JP6307149B2 - 癌細胞を選択的に死滅させるためのｔｒａｉｌエンハンサー - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月19日に出願された米国仮特許出願第61/803,177号の優先権の恩典を主張し、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、HHSN27200700038C、AI077644、AI079436、およびAI094348の下で政府支援によって行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

背景
アポトーシスは、細胞死の遺伝的にプログラムされた生理学的に重要な形態である。それは、健康な成人の組織における細胞ターンオーバーの維持を介して正常な発達において重要な役割を有する保存された細胞恒常性維持機構である。異常なアポトーシス活性が、持続性炎症性疾患を含む、自己免疫疾患および感染症の病因と関連付けられた（Gyrd-Hansen, et al., Nat Rev Cancer 10(8) 561-74（非特許文献1））。アポトーシスを回避することはまた癌の特徴であると確認された（Hanahan D., et al., Cell 2000, 100(1), 57-70（非特許文献2））。従って、アポトーシスプロセスを誘発することは、癌細胞を死滅させること、およびそれらを種々の治療レジメンに対して感作することについて重要であり得る（Ashkenazi, A., Nat Rev Drug Discov 2008, 7(12), 1001-12（非特許文献3）; Ashkenazi, A, et al., J Clin Invest 1999, 104(2), 155-62（非特許文献4））。

癌治療法についての有望な候補には、外因性アポトーシス経路とも呼ばれる、受容体媒介機構を介しての腫瘍壊死因子（TNF）関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）開始アポトーシスがある。TNFおよびFaxリガンド（FasL）などの天然のアポトーシス促進リガンドとは対照的に、マウスへのTRAIL注入は、組織および器官に対して致死的な反応または検出可能な毒性を引き起こさなかった（Ashkenazi, A., Nat Rev Drug Discov 2008, 7(12), 1001-12（非特許文献3）; Ashkenazi, A, et al., J Clin Invest 1999, 104(2), 155-62（非特許文献4）; Walczak, H. et al., Nat Med 1999, 5(2), 157-63（非特許文献5））。さらに、癌細胞を死滅させるためのTRAILの潜在的な重要性が、このサイトカインが正常組織ではなくヒト腫瘍移植片に対して選択毒性を有することを実証する動物モデルにおける研究によって支持された。しかし、TRAIL誘導性アポトーシスに対する感受性はTRAIL治療の効能を限定する重要な因子であり、何故ならば、様々な感受性が、異なる悪性細胞において観察されるためである（Lippa, M.S. et al., Apoptosis 2007, 12(8), 1465（非特許文献6））。さらに、正常細胞と同様に、いくつかの癌細胞もTRAIL誘導性アポトーシスに対して耐性である。

アポトーシスの分子の詳細の理解が進み、腫瘍細胞は、外因性または内因性アポトーシスシグナル伝達経路のいずれかへの干渉を介してアポトーシスに対する耐性を獲得し得ることが示されている。しかし、大抵の癌細胞は、抗アポトーシス効果を克服することができる機構によって誘発されると、アポトーシスを受ける能力を保持している。例えば、NF-κB活性の阻害は、アポトーシス刺激によって誘導されるアポトーシスを著しく増加させる（Beg. A.A., et al, Science 1996, 274 (5288), 782-4（非特許文献7）; Wang, C.Y., et al., Science 1996, 274 (5288), 784-7（非特許文献8）; Van Antwerp, D.J., et al., Science 1996, 274 (5288), 787-9（非特許文献9）; Liu, Z.G., et al., Cell 1996, 87(3), 565-76（非特許文献10））。さらに、アポトーシスの増強はまた、小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（UPR）として真核細胞において公知の、小胞体（ER）ストレスまたはJNK経路を含む、いくつかの細胞内非アポトーシス性シグナル伝達プロセスの活性化で生じる（Ron, D. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2007, 8(7), 519-29（非特許文献11））。ツニカマイシン、タプシガルギンおよびRRR-α-トコフェロールエーテル結合酢酸アナログ（α-TEA）などのUPR活性化剤が、TRAIL誘導性アポトーシスに対して癌細胞を感作することが観察された（Jiang, C.C., et al., Cancer Res 2007, 67(12), 5880（非特許文献12）; Chen, L.H. et al., Carcinogenesis 2007, 28(11), 2328-36; （非特許文献13） Tiwary, R., et al., PLoS One 5(7), e11865（非特許文献14））。しかし、これらの試薬は、UPRの構成的かつ持続的な活性化を誘導する。

細菌代謝産物は、癌を含む、多数の慢性疾患の病因および正常な発達に必須の炎症媒介プロセスにおいて重要な役割を果たす。炎症は、典型的に、受容体依存機構を介しての特定の細菌産物に対する自然免疫反応として開始され、ここで、転写因子NF-κBの誘導が、免疫系の活性化および活性化細胞におけるアポトーシスの制御の両方のために必要とされる。例えば、グラム陰性細菌の存在下において、NF-κB活性化が、Toll様受容体4（TLR4）のアゴニストである細菌性リポ多糖類（LPS）に応答して最初に誘導され、腫瘍壊死因子-α（TNF）およびインターロイキン-1（IL-1）などの炎症促進性サイトカインをコードするNF-κB調節遺伝子が発現される。TNFまたはIL-1受容体の連結後、NF-κB活性化のさらなるラウンドが、このLPS誘導性炎症反応を増幅する。NF-κB依存プロセスは、他のシグナル伝達経路と協力して、特に癌細胞におけるアポトーシス細胞死の必須のメディエーターである、TNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）を含む、アポトーシス促進性癌免疫監視エフェクターの発現をアップレギュレートする。LPS誘導性炎症反応はTNFおよびTRAILなどのアポトーシス促進サイトカインを放出させるが、これらの死のシグナルを受容する癌細胞は、アポトーシスに対するNF-κBシグナル伝達の抑制効果に起因して、依然として生き延びることができる。

Gyrd-Hansen, et al., Nat Rev Cancer 10(8) 561-74 Hanahan D., et al., Cell 2000, 100(1), 57-70 Ashkenazi, A., Nat Rev Drug Discov 2008, 7(12), 1001-12 Ashkenazi, A, et al., J Clin Invest 1999, 104(2), 155-62 Walczak, H. et al., Nat Med 1999, 5(2), 157-63 Lippa, M.S. et al., Apoptosis 2007, 12(8), 1465 Beg. A.A., et al, Science 1996, 274 (5288), 782-4 Wang, C.Y., et al., Science 1996, 274 (5288), 784-7 Van Antwerp, D.J., et al., Science 1996, 274 (5288), 787-9 Liu, Z.G., et al., Cell 1996, 87(3), 565-76 Ron, D. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2007, 8(7), 519-29 Jiang, C.C., et al., Cancer Res 2007, 67(12), 5880 Chen, L.H. et al., Carcinogenesis 2007, 28(11), 2328-36 Tiwary, R., et al., PLoS One 5(7), e11865

概要
本発明は、様々な態様において、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、もしくは細胞増殖の阻害、またはそれらの任意の組み合わせを誘導する方法に関する。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、正常細胞と比較して癌細胞において優先的にアポトーシスを誘導し；しかし、腫瘍細胞はTRAIL耐性を生じ得る。本明細書において、本発明者らは、この耐性が、細菌性アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログまたはAHL産生細菌の存在下で、TRAIL誘導性アポトーシスとNF-κBシグナル伝達によって調節される炎症のAHL媒介阻害との組み合わせ効果を介して克服され得ることを実証する。この発見は、細菌と宿主免疫監視とのこれまでは認識されていなかった共生的な結び付きを明らかにする。

本発明は、様々な態様において、有効量の下記式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物：

またはその薬学的に許容される塩、および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供し、式中、Rは、
1つもしくは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つもしくは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、もしくはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、AHL化合物は、式(II)の化合物：

であってよく、
式中、R¹は、
(a)ジアジレニル基；
(b)1つもしくは複数のカルボニル基；
(c)または、1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

例えば、式(I)の化合物は、ラクトン環への窒素原子の結合の位置でのキラル中心に関して化合物の(S)-エナンチオマーであり得る。

様々な態様において、本発明は、有効量の上述の式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物を患者へ投与する工程を含む、患者における腫瘍を治療する方法を提供する。任意で、有効量の腫瘍調節剤、例えばTRAILポリペプチドも投与することができる。

様々な態様において、本発明は、有効量のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）化合物、および任意で、有効量の腫瘍調節剤、例えばTRAILポリペプチドと、腫瘍細胞とを接触させる工程を含む、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法を提供し、ここで、AHL化合物は上述の式(I)のものである。

様々な態様において、本発明は、本発明の方法の実施に有用な、本発明のAHLアナログの合成方法を提供する。

様々な態様において、本発明は、容器中に、薬学的に許容される液体媒体中に溶解されていてもよい本発明の化合物、例えば化合物(S)-(3-N₂)を含むキットを提供し、キットは、第2容器中に、薬学的に許容される液体媒体中に溶解されていてもよい腫瘍調節剤、例えばTRAILをさらに含んでいてもよく、投与もしくは保管情報または両方をさらに含んでいてもよい。
[本発明1001]
有効量の下記式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意で薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物：

式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。
[本発明1002]
化合物が、式(II)：

のものであり、
式中、R ¹ が、
（j）ジアジレニル基；
（k）1つもしくは複数のカルボニル基；または
（l）1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1003]
TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤をさらに含む、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1004]
N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログが、

からなる群より選択される、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1005]
有効量の下記式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物：

または薬学的に許容される塩、および任意で薬学的に許容される賦形剤を患者へ投与する工程を含み、
式中、Rが、
1つまた複数のジアジレニル基を有し、1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である、患者における腫瘍を治療する方法。
[本発明1006]
化合物が、式(II)の化合物：

であり、
式中、R ¹ が、
（g）ジアジレニル基；
（h）1つもしくは複数のカルボニル基；または
（i）1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである、本発明1005の患者における腫瘍を治療する方法。
[本発明1007]
TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤の有効量を投与する工程をさらに含む、本発明1005の患者における腫瘍を治療する方法。
[本発明1008]
N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログが、

からなる群より選択される、本発明1005の患者における腫瘍を治療する方法。
[本発明1009]
腫瘍が、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳房腫瘍、および脳腫瘍からなる群より選択される、本発明1005の患者における腫瘍を治療する方法。
[本発明1010]
式(I)の化合物またはその薬学的に許容される塩：

式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。
[本発明1011]
化合物が、式(II)の化合物：

であり、
式中、R ¹ が、
（g）ジアジレニル基；
（h）1つもしくは複数のカルボニル基；または
（i）1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである、本発明1010の化合物。
[本発明1012]
TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤と薬学的に組み合わされた、本発明1010の化合物。
[本発明1013]
N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログが、

からなる群より選択される、本発明1010の化合物。
[本発明1014]
腫瘍細胞と、有効量のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）化合物および有効量のTRAILとを接触させる工程を含み、AHL化合物が式(I)：

のものであり、
式中、Rが、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である、
腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法。
[本発明1015]
有効量のAHLアナログが、腫瘍細胞において、小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（UPR）の、小胞体膨張（endoplasmic reticulum swelling）（ERS）の、または両方の活性化剤である、本発明1014の、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法。
[本発明1016]
化合物が、式(II)の化合物：

であり、
式中、R ¹ が、
（f）ジアジレニル基；
（g）1つもしくは複数のカルボニル基；および
（h）1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである、
本発明1014の、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法。
[本発明1017]
N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログが、

からなる群より選択される、本発明1014の、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法。

（図１）C12は哺乳動物細胞においてUPRを誘導する。（AおよびB）緑膿菌（P.a.）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）（S.t.）、および黄色ブドウ球菌（S.a.）に対するマクロファージ反応性の比較。細菌での処理後の細胞抽出物中の、XBP1のRT-PCRアッセイ（A）、ならびにp38、そのリン酸化形態（p-p38）、ならびにPERKのリン酸化形態（p-PERK）およびeIF2αのリン酸化形態（p-eIF2α）のウェスタンブロット分析（B）を示す。（C）マクロファージを緑膿菌野生型（wt）またはlasI変異体（ΔlasI）で刺激し、細胞抽出物（トータルRNAまたはトータルタンパク質）を調製し、（AおよびB）におけるように分析した。（DおよびE）化合物（C12）、即ち、(S)-エナンチオマー、または(R)-エナンチオマー（C12R）、または加水分解産物（C12h）での処理後のマクロファージから調製されたトータルRNA中のXBP1またはアクチンのRT-PCRアッセイを示す。（F）トータルRNAをビヒクル（-）または(C12)の接種後のマウスの肺から調製し、(D)におけるように分析した。（G）化合物(C12)、(C12R)および(C12h)の化学構造。化合物(C12)は、以下の式の化合物の(S)-エナンチオマーである：

。
（図２）C12はスフィンゴリピド代謝の調節を介してUPRを誘導する（AおよびB）。記載されるようにCHX（A）またはD-MAPP（B）の存在または非存在下においてC12、Tm、またはTgで処理されたマクロファージから調製されたトータルRNA中のXBP1のRT-PCRアッセイ。（C）ウェスタンブロット分析は、eIF2α（p-eIF2α）およびp38（p-p38）の(C12)誘導性リン酸化に対するD-MAPPの効果を示し；アクチンについてのウェスタンブロットはローディング対照である。（D）マクロファージをD-MAPPの存在または非存在下においてLPSで刺激し、トータルタンパク質抽出物を調製し、p-p38およびIκBαの発現についてウェスタンブロットによって分析した。（E）RT-PCRアッセイ（上部パネル）またはウェスタンブロット（下部パネル）は、(C12)、スフィンゴシン(Sph) 、またはジメチルスフィンゴシン(DMS)での処理後のマクロファージから調製されたサンプル中のXBP1またはeIF2αもしくはp-p38のレベルをモニタリングする。（F）TLCアッセイは、記載されるようにDMSO（ビヒクル）またはC12で処理されたマクロファージ中の³H-Sph代謝をモニタリングする。標準スフィンゴリピドの位置を左側に示す。Cer、セラミド；Sph、スフィンゴシン；S1P、スフィンゴシン1-リン酸；SM、スフィンゴミエリン。
（図３）TNF、C12、またはC12およびTNFの組み合わせによって誘導されるアポトーシスに対する癌性および非癌性細胞の感受性。記載されるように、細胞をTNF、(C12)またはTNFおよび(C12)の組み合わせと共にインキュベートし、PARPの切断（アポトーシスマーカー）をウェスタンブロットによって測定した。（AおよびB）対照ベクター（ベクター）およびBcl-2またはCLARPを発現するベクターをトランスフェクトした乳癌MCF-7細胞。（C）HeLa細胞株、（D）正常ヒト気管支上皮細胞（NHBE）。
（図４）C12はTRAILに対して肺癌細胞株A549を感作する。（A）TRAIL(50 ng/ml)、化合物(C12)(1μM)、化合物(C12R)(25μM)、またはTRAIL（T）と(C12)もしくは(C12R)との記載の組み合わせを含有する培地中で24時間インキュベーション後に、細胞の生存能力を試験した。(C12)およびその立体異性体(C12R)の化学構造を右側に示す。（B）細胞の生存能力を、TRAIL(50 ng/ml)および記載の用量のC12を含有する培地中で24時間インキュベーション後に試験した。処理後に残存している生存可能な細胞を、XTTに基づく毒物学アッセイキット(Sigma)に従って生細胞のミトコンドリア活性の関数として測定し、生存可能な未処理細胞のパーセンテージとして示す。
（図５）C12はTRAIL誘導性アポトーシスに対して肺癌細胞株A549を感作する。細胞をTRAIL、(C12)、またはTRAILおよび(C12)の組み合わせで記載の時間の間処理し、細胞抽出物を、アポトーシスマーカー（カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、またはPARPの切断形態）、ストレス応答（eIF2α、p38、またはJNKのリン酸化形態）、およびアクチン（ローディング対照）について、ウェスタンブロット分析によって調べた。
（図６）初代ヒトB細胞はC12の存在下でTRAILに対して耐性である。（A）細胞をTRAIL（T）、(C12)、タプシガルギン（Tg）、または記載の組み合わせによって処理した。24時間処理後に残存している生存可能な細胞を、XTTに基づく毒物学アッセイキット(Sigma)に従って生細胞のミトコンドリア活性の関数として測定し、生存可能な未処理細胞のパーセンテージとして示す。（B）細胞をTRAIL、(C12)、タプシガルギン（Tg）、または記載の組み合わせによって6時間処理した。細胞抽出物を、アポトーシスマーカーとしてのPARPの切断について、またはローディング対照としてのアクチンについて、ウェスタンブロット分析によって調べた。
（図７）TRAILおよび(C12)の組み合わせに対する癌性および非癌性細胞の感受性。正常ヒト気管支上皮（NHBE）および癌性ヒトHeLa細胞を、TRAILおよび記載の用量の(C12)と共にインキュベートし、未処理対照に対する細胞生存能力をXTTアッセイによって測定した。
（図８）(C12)の安全性およびアポトーシス促進活性。記載されるように、細胞を、TRAIL、(C12)、ボルメタゾミド（bormetazomid）（Bor）、またはTRAILと(C12)もしくはBorとの組み合わせと共にインキュベートし、細胞生存能力（上部パネル）またはPARPの切断（下部パネル）を測定した。（A）肺癌細胞株A549。（B）正常ドナー由来の初代ヒト肝細胞。
（図９）TRAILに対する癌性細胞の感受性に対する(C12)媒介効果および化合物番号15媒介効果の比較。（A）A549細胞の生存能力を、TRAIL（25 ng/ml）および記載の用量の(C12)またはそのアナログ(番号15)（表1を参照）を含有する培地中で24時間インキュベーション後に調べた。（B）A549細胞をTRAIL、ツニカマイシン（Tu）、タプシガルギン（Tg）、化合物番号15、(C12) 、または記載の組み合わせによって処理した。細胞抽出物を、アポトーシスマーカーとしてのPARPの切断について、またはローディング対照としてのアクチンについて、ウェスタンブロットによって調べた。
（図１０）アナログの生物学的活性。（A）肺癌A549細胞を、記載されるように、(C12)またはそのアナログ（化合物13、16、および17、表1参照）で処理し、細胞抽出物を、eIF2αまたはp38のリン酸化形態について、およびローディング対照としてのアクチンについて、ウェスタンブロットによって調べた。（B）A549細胞を、TRAIL、化合物、(C12) 、または記載の組み合わせによって処理し、細胞抽出物を調製し（6時間処理）、 (A)に記載したように、アポトーシスマーカーとしてのPARPの切断についてウェスタンブロットによって調べた。
（図１１）(C12)産生細菌または(C12)は、癌細胞においてサイトカイン媒介アポトーシスを促進する。（a）この研究において調べたAHLの化学構造。（b）記載されるように、肺癌細胞を、TNFまたはTRAILの存在または非存在下において、緑膿菌(Bac)野生型（wt）またはlasI変異株（ΔlasI）有りまたは無しでインキュベートした。2時間後、細胞溶解物を調製し、PARPまたはローディング対照としてのアクチンに特異的な抗体を用いて免疫ブロット法によって分析した。（c）肺細胞を、6時間、記載の用量の(C12)の存在下においてTNFまたはTRAILで処理したかまたは処理せず（モック（Mock））；細胞サンプルを（b）におけるように分析した。（d）TRAIL、(C12) 、またはそれらの組み合わせに対する肺細胞反応性の比較。記載されるように、刺激での処理後に調製した細胞抽出物中におけるPARP、IκBα、p38のリン酸化形態（p-p38）、およびアクチンのウェスタンブロット分析。
（図１２）(C12)は癌細胞のTRAILが媒介する死滅を促進する。（a）、（c）記載されるように、TRAIL、(C12)、または両方の組み合わせで3時間処理された癌または正常細胞中のPARP切断のウェスタンブロット分析。（b）、（d）TRAILおよび記載の用量の(C12)を含有する培地中で18時間増殖させた癌および正常細胞の生存能力をモニタリングするXTTに基づくアッセイ。細胞生存は、対照サンプル（未処理細胞）において、ならびにTRAIL単独と共にまたはTRAIL無しで同じ用量の(C12)と共にインキュベートされたサンプルにおいて、約100％であった。
（図１３）炎症誘導性NF-κBシグナル伝達のAHL媒介阻害は、腫瘍をTRAIL誘導性アポトーシスに感受性にするために十分である。（a）記載されるようにTRAILまたは種々のAHLとのその組み合わせで3時間刺激した癌細胞におけるPARP切断のウェスタンブロット分析。（b）記載されるように、(C12)または(3-N₂)、即ち、(S)-(3-N₂)で刺激された骨髄由来マクロファージ（BMDM）からの抽出物中におけるPARP切断ならびにeIF2αおよびp38のリン酸化形態のウェスタンブロット分析。（c）LPSまたは(C12)もしくは(3-N₂)とのその組み合わせでの処理後に調製したBMDM抽出物中におけるPARP切断およびIκBα発現の時間的プロフィールのウェスタンブロット分析。（d）BMDM中のLPS誘導性TNF産生に対する(C12)およびその誘導体の阻害効果。（e）記載されるように肺癌細胞を(3-N₂)(10μΜ)、TRAIL(0.5 ng/ml)、TNF(20 ng/ml) 、またはそれらの組み合わせへ曝露した。2時間後、細胞溶解物を調製し、PARP切断、IκBα、およびアクチンについてウェスタンブロットによって分析した。

詳細な説明
アルキル基は、1〜約20炭素原子、典型的に1〜12炭素、またはいくつかの態様において1〜8炭素原子を有する、直鎖および分岐アルキル基ならびにシクロアルキル基を含む。直鎖アルキル基の例としては、1〜8炭素原子を有するもの、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、およびn-オクチル基が挙げられる。分岐アルキル基の例としては、イソプロピル、iso-ブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、および2,2-ジメチルプロピル基が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用する場合、用語「アルキル」は、n-アルキル、イソアルキル、およびアンテイソアルキル（anteisoalkyl）基、ならびにアルキルの他の分岐鎖形態を包含する。

アルケニル基は、2つの炭素原子間に少なくとも1つの二重結合が存在することを除いては、上記に定義されるような直鎖および分岐鎖ならびに環状アルキル基を含む。従って、アルケニル基は、2〜約20炭素原子、典型的に2〜12炭素、またはいくつかの態様において2〜8炭素原子を有する。例としては、特に、ビニル、-CH=CH(CH₃)、-CH=C(CH₃)₂、-C(CH₃)=CH₂、-C(CH₃)=CH(CH₃)、-C(CH₂CH₃)=CH₂、シクロヘキセル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、およびヘキサジエニルが挙げられるが、これらに限定されない。

アルキニル基は、2つの炭素原子間に少なくとも1つの三重結合が存在することを除いては、直鎖および分岐鎖アルキル基を含む。従って、アルキニル基は、2〜約20炭素原子、典型的に2〜12炭素、またはいくつかの態様において2〜8炭素原子を有する。例としては、特に、-C≡CH、-C≡C-CH₃)、-C≡C-CH₂CH₃)、-CH₂C≡CH、-CH₂C≡C-CH₃)、および-CH₂C≡C-CH₂CH₃)が挙げられるが、これらに限定されない。

置換基が一価を超える場合（例えば、二価であるO）、それは、2つ以上の結合と置き換わって原子へ結合され得、即ち、二価置換基は二重結合によって結合され；例えば、Oで置換されたCは、カルボニル基C=Oを形成し、これは「CO」、「C(O)」、または「C(=O)」とも記載され得、ここで、CおよびOは二重結合されている。炭素原子が二重結合酸素（=O）基で置換されている場合、酸素置換基は「オキソ」基と呼ばれる。アルキル、アルケニル、またはアルキニル基がカルボニル基を含むと本明細書に記載される場合、指されるものは、それぞれ、鎖の炭素原子が酸素原子へ二重結合されている、アルキル、アルケニル、またはアルキニル鎖であり、例えば、以下の式のものである：

式中、波線は結合点を示す。カルボニル基はまた、アルキル、アルケニル、またはアルキニルの任意の他の炭素原子へ結合され得る。

用語「ハロ」または「ハロゲン」または「ハロゲン化物」は、それら自体でまたは別の置換基の一部として、特に指定のない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、好ましくは、フッ素、塩素、または臭素を意味する。

「ハロアルキル」基としては、モノ-ハロアルキル基、ポリ-ハロアルキル基（ここで、全てのハロ原子は同一であっても異なっていてもよい）、およびペル-ハロアルキル基（ここで、全ての水素原子が、フルオロなどのハロゲン原子によって置き換えられている）が挙げられる。ハロアルキルの例としては、トリフルオロメチル、1,1-ジクロロエチル、1,2-ジクロロエチル、1,3-ジブロモ-3,3-ジフルオロプロピル、ペルフルオロブチルなどが挙げられる。

「ヒドロキシル」基は、炭素結合されるOH基である。

用語「アジド」は、式

のN₃基を指し、式中、波線は結合点を示す。

「ジアジレニル」基は、その用語が本明細書において使用される場合、1つの炭素原子および2つの窒素原子を含む3員環を指し、ここで、2つの窒素原子は互いへ二重結合されており、各窒素原子は炭素原子へ単結合されており、例えば、構造：

のものを指し、ここで、四面体炭素原子は、2つのさらなる置換基へ結合され得る。アルキル、アルケニル、またはアルキニル基がジアジレニル基を含むと本明細書に記載される場合、指されるものは、それぞれ、鎖の飽和炭素原子が2つの窒素原子の各々へ結合された炭素原子である、アルキル、アルケニル、またはアルキニル鎖である。例えば、ジアジレニル基を含むC10アルキル基は、式

のものであり得、式中、波線は結合点を示す。ジアジレニル基はまた、アルキル、アルケニル、またはアルキニルの任意の他の炭素原子へ結合され得る。

「N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ」は、その用語が本明細書において使用される場合、カーン-インゴルド-プレローグシステムに従って指定される(S)絶対配置の式(I)の化合物

を指すことができ、式中、R基は、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル鎖であり、これは、ジアジレニル基、カルボニル基、または両方を組み込むことができ、かつ上記に定義される基でさらに置換され得る。

式(I)の化合物の例は、化合物(3-N₂)である：

。

ジアジレン（diazirene）はアシル鎖の3-炭素へ結合されており、この命名法を全体にわたって使用する。

明らかであるように、ブチロラクトン環置換の位置にキラル中心が存在する。従って、化合物はいずれかの立体配置のものであり得るが、(S)-(3-N₂)化合物が好ましく、これは以下：

のように様々に表示することができ、構造の意味に変更はなく、両方とも(S)-エナンチオマーを示す。

天然のAHL化合物：

化合物（C14）
が存在し、これらは、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するため、または癌を有する患者を治療するための、本発明の方法の様々な態様において使用され得る。

「塩」は、当技術分野において周知のとおり、イオン型のカルボン酸、スルホン酸、またはアミンなどの有機化合物を、対イオンとの組み合わせで含む。例えば、酸はそれらのアニオン型で、金属カチオン、例えば、ナトリウム、カリウムなどのカチオンと；NH₄ ⁺などのアンモニウム塩もしくはテトラメチルアンモニウムなどのテトラアルキルアンモニウム塩を含む様々なアミンのカチオンと、またはトリメチルスルホニウムなどの他のカチオンなどと塩を形成しうる。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩は、塩化物塩またはナトリウム塩などの、ヒトの消費のために承認されており、一般に非毒性のイオンから形成される塩である。「両性イオン」は、互いに平衡を保つのに役立つ少なくとも2つのイオン化可能な基であって、一方はアニオンを形成し、他方はカチオンを形成する基を有する分子内で形成されうるものなどの、内部塩である。例えば、グリシンなどのアミノ酸は両性イオン型で存在することができる。「両性イオン」は、本明細書における意味内の塩である。本発明の化合物は塩の形を取ってもよい。「塩」なる用語は、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩を含む。塩は「薬学的に許容される塩」でありうる。「薬学的に許容される塩」なる用語は、薬学的適用において有用性を提供する範囲内の毒性を有する塩を意味する。薬学的に許容されない塩は、それにもかかわらず、高い結晶性などの特性を有し得、これは、例えば、本発明の化合物の合成、精製または製剤化のプロセスにおける有用性などの、本発明の実施において有用性を有する。

適切な薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸または有機酸から調製してもよい。無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸が含まれる。適切な有機酸は、有機酸の脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族（araliphatic）、複素環式、カルボン酸およびスルホン酸類から選択してもよく、その例にはギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン（パモ）酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が含まれる。薬学的に許容されない酸付加塩の例には、例えば、過塩素酸塩およびテトラフルオロホウ酸塩が含まれる。

典型的な組成物は、本発明の化合物、および担体または希釈剤であり得る薬学的に許容される賦形剤を含む。例えば、活性化合物は、通常、担体と混合されるか、または担体によって希釈されるか、またはアンプル、カプセル、サシェ、ペーパー、もしくは他の容器の形態であり得る担体内に封入される。活性化合物を担体と混合する場合、または担体が希釈剤として役立つ場合、それは、活性化合物についてのビヒクル、賦形剤、または媒体として作用する、固体、半固体または液体材料であり得る。活性化合物は、例えばサシェ中に含有された、顆粒状固体担体上に吸着され得る。好適な担体のいくつかの例は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、落花生油、オリーブ油、ゼラチン、ラクトース、白土、スクロース、デキストリン、炭酸マグネシウム、砂糖、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸もしくはセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、ならびにポリビニルピロリドンである。同様に、担体または希釈剤は、単独または蝋と混合された、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの、当技術分野において公知の任意の徐放性物質を含み得る。

製剤は、活性化合物と有害に反応しない助剤と混合され得る。このような添加剤は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤および／または着色物質、保存剤、甘味剤または矯味矯臭剤を含み得る。組成物はまた、必要に応じて滅菌することができる。

投与経路は、適切なまたは所望の作用部位へ本発明の活性化合物を有効に輸送する任意の経路、例えば、経口、経鼻、経肺、頬側、皮膚下、皮内、経皮、または非経口、例えば、直腸、デポー、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、眼科用液剤または軟膏剤であり得、経口経路が好ましい。

固体担体が経口投与について使用される場合、調製物は、錠剤化され、粉末もしくはペレット形態で硬ゼラチンカプセル中に置かれ得るか、またはそれはトローチ剤もしくはロゼンジ剤の形態であり得る。液体担体が使用される場合、調製物は、シロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤、または無菌注射用液体、例えば、水性もしくは非水性液体懸濁剤もしくは液剤の形態であり得る。

注射用投薬形態は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる、水性懸濁剤または油懸濁剤を一般に含む。注射用形態は、溶媒または希釈剤を用いて調製される、懸濁剤の形態または溶液相であり得る。許容される溶媒またはビヒクルとしては、滅菌水、リンゲル液、または等張食塩水溶液が挙げられる。あるいは、無菌油が溶媒または懸濁化剤として使用され得る。好ましくは、天然油または合成油、脂肪酸、モノ−、ジ−またはトリ−グリセリドを含む、油または脂肪酸は、不揮発性である。

注射について、製剤はまた、上記のような適切な溶液で再構成するのに好適な粉末であってもよい。それらの例として、凍結乾燥粉末、ロータリー乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または微粒子が挙げられるが、これに限定されない。注射について、製剤は、任意で、安定剤、pH調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティーモディファイヤー、およびこれらの組み合わせを含有し得る。化合物は、ボーラス注射または持続注入などの注射による非経口投与用に処方してもよい。注射用の単位投薬形態は、アンプル中または複数用量容器中に存在してもよい。

本発明の製剤は、当技術分野において周知の手順を用いることにより、患者への投与後に活性成分を迅速放出、持続放出または遅延放出するように設計してもよい。従って、製剤はまた、制御放出または徐放できるように処方してもよい。

本発明によって意図される組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、またはいくつかの別の封入形態を含んでもよく、あるいは、長期の貯蔵および／または送達効果を提供するため、徐放性放出形態で投与してもよい。従って、製剤をペレットまたはシリンダーに圧縮し、筋肉内または皮下にデポー注射剤として埋め込んでもよい。こうした埋没物は、シリコーンおよび生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの公知の不活性材料を利用してもよい。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。

経鼻投与について、調製物は、エアロゾル適用のために、液体担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁させた本発明の化合物を含有し得る。担体は、可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤、吸収促進剤、例えばレシチン（ホスファチジルコリン）もしくはシクロデキストリン、または保存剤、例えばパラベンなどの、添加剤を含有し得る。

非経口適用について、特に好適なのは、注射用液剤または懸濁剤、好ましくは活性化合物をポリヒドロキシ化ヒマシ油に溶解させた水溶液である。

タルクおよび／または炭水化物担体もしくは結合剤などを含む錠剤、糖剤またはカプセル剤は、経口適用に特に好適である。錠剤、糖剤またはカプセル剤に好ましい担体としては、ラクトース、コーンスターチ、および／またはポテトスターチが挙げられる。甘味ビヒクルを利用してもよい場合、シロップ剤またはエリキシル剤を使用してもよい。

通常の打錠技術によって調製しうる典型的な錠剤は下記を含むことができる：
核：
活性化合物（遊離化合物またはその塩として） 250mg
コロイド状二酸化ケイ素（Aerosil）(登録商標) 1.5mg
微結晶セルロース（Avicel）(登録商標) 70mg
調整セルロースゴム（Ac-Di-Sol）(登録商標) 7.5mg
ステアリン酸マグネシウム 全量まで（Ad.）
コーティング：
HPMC概算 9mg
^*Mywacett 9-40 T概算 0.9mg
^*フィルムコーティング用の可塑剤として用いるアシル化モノグリセリド。

経口投与用の典型的なカプセル剤は、本発明の化合物（250mg）、ラクトース（75mg）およびステアリン酸マグネシウム（15mg）を含有する。混合物を60メッシュのふるいを通し、No.1ゼラチンカプセルに充填する。典型的な注射用調製物は、本発明の化合物250mgをバイアルに無菌的に入れ、無菌的に凍結乾燥させ、密封することによって製造される。使用のために、バイアルの内容物を2mLの無菌生理食塩水と混合して、注射用調製物を製造する。

本発明の化合物を、哺乳動物、特に不良状態（malcondition）のそのような治療、予防、除去、緩和または改善を必要としているヒトに投与することができる。そのような哺乳動物には、飼い慣らされた動物、例えば、家庭内ペット、家畜、および野生生物などの飼い慣らされていない動物の両方の動物も含まれる。

本発明の化合物は、広い投薬量範囲にわたり有効である。例えば、成人ヒトの治療の場合、1日当たり約0.05〜約5000 mg、好ましくは約1〜約2000 mg、より好ましくは約2〜約2000 mgの投薬量を使用することができる。典型的な投薬量は、1日当たり約10 mg〜約1000 mgである。患者のレジメンを選択する際、頻繁には、より多い投薬量から始め、状態がコントロールされたとき、投薬量を減らす必要がある場合がある。正確な投薬量は、化合物の活性、投与モード、所望の治療法、投与される形態、治療される対象および治療される対象の体重、ならびに担当の医師または獣医師の優先度および経験によって異なる。

一般に、本発明の化合物は、単位投薬量当たり約0.05 mg〜約1000 mgの活性成分と薬学的に許容される担体を含む単位投薬形態に小分けにする。

通常、経口、経鼻、経肺または経皮投与に適した投薬形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合された約125μg〜約1250 mg、好ましくは約250μg〜約500 mg、より好ましくは約2.5 mg〜約250 mgの化合物を含む。

投薬形態は、毎日投与しても、または1日2回もしくは3回など1日2回以上投与してもよい。あるいは、処方する医師により望ましいことが分かった場合、投薬形態は、1日おきまたは週1回など毎日より少ない頻度で投与してもよい。

詳細な説明
本発明者らは、不完全な免疫系機能を有する宿主においてのみ感染を促進することができる日和見病原体である、グラム陰性細菌緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を調べた（Smith, R. S. and Iglewski, B. H. (2003) Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target. J Clin Invest 112, 1460-5）。化合物(C12)：

は、この細菌によって大量に産生されるシグナル伝達分子であるので、本発明者らは、野生型緑膿菌（P. aeruginosa）、または化合物(C12)の合成を担う遺伝子であるlasIを欠いている変異株が、アポトーシスの示唆的な特徴であるポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ（PARP）のTNF-またはTRAIL-誘導性切断に対して肺癌細胞を感受性にすることができるかどうかを調べた。面白いことに、PARP切断は、細胞がTRAILおよび野生型細菌の組み合わせを受容した場合にのみ検出され（図11b）、このことは、化合物(C12)が癌細胞におけるTRAIL誘導性アポトーシスのために必要であったことを示唆している。特に、他のAHL産生細菌をサイトカインで刺激された細胞へ添加した場合に、同様の結果が観察され、一方、AHLシンターゼを有さない細菌は効果を有さなかった。さらに、滴定実験は、C12またはいくつかの天然のAHLアナログの直接の添加が、TNFまたはTRAILに対する強力なアポトーシス促進反応を生じさせ、本発明者らの細菌実験と一致して、細胞はTRAILに対する感受性がより高くなったことを確認した（図11c）。

NF-κBシグナル伝達の活性化はアポトーシスを阻害するので、TNFおよびTRAILのアポトーシス促進効果において観察された差異は、NF-κB活性を調節するこれらのサイトカインの異なる能力と関連付けられ得る。この解釈と一致して、NF-κBシグナル伝達の示唆的な生化学マーカーである、IκBαの分解および再合成についてのウェスタンブロット分析は、TRAILに応答してではなくTNFに応答してNF-κBシグナル伝達のロバストな活性化を明らかにした。NF-κBまたはアポトーシスシグナル伝達の調節はTRAILまたは化合物(C12)に応答して誘導されなかったが、IκBαのレベルの実質的な変化が、化合物(C12)およびTRAILの組み合わせで刺激された肺癌細胞中におけるPARP切断と一致した（図11d）。興味深いことには、本発明者らはまた、TRAILおよび化合物(C12)の組み合わせ作用は、p38のリン酸化形態（図11d；p-p38）についてのウェスタンブロット分析によって測定されたように、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）p38の延長された活性化を生じさせたことを観察した。これらの知見は、化合物(C12)は、NF-κB、p38または両方のシグナル伝達プロセスの調節を介して、癌細胞においてアポトーシスを実行するTRAILの能力を増強することを示唆している。

TRAIL受容体の発現にもかかわらず、正常細胞はTRAIL誘導性アポトーシスに対して耐性である。非形質転換細胞と同様に、多くの悪性細胞は、TRAILのアポトーシス促進作用に対して感受性がないかまたは部分的にだけ感受性がある。従って、TRAIL依存性腫瘍免疫監視の調節因子としての化合物(C12)の選択性を評価するために、本発明者らは、TRAILおよび化合物(C12)に対するいくつかの癌細胞株および正常細胞の感受性を比較した。本発明者らの以前の観察と一致して、PARP切断の実質的な誘導が、化合物(C12)およびTRAILの組み合わせで刺激された肺、結腸および乳癌細胞において観察された。対照的に、正常ドナー由来のヒト肝細胞ならびに正常組織由来の他の初代細胞は同一の処理に対して耐性であった（図12aおよび12c）。重要なことには、TRAIL＋化合物(C12)での癌細胞のより長い処理は、それらの生存能力を著しく減少させ、しかし、正常細胞の生存に対する効果は見られなかった（図12bおよび12d）。

これらのデータは、TRAIL依存性抗癌活性のエンハンサーとしての化合物(C12)の治療的可能性を示すが、初代マクロファージなどの免疫細胞に対する(C12)媒介アポトーシス促進効果に関する問題に取り組むことが依然として必要とされた。C12に関連する潜在的な固有の薬物動態責任（pharmacokinetic liability）を考慮して、化合物(C12)アナログの小さなシリーズを、骨髄由来マクロファージおよびTRAIL処理肺癌細胞に対して試験した。これらの研究から、3-オキソ部分を欠いているAHLは、両方のアッセイにおいて完全に不活性であることがわかり；しかし、その(S)-エナンチオマーが参照される、化合物(3-N₂)と呼ばれる、化合物(C12)の3-ジアジリン含有誘導体：

は、マクロファージに対しては無毒性であるとわかったが、親分子と同様の様式でTRAIL処理癌細胞に対して毒性を示し、ここで、ジアジリン環（即ち、2つの窒素原子の間に二重結合を含有する）は化合物(C12)のカルボニル基に取って代わっている（構造、合成、およびキャラクタリゼーションデータについては、下記の実施例を参照のこと）。さらに、本発明者らはまた、TRAIL耐性癌細胞においてTRAIL誘導性PARP切断に対する化合物(C12)および化合物(3-N₂)の匹敵する効果を観察した（図13a）。

TRAILのアポトーシス促進作用に対するAHL媒介効果と(C12)または化合物(3-N₂)のアゴニスティックポテンシャルとの間で構造-活性関係をよりよく定義するために、これらの化合物に対するマクロファージの反応を、PARP切断、p38の活性化、および真核生物翻訳開始因子2α（eIF2α）のリン酸化（C12およびその3-オキソ-アナログに応答しての哺乳動物細胞活性化の別の特徴）について、ウェスタンブロット分析によって調べた。化合物(C12)および化合物(3-N₂)のアゴニスト活性の比較は、両方の化合物が同様の様式でeIF2αリン酸化を誘導し；しかし、化合物(3-N₂)はp38リン酸化およびPARP切断を誘導しないことを明らかにし（図13b）、このことは、p38経路の活性化は、以前に開示されたように、食作用活性を刺激することに加えて、AHL誘導性アポトーシスを促進することを示唆している。

そのアゴニスト活性に加えて、化合物(C12)はまた、多種多様の細胞型においてTNF、LPSおよび他のTLRリガンドに対する炎症反応を阻害する。マクロファージにおいて、C12の抗炎症活性は、IκBαおよびTNFなどのNF-κB標的遺伝子の誘導性発現を妨げる。本発明者らの結果はまた、IκBα依存性NF-κBシグナル伝達のAHL媒介中断は、癌細胞をTNF-およびTRAIL-誘導性アポトーシスに対して感受性にすることを示唆している（図11dを参照）。従って、化合物(3-N₂)が刺激誘導性NF-κBシグナル伝達に影響を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは、LPSまたは化合物(C12)もしくは化合物(3-N₂)とのその組み合わせによって活性化されたマクロファージ中におけるIκBα発現の動力学を比較した。奇妙なことに、予想されたアポトーシス促進性PARP切断が化合物(C12)の存在下で観察され、化合物(3-N₂)の存在下では観察されなかったが、両方の化合物は、IκBαのLPS誘導性再合成を遮断することにおいて等しく有効であった（図13c）。さらに、化合物(C12)および化合物(3-N₂)の抗炎症活性間の類似性もまた、TNFのLPS誘導性産生に対するそれらの阻害効果の比較から明らかであった（図13d）。これらの実験は、化合物(3-N₂)が休止中のまたは炎症活性化されたマクロファージに対して無毒性であり；しかし、それはLPS誘導性NF-κBシグナル伝達を調節するC12の能力を保持していることを示している。

TNFは、LPS誘導性腫瘍増殖を担う重要な炎症性メディエーターであり、TNFの増殖促進活性は、NF-κB活性化に依存する。最も重要なことには、LPS誘導性腫瘍増殖のマウスモデルを使用する実験は、癌細胞におけるTNF媒介NF-κBシグナル伝達の阻害は、炎症誘導性腫瘍増殖を、内因性TRAILによって媒介される炎症誘導性腫瘍退縮へ変換することを示唆している。AHLが炎症活性化癌細胞においてTRAILの抗癌活性を増強することができるかどうかについて取り組むために、本発明者らは、TNFおよび化合物(3-N₂)の組み合わせで処理された癌細胞におけるPARP切断に対する最適以下濃度のTRAILの効果を調べた。ウェスタンブロット分析によって、TRAIL依存性PARP切断が、化合物(3-N₂)の存在下においてTNFで刺激された癌細胞において現れ、顕著なことに、TRAIL媒介性アポトーシス応答が、TNF誘導性NF-κBシグナル伝達の中断と同時に起こったことが明らかにされた（図13e）。

要するに、「TRAILエンハンサー」としての化合物(C12)およびそのアナログ（例えば、化合物(3-N₂)）の同定、ならびにNF-κBシグナル伝達の調節を介して炎症促進性応答を阻害するこれらの化合物の能力は、癌細胞の選択的な死滅についての原理証明適用を提供する。特に、癌細胞におけるTRAIL誘導性アポトーシスに対する化合物(3-N₂)の相乗効果は、抗癌剤ボルテゾミブについてのそれと同程度であり；しかし、ボルテゾミブとは対照的に、化合物(3-N₂)は、単独でまたはTRAILと組み合わせて、正常ドナーの組織由来のヒト肝細胞に対して無毒性であった。癌と炎症との関連付けは、癌療法および予防においてNF-κBのインヒビターなどの抗炎症剤を使用することから実質的な利益を得ることができることを示唆している。

従って、様々な態様において、本発明は、有効量の式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物：

またはその薬学的に許容される塩、および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供し、
式中、Rは、
約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルであって、そこへ結合された1つまたは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。

アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよいという記載に関して、位置番号（例えば、4）は、酸素原子が（例えば、アシル鎖の4位で）結合されているアシル鎖の炭素番号を指す。アシル鎖はホモセリンラクトンアミノ基とアミド結合を形成し、AHL化合物が提供される。

例えば、AHL化合物は、式(II)：

のものであり得、
式中、R¹は、
(d)ジアジレニル基；
(e)1つもしくは複数のカルボニル基；または
(f)1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

様々な態様において、本発明の薬学的組成物は、TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤をさらに含み得る。

より具体的には、N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

からなる群より選択される。

様々な態様において、本発明は、患者における腫瘍を治療する方法を提供し、本方法は、有効量の式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物：

または薬学的に許容される塩、および任意で薬学的に許容される賦形剤を、患者へ投与する工程を含み、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、化合物は、式(II)の化合物：

であってよく、
式中、R¹は、
(a)ジアジレニル基；
(b)1つもしくは複数のカルボニル基；または
(c)1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

本発明の方法は、TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤の有効量を投与する工程をさらに含み得る。より具体的には、N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

からなる群より選択され得る。

例えば、本発明の方法に従って治療され得る腫瘍は、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳房腫瘍、および脳腫瘍からなる群より選択され得る。

本発明は、様々な態様において、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法を提供し、本方法は、有効量のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）化合物および有効量のTRAILと、該細胞とを接触させる工程を含み、ここで、AHL化合物が式(I)：

のものであり、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、様々な態様において、有効量のAHLアナログは、腫瘍細胞において、小胞体ストレス応答（UPR）の、小胞体膨張（endoplasmic reticulum swelling：ERS）の、または両方の活性化剤である。

より具体的には、本発明の方法の実施について、AHL化合物は、式(II)の化合物：

であり、
式中、R¹は、
(a)ジアジレニル基；
(b)1つもしくは複数のカルボニル基；および
(c)1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

より具体的には、N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

からなる群より選択され得る。

腫瘍細胞は、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳房腫瘍、および脳腫瘍からなる群より選択される腫瘍に由来し得る。

本発明はさらに、様々な態様において、式(I)の化合物：

またはその薬学的に許容される塩を提供し、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、化合物は、式(II)の化合物：

であってよく、
式中、R¹は、
(a)ジアジレニル基；
(b)1つもしくは複数のカルボニル基；または
(c)1つもしくは複数の独立して選択されるアジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基
のうちの1つまたは複数を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

上述の式(I)の化合物は、TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤と薬学的に組み合わされて提供され得る。例えば、本発明のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

からなる群より選択され得る。

様々な態様において、本発明は、細胞と上述の有効量のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログとを接触させる工程を含む、細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供し、但し、AHLアナログは、式：

でもない。

任意で、アポトーシスを誘導する方法は、有効量の腫瘍調節剤、例えばTRAILを投与する工程をさらに含む。アポトーシスを誘導する方法は、正常細胞に対して癌細胞について選択的であり得る。

様々な態様において、本発明は、有効量のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログ化合物、および有効量の腫瘍調節剤、例えばTRAILを患者へ投与する工程を含む、患者における腫瘍を治療する方法を提供する。様々な態様において、AHLアナログは、式：

でもない。

様々な態様において、腫瘍を治療する方法は、患者の身体の正常細胞の存在下において腫瘍の細胞の選択的な死滅を提供し得る。

式(I)の化合物は、式(3-N₂)の化合物：

であってよい。

例えば、式(I)の化合物は、式(3-N₂)の化合物の(S)-エナンチオマー：

であってよい。

様々な態様において、本発明は、式(I)の化合物：

またはその薬学的に許容される塩を提供し、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を含み、1つまたは複数のカルボニル基をさらに含んでいてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
であり、但し、化合物は、

でもない。

様々な態様において、本発明は、式(3-N₂)の化合物：

を提供し、
式中、2つの窒素原子の間に二重結合を含有するジアジリン環が、化合物C12のカルボニル基に取って代わっており、化合物(3-N₂)を提供する。

様々な態様において、本発明は、本発明の化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。

様々な態様において、本発明は、薬学的に許容される液体媒体中に溶解されていてもよい本発明の化合物を容器中に含むキットを提供し；キットは、第2容器中に、薬学的に許容される液体媒体中に溶解されていてもよい腫瘍調節剤、例えばTRAILをさらに含んでいてもよく；投与もしくは保管情報または両方をさらに含んでいてもよい。

より具体的には、本明細書に開示され特許請求される式(I)のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

のいずれかまたはそれらの任意の薬学的に許容される塩であり得る。

腫瘍は、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳癌、脳腫瘍などであり得る。様々な態様において、式(II)のAHLアナログは有効量で、腫瘍細胞において、小胞体ストレス応答（UPR）の、小胞体膨張（ERS）の、または両方の活性化剤であり得る。

様々な態様において、本発明は、哺乳動物細胞において小胞体ストレス応答（UPR）を誘導する方法を提供し、本方法は、有効量の下記式(I)のAHLもしくはそのアナログまたはその薬学的に許容される塩と、該細胞とを接触させる工程を含む：

式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を含み、1つまたは複数のカルボニル基をさらに含んでいてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。

様々な態様において、このように誘導されたUPRは、細胞周期停止をもたらすことができ、かつ／または細胞分裂もしくは増殖を阻害することができる。細胞周期停止および／または細胞分裂もしくは増殖の阻害は、腫瘍などの新生物の治療において有効な療法であり得る。従って、様々な態様において、本発明は、有効量の下記式(I)のAHLもしくはそのアナログまたはその薬学的に許容される塩を患者へ投与する工程を含む、UPRの誘導、細胞分裂の停止、および／または細胞増殖の阻害が医学的に適応される患者における不良状態を治療する方法を提供する：

式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を含み、1つまたは複数のカルボニル基をさらに含んでいてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。

UPRの誘導を含む治療方法は、有効な量または濃度のTRAILの同時投与をさらに含み得る。例えば、不良状態は、癌または前癌状態もしくは組織過形成を含み得る。

本発明はさらに、様々な態様において、有効量の下記式(I)：

の化合物由来のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログおよび薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物を提供し、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、化合物は、式(II)の化合物であってよい：

式中、R¹は、
(g)ジアジレニル基；
(h)1つもしくは複数のカルボニル基；および
(i)アジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基での任意の置換
を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

様々な態様において、本発明は、TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤をさらに含む、上述の薬学的組成物をさらに提供し得る。

より具体的には、本発明は、N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログが、

からなる群より選択される、上述の薬学的組成物を提供する。

様々な態様において、本発明は、患者における腫瘍を治療する方法を提供し、本方法は、有効量の、式(I)の化合物：

を含むN-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログおよび薬学的に許容される塩を、患者へ投与する工程を含み、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、本発明の方法を実施するために、化合物は、式(II)の化合物であり得る：

式中、R¹は、
(d)ジアジレニル基；
(e)1つもしくは複数のカルボニル基；および
(f)アジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基での任意の置換
を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

例えば、上述の患者における腫瘍を治療する方法は、TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤を投与する工程をさらに含み得る。例えば、上述の患者における腫瘍を治療する方法を実施するために、N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

からなる群より選択され得る。

例えば、腫瘍は、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳房腫瘍、および脳腫瘍からなる群より選択され得る。

本発明は、様々な態様において、式(I)の化合物：

および薬学的に許容される塩をさらに提供し、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基上に4位以上で1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。例えば、化合物は、式(II)の化合物であり得る：

式中、R¹は、
(d)ジアジレニル基；
(e)1つもしくは複数のカルボニル基；および
(f)アジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基での任意の置換
を有していてもよい、約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。

化合物は、TRAILポリペプチドである腫瘍調節剤と組み合わせることができる。本発明の化合物は、

からなる群より選択され得る。

本発明はさらに、様々な態様において、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法を提供し、本方法は、有効量のN-アシルホモセリンラクトン（AHL）化合物および有効量のTRAILと、該細胞とを接触させる工程を含み、ここで、化合物が式(I)：

に由来し、
式中、Rは、
1つまたは複数のジアジレニル基を有し、1つまたは複数のカルボニル基を有していてもよく、かつアジド、ヒドロキシル、またはハロでさらに置換されていてもよい、約9〜約15炭素原子の直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル
である。より具体的には、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法の実施について、有効量のAHLアナログは、腫瘍細胞において、小胞体ストレス応答（UPR）の、小胞体膨張（ERS）の、または両方の活性化剤であり得る。

例えば、上述の本発明の方法の実施について、化合物は、式(II)の化合物であり得る：

式中、R¹は、
(d)ジアジレニル基；
(e)1つもしくは複数のカルボニル基
を有していてもよく、かつ
アジド、ヒドロキシル、もしくはハロ基で置換されていてもよい、
約7〜13炭素原子の直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。

より具体的には、腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための方法の実施について、N-アシルホモセリンラクトン（AHL）アナログは、

からなる群より選択され得る。

様々な態様において、本発明は、薬学的に許容される液体媒体中に溶解されていてもよいAHLアナログ、即ち本発明の化合物を、容器中に含むキットを提供し；キットは、第2容器中に、薬学的に許容される液体媒体中に溶解されていてもよい腫瘍調節剤をさらに含んでいてもよく；投与もしくは保管情報または両方をさらに含んでいてもよい。

生物学的研究
本発明者らによる以前の研究は、細菌性N-(3-オキソ-アシル)ホモセリンラクトン（AHL）は、ERの拡張およびUPRの生化学マーカー（例えば、真核生物翻訳開始因子2α（eIF2α）のリン酸化）の出現を一時的に誘導することを示しており、これはUPRにおけるAHLの役割を示唆している（V. Kravchenko, et al., J Biol Chem 2006, 281(39), 28822-30）。転写因子XBP1（X-ボックス結合タンパク質）をコードするmRNAのイノシトール要求タンパク質1（IRE1）媒介スプライシングは、UPRの進化的に保存されたシグネチャーであるので（Schroder, M., et al, Ann Rev Biochem 2005, 74, 739-89）、本発明者らは、XBP1 mRNAのスプライス形態（sXBP1）がN-(3-オキソ-アシル-ドデカノイル)ホモセリンラクトン（「C12」）の存在に応答して生成されるかどうかを調べることによって、UPRの活性化におけるAHLの役割に取り組んだ。RT-PCRアッセイによって、化合物C12ならびに他のAHLは、マウス胚線維芽細胞（MEF）においてsXBP1の生成を誘導し、C12に対する応答は、ツニカマイシン（Tg）およびタプサガルギン（thapsagargin）（Tg）の効果と同程度であったことが明らかにされた。C12に対するこの応答は、MEFに限定されず、ヒト形質転換細胞を含む、多種多様の細胞型においても観察された。

微生物叢とも呼ばれる、バクテリアル・スーパー・コミュニティーは、多細胞生物と共存し、多数のストレス感知生理学的プロセス、特に、宿主細胞の代謝および免疫反応に関与するものにおいて重要な役割を有する、古代からある環境因子である。例えば、腸内微生物叢は、食物栄養素の取り込みを促進することにより代謝系^1,2、および正常な低レベルの炎症を維持することにより免疫系^2-4の両方に有益に寄与する。伝統的に、炎症プロセスは、組織修復に必要であり、リポ多糖類（LPS）およびペプチドグリカンなどの細菌産物に応答してのToll様受容体（TLR）経路の調節を含む、多くの複雑なシグナル伝達機構の統合を必要とする^4,5。他方では、微生物叢媒介炎症はまた、癌発生および肥満などの代謝障害と関連している^2,6-8。これらの障害の基礎をなす分子機構は、小胞体（ER）ストレス経路の活性化と密接に相互接続されているが^5,9,10、ERストレスを誘発する細菌成分はまだ同定されていない。

小胞体ストレス応答（UPR）として公知の、多成分ERストレス経路の重要な生化学的シグネチャーの中に、真核生物翻訳開始因子2のαサブユニット（eIF2α）のリン酸化、および転写因子XBP1/Hac1（それぞれ、後生動物中のX-ボックス結合タンパク質-1および酵母中のATF/CREBと相同）の活性化がある¹¹。eIF2αリン酸化を誘導するあるグラム陰性細菌由来分子、例えば、N-(3-オキソ-アシル)ホモセリンラクトン（3-オキソ-AHL）の能力¹²ならびに微生物叢のサンプル中の3-オキソ-AHLの存在^13-15は、UPRの活性化におけるそれらの役割を調べるように本発明者らを促した。ヒト微生物叢の一部を形成し得、それぞれ主にTLR4およびTLR2を介して哺乳動物細胞を活性化し得る、2つの進化的に離れた微生物として、グラム陰性緑膿菌およびグラム陽性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）細菌を選択し^4,16；黄色ブドウ球菌（S. aureus）とは異なり、緑膿菌はまた、3-オキソ-AHLファミリーのプロトタイプメンバーであるN-(3-オキソ-ドデカノイル)ホモセリンラクトン化合物(C12)を合成するクラスの細菌を示す。さらに、グラム陰性細菌ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）を、緑膿菌におけるものと同様のTLR4リガンドを含有するが化合物(C12)を合成しない対照微生物として使用した¹⁷。本発明者らの研究を開始するために、本発明者らは、これらの細菌へ骨髄由来マクロファージ（BMDM）を曝露し、マクロファージ反応性を、UPRの生化学マーカー、およびTLR経路の共通マーカーとしてのマイトジェン活性化プロテインキナーゼp38のリン酸化について分析した。XBP1 mRNAのスプライス形態（sXBP1）の迅速かつロバストな生成が緑膿菌に応答して観察されたが、2つの他の細菌は、たとえあったとしても、非常に弱いレベルのsXBP1を誘導した（図1A）。さらに、3つの細菌は全て、同様のレベルのp38リン酸化（p-p38）を誘導したが、UPRの追加のサイン、例えば、eIF2αおよびPERK［二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（PRK）様ERキナーゼ］のリン酸化形態は、緑膿菌に応答してのみ観察された（図1B）。特に、本発明者らは、化合物(C12)合成を担う遺伝子であるlasIを欠いている緑膿菌は、sXBP1およびeIF2αリン酸化を活性化する能力を失っていることを見出し（図1C）、これは、観察されたUPRマーカー誘導が、野生型緑膿菌におけるC12の存在と関連付けられるという証拠を提供している。実際に、C12の直接の添加は、sXBP1の時間依存的および用量依存的な誘導を生じさせた（図1Dおよび1E）。UPRのこのような活性化が化合物(C12)の天然(S)形態に選択的であった一方、非天然(R)立体異性体(C12R)または化合物(C12)の加水分解形態(C12h)は効果がなかった（図1Dおよび1G）。

重要なことには、ラクトン環モチーフの構造的完全性の同様の要件がまた、AHLファミリーの他の天然立体異性体に応答して明白であった（表1）。UPR活性化に対するAHLのこれらの効果は、マクロファージに限定されず、マウス胚線維芽細胞（MEF）、正常ヒト気管支上皮細胞、およびヒトTPH1細胞株を含む他の細胞型においても観察された（表2）。より重要なことには、培養細胞における本発明者らの実験と一致して、マウス肺中へのC12の投与は、sXBP1の生成を生じさせた（図1F）。従って、AHLは、様々な哺乳動物細胞においてUPRを誘導する能力を有する分泌される細菌性分子の最初の例を示す。

C12によるスフィンゴリピド代謝の調節はUPRを活性化させる。
小胞体ストレス応答はERのタンパク質成分および脂質成分の両方に依存する¹¹。C12がERのタンパク質成分を標的化するかどうかを明確にするために、本発明者らは、C12、ツニカマイシン（Tm、新たに合成されたタンパク質の折り畳みに影響を与えるタンパク質グリコシル化のインヒビター）またはタプシガルギン（Tg、デノボタンパク質合成から独立してUPRの活性化へ至るER貯蔵からのカルシウムの受動的放出のインデューサー）に応答してのsXBP1誘導に対する一般的なタンパク質合成インヒビターCHXの効果を調べた。Tgおよび特にTmと比較して、sXBP1のC12誘導性生成はCHXに対して完全に耐性であり（図2A）、これは、ERストレスのタンパク質成分はC12誘導性UPR活性化について重要でないことを示唆している。

UPRの調節に関与する特定の脂質成分はまた明らかにされていないが、脂質の生合成およびUPRの調節が関連付けられることが示唆された^10,11,18。コアスフィンゴリピド、N-アシル-スフィンゴシン、またはセラミド（Cer）のデノボ合成がERにおいて生じるので¹⁰、本発明者らは、スフィンゴリピド代謝の薬理学的インヒビターがC12によるUPR活性化を変化させるかどうかを試験しようとした。これらの実験の結果により、Cer切断のインヒビターであるD-MAPPが、eIF2αのC12誘導性リン酸化を実質的に損なう薬剤であると同定された（図2B）。阻害効果はC12媒介UPR活性化に特異的であり、何故ならば、sXBP1のTm-およびTg-媒介誘導の両方がD-MAPPの存在下で変化しなかったためであり（図2C）；さらに、p38リン酸化のLPS誘導性活性化およびIκBα発現のプロフィールもD-MAPPによって変化しなかった（図2D）。従って、これらの知見は、UPRのIRE1およびPERKアームの両方が、C12によって誘導されるスフィンゴリピド代謝の変化を感知しこれに応答することを示唆している。

全てのスフィンゴリピドの骨格成分である、スフィンゴシン（Sph）はCer切断の産物である。脂肪酸でのSphアミノ基のアシル化はCerを再利用し、一方、Sphのリン酸化は、スフィンゴシン1-リン酸（S1P）を生成し、その加水分解は、代謝経路の最終工程を示す^10,19。Sphはまた、N,N-ジメチルスフィンゴシン（DMS）へN-メチル化され得、これはスフィンゴシンキナーゼ活性の天然のインヒビターとして作用し；細胞へのその添加は、S1Pを減少させ、Sphレベルの僅かな増加を伴う^20,21。このような目的で、本発明者らのデータは、Sph代謝の調節がUPR活性化と相関することを示し、何故ならば、DMS処理に起因する細胞内Sphレベルの予想された増加は、sXBP1およびeIF2αリン酸化の誘導を生じさせ、一方、Sphの細胞外添加は、UPRのこれらの生化学マーカーに対して効果を有さなかったためである（図2E）。従って、C12が細胞内Sphの代謝変換を調節するかどうかに取り組むために、C12の非存在または存在下でBMDMを³H-Sphで放射標識し、スフィンゴリピドフラクション内の放射能の分布を、薄層クロマトグラフィー（TLC）によって評価した。本発明者らは、³H-放射能の実質的な量が、Cerフラクション中へ急速に（5分以内）組み込まれ、2時間後、それはセラミドおよびスフィンゴミエリン（SM）フラクション間に分配されたことを見出した。C12の添加は、スフィンゴリピド代謝の初期ならびに後期段階を劇的に変化させ；2時間後、スフィンゴミエリン中への予想された組み込みは観察されなかったが、むしろ、放射能はスフィンゴシンフラクション中に残った（図2F）。さらに、C12での5分間処理はまた、別のフラクション（恐らくS1P）中への³H-放射能の組み込みを生じさせ、これは経時的に減少した。これらのプロセスに関与する機構のさらなる詳細な研究が必要であるが、これらの知見は、C12が、Sphターンオーバーおよび生成に関与するステップを恐らく介して、スフィンゴリピドの代謝を調節する能力を有し、C12のこの効果はUPRの活性化と相関するという最初の一つの証拠を提供する。従って、本発明者らは、C12はスフィンゴリピドの代謝の調節を介して細胞活性化を誘導すると仮定する。

C12は癌停止剤および癌予防剤として作用する能力を有する。
セラミド（Cer）、スフィンゴシン（Sph）およびSph-1-リン酸（S1P）は、自己免疫および癌発生を予防するための損傷細胞のアポトーシス性除去を調節する防衛機構において重要な役割を有する一般的なシグナル伝達脂質を示す^9,10,19,22。

真核生物において、スフィンゴリピドは、生合成経路を介して小胞体（ER）においてデノボ合成され、ここで、N-アシル-スフィンゴシンまたはCerは、コア代謝産物であり、これは、さらに修飾され得、スフィンゴミエリンまたはより複雑なグリコスフィンゴリピドが生成される。Cerとは対照的に、D-エリスロ-スフィンゴシン（Sph）は、Cer切断の結果においてのみ形成され、一方、脂肪酸でのSphアミン基のアシル化はCerを再利用する。さらに、CerおよびSphのリン酸化生成物、それぞれC1PおよびS1Pの両方は、脱リン酸化によってサルベージされ得るが、S1Pは不可逆的に切断され得る。いったん生成されると、これらの分子は、線形シグナル伝達経路の標準的なパラダイムとは異なる様式で種々の細胞機能を調節する「生物活性」脂質となる¹⁰。スフィンゴリピドシグナル伝達の独特の複雑さは、それらの代謝相互変換にあるだけでなく、所定の経路に対する個々の生物活性脂質の反対の効果である。例えば、Sphは、細胞増殖の負の調節因子として作用し、刺激誘導性アポトーシス経路を促進し^21-24、一方、そのリン酸化相当物S1Pは、細胞増殖を誘導し、アポトーシスから保護する^22,24,25。実際に、多数の環境および内因性因子／条件がスフィンゴリピドの代謝を変更する¹⁰。これらの条件のいくつかはまた代謝性疾患および癌の発生および進行と関連しているので、スフィンゴリピド媒介アポトーシスシグナル伝達の増強は、所定の薬剤が健康な細胞をインタクトにしておきながら、癌性細胞を自己破壊するように誘導することができれば、いかなる段階からの疾患進行も止めることができると考えることが論理的である。

この点に関して、Sph代謝に影響を与えるC12の能力（上記図2を参照）は、C12が、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）を産生するマクロファージなどの、炎症損傷細胞または形質転換細胞におけるアポトーシスの選択的活性化を介して、可能性のある癌停止剤および癌予防剤として作用することを示唆した。この仮定と一致して、本発明者らの以前に発表したデータは、骨髄性細胞のC12処理はアポトーシスの急速な誘導を生じさせるが、非骨髄性細胞は、アポトーシスマーカー発現の著しく遅延した動力学および減少を示すことを明らかにした（Kravchenko et al., 2006；参考文献番号12中の図3を参照のこと）。

この仮説をさらに試験するために、本発明者らは、TNF、C12またはそれらの組み合わせによって誘導されたアポトーシスに対する乳癌細胞株MCF7の感受性を比較した。これらの実験において、本発明者らは、MCF7の対照バリアント（ベクター）、ならびにBcl-2およびCLARPなどのアポトーシスの負の調節因子を安定発現するMCF7細胞を使用した；Bcl-2は、内因性アポトーシス経路のインヒビターであり、一方、CLARPは、外因性アポトーシス経路とも呼ばれる、受容体依存性アポトーシスシグナル伝達を阻害する。細胞をTNF、C12またはそれらの組み合わせと共にインキュベートし、タンパク質抽出物を、アポトーシスを示す生化学マーカーであるPARPの切断についてウェスタンブロットによって分析した²⁶。予想されたように、TNFと共に対照およびMCF7/Bcl-2細胞を長時間インキュベーションすると、PARPの切断を誘導したが、MCF7/CLARP細胞はTNF媒介アポトーシスに対して耐性であった（図3A）。対照的に、3つの細胞株は全て、C12に対して感受性を示し；さらに、C12とTNFとの相乗効果は、両方の刺激の組み合わせによって処理された3つの細胞株の全てにおいて明白であった（図3B）。

形質転換細胞の例としてHeLa細胞株および正常ヒト気管支上皮細胞を使用することによって、同様の実験を行った。本発明者らは、HeLa細胞および正常細胞は両方ともTNFのアポトーシス促進効果に対して耐性であったことを観察した（図3Cおよび3D）。正常細胞はまた、C12、およびTNFとのその組み合わせに対して耐性を示したが（図3D）、C12単独は、HeLa細胞においてPARPの切断を誘導した。特に、強力な相乗作用がHeLa細胞においてTNFとC12との間で観察された（図3Cを参照）。従って、これらのデータは、C12は癌細胞においてアポトーシスを誘導し、一方、正常細胞はC12、またはTNFとのその組み合わせに対して比較的耐性であるという本発明者らの仮定をさらに支持している。さらに、2つの刺激、C12およびTNFは、癌性細胞に対して相乗的に作用するが、正常細胞はインタクトのままである。

TRAILおよびC12またはアナログの組み合わせは癌性細胞を相乗的に死滅させる。
癌治療法についての有望な候補には、腫瘍壊死因子（TNF）関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）がある。TNFファミリーの他のメンバーと同様に、TRAILは、外因性アポトーシス経路とも呼ばれる受容体媒介機構を介して、アポトーシスを開始する。TNFおよびFasリガンド（FasL）などの他の天然のアポトーシス促進リガンドとは対照的に、マウスへのTRAIL注入は、組織および器官に対して致死的な反応または検出可能な毒性を引き起こさなかった^27-29。さらに、癌細胞を死滅させるためのTRAILの潜在的な重要性が、このサイトカインが正常組織ではなくヒト腫瘍移植片に対して選択毒性を有することを実証する動物モデルにおける研究によって支持された^28,29。しかし、TRAIL誘導性アポトーシスに対する感受性はTRAIL治療の効能を限定する重要な因子であり、何故ならば、様々な感受性が、種々の悪性細胞において異なるためである^27,28,30。さらに、正常細胞と同様に、いくつかの癌細胞もTRAIL誘導性アポトーシスに対して耐性であり、しかし、TRAIL媒介効果に対する細胞の感受性および耐性についての基礎は完全には理解されていない。

アポトーシスの分子的詳細が進み、腫瘍細胞が、外因性または内因性アポトーシスシグナル伝達経路のいずれかへの干渉を介してアポトーシスに対する耐性を獲得することができ、これは細胞増殖制御の欠陥または／ならびにNF-κBおよびAktシグナル伝達カスケードなどの生存経路の抗アポトーシス活性の増加を通常伴うことが示されている。実際には、大抵の癌細胞は、そのような抗アポトーシス活性を克服することができる機構によって誘発されると、アポトーシスを行う能力を保持している。例えば、NF-κB活性の阻害は、アポトーシス刺激によって誘導されるアポトーシスを著しく増加させる^31-34。さらに、アポトーシスの増強はまた、小胞体ストレス応答（UPR）として真核細胞において公知の、小胞体（ER）ストレスまたはJNK経路を含む、いくつかの細胞内非アポトーシス性シグナル伝達プロセスの活性化で生じる¹¹。顕著なことに、最近の観察によって、ツニカマイシン（Tm）、タプシガルギン（Tg）およびRRR-α-トコフェロールエーテル結合酢酸アナログ（α-TEA）などのUPR活性化剤が、TRAIL誘導性アポトーシスに対して癌細胞を感作することが明らかにされた^35-37。しかし、これらの試薬は、UPRの構成的かつ持続的な活性化を誘導し、これは、TRAILなどのアポトーシス促進刺激の非存在下であっても^37,40、ミトコンドリア依存性内因性アポトーシス経路の誘導を通常生じさせる^38-40。

宿主と微生物叢との親密な関連性の最新の理解は⁴¹、微生物は、宿主の生物学に協力する巧妙かつ選択的な戦略を進化させたことを示唆している^1,42。通常、多くの細菌産物は、癌および自己免疫疾患の発生と一般的に関連する危険因子である炎症プロセスを誘導する^17,43。しかし、それは他の細菌性分子には当てはまらない。例えば、本発明者らの最近の知見は、C12が強力な抗炎症活性を有することを明らかにした¹⁷。さらに、C12はまたUPRを誘導するという認識は、抗癌療法の補完物としてのそのポテンシャルを探究するように本発明者らを促した。

この仮説を試験するために、本発明者らは、ヒト肺の癌サンプル由来のA549細胞株に対するTRAILの活性に対するインビトロでのC12の効果を調べた。A549細胞に関する報告された観察と一致して²⁸（Ashkenazi A et al., 1999）、培養A549細胞へのTRAIL(50 ng/ml)のインビトロ添加は、それらの生存能力および増殖に著しくは影響を与えなかった。しかし、A549細胞の生存能力は、TRAIL(50 ng/ml)およびC12(1μΜ)の組み合わせを培養培地へ添加した場合に劇的に減少し（図4）、しかし、細胞増殖および生存能力は、C12(1μΜもしくは25μΜ)、その非天然立体異性体C12R(25μΜ)、またはTRAIL(50 ng/ml)およびC12R(25μΜ)の組み合わせの存在下ではほぼ変化しなかった（図4A）。滴定実験は、100 nMのC12および50 ng/mlのTRAILと共に培養培地において24時間インキュベーションした後に、細胞の50％超がそれらの生存能力を失ったことを明らかにした（図4B）。これらのデータは、TRAIL媒介アポトーシスに対する耐性はC12の存在下で克服され得るという本発明者らの仮定を支持している。

C12が癌性細胞に対するTRAILのアポトーシス促進効果を増加させるかどうかに取り組むために、本発明者らは、アポトーシスおよび細胞増殖の調節ならびに細胞ストレス応答に関連する生化学パラメータについてのウェスタンブロット分析によって、TRAIL、C12またはTRAIL+C12に対するA549細胞の応答を比較した。即ち、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ（PARP）およびカスパーゼ-3の切断を、外因性および内因性アポトーシス経路の両方を介して誘導されるプロセスを示す2つの共通マーカーとして使用し^26,44；本発明者らはまた、内因性アポトーシス経路を示すマーカーとしてカスパーゼ-9の切断を調べ⁴⁵；細胞増殖制御と関連付けられる哺乳動物ストレス応答の特徴である、プロテインキナーゼJNK経路の活性化^46-48を、JNKのリン酸化についての分析によって試験した。C12の活性をモニタリングするために、本発明者らは、ERストレスの別の特徴であるeIF2αのリン酸化^11,49、および哺乳動物ストレス応答の追加のマーカーであるプロテインキナーゼp38のリン酸化⁵⁰を分析した。これらの実験の結果は、C12での刺激が、3つ全てのマーカーについて同様の動力学でストレス応答の急速かつ強力な活性化を生じさせたが、試験したいずれの時点でもアポトーシスシグナル伝達は誘導されなかったことを明らかにした（図5）。対照的に、TRAIL処理は、eIF2αリン酸化およびストレス応答の他のマーカーの活性化について確実に静かであったが、しかし、本発明者らは、6時間時点で辛うじて検出可能なp38およびJNKリン酸化に気付き；さらに、本発明者らは、PARPの続いての切断に至る予想されたカスパーゼ-3活性化を観察した（図5を参照のこと）。特に、アポトーシスマーカーおよびストレス応答マーカーの両方の実質的な変化が、遅い時点で、TRAILおよびC12の組み合わせで処理された細胞において明白であった（図5；2および6時間時点を比較する）。

TRAILの代わりにTNFを使用した場合の本発明者らの以前の観察と一致して（上記図3を参照）、他の癌性および正常細胞のパネルについての同様の研究は、これらの観察を確認し、C12は、TRAIL媒介アポトーシスに対して種々の癌性細胞を実質的に感作したが、正常細胞は完全に耐性であったことを実証した（図6、図7および表2）。従って、C12-およびTRAIL-またはTNF-媒介シグナル伝達の間の相互相乗作用は、癌性細胞に対して顕著なアポトーシス促進効果を生じさせ、このことは、C12の適用は新しい抗癌治療戦略を見出し得ることを示唆している。

ボルテゾミブ（ベルケイドとしても公知）は、TRAIL誘導性アポトーシスに対して癌性細胞を強力に感作する抗癌剤である^51-53。従って、抗癌療法についてのC12の可能性のある有用性を評価するために、本発明者らは、癌性A549細胞および初代ヒト肝細胞におけるTRAIL媒介アポトーシスに対するこれらの2つの化合物、(C12)およびボルテゾミブ（Bor）の効果を比較した。TRAILに対するA549細胞の感受性の匹敵する増加が、Borまたは(C12)のいずれかの存在下で観察され（図8A、上部パネル）；さらに、同様のレベルのPARP切断（アポトーシスマーカー）が、TRAILとBorまたは(C12)との組み合わせに応答して誘導された（図7、下部パネル）。正常ヒト肝細胞の生存能力は、TRAILの存在下で変化しなかった（図8B、上部パネル）；さらに、TRAIL処理肝細胞はアポトーシスの証拠を示さなかった（図8B、下部パネル）。Bor処理サンプルの同様の試験は、この薬物は単独では肝細胞に対して比較的低いレベルの毒性を示したが、TRAILの存在下ではBor媒介毒性ならびにBor誘導性アポトーシスが実質的に増強されたことを明らかにした（図8Bを参照）。対照的に、肝細胞は、(C12)、またはTRAILとのその組み合わせの存在下で、ほぼ健康かつインタクトであった（図8Bを参照）。従って、(C12)は、非癌性細胞に対する著しい毒性なしに、強力な抗癌活性を有する。

(C12)は3-オキソ-AHLファミリーのプロトタイプメンバーであるので、癌停止および癌予防活性のためにならびにUPRの活性化のために必要である、AHLの一般的な構造の特徴を決定するために、構造-活性-関係（SAR）研究が正当とされた。この問題に取り組むために、一連のAHLおよびそれらのアナログを合成し（AHLおよびアナログのリストを参照のこと）、全ての化合物の生物学的活性を癌性細胞および正常細胞のパネルについて調べた。選択したアナログについての生化学データのプロトタイプ例を図9および図10に示すが、表2は全ての化合物についてのSAR研究を要約する。これらの包括的なSAR研究は、哺乳動物細胞に対して(C12)様効果を有する、(C12)のいくつかのアナログを同定した（13、15および16、下記表1を参照のこと）。さらに、(C12)と同様に、3つのアナログは全て、TRAIL媒介アポトーシスに対して多数の癌性細胞を強力に感作し、このことは、それらの適用が新しい抗癌治療戦略に至り得ることを示唆している。

引用文献：

（表１）評価した化合物

（表２）哺乳動物細胞における構造-活性-関係研究のために合成した化合物（N-アシルホモセリンラクトンの天然または合成誘導体）の生物学的活性

^*化合物の活性を、N-(3-オキソ-ドデカノイル)ホモセリンラクトン（化合物番号1、本文において(C12)とも略される）についての活性に対して標準化した。

材料および方法
A．一般的方法
癌および正常細胞培養物
肺癌細胞株A549および結腸癌細胞株HT29をATCCから購入した。乳癌細胞株MDA-MB-468をJ.C. Reed (The Burnham Institute, La Jolla, California)から受け取った。細胞株を、以下の増殖培地（GM）中に維持した：10% FBS(HyClone, Logan, UT)、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸(Invitrogen, Carlsbad, CA)が補われたDMEM培地(4.5 g/lグルコース)。正常ヒト気管支上皮（NHBE）細胞および正常ヒト乳房上皮（NHME）細胞を、Cambrex (East Rutherford, NJ)から得て、製造業者によって推奨されるように培養した。正常ヒト結腸平滑筋細胞を、ScienCell Research Lab (San Diego, CA)から得て、製造業者によって推奨されるように培養した。ヒト肝細胞の初代培養物（新たに平板培養された；凍結保存されていない）および培養培地を、Celsis In Vitro Technologies (Baltimore, MD)から得た。細胞を受け取った後、培地を各ウェルから静かに吸引し、Torpedo Antibiotic Mix (Celsis)が補われたInVitroGRO HI培地を補充し、プレートを、飽和湿度でインキュベーター中、37℃にて5% CO₂中に維持した。2〜4時間後、本文および図の凡例に記載されるように細胞を刺激した。

マウス、骨髄由来マクロファージ、および他の細胞培養物
C57BL/6マウスをJackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から購入した。骨髄由来マクロファージ（BMDM）およびマウス胚線維芽細胞（MEF）を、TSRI Animal Care and Use Committeeによって承認された標準プロトコルを使用することによって作製した。L929/NCTCクローン929（結合組織、マウス）細胞株をATCC (Manassas, VA)から購入した。MEFおよびL929細胞株をGM（上記を参照）中に維持した。BMDMを、70% GMおよび30% L929馴化培地中で培養した。一般に、細胞（約60〜70%コンフルエンス）を、刺激前に12〜14時間新鮮な培地中でインキュベートした。

細菌培養物
本発明者らの研究において使用した緑膿菌細菌株は、Scott A. Beatson博士（University of Queensland, Brisbane, Australia）によって好意で提供され、野生型緑膿菌PAO1（もともとはATCCより）およびPAO1ΔlasIを含む。対照研究のために使用した細菌株は、全てATCCからの、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌、およびネズミチフス菌を含む。

試薬および標準アッセイ
組換えヒトTRAILをR&D System, Inc (Minneapolis, MN)から購入し、20 ng/mlの濃度でまたは図の凡例に記載されるように、全ての実験における細胞刺激のために使用した。組換えタンパク質、mTRAILのバリアント118-291を発現する大腸菌の細菌培養物を、組換えマウスTRAILの作製のために使用し、DE52およびヒドロキシアパタイトにおいて標準イオン交換クロマトグラフィーによって単離した。S.ミネソタ（S. Minnesota）Re595 LPSを、以前に記載されたように調製した^E1。N-(3-オキソドデカノイル)-S-および-R-ホモセリンラクトン（それぞれ、C12およびC12R）を含む全てのアシルホモセリンラクトンを、以前に記載されたように合成および精製した^E2。純度は99%より高く、HPLC/質量分析によって確認された。全ての合成分子を所望の濃度の200xでDMSO中に溶解し、アリコートを-20℃で保存した。さらに、定量的QCL-1000 Chromogenic Limulus Amoebocyte Lysateアッセイ(BioWhittaker, Walkersville, MD)は、C12の調製物が内毒素を含まないことを実証した。サンプル中のTNFの上清レベルを、ELISA(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)によって測定した。TRizol試薬(Invitrogen)を使用することによって、トータルRNAを単離した。

抗体およびウェスタンブロット分析
抗-eIF2α、ホスホ-eIF2α(p-eIF2α)、p38、p-p38(Thr180/Tyr132)、p-RelA(Ser536)、p-IκBSer32/36)、PARP抗体をCell Signalingから購入し；抗-RelA、IκBα、IκBβをSanta Cruz Biotechnologyから購入した。細胞抽出物を調製し、以前に記載されたようにウェスタンブロットアッセイによって分析した^E3。

データ表示
図11〜13に示されるデータは3つ以上の実験のうちの1つを示し、各グラフは、複数の研究に典型的な知見を反映している。

一般的な化学方法
特に指定のない限り、無水条件下で、乾燥している新たに蒸留した溶媒を用いて、窒素雰囲気下で、反応を行った。塩化メチレン（CH₂Cl₂）を水素化カルシウムから蒸留した。テトラヒドロフラン（THF）をナトリウム-ベンゾフェノンから蒸留した。収率は、特に指定のない限り、クロマトグラフィー的におよび分光学的に均質な物質を指す。アニスアルデヒド、KMnO₄またはPMA染色を使用して0.25-mm EMDシリカゲルプレート(60F-254)において行った薄層クロマトグラフィー（TLC）によって、反応をモニタリングした。フラッシュ・クロマトグラフィー分離をSilicycleシリカゲル(40-63メッシュ)において行った。NMRスペクトルをBruker 400 MHz分光計において記録し、内部参照として溶媒ピークを使用して較正した。多重度を示すために以下の略語を使用する：s、一重線；d、二重線；t、三重線；q、四重線；m、多重線；br、ブロード。

化学物質：(S)-α-アミノ-γ-ブチロラクトンをAldrichから購入し、受け取った状態のままで使用した。

B．合成手順およびキャラクタリゼーションデータ
C12の3-ジアジリン誘導体（3-N₂）の合成

3の作製
デカン酸1(700 mg, 4.06 mmol)を丸底フラスコへ添加し、25℃にて窒素雰囲気下でTHF(5.0 mL)中に溶解した。次いで、CDI(725 mg, 4.47 mmol)を添加し、得られた混合物を25℃で4時間撹拌した。第2の丸底フラスコ中で、マロン酸t-ブチル(716 mg, 4.47 mmol)を25℃にて窒素雰囲気下でTHF(4.0 mL)中に溶解した。フラスコを0℃へ冷却し、次いで、イソプロピルマグネシウムクロリド(4.5 mL, THF中2.0 M, 8.93 mmol)を滴下した。得られた混合物を0℃で30分間撹拌し、次いで50℃へ30分間加温した。0℃へ冷却後、デカン酸溶液をカニューレによって添加し、0℃〜25℃で一晩撹拌した。次いで、反応物を1 M HCl(10 mL)でクエンチし、EtOAc(2 x 20 mL)で抽出した。合わせた有機相を鹹水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させ、真空下で濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（98:2 ヘキサン:EtOAc）によって精製し、3(950 mg, 収率86%)が得られた。3についてのキャラクタリゼーションデータは、以前に報告されたものと一致した^E4。

4の作製
化合物3(1.34 g, 5.0 mmol)を25℃で丸底フラスコへ添加し、エチレングリコール(910 mg, 14.75 mmol)および塩化メチレン(30 mL)中に溶解した。次いで、TMSCl(3.2 g, 3.7 mL, 29.5 mmol)を25℃で撹拌溶液へ滴下した。得られた混合物を25℃で4日間撹拌し、次いで水(15 mL)でクエンチし、塩化メチレン(2 x 20 mL)で抽出した。合わせた有機相をNa₂SO₄で乾燥させ、真空下で濃縮した。この保護された物質を続いての反応のための粗製物として使用した。粗製のエチレングリコール保護された3を丸底フラスコへ添加し、0℃にて窒素雰囲気下でTHF(40 mL)中に溶解した。水素化アルミニウムリチウム(ヘキサン中1.0 M, 1.5当量)を滴下し、反応混合物を25℃へ加温した。4時間撹拌した後、反応物を水でクエンチし、濾過した。濾液を約20 mLへ濃縮し、1M HCl(20 mL)を添加し、混合物を25℃で一晩撹拌した。次いで、反応混合物をEtOAc(2 x 30 mL)で抽出し、合わせた有機相をNa₂SO₄で乾燥させ、真空下で濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(3:1 ヘキサン:EtOAc)によって精製し、4(1.0 g, 3ステップで収率80%)が得られた。4についてのキャラクタリゼーションデータは、以前に報告されたものと一致した^E5。

5の作製
ジアジリン導入についてのプロトコルは、以前に報告されたものに従った³。化合物4(489 mg, 2.44 mmol)を、冷却器が備えられた丸底フラスコへ添加し、メタノール(8 mL)中に溶解した。液体アンモニア(30 mL)を添加し、撹拌溶液を7時間加熱還流した。得られた混合物をドライアイス-アセトン浴中で冷却し、メタノール(10 mL)中のNH₂OSO₃H(332 mg, 2.93 mmol)の溶液を5分間にわたって添加した。冷却浴を取り除き、混合物を1時間加熱還流した。液体アンモニアを一晩蒸発させた後、反応混合物を濾過し、濾過ケーキをメタノールで洗浄した。濾液および洗浄液を真空下で濃縮し、粗製ジアジリンを続く酸化反応のための粗製物として使用した。ジアジリン5への粗製ジアジリンの酸化を、以前に記載されたヨウ素-Et₃N法^E6を使用して行い、フラッシュカラムクロマトグラフィー後に該化合物が得られた(120 mg, 収率23%)。

3-N₂の作製
標準ジョーンズ酸化条件を使用して、ジアジリン5の第1級アルコールを対応の酸へ酸化した。

酸を、塩化オキサリルを使用して対応の酸塩化物へ変換し、以前に記載されたように^E7,E8、(S)-α-アミノ-γ-ブチロラクトンへカップリングした。

C．細菌実験
細菌培養物への癌細胞の曝露
本発明者らは、組織培養中の細胞と細菌との直接接触を回避しながら、細菌によって放出される産物が真核生物標的と相互作用し得る実験系を利用した。細菌培養物を含有するインサートを、未処理のままであるかまたはTRAILで処理した（TRAILを直接GM培地へ同時に添加した）培養肺癌細胞にごく接近して置いた。本発明者らは、溶剤接着されたポリフッ化ビニリデン膜ベース(PVDF Durapore親水性0.1 m膜, Millipore VVLP09050)を有する切断ポリスチレン管(直径14 mm x 高さ25 mm)から作製されたカスタムメイドのインサートを使用した。これらのインサートを作製するために、切断ポリスチレン管の一方の末端を、5秒間塩化メチレン中へ浸漬し、軟化したプラスチックを、0.5分間、PVDF膜の切断部分の表面上にプレスする。軟化したポリスチレンは、膜細孔構造を損傷することなく不浸透性の結合を形成するために十分にPVDF中へ流動する。溶媒を数時間、完全に蒸発させた後、インサートを30分間1%次亜塩素酸塩中に浸漬し、続いて、無菌食塩水で6回リンスする（ラミナーフローフード中で行う）。直径14 mmインサートは、24-ウェルプレートについて最適な適合であり、インサートの内面積はウェル表面の約70%をカバーする。

本発明者らは、プロトタイプ0.1μm PVDF膜インサートを研究のために使用し、ここで、組織培養細胞を、緑膿菌PAO1（野生型）、PAO1ΔlasI、黄色ブドウ球菌、ネズミチフス菌、A.バウマンニ、および大腸菌（E. coli.）由来の可溶性産物へ曝露する。細菌をBHI寒天プレート上で増殖させ、接種物培養へ一晩移し、続いて37℃、250 rpmでの4〜6時間のインキュベーションのために125 mlバッフル付き振盪フラスコ中の20 ml BHIブロス中へ1/100希釈した。後期対数期培養物または対照BHIブロスの等しいアリコートをPVDFインサートへ移し、これらを、0.5 ml DMEM増殖培地中で培養された標的細胞を含有する24-ウェルプレート中に置いた。

細菌培養物中のC12濃度の測定
2-ml培養物を50μlのHClで酸性化し、10 mlの酢酸エチルを添加し、内容物を激しく混合した。層を分離させ、5 mlの酢酸エチル層を取り出し、MgSO₄で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣を冷メタノール中に再懸濁し、遠心分離し、沈殿物を除去した。得られたメタノール溶液を、C12内容物についてLC-MS（液体クロマトグラフィー-質量分析）によって分析した。逆相LC-MS分析(Agilent Zorbaxカラム, 5μm, 300SB-C8, 4.6 x 50 mm)を、MeCN-H2O-0.1%ギ酸の勾配（0〜1分：5% MeCN、1分〜9分：5% MeCNから98% MeCNへの勾配、および9〜11分：98% MeCN）で行い、以下のイオンを測定することによりC12の定量化を可能にした：298 (M + H⁺), 316 (M + H₂O + H⁺), 320 (M + Na⁺), および338 (M + H₂O + Na⁺)。緑膿菌PAO1（野生型）のサンプル中のC12の濃度は約4.3μΜであった（P < 0.001、n＝5つの独立した実験）。

D．哺乳動物細胞活性化
細胞刺激
全ての実験において、図の凡例に示されるように、BMDMを、LPS(100 ng/ml)、AHL（10〜25μΜ；通常、BMDMおよび初代マクロファージを25μΜのC12によって刺激した）またはそれらの組み合わせで刺激した。示されない場合、癌および正常細胞を、40 ng/mlのTNFα、20 ng/ml TRAIL、および10μΜ（癌細胞の場合）または25μΜ（正常細胞の場合）のAHLで刺激した。

E．細胞生存能力およびアポトーシスの評価
細胞毒性を、製造業者の説明書に従って、XTTに基づく毒物学アッセイキット (Sigma, St. Louis, MS)を使用することによって測定した。いくつかの実験について、毒性のアポトーシス性質を確認するために、Annexin V-FITCアポトーシス検出キット(Biovision, Mountain View, California)のプロトコルおよび説明書を使用して、細胞を分析した。さらに、カスパーゼ3、8、および9活性を比色分析(R&D System)によって測定し、未処理または対照処理細胞の値と比較した変化倍率としてデータを表す（n＝5）。

F．引用した実験参考文献

本明細書において参照される全ての特許および刊行物、特許および非特許は、個々の刊行物が参照によりその全体が組み入れられるように具体的にかつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

使用された用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示されかつ記載される特徴の任意の等価物またはその一部を排除するという意図はなく、しかし、特許請求される本発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書において開示されている概念の改変および変化が当業者によって採用され得ること、ならびにそのような改変および変化は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。

Claims (11)

1. 有効量の下記式（ＩＩ）のＮ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）アナログ化合物またはその薬学的に許容される塩と、任意で薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物：
   

   

   式中、Ｒ^１が、１つのアジド基によって置換されていてもよい、７〜１３炭素原子の直鎖アルキルである。
2. ＴＲＡＩＬポリペプチドである腫瘍調節剤をさらに含む、請求項１記載の薬学的組成物。
3. 

   からなる群より選択される、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）アナログの有効量を含む、薬学的組成物。
4. 患者における腫瘍を治療するための医薬の製造における、下記式（ＩＩ）のＮ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）アナログ化合物：
   

   

   または薬学的に許容される塩の使用であって、
   式中、Ｒ^１が、１つのアジド基によって置換されていてもよい、７〜１３炭素原子の直鎖アルキルであり、
   腫瘍が、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳房腫瘍、および脳腫瘍からなる群より選択される、使用。
5. 前記医薬が、ＴＲＡＩＬポリペプチドである腫瘍調節剤の有効量をさらに含む、請求項４記載の使用。
6. 患者における腫瘍を治療するための医薬の製造における、以下：
   

   

   からなる群より選択される、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）アナログの使用であって、
   腫瘍が、肺腫瘍、頸部腫瘍、乳房腫瘍、および脳腫瘍からなる群より選択される、使用。
7. 式（ＩＩ）の化合物：
   

   

   式中、Ｒ^１が、１つのアジド基によって置換されていてもよい、７〜１３炭素原子の直鎖アルキルである。
8. 以下：
   

   

   からなる群より選択される、化合物。
9. 腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための医薬の製造における、有効量のＮ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）化合物および有効量のＴＲＡＩＬポリペプチドの使用であって、ＡＨＬ化合物が、式（ＩＩ）の化合物：
   

   

   であり、
   式中、Ｒ^１が、１つのアジド基によって置換されていてもよい、７〜１３炭素原子の直鎖アルキルであり、
   腫瘍細胞が、肺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、および脳腫瘍細胞からなる群より選択される、使用。
10. 有効量のＡＨＬ化合物が、腫瘍細胞において、小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（ＵＰＲ）の、小胞体膨張（endoplasmic reticulum swelling）（ＥＲＳ）の、または両方の活性化剤である、請求項９記載の使用。
11. 腫瘍細胞において、アポトーシス、細胞分裂の停止、または細胞増殖の阻害を誘導するための医薬の製造における、有効量のＮ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）アナログおよび有効量のＴＲＡＩＬポリペプチドの使用であって、Ｎ−アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）アナログが、
    

    

    からなる群より選択され、
    腫瘍細胞が、肺腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、および脳腫瘍細胞からなる群より選択される、使用。

Images