirtsstämme
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Der
Ausgangs-Wirtsstamm SKY473 enthält
das cl-reaktive Reportergen LYS2. Er hat den Genotyp (MAT-a, his3,
trp1, IexAop-Leu2, clop-LYS2).
-
In
den vorhergehenden Beispielen beschriebene besondere Konstrukte
werden in ein Cycloheximid-resistentes Derivat von SKY 473 (MAT-a,
his3, trp1, IexAop-Leu2, clop-LYS2, cyh2R)
transformiert, wodurch der Stamm PRT 473 entsteht (MAT-a, cyh2R his3, trp1, IexAop-LEU2, IexAop-CYH2ade2::ZEOR,
IexAop-URA3his5::G418R, clop-LYS). Bei Verwendung
des gleichen Ausgangsstamms führen
verschiedene Genkonstrukte zu dem Stamm PRT 475 (MAT- a, cyh2R his3,
trp1, ade2, IexAop-GAL1-LEU2, IexAop-GAL1/10-CYH2, IexAop-CUP1-URA3
und clop-GAL1-LYS2).
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Der
Stamm PRT 474 unterscheidet sich von dem Stamm PRT 475 nur durch
die Auswahl des reprimierbaren Promotors, der die Expression von
URA3 antreibt. Der CUP1-Promotor hat den Vorteil, kupferinduzierbar
zu sein, was die Titration der Repression durch Veränderung
der Kupferkonzentration im Medium ermöglicht. Verfahren zu solcher
Titration des Ausmaßes
der Repression des CUP1-Promotors sind dem Fachmann bekannt (Schneider,
1991).
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BEISPIEL 11
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Einstellung der Selektionsschwelle
durch Galaktosetitration
-
Das
erfindungsgemäße reverse
2-Hybrid-Screeningsystem ermöglicht
die primäre
Einstellung der Stringenzschwelle für beliebige Expressionspartner,
die von dem GAL1-Promotor aus exprimiert werden. Da sowohl die Beute-
als auch die Köder-Interaktoren
unter der Kontrolle des GAL1-Promotors exprimiert werden, wird die
Expression dieser Proteine in der Zelle durch Modifikation des Galaktosespiegels
im Medium zwischen dem Fehlen von Galaktose und 2 % (Gew./Vol.)
Galaktose variiert. Die Konzentration des neutralen Zuckers Raffinose
wird konstant bei einer Konzentration von 2 % (Gew./Vol.) gehalten.
-
Das
Galaktoseinduktionssystem erleichtert die Bestimmung der Minimalkonzentration
der Bindungspartnerexpression, die erforderlich ist, um ein gegenselektierbares
Reportergen in einem Maß zu
exprimieren, das bei vorher festgelegten Konzentrationen von 5-FOA
oder Cycloheximid den Zelltod verursacht. Dies überwindet das Problem der Selbstaktivierung
einiger Köderkonstrukte,
die in der Abwesenheit eines Interaktionspartners den Zelltod verursacht.
-
Das
Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Galaktosekonzentration
zur Induktion der Expression der Bindungspartner ist in Beispiel
1, oben, beschrieben.
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BEISPIEL 12
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Identifikation hochaffiner
Peptidinhibitoren unter Verwendung von Oberflächen-Plasmonresonanz
-
Die
Oberflächen-Plasmonresonanz
ist rasch zu der Referenztechnik für die physikalische Messung
biomolekularer Interaktionen geworden. Das Instrument verwendet
ein infinitesimales Wellenphänomen
zur Erzeugung eines detektierbaren Signals aus sehr subtilen Veränderungen
des Brechungsindex auf der Oberfläche eines Mikrochips, wie z.
B. eines Biosensorchips. Demgemäß wird die
Bindung oder Dissoziation selbst einiger weniger Proteinmoleküle an ein
Partnerproteinmolekül,
das an die Mikrochip-Oberfläche
gebunden ist, in Echtzeit gemessen. Dies erleichtert die Herleitung
von Echtzeit-Assoziations- und Dissoziations-Konstanten. Daher ist
die Plasmonresonanz für
das Studium der Interaktionen von in reversen n-Hybrid-Screenings identifizierten
Proteinen ideal geeignet.
-
Weiterhin
erlaubt die Empfindlichkeit der Oberflächen-Plasmonresonanz-Instrumente
(z. B. BIAcore2000, Pharmacia) die Identifikation von Komponenten
in Rohzellextrakten, die mit der Zielinteraktion kompetieren, auf
einer Mikrochip-Oberfläche
gemessen. Z. B. wird SCL, unter Verwendung des Vektors pTYB1 (New
England Biolabs) als Fusion mit einem Chitin-Bindungsprotein gereinigt, als Ausgangsmaterial verwendet.
In einer Anpassung des in Beispiel 2 beschriebenen Screenings wird
gereinigtes SCL kovalent an die Mikrochip-Oberfläche gekoppelt, gereinigtes
LMO2, DRG oder E47, als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase
(GST) exprimiert, wird über
die Chipoberfläche
geleitet, und die Bindung wird unter Verwendung des BIAcore2000
gemessen. Hefeextrakte, die Peptidaptamere exprimieren, oder ein
Trx-Polypeptid als Vektorkontrolle,
werden dann über
den Chip geleitet, und die Fähigkeit
jedes einzelnen Aptamers, die Assoziation der zugehörigen Partner
mit SCL zu inhibieren, wird durch eine Veränderung des Brechungsindex,
die von dem BIAcore2000 gemessen wird, bestimmt. Die Veränderung
des Brechungsindex wird gemessen, wenn der Peptidinhibitor an SCL
oder sein Partnerprotein oder an beide Proteine bindet. Da das produzierte
Signal proportional zur Größe des interagierenden
Proteins ist, kann der Unterschied zwischen der Bindung des zugehörigen Partners
von SCL und dem wesentlich kleineren künstlichen Aptamer, sollte dieses
direkt mit SCL interagieren, detektiert werden.
-
Der
reverse 2-Hybrid-Assay wird unter Verwendung nicht verwandter Paare
von Proteinen wiederholt, um die Spezifität der Interaktion sicherzustellen.
-
Diejenigen
Peptidaptamere, die die Interaktion mit der höchsten Affinität und Spezifität inhibieren,
werden über
ihre Trx-Domäne
oder andere Epitop-Domäne
immungereinigt und auf direkte Interaktionen mit den Bindungspartnern
geprüft.
Es werden dann ihre Dissoziationskonstanten und Sequenzen bestimmt.
-
Die
inhibitorische Wirkung von Peptidaptameren wird ursprünglich getestet,
indem man sie in die Trx-Polypeptidschleife eingespannt in Zelllinien
exprimiert. Die 20-gliedrigen Peptide werden als mit dem Drosophila-Penetratinmotiv
fusionierte zyklische Peptide synthetisiert. Ein solcher Ringschluss
wird erreicht, indem man flankierende Cysteinreste in die synthetischen
Peptide einbezieht. Dies bewahrt eine hohe Affinität, indem
es die Peptide konformationell spannt (Giebel et al., 1995). Eine
Fusion mit dem Penetratinmotiv erleichtert die Verabreichung der
Peptide ins Medium einer Zelle oder in den extrazellulären Raum.
Dieser Ansatz hat bereits mehrere biologisch aktive Peptidinhibitoren
erbracht.
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BEISPIEL 13
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Vorläufige ex-vivo-Validierung
des Pharmakonscreening-Ansatzes
-
Es
werden Transfektions-Assays verwendet, um festzustellen, ob die
Expression von Peptiden, die die SCL/LMOS-Interaktion in vitro inhibieren,
auch die zelluläre
Proliferation auf negativ-dominante Weise inhibiert. Die Peptide
werden in einer konformationell gespannten Form als Fusionen mit
der „Penetratin"-Zielsteuerungssequenz
von Drosophila synthetisiert, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben.
Alternativ oder zusätzlich
werden die Proteine als Fusionen mit dem VP22-Protein des Herpes-simplex-Virus
vom Typ 1 exprimiert (Phelan et al., 1998). Diese zyklischen Peptide
werden nachfolgend direkt an Leukämiezellen in Kultur verab reicht,
um ihre Fähigkeit
zu bestimmen, das Wachstum oder die Proliferation der Zellen zu
inhibieren.
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In
der hier beschriebenen Ausführungsform
werden die folgenden Verfahren verwendet. Die Leukämiezellen
werden in RPMI mit 10 % FCS kultiviert und durch Elektroporation
gemäß Standardprotokollen
mit Plasmiden transfiziert, die Kandidaten für inhibitorische Peptide exprimieren.
Die transfizierten Zellen werden unter Verwendung von magnetischen
Beads mittels des Einzelkettenantikörpers gegen das Hapten phOx,
den der Vektor pHOOK-2 (Invitrogen) exprimiert, gereinigt. Man lässt die
gereinigten Transfektanten in Gegenwart von G418 auswachsen. Es
werden routinemäßig Standardverfahren
zur Bestimmung des Wachstums durch Aufnahme von 3H-Thymidin
aus dem Medium und klonogene Koloniebildungs-Assays verwendet. Die
Zählung lebender
und toter Zellen wird unter Verwendung eines Satzes Sonden von Molecular
Probes (#L03224) durchgeführt.
-
Expression von Peptidinhibitoren
in aus Leukämiepatienten
gewonnenen Zelllinien: Ein Modell für die Inhibition des Leukämiezellwachstums
-
Plasmide
der hier beschriebenen pBLOCK-Vektorserie ermöglichen das direkte Bioassay
von Kandidaten für
blockierende Peptide in Säugerzellen.
Die Klone werden aus Hefekulturen durch Transformation von Bakterien
wie z. B. E. coli unter Verwendung von Hefelysaten und Selektion
auf Antibiotikumsresistenz zurückgewonnen.
Die Selektion des pBLOCK-Plasmids unter anderen in der Hefezelle
gegenwärtigen
Plasmiden wird dadurch erleichtert, dass man sicherstellt, dass
der Antibiotikumsresistenzmarker für dieses Plasmid einzigartig
ist.
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Alternativ
werden vielversprechende hochaffine Peptidinhibitoren im Kontext
der Thioredoxinschleife in den Säugerexpressionsvektor
pHOOK2 (Invitrogen) unter Kontrolle des CMV-Promotors kloniert. Dieser Vektor enthält auch
einen selektierbaren Marker für
Säugerzellen
(NEO) und exprimiert konstitutiv einen Einzelkettenantikörper gegen
das Hapten phOx. Wenn das Empfängerplasmid
passende flankierende Sequenzen für die ortsspezifische Rekombination
enthält,
erlauben die Plasmide (z. B. pBLOCK-3.2, pBLOCK-3.6 und pBLOCK-3.8)
alternativ die schnelle Übertragung
von Inserts aus der Bibliothek in das gewünschte Expressionsplasmid unter
Verwendung einer Rekombinasereaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird dieser Schritt in den Vektoren der pBLOCK-Familie eliminiert,
die bereits Gene enthalten, die Einzelkettenantikörper zur
physikalischen Selektion über
ihre zugehörigen
Epitope/Haptene enthalten. Vorzugsweise werden die Peptidinhibitor-exprimierenden
Konstrukte durch Lipofektion oder Elektroporation in die folgenden
Zelllinien transfiziert:
- (i) Erythroleukämische K562-Zellen,
die LMO2, DRG, E47 und SCL exprimieren;
- (ii) die Zelllinie PER-255 (Kees et al., 1989), die DRG, E47
und SCL exprimiert;
- (iii) die Zelllinie PER-117 (Kees et al., 1987), die SCL, DRG
und E47 exprimiert; und
- (iv) die Zelllinie PER-550 (Kees et al., unveröffentlicht),
die LMO2, SCL, E47 und DRG exprimiert.
-
Als
Kontrolle wird die Verwendung der T-Zelllinie MOLT-4 oder der B-Zelllinie
Raji, die SCL nicht exprimieren, aber sowohl DRG als auch E47 exprimieren
(Green et al., 1991a, b), in Betracht gezogen.
-
Zusätzlich wird
als Negativkontrolle der Expressionsvektor allein in jede der oben
genannten Zelllinien transfiziert.
-
Nach
Transfektion und 24-stündigem
Wachstum wird die transfizierte Zellpopulation unter Verwendung
von magnetischen Beads, die mit dem phOx-beschichteten Hapten beschichtet
sind, gereinigt. Gleiche Anzahlen selektierter Zellen und Kontrollzellen
werden in Kultur genommen und in G418-enthaltendem Medium wachsen
gelassen. Die Zellzahlen werden nach 24, 48 und 72 Stunden gemessen.
Die Proliferation wird durch Messung der 3H-Thymidin-Aufnahme sowie durch
Durchführung
klonogener Koloniebildungsassays bestimmt, wozu Standardverfahren
verwendet werden. Die Lebensfähigkeit
wird durch Zählung
lebender und toter Zellen unter Verwendung von Sonden, die für die Detektion
mit Durchflusscytometrie oder FACS geeignet sind, gemessen.
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Einführung von Peptiden in Leukämie-Zelllinien
-
Die
in diesem Experiment verwendeten Peptide wurden zuvor in vitro auf
hochaffine Inhibition der SCL/LMO2-Interaktion selektiert (Beispiel
2). Inhibitorische Peptide und als Kontrolle dienende „durcheinandergeworfene" Peptide gleicher
Länge werden
als Fusionen mit der Drosophila-Penetratinsequenz und mit oxidierbaren
flankierenden Cysteinresten zur Erleichterung des Ringschlusses
synthetisiert.
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Die
Peptidinhibition des SCL-abhängigen
Wachstums und der Zielgeninaktivierung werden durch direkte Zugabe
der interagierenden Peptide (und einer nicht interagierenden Kontrolle)
zu Kulturen von K562-, PER-255-, PER-550-, PER-117-, MOLT-4- und
Raji-Zellen und Beobachtung der Wirkung über einen Zeitraum von 72 Stunden
wie oben beschrieben bestimmt. Peptide, die Interaktionen in vivo
inhibieren, blockieren das SCL-abhängige Wachstum. Im Gegensatz
dazu haben die Kontrollpeptide oder die Peptide mit Affinität für ein nicht
exprimiertes Partnerprotein keine Wirkung auf das SCL-abhängige Wachstum.
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BEISPIEL 14
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Entwurf von Peptiden,
die Onkoprotein-Interaktionen inhibieren
-
Konsensus-Alignments
von Sequenzinformationen, die von vielversprechenden Peptidinhibitoren
der SCL/LMO2-Interaktion gewonnen worden sind, helfen bei der Aufklärung möglicher
natürlich
vorkommender Bindungspartner für
ein Kern-Onkoprotein. Insbesondere definieren die im Alignment gefundenen
Sequenzen die Konsensusmotive für
hochaffine Bindungspartner.
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In
einem Ansatz werden aus T-ALL-Zelllinien (oben) konstruierte cDNA-Bibliotheken
unter Verwendung von Oligonukleotiden durchmustert, die ein oder
mehrere Konsensus-Inter aktionsmotive kodieren, um eine cDNA zu identifizieren,
die ein natürlich
vorkommendes Onkoprotein kodiert, das das Interaktionsmotiv oder
die Interaktionsmotive besitzt.
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Alternativ
können
aus den gepoolten Genomen sequenzierter Organismen konstruierte
Bibliotheken durchmustert und die Sequenzen positiv hybridisierender
Klone dem Alignment unterzogen werden. Während das Alignment von aus
einem Screening gewonnenen Sequenzen Konsensusmotive erkennen lässt, werden andere
mögliche
verwandte Motive ausgeschlossen, wenn sie nicht aus irgendeinem
einzelnen Genom identifiziert werden, in dem sie theoretisch vorkommen,
trotz erschöpfenden
Durchmusterns bei einer Komplexität, die laut Vorsage sämtliche
möglichen
Domänen,
die das Genom oder die Genome kodieren, abdecken sollte. Demgemäß sind die
im Alignment erhaltenen Sequenzen aus der Durchmusterung gepoolter
Genome verwendbar zum Entwurf optimaler Peptide, die die in dem
biologischen Screening identifizierten Konsensusmotive imitieren,
während
ihnen alternative Reste strukturell verwandter Peptide fehlen, die
in die erschöpfende Durchmusterung
eines einzelnen Genoms eingeschlossen wurden.
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BEISPIEL 15
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Peptidsynthese
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38-gliedrige
Peptide werden in der Form von Cys-(interagierendes 20-mer)-Cys(Penetratin
16-mer) hergestellt. Die Sequenz des Penetratin-Motivs wird von
Derossi (1994) bereitgestellt. Die Peptide (von Chiron Mimotopes,
Australien, synthetisiert) werden durch Oxidation der flankierenden
Cysteinreste unter Verwendung von 10 mM K3Fe(CN)6 bei pH 8,4 zyklisiert und durch Reverse-phase-HPLC
nach Koivunen (1994) gereinigt.
-
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