CN109689873A - 编码促凋亡蛋白的核酸的膳食受控表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在个体中编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸，其包括：‑调节性多核苷酸，所述调节性多核苷酸包含最小启动子和至少一种AARE(氨基酸应答元件)核酸，在摄入缺乏至少一种必需氨基酸的膳食后所述调节性多核苷酸在个体中被激活；和‑编码促凋亡蛋白的核酸，所述编码促凋亡蛋白的核酸被置于所述调节性多核苷酸的控制下。

Description

编码促凋亡蛋白的核酸的膳食受控表达

技术领域

本发明涉及用于在个体中编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸。

特别地，可以在摄入缺乏至少一种必需氨基酸的膳食后控制核酸的表达。

背景技术

最近，基因转移载体的技术改进和适当的基因递送系统的发展已使得基因疗法取得了实质性的临床成功。然而，在基因疗法成为各种疾病广泛接受的治疗之前，必须克服几个障碍。除了关于可用载体系统的安全性问题(例如遗传毒性、免疫应答)之外，主要限制是当前不能以可靠、高度特异性、简单且安全的方式外源地调节转基因的表达。一种策略将是以剂量依赖性方式调节基因表达，例如通过口服可用的耐受良好的诱导物。此外，基因表达的诱导和抑制都应该是可逆的。

科学界同意这样一个事实，即如果有可能在不良事件的情况下迅速消除输注的细胞，则细胞疗法可以在癌症治疗和再生医学中发挥作用。更具体地，基于过继性嵌合抗原受体(CAR)T细胞的治疗迫切需要完全安全的分子开关，以实现其为多种类型的癌症提供治愈的巨大希望。这种开关对于确保基于干细胞(特别是造血干细胞)和基于iPS细胞的疗法的潜力并且促进再生医学领域也是非常宝贵的。

过继性T细胞疗法最初涉及肿瘤特异性T细胞的分离和离体扩增，以获得比单独接种疫苗所获得的更多数量的T细胞。然后将肿瘤特异性T细胞输注到患有癌症的患者中，试图经由T细胞识别肿瘤特异性抗原和癌细胞破坏使其免疫系统能够压倒剩余的肿瘤。换句话说，此类疗法涉及操纵患者自身的免疫细胞以识别和攻击他们的肿瘤。

有几种形式的过继性T细胞疗法用于癌症治疗：培养和扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，分离和扩增一种特定的T细胞克隆，以及使用经过工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞以有效识别肿瘤抗原并破坏肿瘤细胞。CAR T细胞在临床试验中表现最有希望，目前仅在美国注册超过50项CAR临床试验(clinicaltrials.gov)。值得注意的是，嵌合抗原受体(CAR)-重定向的T细胞在难治性白血病患者中产生了长期持久的缓解和显著的客观应答率。

迄今为止，CAR技术通过从每名患者自己的T细胞定制制造治疗产品来施用。然而，这种患者特异性自体范例是CAR技术大规模部署的重要限制因素。目前正在开发用于在同种异体移植的背景下从不相关的第三方供体T细胞产生“现成的”CAR T细胞的平台。

尽管CAR T细胞在临床上已显示出很大的初步前景，但这些发展伴随着一些严重且甚至致命的副作用(Gargett和Brown,Front Pharmacol.,2014年10月28日；5:235)。

已经观察到，移植后复发患者的供体T细胞输注可以通过移植物抗白血病效应导致疾病缓解，但这通常与由于针对非造血组织的同种免疫导致的GVHD(移植物抗宿主病)的发展有关(Kolb,Blood,2008年12月1日；112(12):4371-83)。

由于可以预期靶向分化抗原的T细胞也识别表达相同抗原的非恶性细胞，因此可能发生中靶但脱肿瘤的不良反应，导致不良事件。例如，用靶向黑素细胞分化抗原(例如MART-1和gp100)的T细胞治疗的黑素瘤患者经常发生白癜风和葡萄膜炎(Teulings等,2014；Pigment Cell Melanoma Res.2014年11月；27(6):1086-96.)。

中靶但脱肿瘤毒性可以立即危及生命。具有肺和肝转移肿瘤的结肠直肠癌患者在HER2-特异性CAR T细胞输注的15分钟内发生呼吸窘迫，并且随后在5天后死于多器官衰竭。

在这些情况中的每一种下，尽管在脱肿瘤部位中的抗原表达水平相对较低，但仍发生了不良反应，因此突出了使用具有高亲合力和效力的重定向T细胞的潜在危害。

随着T细胞疗法变得更有效，急性毒性也变得更加明显并且可能引起细胞因子释放综合征，其特征在于发烧、寒颤、低血压和缺氧。由于在识别CD19+恶性细胞后大规模T细胞激活，已在许多CD19CAR T细胞研究中观察到该综合征。

T细胞疗法的一个吸引人之处在于转移细胞持续存在和扩增的潜力，从而介导持续的治疗效果。然而，任何不良反应也将类似地持续，随着细胞增殖而恶化，并且与细胞增殖相关(Tey,Clin Transl Immunology,2014年6月20日；3(6):e17)。

正如Zhou等所承认的：“尽管细胞疗法在癌症治疗中是有效的，但它们的扩增潜力、正常器官的损伤和恶性转化是令人担忧的问题。在体内有条件地消除异常细胞的能力将改善这些问题并拓宽细胞疗法的应用”(Methods Mol Biol.2015；1317:87-105)。

因此，为了发挥其潜力，过继性细胞转移技术需要结合“自杀”安全性组分，特别是在CAR T细胞的水平下。如下所讨论，已经开发了一些方法，但没有完全满足在临床环境中安全翻译的要求。

ESC细胞的潜力已经在造血系统疾病的背景下得到了充分证明。类似地，诱导性多能干细胞(iPSC)技术基于其无限的自我更新能力和分化成源自所有三个胚胎胚层的细胞类型的能力，对再生医学具有很大的希望。显然，基于iPSC的疗法为患者特异性再生医学提供了有希望的途径。

Assawachananont等最近表明，小鼠胚胎干细胞-源性或诱导性多能干细胞-源性3D视网膜组织形成结构化的外核层(ONL)，其即使在缺乏ONL的晚期视网膜变性模型(rd1)中也具有完整的内部和外部区段。通过免疫组织化学观察宿主-移植物突触连接，从而为晚期视网膜退行性疾病的视网膜片移植疗法提供“概念证明”。(Stem Cell Reports.2014年4月24日；2(5):662-74)。

这些结果与非人类灵长类动物的工作一起，使上述作者将自体iPSC源性视网膜色素上皮(RPE)细胞片植入人体。该临床试验被誉为基于iPS细胞的产品的首次历史性移植。

该患者对两只眼睛均进行了一系列18次抗血管内皮生长因子(VEGF)眼部注射，以应对该疾病的不断复发。在移除视网膜下纤维化组织和植入iPS-细胞源性RPE细胞片后，患者在6个月点时没有经历新血管形成的复发并且没有频繁的抗-VEGF注射。她的视敏度稳定，并且至少在移植后近一年的2015年9月没有出现与安全相关的问题。

然而，对这项试验提出了担忧：“由iPS细胞制成的组织仍然存在着自己的担忧，并且这阻碍了任何国家批准它们进行临床试验。身体的免疫系统可以攻击它们，或者它们可能包含一些仍然处于多能状态并导致癌性生长的细胞”(Jeanne Loring，加州拉荷亚斯克里普斯研究所)。

显然，迫切需要为参与RPE片生产的iPS细胞配备稳健的内置安全系统。如上文在CAR T细胞输注的背景下强调的那样，具有此类系统的RPE细胞的临床试验(以及此后的治疗)将是相当安全的。此类安全装置还将大大加速不仅用于眼部疾病还可以支持整个再生医学领域的治愈方法的出现。

实际上，现有的“自杀”系统有其警告。

已经临床测试的第一个自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)，其介导更昔洛韦向三磷酸更昔洛韦的转化，所述三磷酸更昔洛韦对分裂细胞有毒。然而，作为安全开关的HSVtk具有许多缺点，例如更昔洛韦对HSV-TK的激活相对缓慢的事实，需要3天才能在体外具有完全的效果(Marin等,Hum Gene Ther Methods.2012年12月；23(6):376-86)。

最重要的是，病毒TK基因产物具有内在的免疫原性，可能导致转导细胞被免疫活性的个体体内的宿主免疫系统排斥(Berger等,Blood.2006年3月15日；107(6):2294-302)。此外，如果使用更昔洛韦治疗免疫功能不全的造血干细胞移植接受者的CMV感染，则使用这种自杀基因会导致转导细胞的不必要缺失(Bonini等,Mol Ther.2007年7月；15(7):1248-52)。

替选的自杀基因系统由诱导型半胱天冬酶9(iCasp9)基因和小分子生物惰性化学诱导二聚化(CID)药物AP1903一起组成。iCasp9基因含有人半胱天冬酶9蛋白(促凋亡分子)的细胞内部分，所述细胞内部分与源自人FK506结合蛋白的药物结合结构域融合(Straathof等,Blood.2005年6月1日；105(11):4247-54)。静脉内施用AP1903产生该嵌合蛋白的药物结合结构域的交联，这继而使半胱天冬酶9二聚化并使下游处决者(executioner)半胱天冬酶3分子激活，导致细胞凋亡。

在使用SCID小鼠-人异种移植模型的早期体内实验中，单剂量到第3天杀伤超过99％的循环人GFP+T细胞。重要的是，已经发现经由iCasp9的杀伤非常快，其中早期凋亡的膜联蛋白V+细胞出现在30分钟内，并且体外24小时CID处理观察到完整效果(Marin等，2012)。

关于造血干细胞和祖细胞(Stem Cells.2015年1月；33(1):91-100)，CyntiaDunbar(NIH)报道“在恒河猴(rhesus macaque)中表达造血细胞的iCasp9的稳定移植后，施用AP1903(能够激活iCasp9的化学二聚化诱导物)长期特异性地消除所有造血谱系中的含载体的细胞，提示在HSPC水平下的活性。通过良好耐受的AP1903给药消除了75％至94％的含载体的细胞，但缺乏完全消融与残留细胞中较低的iCasp9表达有关。关于抗性机制的进一步研究表明，在用载体转导且对AP1903消融有抗性的造血细胞系中Bcl-2上调。这些结果证明了在与临床开发密切相关的模型中，利用iCasp9到HSPC-靶向基因疗法设置的安全方法的潜力和局限性”。

尽管iCasp9自杀系统的当前功效可能适用于某些特定情况，但它不能充分克服肿瘤发生过程。

无论如何，主要问题是其固有的免疫原性的问题。

Malcom Brenner团队推出了iCasp9自杀系统。人来源的iCasp9自杀基因可能使其免疫原性低于来自异种来源的自杀基因。没有发现在患者体内长期保持稳定水平的对转基因细胞有免疫应答的证据，但在其他临床环境中不能排除该构建体任何组分的免疫原性(Di Stasi等；N.Engl.J.Med.2011年11月3日；365(18):1673-83)。

实质上，由于合成的20-氨基酸肽和该肽与两个肽部分之间的铰链是非人源的，iCasp9蛋白具有潜在的免疫原性。尽管在仅包括小群组患者的最初临床试验中没有观察到不良事件，但是没有保证当更多患者将被招募时不会发生免疫事件，甚至也不会有保证。

显然，需要新的自杀系统。

一些营养相关的研究一直致力于确定氨基酸(AA)在生理功能调节中的作用，特别是涉及AA调节基因表达的机制。在食用缺乏一种必需氨基酸(EAA)的膳食后，限制性EAA的血液浓度迅速且极大地降低，从而引发普遍存在的适应性过程(称为氨基酸应答途径)。该途径的最初步骤是通过哺乳动物GCN2蛋白激酶的不带电荷的tRNA而激活，其磷酸化丝氨酸51上真核起始因子2的α亚基(eIF2α)，导致激活转录因子(ATF4)翻译上调。一旦被诱导，ATF4通过与氨基酸应答元件(AARE)结合而使特定靶基因的转录激活。通过施用缺失的EAA可以快速关闭GCN2-eIF2α-ATF4途径。

利用这些观察结果的优势，专利申请WO 2013/068096公开了包括在诱导型启动子控制下的目标基因的表达盒，所述诱导型启动子包括至少一个AARE调节性序列和最小启动子。

发明内容

在第一方面，本发明涉及用于在个体中编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸，其包括：

-调节性多核苷酸，所述调节性多核苷酸包含最小启动子和至少一种AARE(氨基酸应答元件)核酸，在摄入缺乏至少一种必需氨基酸的膳食后所述调节性多核苷酸在个体中被激活；和

-编码促凋亡蛋白的核酸，所述编码促凋亡蛋白的核酸被置于所述调节性多核苷酸的控制下。

在另一方面，本发明涉及用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸载体，所述核酸载体包含根据本发明的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸。

在另一方面，本发明涉及递送颗粒，所述递送颗粒包含如本发明所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

本发明的又其它方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含(i)如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体、或递送颗粒，以及(ii)药学上可接受的载剂。

在一方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

在另一方面，本发明涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作药物的用途。

在一个其它方面，本发明涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作用于将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的活性剂的用途。

在又其它方面，本发明涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作用于治疗和/或预防肿瘤的活性剂的用途。

在另一方面，本发明涉及用于将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的方法，所述方法包括至少以下步骤：向有需要的个体施用如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

在一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防肿瘤的方法，所述方法包括至少以下步骤：向有需要的个体施用如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

最后，本发明的另一方面涉及用于治疗和/或预防肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括：

-如本文所定义的药物组合物，和

-抗肿瘤化合物。

附图说明

图1：示出GCN2-eIF2α-ATF4信号传导途径的方案。应答于EAA饥饿，激活的GCN2使eIF2α磷酸化，导致转录因子ATF4的上调及其补充至AARE序列以诱导靶基因表达。

图2：示出AARE-基因构建体的描绘的方案：来自Trb3启动子的两个拷贝的AARE(灰色框)和Tk最小启动子组成该构建体。

图3：示出小鼠血浆亮氨酸浓度的图。在清洁的笼子中过夜禁食后，给小鼠饲喂对照(对照，空心方形)或没有亮氨酸的膳食(-Leu，实心方形)。收集血浆并测量亮氨酸(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图4：示出体内荧光素酶表达的测量的图。使用转基因小鼠，其中AARE-TK-荧光素酶构建体稳定整合。禁食16小时后，将转基因小鼠饲喂对照膳食(对照)或不含亮氨酸的膳食(-Leu)。在进食开始后进行生物发光成像3至12小时。作为光子检测结果的信号强度从红色(最高光子数)到蓝色(最低强度)(未示出)分级。然后使用覆盖腹部(腹侧区域，闭合方块)或背侧区域(灰色方块)的目标区域(ROI)量化光发射(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，**p<0.01，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图5：示出长禁食期后体内荧光素酶表达的测量的图。在16小时、20小时或24小时禁食期后，对转基因小鼠进行生物发光成像。然后使用覆盖腹部(腹侧区域，闭合方块)或背侧区域(灰色方块)的目标区域(ROI)量化光发射(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图6：示出经由AARE驱动的表达系统对转基因进行开/关表达调节的策略的方案。进行膳食的脉冲交换缺乏的氨基酸(异亮氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸)。AARE-Luc转基因小鼠经历三个饥饿顺序，每个顺序依次包括：12小时禁食(白色形状，Fa)，进行缺乏EAA膳食的6小时饲喂期(灰色形状，–I；–F；-K)和30小时的对照膳食恢复期(灰色形状，C)。四分之一圆表示6小时。黑色箭头表示生物发光采集的时间点。作为光子检测结果的信号强度从红色(最高光子数)到蓝色(最低强度)(未示出)分级。

图7：在图6中描述的条件下表示示出使用覆盖腹部区域的ROI和沿时间的生物发光倍数诱导定量光发射的图(学生t检验：相对于第0天***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图8：示出24天利用AARE-驱动的表达系统的营养方案的方案。将小鼠重复上述营养循环四次(-EAA组)。对照组(Ctrl组)仅饲喂对照膳食(参见图6用于参考)。

图9：示出在上图8中描述的营养方案期间观察到的体重(以初始值的百分比表示)的图。描绘了对照组(空心方块)和-EAA组(实心方块)。两组之间未观察到显著差异。

图10：示出在上图8中描述的营养方案期间观察到的瘦体重(以初始值的百分比表示)的图。描绘了对照组(空心方块)和-EAA组(实心方块)。两组之间未观察到显著差异。

图11：示出在上图8中描述的营养方案期间观察到的脂肪量(以初始值的百分比表示)的图。描绘了对照组(空心方块)和-EAA组(实心方块)。两组之间未观察到显著差异。

图12：示出在图8中描绘的营养方案结束时肌肉组织重量的图。处死小鼠并收集三个骨骼肌(比目鱼肌、腓肠肌和胫骨肌)并称重。数据以对照组的百分比表示。两组之间未观察到显著差异。

图13：示出在pGL3-AARE-Luc的基于流体动力学的DNA注射后从小鼠的生物发光成像测量的平均辐射率的图。根据流体动力学注射方法，野生型小鼠接受25微克质粒。二十四小时后，用营养方案(O/N饥饿过夜后的-Ile膳食)攻击(challenge)小鼠。在用食开始后6小时进行生物发光成像，并使用覆盖腹部区域的ROI定量发光，对照组用空心方块表示，并且-Ile组用实心方块表示(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。作为光子检测结果的信号强度从红色(最高光子数)到蓝色(最低强度)(未示出)分级。

图14：示出从如图13中所述处理的小鼠的肝脏测量的相对荧光素酶活性的图。收集肝脏并对其进行生物发光成像，然后测定相应的蛋白质匀浆的荧光素酶活性测定。对照组用空心方块表示，且-Ile组用实心方块表示(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图15：示出慢病毒转导后胰腺内递送和诱导AARE-Luc的图。向野生型小鼠的胰腺中进行含有AARE-TK-Luc(LV-AARE-Luc)的慢病毒颗粒的施用。注射后10天，用营养方案(O/N饥饿过夜后的-Ile膳食)攻击小鼠。使用覆盖胰腺区域的ROI定量光发射。作为光子检测结果的信号强度从红色(最高光子数)到蓝色(最低强度)(未示出)分级。对照组用空心方块表示，并且-Ile组用实心方块表示(学生t检验：相对于对照膳食**p<0.01，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图16：示出从如图15中所述处理的小鼠的胰腺测量的相对荧光素酶活性的图。收集胰腺并对其进行生物发光成像，并测定相应的蛋白质匀浆的荧光素酶活性测定。对照组用空心方块表示，并且-Ile组用实心方块表示(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图17：示出慢病毒转导后AARE-Luc的海马体内递送和诱导的图。在野生型小鼠的海马体中进行含有AARE-Luc构建体的慢病毒颗粒的立体定向施用。使用两种构建体：注射在海马体的左侧部分中的AARE-TK-LUC构建体(LV-AARE-Luc)和输注在右侧部分中的对照TK-LUC构建体(LV-Luc)(其中AARE序列被去除)。注射后10天，用营养方案(-Ile膳食)攻击小鼠。然后，收集海马体的两部分(左侧和右侧)，解剖并测定荧光素酶活性。对照组用空心方块表示，并且-Ile组用实心方块表示(学生t检验：相对于对照膳食***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图18：示出使用AARE驱动的表达系统通过TRAIL表达进行的肿瘤生长抑制的图。将Gli36-luc细胞(2x10⁶个)皮下植入裸小鼠中。一周后，进行肿瘤内注射LV-AARE-TRAIL慢病毒。然后，对小鼠进行图8中描述的营养方案：一组饲喂对照膳食(对照；空心方块)，第二组交替饲喂EAA缺乏膳食(-EAA；实心方块)。在Gli36-luc植入(T0)后第一天和随后每周通过生物发光成像监测肿瘤生长。使用覆盖肿瘤的ROI定量目标区域内的信号强度(每组6只小鼠)。光子检测从红色(最高光子数)到蓝色(最低强度)(未示出)分级。使用具有交互作用的双因素ANOVA分析数据，包括作为一个因素的营养方案和作为第二因素的周数*p<0.05；***p<0.001，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图19：示出如图18处理的小鼠的肿瘤重量分析的图。在营养方案结束时，对切除的肿瘤进行拍照并称重。对照组用空心方块表示，并且-EAA组用实心方块表示(学生t检验：相对于对照膳食**p<0.01，n＝6只雄性小鼠；误差条：平均值+s.e.m.)。

图20：示出用于控制TRAIL依赖性凋亡的营养方案的方案。在营养方案结束时，在第21天切除来自饲喂对照膳食的对照组(对照/对照)的肿瘤。在-EAA组中，在第21天处死一半的批次，而另一半在一天后杀伤。更具体地，在摄入不含异亮氨酸的膳食(-EAA/-Ile)后首先处死三只小鼠以检测TRAIL表达的诱导。一天后，杀伤另外三只小鼠以验证应答于对照膳食的TRAIL表达的消失。黑色箭头表示每种上述情况的处死时间。

图21：来自如图20处理的小鼠的切除肿瘤的蛋白质匀浆的分析的结果。通过蛋白质印迹分析蛋白质匀浆，用于检测TRAIL(短期和长期暴露)、切割的-PARP和ATF4水平。肌动蛋白水平显示为上样对照。蛋白质印迹的定量显示，EAA-膳食下的TRAIL水平估计比在对照条件下获得的微弱信号强100倍以上。

具体实施方式

本文提及的任何引文均通过引用并入。

本发明人评估了营养适应途径对于缺少一种必需氨基酸的膳食的显著特征，以实现理想地适合于基因疗法的调节性系统。本发明人发现，基于膳食特异性氨基酸饥饿的这种系统不需要合成转录因子或调节性蛋白的表达，也不需要施用药理学诱导物。它是生理性的，无毒的，并且适合临床应用。这种新的基于营养的调节系统是一种生理学方法，能够解决人基因疗法中的一个主要剩余障碍，并为基于“自杀策略”的疗法方法提供“安全开关”。

如本文实例中所示，AARE驱动的表达系统的灵活性，其中每个单个必需氨基酸可以充当潜在的诱导物。本发明人认为这一点很重要，因为即使在使用单个循环的情况下，它也提供了根据诱导过程的幅度选择“缺少必需氨基酸”的手段，这对于特定实验/情况是最合适的。

以下实验数据中的关键部分涉及促凋亡蛋白TRAIL。进行相应的一组实验不仅解决与癌症有关的问题，还作为解决背景活动和系统动态问题的模型系统。换句话说，为了具有临床相关性，基因调节系统应该在载体的安全剂量内在较宽剂量范围的诱导物上进行调节，并且表现出低水平的背景表达。

如将来自下面的描述，AARE/自杀基因系统理想地适合用作自杀安全装置，导致没有可能的免疫应答。此类装置对于CAR T细胞的功能不是必需的，也不是干细胞/iPS细胞的成熟/分化所必需的。然而，此类安全装置的存在将代表这些相应疗法中不可或缺的保障。

此外，基于AARE的安全装置本质上是完全安全的。自杀基因的无法预见的表达会破坏CAR T细胞(或iPSC源性细胞)，不会伤害患者，鉴于该患者可以很容易地接受另一次输注的治疗性“现成”CAR T细胞。

最后，基于AARE的自杀系统大大拓宽了安全开关的领域和发展。可以考虑整个半胱天冬酶家族。此外，AARE自杀系统不一定依赖非人来源的蛋白质来执行自杀任务。自杀转基因的表达必须不可避免地随后执行相应的细胞，其中自杀基因被内源表达，从而没有时间进行任何免疫反应。因此，自杀基因列表可以包括来自不同来源的“毒素”，条件是基因产物不被分泌，并且它们的表达与细胞的杀伤密切相关。

·用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸

本发明的第一方面涉及用于在个体中编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸，其包括

-调节性多核苷酸，所述调节性多核苷酸包含最小启动子和至少一种AARE(氨基酸应答元件)核酸，在摄入缺乏至少一种必需氨基酸的膳食后所述调节性多核苷酸在个体中被激活；和

-编码促凋亡蛋白的核酸，所述编码促凋亡蛋白的核酸被置于所述调节性多核苷酸的控制下。

在本发明的范围内，表述“促凋亡蛋白”意在表示在细胞接收适当信号后生理上参与程序性细胞死亡或凋亡的蛋白质。

在本发明的范围内，表述“受控表达”表达意在表示相对于诱导的时刻、诱导的持续时间，以精确的方式诱导或“开启”以及停止或“关闭”表达。

在某些实施方式中，编码促凋亡蛋白的核酸的表达可以通过现有技术中可用的任何合适的方法测量，包括由编码促凋亡蛋白的核酸的转录产生的mRNA表达的测量和/或促凋亡蛋白表达的测量。

在一些实施方式中，可以通过用特异性结合至所述促凋亡蛋白的抗体测量促凋亡蛋白的表达来进行促凋亡蛋白表达的测量。

在本发明的范围内，与基础的非诱导表达相比，诱导表达可以表达为时间倍数表达。

在一些实施方式中，与基础表达相比，诱导的表达可以从2倍至10000倍、优选4倍至500倍、更优选8倍至250倍、最优选10倍至100倍变化。

在本发明的范围内，2倍至10000倍包括3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、2000倍、3000倍、4,000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍和9000倍。

在本发明的范围内，表述“最小启动子”意在表示包括正确地启动位于下游的目的基因的转录所需的所有元件的启动子。在本发明的范围内，“最小启动子”和“核心启动子”被认为是等同的表达。技术人员理解“最小启动子”包括至少转录起始位点、RNA聚合酶的结合位点和一般转录因子的结合位点(TATA盒)。

合适的最小启动子是本领域技术人员已知的。

在一些实施方式中，适合于实施本发明的最小启动子可以选自包括以下的组：胸苷激酶的启动子、β-珠蛋白的启动子、巨细胞病毒(CMV)的启动子、SV40启动子等。

在一些实施方式中，个体是人或非人哺乳动物，优选人。

在一些实施方式中，非人哺乳动物选自包括以下的组：宠物，例如狗、猫、驯养猪、兔、雪貂、仓鼠、小鼠、大鼠等；灵长类动物，例如黑猩猩、猴子等；经济上重要的动物，例如牛、猪、兔、马、绵羊、山羊、小鼠、大鼠。

在本发明的范围内，表述“必需氨基酸”包括组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)和缬氨酸(Val，V)。

在本发明的范围内，表述“至少一种必需氨基酸”意在表示1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种必需氨基酸。

在一些实施方式中，可以将缺乏至少一种必需氨基酸的膳食施用给个体5分钟至12小时的时间段，其包括10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、1小时、1小时30分钟、2小时、2小时30分钟、3小时、3小时30分钟、4小时、4小时30分钟、5小时、5小时30分钟、6小时、6小时30分钟、7小时、7小时30分钟、8小时、8小时30分钟、9小时、9小时30分钟、10小时、10小时30分钟、11小时、11小时30分钟。

在一些实施方式中，缺乏至少一种必需氨基酸的膳食可以每天一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次施用给个体。

在一些实施方式中，缺乏至少一种必需氨基酸的膳食可以每天、每隔一天、每周一次、每周两次、每周三次施用给个体。

在一些实施方式中，缺乏至少一种必需氨基酸的膳食可以施用给个体半天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或更久的时间段。

在某些实施方式中，缺乏至少一种必需氨基酸的膳食可以每天一次或两次施用给个体。

在一些实施方式中，缺乏至少一种必需氨基酸的膳食可以在清晨施用给个体例如用作早餐，然后可以向个体施用正常膳食用作午餐和晚餐。

在本发明的范围内，表述“正常膳食”意在表示不缺乏任何必需氨基酸的膳食。

在一些实施方式中，可以每周、每隔一周、每月、每(隔一)月或更久重复缺乏至少一种必需氨基酸的膳食。

在一些实施方式中，缺乏至少一种必需氨基酸的膳食可以由不含异亮氨酸、不含亮氨酸和不含缬氨酸的粉末食品提供，该食品可以商品名从NUTRICA商购获得。该膳食适用于具有枫糖浆尿病的个体，所述疾病似乎影响支链氨基酸代谢。

在某些实施方式中，可以通过将不含异亮氨酸、不含亮氨酸和不含缬氨酸的粉末与其余2种氨基酸的外部来源混合来获得不含亮氨酸、不含异亮氨酸或不含缬氨酸的膳食。

在某些实施方式中，不含苯丙氨酸的膳食可以提供为不含苯丙氨酸的粉末，从MEAD商购获得。该膳食适用于具有苯丙酮尿症的个体。

在实践中，将粉末与不含所期望的必需氨基酸的适合液体或半固体食物混合。

在一个实施方式中，氨基酸应答元件(AARE)核酸选自包括具有以下序列的核酸的组：SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5。

在本发明的范围内，表述“至少一种AARE核酸”包括至少2种、至少3种、至少4种和至少5种AARE核酸。因此，表述“至少一种AARE核酸”包括1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种AARE核酸。

在某些实施方式中，调节性多核苷酸包含至少两种AARE核酸。

在一些其他实施方式中，调节性多核苷酸包含1种至20种AARE核酸，优选1种至10种AARE核酸。

在某些实施方式中，调节性多核苷酸包含2种至6种AARE核酸。

在一些实施方式中，调节性多核苷酸包含选自包括具有以下序列的核酸的组的两种AARE核酸：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。

在一些实施方式中，调节性多核苷酸包含序列SEQ ID NO:1的六种AARE核酸。

在某些实施方式中，所述至少两种AARE核酸可以相同或不同。

在一些实施方式中，包含在用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸中的调节性多核苷酸也可以在施用给卤夫酮、衣霉素等(即已知具有AARE核酸的激活性质的化合物)的个体后被激活。

迄今为止，已鉴定出几个促凋亡蛋白家族，其中可以引用Bcl2蛋白家族、含Bir蛋白家族、含Card蛋白家族、半胱天冬酶蛋白家族、含死亡结构域的蛋白家族、含死亡效应结构域的蛋白家族、死亡配体蛋白家族、死亡受体蛋白家族和IAP拮抗剂蛋白家族。

不受限制地，促凋亡蛋白可以选自包括以下的组：凋亡诱导因子1(AIF、AIFM1)、腺苷酸激酶同工酶2(AK2)、膜联蛋白A1(膜联蛋白-1、膜联蛋白I、脂皮质素I、依钙蛋白II、嗜铬粒结合蛋白-9、p35、磷脂酶A2抑制蛋白、ANXA1、ANX1、LPC1、ANNEXIN-1、LIPOCORTIN I)、凋亡蛋白酶激活因子1(APAF1、CED4)、核仁蛋白3(Myp、Nop30、ARC、NOL3)、细胞死亡调节物Aven(AVEN、PDCD12)、细胞死亡的Bcl2拮抗剂(Bcl-2结合组分6、Bcl-XL/Bcl-2-相关死亡启动子、Bcl-2样8蛋白、BAD、BCL2L8、BBC2)、Bcl-2同源拮抗剂/杀伤因子(killer)(凋亡调节物BAK、Bcl-2-样7蛋白、BAK1、BAK2)、凋亡调节物BAX(BAX、BCL2L4)、Bcl-2相关蛋白A1(BCL2A1、GRS、BFL1、BCL2L5、ACC-1、ACC-2)、凋亡调节物Bcl-X(BCL2L1、BCLX、BCL2L、BCL-X、BCL-XL、BCL-XS)、凋亡调节物Bcl-B(BCL2L10、DIVA、BOO、BCL-B)、Bcl-2样蛋白11(细胞死亡的Bcl2-相互作用中介物、BCL2L11、BOD、BIML、BIMEL、BIM)、Bcl-2相关的富含脯氨酸的蛋白质(Bcl-2样12蛋白、BCL2L12、BCL-2L12)、Bcl-2样13蛋白(蛋白质Mil1、Bcl-rambo、BCL2L13、MIL1、BCL-RAMBO、RAMBO)、凋亡促进物Bcl-2-样14蛋白(凋亡调节物Bcl-G、BCL2L14、BCLG、BCL-G)、凋亡调节物Bcl-W(Bcl-2-样2蛋白、BCL2L2、KIAA0271、BCL-W)、BH3相互作用结构域死亡激动剂(p22BID、BID)、Bcl-2相互作用杀伤因子(凋亡诱导物NBK、BP4、BIP1、BIK、NBK/BLK)、含杆状病毒IAP重复序列的蛋白1(神经元凋亡抑制蛋白、BIRC1、NLRB1)、含杆状病毒IAP重复序列的蛋白3(凋亡蛋白抑制剂1、HIAP-1、HIAP1、C-IAP2、TNFR2-TRAF-信号传导复合蛋白1、IAP同系物C、凋亡抑制剂2、API2、环指蛋白49、BIRC3、CIAP2、HIAP-1、MIHC、RNF49、MALT2)、含杆状病毒IAP重复序列的蛋白5(凋亡抑制剂存活、凋亡抑制剂4、BIRC5)、Bcl-2修饰因子(BMF，FLJ00065)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3(BNIP3、NIP3)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3样(NIP3样蛋白X、NIP3L)、BCL2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3A、腺病毒E1B19K结合蛋白B5、BNIP3L、NIX、BNIP3A)、Bcl-2相关卵巢杀伤蛋白(Hbok、BOK、BCL2L9、BOKL、MGC4631)、钙网蛋白前体(CRP55、网钙调蛋白、HACBP、ERp60、grp60、CALR)、半胱天冬酶-1前体(CASP-1、EC3.4.22.36、白介素-1β转化酶、IL-1BC、白介素-1β转化酶、IL-1β转化酶、ICE、p45、CASP1、ICE、CASPASE-1、CASPASE 1、CASP1)、半胱天冬酶-10前体(CASP-10、EC 3.4.22.63、ICE样凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶Mch-4、FAS相关死亡结构域蛋白白介素-1B转化酶2、FLICE2、CASP10、MCH4)、非活性半胱天冬酶-12(CASP-12)、半胱天冬酶-2前体(CASP-2、EC3.4.22.55、ICH-1蛋白酶、神经前体细胞表达发育下调蛋白2、NEDD-2、CASP2、ICH1)、半胱天冬酶-3前体(CASP-3、EC 3.4.22.56、凋亡素、半胱氨酸蛋白酶CPP32、CPP-32、Yama蛋白、SREBP切割活性1、SCA-1、CASP3、CPP32、CPP32B、YAMA、APOPAIN)、半胱天冬酶-4前体(CASP-4、EC 3.4.22.57、ICH-2蛋白酶、TX蛋白酶、ICE(rel)-II、CASP4、ICE(REL)II、ICH-2、TX)、半胱天冬酶-5前体(CASP-5、EC 3.4.22.58、ICH-3蛋白酶、TY蛋白酶、ICE(rel)-III、CASP5、ICE(REL)III)、半胱天冬酶-6前体(CASP-6、EC 3.4.22.59、凋亡蛋白酶Mch-2、CASP6、MCH2)、半胱天冬酶-7前体(CASP-7、EC 3.4.22.60、ICE样凋亡蛋白酶3、ICE-LAP3、凋亡蛋白酶Mch-3、CMH-1、CASP7、MCH3)、半胱天冬酶-8前体(CASP-8、EC 3.4.22.61、ICE样凋亡蛋白酶5、MORT1相关CED-3同源物、MACH、FADD同源ICE/CED-3-样蛋白酶、FADD样ICE、FLICE、凋亡半胱氨酸蛋白酶、凋亡蛋白酶Mch-5、CAP4、CASP8、MCH5)、半胱天冬酶-9前体(CASP-9、EC3.4.22.62、ICE样凋亡蛋白酶6、ICE-LAP6、凋亡蛋白酶Mch-6、凋亡蛋白酶激活因子3、APAF-3、CASP9、CASPASE-9、CASPASE 9、CASP9、MCH6、ICE-LAP6、APAF-3)、半胱天冬酶-14前体(CASP-14、EC 3.4.22、CASPASE-14、CASP14、CASPASE 14、MICE、MGC119078、MGC119079)、CASP8和FADD样凋亡调节物前体(细胞FLICE样抑制蛋白、c-FLIP、半胱天冬酶-8相关蛋白、Casper、半胱天冬酶样凋亡调节性蛋白、CLARP、MACH相关毒性诱导物、MRIT、半胱天冬酶同源物、CASH、FLICE抑制剂、I-FLICE、FADD样抗凋亡分子1、FLAME-1、Usurpin、CFLAR、CASPER、CLARP、FLAME、FLIP、MRIT)、含杆状病毒IAP重复序列的蛋白2(凋亡蛋白抑制剂2、HIAP-2、C-IAP1、TNFR2-TRAF-信号传导复合蛋白2、IAP同源物B、环指蛋白48、CIAP1、BIRC2、CIAP1、HIAP-2、MIHB、RNF48)、含死亡结构域的蛋白CRADD(具有死亡结构域的半胱天冬酶和RIP衔接子、具有死亡结构域的RIP相关蛋白、CRADD、RAIDD)、输出蛋白-2(Exp2、输入蛋白-α再输出子、染色体分离1样蛋白、细胞凋亡易感蛋白、CSE1L、CAS、XPO2、CSE1)、可能的泛素羧基末端水解酶CYLD(EC 3.1.2.15、泛素硫酯酶CYLD、泛素-特异性加工蛋白酶CYLD、去泛素化酶CYLD、CYLD)、细胞色素c(CYTOCHROME C、HCS、CYCS)、Diablo同源物、线粒体前体(第二线粒体源性半胱天冬酶激活物、Smac蛋白、低pI的直接IAP结合蛋白、DIABLO、SMAC、DIABLO-S、FLJ25049、FLJ10537)、核酸内切酶G、线粒体前体(Endo G、EC 3.1.30.-)、蛋白质FADD(FAS相关死亡结构域蛋白、含FAS相关死亡结构域的蛋白、受体诱导毒性中介物、FADD、MORT1、GIG3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员6前体(FASLG受体、凋亡介导的表面抗原FAS、Apo-1抗原、CD95抗原、FAS、CD95、APO-1)、肿瘤坏死因子配体超家族成员6(Fas抗原配体、Fas配体、CD95L蛋白、凋亡抗原配体、APTL、CD178抗原、FASL、CD178、FAS配体)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、颗粒酶B前体(EC 3.4.21.79、颗粒酶-2、T细胞丝氨酸蛋白酶1-3E、细胞毒性T淋巴细胞蛋白酶2、淋巴细胞蛋白酶、SECT、组织蛋白酶G样1、CTSGL1、CTLA-1、片段化酶-2、人淋巴细胞蛋白、HLP、C11、GZMB、GRB、GRANZYME B)、凋亡切腹激活剂(神经元死亡蛋白DP5、含BH3相互作用结构域的蛋白3、HRK、DP5)、丝氨酸蛋白酶HTRA2、线粒体前体(EC 3.4.21.108、高温要求蛋白A2、HtrA2、Omi应激调节的内切蛋白酶、丝氨酸蛋白酶OMI、丝氨酸蛋白酶25、HTRA2、OMI、PARK13)、细胞间粘附分子3前体(ICAM-3、ICAM-R、CDw50、CD50抗原)、富含亮氨酸的重复序列和含有死亡结构域的蛋白质(具有死亡结构域的p53诱导的蛋白质、LRDD、PIDD、MGC16925、DKFZP434D229)、原低密度脂蛋白受体相关蛋白1前体(LRP、α-2-巨球蛋白受体、A2MR、载脂蛋白E受体、APOER、CD91抗原、LRP1、CD91)、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1(EC 3.4.22.-、MALT淋巴瘤相关易位、类半胱天冬酶、MALT1)、丝裂原激活的蛋白激酶8(EC 2.7.11.24、应激激活的蛋白激酶JNK1、c-Jun N末端激酶1、JNK-46、MAPK8、JNK、JNK1、SAPK1)、诱导的骨髓白血病细胞分化蛋白Mcl-1(BCL-2相关蛋白EAT/mcl1、mcl1/EAT、MCL1、BCL2L3)、凋亡调节剂1(MAP1、MAP1、副肿瘤抗原MA4、MOAP1、PNMA4)、含LRR和PYD结构域的蛋白1(死亡效应细丝形成性ced-4样凋亡蛋白、核苷酸结合结构域和半胱天冬酶募集结构域、含半胱天冬酶募集结构域的蛋白7、NLRP1、KIAA0926、DKFZP586O1822、CARD7、NAC、CLR17.1、DEFCAP、NACHT)、含LRR和PYD结构域的蛋白3(冷自身炎症综合征1蛋白、冷炎素、含PYRIN的APAF1样蛋白1、血管紧张素/血管升压素受体AII/AVP样、NLRP3、AGTAVPRL、AII、AVP、FCAS、FCU、NALP3、PYPAF1、MWS、CLR1.1、NACHT)、佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸诱导的蛋白1(PMA诱导的蛋白1、立即早期应答蛋白APR、NOXA、PMAIP1、APR)、发动蛋白样120kDa蛋白、线粒体前体(视神经萎缩蛋白1、OPA1)、富含酸性亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A(强效热稳定蛋白磷酸酶2A抑制剂I1PP2A、酸性核磷蛋白pp32、富含亮氨酸的酸性核蛋白、Lanp、推定的HLA-DR相关蛋白I、PHAPI、微管调节蛋白(Mapmodulin)、PHAP、ANP32A、LANP、PP32、I1PP2A、MAPM、MAPMODULIN)、Bcl-2结合组分3(凋亡p53上调调节物、JFY-1、PUMA、BBC3)、含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(含有hASC、PYD和CARD结构域的蛋白质、甲基化诱导的沉默的靶标1、含半胱天冬酶募集结构域的蛋白质5、PYCARD、TMS-1、CARD5、ASC)、受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(EC 2.7.11.1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RIP、细胞死亡蛋白RIP、受体相互作用蛋白、RIPK1、RIP)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(EC 2.7.11.1、RIP样蛋白激酶3、受体相互作用蛋白3、RIP-3、RIPK3)、内吞蛋白-B1(含SH3结构域的GRB2样蛋白B1、Bax-相互作用因子1、Bif-1、SH3GLB1、CGI-61、KIAA0491、BIF-1)、肿瘤坏死因子前体(TNF-α、肿瘤坏死因子配体超家族成员2、TNF-α、恶病质素、TNF、TNFSF2、DIF、TNF-α)、肿瘤坏死因子受体超家族成员1A前体(p60、TNF-R1、TNF-RI、TNFR-1、p55、CD120a抗原、TNFRSF1A、TNF-R、TNFAR、TNFR60、TNF-R-I、CD120A、TNF-R55)、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B前体(肿瘤坏死因子受体2、TNF-R2、肿瘤坏死因子受体II型、p75、p80TNF-α受体、CD120b抗原、依那西普、TNFRSF1B、TNFBR、TNFR80、TNF-R75、TNF-R-II、P75、CD120B)、肿瘤坏死因子配体超家族成员10(TNF相关的凋亡诱导配体、蛋白TRAIL、凋亡配体2、Apo-2配体、Apo-2L、Apo2L、CD253抗原、TNFSF10、TRAIL、APO-2L、APO2L TL2、CD253)、细胞肿瘤抗原p53(肿瘤抑制因子p53、磷蛋白p53、抗原NY-CO-13、TP53、P53、LFS1)、肿瘤坏死因子受体1型相关的DEATH结构域蛋白(TNFR1相关的DEATH结构域蛋白、TNFRSF1A相关的死亡结构域、TRADD、HS.89862)、TNF受体相关因子1(爱泼斯坦-巴尔病毒诱导蛋白6、TRAF1、EBI6)、TNF受体相关因子2(肿瘤坏死因子2型受体相关蛋白3、TRAF2、TRAP3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10A前体(死亡受体4、TNF相关凋亡诱导配体受体1、TRAIL受体1、TRAIL-R1、CD261抗原、TRAIL-R1、DR4、TNFRSF10A、DR4、CD261)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10B前体(死亡受体5、TNF相关凋亡诱导配体受体2、TRAIL受体2、TRAIL-R2、CD262抗原TRAIL-R2、TNFRSF10B、TNFRSF10B、TRAIL-R2、DR5、KILLER、TRICK2A、TRICK2B、APO-2、CD262)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10C前体(诱饵受体1、DcR1、无死亡结构域的诱饵TRAIL受体、TNF相关凋亡诱导配体受体3、TRAIL受体3、TRAIL-R3、没有细胞内结构域的Trail受体、TRAIL的淋巴细胞抑制剂、TRAIL/Apo-2L的拮抗剂诱饵受体、CD263抗原、TRAIL-R3/TNFSF10C、TNFRSF10C、TRAIL-R3、DCR1、LIT、TRID、CD263)、TNF相关凋亡诱导配体受体4(TRAIL受体4、TRAIL-R4、肿瘤坏死因子受体超家族成员10D前体、诱饵受体2、DcR2、具有截短死亡结构域的TRAIL受体、CD264抗原、TRAIL-R4、TNFRSF10D、TNFRSF10D、DCR2、TRUNDD、CD264)、XIAP相关因子1(BIRC4结合蛋白，XAF1)和含有杆状病毒IAP重复序列的蛋白4(EC 6.3.2.-、E3泛素蛋白质连接酶XIAP、凋亡蛋白抑制剂3、X连锁凋亡蛋白抑制剂、X连锁IAP、IAP样蛋白、XIAP、HILP)。

在一些实施方式中，促凋亡蛋白选自包括以下的组：TRAIL、FAS受体、FAS相关蛋白、FADD、半胱天冬酶1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8和半胱天冬酶9。

在某些实施方式中，促凋亡蛋白是TRAIL。

·核酸载体

在另一方面，本发明还涉及用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸载体，所述核酸载体包含如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸。

在一些实施方式中，将根据本发明的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸并入适合于基因疗法的载体中。

在本发明的范围内，表述“适合于基因疗法的载体”意在表示载体包含用于实现在靶细胞中编码促凋亡蛋白的核酸表达的必需元件。

在某些实施方式中，载体是病毒载体。

在一些实施方式中，病毒载体选自包括以下的组：腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒、非整合型慢病毒、逆转录病毒和痘苗病毒。

·递送颗粒

在另一方面，本发明还涉及递送颗粒，所述递送颗粒包含如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

在某些实施方式中，递送颗粒可以呈脂质复合物的形式，其包含阳离子脂质；脂质纳米乳液；固体脂质纳米颗粒；基于肽的颗粒；基于聚合物的颗粒，特别是包含天然和/或合成聚合物。

在一些实施方式中，基于聚合物的颗粒可以包含蛋白质；肽；多糖，特别是壳聚糖。

在一些实施方式中，基于聚合物的颗粒可以包含合成聚合物，特别是聚乙烯亚胺(PEI)、树枝状大分子、聚(DL-丙交酯)(PLA)、聚(DL-丙交酯-共-糖苷)(PLGA)、聚甲基丙烯酸酯和多磷酸酯。

在一些实施方式中，递送颗粒在其表面还包含一种或多种适合与靶向细胞膜处暴露的靶受体结合的配体。

·药物组合物

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含(i)如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体或递送颗粒，和(ii)药学上可接受的载剂。

根据本发明的药物组合物的配制是本领域技术人员公知的。

如本文所提及，如本公开中所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体或递送颗粒可以代表活性剂。

在一些实施方式中，药物组合物可以包含如本公开中所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体或递送颗粒作为唯一的活性剂。

在一些实施方式中，根据本发明的合适的药物上可接受的载剂包括任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。

在某些实施方式中，合适的药物上可接受的载剂可以包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其混合物。

在一些实施方式中，药学上可接受的载剂还可以包括少量辅助物质(例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂)，其增强细胞的保质期或有效性。药学上可接受的载剂的制备和使用在本领域中是公知的。

除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于本发明的药物组合物中。

在一些实施方式中，药物组合物可以通过任何途径施用给有需要的个体，即通过经口施用、局部施用或肠胃外施用，例如通过注射，包括皮下施用、静脉施用、动脉施用、肌内施用、眼内施用和耳内施用。

在某些实施方式中，通过注射施用药物组合物可以直接在目标靶组织中进行，特别是为了避免包含在所述药物组合物中的核酸或核酸载体的扩散。

本发明人认为，当脑组织是靶标时，这尤其重要。核酸载体输注可以非常精确地在脑组织的特定部分中进行，例如通过利用磁共振扫描仪的方式，特别是使用无框立体定向瞄准装置。MRI引导和新的立体定向瞄准装置的使用现已为神经基因疗法成为介入神经学中可接受的程序奠定了坚实的基础。

其他施用模式采用经肺制剂、栓剂和透皮涂抹。

在一些实施方式中，根据本发明的经口制剂包括常用的赋形剂，诸如例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在一些实施方式中，将有效量的所述化合物施用给有需要的所述个体。

在本发明的范围内，“有效量”是指单独刺激所期望的结果(即减轻或根除所涵盖的疾病(特别是癌症)的症状)的所述化合物的量。

为了观察所期望的结果，确定用于编码促催化蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体或递送颗粒的有效量在本领域技术人员的公知范围内。

在本发明的范围内，待施用的化合物的有效量可以由医师或本领域授权技术人员确定，并且可以在治疗的时间过程中适当地调整。

在某些实施方式中，待施用的有效量可以取决于多种参数，包括选择用于施用的材料、施用是单剂量还是多剂量，以及个体的参数(包括年龄、身体状况、尺寸、体重、性别和待治疗疾病的严重程度)。

在某些实施方式中，活性剂的有效量可以包括每剂量单位约0.001mg至约3000mg，优选每剂量单位约0.05mg至约100mg。

在本发明的范围内，每剂量单位约0.001mg至约3000mg包括约0.002mg、0.003mg、0.004mg、0.005mg、0.006mg、0.007mg、0.008mg、0.009mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1100mg、1150mg、1200mg、1250mg、1300mg、1350mg、1400mg、1450mg、1500mg、1550mg、1600mg、1650mg、1700mg、1750mg、1800mg、1850mg、1900mg、1950mg、2000mg、2100mg、2150mg、2200mg、2250mg、2300mg、2350mg、2400mg、2450mg、2500mg、2550mg、2600mg、2650mg、2700mg、2750mg、2800mg、2850mg、2900mg和2950mg。

在某些实施方式中，活性剂的剂量水平可以足以每天递送约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg的受试者体重，优选约0.1mg/kg至约40mg/kg的受试者体重，优选约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg的受试者体重，更优选约1mg/kg至约25mg/kg的受试者体重。

在一些具体的实施方式中，有效量的活性剂可以包含每剂量单位约1x10⁵个至约1x10¹⁵个拷贝的如本公开所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体或递送颗粒。

在本发明的范围内，每剂量单位约1x10⁵个至约1x10¹⁵个拷贝包括2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵、9x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷、4x10⁷、5x10⁷、6x10⁷、7x10⁷、8x10⁷、9x10⁷、1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸、9x10⁸、1x10⁹、2x10⁹、3x10⁹、4x10⁹、5x10⁹、6x10⁹、7x10⁹、8x10⁹、9x10⁹、1x10¹⁰、2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰、9x10¹⁰、1x10¹¹、2x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、8x10¹¹、9x10¹¹、1x10¹²、2x10¹²、3x10¹²、4x10¹²、5x10¹²、6x10¹²、7x10¹²、8x10¹²、9x10¹²、1x10¹³、2x10¹³、3x10¹³、4x10¹³、5x10¹³、6x10¹³、7x10¹³、8x10¹³、9x10¹³、1x10¹⁴、2x10¹⁴、3x10¹⁴、4x10¹⁴、5x10¹⁴、6x10¹⁴、7x10¹⁴、8x10¹⁴、9x10¹⁴个拷贝。

·宿主细胞

在另一方面，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

在一些实施方式中，宿主细胞是真核细胞。

在本发明的范围内，“真核细胞”涵盖动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。

在一些优选的实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。

在某些实施方式中，根据本发明的宿主细胞可以涵盖但不限于中枢神经系统细胞、上皮细胞、肌细胞、胚胎细胞、生殖细胞、干细胞、祖细胞、造血干细胞、造血祖细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)。

在一些特定的实施方式中，宿主细胞不是干细胞、祖细胞、生殖细胞或胚胎细胞。

在一些实施方式中，宿主细胞可以属于选自包括以下的组的组织：肌肉组织、神经组织、结缔组织和上皮组织。

在一些实施方式中，宿主细胞可以属于选自包括以下的组的器官：膀胱、骨、脑、乳房、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、肾、喉、肝脏、肺、食道、卵巢、胰腺、胸膜、前列腺、直肠、视网膜、唾液腺、皮肤、小肠、软组织、胃、睾丸、甲状腺、子宫、阴道。

在某些实施方式中，根据本发明的宿主细胞可以是癌细胞，特别是选自包括以下的组的癌细胞：白血病细胞、癌(carcinoma)细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、颅咽管瘤细胞、胚细胞瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经胶质瘤细胞和间皮瘤细胞。

在一些实施方式中，癌细胞选自包括以下的组：嗅神经母细胞瘤细胞、成胶质细胞瘤细胞、肝母细胞瘤细胞、成神经管细胞瘤细胞、肾母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、胰腺母细胞瘤细胞、胸膜肺母细胞瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞。

·用途

本发明的另一方面涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作药物的用途。

在一方面，本发明还涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用于制备或制造药物的用途。

在另一方面，本发明涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的活性剂的用途。

本发明的另一方面还涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的活性剂的用途。

在某些实施方式中，凋亡的诱导可以在体内、体外或离体进行。

在一个实施方式中，靶细胞是肿瘤细胞。

在一些实施方式中，肿瘤细胞选自包括来自以下的细胞的组：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、子宫颈癌、上呼吸消化道癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞癌、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、骨髓瘤、肾母细胞瘤(威尔姆氏瘤)、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胸膜癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(包括黑色素瘤)、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌和甲状腺癌。

在一方面，本发明涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作治疗和/或预防肿瘤的活性剂的用途。

在一些实施方式中，肿瘤选自包括以下的组：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、子宫颈癌、上呼吸消化道癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞癌、成胶质细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、骨髓瘤、肾母细胞瘤(威尔姆氏瘤)、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胸膜癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(包括黑色素瘤)、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌和甲状腺癌。

在一些实施方式中，本领域技术人员可以理解，离体操作和/或疗法可以涵盖在本发明的范围内，其包括干细胞和祖细胞、造血干细胞和祖细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)和来自不同物种的成体细胞。不希望受理论束缚，本发明人认为当技术人员进行再生医学时这是特别感兴趣的。

在某些实施方式中，本发明涵盖的核酸和核酸载体可以用于工程化动物或植物模型(例如用于临床前研究的动物模型)，考虑到基本的伦理原则。

本发明的另一方面涉及如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸用作过继性细胞转移的活性剂的用途。

·方法

本文公开的方法可以在体外、体内或离体实现。

本发明的另一方面涉及用于将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的方法，该方法包括至少以下步骤：向有需要的个体施用如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

在一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防肿瘤的方法，该方法包括至少以下步骤：向有需要的个体施用如本文所定义的用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体。

在一些实施方式中，上述方法还包括以下步骤：向个体提供缺乏至少一种必需氨基酸(特别是选自包括以下的组的氨基酸)的膳食：组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)和缬氨酸(Val，V)。

在某些实施方式中，上述方法替选地包括以下步骤：施用已知激活包含在调节性多核苷酸中的AARE核酸的化合物，特别是选自包括卤夫酮、衣霉素等的组中的化合物。在一些实施方式中，用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸或核酸载体可以配制成如上所述的药物组合物。

在一些实施方式中，药物组合物可以通过任何途径施用给有需要的个体，即通过经口施用、局部施用或肠胃外施用，例如通过注射，包括皮下施用、静脉施用、动脉施用、肌内施用、眼内施用和耳内施用。

其他施用模式采用经肺制剂、栓剂和透皮涂抹。

在一些实施方式中，根据本发明的经口制剂包含常用的赋形剂，诸如例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在一些实施方式中，将有效量的所述化合物施用给有需要的所述个体。

在本发明的范围内，“有效量”是指单独刺激所期望的结果(即减轻或根除所涵盖的疾病(特别是癌症)的症状)的所述化合物的量。

为了观察所期望的结果，确定用于编码促催化蛋白的核酸的受控表达的核酸、或核酸载体或递送颗粒的有效量在本领域技术人员的公知范围内。

在本发明的范围内，待施用的化合物的有效量可以由医师或本领域授权技术人员确定，并且可以在治疗的时间过程中适当地调整。

在某些实施方式中，待施用的有效量可以取决于多种参数，包括选择用于施用的材料、施用是单剂量还是多剂量，以及个体的参数(包括年龄、身体状况、尺寸、体重、性别和待治疗疾病的严重程度)。

·试剂盒

在另一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括：

-如本文所定义的药物组合物，和

-抗肿瘤化合物。

在一些实施方式中，抗肿瘤化合物可以由本领域技术人员从化疗中常用的化合物中选择。

在某些实施方式中，抗肿瘤化合物可以选自包括以下的组：烷化剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、蒽环霉素、博来霉素、丝裂霉素、拓扑异构酶1抑制剂、拓扑异构酶2抑制剂、taxan、单克隆抗体、细胞因子、蛋白激酶抑制剂等。

实施例

1/方法

1.1/伦理声明.

本文获得的实验数据根据INRA指南，符合欧洲动物福利法规。小鼠维持和所有实验已经经由我们的机构-动物护理和使用委员会批准，符合法国和欧盟法律(对小鼠进行实验的许可B63-150，当地伦理委员会CEMEA CE10-13，动物设施协议C6334514，GMO协议4756CA-I)。

1.2/动物和实验膳食.

如Chaveroux等(Science signaling；2015,8(374):rs5)所述，在我们的实验室中工程化在AARE控制下表达荧光素酶基因的C57Bl/6转基因小鼠。将Fisher大鼠和BalB/C和C57Bl/6小鼠圈养在INRA的动物设施中。裸小鼠购自Janvier labs(SM-NU-6S-M)。对于每个实验，使用每组6只6周龄雄性。如果动物在肿瘤内或组织递送慢病毒和饲喂方案之间的时间段期间死亡，则将该动物排除在研究之外。检查者在膳食施用和治疗方面没有设盲。除非另有说明，否则动物可以随时随意获取食物和水。将动物分别圈养在塑料笼中，并在无病原体环境中在22℃的温度下进行12小时光/暗循环。如先前在Maurin.等(Cell Metab,2005,1,273-277)中进行营养实验。

一般而言，他们的设计应该符合与使用啮齿动物有关的偶然性，考虑到啮齿动物经常蚕食且食粪。因此，在使小鼠经受缺少氨基酸的用食之前，过夜禁食期是必要的，同时确保在该期间给动物提供刚刚清洁的笼子。在这样做时，当提供用食时动物挨饿且饥饿并且将容易地食用营养膳食。在每个实验中控制食物摄入。如有必要，强制饲喂也可以是一种选择，但应该在对动物没有压力的条件下进行。实验膳食是在INRA膳食核心设施(Unité dePréparation des Aliments Expérimentaux,INRA)中制造的。

1.3/体内慢病毒转导和流体力学注射程序.

如下进行胰腺注射：用异氟烷麻醉6周龄雄性C57Bl/6小鼠，并通过中线切口进行剖腹术。将含有2x10⁷个颗粒的慢病毒载体溶液施用至脾静脉中。注射后10天，给禁食16小时的小鼠饲喂对照或不含异亮氨酸的膳食6小时。在实验结束时，通过使用生物发光成像系统(IVIS光谱，PerkinElmer)测量全身和切除的胰腺生物发光。

在6周龄雄性344只大鼠(每组6只动物)中进行海马体施用慢病毒颗粒。用异氟烷麻醉动物并置于立体定向框架中。在注射之前，用无菌PBS稀释慢病毒载体以达到10x10⁹个的滴度。将2-μL体积的病毒制剂单侧注射到海马体的齿状回区域重。通过使用Hamilton 5-μL注射器和27G注射器，在4分钟的时间内以0.5μL/分钟的速度注射制剂。

通过在对应于小鼠的10％体积的盐水生理缓冲液中稀释50μg pGL3-2XAARETRB3-Tk-LUC质粒来制备流体力学注射剂，并且在5秒的时间内施用至6周龄雄性BalB/C小鼠的尾静脉中(每组6只动物)。注射后24小时，给禁食16小时的小鼠饲喂对照或不含异亮氨酸的膳食6小时。在实验结束时，通过使用生物发光成像系统(IVIS光谱，PerkinElmer)测量全身和切除的肝脏生物发光。

对于体内生物发光实验，在基因转移方法后，通过IVIS光谱测量评估基础光发射。将小鼠分别按荧光素酶活性进行分级并分配到实验组中以确保不同组之间的平均生物发光活性相等。

1.4/体内肿瘤异种移植物模型.

通过将悬浮在200μL DMEM中的2x10⁶个Gli36-luc细胞注射到左侧区域中来获得肿瘤。在异种移植物植入1周时间后，根据肿瘤的光发射对小鼠进行分级，然后将其分配到实验组中以确保各组之间的平均肿瘤体积相等。然后向肿瘤注射10⁹个慢病毒颗粒并使其经受指定的营养条件。在异种移植物植入1周时间后，向肿瘤注射10⁹个慢病毒颗粒并使其经受指定的营养条件。每周用生物发光成像系统(IVIS光谱，Perkin-Elmer)测量所得肿瘤的大小。在终点时，处死小鼠并通过外科手术收获肿瘤，称重、拍照并快速冷冻用于随后的蛋白质分析。

1.5/血浆氨基酸分析.

从麻醉小鼠的主动脉抽取血液样品。纯化血浆氨基酸，即将100μL血浆加入到预先蒸发的30μL磺基水杨酸溶液(1mol/L在乙醇中，含有0.5mol/L硫二甘醇)中。添加正亮氨酸作为内标来评价样品处理效率，然后将其用于校正原始值。使用L8900氨基酸分析仪(法国科塔布夫ScienceTec)和BTC 2410树脂(Hitachi Chemical)测定氨基酸浓度。

1.6/身体测量.

通过将受约束的各个小鼠置于小鼠EchoMRI-100仪器(Echo Medical SystemsLLC)中来确定脂肪量和瘦体重。对于肌肉萎缩评估，在实验24天后，对腓肠肌、比目鱼肌和胫骨前后肢骨骼肌进行加权。将来自饲喂缺乏EAA的膳食的小鼠的结果报告给对照组数据并以百分比表示。

1.7/细胞培养和慢病毒转导.

将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、HeLa和Gli36-luc细胞在含有10％胎牛血清的杜尔贝科氏改良的伊戈尔培养基F12(Dulbecco’s modified Eagle’s medium F12，DMEM F12)(Sigma)中、在37℃下培养。当指出时，使用缺乏亮氨酸的DMEM F12(DMEM F12 Base)(Sigma)。在涉及氨基酸饥饿的所有实验中，使用10％透析的小牛血清。Gli36-Luc细胞是Shah K博士(马塞诸塞州波士顿哈佛医学院)的馈赠。GCN2-/-和PERK-/-MEF由D.Ron和H.Harding博士(英国剑桥代谢科学研究所)馈赠。PKR-/-MEF来自John C Bell博士(加拿大渥太华健康研究所)。通过PCR和蛋白质印迹分析验证KO MEF，以及通过荧光素酶测定验证Gli36-Luc细胞。所有细胞系均不含支原体。在聚凝胺(5μg/mL)存在下，通过使用为10的MOI，用LV-AARE-eGFP或LV-AARE-TRAIL载体转导Gli36-luc细胞。感染后48小时，将细胞转移到10cm培养皿并维持用于实验目的。

1.8/免疫印迹分析和抗体.

如先前在Maurin.等(Cell reports,2014,6,438-444)中所述进行蛋白质印迹。使用的一抗是：抗-磷酸-eIF2α(Abcam，ab32157)、抗-ATF4(Santa Cruz，sc-200)、抗-肌动蛋白(Santa Cruz，sc-1616R)、抗-切割的PARP(Cell signaling tech.，5625)、抗-TRAIL(Cell signaling tech.，3219)。

1.9/瞬时转染和荧光素酶测定.

将细胞涂铺在24孔板中，并通过磷酸钙共沉淀法转染，如先前在Bruhat等(MolCell Biol,2000,20,7192-7204)中所述。对于所有转染实验，使用质粒pCMV-βGAL作为内部对照。相对荧光素酶活性以相对荧光素酶单位/相对-Gal单位的比率给出。所有值均是根据三次独立实验的结果计算的平均值(每组3个样品)。

1.10/质粒和慢病毒构建.

通过将含有两个拷贝的不同AARE序列的SacI-XhoI双链寡核苷酸插入pcDNA3-TK-Luc质粒中构建2XAARE TRB3-Tk-LUC、2XAARE CHOP-Tk-LUC和2XAARE ATF3-Tk-LUC质粒。通过用对应于各条AARE序列的双链序列替换侧接有Xho1和HindIII限制性位点的TK最小启动子序列，获得2XAARE TRB3-β-珠蛋白-LUC构建体。通过合成eGFP和人TRAIL cDNA序列(GeneCust)(侧接有Nco1和Xba1限制性位点)获得2XAARE TRB3-Tk-eGFP和2XAARE TRB3-Tk-TRAIL慢病毒。然后将DNA盒插入含有来自Trib3基因的两个拷贝的AARE的HIV-INS载体中。2XAARE TRB3-Tk-eGFP和2XAARE TRB3-Tk-TRAIL慢病毒在载体学设施(巴黎ICM)中产生。

为了便于操作，2XAARE TRB3-Tk-TRAIL构建首先在pENTR质粒中实施，如SEQ IDNO:8所述。

1.11/细胞存活、凋亡和ELISA测定.

用XTT细胞存活力试剂盒(Cell signaling tech.,9095)测量细胞的存活力。使用ANXA5/PE/7-AAD凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,559763)按照制造商的说明通过流式细胞术分析评价细胞凋亡。关于ELISA测定，处理后16小时，收集培养基并用于用人TRAIL/TNFSF10Quantikine ELISA试剂盒(R&D系统，DTRL00)测定TRAIL蛋白。

1.12/统计.

每个细胞实验重复3次。所有动物实验组均由6只小鼠或大鼠组成。使用GraphPadPrism 6(GraphPad软件)生成所有统计分析，并且所有数据表示为平均值±SEM。对于两个或更多个实验组之间的比较，经由学生t检验或双因素ANOVA(随后Bonferroni事后检验，调整成对比较p值)评估统计学显著性，其中α水平为0.05。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

2/结果

2.1/应答于氨基酸缺陷来控制转录的异体系统的优化和体内验证

基于先前的结果，优化了由EAA可用性控制的新基因表达系统。如先前报道的，Trb3、Chop和Atf3基因的表达在GCN2-eIF2α-ATF4途径激活后上调，并暗示ATF4募集至特异性AARE以诱导其表达(图1)。这些AARE作为Chop和Atf3启动子内核心序列的单拷贝存在，或作为Trb3启动子中三个拷贝的重复存在。

在转染的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中测试了使用荧光素酶作为报告基因的与两种最小启动子(胸苷激酶和β-珠蛋白)融合的这些AARE的不同组合。使用与TK启动子相关的两个拷贝的Trb3AARE(6个重复的核心序列)获得最高应答性，从而应答于具有低背景水平的亮氨酸饥饿产生6倍诱导(未显示)。具有β-珠蛋白最小启动子的构建体提供了相似的诱导水平，其中相应的背景水平比TK启动子高3倍(未显示)。因此，所有进一步的实验都是用两个与TK最小启动子相关的Trb3 AARE进行的。该构建体被命名为AARE驱动的表达系统(图2)。

最后，当稳定整合到小鼠(MEF)或人(HeLa)细胞中时(未显示)，通过氨基酸饥饿维持该构建体的可诱导性得到了验证。除GCN2外，eIF2α可以在哺乳动物组织中被三种其他激酶磷酸化：PKR(由dsRNA和细胞因子激活)、PERK(由内质网应激激活)或HRI(由血红素缺乏激活)。HRI以红系细胞特异性方式表达；因此，注意力集中在普遍表达的激酶GCN2、PKR和PERK的作用上。应答于亮氨酸饥饿，在GCN2-/-细胞中完全消除了荧光素酶诱导，而在PERK-/-和PKR-/-细胞中没有观察到效果，证明转基因调节严格依赖于GCN2表达(未显示)。接下来，我们就亮氨酸浓度测试了荧光素酶表达的体外诱导。报告基因表达的诱导与亮氨酸浓度成反比(未显示)。最值得注意的是，在该体外实验中，触发转录激活的亮氨酸浓度类似于摄入缺乏亮氨酸的膳食后在哺乳动物中获得的浓度，表明它在体内也同样有效。

考虑到生物体快速吸收膳食游离氨基酸，制备了合成膳食，其中蛋白质部分被游离氨基酸的混合物替代。在这种情况下，当膳食缺少一种EAA时，血液中该EAA的水平应该迅速降低。为了将这种基因调节系统的概念转化到动物，我们首先测试了缺乏亮氨酸的膳食对餐后血液亮氨酸含量的影响。图3显示了在摄入对照用食后的餐后期期间血液亮氨酸水平增加。形成鲜明对比的是，早在摄入缺乏亮氨酸的膳食后30分钟时，亮氨酸血症急剧减少。

通过利用先前工程化的AARE驱动的荧光素酶小鼠模型进一步评估AARE驱动的表达系统的体内验证，Chaveroux等(Science signaling,2015,8(374):rs5)。摄入不含亮氨酸的膳食导致腹腔中的生物发光一到3小时就显著增加，并且维持至少12小时(图4)。16小时至24小时的禁食期对转基因表达没有影响(图5)。先前的工作表明，在摄入缺乏亮氨酸的膳食后，GCN2-eIF2α-ATF4途径在体内快速激活。例如，在无亮氨酸用食开始后1小时显著诱导编码Trb3的肝mRNA。获得可测量的生物发光的延迟是由于必须积累足够的荧光素酶。如先前的体外结果所预期的，该实验提供了AARE驱动的表达系统在体内也起作用的明确指示。

2.2/确定AARE-驱动的表达体系的最佳营养诱导

在哺乳动物中，必须在膳食中供应9种EAA，并且缺少其中任何一种EAA代表AARE驱动的表达系统的潜在诱导物。将独立耗尽9种EAA中的每一种的膳食的效果与AARE驱动的荧光素酶表达水平进行比较。首先，确定在膳食摄入后缺乏EAA的血液浓度显著下降。降低的程度从一种氨基酸变化到另一种氨基酸(未显示)。在将动物转换为特定膳食后6小时，通过体内生物发光成像在AARE驱动的荧光素酶小鼠中测量荧光素酶活性的诱导比率。在异亮氨酸或色氨酸饥饿的情况下，诱导比率从5变化到超过50。如所预期的，在禁食小鼠或用丧失非必需氨基酸(例如丙氨酸)的膳食饲喂的小鼠中未观察到荧光素酶诱导。这些结果突出了AARE驱动的表达系统的灵活性，其中每个个体EAA可以充当潜在的诱导物。

2.3/“基于营养”的长期转基因表达方案

基因疗法需要转基因的长期表达。考虑到长期EAA丧失在生理学上无关，通过利用AARE驱动的表达系统的灵活性来测试维持转基因长期表达的能力。为此，进行了丧失氨基酸的膳食的脉冲交换缺乏EAA的每一种。在该范式中，如图6所述，将AARE驱动的荧光素酶小鼠进行营养循环6天。每天监测腹部生物发光(图7)。生物发光的定量清楚地表明，在膳食攻击后24小时，转基因表达恢复到接近基础的水平。再诱导遵循类似的动力学，最大水平取决于缺乏的AA。缺乏EAA的膳食的饲喂周期对蛋白质代谢没有影响，条件是氨基酸从一个循环到另一个循环不同。在已经进行上述循环营养方案24天(如图8所示的4个营养周期)的动物中监测体重、瘦体重和脂肪量的百分比以及肌肉重量。如图9至图12所示，相对于对照，这些生理参数均未被修改。

2.4/基于营养的调节系统在体内基因转移的背景下是有效的

然后通过靶向与基因疗法相关的各种组织来研究营养在基因转移实验设置中调节AARE驱动的表达系统的能力。尽管GCN2-eIF2α-ATF4途径普遍存在，但某些器官比其他器官对不含EAA的膳食更敏感。来自喂食缺乏EAA膳食的转基因小鼠的数据显示该途径在脑和许多代谢器官(包括肝脏和胰腺)中起作用(未显示)。与先前基于转基因小鼠的实验类似，给动物饲喂包括过夜饥饿、然后饲喂缺乏异亮氨酸的膳食6小时的营养方案。

在一系列实验中，首先将携带由AARE驱动的荧光素酶的质粒的流体力学注射剂探到Balb/C小鼠的尾静脉中，从而允许肝脏转染。与对照膳食相比，应答于6小时膳食异亮氨酸饥饿，显著诱导腹部区域和收集的肝脏中的生物发光(图13)。肝蛋白提取物的荧光素酶测定证实了荧光素酶活性的这种增加(图14)。

在第二组实验中，用携带由AARE驱动的荧光素酶的慢病毒载体转导胰腺组织。应答于诱导物膳食，在胰腺中观察到明显的发光诱导，这通过测量蛋白质提取物中的荧光素酶活性来证实(图15和图16)。在小鼠的其他部分没有检测到信号。最后，为了测试脑中AARE驱动的表达系统的调节，在大鼠的海马体(即通过立体定向注射容易接近的大脑区域)中进行AARE驱动的Luc表达系统的慢病毒注射。左侧海马体接受含有AARE-Luc序列的慢病毒颗粒，而右侧接受没有AARE序列的颗粒。在营养方案完成时，在脑提取物中测量荧光素酶活性。如图17所示，含有携带AARE驱动的Luc表达系统的载体的左侧海马体的脑提取物表现出增加的荧光素酶活性，而右侧海马体和左侧海马体的非注射区域表现出背景活性。

在这些体内研究的背景下，观察到AARE驱动的表达系统可以在腹膜内注射卤夫酮(一种通过抑制脯氨酰--tRNA合成酶18来模拟氨基酸饥饿的GCN2的药理学激活剂)后在肝脏和胰腺中进行药理学诱导(未显示)。GCN2的药理学激活可以提供营养方案的替选方案。然而，正在等待对卤夫酮的特异性、药代动力学和潜在不良反应进行的仔细评估。

2.5/施加“基于营养”的方案以调节危险治疗因子的表达

在一些情况下，可能需要根据患者的需要和/或在不希望的毒性效应的情况下消除其表达来严格调节治疗因子的水平。选择TRAIL作为目标基因。TRAIL是一种分泌的细胞因子，其通过与特异性的死亡受体结合以引发凋亡而以旁分泌的方式起作用。已经对TRAIL进行了深入研究，特别是在成胶质细胞瘤细胞中。它具有短的生物半衰期(30分钟)并且在全身施用后迅速从体内清除。然而，正常人体细胞长期暴露于TRAIL仍可能有毒。

在该背景下，长期的“基于营养的”方案可以代表调节TRAIL表达的合适解决方案。人Gli36-荧光素酶细胞用作成胶质细胞瘤细胞的模型。组成型表达荧光素酶的这些细胞用AARE驱动的TRAIL表达系统转导。首先，确定TRAIL蛋白表达应答于亮氨酸饥饿而被诱导，分泌到培养基中，对周围细胞具有旁分泌作用并触发凋亡(未显示)。

最后，我们测试了在裸小鼠中TRAIL表达对Gli36-荧光素酶成胶质细胞瘤异种移植物的影响。将慢病毒载体直接注射到肿瘤中(细胞植入后1周)，并应用上述长期“基于营养的”方案2周。通过生物发光成像评估肿瘤发展。值得注意的是，TRAIL表达阻止肿瘤生长，在总水平上没有明显的毒性(-EAA组)，而用对照膳食饲喂的类似动物没有显示出抑制(对照组)(图18和图19)。来自肿瘤的蛋白质的免疫印迹分析显示，只有来自-EAA组的小鼠显示凋亡标志物切割的PARP升高，表明在这些细胞中发生了凋亡过程而在对应物对照中没有(图20和图21)。

重要的是，在-Ile膳食期6小时后，仅在来自-EAA组的肿瘤中检测到TRAIL蛋白。正如所料，营养方案本身对肿瘤生长没有影响(未显示)。总的来说，这些发现验证了AARE驱动的表达系统生成转基因表达脉冲的能力，从而允许长期/间歇性基因疗法治疗。

3/讨论

长期以来一直在等待治疗基因表达的时间调节以拓宽基因疗法的临床效用。本文显示了最初在与营养丧失生理学相关的基础研究的背景下发现的调节系统如何提供非常简单、高度特异性、可靠和稳健的用于控制外源转基因的表达的方法，并显示出从实验室转换到临床实践所期望的性质。

这种基于营养的调节系统的开发利用了感应氨基酸缺乏的适应性GCN2-eIF2α-ATF4信号转导途径。当杂食性动物面临限制在一种EAA中的食物时，这种从酵母到人保守的途径被触发，如果只有一种植物蛋白质来源可获得时这是可以在自然环境下经常发生的情况。

GCN2-eIF2α-ATF4途径的激活仅仅应答于EAA不平衡膳食的摄入而发生，并且不参与其他人营养条件。生理条件(例如禁食)不影响氨基酸血液浓度到如此程度以致于它将触发GCN2途径。应答于长时间的禁食，所有氨基酸的血液浓度将通过补偿机制维持，所述补偿机制涉及肝脏中然后肌肉中的蛋白水解增加。

已经在许多组织(例如肝脏、胰腺和脑的不同部分)中发现了GCN2-eIF2α-ATF4途径，从而揭示了AARE驱动的表达系统对许多疾病的巨大潜在适用性。它是独特的并且没有展示出固有毒性，因为它不基于依赖于可以生成免疫应答的非人/病毒转录因子/调节性蛋白的外源配体诱导系统。此外，它不需要(特别是对于长期治疗)可以产生毒性作用的药理学诱导物。

基于营养素的调节系统提供了一种稳健且灵活的方法来精确调节所期望基因的表达，因为诱导物膳食由易被吸收的游离氨基酸组成，从而导致EAA快速血滴动力学和触发治疗转基因。给定转基因的表达水平将取决于膳食中缺乏的特定EAA。早晨，由患者服用的由游离氨基酸组成的膳食预期不会对患者构成挑战。使用即食膳食包装类似于服用食物补充剂。在该临床背景下，还特别值得注意的是，市售的并且在枫糖浆尿病(MSUD)中验证的无亮氨酸膳食的医药配方可以容易地与AARE系统结合使用。此外，可以开发出适合患者个体需求和口味的新配方。在诱导期后，患者可以在几小时后恢复进食正常的膳食。在需要时，可以通过每天或每隔几天交替膳食来获得转基因的持续表达。

与基因置换/手术相反，转基因表达的及时外源调节似乎特别适合药理学基因疗法的情况。基因置换/手术策略允许通过真正的功能性对应物替换缺陷基因，从而避免了对外源调节的需要。相反，与常规药理学治疗类似的药理学基因疗法可能需要长期/间歇性调节转基因表达。相关情况由营养因子(tropic factor)代表，这些因子在神经退行性病症的情况下受到相当大的关注。特别地，神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)已被证明对于成年大脑中多巴胺能神经元的存活是必需的，并且正在评价帕金森氏病(Parkinson’sdisease)的基因疗法方法。

给定调节系统的动力学是解决通过基因转移供应的给定药物的药理学性质的关键特征。为了具有临床相关性，基因调节系统应该在载体的安全剂量范围内在大剂量范围的诱导物上进行调节，并且表现出低水平的背景表达。在这方面，结果部分中描述的促凋亡TRAIL细胞因子的研究提供了转基因表达和所得生理/临床效应之间的直接和定量比较。

具体地，在不存在膳食异亮氨酸的情况下，诱导肿瘤中表达的TRAIL水平估计比在对照条件下获得的微弱信号强100倍以上。值得注意的是，TRAIL表达阻止肿瘤生长，在总水平上没有明显毒性，而用对照膳食饲喂的动物未显示出肿瘤抑制。与营养方案相关的这种高诱导比率提供了极大的灵活性，使转基因表达水平适应最佳治疗水平并在需要时消除背景底活性。因此，在临床环境中，应该能够通过处理以下来生成有效且安全剂量的治疗性分子：(i)治疗载体的剂量，(ii)驱动治疗性转基因的最小启动子的强度，(iii)相应RNA的(去)稳定化，(iv)选择将满足所有功效和安全性问题的丧失EEA的膳食。

鉴于eIF2α-ATF4信号传导途径是ER应激应答的三个分支中的一个的一部分的事实，AARE系统在特定情况下可以充当内源受控系统。因此，在严格地在患病组织内递送载体后，AARE依赖性转录可以在例如某些肿瘤或患有阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的患者的某些脑区域的情况下变得内部激活。在这些情况下，可以内源性地触发治疗基因的表达，而不诉诸于缺乏EAA的膳食。或者，当治疗因子是具有旁分泌作用的分泌蛋白时，可以通过将载体注射到邻近的健康组织中然后进行膳食诱导来获得治疗效果。

最后，基于营养的调节系统显示为在载体骨架的情况下是有效的，例如在有效转导许多类型的细胞并且是目前用于基因疗法试验的最有希望的病毒载体之一的慢病毒载体的情况下。该发现要求测试其他载体的表达AARE系统的能力，这可以进一步证明营养调节系统的灵活性和潜力。显然，AARE系统突出了基因疗法领域的一个新概念，即合成膳食可以实现对治疗性转基因表达的严格和稳健的时间控制，从而解开了将基因疗法方案转化为临床结果的常见障碍。

用于本发明中的核酸序列

下表1公开了本文所用的核酸序列：

SEQ ID No:	序列	注释
			1	CGGTTTGCATCACCCG	来自TRIB3基因的AARE序列
2	AACATTGCATCATCCC	来自CHOP基因的AARE序列
			3	GAAGTTTCATCATGCC	来自ASNS基因的AARE序列
4	AGCGTTGCATCACCCC	来自ATF3基因的AARE序列
			5	GATATTGCATCAGTTT	来自SNAT2基因的AARE序列

调节性多肽包含胸苷激酶(Tk)最小启动子和六个拷贝的来自TRIB3基因的AARE核 酸序列：SEQ ID NO:6

TRAIL蛋白的cDNA：SEQ ID NO:7

包含六个拷贝的来自Trib3基因序列的AARE核酸、Tk最小启动子和编码TRAIL蛋白 质的cDNA的质粒pENTR：SEQ ID NO:8

序列表

<110> 国家农艺研究院(INRA)

国家科学研究中心(CNRS)

<120> 编码促凋亡蛋白的核酸的膳食受控表达

<130> PR77922

<150> US62/345,162

<151> 2016-06-03

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自TRIB3基因的AARE序列

<400> 1

cggtttgcat cacccg 16

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自CHOP基因的AARE序列

<400> 2

aacattgcat catccc 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自ASNS基因的AARE序列

<400> 3

gaagtttcat catgcc 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自ATF3基因的AARE序列

<400> 4

agcgttgcat cacccc 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自SNAT2基因的AARE序列

<400> 5

gatattgcat cagttt 16

<210> 6

<211> 317

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含胸苷激酶(Tk)最小启动子和来自TRIB3基因的6个拷贝的AARE核酸序

列的调节性多肽

<400> 6

ggtaccgatt agctccggtt tgcatcaccc ggaccggggg attagctccg gtttgcatca 60

cccggaccgg gggattagct ccggtttgca tcacccggac cgggggccgg gcgcgtgcta 120

gcgattagct ccggtttgca tcacccggac cgggggatta gctccggttt gcatcacccg 180

gaccggggga ttagctccgg tttgcatcac ccggaccggg gactcgaggt ccacttcgca 240

tattaaggtg acgcgtgtgg cctcgaacac cgagcgaccc tgcagcgacc cgcttaacag 300

cgtcaacagc gtgccgc 317

<210> 7

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TRAIL蛋白的cDNA

<400> 7

atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60

atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120

gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180

gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc 240

aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt 300

tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag 360

agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac 420

tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg 480

cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg 540

ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca 600

aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 660

ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat 720

tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta 780

acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt tttttggggc ctttttagtt 840

ggctaaaccg gtgctagctc taga 864

<210> 8

<211> 3806

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含六个拷贝的来自Trib3基因序列的AARE核酸、Tk最小启动子和编码TRAIL

蛋白质的cDNA的质粒pENTR

<400> 8

caccggtacc gattagctcc ggtttgcatc acccggaccg ggggattagc tccggtttgc 60

atcacccgga ccgggggatt agctccggtt tgcatcaccc ggaccggggg ccgggcgcgt 120

gctagcgatt agctccggtt tgcatcaccc ggaccggggg attagctccg gtttgcatca 180

cccggaccgg gggattagct ccggtttgca tcacccggac cggggactcg aggtccactt 240

cgcatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta 300

acagcgtcaa cagcgtgccg caagcttgaa ttctgatcag cattccggta ctgttggaaa 360

gccaccatgg ctatgatgga ggtccagggg ggacccagcc tgggacagac ctgcgtgctg 420

atcgtgatct tcacagtgct cctgcagtct ctctgtgtgg ctgtaactta cgtgtacttt 480

accaacgagc tgaagcagat gcaggacaag tactccaaaa gtggcattgc ttgtttctta 540

aaagaagatg acagttattg ggaccccaat gacgaagaga gtatgaacag cccctgctgg 600

caagtcaagt ggcaactccg tcagctcgtt agaaagatga ttttgagaac ctctgaggaa 660

accatttcta cagttcaaga aaagcaacaa aatatttctc ccctagtgag agaaagaggt 720

cctcagagag tagcagctca cataactggg accagaggaa gaagcaacac attgtcttct 780

ccaaactcca agaatgaaaa ggctctgggc cgcaaaataa actcctggga atcatcaagg 840

agtgggcatt cattcctgag caacttgcac ttgaggaatg gtgaactggt catccatgaa 900

aaagggtttt actacatcta ttcccaaaca tactttcgat ttcaggagga aataaaagaa 960

aacacaaaga acgacaaaca aatggtccaa tatatttaca aatacacaag ttatcctgac 1020

cctatattgt tgatgaaaag tgctagaaat agttgttggt ctaaagatgc agaatatgga 1080

ctctattcca tctatcaagg gggaatattt gagcttaagg aaaatgacag aatttttgtt 1140

tctgtaacaa atgagcactt gatagacatg gaccatgaag ccagtttttt tggggccttt 1200

ttagttggct aaaccggtgc tagctctaga aagggtgggc gcgccgaccc agctttcttg 1260

tacaaagttg gcattataag aaagcattgc ttatcaattt gttgcaacga acaggtcact 1320

atcagtcaaa ataaaatcat tatttgccat ccagctgata tcccctatag tgagtcgtat 1380

tacatggtca tagctgtttc ctggcagctc tggcccgtgt ctcaaaatct ctgatgttac 1440

attgcacaag ataaaaatat atcatcatga acaataaaac tgtctgctta cataaacagt 1500

aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt cgaggccgcg attaaattcc 1560

aacatggatg ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt 1620

gcgacaatct atcgcttgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc 1680

aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa 1740

tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc 1800

accactgcga tccccggaaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt 1860

gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt 1920

aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat 1980

aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa 2040

gtctggaaag aaatgcataa acttttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt 2100

gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt 2160

ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt 2220

gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat 2280

atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt tctaatcaga attggttaat 2340

tggttgtaac actggcagag cattacgctg acttgacggg acggcgcaag ctcatgacca 2400

aaatccctta acgtgagtta cgcgtcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 2460

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 2520

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 2580

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 2640

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 2700

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 2760

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 2820

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg 2880

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 2940

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 3000

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 3060

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 3120

ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 3180

gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 3240

gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 3300

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tacgcgtacc 3360

gctagccagg aagagtttgt agaaacgcaa aaaggccatc cgtcaggatg gccttctgct 3420

tagtttgatg cctggcagtt tatggcgggc gtcctgcccg ccaccctccg ggccgttgct 3480

tcacaacgtt caaatccgct cccggcggat ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca 3540

aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt ccgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc 3600

tggcagttcc ctactctcgc gttaacgcta gcatggatgt tttcccagtc acgacgttgt 3660

aaaacgacgg ccagtcttaa gctcgggccc caaataatga ttttattttg actgatagtg 3720

acctgttcgt tgcaacaaat tgatgagcaa tgctttttta taatgccaac tttgtacaaa 3780

aaagcaggct ccgcggccgc cccctt 3806

Claims (16)

1.一种用于在个体中编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸，其包括：

-调节性多核苷酸，所述调节性多核苷酸包含最小启动子和至少一种AARE(氨基酸应答元件)核酸，在摄入缺乏至少一种必需氨基酸的膳食后所述调节性多核苷酸在个体中被激活；和

-编码促凋亡蛋白的核酸，所述编码促凋亡蛋白的核酸被置于所述调节性多核苷酸的控制下。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述氨基酸应答元件(AARE)核酸选自包括具有以下序列的核酸的组：SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的核酸，其中，所述调节性多核苷酸包括至少两种AARE核酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中，所述促凋亡蛋白是TRAIL。

5.一种用于编码促凋亡蛋白的核酸的受控表达的核酸载体，所述核酸载体包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸。

6.一种递送颗粒，所述递送颗粒包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸或根据权利要求5所述的核酸载体。

7.根据权利要求6所述的递送颗粒，所述递送颗粒在其表面处包含适用于结合至在靶细胞的膜处暴露的靶受体的一种或多种配体。

8.一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)根据权利要求1至4中任一项所述的核酸、或根据权利要求5所述的核酸载体、或根据权利要求6或7所述的递送颗粒，和(ii)药学上可接受的载剂。

9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸或根据权利要求5所述的核酸载体。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸用作药物的用途。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸用作用于将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的活性剂的用途。

12.根据权利要求11所述的核酸的用途，其中，所述靶细胞是肿瘤细胞。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸用作用于治疗和/或预防肿瘤的活性剂的用途。

14.一种用于将凋亡诱导到至少一种靶细胞中的方法，所述方法包括至少向有需要的个体施用根据权利要求1至4中任一项所述的核酸或根据权利要求5所述的核酸载体的步骤。

15.一种用于治疗和/或预防肿瘤的方法，所述方法包括至少向有需要的个体施用根据权利要求1至4中任一项所述的核酸或根据权利要求5所述的核酸载体的步骤。

16.一种用于治疗和/或预防肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括：

-根据权利要求8所述的药物组合物，和

-抗肿瘤化合物。