CN1869063A - 一种抑制明胶酶a活性的多肽和制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4,由H WW Q W P S S L Q L R G G G S所示的氨基酸序列所组成。采用噬菌体展示技术筛选MMP-2特异性结合抑制性多肽来抑制MMP-2的活性,筛选多肽的方法:首先是噬菌体亲和筛选,其次是噬菌体的扩增,经几轮筛选得到特异性结合MMP-2的噬菌体,并涂板,挑克隆,进行噬菌体扩增,然后用MMP-2荧光药物筛选试剂盒再次对噬菌体单克隆筛选,即可得到抑制MMP-2酶活性的多肽M204C4,经试验研究表明该多肽M204C4具有抑制MMP-2酶活性的作用,有抑制体外胰腺癌细胞系PANC-1和CFPAC-1侵袭转移的作用。
Description
一、技术领域
本发明涉及生物化学多肽的制备及应用,具体地说是应用噬菌体展示技术筛选并获得明胶酶A(MMP-2)抑制性多肽M204C4编码cDNA序列的过程、该多肽具有对MMP-2酶活性有抑制作用以及体外抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用;因此,该多肽可能应用于人类肿瘤细胞侵袭的预防和治疗。
二、背景技术
肿瘤已成为继心血管疾病之后威胁人类生命的一大杀手。肿瘤的进程包括:正常细胞某些基因的改变、恶性表型的形成、侵袭邻近正常组织、远距离及全身组织扩散(转移)。据临床统计,约有80%以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移,故对肿瘤细胞的侵袭、转移研究方面一直受到人们的关注。
肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于肿瘤血管的生成。肿瘤细胞生长转移的主要障碍是细胞外基质。研究表明,基质金属蛋白酶类(MMPs)和其他蛋白酶与肿瘤组织周围基质的重塑有关。其中,MMP-2与肿瘤的发生、发展以及肿瘤临床恶性程度密切相关。
MMP-2,又称明胶酶A,分子量72KD,是基质金属蛋白酶家族中的一员。MMP-2主要降解明胶、IV、V、VII、X型基底膜胶原。基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)为MMP-2特异性组织抑制因子,能特异性与MMP-2催化中心的Zn2+结合,封闭其催化活性。在体内,MMPs和TIMPs的转录和活性受多因素和多水平的调节,从而维持动态平衡。该调节机制紊乱,可出现相应的病理状态,尤其在肿瘤侵袭、转移中的作用更为突出。研究表明,MMP-2在多种肿瘤中过表达,并与肿瘤恶性程度密切相关,如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌等(李东、于宏、贺占国。明胶酶与疾病关系的研究。医学综述,2002,8(8):442。)。TIMP-2作用作为MMP-2的组织抑制剂,其方式复杂,它一方面可以抑制MMP-2的活性,但同时还参与MMP-2的激活(李东、于宏、贺占国。明胶酶与疾病关系的研究。医学综述,2002,8(8):442。),有时参与细胞生长、繁殖及刺激血管生成等病理、生理学过程。MMP-2与TIMP-2相互作用的结果与肿瘤细胞侵袭、转移有相关性,MMP-2/TIMP-2比值甚至作为一些肿瘤恶性程度及预后判断的一项指标(朱峰、刘新光、梁念慈。基质金属蛋白酶及其组织抑制物与肿瘤侵袭转移。国外医学临床生物化学与检验学分册,2001,22(5):229。)。MMP-2其他抑制因子如:Kazal基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白(RECK)、组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)等虽然可以作为MMP-2的抑制物,并且在体外已表达,但由于其作用机理仍未完全清楚,在抑制MMP-2活性的同时产生其他的副作用(Andrew H.Baker,Dylan R.Edwards and Gillian Murphy.Metalloproteinasein hibitors:biological actions and therapeutic opportunities.Journalof cell science.2002,115(19):3719.)。
综上所述,寻找与MMP-2特异结合的抑制剂,对于抑制MMP-2活性,同时在体内抑制肿瘤的侵袭、转移对于肿瘤患者治疗是非常重要的。
三、发明内容
1.发明目的
本发明的目的是提供一种抑制MMP-2活性的多肽及其制法以及该多肽抑制MMP-2作用和体外抑制肿瘤细胞侵袭转移作用。
2.技术方案
本研究主要采用噬菌体展示技术筛选MMP-2特异性结合抑制性多肽来抑制MMP-2的活性。首先是将靶蛋白MMP-2包被酶标板,4℃过夜,使MMP-2能与酶标板很好的结合。然后用BSA封闭液封闭酶标板孔中未结合MMP-2的部位,减少非特异性噬菌体结合。向已封闭好的酶标板中加入噬菌体,使得噬菌体尾部表达的肽与MMP-2结合,再用TBST洗掉未结合的噬菌体,最后用甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱结合的噬菌体,用Tris-HCl中和后即得筛选的噬菌体。将该噬菌体经过扩增以后进行随后的几轮筛选,即可得到特异性结合MMP-2的噬菌体。在噬菌体筛选的过程中,第一轮筛选洗脱时强度要小,在随后的几轮中逐渐增强洗脱强度,即可得到结合能力强的特异性结合的噬菌体。将末次筛选的噬菌体涂板,挑克隆,进行噬菌体扩增,然后用MMP-2荧光药物筛选试剂盒再次对噬菌体单克隆进行筛选,即可得到结合能力最强的噬菌体。然后将所得噬菌体提取DNA,测序,比对后就可得到抑制MMP-2酶活性的多肽编码序列M204C4。
一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4,其特征是它由H W W Q W P S S L QL R G G G S所示的氨基酸序列所组成。
编码M204C4的cDNA序列为CAT TGG TGG CAG TGG CCT TCT TCG
CTT CAG CTT CGG GGT GGA GGT TCG
上述编码M204C4的cDNA序列,还包含所列cDNA序列的互补序列,以及类似的人工合成序列。
筛选上述多肽M204C4的方法,其步骤如下:
(1)噬菌体的扩增从第一、二轮筛选的噬菌体洗脱液中取10μl,加入20mL培养至吸光度A600=0.5的ER2738菌中,室温放置、振荡、培养、离心,分离出上清液,将上清液再离心,加1/6体积的PEG8000NaCl溶液,过夜;第二天将沉淀过夜的噬菌体溶液离心,弃上清,加1mL TBS混悬沉淀,离心,转移上清液至
EP管中,离心,再次转移上清液至新的EP管中,加1/6体积的PEG8000NaCl溶液,冰浴沉淀后离心,弃上清,100μl TBS溶沉淀,再离心1min,转移上清至新EP管中,即得扩增的噬菌体;
(2)亲和筛选用100ulMMP-2靶蛋白包板,过夜,加入200ulBSA封闭液封闭,用TBST洗6次,每次在加入TBST后均在摇床上轻摇2分钟,清洗完毕后,将酶标条在干净的吸水纸上敲几次,去除剩余的液体,噬菌体原库10μl加入100μl TBST即含0.1%吐温中,混匀后加入包被好的酶标板中,摇60分钟,按上述方法用TBST即含0.1%吐温洗10次,去除剩余液体后,加入100μl甘氨酸-盐酸洗脱液,摇7分钟,收集洗脱液,加15μl Tris-HCl中和,滴度测定,此即第一轮筛选;取10μl洗脱液进行噬菌体扩增,用扩增的噬菌体进行第二轮的亲和筛选;同法进行第三轮筛选;
(3)将第三轮筛选的噬菌体进行滴度测定,同时挑克隆,扩增,然后用MMP-2特异性荧光分析试剂盒检测挑选的单克隆扩增产物对MMP-2酶活性的抑制作用,挑选抑制作用强的噬菌体单克隆提取DNA,进行DNA测序,由此cDNA翻译得到的多肽序列命名为M204C4。
上述筛选多肽的方法在步骤(1)中在ER2738菌中加入噬菌体洗脱液后,室温放置15min,于37℃250r/min振荡培养(4-4.5)h,4℃10000rpm离心10min,将上清液再离心5min,加1/6体积的PEG8000NaCl为20%W/V的PEG8000、2.5mol/L的Nacl,4℃过夜,将过夜的噬菌体溶液在4℃10000rpm离心15min,转移上清液至EP管中后在4℃12000rpm离心5min,冰浴沉淀(40-60)min,4℃13000rpm离心20min。
上述筛选多肽的方法在步骤(2)中所述的MMP-2靶蛋白包板是用pH8.6、0.1mol/L NaHC03溶解至浓度为10μg/ml,4℃过夜,所述的BSA封闭液为5mg/mlBAS,0.1mol/L NaHCO3,pH8.6,封闭1h;所述的TBST洗液为50mmol/L,Tris-HCl,pH7.5,150mmol/L NaCl,0.1%V/V Tween-20;所述的甘氨酸-盐酸为0.2mol/L,pH2.2,用1.0mol/L,pH9.1的Tris-HCl中和。
试验研究结果表明不同浓度的多肽M204C4,对MMP-2具有不同程度的抑制作用,且随着多肽M204C4浓度的不断增加,对MMP-2的活性抑制逐渐升高,呈现剂量依赖性;中和性多肽M204C4抑制MMP-2酶活性的IC50为78.0nmol/L;不同剂量的多肽M204C4,对体外人胰腺癌细胞系PANC-1与CFPAC-1侵袭转移作用具有不同程度的抑制作用,且随着多肽M204C4剂量的增加,其抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用逐渐增强,呈现剂量依赖性。
3.有益效果
本发明所得M204C4多肽,经过抑制MMP-2酶活性试验测定IC50,以及体外对经过PGE2处理后获得高侵袭性的胰腺癌细胞系PANC-1、CFPAC-1的侵袭转移抑制性试验研究结果表明:
(1).M204C4在较低浓度下即可抑制MMP-2酶活性(表1),其IC50为78.0nmol/L。
(2).M204C4体外可以抑制PANC-1、CFPAC-1的侵袭转移作用,并具有一定的剂量——效应关系(图3、图4)。
四、附图说明
图1.编码M204C4的cDNA序列。
图2.M204C4氨基酸序列。
图3.胰腺癌细胞系PANC-1经PGE2处理后,MMP-2生成增加,侵袭转移能力显著增强,当加入M204C4后,侵袭转移能力下降,并具有一定的剂量效应关系。
图4.胰腺癌细胞系CFPAC-1经PGE2处理后,MMP-2生成增加,侵袭转移能力显著增强,当加入M204C4后,侵袭转移能力下降,并具有一定的剂量效应关系。
五、具体实施方式
实施例1.多肽M204C4的筛选方法
试验材料
(1)噬菌体12肽库、受体菌ER2738均购自NEW ENGLAND Biolabs公司。
(2)重组人MMP-2,购自美国R&D公司。
(3)MMP-2荧光分析药物筛选试剂盒,购自美国Biomol公司。
试验方法
(1)噬菌体的扩增从第一、二轮筛选的噬菌体洗脱液中取10μl,加入20mL培养至吸光度A600=0.5的ER2738菌中,室温放置15min,于37℃250r/min振荡培养4.5h,4℃10000rpm离心10min,分离出上清液,将上清液再离心5min,加1/6体积的PEG8000NaCl(20%W/V PEG8000、2.5mol/L NaCl)溶液,4℃过夜;第二天将沉淀过夜的噬菌体溶液在4℃10000rpm离心15min,弃上清,加1mL TBS混悬沉淀,离心,转移上清液至EP管中,4℃12000rpm离心5min,重新转移上清液至新EP管中,加1/6体积的PEG8000NaCl溶液,冰浴沉淀40分钟,4℃13000rpm离心20min,弃上清,100μl TBS溶沉淀,再离心1min,转移上清至新EP管中,即得扩增的噬菌体;
(2)亲和筛选用100ul MMP-2靶蛋白(用pH 8.6,0.1mol/L NaHCO3溶解至浓度为10μg/ml)包板,4℃过夜,弃去包被液,加入200ulBSA封闭液(5mg/mLBSA,0.1mol/L NaHCO3pH 8.6)封闭1h,用TBST(50mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150mmol/L NaCl,0.1%V/V Tween-20)洗6次,每次在加入TBST后均在摇床上轻摇2分钟,清洗完毕后,将酶标条在干净的吸水纸上敲几次,去除剩余的液体,噬菌体原库10μl加入100μl TBST(0.1%吐温)中,混匀后加入包被好的酶标板中,摇60分钟,按上述方法用TBST(0.1%吐温)洗10次,去除剩余液体后,加入100μl甘氨酸-盐酸(0.2mol/L pH2.2)洗脱液,摇7分钟,收集洗脱液,加15μl Tris-HCl(1.0mol/L pH9.1)中和,滴度测定,此即第一轮筛选;取10μl噬菌体洗脱液进行噬菌体扩增,并进行第二轮的亲和筛选,同法进行第三轮筛选;
(3)将第三轮筛选的噬菌体进行滴度测定,同时挑克隆,扩增,然后用MMP-2特异性荧光分析试剂盒检测挑选的单克隆扩增产物对MMP-2酶活性的抑制作用,挑选抑制作用强的噬菌体单克隆提取DNA,进行DNA测序(结果见图1),并经过翻译后得到的多肽序列命名为M204C4(见图2)。
实施例2.多肽M204C4对MMP-2的抑制作用与IC50的计算
试验方法
按照MMP-2荧光检测试剂盒方法,向96孔检测板中加入中和性多肽M204C4(由西安华辰有限公司合成)和MMP-2,使得M204C4终浓度分别为0、10、20、50、100、200nmol/L,37℃温育45min,加入底物,立即在波长为328/393nm处测定荧光值,并计算酶活性抑制百分率。应用SPSS10.0软件计算IC50。
实验结果
如表1所示,向反应体系中加入不同浓度的M204C4,对MMP-2具有不同程度的抑制作用,且随着M204C4浓度的不断增加,对MMP-2的活性抑制作用逐渐增强,呈现剂量依赖性。中和性多肽M204C4抑制MMP-2酶活性的IC50为78.0nmol/L。
表1 M204C4对MMP-2活性抑制作用
浓度(nmol/L) | 荧光值(ABUs/min) | 酶活性抑制(%) |
0102050100200 | 2.80±0.152.54±0.162.45±0.182.37±0.070.47±0.040.05±0.05 | -9.312.715.683.498.1 |
实施例3.多肽M204C4体外抑制胰腺癌细胞系侵袭试验
试验材料
(1)M204C4多肽:由西安华辰有限公司合成,用pH7.2PBS缓冲液溶解。
(2)人胰腺癌细胞系PANC-1与CFPAC-1,购至中科院上海细胞所。细胞培养于含10%FBS、100ug/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM培养液中,于5%CO2、37℃培养。细胞密度达80%-90%时用0.25%胰酶消化传代。
试验方法
将PANC-1、CFPAC-1接种于培养瓶中,过夜。用终浓度为10μmol/L的PGE2处理细胞8h,胰酶消化,用含0.5%BSA的无血清DMEM中和,离心,收集细胞。用无血清DMEM重悬细胞,调整细胞密度(PANC-1:1.0×105/mL,CFPAC-1:2.0×105/mL)。将250μL细胞悬液加入已用无血清DMEM培养液润湿好的侵袭小室上室中,同时加入PGE2(终浓度10μmol/L)和中和性多肽M204C4(终浓度分别为200、60、20nmol/L)。在下室中加入含5.0%FBS的DMEM,于5%CO2、37℃培养24h。取出上室,用棉签去除未侵袭转移的细胞和基质胶,结晶紫染色,显微镜下观察。每样随机各取3个视野进行细胞计数。本试验重复三次。
数据处理
用相对值表示,即以单独用PGE2处理的侵袭转移细胞数为基准,其余各组与其相比即得。应用SPSS10.0软件进行统计学分析处理,P<0.05具有统计学意义。
试验结果
(1)胰腺癌细胞系PANC-1经PGE2处理后,侵袭转移能力明显增强,与对照组相比具有显著的统计学差异(P<0.01)。PANC-1细胞经PGE2预处理后加入中和性多肽M204C4后,其侵袭转移能力明显下降。高剂量200nmol/L M204C4能显著抑制PANC-1细胞侵袭转移,与单独用PGE2处理组相比,具有显著的统计学差异(P<0.001);中剂量60nmol/L M204C4也具有相似的作用效果(P<0.001),但其抑制PANC-1的侵袭转移作用小于高剂量组;低剂量20nmol/L M204C4虽然也可以抑制PANC-1的侵袭转移,但其作用弱于高、中剂量组,与单独用PGE2处理组相比亦有统计学差异(P<0.01)。
(2)胰腺癌细胞系CFPAC-1未经PGE2处理时,几乎无侵袭转移能力(未附图),经PGE2处理后,侵袭转移能力明显增强,在镜下观察可见大量的细胞。CFPAC-1经PGE2预处理后加入中和性多肽M204C4后,其侵袭转移能力明显下降。高剂量200nmol/L M204C4能显著抑制MMP-2的活性,使得CFPAC-1细胞侵袭转移能力减弱,与对照PGE2处理组相比,具有非常显著的统计学差异(P<0.001);中剂量60nmol/L M204C4也具有相似的作用效果(P<0.01),但其抑制作用小于高剂量组;低剂量20nmol/L M204C4虽然可以抑制CFPAC-1的侵袭转移,但与PGE2处理组相比无统计学差异(P>0.05)。
Claims (7)
1、一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4,其特征是它由H W W Q W P S S LQ L R G G G S所示的氨基酸序列所组成。
2、一种抑制明胶酶A活性的多肽M204C4,其特征是它具有如下cDNA序列:
CAT TGG TGG CAG TGG CCT TCT TCG
CTT CAG CTT CGG GGT GGA GGT TCG
3、一种筛选权利要求1所述多肽M204C4的方法,其步骤如下:
(1)噬菌体的扩增从第一、二轮筛选的噬菌体洗脱液中取10μl,加入20mL培养至吸光度A600=0.5的ER2738菌中,室温放置、振荡、培养、离心,分离出上清液,将上清液再离心,加1/6体积的PEG8000NaCl溶液,过夜;第二天将沉淀过夜的噬菌体溶液离心,弃上清,加1mL TBS混悬沉淀,离心,转移上清液至EP管中,离心,再次转移上清液至新EP管中,加1/6体积的PEG8000NaCl溶液,冰浴沉淀后离心,弃上清,100μl TBS溶沉淀,再离心1min,转移上清至新EP管中,即得扩增的噬菌体;
(2)亲和筛选用100ulMMP-2靶蛋白包板,过夜,加入200ulBSA封闭液封闭,用TBST洗6次,每次在加入TBST后均在摇床上轻摇2分钟,清洗完毕后,将酶标条在干净的吸水纸上敲几次,去除剩余的液体,噬菌体原库10μl加入100μl TBST即含0.1%吐温中,混匀后加入包被好的酶标板中,摇60分钟,按上述方法用TBST即含0.1%吐温洗10次,去除剩余液体后,加入100μl甘氨酸-盐酸洗脱液,摇7分钟,收集洗脱液,加15μl Tris-HCl中和,滴度测定,此即第一轮筛选;取10μl噬菌体洗脱液进行扩增,并进行第二轮的亲和筛选,同法进行第三轮筛选;
(3)将第三轮筛选的噬菌体进行滴度测定,同时挑克隆,扩增,然后用MMP-2特异性荧光分析试剂盒检测挑选的单克隆扩增产物对MMP-2酶活性的抑制作用,挑选抑制作用强的噬菌体单克隆提取DNA,进行DNA测序,得到的多肽序列命名为M204C4。
4、根据权利要求4所述筛选多肽的方法,其特征在于在步骤(1)中在ER2738菌中加入噬菌体洗脱液后室温放置15min,于37℃250r/min振荡培养4.5h,4℃10000rpm离心10min,将上清液再离心5min,加1/6体积的PEG8000NaCl为20%W/V的PEG8000、2.5mol/L的NaCl,4℃过夜,将过夜的噬菌体溶液在4℃10000rpm离心15min,转移上清液至EP管中后在4℃12000rpm离心5min,冰浴沉淀40min,4℃13000rpm离心20min。
5、根据权利要求4所述筛选多肽M204C4的方法,其特征在于在步骤(2)中所述的MMP-2靶蛋白是用pH8.6,0.1mol/L NaHCO3溶解至浓度为10ug/ml包板,4℃过夜,所述的BSA封闭液为5mg/ml BAS,0.1mol/L NaHCO3,pH8.6,封闭1h;所述的TBST洗液为50mmol/L,Tris-HCl,pH7.5,150mmol/L NaCl,0.1%V/VTween-20;所述的甘氨酸-盐酸为0.2mol/L,pH2.2,用1.0mol/L,pH9.1的Tris-HCl中和。
6、权利要求1所述的多肽M204C4,其特征在于不同浓度的多肽M204C4,对MMP-2酶活性具有不同程度的抑制作用,且随着多肽M204C4浓度的不断增加,对MMP-2的活性抑制逐渐增强,呈现剂量依赖性;中和性多肽M204C4抑制MMP-2酶活性的IC50为78.0nmol/L。
7、权利要求1所述的多肽M204C4,其特征在于不同剂量的多肽M204C4,对体外人胰腺癌细胞系PANC-1与CFPAC-1的侵袭转移作用具有不同程度的抑制作用,且随着多肽M204C4剂量的增加,其抑制作用逐渐增强,呈现剂量依赖性。
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PB01 | Publication | ||
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Open date: 20061129 |