CN1219811C

CN1219811C - 带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂及制法和用途

Info

Publication number: CN1219811C
Application number: CN 03100736
Authority: CN
Inventors: 苏志国; 何明磊
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2003-01-22
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2005-09-21
Anticipated expiration: 2023-01-22
Also published as: CN1519266A

Abstract

本发明涉及的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂，其化学通式为：其中，mPEG是单甲氧基聚乙二醇。该修饰剂由单甲氧基聚乙二醇与谷氨酸缩合得到，特别优选的是由重均分子量是750～10,000之间的单甲氧基聚乙二醇制得，还特别优选的是L-谷氨酸。本发明涉及的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂可用于修饰血红蛋白，尤其是用于修饰牛血红蛋白和修饰作为人体使用的人血红蛋白。

Description

带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂及制法和用途

技术领域

本发明涉及一种带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂、制备方法以及其在修饰血红蛋白中的用途。

背景技术

蛋白质是一类重要的生物大分子，它是生命活动的主要承担者。蛋白质的生物活性不仅决定于其特定的化学结构，而且还决定于其特定的空间结构。

蛋白质的化学修饰是指用化学及生物化学的手段来造成蛋白质分子化学结构的改变。蛋白质的化学修饰不仅是研究蛋白质结构与功能关系的一种重要手段，也是定向改造蛋白质性质的一种有力工具。

许多医用蛋白或功能蛋白由于种种原因(异体蛋白，毒性反应，循环半寿期短)不能应用于人体。化学修饰就是解决此类问题的一个良好途径。

血液对于人体的重要性毋庸絮言，血液的最重要的生物学功能是通过血红蛋白实现的。将从血液中获得的血红蛋白用于医疗的想法在100多年前已经存在。首次报告使用未经修饰的血红蛋白作为红细胞替代物是在1898年，Von Stark用未经修饰的血红蛋白治疗一个贫血病人(Red Cell Substitutes：Basic Principals and ClinicalApplication，Johns Hopkins University Press，1992，242p，RM Winslow)。尽管做了许多尝试，结果存在着：(1)血红蛋白很快从肾脏排泄出去，(2)肾毒性，(3)血压升高等现象；经人们研究发现：快速从肾脏排除是由于血红蛋白分子太小，肾毒性是由于血红蛋白进入血液后分解成二聚体。二聚体具有肾毒性；血压升高则是因为“血管活性”效应。血红蛋白由于有上述缺陷，因而不能直接用作血液替代品。一个解决的办法就是对血红蛋白进行化学修饰。这方面的研究在60-70年代作出了几个非常重要的发现：a.通过引入别构调节物(Biochemistry，11，3576-3582，1972，Benesch，R，Benesch，R.E.，Renthal，R.P.and Maeda，N.)来修饰2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG，为方便起见，下文中均简称为2，3-DPG)结合位点，使之具有良好的P₅₀(P₅₀是血液中血红蛋白氧饱和度50％时的氧分压值，为方便起见，下文中均简称为P₅₀)；b.通过交联(cross-linking)使之不解聚(Science，146，524-525，1964，Chang，T.M.S.)；c.通过交联及偶联(conjugated)使分子增大，增加循环半寿期。然而，真正努力开发用于人体的修饰血红蛋白是由于受到公众对于捐献血液中存在的HIV和丙肝及其它病毒的关注在80年代才开始的。与红细胞相比，修饰的血红蛋白有许多不可比拟的优点，使得其作为血液替代物在80-90年代得到了空前的发展。

可以用来修饰血红蛋白的修饰剂包括：

1 戊二醛作为修饰剂

用戊二醛交联的聚合人血红蛋白(PolyHb)需要向2，3-DPG上的凹“袋”中添加磷酸吡哆醛来提高P₅₀。这种血红蛋白具有合适的P₅₀(28-30mmHg)，其血红蛋白浓度为10g/dl和很低的渗透压(20mmHg)，因此可以很高剂量输入人体。临床试验中没有观察到诸如血管收缩之类的不正常现象，目前已经进行第三期临床试验(BioChem.Biophys.Res.Commun.，44，1531-1533，1971，Chang，T.M.S.)。此方法的不足之处是由于戊二醛是小分子，所以造成在修饰中很难控制修饰度和修饰的聚合物产物的分子量分布。用戊二醛交联的聚合牛血红蛋白正在研究中(BloodSubstitutes：Principles，Methods，Products and Clinical Trials，Karger，Basel Swizerland，1998，Vol 2，pp82-98.，Pearce，L.B.And Gawryl，M.S.)。与人的血红蛋白不同，牛血红蛋白的P₅₀受氯化物的控制，因此不需要2，3-DPG。含有不超过5％交联四聚体的PHB已经进行了第二期临床试验。

2 高分子作为修饰剂

血红蛋白还可以与高分子偶联，增大其分子大小。这些高分子诸如右旋糖苷(Proc Natl Acad Sci，U.S.A.，7321-28，1976，Tam，S.C.，et.al.)、聚氧乙烯(Biomater ArtifCells Artif Organs，16，271-280，1988，Iwashita，Y.，et.al.)、单甲氧基聚乙二醇(Artif CellsBlood Substites Immob Biotechnol，24，655-683，1996，Shum，K.L.，et.al.)、白蛋白、羟乙基淀粉、菊糖和长链脂肪酸等。所有这些偶联物都有效地延长了循环半寿期。其中聚氧乙烯偶联物和单甲氧基聚乙二醇偶联物已经进行二期临床试验。Yoji Iwashita报道吡哆醛化的血红蛋白的聚氧乙烯偶联物具有较长的循环半寿期(狗44小时)和较好的P₅₀(20mmHg)，毒性小，无抗原性。但该种物质在制备过程中，P₅₀与循环半寿期形成了一对矛盾，即随着修饰度的增加，半寿期也增加，但P₅₀减小，只是在一个合适的修饰度下才能产生上述的半寿期和P₅₀。因此，控制其修饰度就成为这种产品的关键。

发明内容

本发明的目的在于克服以上两类修饰血红蛋白的聚合物的分子量分布范围不易控制；不易同时产生适宜的P₅₀与循环半寿期的缺陷，从而提供一种带有单甲氧基聚乙二醇长尾的交联蛋白质修饰剂(mPEG-Glu，为方便起见，下文中均简称为mPEG-Glu)，其起交联作用的是mPEG-Glu分子中的谷氨酸部分，mPEG-Glu在对血红蛋白的修饰中可以在增大血红蛋白的分子大小的同时，引入适量的单甲氧基聚乙二醇(mPEG，为方便起见，下文中均简称为mPEG)成分，较好地解决了上述两种修饰剂单独修饰血红蛋白时所产生的问题。

本发明的另一目的在于提供该蛋白质修饰剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供将该该蛋白质修饰剂应用于血红蛋白的化学修饰。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂，其特征在于，该修饰剂为单甲氧基聚乙二醇与谷氨酸化合得到的产物，其通式为：

其中，mPEG是单甲氧基聚乙二醇。

本发明提供的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂在作为血红蛋白修饰剂使用时，尤以所述的谷氨酸以L-谷氨酸为较佳；所述的单甲氧基聚乙二醇为重均分子量是750～10,000之间的聚合物。

本发明提供的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其步骤如下：

1)制备谷氨酸二乙酯盐酸盐：

将谷氨酸用过量的无水乙醇进行酯化，并用氯化氢成盐；

更为优选的是，将谷氨酸与无水乙醇以1∶5～10的摩尔比混配，在搅拌条件下通入氯化氢气体直至饱和，谷氨酸逐渐溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸出过量的乙醇和氯化氢，向残余物中加入无水乙醚，谷氨酸二乙酯盐酸盐结晶、析出，经过滤、洗涤、干燥得到谷氨酸二乙酯盐酸盐白色晶体；

2)制备羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇：

将重均分子量(M.W.)在750～10,000的单甲氧基聚乙二醇溶于干燥过的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰(活化二氧化锰可以直接购得)，混合均匀后，室温下搅拌过夜；过滤除去二氧化锰，减压蒸去溶剂；将残余物溶于过量的过氧化氢的重量浓度为2～3％的过氧化氢水溶液中，充分反应；通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.01～0.02M盐酸洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇；

3)制备带有单甲氧基聚乙二醇长尾的修饰剂(mPEG-Glu)

将步骤1所得的谷氨酸二乙酯盐酸盐和步骤2所得的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以等摩尔比溶于干燥过的二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺和等摩尔比的氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下充分反应；过滤除去生成的二环己基脲，然后加入冷乙醚，滤出沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的产物溶于1M的氢氧化钠溶液，加入氯化钠，充分反应；用盐酸将反应混合液调至pH值为3，然后用氯仿萃取3次，合并有机相，并用无水硫酸镁干燥；减压蒸馏，浓缩反应液，加入冷乙醚，滤出沉淀，得到带有单甲氧基聚乙二醇长尾的修饰剂(mPEG-Glu)。

本发明的优点在于：

1、本发明所述的蛋白质修饰剂的制备方法简单，其基于多肽合成中的接肽原理，只需保护谷氨酸的羧基，不需要活化氨基和羧基；反应在室温进行，不需控制pH值；主要反应在有机相中进行，具有较高产率(85％)；

2、本发明所述的蛋白质修饰剂因为其特殊的结构，在对蛋白质修饰时具有交联和偶联的双重功能；

3、本发明所述的蛋白质修饰剂在对血红蛋白进行修饰时，可很容易地控制修饰产物的分子量分布。

附图说明

图1是羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇的红外光谱图，图中波数为1745.5cm^-1处的吸收峰为羧羰基的特征吸收峰。

图2是带有单甲氧基聚乙二醇长尾的修饰剂(mPEG-Glu)的300M核磁共振氢谱(¹H NMR，CDCl₃)，图中：其化学位移为1.4ppm处的三重峰，对应于mPEG-Glu中谷氨酸的-CH₂-；3.14ppm处的单峰，对应于mPEG-Glu中mPEG末端甲氧基上的3个H；3.61～3.71ppm处对应于mPEG-Glu中mPEG主链的-CH₂CH₂O；7.5ppm处的双峰对应于与羰基相连的谷氨酸α-NH-。

图3是以不同比例的修饰剂修饰了牛血红蛋白后的产物在Superdex 200层析柱上的洗脱图，紫外检测波长是280nm。图中(————)代表天然的牛血红蛋白，(-----)代表牛血红蛋白∶修饰剂为1∶10的修饰了的牛血红蛋白，(…………)代表牛血红蛋白∶修饰剂为1∶13的修饰了的牛血红蛋白，m代表分子量为170kDa的α₂-巨球蛋白的洗脱峰位，n代表分子量为116kDa的β-半乳糖苷酶的洗脱峰位。

图4是修饰了的牛血红蛋白、无基质牛血红蛋白及天然牛血红蛋白的氧平衡曲线图。图中，曲线a代表天然牛血红蛋白，曲线b代表无基质牛血红蛋白，曲线c代表牛血红蛋白∶修饰剂为1∶10的修饰了的牛血红蛋白。

图5是修饰牛血红蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。图中，泳道1是蛋白质标准物，泳道2～4是牛血红蛋白∶修饰剂为1∶5、1∶3和1∶7的修饰了的牛血红蛋白样品，泳道5是天然的牛血红蛋白。

具体实施方式

实施例1：以L-谷氨酸和mPEG₅₀₀₀(M.W.5000)为起始原料制备mPEG₅₀₀₀-Glu，其制备步骤为：

1 制备L-谷氨基酸二乙酯盐酸盐：将L-谷氨酸30g加入无水乙醇中，在搅拌条件下通入氯化氢气体直至饱和，L-谷氨酸逐渐溶解。将此溶液放置过夜，然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢。向残余物中加入无水乙醚，L-谷氨酸二乙酯盐酸盐结晶、析出。经过滤、洗涤、干燥得到L-谷氨酸二乙酯盐酸盐白色晶体。所得产物熔点为107℃，理论值(E.Fischer，Chem.Ber.，39，453，1906)为：107～109℃。

2 将10克mPEG₅₀₀₀溶于干燥过的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰10克，混合均匀后，室温下搅拌过夜。过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂，得到中间氧化产物。将得到的中间氧化产物溶于3％的过氧化氢水溶液中(过氧化氢过量)，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M盐酸洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇。产物的红外分析见图1。

3 mPEG₅₀₀₀-Glu的合成：

将0.47g(2mmol)的L-谷氨酸二乙酯盐酸盐加入到装有25mL二氯甲烷(干燥过)的50mL三角瓶中。然后将4mmol的三乙胺，10g(2mmol)的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇，以及过量的二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺依次加入到溶液中。该反应液在磁力搅拌下室温反应24h。过滤除去反应中生成的二环己基脲。而后缓慢地将溶液倾入强烈搅拌下的150mL冷乙醚中，此时有白色沉淀生成。将此白色沉淀滤出并真空干燥，得白色粉末状物9.5g。将此白色粉末溶于50mL 1mol/LNaOH中，然后加入10gNaCl。此溶液在室温下搅拌反应1小时，用6mol/L盐酸调节至pH值为3。然后用氯仿将溶液萃取三次(3×50mL)，合并有机相，并用硫酸镁干燥。将溶液减压浓缩至50mL，将此浓缩的溶液慢慢倾入强烈搅拌下的300mL冷乙醚中，有白色沉淀析出。将此沉淀滤出并真空干燥得9.0g产物，目标产物的结构可通过1H NMR图谱证实(图2)

实施例2：以L-谷氨酸和mPEG2000(M.W.2000)为起始原料制备mPEG₂₀₀₀-Glu，其制备步骤为：

1 制备L-谷氨基酸二乙酯盐酸盐：同实施例1中步骤1。

2 将8克mPEG₂₀₀₀溶于干燥过的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰10克，混合均匀后，室温下搅拌过夜。过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂，得到中间氧化产物。将得到的中间氧化产物溶于3％的过氧化氢水溶液中(过氧化氢过量)，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M盐酸洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇。

3 mPEG₂₀₀₀-Glu的合成：

将0.47g(2mmol)的L-谷氨酸二乙酯盐酸盐加入到装有25mL二氯甲烷(干燥过)的50mL三角瓶中。然后将4mmol的三乙胺，4g(2mmol)的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇，以及过量的二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺依次加入到溶液中。该反应液在磁力搅拌下室温反应24h。过滤除去反应中生成的二环己基脲。而后缓慢地将溶液倾入强烈搅拌下的150mL冷乙醚中，此时有白色沉淀生成。将此白色沉淀滤出并真空干燥，得白色粉末状物3.5g。将此白色粉末溶于50mL 1mol/L NaOH中，然后加入10g NaCl。此溶液在室温下搅拌反应1小时，用6mol/L盐酸调节至pH值为3。然后用氯仿将溶液萃取三次(3×50mL)，合并有机相，并用硫酸镁干燥。将溶液减压浓缩至50mL，将此浓缩的溶液慢慢倾入强烈搅拌下的300mL冷乙醚中，有白色沉淀析出。将此沉淀滤出并真空干燥得3.2g产物。

实施例3：以L-谷氨酸和mPEG₇₅₀(M.W.750)为起始原料制备mPEG₇₅₀-Glu，其制备步骤为：

1 制备L-谷氨基酸二乙酯盐酸盐：同实施例1中步骤1。

2 将3克mPEG₇₅₀溶于干燥过的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰18克，混合均匀后，室温下搅拌过夜。过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂，得到中间氧化产物。将得到的中间氧化产物溶于3％的过氧化氢水溶液中(过氧化氢过量)，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M盐酸洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇。

3 mPEG₇₅₀-Glu的合成：

将0.94g(4mmol)的L-谷氨酸二乙酯盐酸盐加入到装有25mL二氯甲烷(干燥过)的50mL三角瓶中。然后将8mmol的三乙胺，3g(4mmol)的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇，以及过量的二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺依次加入到溶液中。该反应液在磁力搅拌下室温反应24h。过滤除去反应中生成的二环己基脲。而后缓慢地将溶液倾入强烈搅拌下的150mL冷乙醚中，此时有白色沉淀生成。将此白色沉淀滤出并真空干燥，得白色粉末状物2.8g。将此白色粉末溶于50mL 1mol/L NaOH中，然后加入10g NaCl。此溶液在室温下搅拌反应1小时，用6mol/L盐酸调节至pH值为3。然后用氯仿将溶液萃取三次(3×50mL)，合并有机相，并用硫酸镁干燥。将溶液减压浓缩至50mL，将此浓缩的溶液慢慢倾入强烈搅拌下的300mL冷乙醚中，有白色沉淀析出。将此沉淀滤出并真空干燥得2.5g产物。

实施例4：以L-谷氨酸和mPEG_10,000(M.W.10,000)为起始原料制备mPEG_10,000-Glu，其制备步骤为：

1 制备L-谷氨基酸二乙酯盐酸盐：同实施例1中步骤1。

2 将10克mPEG_10,000溶于干燥过的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰5克，混合均匀后，室温下搅拌过夜。过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂，得到中间氧化产物。将得到的中间氧化产物溶于3％的过氧化氢水溶液中(过氧化氢过量)，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M盐酸洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇。

3 mPEG_10,000-Glu的合成：

将0.24g(1mmol)的L-谷氨酸二乙酯盐酸盐加入到装有25mL二氯甲烷(干燥过)的50mL三角瓶中。然后将2mmol的三乙胺，10g(1mmol)的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇，以及过量的二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺依次加入到溶液中。该反应液在磁力搅拌下室温反应24h。过滤除去反应中生成的二环己基脲。而后缓慢地将溶液倾入强烈搅拌下的150mL冷乙醚中，此时有白色沉淀生成。将此白色沉淀滤出并真空干燥，得白色粉末状物9.5g。将此白色粉末溶于50mL 1mol/L NaOH中，然后加入10g NaCl。此溶液在室温下搅拌反应1小时，用6mol/L盐酸调节至pH值为3。然后用氯仿将溶液萃取三次(3×50mL)，合并有机相，并用硫酸镁干燥。将溶液减压浓缩至50mL，将此浓缩的溶液慢慢倾入强烈搅拌下的300mL冷乙醚中，有白色沉淀析出。将此沉淀滤出并真空干燥得9.0g产物。

实施例5：使用mPEG₅₀₀₀-Glu修饰牛血红蛋白

1 mPEG₅₀₀₀-Glu的活化：将2mmol mPEG₅₀₀₀-Glu与8mmol二环己基碳二亚胺(DCC)、8mmol氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在30ml二氯甲烷中，室温下搅拌反应24h后，过滤除去生成的二环己基脲，然后将溶液倾入剧烈搅拌的210ml冷乙醚中，活化的mPEG₅₀₀₀-Glu沉淀出来，用乙醚淋洗后真空干燥。

2 用活化的mPEG₅₀₀₀-Glu修饰牛血红蛋白：按照牛血红蛋白∶修饰剂摩尔比为1∶10的比例，将100mg无基质牛血红蛋白溶于10ml 0.1M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入77mg活化的修饰剂。反应混合物在室温下搅拌反应4h后，得到了含有活化的mPEG₅₀₀₀-Glu修饰牛血红蛋白A的混合液。

3 对活化的mPEG₅₀₀₀-Glu修饰牛血红蛋白的混合液通过Superdex 200进行凝胶过滤分析其分子量，测定其氧平衡曲线，通过SDS凝胶电泳分析交联情况。采用同样的方法按牛血红蛋白∶修饰剂摩尔比为1∶13、1∶7、1∶5、1∶3的比例，分别将100mg牛血红蛋白用100、54、38、23mg的活化的mPEG₅₀₀₀-Glu修饰牛血红蛋白，相应地得到了修饰了的牛血红蛋白B、修饰了的牛血红蛋白C、修饰了的牛血红蛋白D和修饰了的牛血红蛋白E。通过Superdex 200进行凝胶过滤分析修饰后牛血红蛋白的分子量变化，测定其氧平衡曲线，通过SDS凝胶电泳分析交联情况。

不同比例的修饰剂修饰了牛血红蛋白后的产物在Superdex 200层析柱上的洗脱图结果绘于图3。图中(————)代表天然的牛血红蛋白，(-----)代表修饰了的牛血红蛋白A，(…………)代表修饰了的牛血红蛋白B。由图3可知，修饰了的牛血红蛋白A和B的洗脱溶剂量在分子量为116kDa的β-半乳糖苷酶和170kDa的α₂-巨球蛋白之间，说明修饰了的牛血红蛋白A和B的分子量在116和170kDa之间，比天然的牛血红蛋白分子量(65kDa)明显增加，大约为130kDa，且与二聚的牛血红蛋白的分子量相当。并且，由图3可以看出，修饰了的牛血红蛋白的分子量分布也较窄。

图4是修饰了的牛血红蛋白、无基质牛血红蛋白及天然牛血红蛋白的氧平衡曲线图。图中，曲线a代表天然牛血红蛋白，曲线b代表无机质牛血红蛋白，曲线c代表牛血红蛋白∶修饰剂为1∶10的修饰了的牛血红蛋白。由图4可知，天然血红蛋白、无基质血红蛋白、产物A的P₅₀非常近似，分别为28、21、19(毫米汞柱)。

图5是修饰了的牛血红蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。图中，泳道1是蛋白质标准物，泳道2、3和4是牛血红蛋白∶修饰剂为1∶5、1∶3和1∶7的修饰了的牛血红蛋白D、E和C样品，泳道5是天然的牛血红蛋白。天然牛血红蛋白有四个亚基，其亚基分子量都在16kD左右，在SDS电泳的条件下所有的四个亚基间的结合都被破坏，所以图5中泳道5的天然牛血红蛋白对照样只有16kD一条带。泳道2，3和4在32kD增加了三条带，而亚基间只有共价结合才能在SDS电泳条件下不裂解，说明了在修饰剂与天然血红蛋白之间确实发生了交联反应，形成了共价键。

Claims

1、一种带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂，其特征在于，该修饰剂为单甲氧基聚乙二醇与谷氨酸化合得到的产物，其化学通式为：

其中，mPEG是单甲氧基聚乙二醇；其重均分子量是750～10,000。

2、按权利要求1所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂，其特征在于，所述的谷氨酸为L-谷氨酸。

3、一种权利要求1所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其特征在于，步骤如下：

1)制备谷氨酸的二乙酯盐酸盐：将谷氨酸在氯化氢气体的催化下用过量的无水乙醇进行酯化，形成谷氨酸的二乙酯盐酸盐；

2)制备羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇：将单甲氧基聚乙二醇、活化二氧化锰和二氯甲烷混合均匀后，室温下搅拌过夜；过滤除去二氧化锰，蒸去二氯甲烷；残余物溶于过量的过氧化氢的重量浓度为2～3％的过氧化氢水溶液中，充分反应后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.01～0.02M盐酸洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇；

3)制备带有单甲氧基聚乙二醇长尾的修饰剂：将步骤1)所得的谷氨酸二乙酯盐酸盐和步骤2)所得的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以等摩尔比溶于干燥过的二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺和等摩尔比的氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下充分反应；过滤除去生成的二环己基脲，然后加入冷乙醚，滤出沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的产物溶于1M的氢氧化钠溶液，加入氯化钠，充分反应后用盐酸将反应混合液调至pH值为3，然后用氯仿萃取3次，合并有机相，并用无水硫酸镁干燥；减压蒸馏，浓缩反应液，加入冷乙醚，滤出沉淀，得到带有单甲氧基聚乙二醇长尾的修饰剂。

4、按权利要求3所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其特征在于，所述的谷氨酸包括L-谷氨酸。

5、按权利要求3所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其特征在于，所述的单甲氧基聚乙二醇包括重均分子量为750～10,000之间的聚合物。

6、按权利要求3所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其特征在于：步骤1)中乙醇的摩尔量为谷氨酸的5～10倍。

7、按权利要求3所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其特征在于：步骤2)中的过氧化氢水溶液中过氧化氢的重量浓度为3wt％。

8、按权利要求3所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的制法，其特征在于：步骤2)中的盐酸浓度为0.02M。

9、一种权利要求1所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的用途，其特征在于：用于修饰血红蛋白。

10、按权利要求9所述的所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的用途，其特征在于：用于修饰牛血红蛋白。

11、按权利要求9所述的所述的带单甲氧基聚乙二醇长尾的蛋白质修饰剂的用途，其特征在于：用于修饰作为人体使用的人血红蛋白。