CN102049038B - 明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 - Google Patents
明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102049038B CN102049038B CN2011100029928A CN201110002992A CN102049038B CN 102049038 B CN102049038 B CN 102049038B CN 2011100029928 A CN2011100029928 A CN 2011100029928A CN 201110002992 A CN201110002992 A CN 201110002992A CN 102049038 B CN102049038 B CN 102049038B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gelatinase
- inhibitory polypeptide
- modifier
- tumor
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 28
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 102000000424 Matrix Metalloproteinase 2 Human genes 0.000 title abstract 7
- 108010016165 Matrix Metalloproteinase 2 Proteins 0.000 title abstract 7
- 239000003607 modifier Substances 0.000 title abstract 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 10
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 10
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 10
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 10
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 16
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 4
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 4
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 2
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- HKIWSNQLOOLXOH-UHFFFAOYSA-N methanol;2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound O.OC.OC(=O)C(F)(F)F HKIWSNQLOOLXOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010000077 Abdominal mass Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 241000459479 Capsula Species 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101000990902 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000033147 Parenteral nutrition-associated cholestasis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005353 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000863032 Trieres Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- XFILPEOLDIKJHX-QYZOEREBSA-N batimastat Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](CSC=1SC=CC=1)C(=O)NO)C1=CC=CC=C1 XFILPEOLDIKJHX-QYZOEREBSA-N 0.000 description 1
- 229950001858 batimastat Drugs 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- -1 especially MMP2 Proteins 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N marimastat Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](O)C(=O)NO OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N 0.000 description 1
- 229950008959 marimastat Drugs 0.000 description 1
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- BSIZUMJRKYHEBR-QGZVFWFLSA-N n-hydroxy-2(r)-[[(4-methoxyphenyl)sulfonyl](3-picolyl)amino]-3-methylbutanamide hydrochloride Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N([C@H](C(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CN=C1 BSIZUMJRKYHEBR-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 229920006111 poly(hexamethylene terephthalamide) Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000002951 street drug Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物的应用。该明胶酶A抑制性多肽的修饰物为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，其分子量为11000~13000，该应用为在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。本发明的明胶酶A抑制性多肽的修饰物，克服M205C4活性肽的稳定性差和体内代谢快的不足，其具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点，并且在胰腺癌动物模型中发挥了良好的抗肿瘤作用，为其在人体的治疗应用提供了重要基础和保证。
Description
技术领域
本发明涉及一种明胶酶A抑制性多肽(M205C4)，具体涉及一种明胶酶A抑制性多肽(M205C4)的修饰物的应用。明胶酶A抑制性多肽的修饰物，简称为M205C4-PEG。
背景技术
局部侵袭和远处转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是导致肿瘤患者较高死亡率的主要原因。目前的研究认为在肿瘤的侵袭、转移过程中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的破坏是关键环节。在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)是最重要的蛋白水解酶，尤其是MMP2、MMP9在癌细胞侵袭转移过程中不仅可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原。所以设计寻找针对MMPs拮抗药物就尤为重要。目前已有人工合成的MMPs抑制物，如：Marimastat、Batimastat、Mtastat、BAY12-9566、AG-3340、CGS-27023A和SC-204092等，正在进行不同阶段临床试验。虽然这类小分子化合物可以有效抑制基质金属蛋白酶的酶解作用，但同时所产生的细胞毒作用会给试用者带来强烈的副作用。由此研究人员把目光转向了基质金属蛋白酶类的组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases , TIMPs）家族。TIMPs的主要功能是天然地抑制MMPs的活性，在调节细胞外基质的代谢中起到了重要作用。其中TIMP-1被认为是组织中MMPs活性主要调节者，控制着大多数的MMPs家族成员。然而TIMPs对肿瘤却是把双刃剑，一方面，通过对抗MMPs蛋白的水解作用抑制肿瘤的浸润。但肿瘤也需要对抗自身的过度水解，所以TIMPs对肿瘤生长同样是必须的。另外，还对肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成等方面起到了关键作用，因此对肿瘤的发展具有双向性。因此寻找结合了小分子化合物和TIMPs蛋白优势的新型药物是我们的研究重点。
多肽类药物具备高效、低毒和特异性强的显著性优势。M205C4是通过噬菌体展示技术筛选的特异性MMP2抑制性结合肽，拮抗作用完全模拟了TIMPs对MMPs活性调节的方式，可以有效的抑制肿瘤细胞的侵袭转移并于2006年成功报批国家专利（ZL200610085779.7）。经后期实验证明，M205C4对多种肿瘤细胞的生长及血管新生没有明显的促进作用，符合我们的新药筛选标准。但同时也存在肽类药物在体不稳定、易降解的问题，无法使药物在体发挥其特有的生物学活性。而对于药物的修饰同时要考虑到其自身空间结构改变所导致的活性变化和体内代谢行为两个重要因素以外，修饰的工艺化问题也是不容忽视的。所以修饰及其制备方法的选择对于药物的后期研究至关重要。
发明内容
发明目的：针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种M205C4的修饰物的应用，修饰后药物保留了原有生物学活性的同时，降低了免疫原性，延长了其在生物体内的半衰期。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物，为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，结构式为
分子量为11000~13000；结构式中，为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。
明胶酶A抑制性多肽的修饰物的修饰方法，包括以下步骤：
（1）按摩尔比为1:1~5分别称取M205C4和mPEG-SC，定溶于pH5.0-8.0的PBS缓冲液中，M205C4的反应浓度为100 uM；在静音混合器上，4℃反应2.5h以上，制得M205C4-PEG混合液；
（2）采用SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱对步骤（1）制得的M205C4-PEG混合液进行液相分离和浓缩，制得浓缩液；对浓缩液进质谱检测，纯度及分子量符合标准后，将浓缩液分装至2ml EP管中，在液氮中过夜保存；
（3）将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末，即可。
步骤（1）中，优选：按摩尔比约为1:3分别称取M205C4和mPEG -SC，定溶于pH7.4的PBS缓冲液中，M205C4的浓度为100 uM；在静音混合器上，4℃反应3h。
上述的明胶酶A抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
有益效果：本发明的明胶酶A抑制性多肽的修饰物的应用，克服M205C4活性肽的稳定性差和体内代谢快的不足，其具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点，并且在胰腺癌动物模型中发挥了良好的抗肿瘤作用，为其在人体的治疗应用提供了重要基础和保证。
附图说明
图1是M205C4和M205C4-PEG的色谱图及质谱图。A、B、C和D图均为色谱图，E图为质谱图。
图2为基质金属蛋白酶II酶活检测实验结果图。P图为修饰后的结果图，Q图为未修饰的结果图。
图3是ICR小鼠的药代动力学检测结果图。I图式修饰后的结果图，II图是未修饰的结果图。
图4是比格犬实验中药物经修饰后提高了药代动力学行为检测结果图。G图式修饰后的结果图，F图是未修饰的结果图。
图5是给药干预45天后测量各组原位肿块（PNAC-1）大小的结果图。
图6是给药干预后部分改善了肿瘤细胞侵袭所致的肝功能异常结果图。H图是天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定结果图，K图是丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定结果图。
图7是两种胰腺癌细胞株原位荷瘤鼠的生存曲线结果图。M图是腺胰癌PANC-1细胞株，N图是腺胰癌CFPAC-1细胞株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
以下实施例所使用的方法和药品具体如下：
M205C4活性肽为在中国专利ZL200610085779.7公开的活性肽，由上海吉尔生化公司合成，mPEG-SC（10KD）购于北京键凯公司。
SDS-PAGE电泳法：将所要检测的样品与4×非还原性上样缓冲液按3:1的体积比混合，室温放置15分钟后进行电泳。胶体共分为3层，上层为浓缩胶（4%），中层为间隔胶（10%），下层为分离胶（16%）。首先采用80V恒压进行电泳，待样品全部进入浓缩胶并压缩成直线后，改用120V恒压继续进行电泳。电泳结束后，将胶体浸入固定液（50%甲醇+10%乙酸）中，室温浸泡30分钟后置于染色液（10%乙酸+0.025%考马斯亮蓝R250）中，室温下染色过夜，将胶体转入脱色液（10%乙酸）中，室温脱色至样品条带清晰为止。 用BIO-RAD 凝胶成像系统Universal Hood Ⅱ对凝胶进行成像。
冻干仪：FreeZone（2.5L），购于LABCONCO公司；
其他没有药品和设备均为市售药品或常用药品和设备。
实施例1
单修饰M205C4-PEG的制备
用分析天平分别精密称取M205C4和mPEG-SC干粉1mg及15mg(摩尔比约为1:3)，定溶于5ml PBS缓冲液(pH7.4)中，M205C4的工作浓度为100 uM，4℃反应3h，整个反应在静音混合器上完成。
制备液相分离和纯化M205C4-PEG：型号：Waters 2545-2767-UV2489；柱子：SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱 (30*150 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-水-三氟乙酸(60:40:0.1)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测器：Waters 2489 （双波长，220nm及330nm）；
将回收的溶液浓缩并分装至2ml EP管中，进行质谱检测后在液氮中过夜保存。
M205C4-PEG冻干粉的制备：将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末。
如图1所示，A图：M205C4标准品直接进样；B图：M205C4和mPEG- SC的反应样品；C图： M205C4和mPEG-SC的反应样品的ELSD检测结果；D图：制备的M205C4-PEG样品直接进样；E图：M205C4-PEG质谱结果，mPEG-SC为分子量9000-11000的长链混合物，由此所得到的修饰后产物的分子量区间为11000-13000，峰值在12000左右。其中1号峰为 M205C4，2号峰为M205C4-PEG，3号峰为PEG。
mPEG-SC的分子量约为9000~11000，制得的修饰产物为M205C4-PEG，是mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，其分子量为11000~13000。M205C4-PEG的结构式为：
结构式中，为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。
实施例2
基质金属蛋白酶II酶活检测实验
试剂盒: MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit (Biomol)
仪器：荧光酶标仪（Molecular Devices公司、Gemini EM）
操作方法参照试剂盒说明，结果如图2所示，为基质金属蛋白酶II酶活检测实验结果图，由此可得，修饰后产物对基质金属蛋白酶II(MMP2)的半数抑制浓度（IC50）为101.4uM，是未修饰多肽的4.1倍，即修饰后产物的生物学活性下降到24.3%。
实施例3
M205C4-PEG在动物中药代动力学行为
一、M205C4-PEG在ICR小鼠中药代动力学行为
（1）血药样品的采集：
ICR小鼠：雌性，6周龄，体重22-24g/只。
分组：共60只，随机分成10组（10个时间点），每组6只。
给药及血样的采集：尾静脉注射给药，20mg/kg/只(M205C4/M205C4-PEG)，眼眦取血，置于肝素钠抗凝的干燥2ml EP管中，3000 r??min-1离心5min，每只小鼠取血清200ul，用600ul乙腈沉淀蛋白，12000r??min-1离心5min，取上清600ul加入300ul超纯水及300ul氯仿，涡旋1min，静止分层后取上层水相200ul浓缩至冻干粉用作含量测定。
采血的时间点：给药前采集空白血样，给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，16h，24h。
（2）血药浓度的测定：
样品处理：将每个样品（冻干粉）1mg溶解于50ul超纯水，12000r??min-1离心5min，去上清30ul进样。
色谱条件：型号：Waters 2690/5；柱子：GL science C18 (4.6*250mm，5um)；流动相：甲醇-水-三氟乙酸(10:90:0.1)；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；检测器: Waters 2998（220nm）。
质谱条件及样品处理
质谱仪型号：Ultraflex II MALDI-TOF/TOF
样品的处理（溶剂法制样）：分别称取1mg M205C4-PEG，4mg冻干粉（血浆），溶于lmL TFA中，振荡溶解，得到淡黄色透明溶液。称取5mg PA6T分别溶于不同的样品溶剂(TFA，THF，FA，ACN，60％ACN／5％TFA)中，振荡至充分溶解，得到白色悬浊液。取2ul样品溶液点于Anchorchip 靶板PAC96上，在空气中自然风干后，再取2ul基质溶液点于风干后的样品上，待溶剂完全挥发后将样品靶送入靶仓。
质谱条件：MALDI-TOF质谱仪的脉冲氮激光(337nm)为离子解吸电离源。采用线性和高分辨率反射分析模型，加速电压为20 kV，平均每次测定样品的激光脉冲次数为120。采用外标法标定多肽质谱峰峰位。
如图3所示，在ICR小鼠实验中药物经修饰后显著性的提高了药代动力学行为，其半衰期是未修饰多肽的40.1倍。
二、M205C4-PEG在比格犬中药代动力学行为
（1）血药样品的采集
比格犬及其分组：6月龄，共10条，雌雄各5只，体重8-10kg/条，购于上海交通大学。
给药及血样的采集：右前肢静脉给药，15mg/kg (M205C4/M205C4-PEG) ，左前肢静脉取血，置于肝素钠抗凝的干燥15ml EP管中，3000 r??min-1离心5min，每只比格犬取血清1ml，用4ml乙腈沉淀蛋白，12000 r??min-1离心5min，取上清4ml分别加入2ml超纯水及氯仿，涡旋1min，静置分层，取上层水相1.6ml浓缩至冻干粉用作含量测定。
（2）血药浓度的测定，方法同“M205C4-PEG在ICR小鼠中药代动力学行为”的方法。
如图4所示，在比格犬实验中药物经修饰后提高了药代动力学行为，其半衰期是未修饰多肽的7.8倍。
实施例4
M205C4-PEG的抗肿瘤作用
一、胰腺癌细胞系原位动物模型建立
细胞系：胰腺癌细胞（PANC-1/CFPAC-1）；
BALB/c裸鼠：雌性，6周龄，约20g/只，购于上海斯莱克公司。
建立皮下移植肿瘤模型：消化对数生长期的细胞，冷PBS洗3次，离心浓缩（900转，5分钟），用无血清无双抗的DMEM培养液重悬成108个/ml的单细胞悬液。将0.1ml悬液接种于裸鼠右腋下。
建立原位移植肿瘤模型：三周左右待皮下瘤块长至1cm大小时，脊椎脱位处死荷瘤鼠，消毒皮肤，剥离肿块，侵入含有青霉素和链霉素的高糖无血清DMEM培养液中，去除死皮及中央坏死组织，选取正常肿瘤组织，剪成约为大小约5mm3肿块供原位移植用。
1%戊巴比妥钠溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮肤，于左上腹直肠旁行1cm的纵行切口，分开胃和脾之间的薄膜，暴露胰腺，剪开胰腺被膜，将5mm3肿块植入胰体尾处，以8-0可吸收线缝合胰腺被膜。将胰腺送回腹腔，6-0可吸收线单层缝合腹壁肌及皮肤。所有操作均在超净台内进行，术者佩戴外科手术放大镜。
二、给药干预后的有益效果
术后十天进行给药干预
分组：以肿瘤生长的均一性为标准，从40只术后荷瘤鼠中，挑选32只，进行随机性分组，每组8只，共4组。
给药方式：腹腔注射，每12小时给药一次；给药剂量(药物均溶于PBS缓冲液)；
治疗组：M205C4-PEG 50mg/kg；对照组1：PEG 45.3 mg/kg；对照组2：PBS0.25ml/只；对照组3: M204C4-PEG 5Omg/kg。M204C4 为体外实验活性较弱的相关肽，在CN1869063A中公开。
M205C4-PEG对裸鼠原位移植的胰腺癌细胞株PANC-1的生长抑制作用：待荷瘤鼠发病自然死亡后，取出腹部肿块。肿瘤的大小=长径×短径2
如图5所示，为试验结果图。图中明显得出，M205C4-PEG可减缓肿瘤的生长，与对照组2比较治疗组的抑瘤率为32.7%(P<0.05)。
M205C4-PEG对胰腺癌细胞株PANC-1荷瘤鼠肝功能的作用：测定荷瘤鼠血浆中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量 。试剂盒购于USCNLIFETM公司。方法参照该试剂盒。如图6所示，为试验结果图。给药干预后可部分逆转癌细胞诱发的肝功能异常。
M205C4-PEG对荷瘤鼠的生存率的影响：：生存率为对照组1和2存活率变为最低时所对应的治疗组的存活率的均值。如图7所示，M205C4-PEG分别显著性的提高了两种胰腺癌细胞株荷瘤鼠40%和30%的生存率，延缓肿瘤的恶性发展。
Claims (1)
1.明胶酶A抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为胰腺癌，所述的明胶酶A抑制性多肽的修饰物为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，结构式为
，分子量为11000~13000；结构式中，
为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100029928A CN102049038B (zh) | 2011-01-07 | 2011-01-07 | 明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100029928A CN102049038B (zh) | 2011-01-07 | 2011-01-07 | 明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102049038A CN102049038A (zh) | 2011-05-11 |
| CN102049038B true CN102049038B (zh) | 2013-06-05 |
Family
ID=43954055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011100029928A Expired - Fee Related CN102049038B (zh) | 2011-01-07 | 2011-01-07 | 明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102049038B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219811C (zh) * | 2003-01-22 | 2005-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂及制法和用途 |
| CN1869063A (zh) * | 2006-06-30 | 2006-11-29 | 南京医科大学 | 一种抑制明胶酶a活性的多肽和制备方法及其应用 |
| CN100383161C (zh) * | 2006-06-30 | 2008-04-23 | 南京医科大学 | 一种抑制明胶酶a活性的多肽和制备方法及其应用 |
| CN101429233A (zh) * | 2008-10-06 | 2009-05-13 | 南开大学 | 聚乙二醇修饰抗菌肽及用途 |
-
2011
- 2011-01-07 CN CN2011100029928A patent/CN102049038B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219811C (zh) * | 2003-01-22 | 2005-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂及制法和用途 |
| CN1869063A (zh) * | 2006-06-30 | 2006-11-29 | 南京医科大学 | 一种抑制明胶酶a活性的多肽和制备方法及其应用 |
| CN100383161C (zh) * | 2006-06-30 | 2008-04-23 | 南京医科大学 | 一种抑制明胶酶a活性的多肽和制备方法及其应用 |
| CN101429233A (zh) * | 2008-10-06 | 2009-05-13 | 南开大学 | 聚乙二醇修饰抗菌肽及用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BerndMeibohm（美）原著.第三篇 机遇和挑战 第11章 生物技术药物化学改造后的特异性药代动力学与药效.《生物技术药物药代动力学与药效动力学 药物开发指导原则与应用实例》.人民军医出版社,2010,197-201. * |
| 郑马庆.MMP-2抑制性结合肽筛选及其模拟化合物体内、外抗肿瘤作用的研究.《中国优秀博士学位论文全文数据库,医药卫生科技辑,南京医科大学博士学位论文》.2008,摘要. * |
| 颜真、张英起主编.第十五章 蛋白质的化学修饰.《蛋白质研究技术》.第四军医大学出版社,2007,194-198. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102049038A (zh) | 2011-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Antitumor activity of sulfated extracellular polysaccharides of Ganoderma lucidum from the submerged fermentation broth | |
| ES2477873T3 (es) | Disolución acuosa de composición farmacéutica de 20(R)-ginsenósido Rg3 y procedimiento de la misma | |
| Qin et al. | Effects of selenizing Codonopsis pilosula polysaccharide on macrophage modulatory activities | |
| Liu et al. | Development of R8 modified epirubicin–dihydroartemisinin liposomes for treatment of non-small-cell lung cancer | |
| Liu et al. | Codonopsis pilosula polysaccharide in synergy with dacarbazine inhibits mouse melanoma by repolarizing M2-like tumor-associated macrophages into M1-like tumor-associated macrophages | |
| Zeng et al. | Oleanolic acid derivative isolated from Gardenia jasminoides var. radicans alleviates LPS-induced acute kidney injury in mice by reducing oxidative stress and inflammatory responses via the TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway | |
| KR20100031759A (ko) | 흑색종의 치료 | |
| CN102294015A (zh) | 一种用于肿瘤靶向治疗的药物组合物及其制备方法 | |
| CN102049038B (zh) | 明胶酶a抑制性多肽的修饰物的应用 | |
| CN108853008A (zh) | 一种可注射天然产物凝胶的制备方法及其应用 | |
| CN102293756A (zh) | 一种尿促性素冻干粉针剂及其制备方法 | |
| CN107970243B (zh) | 一种去甲氯氮平的新用途 | |
| CN103505424B (zh) | 一种注射用硼替佐米的制备方法 | |
| CN107383150B (zh) | 一种具有抗肝损伤活性的化合物及其制备方法和用途 | |
| CN105288583A (zh) | 一种口服胸腺五肽制剂及其制备方法 | |
| Guo et al. | Reactive oxygen species activated by mitochondria-specific camptothecin prodrug for enhanced chemotherapy | |
| Zheng et al. | Hypoxia-activated glutamine antagonist prodrug combined with combretastatin A4 nanoparticles for tumor-selective metabolic blockade | |
| CN104231047B (zh) | 水溶性靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途 | |
| CN101020059A (zh) | 一种含多烯紫杉醇类物质的药物组合物及其制备方法 | |
| CN114042043A (zh) | 一种雷公藤甲素线粒体靶向脂质体及其应用 | |
| CN103130871B (zh) | 内肽酶激活式多柔比星前药的制备方法和应用 | |
| Xu et al. | Radiation responsive PROTAC nanoparticles for tumor-specific proteolysis enhanced radiotherapy | |
| Yan et al. | Inhalable nanoparticles with enhanced cuproptosis and cGAS–STING activation for synergistic lung metastasis immunotherapy | |
| CN106853252B (zh) | 曲贝替定药物组合物及其制备方法 | |
| CN110194788A (zh) | 一种多肽st-17及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Han Xiao Inventor after: Gao Lu Inventor after: Sha Min Inventor after: Wu Yue Inventor after: Sun Yujie Inventor after: Zhu Yunxia Inventor after: Zheng Maqing Inventor before: Han Xiao Inventor before: Gao Lu Inventor before: Sha Min Inventor before: Qiao Nan Inventor before: Sun Yujie Inventor before: Zhu Yunxia Inventor before: Zheng Maqing |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: HAN XIAO GAO LU SHA MIN QIAO NAN SUN YUJIE ZHU YUNXIA ZHENG MAQING TO: HAN XIAO GAO LU SHA MIN WU YUE SUN YUJIE ZHU YUNXIA ZHENG MAQING |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20151022 Address after: Park Road in Jiangning District of Nanjing city and Jiangsu province 211100 No. 18 Patentee after: NANJING SENMU BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 210029 Hanzhoung Road, Jiangsu, China, No. 140, No. Patentee before: Nanjing Medical University |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130605 Termination date: 20190107 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |