CN1827763B - 筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于分子生物学及生物制药技术范畴的一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法。利用酵母转录激活因子的DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)在空间上可分离的特点，在桥质粒pBridge的BD域下游插入X基因，在第二个条件型甲硫氨酸启动子(RMET25)下游插入以硫氧还蛋白为骨架的随机10肽库，将Y基因插入到含有AD域的pACT2，共转酵母宿主细胞，利用营养缺陷型和相应报告基因的表达来筛选促X-Y解离的小肽分子。该方法为研究蛋白质复合物的解离提供新的途径；获得的解离肽可有效阻断信号通路中的重要蛋白复合物，为治疗由于信号转导通路异常导致的疾病如自身免疫、肿瘤等提供药物靶点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及生物制药技术范畴，特别涉及一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法。
背景技术
在生命活动中，由于信号转导通路异常而导致疾病的发生，如B细胞激活因子BAFF(B-cell-activating factor)主要通过BAFF-R影响B细胞的存活和成熟，BAFF-R介导的胞内信号途径在自身免疫和恶性B淋巴瘤的发病机制中起重要作用。利用该方法筛选获得的小肽可以促进BAFF-RTARF3复合物的解离，阻断BAFF-R信号通路，达到治疗自身免疫性疾病和恶性B淋巴瘤的目的。又如体内游离的胰岛素样生长因子IGF-1的浓度与糖尿病密切相关，目前治疗糖尿病主要是靠中西药物进行治疗，并依靠调节饮食来控制，总的治疗效果不理想。在人体血浆和组织中，胰岛素样生长因子IGF-1与蛋白IGFBPs结合，以复合物的形式存在。IGFBPs通过调节与IGF-1的结合来控制体内游离IGF-1的含量，利用该方法筛选获得的小肽可以促进IGF-1/IGFBPs复合物的解离，提高体内游离IGF-1的浓度，从而达到治疗糖尿病的目的。
蛋白相互作用和解离是生命活动的基础，酵母杂交技术是研究蛋白之间相互作用的有力工具。酵母双杂交是利用酵母转录激活因子的DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)在空间上可分离的特点，将DNA-BD与诱饵蛋白X融合，AD与靶蛋白Y融合，分别构建BD-X和AD-Y重组质粒载体，并在酵母细胞中共表达。如果诱饵蛋白X与靶蛋白Y相互作用，DNA-BD和AD相互靠近，组成有活性的转录激活子，激活下游报告基因(如lacZ或HIS3)的表达。酵母三杂交技术则是在双杂交的基础上，引入第三个蛋白，研究三个蛋白之间的相互作用。本发明将文库技术与酵母三杂交技术相结合，筛选出促蛋白解离的小肽分子。利用酵母构象型随机肽库筛选出促蛋白解离的小肽，可阻断由蛋白组分介导的信号通路，对于治疗由于信号转导通路异常而导致的疾病有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法。其特征在于，所述筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法为：
1.载体(图1、图2)
采用桥质粒pBridge(见图1)，pBridge具有双启动子，在BD域的下游具有MCS I，能诱导BD融合蛋白的表达，此外，在pBridge还具有MCS II，受控于甲硫氨酸启动子(PMET25)，当甲硫氨酸缺乏时，能诱导第三个蛋白的表达，为研究三个蛋白之间的相互作用奠定基础。pACT2在AD域下游具有MCS，能诱导AD融合蛋白的表达。
2.骨架蛋白选择
骨架蛋白选用硫氧还蛋白(TrxA)，TrxA通过两个Cys形成一个突环区，在该突环区插入编码10肽的随机DNA片段(图3)，编码的小肽因构象受限而形成较为稳定的结构，有利于筛选到具有高亲和力的配基。在TrxA的突环区只有一个Rsr II酶切位点，设计两对引物，通过重叠延伸PCR向TrxA的突环区引入AscI酶切位点，有利于随机DNA片段定向插入。
3.相互作用蛋白的选择
选择信号转导通路中具有明确相互作用的重要蛋白复合物为靶标，在获得已知具有相互作用的蛋白X、Y基因的基础上，构建pBD-X和pAD-Y重组载体，利用酵母双杂交系统验证X-Y的相互作用，然后以X-Y复合物靶标，利用随机肽库筛选促X-Y解离的小肽分子。如BAFF主要通过BAFF-R对B细胞进行调节，TARF3作为BAFF-R的下游分子在信号转导中起重要作用。调取BAFF-R和TARF3基因，构建pBD-BAFF-R和pAD-TARF3重组载体，共转酵母宿主细胞在BAFF-R/TRAF3具有相互作用的基础上，再以BAFF-R/TRAF3复合物为靶标，筛选促BAFF-R/TRAF3解离的小肽。许多人类疾病的发生是由于信号通路异常造成的，利用小肽分子解离蛋白复合物组分之间的相互作用，可阻断由蛋白组分介导的信号通路，从而治疗疾病的目的。
4.文库构建
构建文库多为6～16肽，我们选择构建10肽库，采用NNK编码方式，N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指导合成全部20种氨基酸和一个TAG琥珀型终止子。将编码随机肽库的两条链经退火、延伸补平、双酶切后，与经同样双酶切的5’去磷酸化载体连接，电转E.coli感受态细胞。
5.随机肽库库容和多样性检验
取1μl扩增的DH10B肽库菌液(由中国人们解放军军事医学科学院基础医学研究所构建)，梯度稀释后涂布LB平板，计算库容。随机挑选20个克隆进行测序，对其多样性进行检验。
所述高通量筛选蛋白相互作用(复合物)解离肽的实施是以酵母双杂技术作为基础，将酵母双杂交和多肽文库技术相融合，构建双启动子解离肽筛选文库；用具有相互作用的两种蛋白质X与Y，高通量筛选促X与Y复合物解离的多肽。将pBD-X与pAD-Y共转染酵母宿主细胞，当蛋白X与Y具有相互作用时，导致AD与BD在空间上靠拢，则可激活相关下游基因的转录，在pAD或pBD上导入另一可诱导的启动子序列，并在其下游插入6～12肽的随机多肽文库，为增大筛选的机会可利用构象型肽库或偏性肽库。在共转pBD-X/Z与pAD-Y(或pBD-X与pAD-Y/Z)后，利用相关的营养缺陷型培养基启动多肽文库的表达，筛选出能够阻断X与Y相互作用的解离肽。
本发明的有益效果是选择蛋白质间相互作用的解离作为切入点，将构象型随机肽库与三杂交系统有机结合，真正做到了高通量大规模筛选。在获得两已知相互作用的蛋白基因的基础上，可直接筛选解离肽，不需纯化蛋白，省去了免疫筛选的繁琐过程，实现了多肽化学和分子生物学的优势互补。而且，筛选靶点从单一蛋白转变为具相互作用的蛋白复合物，在真核细胞内的解离反应与体外所作的筛选相比更接近于自然状态。此外，通过构象型随机肽库展示的肽段因其构象受限，更有利于筛选到高亲和力的配基。因此，利用双启动子酵母构象型肽库筛选解离肽作为研究蛋白相互作用解离的新策略，有着重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为pBridge载体的限制图谱和多克隆位点。
图2为pACT2 AD的限制图谱和多克隆位点。
图3为骨架蛋白TrxA的选择。
图4为PCR扩增BAFF-R胞内区基因，图中M为DL2000；1为BAFF-R胞内区基因。
图5为PCR扩增TRAF-C基因，图中M为DL2000；1为TRAF-C基因。
图6为PCR扩增TrxA基因，图中M为DL2000；1为TrxA基因。
图7为重叠延伸PCR扩增TrxAc，图中M为DL2000；1以pL1、pR1为引物进行PCR；2以pL2、pR2为引物进行PCR；3.以pL1、pR2为引物；1，2为模板进行PCR。
图8为BAFF-R，TrxAc，TRAF-C转录激活活性分析，图中1-2为pCL1，3-4为阴性对照，5-6为pBD-BAFF-R单转Y190，7-8为pBD-TrxAc单转Y190，9-10为pACT2-TRAF-C单转Y190。
图9为pBridge-BAFF-R，pACT2-TRAF-C相互作用的验证，图中1-2为pTD1-1和pVA3-1共转Y190，3-4为pTD1-1和pLAM5’-1共转Y190，5-6为pBD-BAFF-R单转Y190，7-8为pAD-TRAF-C单转Y190，9-10为pBD-TrxAc单转Y190，11-12为pBD-BAFF-R-TrxAc单转Y190，13-15为pBD-BAFF-R-TrxAc和pAD-TRAF-C共转Y190。
具体实施方式
本发明提供一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法。所述筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法结合附图和实施例予以说明。
实施例，BAFF-R/TARF-C复合物解离肽的筛选
BAFF(B-cell-activating factor)是1999年发现的TNF家族成员，通过影响B细胞的存活和成熟在自身免疫和恶性B淋巴瘤的发病机制中起重要作用。BAFF主要通过BAFF-R对B细胞进行调节，TARF3作为BAFF-R介导替代NF-κB途径的下游分子，在信号转导中起重要作用。我们调取了BAFF-R的胞内区和TRAF3的TRAF domain(TRAF-C)基因，构建了pBD-BAFF-R和pAD-TRAF-C重组表达载体，共转酵母Y190宿主细胞，利用酵母双杂交验证BAFF-R胞内区与TRAF-C的相互作用。并在pBridge的第二个条件型甲硫氨酸启动子(PMET25)下游插入以硫氧还蛋白为骨架的随机10肽库，对随机肽库的库容及多样性进行了验证。
1.实验材料：
E.coli HB101：由中国人们解放军军事医学科学院基础医学研究所保存，E.coli DH10B：F- mcrA Δ(mrr-hsaRMS-mcrBC)Φ80lacZ ΔM15ΔlacX74 recA1endA1 araD139Δ(ara，leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG购自Invitrogen公司；酵母Y190菌种为clontech公司产品。
桥质粒pBridge，pACT2，pCL1，pLAM5′-1，pTD1-1，pVA3-1载体，酵母培养基YPD，SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-Trp-Leu，SD/-Trp-Leu-His，SD/-Met-Trp-Leu-His等购自Clontech公司；Pryobest DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Klenow大片段，碱性磷酸酶CIAP，限制性内切酶EcoR I、BamH I购自TaKaRa公司；限制性内切酶Bgl II、Not I购自promega公司；Rsr II、Asc I购自Biolabs公司。
E.N.Z.A Plasmid Miniprep kit I，E.N.Z.A Gel Extraction Kit购自Omega公司。
Mi cropure-EZ Enzyme Remover，VSWP02500表面滤膜购自Millipore公司。
2.具体实施
2.1.pBD-BAFF-R、pAD-TRAF-C重组载体的构建
培养Raji细胞，提取总RNA，利用RT-PCR钓取BAFF-R胞内区及TRAF-C基因(图4，5)，引物由上海博亚公司合成，根据BAFF-R胞内区及TRAF-C cDNA序列，设计引物。BAFF-R胞内区：
PL(in)：5’cggaattcagctggaggcggcgacagc
pR：5’cgggatccctattgttgctcagggccggcc
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃，30sec；64℃，30sec；72℃，30sec，共30个循环，最后72℃延伸7min。
TRAF-C：
PL：5’cgggatccgacagcacgtcaacctgctgaag
PR：5’cggaattctcagggatcgggcagatcc
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃，30sec；52℃，30sec；72℃，60sec，共30个循环，最后72℃延伸7min。
将BAFF-R胞内区与TRAF-C经EcoR I，BamH I双酶切，分别插入到经同样双酶切的pBridge、pACT2载体上，分别将pBridge-BAFF-R和pACT2-TRAF-C连接产物转化HB101感受态细胞，挑取阳性克隆进行酶切鉴定。
2.2.骨架蛋白TrxA的调取与改构
设计一对引物，
pL1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3’
pR2：5’GA AGATCTTCACAGGTTAGCGTCGAGGAACTC-3’
在引物的上游引入Not I酶切位点，下游引入Bgl II酶切位点。从E.coliJM109宿主菌基因组中调取324bp的TrxA基因(图6)，回收TrxA pCR产物，与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，由上海申能博彩公司测序。测序正确后，另外设计一对引物：
pL2：5’-CGTATGTTGGGCGCGCCTGCAAAATGATCGCCCCGATTC-3’
pR1：5’-GGCGCGCCCAACATACGGACCGCACCACTATGC-3’
通过重叠延伸PCR，获得在TrxA的凸环区引入Asc I酶切位点的改构的TrxA(TrxAc)基因(图7)，经Not I、Bgl II双酶切插入到pBD的MCS II，测序结果正确。
2.3.FBAF-R胞内区与TRAF-C的相互作用的验证
2.3.1BAFF-R，TrxAc，TRAF-C转录激活活性分析
pBD-BAFF-R，pBD-TrxAc，pAD-TRAf-C分别单转酵母宿主细胞Y190；均不能使X-gal变蓝(图8)，表明BAFF-R，TrxAc，TRAF-C均不具有转录激活活性。
2.3.2验证相互作用
将pBD-BAFF-R-TrxAc和pAD-TRAF-C共转酵母宿主细胞Y190，从三缺SD/Trp-Leu-His和四缺SD/Met-Trp-Leu-His上挑取的菌落均能使β-半乳糖苷酶显兰色(图9)，表明BAFF-R与TRAF-C存在相互作用，并且，这种相互作用不受TrxAc表达的影响。
3.酵母构象型随机肽库的构建
3.1线性化载体的制备
提取pBridge-TrxAc质粒，Asc I、Rsr II进行双酶切，利用Omega胶回收试剂盒回收酶切产物，CIAP酶进行去磷酸化处理。在Eppendorf管中加入适量酶切产物，缓冲液及CIAP酶，去离子水补充至50μl，混匀后50℃水浴30min，75℃水浴15min灭活CIAP酶，去磷酸化产物用酚∶氯仿(1∶1)抽提两次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀后，-20℃。
3.2编码10肽的随机DNA片段的制备
根据TrxAc突环区的Rsr II、Asc I酶切位点情况及构建随机肽库的要求，设计两条寡核苷酸片段，链1：5’-GTGGTGCGGTCCG(NNK)10GGGCGCGCCTTAATGAT-3’，其中N代表A、G、C、T四种碱基，K代表G、T两种碱基。在5’和3’端引入Rsr II、Asc I酶切位点，用下划线表示。链2：5’-ATCATTAAGGCGCGCCC-3’与链1的3’端互补。在一Eppendorf管中加入10×退火Buffer2μl，100pmol/μl的DNA单链各1μl，H2O 11μl，95℃加热10min，缓慢降至室温。在继续加入2.5mmol/L的dNTPs 2μl，Klenow大片段1μl，10×Klenow缓冲液2μl，25℃水浴15min，75℃20min灭活Klenow酶。将退火延伸的随机片段经Asc I、Rsr II双酶切，15％的PAGE分离回收目的条带。
3.3连接及连接产物的回收处理
对酶切回收的载体与插入片段进行紫外定量，线性化载体与插入片段按1∶0，1∶3，1∶5，1∶7，1∶10进行转化，确定最佳连接比为1∶5。用不同连接产物进行转化以确定最佳转化产物量2μl。利用Micropure-EZ除酶管去除连接酶，VSWP02500膜进行微量透析以去除离子。
3.4电转化
有关电转化感受细胞的制备见分子克隆实验指南(第三版)，取2μl精制的连接产物与30μl电转感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，至于预冷的孔隙为0.1cm电转杯，进行电转。电转仪参数为2.0KV，25μF，200Ω。电击后，加入1ml SOC培养基，37℃，200rpm振摇60min。取少量菌体适量稀释后涂布LB平板，其余加入到50mlLB(含100μg/ml)培养基中，30℃振荡培养18-20h，取样进行平板计数，其余加甘油至终浓度为25％，分装成小管，-70℃冻存。
3.5序列测定及分析
随机挑取若干原始细菌克隆，设计正向引物5’-ATTCACCTGACTGACGAC-5’测序(上海申能博彩公司)，并对构建的构象型随机肽库的寡核苷酸的随机性、库容及丰度进行评价。
4.文库的库容及多样性评价
载体与插入片段摩尔比为1∶5，取2μl精制的连接产物进行电转，原库容为6.38*105，转化效率为7.49*106cfu/μg DNA。将多次转化合并后，库容为1.35*107，扩增后稀释样品涂平板，库容为8.7*108，满足用于筛选的需要。
从扩增肽库中随机挑选20个克隆，进行序列测定(表1)。结果显示(表2)，四种寡核苷酸的出现情况与预先设计的NNK相符，第一、二位核苷酸分别为A/T/C/G中的任一种，其中每一种核苷酸的出现的频率的理论值为25％，第三位核苷酸为G/T中的任一种，G或T的出现频率为50％。实际值与理论值存在一定的偏差，可能是由于样本较小的缘故，随着测序样本的增加，这种差异将逐渐减小。结果表明，所构建的随机肽库不论从基本框架，还是库容及多样性方面均满足设计要求。
在获得构构象型随机肽库的基础上，大提文库质粒，共转pBD-BAff-R/TrxAc(pBD-X/Z)与pAD-TRAF-C(pAD-Y)，利用营养缺陷型培养基SD/-Met-Trp-Leu-His启动多肽文库的表达，从而筛选阻断X与Y相互作用的解离肽。
上述结果表明，将构象型随机肽库与三杂交系统有机结合，真正做到了高通量大规模筛选。在获得两已知相互作用的蛋白基因的基础上，可直接筛选解离肽，不需纯化蛋白，省去了免疫筛选的繁琐过程，实现了多肽化学和分子生物学的优势互补。而且，筛选靶点从单一蛋白转变为具相互作用的蛋白复合物，在真核细胞内的解离反应与体外所作的筛选相比更接近于自然状态。所构建的随机肽库不论从基本框架，还是库容及多样性方面均满足设计要求。此外，通过构象型随机肽库展示的肽段因其构象受限，更有利于筛选到高亲和力的配基。因此，利用双启动子酵母构象型肽库筛选解离肽作为研究蛋白相互作用解离的新策略，有着重要的理论和实际意义。
表110肽库随机挑选克隆核苷酸的插入与对应的氨基酸序列
序号 序列
序列1 ACG CCT ACG AGG ATT TCG GCT CCT GAG CAG
T P T R I S A P E Q
序列2 CTT GGG TCT TTT CTG CAT ACT CAT GTG AAG
L G S F L H T H V K
序列3 AGG ATG GAG TTG TAT TCG TCT GTT CGG CAG
R M E L Y S S V R Q
序列4 CTT ATT GGG TCT TGG CAT TAT CCG TCT GGT
L I G S W H Y P S G
序列5 CCT CGG AAG GTG GTT GCT ATG GTT AAG AAG
P R K V V A M V K K
序列6 TAT AAG ATT GAT TCG CAT ATG GCG ACG TTT
Y K I D S H M A T F
序列7 TCT GCG CGG GAT CTG GGG ACT CTT GCG CTG
S A R D L G T L A L
序列8 ACT TTG TTT AGG CGG GTT TTT ACG CAT AGT
T L F R R V F T H S
序列9 TGT ATG TGG TGT TTG AAT AGG GTT CAG CAG
C M W C L N R V Q Q
序列10 TCG CGG GAG AAG GGG GGT AAT TAT CCG TCT
S R E K G G N Y P S
序列11 TTT GTT TTG ATT TAT GAT CCG TGG GCG ACT
F V L I Y D P W A T
序列12 TTT TCG TTT TGG AGT ACT GCT CAT TTG AGT
F S F W S T A H L S
序列13 TTT TCT AAG GAT ACT CTG CGG TTT AGT GCG
F S K D T L R F S A
序列14 CTT GCT TGT ACT ATT ACG ACG ACG AGT TCT
L A C T I T T T S S
序列15 GTT TGT CAT GCG CAG TAT AAG CTG GGG CGT
V C H A Q Y K L G R
序列16 GGG TGG CTT GGG GTG TTG AGG CGT AGG GCG
G W L G V L R R R A
序列17 AGT TCG GGT TTT AAT CGT TTG TCT CGG CTT
S S G F N R L S R L
序列18 CAT TGG TCG AAG CCT CCG AGG CCG GTT CCG
H W S K P P R P V P
序列19 AAT ATT AGG CGG ATG TAT TTT TAT GGG TTG
N I R R M Y F Y G L
序列20 CTG TTG ACT ACT TGT CCT TGG GTT ACG GTT
L L T T C P W V T V
表210肽库随机挑选克隆核苷酸的分布(％)
Claims (1)
1.一种筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法，其特征在于，所述筛选蛋白质解离肽的双启动子酵母随机肽库的构建方法包括：
1)载体
采用如图1所示的购自Clontech公司的具有双启动子的桥质粒pBridge载体，pBridge在BD域的下游具有MCS I，能诱导BD融合蛋白的表达，此外，pBridge还具有MCS II，受控于甲硫氨酸启动子PMET25，当甲硫氨酸缺乏时，能诱导第三个蛋白的表达，为研究三个蛋白之间的相互作用奠定基础；采用如图2所示的购自Clontech公司的pACT2，在AD域下游具有MCS，能诱导AD融合蛋白的表达；
2)骨架蛋白选择
骨架蛋白选用硫氧还蛋白TrxA，TrxA通过两个Cys形成一个突环区，在该突环区插入编码10肽的随机DNA片段，编码的小肽因构象受限而形成较为稳定的结构，有利于筛选到具有高亲和力的配基，在TrxA的突环区只有一个Rsr II酶切位点，设计两对引物，通过重叠延伸PCR向TrxA的突环区引入Asc I酶切位点，有利于随机DNA片段定向插入；
其中骨架蛋白TrxA的调取与改构设计一对引物，
pL 1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGAGCGATAAAATTATTCACCTG-3’
pR2：5’GAAGATCTTCACAGGTTAGCGTCGAGGAACTC-3’
在引物的上游引入Not I酶切位点，下游引入Bgl II酶切位点；如图6所示，从E.coli JM109宿主菌基因组中调取324bp的TrxA基因，回收TrxA pCR产物，与pGEM-T easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，由上海申能博彩公司测序；测序正确后，另外设计一对引物：
pL2：5’-CGTATGTTGGGCGCGCCTGCAAAATGATCGCCCCGATTC-3’
pR1：5’-GGCGCGCCCAACATACGGACCGCACCACTATGC-3’
通过重叠延伸PCR，获得在TrxA的凸环区引入Asc I酶切位点的改构的TrxAc基因，经Not I、Bgl II双酶切插入到pBD的MCS II，测序结果正确；
3)相互作用蛋白的选择
选择信号转导通路中具有明确相互作用的重要蛋白复合物为靶标，在获得已知具有相互作用的蛋白X、Y基因的基础上，构建pBD-X和pAD-Y重组载体，利用酵母双杂交系统验证X-Y的相互作用，然后以X-Y复合物靶标，利用随机肽库筛选促X-Y解离的小肽分子，所述B细胞激活因子BAFF主要与受体BAFF-R结合，由BAFF-R介导胞内信号转导而发挥其生物学效应；调取BAFF-R和下游分子TRAF-C基因，构建pBD-BAFF-R和pAD-TRAF-C重组载体，共转酵母宿主细胞在BAFF-R和TRAF-C具有相互作用的基础上，再以BAFF-R和TRAF-C复合物为靶标，筛选促BAFF-R和TRAF-C解离的小肽；其中随机肽库的构建如下：
3.1线性化载体的制备
提取pBridge-TrxAc质粒，Asc I、Rsr II进行双酶切，利用Omega胶回收试剂盒回收酶切产物，CIAP酶进行去磷酸化处理，在Eppendorf管中加入适量酶切产物，缓冲液及CIAP酶，去离子水补充至50μl，混匀后50℃水浴30min，75℃水浴15min灭活CIAP酶，去磷酸化产物用酚∶氯仿1∶1抽提两次，氯仿抽提一次，乙醇沉淀后，-20℃；
3.2编码10肽的随机DNA片段的制备
根据TrxAc突环区的Rsr II、Asc I酶切位点情况及构建随机肽库的要求，设计两条寡核苷酸片段，链1：5’-GTGGTGCGGTCCGNNK10GGGCGCGCC TTAATGAT-3’，其中N代表A、G、C、T四种碱基，K代表G、T两种碱基；在5’和3’端引入Rsr II、Asc I酶切位点，用下划线表示，链2：5’-ATCATTAAGGCGCGCCC-3’与链1的3’端互补；在一Eppendorf管中加入10×退火Buffer2μl，100pmol/μl的DNA单链各1μl，H2O 11μl，95℃加热10min，缓慢降至室温，在继续加入2.5mmol/L的dNTPs 2μl，Klenow大片段1μl，10×Klenow缓冲液2μl，25℃水浴15min，75℃20min灭活Klenow酶，将退火延伸的随机片段经Asc I、Rsr II双酶切，15％的PAGE分离回收目的条带；
4)文库构建
采用NNK编码方式，构建10肽随机文库，N代表任意核苷酸，K代表G或T，指导合成全部20种氨基酸和一个TAG琥珀型终止子；将编码随机肽库的两条链经退火、延伸补平、双酶切后，与经同样双酶切的5’去磷酸化载体连接，电转E.coli感受态细胞；
5)随机肽库库容和多样性检验
取1μl扩增的DH10B肽库菌液，梯度稀释后涂布LB平板，计算库容，随机挑选20个克隆进行测序，对其多样性进行检验；
所述高通量筛选蛋白相互作用，其中，解离肽的实施是以酵母双杂技术作为基础，将酵母三杂交和多肽文库技术相融合，构建双启动子解离肽筛选文库；用具有相互作用的两种蛋白质X与Y，高通量筛选促X与Y复合物解离的多肽，将pBD-X与pAD-Y共转染酵母宿主细胞，当蛋白X与Y具有相互作用时，导致AD与BD在空间上靠拢，则激活相关下游基因的转录，在pAD或pBD上导入另一诱导的启动子序列，并在其下游插入6～12肽的随机多肽文库，为增大筛选的机会利用构象型肽库或偏性肽库，在共转pBD-X/Z与pAD-Y，或pBD-X与pAD-Y/Z后，利用相关的营养缺陷型培养基启动多肽文库的表达，筛选出能够阻断X与Y相互作用的解离肽。
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