CN105504000B - 一种筛选n-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于病原微生物预防与控制领域，具体涉及一种筛选N‑酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法，以QS分子C4‑AHL感应诱导抗性载体pSB538，带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI’和氯霉素抗性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4‑AHL分子或者其模拟多肽时，激活AhyI’启动子，诱导抗性基因表达；在培养基中培养，只有添加C4‑AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活；利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出孵育后在可见光下显蓝色的噬菌斑；然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过C4‑AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列。

Description

一种筛选N-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法

技术领域

本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)模拟物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)多肽模拟物的技术，该方法同样也适用于各种类型长、短链AHLs的多肽模拟物筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5α F’、XL1-Blue等，涉及的载体为感应QS分子诱导细菌携带耐药抗性基因的载体pSB538。属于病原微生物预防与控制领域。

背景技术

随着细菌耐药的形势日益严峻，替代抗生素的新型抑菌技术和策略的研究和开发迫在眉睫。其中，通过免疫细菌群体感应（QS, quorum sensing）效应分子来提高宿主抗菌能力是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略。细菌的群体感应是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质（又称为自诱导物，AI, autoinducer）分为以下4类：一类信号分子为AI-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）及其衍生 物, 广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。该类分子作用机理的研究相对比较透彻：AHLs分子由一系列具有相同高丝氨酸内酯环和不同碳原子数目和饱和程度的酰胺侧链构成，N侧链中的碳原子数多为偶数（只有C7一个奇数），从C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基团。以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程；第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物AI-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。文献报道AI-2在多种革兰氏阳性和阴性细菌中存在，是不同物种细菌间相互联系的通用信号。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子 AIP（Autoinducing peptide）以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统（AI-3）信号分子。

研究发现，AHLs分子具有免疫保护作用。1998年，Tateda等人发现，3-oxo-C₁₂-HSL分子可以刺激宿主增加IgG和IgE浓度并提高免疫保护力。此后，研究人员陆续发现该分子还可以刺激IL-8表达，提高中性细胞数目和噬菌细胞活性，并介导炎症发生，提示AHLs可能作为潜在的疫苗候选物。2006年，Miyairi等人将3-oxo-C₁₂-HSL偶联BSA制备成半抗原后免疫小鼠，结果发现小鼠感染铜绿假单胞菌的存活率得到显著提高，进一步证实了AHLs分子作为疫苗候选物的可能性。

本专利中运用到QS分子或者QS抑制剂感应菌株。目前研发了多种检测不同类型AHLs分子及其抑制物的报告菌株（Quorum sensing biosensors），其原理是通过感应到外源添加的QS分子，从而诱导系统启动发光或者自杀基因，从而达到筛选的目的。例如大肠杆菌的pSB536质粒上带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和生物发光基因luxCDABE，当添加入短链AHLs分子后，AhyR蛋白感应QS分子，激活AhyI’启动子，从而启动LuxCDABE蛋白，使细菌生物发光。又如大肠杆菌的QSIS1系统，pTBR2iB载体携带费氏弧菌的luxRI’和QS分子激活启动的自杀基因phlA。在添加入相应QS分子和候选QS抑制物后，细菌只在能抑制QS分子启动自杀基因的QS抑制物培养基中存活，从而筛选到QS抑制物。

本专利中运用到的另一个技术是噬菌体展示随机肽库（Phage display）技术，它是将一段长度大约为15-36bp的随机核苷酸序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上, 7个随机氨基酸序列可产生约20⁷种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合靶物质的多肽。该技术一般采用生物淘选（Biopanning）的方法来筛选抗原表位，其常规技术流程大致为：将靶蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异的短肽序列。

发明内容

虽然AHLs分子可以作为疫苗候选物，但是该化合物或者其衍生物是一类脂类的小分子物质，前期的提取、鉴定和纯化过程复杂，而且人工设计合成不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列问题，导致该分子及其衍生物价格昂贵，目前无法大量纯化生产并应用于宿主疫苗，只在科研实验范围内运用。这些问题制约着AHLs分子及其模拟物的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高效AHLs分子或者具有其相似功能的模拟物分子的新方法。因此，本研究所要解决的技术问题是：如何筛选出价格便宜，宿主免疫保护效果显著的AHLs分子类似物。本发明的主要目的是：建立一种简单、快速地筛选AHLs分子类似物的技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本研究专利基于多肽适体与小分子物质结合靶蛋白相同位点，可触发相同生物学效应的假说，利用随机肽库可模拟AHLs分子效应空间结构的原理。其主要原理如图2所示：首先构建一个可以感应外源添加的特定AHLs分子，诱导抗生素抗性，从而在抗生素筛选平板中存活的质粒系统。然后携带有该质粒的细菌与噬菌体随机肽库孵育侵染，在不添加特定AHLs分子的平板中孵育。在利用抗生素抗性的质粒系统中，不能诱导产生抗生素抗性的非特异噬菌体感染的细菌，不能在添加抗生素的平板中存活，而能表达与QS分子相同效应的特异噬菌体，因能形成与QS分子类似功能结构而诱导抗生素抗性表达，从而使细菌在抗生素平板中存活。然后将目的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的AHLs分子模拟物多肽。

本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的：本发明公开了一种利用M13噬菌体展示随机肽库筛选AHLs分子模拟多肽的方法。以QS分子-C4-AHL感应诱导抗性载体pSB538为例，如图1所示，该质粒由QS感应菌株pSB536（SIMON SWIFT et,1997）为实验室保存。带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI’和氯霉素抗性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4-AHL分子或者其模拟多肽时，激活AhyI’启动子，诱导抗性基因表达。在添加氨苄抗生素的培养基中培养，只有添加C4-AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活。主要原理如图3所示，利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出可见光下显蓝色，且12小时孵育后能正常生长的噬菌斑。然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过C4-AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列。本专利的方法不只限于利用抗生素抗性和生物发光来筛选特异噬菌体感染克隆，诱导GFP等发光报告系统的细菌，都可适用。

所述方法具体为：

（1）将含有QS信号分子C4-AHL感应抗生素抗性质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株；从划线平板中分别挑取单菌落ER2738接种至5 ml添加有20 µg/mL四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37 ^oC、250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期，含pSB538质粒菌收集1 mL菌体后重悬于200 µL LB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，分别取10 µL稀释到90 µL无菌水中，另取10 µL稀释到990 µL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200 µL菌液与10 µL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5 min；吸取上述所有预混液加入3 mL、45 ^oC温浴已融化的含有0.7 wt. %琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素和100 µg/mL氯霉素的IPTG/X-gal LB下层琼脂培养基平板上；等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37 ^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将平板在白光光源下拍照比对，分析比较在氯霉素抗性作用条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250 rpm条件下，培养4-5 h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含QS信号分子C4-AHL感应质粒pSB536的ER536菌株过夜活化后以1:100转接到LB培养基中200 rpm条件下，培养3h，以体积1：1的比例与所述上清液混匀后孵育5-10 min，然后在含有30 µg/mL 四环素、100µg/mL 氨苄青霉素的IPTG/X-gal LB固体培养基平板上点板验证；

（5）最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的平板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为5 min；挑选多肽候选物；最后，将目的噬菌体灭活后，测序，获得特异模拟多肽序列。

所述的IPTG/X-gal LB培养基制备方法为：称取1.25 g IPTG、1 g X-gal 溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化钠，pH= 7.4-7.6，1000 mL。所述的上层琼脂LB培养基为LB培养基中添加0.7 wt.%琼脂粉。

本发明的优点在于：本发明中使用的方法在原理上与现有筛选AHLs分子类似物的策略完全不同，它是利用随机文库筛选获得的特异性多肽序列，而不是化学合成或者自然界筛选的无机小分子，这样就省去了选材盲目、化学合成与样品处理步骤繁琐、结果无法预知、且最终小分子物质的结构和性质很难分离鉴定等问题。同时，以往方法共有的问题是，步骤繁琐，耗时长，需找一个AHLs分子类似物至少需要花费1个月至半年以上的时间。国内外目前并无由多肽构成AHLs模拟物的方法，因此本发明具有新颖性和创新性。此外，本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个AHLs分子模拟候选多肽，因此具有非常明显的优势。AHLs分子模拟多肽的研究与开发，可以广泛应用于疫苗的研究和应用中。本发明适用于任何类型的AHLs分子的模拟物筛选。

附图说明

图1. 本专利中使用的原始生物发光载体pSB536图谱与新构建的QS感应诱导抗生素抗性载体pSB538。

图2. 本专利中筛选细菌AHLs分子模拟多肽的原理示意图。

图3. 本专利中筛选细菌AHLs分子模拟多肽的试验流程图。

图4. 筛选的噬菌体上清影响QS生物发光感应菌株pSB536情况。

具体实施方式

所述方法具体为：

（1）将含有QS信号分子C4-AHL感应抗生素抗性质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株；从划线平板中分别挑取单菌落ER2738接种至5 ml添加有20 µg/mL四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37 ^oC、250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期，含pSB538质粒菌收集1 mL菌体后重悬于200 µL LB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，分别取10 µL稀释到90 µL无菌水中，另取10 µL稀释到990 µL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200 µL菌液与10 µL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5 min；吸取上述所有预混液加入3 mL、45 ^oC温浴已融化的含有0.7 wt. %琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素和100 µg/mL氯霉素的IPTG/X-gal LB下层琼脂培养基平板上；等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37 ^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将平板在白光光源下拍照比对，分析比较在氯霉素抗性作用条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250 rpm条件下，培养4-5 h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含QS信号分子C4-AHL感应质粒pSB536的ER536菌株过夜活化后以1:100转接到LB培养基中200 rpm条件下，培养3h，以体积1：1的比例与所述上清液混匀后孵育5-10 min，然后在含有30 µg/mL 四环素、100µg/mL 氨苄青霉素的IPTG/X-gal LB固体培养基平板上点板验证；

（5）最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的平板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为5 min；挑选多肽候选物；最后，将目的噬菌体灭活后，测序，获得特异模拟多肽序列。

所述的IPTG/X-gal LB培养基制备方法为：称取1.25 g IPTG、1 g X-gal 溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化钠，pH= 7.4-7.6，1000 mL。所述的上层琼脂LB培养基为LB培养基中添加0.7 wt.%琼脂粉。

实施例1

1.材料方法

实验材料BamHI、EcoRI购自Thermo scientific 公司；Quorum Sensing 检测质粒pSB536和E.coli JM109 （SIMON SWIFT et,1997）宿主菌为本实验室保存，ER2738宿主菌、噬菌体环7肽库Ph.D.-C7C^TM Phage Display Peptide Library Kit 购自美国New EnglandBiolabs纽英伦生物技术有限公司；抗生素四环素、氨苄青霉素购于Sigma公司，其他蔗糖等相关药品试剂及培养基分别购于中国国药集团化学有限公司与英国OXOID公司。引物合成和序列测定由上海立菲生物技术有限公司完成；信号分子N-butyryl-L-Homoserinelactone (C4-AHL)购自Cayman公司, 货号10007898，50 mg。

所述的IPTG/X-gal LB培养基制备方法为：称取1.25 g IPTG、1 g X-gal 溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化钠，pH= 7.5，1000 mL。

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实验步骤

(1)首先， 将实验室所保存的含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，利用分子改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE（SEQ ID NO.1）通过酶切位点BamHI、EcoRI替换成致死基因序列Cmr，（SEQ ID NO.2）经测序验证后保存于-20 ^oC备用，命名为pSB538；同时将噬菌体环7肽库试剂盒中的侵染所用宿主菌ER2738利用氯化钙法制备感受态（参考分子克隆实验指南第四版）；然后取出核酸含量为100 ng的pSB538质粒运用热激转化法将该质粒转导入所制备的ER2738感受态中。以上该步骤的实施，有效的提高了本实验筛选的过程中噬菌体对宿主菌侵染能力，故将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒pSB538转导入大肠杆菌ER2738菌株尤为必要。从划线平板中挑取单菌落ER2738接种至5ml含有终浓度为20 µg/mL四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的液体LB培养基中37 ^oC，250 rpm振荡过夜；翌日，取过夜菌以1:200转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期并收集1 mL菌体后重悬于200 µL LB培养基中待用；

(2)然后，将噬菌体C7C环肽文库（NEB公司）放置冰上化冻，取10µL稀释到90 µL无菌水中，再分别将步骤（1）稀释后待用的200 µL菌液与该稀释后10 µL的噬菌体肽库轻轻混匀，置于室温条件下孵育2-5 min；接着吸取上述预混液加入3 mL、45 ^oC 温浴已融化的含有琼脂粉0.7 wt.%的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒至含有终浓度为20 µg/mL四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素和100 µg/mL氯霉素的IPTG/X-gal下层固体LB培琼脂培养基平板上；除以上实验组之外，还设置了两组对照，分别为不添加噬菌体以及添加终浓度10µM C4-AHL信号分子为阴性、阳性对照；待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37 ^oC培养箱中静置培养14 h；

(3)将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在氯霉素作用条件下能够生长且存在噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落以及对照未显蓝色单菌落转接于5 mLLB培养基中，37 ^oC，250 rpm条件下培养5 h；

(4)然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将实验室保存含QS信号分子C4-AHL感应质粒pSB536的原始菌株过夜活化后以1:100转接到LB培养基中200 rpm，3 h，以1：1的比例与所述上清液混匀后孵育7 min，然后在含有30 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素的IPTG/X-gal LB固体培养基平板上点板作为实验组，并以ER2738含有pSB536质粒菌株与信号分子孵育为阳性对照组（图4中的6），以ER2738携带pSB536质粒菌株感染非特异噬菌体（例如Y27，图4中的1），以及不感染噬菌体（图4中的2）为阴性对照组，图4中的3-5以及7-8号为待检测的类似物。待平板完全干后倒置于37 ^oC培养箱，静置过夜培养。

(5)利用化学发光成像技术，将该过夜的平板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为5min。结果如图4所示，图4A中的4、5、7和8； 图4B中的7；图4C中的7和8以及图4D中的3、4和7样品在生物发光条件下发光，为类似物多肽候选物。最后，将目的噬菌体灭活后，送公司测序，以做进行进一步分析比较。

综上所述，利用QS感应抗生素抗性菌株可以被AHLs分子及其类似物诱导抗生素抗性的特性，结合噬菌体随机文库展示技术进行AHLs分子模拟多肽的筛选，解决传统噬菌体文库展示方法中，小分子物质化学结构复杂，难以固定的难题，可以迅速、大规模地筛选针对各种不同类型AHLs分子的模拟多肽；通过进一步的功能验证，可制备成与AHLs分子具有相同功能的多肽，诱导宿主免疫，为新型疫苗的开发提供基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种筛选N-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5796

<212> DNA

<213> 发光基因序列LuxCDABE

<400> 1

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aaataacgga gtatgttgat aagttgaatt ttgaacagat tttagtgtat gaaaatcatt 3660

tttcagataa tggtgttgtc ggcgctcctc tgactgtttc tggttttctg ctcggtttaa 3720

cagagaaaat taaaattggt tcattaaatc acatcattac aactcatcat cctgtccgca 3780

tagcggagga agcttgctta ttggatcagt taagtgaagg gagatttatt ttagggttta 3840

gtgattgcga aaaaaaagat gaaatgcatt tttttaatcg cccggttgaa tatcaacagc 3900

aactatttga agagtgttat gaaatcatta acgatgcttt aacaacaggc tattgtaatc 3960

cagataacga tttttatagc ttccctaaaa tatctgtaaa tccccatgct tatacgccag 4020

gcggacctcg gaaatatgta acagcaacca gtcatcatat tgttgagtgg gcggccaaaa 4080

aaggtattcc tctcatcttt aagtgggatg attctaatga tgttagatat gaatatgctg 4140

aaagatataa agccgttgcg gataaatatg acgttgacct atcagagata gaccatcagt 4200

taatgatatt agttaactat aacgaagata gtaataaagc taaacaagag acgcgtgcat 4260

ttattagtga ttatgttctt gaaatgcacc ctaatgaaaa tttcgaaaat aaacttgaag 4320

aaataattgc agaaaacgct gtcggaaatt atacggagtg tataactgcg gctaagttgg 4380

caattgaaaa gtgtggtgcg aaaagtgtat tgctgtcctt tgaaccaatg aatgatttga 4440

tgagccaaaa aaatgtaatc aatattgttg atgataatat taagaagtac cacatggaat 4500

atacctaata gatttcgagt tgcagcgagg cggcaagtga acgaatcccc aggagcatag 4560

ataactatgt gactggggtg agtgaaagca gccaacaaag cagcagcttg aaagatgaag 4620

ggtataaaag agtatgacag cagtgctgcc atactttcta atattatctt gaggagtaaa 4680

acaggtatga cttcatatgt tgataaacaa gaaattacag caagctcaga aattgatgat 4740

ttgatttttt cgagcgatcc attagtgtgg tcttacgacg agcaggaaaa aatcagaaag 4800

aaacttgtgc ttgatgcatt tcgtaatcat tataaacatt gtcgagaata tcgtcactac 4860

tgtcaggcac acaaagtaga tgacaatatt acggaaattg atgacatacc tgtattccca 4920

acatcggttt ttaagtttac tcgcttatta acttctcagg aaaacgagat tgaaagttgg 4980

tttaccagta gcggcacgaa tggtttaaaa agtcaggtgg cgcgtgacag attaagtatt 5040

gagagactct taggctctgt gagttatggc atgaaatatg ttggtagttg gtttgatcat 5100

caaatagaat tagtcaattt gggaccagat agatttaatg ctcataatat ttggtttaaa 5160

tatgttatga gtttggtgga attgttatat cctacgacat ttaccgtaac agaagaacga 5220

atagattttg ttaaaacatt gaatagtctt gaacgaataa aaaatcaagg gaaagatctt 5280

tgtcttattg gttcgccata ctttatttat ttactctgcc attatatgaa agataaaaaa 5340

atctcatttt ctggagataa aagcctttat atcataaccg gaggcggctg gaaaagttac 5400

gaaaaagaat ctctgaaacg tgatgatttc aatcatcttt tatttgatac tttcaatctc 5460

agtgatatta gtcagatccg agatatattt aatcaagttg aactcaacac ttgtttcttt 5520

gaggatgaaa tgcagcgtaa acatgttccg ccgtgggtat atgcgcgagc gcttgatcct 5580

gaaacgttga aacctgtacc tgatggaacg ccggggttga tgagttatat ggatgcgtca 5640

gcaaccagtt atccagcatt tattgttacc gatgatgtcg ggataattag cagagaatat 5700

ggtaagtatc ccggcgtgct cgttgaaatt ttacgtcgcg tcaatacgag gacgcagaaa 5760

gggtgtgctt taagcttaac cgaagcgttt gatagt 5796

<210> 2

<211> 660

<212> DNA

<213> 抗性基因序列Cmr序列

<400> 2

atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60

cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120

attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180

cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 240

gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300

acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360

tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420

aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480

gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540

gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtctgtga tggcttccat 600

gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660

Claims (2)

1.一种筛选N-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法，其特征在于：以QS分子C4-AHL感应诱导抗性载体pSB538，该质粒pSB538由QS感应菌株pSB536衍生而来；带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和氯霉素抗性性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4-AHL分子或者其模拟多肽时，激活AhyI’启动子，诱导抗性基因表达；在添加含有氯霉素抗性的培养基中培养，只有添加C4-AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活；利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出可见光下显蓝色，且12小时孵育后能正常生长的噬菌斑；然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过C4-AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列；

所述方法具体为：

（1）将含有QS信号分子C4-AHL感应抗生素抗性质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株；从划线平板中分别挑取单菌落ER2738接种至5 ml添加有20 µg/mL四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37 ^oC、250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期，含pSB538质粒菌收集1 mL菌体后重悬于200 µL LB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，分别取10 µL稀释到90 µL无菌水中，另取10 µL稀释到990 µL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200 µL菌液与10 µL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5 min；吸取上述所有预混液加入3 mL、45 ^oC温浴已融化的含有0.7 wt. %琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素和100 µg/mL氯霉素的IPTG/X-gal LB下层琼脂培养基平板上；等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37 ^oC培养箱中静置培养12-16 h；

（3）翌日，将平板在白光光源下拍照比对，分析比较在氯霉素抗性作用条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37 ^oC、250 rpm条件下，培养4-5 h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将含QS信号分子C4-AHL感应质粒pSB536原始菌株过夜活化后以1:100转接到LB培养基中200 rpm条件下，培养3 h，以1：1的比例与所述上清液混匀后孵育5-10 min，然后在含有30 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素的IPTG/X-gal LB固体培养基平板上点板验证；

（5）最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的平板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为5 min；挑选多肽候选物；最后，将目的噬菌体灭活后，测序，获得特异模拟多肽序列。

2.根据权利要求1所述的一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述的IPTG/X-gal LB培养基制备方法为：称取1.25 g IPTG、1 g X-gal 溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1 %添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g氯化钠，pH=7.4-7.6，1000 mL。