CN1083822A - 与生物分子连接的聚氧化亚甲基-氧化乙烯共聚物 - Google Patents

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Abstract

具有提高了生物活性的生物因子是通过将生物 分子共价地键合到一种或多种合成的聚合物链上而 制备的，其中的合成聚合物是由氧化亚甲基-氧化乙 烯部分结构衍生而来的。

Description

本发明涉及提高活性的生物因子，它包括生物分子共价地键合到一种或多种合成的聚合物上，其中所说的合成聚合物是由氧化亚甲基-氧化乙烯部分结构衍生而来的。
许多为治疗目的而被给药使用的生物学上的分子（生物分子）通过肾小球过滤作用从循环中迅速地清除出去，因而，显示相当短期的药理活性。正是由于这样迅速的清除作用，所以常常需要在较频繁的间隔给予大量的生物分子，以便达到所要求的治疗响应。曾有报导，在许多情况下，该治疗试剂的清除时间可以通过水可溶的聚合物的共价接合而被延长，这类水可溶聚合物的实例有聚乙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮和聚脯氨酸[Abuchowski  and  Daris，Soluble  Polymer-Enzyme  Adducts.In：Enzymes  as  Drugs，Holcenderg  and  Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New  York，NY，1981，pp.367-383;Newmark，et  al.，J.Appl.Biochem.4：185-189（1982）;katre，et  al.，proc.Natl.Acad.sci.USA  84：1487-1491（1987）]。要求与这些聚合物的接合是为了提高更多疏水性药品在水中的溶解性、消除肽和蛋白质的聚集作用并大大地减少它们的免疫性和抗原性，通常可以提高治疗试剂的物理和化学的稳定性。对于蛋白质和肽[Fuertges  and  Abuchowski，J.controlled  release，11：139-148（1990）]、低分子量治疗试剂[Zalli  psky  et  al.，Eur.polym.J.，19：1177-1183（1983）]以及，新近对于脂质体类[Woodle，et  al.，US  patent  5013556，issued  7th  May  1991]的改进性质均已报导过了。
尽管有许多明确的报导，查阅科技文献表明，共价键连接到合成的水可溶聚合物上没有预示可提高生物分子的生物活性。例如，链激酶-血纤维蛋白溶酶配合物和Pluronic F68，即乙二醇和丙二醇的嵌段共聚物的结合破坏这种酶的活性[Newmark，et al.，J.Appl.Biochem.4：185-189，（1982）]。曾报导过几种蛋白质的葡聚糖结合物对兔、羊和豚鼠是强化地致免疫的[Richter et al.，Int.Arch.Allergy，42：885-902（1972）。尿酸酶的葡聚糖连接物对于小鼠的等离子体半衰期依赖于葡聚糖的电荷情况，阳离子型的和中性的葡聚糖加速蛋白质的消除作用，而阴离子型葡聚糖则提高半衰期[Fujita et al.，J.controlled Release，11：149-156（1990）]。曾已发现，聚乙烯基吡咯烷酮连接物是免疫的[Abuchowski and Davis，Soluble polymer-Enzyme Adducts.In：Enzymes as Drugs，Holcenberg and Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，1981，PP.367-383]，并且破坏核糖核酸酶的生物活性（Veronese，et al.J.Bioactive comp.polym.，5：167-178（1990））。相反，核糖核酸酶与聚乙二醇（PEG）连接之后则保持它的活性[Veronese，et al.，Appl.Biochem.Biotech.，11：141-152（1985）]。甚至于取代度和连接键的类型都能够影响生物分子的生物活性。例如，1989年4月10日公开的欧洲申请0335423A2所披露的那样，氰尿酰氯活化的PGE对蛋白质粒性细胞集群激化因子（G-CSF）的渐进连接作用成比例地减少它的体外生物活性。这些例子表明，生物分子与水可溶聚合物的连接作用不可能预示到改进治疗试剂的生物学性质的方法。
聚-1，3-二氧戊环是含有通式-[-O-CH2-O-CH2-CH2-]n-的合成水溶性聚合物。聚-1，3，6-三氧辛环是结构相关具有通式-[-O-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-]n-聚合物。其中，n是重复链节单元数，其理论值可以从10以下到成千上万。这两种聚合物均含有氧化亚甲基-氧化乙烯部分结构。尽管聚合物具有的这种结构是现有技术中已知的[Franta，et al.，Die Makromol.Chem.191：1689-1698（1990）;Velichove，et al.，J.Polymer Science，Part A，28：3145-54（1990）]，但是迄今为止，没有任何人使其与生物分子连接起来以便提高后者的活性。
含有氧化亚甲基-氧化乙烯部分结构的聚合物的简易制法，是使环状单体1，3-二氧戊环或1，3，6-三氧辛环进行开环聚合。在得到的聚合物（聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧辛环）中亚甲基氧对乙烯氧基的比例分别为1∶1和1∶2。由1，3-二氧戊环和1，3，6-三氧辛环互相之间或与其它单体之间的共聚合作用而使该比例可以在非整数值的广泛的范围内变化。例如，具有通式（CH2O）3的1，3，5-三噁烷已经或与1，3-二氧戊环或与1，3，6-三氧辛环进行共聚合来提高聚合物中的亚甲基氧基的含量。另外，与环氧乙烷的共聚合可以提高乙烯氧基的含量。这些氧化亚甲基-氧化乙烯聚合物与生物试剂的结合构成了本发明。
先前介绍的有关制备聚合物-结合加合物的各种方法，没有一种对于如何用主题聚合物改性生物分子以提高其体内生物活性的任何细节加以披露。
本发明公开一类新的具有改进的性质，例如较大的稳定性，较长的体内半衰期、降低的免疫性和抗原性、以及提高了的对哺乳动物的效能的生物试剂的聚合物衍生物。该聚合物是由按有规、无规或嵌段方式排列的氧化亚甲基和氧化乙烯基的链节组成的。氧化乙烯对氧化亚甲基的比例可在很宽的范围变化，并且可以通过选择用于制备该聚合物的单体而被确定，根据聚合引发剂和催化剂而定，可以用未反应的嵌段基团，例如烷基或芳基醚基，在链的末端对该聚合物进行部分地取代或在链的末端不进行取代。该水溶性氧化亚甲基-氧化乙烯共聚物具有至少一个末端反应基与生物分子的功能基因结合，并对所制得的加合物进行纯化，以便生产一种具有延长了循环半衰期的和提高了生物活性的改性的生物分子。
图1、一次皮下注射100μg/kg的rhu  G-CSF（+），100μg/kg的α-乙氧基-聚（1，3-二氧戊环）-ω-琥珀酸酯-rhu  G-CSF，实施例3A，（-◇-），或安慰剂（-○-），之后在仓鼠体内循环的白（血）细胞的含量。
图2、一次皮下注射100μg/kg的rhu  G-CSF（+），100μg/kg的α-乙氧基-聚（1，3-二氧戊环）-ω-碳酸酯-rhu  G-CSF，实施例3B，（-◇-），或安慰剂（-○-），之后在仓鼠体内循环的白（血）细胞的含量。
图3、7天皮下注射1  mg/kg的rr-SCF，1mg/kg的α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3-二氧戊环）-rr-SCF[EPD-rr-SCF（2X），实施例3C;EPD-rr-SCF（10X），实施例3D]，1mg/kg的α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3，6-三氧辛环）-rr-SCF[EPT-rr-SCF（2X），实施例3E;EPT-rr-SCF（10X），实施例3F]或安慰剂（-○-）之后在小鼠体内循环的白（血）细胞的含量。
本发明涉及具有提高了生物活性的生物因子，它包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合上，其中所说的聚合物含有氧化亚甲基-氧化乙烯部分结构。
本发明的生物分子包括那些具有显著生物学活性（最好是体内活性）的任何一种分子，或者是具有显著生物学活性的分子载体。生物活性指的是对于生物系统内发生的任何一种反应的发生、进行速度、效率、和/或抑制的影响的能力，包括生物分子对受体的结合和对受体结合的细胞响应。聚合的结合物可显示出提高生物活性的生物分子和载体可举例说明为，（但是不限于）蛋白质、聚肽、脂质体和低聚糖。其中较重要的蛋白质是（a）粒细胞集群激发因子（G-CSF），干细胞因子（SCF）、促红细胞生成素（EPO）和其它细胞分裂素（cytokines），（b）脑衍生神经营养性因子（BDNF）和其它神经营养性因子，（c）表皮生长因子（EGF），角蛋白（keratinocyte）生长因子（KGF）和其它生长因子，（d）金属蛋白酶抑制剂（MI），同感干扰素和其它在体内可有酶促活性或抑制酶促活性的内生蛋白质。
本发明的聚合物是由氧化亚甲基和氧化乙烯基：
氧化亚甲基-[-O-CH2]-
氧化乙烯基-[O-CH2-CH2]-
的链节构成的。
如上所列，本发明的聚合物可由构成聚合物链的氧化亚甲基和氧化乙烯基的完全无规的链段所组成。该聚合物也可以由氧化亚甲基和氧化乙烯基的有规链段，如其重复基团为-O-CH2-O-CH2-CH2-的有规链段衍生而来，在此情况下氧化亚甲基和氧化乙烯基在整个聚合物链中交替排列着的。另一种方法是，该聚合物可以是含有较长的氧化亚甲基或氧化乙烯基的链段，如[-O-CH2]n-或-[O-CH2-CH2]n-的嵌段共聚物。该聚合物还可以是所有这些分子结构的组合。优选的是，氧化亚甲基的重复基团是以至少10%（按数目计），较优选为至少25%（按数目计），最优选为大约50%的含量存在于该聚合物之中。
含有氧化亚甲基一氧化乙烯部分结构的聚合物的简易制法是环状单体1，3-二氧戊环或1，3，6-三氧辛环的开环聚合法。在所制得的聚合物（聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧辛环）中，亚甲基氧对乙烯基氧的比例分别为1∶1和1∶2。通过1，3-二氧戊环和1，3，6-三氧辛环互相之间或与其它单体之间的共聚合反应，可使该比例在很宽的非整数区域变化。例如具有通式（CH2O）3的1，3，5-三噁烷可以随便与1，3-二氧戊环或1，3，6-三氧辛环进行共聚合，以便增加聚合物中亚甲基氧的含量。另外与环氧乙烷的共聚合可以用来增加乙烯基氧的含量。
具有氧化亚甲基和氧化乙烯基无规排列的优选聚合物可以采用环状单体对的阳离子开环聚合而制备。适于该目的的优选环状单体是1，3-二氧戊环、1，3，6-三氧辛环、环氧乙烷和1，3，5-三噁烷，较优选的是1，3-二氧辛环、1，3，6-三氧辛烷和1，3，5-三噁烷。这些优选的单体可以按各种组合进行共聚以便形成聚合物，其中最好的是构成单体时，例如是环氧乙烷与1，3-二氧戊环、1，3-二氧戊环与1，3，5-三噁烷、1，3-二氧戊环与1，3，6-三氧辛环以及1，3，6-三氧辛环与1，3，5-三噁烷。
最优选的实施方案是聚（1，3-二氧戊环），其中聚合物链中氧化亚甲基为50%（按数目计），并且其规则的重复链段为-（OCH2OCH2CH2）-。按照已知方法1，3-二氧戊环进行阳离子开环聚合可以制得该聚合物[Franta et al.，Die Makromol，Chem.，191：1689-1698（1990）]。第二种最优选的实施方案是聚（1，3，6-三氧辛环），其中氧化亚甲基含量为33%（按数目计），并且其规则重复链段为-（OCH2OCH2CH2OCH2CH2）-。按照已知方法[Velichova，et al.，J.Polymer Science，Part A，28：3145-54（1990）]使1，3，6-三氧辛环进行阳离子聚合可以制得该聚合物。第三种最优选的实施方案是一种具有由1，3-二氧戊环和1，3，5-三噁烷共聚合得到的无规链段的聚合物，该聚合物中氧化亚甲基含量接近于80%（按数目计）。按照实施例1c所述的方法可以获得该聚合物。
在预聚物存在下使一种单体进行引发聚合可以制备嵌段共聚物。例如，众所周知，在市售的羟基封端的聚乙二醇存在下，使1，3-二氧戊环进行阳离子聚合将导致嵌段共聚物的形成[Reibel，et  al.，Makromol.Chem.Macromol.Symp.3：221-230（1986）]。正如聚合物化学家们业已知道的那样，具有不相等反应性的单体的共聚合将不能得到完全无规的单体单元排列，但是可以得到一种含有一个或两个链节单元的长链段的聚合物。
本发明的聚合物的优选尺寸是适于方便的连接到生物分子上并适于改进或提高该生物分子的生物活性。对于本发明聚合物的适宜尺寸优选的是，其数均分子量小于100，000，较优选的是数均分子量在500和50，000之间，最优选的是数均分子量在1，000和10，000之间。
采用本技术领域通常已知的方法使主题聚合物对任何一种生物分子的结合都能够是有效的，例如，该聚合物可以方便地连接到肽或蛋白质中的一个或多个反应性的氨基酸残基（如氨基末端的氨基酸的α-氨基、赖氨酸侧链的ε-氨基）、半胱氨酸侧链的巯基、天冬氨酰和谷氨酰基侧链的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、酪氨酸侧链，或连接到已连接到某些天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基上的糖基链的活化衍生物上。官能团的类似变化也存在于与低分子量药物的结合之中。例如，PEG已被结合到使用羟基、羧基和氨基等官能度的青霉素v、阿司匹灵、苯异丙胺、奎宁和阿托品上[Zalipsky  et  al.，Eur.polym.J.，19：1177-1183（1983）]。
适于直接与蛋白质反应的氧化亚甲基-氧化乙烯聚合物的大多数活化形式都可以被使用。对于与生物分子的氨基基团进行反应的有用的官能团包括：碳酸酯衍生物或羧酸的活化酯类、尤其是，其中离去基团是N-羟基丁二酰亚胺、对一硝基苯酚、或1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸酯。含有马来酰亚氨基或卤代乙酰基的聚合物衍生物对于游离巯基的结合作用是有用的试剂。同样，含有氨基、肼或酰肼基团的试剂，对于与由生物分子的碳水化合物基团的高碘酸氧化作用而产生的醛类进行反应是有用的。
重要的是，应当控制氧化亚甲基-氧化乙烯聚合物上的活化基团数。尤其是，如果生物分子具有一个以上的官能团能够结合时，最好借助于聚合物链的单一末端基进行结合;多官能的聚合物与多官能的生物分子反应时，非常可能产生不可控制的连环作用和交联的产物。具有单一反应基的聚合物的制备方法是通过特殊选择的催化剂和引发剂的聚合条件而实现的。在三氟代甲磺酸催化剂存在下以醇类作为引发剂对1，3-二氧戊环和1，3，6-三氧辛环等单体进行开环聚合;能产生出含有一个羟基末端基和一个烷氧基末端基的聚合物[Franta，et  al.，Die  Makromol.Chem.191：1689-1698（1990）]。用氟代磺酸甲酯或三氟甲磺酸甲酯作为催化剂对1，3-二氧戊环进行聚合制备出的聚合物为α-甲氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环），该聚合物含有一个甲氧基和一个羟基末端基[Yokoyama，et  al.，Polymes  J.，：365-370（1979）]。
正如聚合物科学家们所熟知的那样，由公式Mn＝[ROH]-1可见，产物的分子量将直接地与所用的醇的摩尔数有关。因此，使用多元醇时将使之有可能制备出含有氧化亚甲基和氧化乙烯链的支化聚合物。
在生物分子中反应基团的数目，它们相对于受体连接位的空间分布、以及它们在维持固有结构和生物活性中的重要性方面，各种化合物之间是各不相同的。鉴于这一原因，通常是不可能先验地预示将产生最佳的长期结合又不破坏它的理想的生物活性的改性的程度或聚合物连接位。
改性的生物因子（包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上）可以用于改进或提高生物分子的生物活性。改进生物分子的生物活性将包括提高它的特效活性、提高它的循环半衰期、降低它的清除性、降低它对酶降解的敏感性、提高它的吸收性、提高它的物理的和热的稳定性、减少它的抗原性、或提高它的溶解性。
本发明的改性生物因子的给药包括含有作为活性组分的改性生物因子的药物组合物的合适量的给药。该药物组合物除了活性组分之外，还可以含有适当的缓冲剂，稀释剂和添加剂。给药可以采用包括但不限于静脉内的、皮下的、或肌肉内的任何一种惯用方法进行。
最好，药物制剂是按单位剂量形式。在这样的形式中，制剂再被细分成含有合适量例如为达到要求目的的有效量的活性组分的单位剂量。
使用的实际剂量可以根据患者的需要和处理情况的严重程度加以改变。对于特殊情况的合适剂量的确定是本技术领域熟知的。通常，处理是以小于该化合物的最佳剂量的较小剂量开始的。因此，增加剂量是通过少量增加直到在这些情况下达到最佳效果。给药量和给药频率将根据考虑到如患者的年令、病情和体重以及待处理的疾病的严重程度的照管临床医生的判断进行调节。
实施例
下面提供几个实施例作为本发明的特定实施方案，但是对本发明的范围没有任何限制。
实施例1
聚合物的制备
根据Franta等人所介绍的方法[Die  Makromolek  Chem.191：1689-1698（1990）]分别对1，3-二氧戊环和1，3，6-三氧辛环进行阳离子均聚来制备聚（1，3-二氧戊环）和聚（1，3，6-三氧辛环）。1，3-二氧戊环和1，3，6-三氧辛环彼此之间和与1，3，5-三噁烷之间的共聚物是通过同样的方法，使用合适的单体混合物进行制备的。聚合物的末端基和分子量是通过选择催化剂和引发剂加以控制的。
A、α-乙氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环）
将二氯甲烷（26.9克）和1，3-二氧戊环（32.5克）放在氢化钙上保存过夜进行干燥，然后在氮气下蒸馏到引发剂2-（2-乙氧基乙氧基）乙醇（0.62克）和催化剂三氟甲磺酸（30毫升）的玻璃器皿中。在50℃下进行聚合。5小时以后，加入1毫升氢氧化钾水溶液并对混合物进行振荡，然后注入到冷乙醚中。对沉淀的聚合物进行过滤，并在真空下进行干燥，然后用核磁共振（NMR）和红外光谱（IR）以及凝胶渗透色谱（GPC）进行鉴定。熔点为44℃。特性粘度为[η]＝0.273（CHCl3中测定的）。1H-NMR光谱表明主峰在4.76.（-O-CH2-O-）和3.73PPM（-O-CH2CH2-O-），比例2∶4，由于末端乙氧基引起的子峰在1.21（t，J＝7Hz，-CH3）和3.53（q，J＝7Hz，-OCH2-）.IR（液膜）峰出现在3550CM-1（OH末端基）;GPC（超级聚苯乙烯型交联共聚物，CHCl3，聚乙二醇标准样）Mn＝5400，Mw/Mn＝1.71。
α-甲氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环）的制备是用取代的三氟甲磺酸甲酯代替三氟甲磺酸，并且不用2-（2-乙氧基乙氧基）-乙醇。
B、聚（1，3，6-三氧辛环）
于甲苯中在Amberlite  IR-120（Rohm  and  haas  co.）存在下由甲醛与二乙二醇的反应来制备1，3，6-三氧辛环，这是按照Astle等人介绍的方法进行的[Ind.Eng.Chem.，46（4）：787-91（1954）]。1，3，6-三氧辛环（15.5克）的聚合是在50℃下干燥的硝基甲烷（22.2克）中，使用2-（2-乙氧基乙氧基）乙醇（0.20克，1.48毫摩尔）作为引发剂和三氟甲烷磺酸（100μl，1.13毫摩尔）作为催化剂的条件下进行的。15分钟以后，用叔-丁基胺骤冷该混合物，然后通过用乙醚沉淀来离析该产物。对沉淀的聚合物（13.3克，86%）进行过滤、在真空下干燥，并用NMR和IR光谱以及凝胶渗透色谱（GPC）进行鉴定。特性粘度[η]＝0.31（CHCl3）。1H-NMR光谱展示的主峰在4.74（-O-CH2-O-）和3.69PPM（-O-CH2-CH2-O-），比例2∶8，以及由乙氧末端基引起的子峰在1.21（t，J＝7Hz，-CH3）。IR（液膜）峰出现在3550cm-1（OH末端基）;GPC（超级聚苯乙烯型交联共聚物，CHCl3，聚乙二醇标准样）Mn＝7440，Mw/Mn＝1.15。
C、1，3-二氧戊环和1，3，5-三噁烷的共聚物
将二氯甲烷（28克）和1，3-二氧戊环（37.0克）于氢化钙中保存过夜来进行干燥，然后在氮气下蒸馏到内装1，3，5-三噁烷（45.0克）、引发剂2-（2-乙氧基乙氧基）乙醇（0.62克）和催化剂三氟甲磺酸（30微升）的玻璃器皿中。在50℃下进行聚合。5小时之后，加入1毫升的氢氧化钾水溶液并振荡该混合物，然后注入冷乙醚中。对沉淀的聚合物进行过滤、在真空下干燥和用NMR和IR光谱以及凝胶渗透色谱进行鉴定。特性粘度[η]＝.3（CHCl3）。1H-NMR光谱展示的主峰在4.76（-O-CH2-O-）和3.73PPM（-O-CH2-CH2-O-），比例8∶4，和由乙氧末端基产生的子峰在1.21（t，J＝7Hz，-CH3）和3.53（q，J＝7Hz，-OCH2-）。IR（液膜）3550 cm-1（OH末端基）;GPC（超级聚苯乙烯型交联共聚物，CHCl3，聚乙二醇标准样）Mn＝5000，Mw/Mn＝1.7。
实施例2
活化的聚合物的制备
A、琥珀酰亚胺基α-乙氧基-聚（1，3-二氧戊环）-ω-碳酸酯
将α-乙氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环）（3.5克，0.65毫摩尔）和N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（716毫克，2.80毫摩尔）溶解在无水二甲基甲酰胺（DMF）（20毫升）中，接着将无水DMF（10毫升）中的二甲基氨基吡啶（512mg，4.19毫摩尔）滴加进去。在室温下将该反应混合物搅拌一小时，然后缓慢地加到4℃的无水乙醚（300毫升）中。过滤收集沉淀物，然后沉淀物再溶于无水DMF中并用无水乙醚使其沉淀再进行回收，得到3克产物。
对该产物和其它琥珀酰亚胺基酯类的琥珀酰亚胺基含量进行光谱测定，精确称取大约2-3毫克的产物，并用100mM N-二（羟乙基）甘氨酸缓冲剂进行稀释，PH为8.0，以便得到浓度为1毫克/毫升。在一个1cm的小透明池中监测260mm处的紫外线吸量作为时间的函数，一直监测利获得恒定的吸收为止。从起始的吸收（Ao）和最后的吸收（A∞）之差以及已知的N-羟基琥珀酰亚胺的消光系数8760M-1cm-1。
B、琥珀酰亚胺基α-乙氧基-聚（1，3-二氧戊环）-ω-戊二酸酯
将α-乙氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环）（2.7克，0.50毫摩尔）、戊二酸酐（285毫克，2.50毫摩尔）、二甲基氨基吡啶（244毫克，2.01毫摩尔）和三乙基胺（0.28毫升，2.01毫摩尔）溶于无水二噁烷（25毫升）中。在室温下放置过夜之后，通过将反应混合物滴入冷乙醚和环己烷（2∶1，300毫升）中而对产物进行回收。对沉淀物进行过滤和真空干燥，生产出2.5克产物。将该中间产物戊二酸半酯（2.5克，0.45毫摩尔）溶于无水二氯甲烷（20毫升）中，然后加入二环己基羰基二酰亚胺（0.207毫克，1.00毫摩尔）。和N-羟基琥珀酰亚胺（0.12克，1.0毫摩尔）。将该溶液在室温下放置过夜，然后通过过滤除去沉淀的二环已基脲并用二氯甲烷洗涤。经蒸发浓缩过的滤液被加入到冷的无水乙醚/环己烷（2∶1，300毫升）中。沉淀的产物通过用乙醚/环己烷从无水DMF中再沉淀而被提纯，得到2.2克产物。
C、琥珀酰亚胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3-二氧戊环）
将α-乙氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环）（5克，0.09毫摩尔）溶于无水甲苯（20毫升）中，并加入叔-丁醇钾（potassium  t-butanoate）（1.6克，14毫摩尔）。使该溶液进行回流，然后在50℃下保持5小时。缓慢地加入溴乙酸乙酯并在同样的温度下对该溶液搅拌过夜。通过过滤除去沉淀出来的盐并用二氯甲烷（20毫升）进行洗涤。通过部分地浓缩该滤液并缓慢地注入到乙醚/环已烷（1∶1，200毫升）中来回收该聚合物。真空下干燥的该聚合物再被溶于1N的NaOH（20毫升）中然后加NaCl（4克）。1小时之后，用2N的HCl酸化该溶液使其PH＝3.0，然后用二氯甲烷（3X50毫升）进行萃取。混合的有机相被干燥（MgSO4），浓缩到30毫升，然后注入到冷的乙醚/环己烷（3∶1，300毫升）中。通过过滤收集沉淀物并于真空下进行干燥。
将得到的α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3-二氧戊环）（5克，0.09毫摩尔）溶于无水二氯甲烷（20毫升）中，并加入N-羟基琥珀酰亚胺（0.23克，2.0毫摩尔）和二环己基羰基二酰亚胺（0.413克，2.00毫摩尔）。该溶液于室温下放置过夜，之后通过过滤除去沉淀出来的环己基脲并用二氯甲烷洗涤。该溶液被浓缩并加入到冷的无水乙醚/环己烷（1∶1，300毫升）。通过用乙醚/环己烷从无水DMF的溶液中沉淀的办法提纯该产物，得到4.8克产物。
D、琥珀酰亚胺基α-乙氧基-聚（1，3-二氧戊环）-ω-琥珀酸酯
将α-乙氧基-ω-羟基-聚（1，3-二氧戊环）（5.4克，0.09毫摩尔）、琥珀酸酐（125毫克，1.25毫摩尔）、二甲基氨基吡啶（122毫克，1.00毫摩尔）和三乙基胺（0.14毫升，1.00毫摩尔）溶于无水二噁烷（30毫升）中并在室温下放置过夜。蒸发除去溶剂，取出残渣放入四氯化碳（15毫升）中，在冷乙醚（300）中过滤和沉淀。该沉淀物被过滤并在真空下被干燥。得到5.14克产物。将N-羟基琥珀酰亚胺（126毫克，1.09毫摩尔）加到于无水DMF（25毫升）中的该中间体（5克）中，接着再加入溶解在无水DMF（1毫升）中的二环己基羰基二酰亚胺（227毫克，1.10毫摩尔）。该混合物在室温下放置过夜，并进行过滤和通过在冷的无水乙醚（250毫升）中沉淀的办法回收聚合物。在无水DMF中溶解和在乙醚中沉淀的操作过程重复两次，得到4克产物。
E、琥珀酰亚胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3，6-三氧辛环）
将α-乙氧基-ω-羟基-聚（1，3，6-三氧辛环）（7.5克，1.0毫摩尔）溶于50℃下的无水叔-丁醇（50毫升）中，再加入叔-丁醇钾（1.6克，14毫摩尔）。该溶液于50℃下搅拌8小时。缓慢地加入溴乙酸乙酯（1.6毫升，14毫摩尔）并将该溶液于同样温度下搅拌过夜，通过过滤除去沉淀出来的盐并用二氯甲烷（20毫升）洗涤。通过部分地浓缩该滤液并缓慢地注入到乙醚（300毫升）中的办法回收该聚合物。所沉淀出来的聚合物在真空下被干燥，然后溶于1N的NaOH（30毫升）中再加入NaCl（6克）。4小时以后，用2N的HCl酸化该溶液使其PH＝3.0，然后用二氯甲烷（3×50毫升）进行萃取。混合的有机相被干燥（MgSO4），浓缩到25毫升，然后注入到冷的乙醚（300毫升）中。通过过滤收集沉淀物然后于真空下进行干燥。
将得到的羧甲基衍生物（5.9克）溶于无水二氯甲烷（20毫升）中，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺（0.18克，1.6毫摩尔）和二环己基羰基二酰亚胺（0.33毫克，1.6毫摩尔）。该溶液于室温下放置过夜，此后通过过滤除去沉淀出来的环己基脲并用二氯甲烷洗涤。该溶液被浓缩并加到冷的无水乙醚（300毫升）中。通过重沉淀对该产物进行提纯，得到4.9克产物。
实施例3
聚合物与蛋白质的结合
A、聚（1，3-二氧戊环）与G-CSF的结合
将按实施例2D所述方法制备的琥珀酰亚胺基α-乙氧基-聚（1，3-二氧戊环）-ω-琥珀酸酯（500毫克，80.6微摩尔，Mn＝6，700）加到3.0毫升含有30.3毫克（1.61微摩尔）在0.10M硼酸钠中（PH＝9.0）的重组体的人的粒细胞集群激发因子（rhuG-CSF）的溶液中。该溶液在室温下被搅拌30分钟，然后用27毫升0.10M的柠檬酸钠稀释，使其PH＝3.25，再将其浓缩（Amicon Centriprep 10离心超滤机）至最终体积接近于2毫升。该浓缩的粗制反应混合物被送入凝胶过滤柱（pharmacia Superdex prep 200，1.6×60cm）然后再用0.10M的柠檬酸钠，在PH＝3.25，和在0.25毫升/分钟的流速下进行洗脱。连续地监测柱中的蛋白质流出物（在280nm处的UV吸收），收集各级份（1.0毫升）。各级份号为18-57，含有改性蛋白质的绝大部分的这些级份，通过对于注射水逆向（WFI）的超滤作用（Amicon Ym10渗透膜）而被沉积，被渗析，用HCl滴定到PH＝3.25，然后通过超滤将其浓缩到最终的蛋白质浓度为1.2毫克/毫升（是使用对于1.0毫克/毫升的溶液而言A280＝0.86的rhuG-CSF值由A280计算的）。
在类似凝胶过滤色谱条件下，未改性的rhuG-CSF洗脱的各级份编号为77-84。
B、聚（1，3-二氧戊环）与G-CSF的结合
将按实施例2A所述方法制备的琥珀酰亚胺基α-乙氧基聚（1，3-二氧戊环）-ω-碳酸酯（437毫克，65.2微摩尔 Mn＝6700）加入到1.23毫升含有24.5毫克（1.30微摩尔）于0.10M硼酸钠中的rhuG-CSF的溶液（（PH＝9.0）中。该溶液于室温下搅拌2小时，然后用11毫升0.10M的柠檬酸钠，PH＝3.25，和49毫升的注射水（WFI）进行稀释。将该稀释的粗制反应混合物送入阳离子交换柱（Pharmacia Sepharose，1.5×2.3cm）中，该柱子已预先用20mM柠檬酸钠预-平衡过了，PH＝3.25。一旦全部反应混合物被吸收，则用8毫升20mM柠檬酸钠洗涤，PH＝3.25，以便洗脱各种反应付产物、N-羟基琥珀酰亚胺和α-乙氧基聚（1，3-二氧戊环）-ω-碳酸酯。然后用24毫升20mM柠檬酸钠，PH＝3.25，IMNaCl洗脱吸收的蛋白质，采用逆向WFI的超滤作用（Amicon Ym10渗透膜）进行渗析，用HCl滴定到PH＝3.25，再用超滤浓缩到最终的蛋白质浓度为1.1毫克/毫升（是从使用对于1.0毫克/毫升溶液而言A280＝0.86的rhuG-CSF值的A280计算的）。采用在TosoHaas TSK G3000SWXL和TSK G4000SWXL串连柱子每个是0.78×30cm;5μ上的筛析HPLC分析反应产物，用0.1M磷酸钠，PH＝6.9，流速为1毫升/分，进行洗脱，再用紫外线（280nm）和折射率测定仪连续地监测流出物。最终产物没有未结合的聚-1，3-二氧戊环和未改性的rhuG-CSF。
C、聚（1，3-二氧戊环）与干细胞因子的结合
将按实施例2C所述方法制备的琥珀酰亚胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3-二氧戊环）4.2毫克（0.793微摩尔），加到于0.725毫升的0.1M N-（二羟基）甘氨酸缓冲液（PH＝8.0，室温下）中的7.25毫克（0.396微摩尔）的重组大鼠干细胞因子（rr-SCF）中。1小时之后，反应混合物用2.9毫升的WFI进行稀释，用1.0N的HCl滴定到PH＝4.0，并通过0.20μ醋酸纤维素过滤器（Nalgene no.156-4020）进行过滤。滤液以4.0毫升/分的速度被送入6.0×1.6cm的Toypearl SP550C（TOSO-Haas）柱子中，该柱子已预先用20mM的醋酸钠进行了平衡（在室温下PH＝4.0）。在试样载荷期间按2.5毫克为一级份来收集从柱子中流出的流出物（编号为1-2），并连续地监测该流出物的紫外线吸收（A280）。然后柱子顺序地用24.0毫升的平衡缓冲剂以4.0毫升/分的速度洗涤（级份编号为3-12），再用48毫升的20mM醋酸钠、0.3M的NaCl，PH＝4.0，以4.0毫升的速度进行洗涤（级份编号为13-31），最后用24.0毫升的20mM醋酸钠，1.0M的NaCl，PH＝4.0，以8.0毫升/分的速度进行洗涤（级份编号为32-41）。混合含有聚合物-rr-SCF结合物的各级份（编号为16-23），通过同10mM醋酸钠，140mM的NaCl（PH＝50）逆向的超滤（Amicon YM-10渗透膜）来进行渗析，再通过超滤（0.45μ醋酸纤维素膜;Costar no.8302）进行灭菌，得到4.0毫克（按体积计为6.13毫升）的最终产物。
D、聚（1，3-二氧戊环）与SCF的结合
将按实施例2C所述方法制备的琥珀酰亚胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3-二氧戊环）19.4毫克（3.66微摩尔），加到在0.67毫升0.1M的n-（二羟基）甘氨酸缓冲剂（PH＝8.0，室温下）中的6.70毫克（0.366微摩尔）的rr-SCF中。1小时之后，反应混合物用2.68毫升的WFI稀释，用1.0N的HCl滴定到PH＝4.0，通过0.20μ的醋酸纤维素过滤器（Nalgene no.156-4020）进行过滤，然后以4.0毫升/分的速度送入6.0x1.6cm的Toyopearl SP550C（TOSO-Haas）柱子中，该柱子已预先用20mM的醋酸钠平衡过了（室温下PH＝4.0）。在试样载荷过程中以2.5毫升为一级来收集柱中流出物（编号为1-2），并连续地监测流出物的紫外线吸收（A280）。然后按下列顺序洗涤该柱子：用24.0毫升的平衡缓冲剂以4.0毫升/分的速度洗（级份编号为3-12）、用48.0毫升20mM的醋酸钠、0.3M的NaCl（PH＝4.0）以4.0毫升/分的速度洗（级份编号为13-31），最后用24.0毫升的20mm醋酸钠、1.0m的NaCl（PH＝4.0）以8.0毫升/的速度洗（级份编号为32-41）。混合含有聚合物-rr-SCF结合物的各级份，通过同10mM醋酸钠，140mM的NaCl（PH＝5.0）逆向的超滤（Amicon YM-10渗透膜）来进行渗析，再通过超滤（0.45μ醋酸纤维素膜;Costar no.8302）进行灭菌，得到3.26毫克（按体积计为6.94毫升）的最终产物。
E、聚（1，3，6-三氧辛环）与SCF的结合
将按实施例2E制备的琥珀酰亚胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3，6-三氧辛环）（4.6毫克，0.794微摩尔）加到7.26毫克（0.397微摩尔）的rr-SCF中[rr-SCF是在0.726毫升的0.1M  N-（二羟基）甘氨酸缓冲剂（室温下  PH＝8.0）中的]。1小时之后反应混合物用2.90毫升的WFI稀释，用1.0N的HCl滴定至PH＝4.0，再经过一个0.20μ的醋酸纤维素过滤器（Nalgene no.156-4020）进行过滤，以4.0毫升/分的速度将该滤液送至一个6.0×1.6cm的Toyopearl SP550C（TOSO-Haas）柱子中，该柱子已预先用20mM的醋酸钠（室温下PH＝4.0）平衡过了。在试样载荷过程中以2.5毫升为一个级份收集柱子的流出物（编号为1-2），并连续地监测流出物的紫外线吸收（A280）。然后按下列顺序依次对柱子进行洗涤：用24.0毫升的平衡缓冲剂以4.0毫升/分的速度洗（级份编号为3-12），用48.0毫升的20mM醋酸钠、0.3M的NaCl（PH＝4.0）以4.0毫升/分的速度洗涤（级份编号为13-31），最后用24.0毫升的20mM醋酸钠、1.0m的NaCl（PH＝4.0）以8.0毫升/分的速度洗（级份编号为32-41）。混合含有聚合物-rr-SCF结合物的各级份（16-26），通过同10mM醋酸钠，140mM的NaCl（PH＝5.0）逆向的超滤（Amicon YM-10渗透膜）来进行渗析，再通过超滤（0.45μ醋酸纤维素膜;costar no.8302）进行灭菌，得到3.47毫克（按体积计为7.15毫升）的最终产物。
F、聚（1，3，6-三氧辛环）与SCF的结合
将按照实施例2E所述方法制备的琥珀酰亚胺基α-乙氧基-ω-羧甲基-聚（1，3，6-三氧辛环）（24.3毫克，4.19微摩尔）加到在0.767毫升的0.1M  N-（二羟基）甘氨酸缓冲剂（室温下PH＝8.0）中的7.67毫克（0.419微摩尔）的rr-SCF中。1小时之后反应混合物用3.07毫升的WFI稀释，用1.0N的HCl滴定至PH＝4.0，再经过一个0.20μ醋酸纤维素过滤器（Nalgene  no.156-4020）进行过滤。以4.0毫升/分的速度将该滤液送至6.0×1.6cm的Toyopearl SP550C（TOSO-Haas）柱子中，该柱子已预先用20mM的醋酸钠（室温下PH＝4.0）平衡过了。在试样载荷过程中以2.5毫升为一个级份收集柱子的流出物（编号为1-2），并连续地监测流出物的紫外线吸收（A280）。然后按下列顺序依次对柱子进行洗涤：用24.0毫升的平衡缓冲剂以4.0毫升/分的速度洗（级份编号为3-12），用48.0毫升的20mM醋酸钠、0.3M的NaCl以（PH＝4.0）4.0毫升/分的速度洗（级份编号为13-31），最后用24毫升的20mM醋酸钠、1.0m的NaCl（PH＝4.0）以8.0毫升/分的速度洗（级份编号为32-41）。混合含有聚合物-rr-SCF结合物的各级份（15-19），通过同10mM醋酸钠，140mM的NaCl（PH＝5.0）逆向的超滤（Amicon YM-10渗透膜）进行渗析，再通过超滤（0.45μ醋酸纤维素膜;costar no.8302）进行灭菌，得到5.85毫克（按体积计为7.62毫升）的最终产物。
实施例4
通过结合作用提高生物活性
A、ω-乙氧基聚（1，3-二氧戊环）与G-SCF结合物的在活体内活性
以在活体内仓鼠粒细胞生成活体检定来对实施例3A和3B中所述的聚（1，3-二氧戊环-rhuG-CSF连接物与未改性的rhuG-CSF进行比较。每个实验试料，聚（1，3-二氧戊环）-rhuG-CSF结合物、未改性的rhuG-CSF或安慰剂按每一次剂量为100微克蛋白质/kg体重的剂量是通过皮下注射给35只Golden  Syrian雄仓鼠（90-110克）。在剂量给药后0.5、1、1.5、2、4、7和10天的间距上通过心脏穿刺从每一处理组的5只动物采取末梢血样，并测量总的白（血）细胞（WBC）数目。在用聚（1，3-二氧戊环）-rhuG-CSF结合物处理的动物体内WBC的含量在剂量给药后两天的保持在提高的水平上，而在用来改性的rhuG-CSF处理的动物体内在相同时间里WBC的含量已经恢复到原来的水平了（图1和2）。
B、ω-乙氧基聚（1，3，6-三氧辛环）和ω-乙氧基聚-（1，3-二氧戊环）与SCF结合物的生物活性
分别将实施例3C-3D和3E-3F所述所述方法制备的重组大鼠SCF的聚（1，3-二氧戊环）和聚（1，3，6-三氧辛环）结合物每天投药给雌性Swiss  ICR  outbred小鼠（Charles  River  Breeding  Laboratories  CD-1;22-24克），并以1.0毫克/kg的剂量连续七天。每个处理组由5只动物组成。剂量给药溶液通过用10mM醋酸钠、0.14M的NaCl、0.5毫克/毫升小鼠血清清蛋白（PH＝5.0）稀释聚合物一蛋白质结合物的办法进行制备，并以0.2毫升的体积量通过皮下注射给药。在实验研究的第8天时，通过用无菌解剖刀切割侧尾脉的办法从每只小鼠采取血样，然后用一次性的吸管收集0.02毫升等分试样的血。该血样立刻用抗凝血剂溶液进行稀释并用8-参数自动血液分析仪（Model  HC-820;Danam  Electronics，Dallas，TX）进行计数。在与用来改性的rr-SCF处理的小鼠进行比较可见白血细胞量在用聚合物-rr-SCF结合物处理的小鼠体内明显提高，（见图3）。

Claims (21)

1、一种提高了生物活性的生物因子，它包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上，其中所说的聚合物链是由氧化亚甲基和氧化乙烯基结合组成的。
2、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有10%-90%的氧化亚甲基（按数目计）。
3、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有50%的氧化亚甲基（按数目计）。
4、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有大约33%的氧化亚甲基（按数目计）。
5、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有-O-CH2-O-CH2CH2-重复基团。
6、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有-O-CH2-OCH2-CH2-O-CH2CH2-重复基团。
7、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有氧化亚甲基和氧化乙烯基的无规链段。
8、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有氧化亚甲基和氧化乙烯基的嵌段链段。
9、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物含有嵌段链段和无规链段。
10、按照权利要求1的提高了生物活性的生物因子，其中所说的生物分子选自蛋白质、聚肽、碳水化合物、酶、金属蛋白质、和脂质体。
11、按照权利要求1的生物因子，其中所说的生物分子是蛋白质。
12、按照权利要求11的生物因子，其中所说的蛋白质是促血红细胞生长因子。
13、按照权利要求12的生物因子，其中所说的促血红细胞生长因子选自EGF、EPO、GM-CSF、G-CSF、PDGF、MI、同感干扰素、SCF。
14、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物是由两种或多种共单体：1，3-二氧戊环、1，3，6-三氧辛环、环氧乙烷、和1，3，5-三噁烷衍生来的。
15、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物的数均分子量为500-100，000。
16、按照权利要求15的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中所说的聚合物的数均分子量为1，000-10，000。
17、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助同所说聚合物的碳酸衍生物或羧酸的活性酯的反应而将所说的聚合物连接到生物分子上。
18、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助同该聚合物的N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、或1-羟基-2-硝基-苯-4-磺酸酯的反应而将所说聚合物连接到生物分上。
19、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助生物分子的一个或多个游离的巯基与该聚合物的马来酰亚氨基或卤代乙酰基衍生物的反应使所说聚合物连接到生物分子上。
20、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助与生物分子的氨基、羧基、巯基、或羟基的反应使所说聚合物连接到生物分子上。
21、按照权利要求1的包括生物分子共价地键合到一种或多种聚合物链上而提高了生物活性的生物因子，其中是借助该聚合物的氨基、肼基或酰肼基衍生物与该生物分子的碳水化合物部分的氧化作用产生的一个或多个醛基的反应使所说的聚合物连接到生物分子上。
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