PL200586B1 - Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów - Google Patents

Abstract

1. Polipeptyd zawieraj acy: (a) mutant interferonu-beta-1a (IFN- ß) wybrany z grupy sk ladaj acej si e z mutantów IFN- ß o se- kwencji aminokwasowej przedstawionej w Tabeli 1 jako A1, B1, C1, CD1 i CD2 i (b) domen e zawiasow a, domeny CH2 i CH3 immunoglobuliny. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-la, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów.

Stosowanie polipeptydów i białek do układowego leczenia pewnych chorób jest obecnie powszechnie akceptowane w praktyce medycznej. Rola, jaką te substancje odgrywają w leczeniu, jest tak ważna, że wiele badań jest skierowanych na syntezę ich w dużej ilości przez zastosowanie technologii rekombinowania DNA. Wiele z tych polipeptydów to endogenne cząsteczki o dużym potencjale i specyficzności działania biologicznego.

Głównym czynnikiem limitującym przydatność tych białkowych substancji do ich stosowania jest to, że przy podawaniu pozajelitowym są one w krótkim czasie eliminowane z organizmu. Następuje to na skutek metabolizowania przez proteazy albo usuwania przy zastosowaniu normalnych dróg eliminacji białka, takich jak filtracja w nerkach. Problemy związane z tymi drogami podawania białek są dobrze znane w przemyśle farmaceutycznym i dla ich rozwiązania stosuje się różne strategie.

Rodzinę peptydów, której dotyczy wiele prac klinicznych i wysiłków w celu ulepszenia sposobów podawania i bioasymilacji, stanowią interferony. Interferony zbadano w rozmaitych klinicznych stanach chorobowych. Zastosowanie ludzkiego interferonu beta, jednego z przedstawicieli tej rodziny, jest najbardziej zaawansowane w leczeniu stwardnienia rozsianego. Dwie postaci zrekombinowanego interferonu beta uzyskały ostatnio licencję w Europie i USA na leczenie tej choroby. Jedną z tych postaci jest interferon beta-1a (sprzedawany pod zastrzeżonym znakiem towarowym AVONEX®, mfg. Biogen, Inc., Cambridge, MA) i dalej określany wymiennie jako „interferon-beta-1a” lub „IFN-beta-1a” lub „IFN-e-1a” lub „interferon-e-1a”. Inną postacią jest inter1^(^i^c^mt^^tt^--b (sprzedawany pod zastrzeżonym znakiem towarowym BETASERON®, Berlex, Richmond CA) i dalej określany jako „interferon-beta-1b”. Interferon beta-1a jest wytwarzany w komórkach ssaków przy zastosowaniu naturalnej ludzkiej sekwencji genowej i jest glikozylowany, podczas gdy interferon beta-1 b jest wytwarzany w bakterii E. coli przy zastosowaniu zmodyfikowanej ludzkiej sekwencji genowej, i zawiera dokonane na drodze inżynierii genetycznej podstawienie cysteiny seryną w pozycji aminokwasowej 17 i jest nieglikozylowany.

Uprzednio, bezpośrednio porównaliśmy względną siłę działania in vitro interferonu-beta-1a i interferonu-beta-1b w testach funkcjonalnych i wykazaliśmy, że specyficzna aktywność interferonu-beta-1a jest około dziesięciokrotnie większa niż specyficzna aktywność interferonu-beta-1b (Runkel i wsp., 1998, Pharm. Res. 15:641-649). Na podstawie badań zaprojektowanych w celu zidentyfikowania podstawy strukturalnej tych różnic w aktywności, zidentyfikowaliśmy glikozylację jako jedyną ze znanych różnic strukturalnych między tymi produktami, która wpływa na aktywność specyficzną. Wpływ węglowodanu manifestował się w dużej mierze jego stabilizującą rolą na strukturę. Działanie stabilizujące węglowodanu było widoczne w doświadczeniach z denaturacją termiczną i w analizie SEC. Brak glikozylacji korelował również ze wzrostem agregacji i zwiększeniem wrażliwości na denaturację cieplną. Usunięcie enzymatyczne węglowodanu z interferonu-beta-1a przy użyciu PNGazy F powodowało intensywną precypitację deglikozylowanego produktu.

Badania te wskazują, że pomimo konserwowania sekwencji pomiędzy interferonem-beta-1a i interferonem-beta-1b, mają one odmienne właściwości biochemiczne, a zatem większość z tego, co wiadomo o interferonie-beta-1b nie może być stosowane do interferonu-beta-1a i odwrotnie.

Badaliśmy zalety glikozylowanego interferonu beta w stosunku do postaci nieglikozylowanych. W szczególności opracowano kompozycję interferonu-beta-1a o zwiększonej aktywności w stosunku do interferonu-beta-1b, który ma również zasadniczo korzystne właściwości w postaci fuzji białkowych bez widocznej utraty aktywności w porównaniu z postaciami interferonu-beta-1a, które nie są fuzjami białkowymi. A zatem, jeżeli przeprowadza się modyfikacje w taki sposób, że produkty (fuzje białkowe z interferonem-beta-1a) zachowują wszystkie albo większość aktywności biologicznych, można uzyskać następujący efekt: zmianę farmakokinetyki i farmakodynamiki prowadzącą do zwiększonego okresu półtrwania i zmiany w dystrybucji tkankowej (np. zdolność do pozostawania w układzie naczyniowym przez dłuższy czas). Taka kompozycja stanowi zasadniczy postęp w dziedzinie farmacji i medycyny i będzie mogła wnieść znaczący wkład do postępowania w przypadku różnych chorób, gdzie ma zastosowanie interferon, takich jak stwardnienie rozsiane, zwłóknienie i inne choroby zapalne albo autoimmunologiczne, nowotwory, zapalenie wątroby i inne choroby wirusowe oraz choroby charakteryzujące się tworzeniem de novo naczyń krwionośnych. W szczególności zdolność do pozostawania

PL 200 586 B1 przez dłuższy czas w układzie naczyniowym umożliwia zastosowanie interferonu-beta-la do hamowania rozwoju naczyń krwionośnych i potencjalnie do przekraczania bariery krew-mózg.

Polipeptyd według wynalazku zawiera:

(a) mutant interferonu-beta--a (IFN-β) wybrany z grupy składającej się z mutantów IFN-β o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Tabeli 1 jako A1, B1, C1, CD1 i CD2 i (b) domenę zawiasową, domeny CH2 i CHS immunoglobuliny.

Korzystnie immunoglobuliną jest ludzka immunoglobulina. Korzystniej immunoglobuliną jest IgG, a najkorzystniej IgG1. Gdy immunoglobuliną jest IgG1 polipeptyd według wynalazku korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 10 lub na Figurze 11.

Korzystnie polipeptyd ma glikozylowany aminokwas w sekwencji aminokwasowej.

Korzystnie mutant interferonu beta-1a (IFN-β) ma derywatyzowany aminokwas w sekwencji aminokwasowej.

Korzystniej mutant interferonu beta-1a (IFN-β) jest derywatyzowany glikolem polialkilenowym, a bardziej korzystnie glikol polialkilenowy jest związany z N-końcem sekwencji aminokwasowej.

Część peptydu pochodząca od immunoglobuliny może pochodzić od immunoglobuliny z klasy wybranej spośród IgM, IgG, IgD, IgA i IgE. Jeżeli klasą tą jest IgG, wówczas jest ona wybrana jako jedna z IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Część stała ludzkiej IgM i IgE zawiera 4 regiony stałe (CH1, (region zawiasowy), CH2, CH3 i CH4, podczas gdy części stałe ludzkich IgG, IgA i IgD zawierają 3 regiony stałe (CH1, (region zawiasowy), CH2, CH3).

W zakres wynalazku wchodzi też cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również komórki gospodarza transformowanej cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania polipeptydu według wynalazku obejmującego: dostarczanie populacji komórek gospodarza według wynalazku; hodowanie populacji komórek w warunkach umożliwiających ekspresję polipeptydu i izolację wyrażonego polipeptydu.

Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu według wynalazku

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku.

Wynalazek dotyczy też zastosowania polipeptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka, chorób autoimmunologicznych, choroby zapalnej, choroby wirusowej lub choroby naczyniopochodnej.

W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do leczenia choroby wirusowej, którą jest zakażenie ECM, grypa, zakażenie dróg oddechowych, wścieklizna, zapalenie wątroby.

W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do leczenia choroby autoimmunologicznej, którą jest toczeń lub stwardnienie rozsiane.

W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do leczenia choroby zapalnej, którą jest zwłóknienie.

W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do leczenia choroby naczyniopochodnej, którą jest retinopatia cukrzycowa, retinopatia wcześniacza, degradacja plamki, odrzucenie przeszczepu rogówkowego, jaskra neowaskularna, fibroplazja pozasoczewkowa, rubeoza lub zespół Osler-Webbera.

W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do leczenia choroby nowotworowej, którą jest mięsak osteolityczny, chłoniak, ostra białaczka limfocytarna, rak sutka, czerniak, rak nosogardzieli lub naczyniak krwionośny.

Krótki opis rysunków.

Figura 1. cDNA i wydedukowana sekwencja aminokwasowa fuzji znacznik histydynowy-interferon beta (nazywanej także „his IFN-beta” lub „ze znacznikiem His6”). Pokazane są pełna sekwencja DNA i białka his IFN-beta-1a. Odcinana sekwencja sygnałowa VCAM-1 pozostawia 3 aminokońcowe reszty (SerGlyGly) przed znacznikiem histydynowym (His₆, pozycje 4-9). Sekwencja łącznikowa enterokinazy (AspAspAspAspLys) jest oddzielona od znacznika histydynowego sekwencją rozdzielającą (pozycje 10-12, SerSerGly). Naturalna sekwencja białkowa IFN-beta-1a obejmuje pozycje (Met18-Asn183).

Figura 2. cDNA i wydedukowana sekwencja aminokwasowa fuzji interferon-beta-1a/Fc. Pokazane są pełna sekwencja DNA i białka ludzki IFN-beta-1a/mysi Fc. Sekwencja białkowa ludzkiego IFN-beta-1a obejmuje reszty aminokwasowe 1-166 (sekwencja DNA 1-498). Sekwencja łącznikowa enterokinazy

PL 200 586 B1 obejmuje reszty aminokwasowe 167-171 (sekwencja DNA 499-513). Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego mysiej IgG2a obejmuje reszty aminokwasowe 172-399 (sekwencja DNA 514-437).

Figura 3. Wiązanie mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi z dimerowym białkiem fuzyjnym zawierającym zewnątrzkomórkową domenę łańcucha receptora interferonu typu I, IFNAR2/Fc. Powinowactwa wiązania mutantów IFN z podstawieniami alaninowymi (A1-E) z łańcuchem receptora IFNAR2 ustalono tak, jak opisano w Przykładzie 1 (podrozdział D). Histogram przedstawia ich powinowactwa wiązania w tym teście w stosunku do his-IFNbeta typu dzikiego (% wagowy). Wartości w % wagowych obliczono jako (powinowactwo his-IFN-beta typu dzikiego)/(powinowactwo mutanta IFN-beta) x 100. Pokazano % wag., (x) dla wielokrotnych testów (n=3) i średni % wag. (x) dla zestawu eksperymentalnego. Mutanty A2, AB1, AB2 i E nie wiążą się z IFNAR2/FC w stężeniach 500 razy wyższych niż ciężar. his-IFN-beta EC 50 (*).

Figura 4. Wiązanie mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi z kompleksami komórkowego powierzchniowego receptora interferonu typu I („kompleks IFNAR1/2”) wyrażanych na komórkach chłoniaka Daudi Burkitt'a. Właściwości wiązania się z receptorem mutantów z podstawieniami alaninowymi (A1-E) określono w oparciu o FASC przy zastosowaniu testu wiązania się z komórkowym powierzchniowym receptorem tak, jak opisano w Przykładzie 1 (podrozdział D). Histogram przedstawia ich powinowactwa wiązania w tym teście w stosunku do his-IFN-beta typu dzikiego (% wag.). Wartości w % wagowych, dla każdego mutanta obliczono jako (powinowactwo his-IFN-beta typu dzikiego)/(powinowactwo mutanta IFN-beta) x 100. Pokazane są % wagowe, (o) dla wielokrotnych testów pod histogramem i średnie wartości w % wagowych dla zestawu eksperymentalnego (x).

Figura 5. Aktywności antywirusowe mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi.

Aktywności antywirusowe mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi (A1-E) ustalono na ludzkich komórkach A549 prowokowanych wirusem EMC, jak opisano w Przykładzie 1 (podrozdział E). Histogram przedstawia ich aktywności w tym teście w stosunku do his-IFN-beta typu dzikiego (% wag.). Wartości w % wagowych obliczono jako odwrotność stężenia mutanta IFN-beta (50% cpe)/stężenie wagowe. his-IFN-beta (50% cpe) x 100. Pokazane są w % wagowych (o) dla wielokrotnych testów i średnia z zestawu danych eksperymentalnych (x).

Figura 6. Aktywności antyproliferacyjne mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi.

Aktywności antyproliferacyjne mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi (A1-E) ustalono na komórkach chłoniaka Daudi Burkitt'a, jak opisano w Przykładzie 1 (podrozdział E). Histogram przedstawia ich aktywności w tym teście w stosunku do his-IFNbeta typu dzikiego (% wagowy). Wartości w % wagowych obliczono jako (stężenie his-IFN-beta (50% zahamowanie wzrostu)/stężenie zmutowanego IFN-beta (50% zahamowanie wzrostu) x 100. Pokazane są w % wagowych (o) dla wielokrotnych testów i średnia z zestawu danych eksperymentalnych (x).

Figura 7. Względne aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi

Porównano aktywności mutantów interferonu-beta z podstawieniami alaninowymi (A1-E)w testach antywirusowych (oś x) i antyproliferacyjnych (oś y). Do tego porównania użyty był średni procent his-IFN-beta typu dzikiego (% wagowy.(x)) przedstawiony na Fig. 5 i 6. Mutanty ze skoordynowaną utratą/wzrostem aktywności znajdują się na albo w pobliżu linii przekątnej. Te mutanty, które mają nieproporcjonalną utratę/wzrost w aktywności antywirusowej lub antyproliferacyjnej znacząco odbiegają od linii przekątnej (DE1, D, C1). Istotność określano biorąc po uwagę odchylenia standardowe uzyskane dla zastosowanych wartości w % wagowych.

Figura 8. Aktywność antywirusowa fuzji interferon-beta-1a/Ig.

Aktywność interferonu-beta-1a (stosowanego jako AVONEX®) lub fuzji interferon-beta-1a/mysia Ig2a w stężeniach wskazanych na osi X badano w teście antywirusowym przy użyciu komórek ludzkiego raka płuc (A549) prowokowanych wirusem EMC. Po dwóch dniach inkubacji z wirusem, żywotne komórki barwiono MTT, płytki odczytano przy 450 nm, a absorbancję, która odzwierciedla żywotność komórek, pokazano na osi Y. Odchylenia standardowe są pokazane jako pionowe kreski. Stężenie rnterferonu-taeta^a/^ (u^żywane^go jako A^NE^⁸), ^ktere dawato ⁵⁰% maksimum ^OD450, a zatem 50% zabijania wirusem („50% efekt cytopatyczny”), wynosiło około 0,4 pM, a 50% efekt cytopatyczny dla fuzji interferonu-beta-1a wynosił około 0,15 pM.

Figura 9. Pomiary aktywności antywirusowej interferonu-beta w osoczu myszy traktowanych fuzją interferon-beta-1a/Fc lub interferonem-beta-1a.

Myszom wstrzykiwano iv bądź 50000 jednostek interferonu-beta-1a (używanego jako AVONEX®), albo 50000 jednostek fuzji interferonu-beta-1a/Fc. Krew od tych myszy otrzymano przez

PL 200 586 B1 skrwawianie pozaoczodołowe w różnych punktach czasowych po iniekcji jak wskazano na osi X. Dla każdego punktu czasowego skrwawiono przynajmniej 3 myszy, a osocze przygotowano i zamrażono do czasu badania aktywności interferonu-beta-1a w teście antywirusowym przy zastosowaniu komórek ludzkiego raka płuc (A549) prowokowanych wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego. Żywotne komórki barwiono roztworem MTT, płytki odczytywano przy 450 nm w celu określenia absorbancji, która odzwierciedla żywotność komórek i aktywność interferonu-beta-1a. Dla każdej płytki sporządzano krzywą standardową przy zastosowaniu interferonu-beta-1a AVONEX® i używano do określenia ilości inerferonu-beta-1a w każdej probówce. Pokazane są dane dla poszczególnych zwierząt.

Figura 10. Pełne sekwencje DNA i białka otwartych ramek odczytu bezpośrednich fuzji ludzkiego IFN beta i ludzkiej IgG1Fc (ZL5107).

Figura 11. Pełne sekwencje DNA i białka otwartych ramek odczytu białka fuzyjnego składającego się z ludzkiego IFN beta/łącznika G4S/ludzkiej IgG1Fc(ZL6206).

Stosowane są następujące terminy:

I. Definicje:

Interferon (określany również jako „IFN”) jest małym, swoistym gatunkowo jednołańcuchowym polipeptydem, wytwarzanym przez komórki ssaków w odpowiedzi na ekspozycję na rozmaite induktory, takie jak wirusy, polipeptydy, mitogeny i temu podobne. Najkorzystniejszym interferonem stosowanym w wynalazku jest glikozylowany, ludzki interferon beta, który jest glikozylowany w pozycji 80 (Asn80) i który korzystnie został wytworzony w technologii rekombinowania DNA. Korzystny glikozylowany interferon beta jest nazywany „interferonem-beta--a” („IFN-beta--a” lub „IFN-3-1a” lub „interferonem beta 1a” lub „interferonem-beta-1a” lub „interferonem β 1a”; wszystkie terminy stosowane są wymiennie). Termin „interferon-beta-1a” również obejmuje wszystkie postaci zmutowane (tj. Przykład 1) pod warunkiem, że mutanty korzystnie są również glikozylowane w pozycji Ans80.

Sposoby rekombinowania DNA do wytwarzania białek, w tym interferonów, są znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład patenty USA 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel i wsp.) i 4,470,461 (Kaufman).

Korzystne polinukleotydy dla interferonu-beta-1a, które można zastosować w sposobach według niniejszego wynalazku, pochodzą z sekwencji genu dla interferonu beta typu dzikiego różnych kręgowców, korzystnie ssaków i są otrzymane przy zastosowaniu metod dobrze znanych specjalistom, takich jak metody opisane w następujących patentach USA: Patent USA 5,641,656 (wydany 24 czerwca, 1997: DNA kodujący proproteinę ptasiego interferonu typu I i dojrzały ptasi interferon typu I), Patent USA 5,605,688 (25 lutego, 1997 - zrekombinowane interferony typu I, psi i koński); Patent USA 5,231,176 (27 lipca, 1993, cząsteczka DNA kodująca ludzki interferon z leukocytów); Patent USA 5,071,761 (10 grudnia, 1991, sekwencja DNA kodująca podsekwencje ludzkich limfoblastoidalnych interferonów LylFN- alfa-2 i LylFN-alfa-3); Patent USA 4,970,161 (13 listopada, 1990, sekwencja DNA kodująca ludzki interferon-gamma); Patent USA 4,738,931 (19 kwietnia, 1988, DNA zawierający ludzki gen dla interferonu beta); Patent USA 4,695,543 (22 września, 1987, ludzki gen dla alfa-interferonu Gx-1; Patent USA 4,456,748 (26 czerwca, 1984, DNA kodujący podsekwencje różnych naturalnie występujących interferonów z leukocytów).

Mutanty interferonu-beta-1a zastosowane zgodnie z tym wynalazkiem wytwarza się wprowadzając mutacje przy zastosowaniu konwencjonalnych metod ukierunkowanej mutagenezy, znanych specjalistom.

Reasumując, termin „interferon” obejmuje, ale nie wyłącznie, czynniki wymienione powyżej, jak również ich funkcjonalne ekwiwalenty. Stosowany tu termin „funkcjonalny ekwiwalent” oznacza zatem białko interferonu-beta-1a albo polinukleotyd kodujący białko interferonu-beta-1a, który ma ten sam albo lepszy korzystny wpływ na ssaka będącego biorcą, jak interferon, w stosunku do którego ma on być funkcjonalnym ekwiwalentem. Dla specjalisty jest to zrozumiałe, że białko funkcjonalnego ekwiwalentu można wytworzyć przy zastosowaniu technik rekombinowania DNA, np. przez wyrażenie „funkcjonalnie ekwiwalentnego DNA”. A zatem, niniejszy wynalazek obejmuje polipeptydy interferonu-beta-1a kodowane przez naturalnie występujący DNA. Na skutek degeneracji kodujących sekwencji nukleotydowych do zakodowania interferonu-beta-1a można zastosować inne polinukleotydy. Obejmują one całe albo części powyższych sekwencji, które są zmienione przez podstawienie różnych kodonów, które kodują taką samą resztę aminokwasową w sekwencji, dając zatem zmianę cichą. Takie zmienione sekwencje aminokwasowe są traktowane jako ekwiwalenty tych sekwencji. Przykładowo, Phe (F) jest kodowana przez dwa kodony, TTC lub TTT, Tyr (Y) jest kodowana przez TAC lub TAT i His (H) jest kodowana przez CAC lub CAT. Z drugiej strony, Trp (W) jest kodowany przez pojedynczy kodon, TGG. A zatem będzie oczywiste, że dla danej sekwencji DNA kodującej konkretny interferon

PL 200 586 B1 będzie wiele zdegenerowanych sekwencji, które go kodują. Zdegenerowane sekwencje wchodzą też w zakres tego wynalazku.

„Fuzja”- dotyczy współliniowego, kowalencyjnego połączenia dwóch lub większej liczby białek albo ich fragmentów przez ich pojedyncze szkielety peptydowe, korzystniej przez ekspresję genetyczną cząsteczki polinukleotydu kodującej takie białka. Korzystnie, białka lub ich fragmenty pochodzą z różnych źródeł.

Stosowany tu termin „zrekombinowane” oznacza, że białko pochodzi ze zrekombinowanego, ssaczego systemu ekspresji. Białko wyrażane w większości hodowli bakteryjnych, np. E. coli, będzie wolne od glikanu, a zatem te systemy ekspresji nie są korzystne. Białko wyrażane w drożdżach może mieć strukturę oligosacharydu, który różni się od wyrażanego w komórkach ssaków.

Termin „aktywny biologicznie” stosowany w tym opisie jako cecha interferonu-beta-1a, oznacza że ta konkretna cząsteczka ma dostateczną homologię sekwencji aminokwasowej z ujawnionymi tu wykonaniami wynalazku aby mieć zdolność do wykazywania aktywności antywirusowej mierzonej in vitro w teście antywirusowym typu pokazanego w Przykładzie 1, jak opisano poniżej.

Stosowany tu termin „kompozycja terapeutyczna” oznacza kompozycję zawierającą polipeptydy według wynalazku lub inne fizjologicznie odpowiednie składniki. Kompozycja terapeutyczna może zawierać zaróbki, takie jak wodę, minerały i nośniki, takie jak białko.

„Aminokwas”- monomerowa jednostka peptydu, polipeptydu albo białka. Dwadzieścia dwa aminokwasy znajdują się w naturalnie występujących peptydach, polipeptydach i białkach, wszystkie są izomerami L. Termin obejmuje również analogi aminokwasów i D-izomery aminokwasów białkowych oraz ich analogi.

„Pochodna” aminokwasu jest naturalnym albo nienaturalnym aminokwasem, w którym zazwyczaj występujący łańcuch boczny albo grupa końcowa (albo reszta cukrowa w interferonie-beta-1a) jest zmodyfikowana w reakcji chemicznej. Takie modyfikacje obejmują na przykład gammma-karboksylację, beta-karboksylację, pegylację, usiarczenie, sulfonowanie, fosforylację, amidyzację, estryfikację, N-acetylację, karbobenzylację, tosylację i inne modyfikacje znane w tej dziedzinie. „Derywatyzowany polipeptyd” jest polipeptydem zawierającym jeden lub więcej derywatyzowanych aminokwasów i/lub jeden lub więcej derywatyzowanych cukrów, jeżeli polipeptyd jest glikozylowany.

„Białko” - dowolny polimer składający się zasadniczo z dowolnego z 20 aminokwasów. Jakkolwiek „polipeptyd” jest często stosowany w odniesieniu do stosunkowo dużych polipeptydów, a „peptyd” jest stosowany w odniesieniu do małych polipeptydów, zastosowanie tych terminów w tej dziedzinie często nakłada się na siebie i jest zmienne. Stosowany tu termin „białko” dotyczy peptydów, białek i polipeptydów, o ile nie zaznaczono inaczej.

„Funkcjonalny ekwiwalent” reszty aminokwasowej jest aminokwasem, mającym podobne własności fizykochemiczne jak reszta aminokwasowa, którą zastąpiono funkcjonalnym ekwiwalentem.

„Mutant” - dowolna zmiana w materiale genetycznym organizmu, w szczególności dowolna zmiana (tj. delecja, substytucja, addycja albo zamiana) w sekwencji polinukleotydowej typu dzikiego albo w białku typu dzikiego. Termin: „muteina” jest stosowany wymiennie z „mutantem.

„Typ dziki” - naturalnie występująca sekwencja polinukleotydowa eksonu białka albo jej część, albo sekwencja białka albo jej część, odpowiednio, taka jak normalnie istnieje in vivo.

„Standardowe warunki hybrydyzacji” - sól i warunki temperaturowe zasadniczo równoważne 0,5 x SSC do około 5 x SSC i 65°C dla obu, hybrydyzacji i przemywania. Stosowany tu termin „standardowe warunki hybrydyzacji” jest zatem definicją funkcjonalną i obejmuje zakres warunków hybrydyzacji. Ostrzejsze warunki mogą, na przykład, obejmować hybrydyzację w buforze do hybrydyzacji łysinkowej (0,2% poliwinylopirolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% albumina z surowicy wołowej; 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1M NaCI; 0,1% fosforan sodu; 1% SDS); 10% siarczan dekstranu, i 100 ng/ml zdenaturowanego, sonikowanego DNA spermy łososia w 65°C przez 12-20 godzin, i płukanie w 75 mM NaCl/7,5 mM cytrynianie sodu (0,5 x SSC)/1% SDS w 65°C. Warunki określane jako niższa ostrość mogą, na przykład, obejmować hybrydyzację w buforze do hybrydyzacji łysinkowej, 10% siarczan dekstranu i 110 ng/ml zdenaturowanego, sonikowanego DNA spermy łososia w 55°C przez 12-20 godzin i przemywanie w 300 mM NaCl/30 mM cytrynian sodu (2,0 x SSC)/1% SDS w 55°C. Patrz także Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, podrozdziały 6.3.1-6.3.6, (1989).

„Sekwencja kontrolująca ekspresję” - sekwencja polinukleotydów, która kontroluje i reguluje ekspresję genów, gdy jest funkcjonalnie połączona z tymi genami.

„Połączona funkcjonalnie” - sekwencja polinukleotydowa (DNA, RNA) jest połączona funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję, gdy sekwencja kontrolująca ekspresję kontroluje i reguluje

PL 200 586 B1 transkrypcję i translację tej sekwencji polinukleotydowej. Termin „funkcjonalnie połączony” obejmuje posiadanie odpowiedniego sygnału startu (np. ATG) na początku sekwencji polinukleotydowej, która ma być wyrażana i utrzymywanie prawidłowej ramki odczytu dla umożliwienia ekspresji sekwencji polinukleotydowej pod kontrolą sekwencji kontrolującej ekspresję i wytwarzania żądanych polipeptydów kodowanych przez sekwencję polinukleotydową.

„Wektor ekspresyjny” - polinukleotyd, taki jak DNA plazmidu albo faga (spośród innych powszechnych przykładów), który umożliwia ekspresję co najmniej jednego genu, gdy wektor ekspresyjny jest wstawiony do komórki gospodarza. Wektor może być, lub może nie być zdolny do replikacji w komórce.

„Izolowany” (stosowany zamiennie z „zasadniczo czystym”) - gdy jest stosowany w odniesieniu do kwasów nukleinowych tj. sekwencji polinukleotydowych, które kodują polipeptydy, oznacza polinukleotyd RNA albo DNA, część polinukleotydu genomowego, polinukleotydu cDNA albo syntetycznego, który z powodu swojego pochodzenia albo manipulacji: (i) nie jest związany z całym polinukleotydem, z którym jest związany w naturze (np. jest obecny w komórce gospodarza jako wektor ekspresyjny albo jego część); albo (ii) jest połączony z kwasem nukleinowym albo inną cząsteczką chemiczną inną niż ta, z którą jest połączony w naturze; albo (iii) nie występuje w naturze. „Wyizolowany” oznacza ponadto sekwencję polinukleotydową, która jest: (i) powielona in vitro, na przykład, w reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR); (ii) zsyntetyzowana chemicznie; (iii) wytworzona przez rekombinowanie DNA-klonowanie; albo (iv) oczyszczona, na przykład, przez cięcie i rozdział w żelu.

A zatem „zasadniczo czysty kwas nukleinowy” jest kwasem nukleinowym, który nie jest bezpośrednio ciągły z jedną albo obydwiema sekwencjami kodującymi, z którymi tworzy zwykle ciągłość w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego kwas nukleinowy pochodzi. Zasadniczo czysty DNA obejmuje również zrekombinowany DNA, który jest częścią hybrydowego genu kodującego dodatkowe sekwencje.

„Izolowany” (stosowany zamiennie z „zasadniczo czystym”) - gdy jest stosowany w odniesieniu do polipeptydów, oznacza polipeptyd albo jego część, które, z powodu swojego pochodzenia albo manipulacji: (i) są obecne w komórce gospodarza jako produkt ekspresji części wektora ekspresyjnego; albo (ii) są połączone z białkiem albo inną cząsteczką chemiczną różną niż ta, z którą są połączone w naturze; albo (iii) nie występują w naturze. „Wyizolowany” oznacza ponadto białko, które jest: (i) zsyntetyzowane chemicznie; (ii) wyrażone w komórce gospodarza i oczyszczone z pozbyciem się towarzyszących białek. Termin oznacza ogólnie polipeptyd, który został oddzielony od innych białek i kwasów nukleinowych, z którymi naturalnie występuje. Korzystnie polipeptyd jest oddzielony również od substancji, takich jak przeciwciała albo złoże żelowe (poliakryloamid), które zostało zastosowane do jego oczyszczenia.

Zastosowany tu termin „heterologiczny promotor” to promotor, który nie jest naturalnie związany z genem albo oczyszczonym kwasem nukleinowym.

Zastosowany tu termin „homologiczny” jest synonimem terminu „identyczność” i dotyczy podobieństwa sekwencji pomiędzy dwoma polipeptydami, cząsteczkami albo pomiędzy dwoma kwasami nukleinowymi. Gdy w danej pozycji w dwóch porównywanych sekwencjach jest ta sama zasada albo jednostka aminokwasowa (na przykład, jeżeli w danej pozycji w dwóch cząsteczkach DNA znajduje się adenina, albo w danej pozycji w dwóch polipeptydach znajduje się lizyna), wówczas odpowiednie cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby odpowiadających sobie albo homologicznych pozycji wspólnych dla dwóch sekwencji podzieloną przez liczbę porównywanych pozycji x 100. Przykładowo, jeżeli 6 z 10 pozycji w dwóch sekwencjach odpowiada sobie albo jest homologicznych, wówczas dwie sekwencje są homologiczne w 60%. Jako przykład, sekwencje DNA CTGACT i CAGGTT wykazują 50% homologii (3 z 6 pozycji odpowiadają sobie). Generalnie, porównywanie przeprowadza się po dopasowaniu do siebie dwóch sekwencji tak, aby uzyskać maksimum homologii. Takie dopasowanie może być dokonane przy zastosowaniu na przykład metody Needleman i wsp.. J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), włączonej zwykle do programów komputerowych, takich jak program Align (DNAstar, Inc.). Sekwencje homologiczne mają identyczne albo podobne reszty aminokwasowe, gdzie podobne reszty są konserwatywnymi podstawieniami albo „dozwolonymi mutacjami punktowymi” odpowiadających sobie reszt aminokwasowych w dopasowanej sekwencji stanowiącej odniesienie. Z tego względu „konserwatywne podstawienie” reszty w sekwencji będącej odniesieniem stanowią takie podstawienia, które są fizycznie albo funkcjonalnie podobne do odpowiednich reszt w sekwencji stanowiącej odniesienie np. mają podobny rozmiar, kształt, ładunek elektryczny, właściwości chemiczne, włączając w to zdolność do tworzenia wiązań kowalencyjnych albo wodorowych i temu podobne. Szczególnie korzystnymi podstawieniami konserwatywnymi

PL 200 586 B1 są takie, które spełniają kryteria zdefiniowane dla „dopuszczalnych mutacji punktowych” w Dayhoff i wsp., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Sup. 3, rozdział 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation. Washington, D.C. (1978).

Termin „sekwencja polinukleotydowa” i „sekwencja nukleotydowa” są tu również stosowane wymiennie.

Termin „neowaskularyzacja” i „angiogeneza” oznacza w najszerszym sensie powstawanie nowych naczyń krwionośnych. W szczególności „angiogeneza”, odnosi się również do powstawania nowych naczyń krwionośnych w miejscu występowania nowotworu.

„IFNAR2”, „IFNAR1”, „IFNAR1/2” dotyczy białek, o których wiadomo, że tworzą komórkowy receptor powierzchniowy interferonu typu I. Część zewnątrzkomórkowa (ektodomena) łańcucha IFNAR2 sama może wiązać się z interferonem alfa albo beta.

W praktyce wynalazku będą stosowane, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinowania DNA, chemii białek i immunologii, które są w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie. W literaturze opisane są takie techniki. Patrz na przykład, Molecular Coning: A Laboratory Manual, wydanie 2-gie. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: DNA Cloning. Tomy I i II (D.N. Glover, wyd.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, wyd.), 1984; Patent USA Nr 4.683,195 (Mullis i wsp.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, wyd.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.). 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, wyd.). Alan R. Liss, Inc., 1987: Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal).1984: Methods in Enzymology, Tomy 154 i 155 (Wu i wsp., wyd.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, wyd.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory: Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, wyd.). Academic Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Tomy I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell, wyd.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Wytwarzanie i ekspresja białek fuzyjnych

Polipeptydy według wynalazku można uzyskać rozmaitymi metodami znanymi w tej dziedzinie. Przykładowo, interferon-beta-1a pełnej długości albo postaci skróconego interferonu-beta-1a można wytworzyć znanymi technikami rekombinowania DNA z zastosowaniem cDNA (patrz poniżej).

Gen, który koduje żądany polipeptyd interferonu-beta-la można zaprojektować w oparciu o sekwencję aminokwasową żądanego polipeptydu. Standardowe sposoby można następnie zastosować do zsyntetyzowania genu. Przykładowo, sekwencję aminokwasową można zastosować do skonstruowania genu na podstawie produktu translacji. Oligomer DNA zawierający sekwencję nukleotydową zdolną do zakodowania interferonu-beta-1a można wytworzyć w jednym etapie. Alternatywnie, kilka mniejszych oligonukleotydów kodujących fragmenty żądanego interferonu-beta-1a, można zsyntetyzować, a następnie połączyć razem poprzez ligację. Korzystnie, sekwencje DNA kodujące cześć interferonu-beta-1a będą wytworzone jako kilka odrębnych oligonukleotydów, które są kolejno razem łączone (patrz Przykład 2). Poszczególne oligonukleotydy typowo zawierają jednoniciowe odcinki 5' i 3' w celu połączenia na zasadzie komplementarności.

Po połączeniu, korzystne geny będą scharakteryzowane przez sekwencje, które są rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne (włączając w to miejsca restrykcyjne dla bezpośredniego klonowania w wektorze ekspresyjnym), biorąc pod uwagę preferowane kodony w gospodarzu dla układu ekspresyjnego, który ma być zastosowany (korzystnie komórka ssaka) oraz sekwencję, która po transkrypcji daje stabilny, ulegający wydajnej translacji RNA. Właściwe złożenie można potwierdzić przez sekwencjonowanie nukleotydów, mapowanie restrykcyjne i ekspresję biologicznie aktywnego polipeptydu w odpowiednim gospodarzu.

cDNA ssaka dla interferonu beta można wyizolować przy użyciu odpowiedniej sekwencji DNA ludzkiego interferonu-beta jako sondy do przeszukania konkretnej ssaczej biblioteki cDNA w międzygatunkowej hybrydyzacji. Ssaczy interferon beta zastosowany w niniejszym wynalazku obejmuje na przykład interferon beta naczelnych, człowieka, mysi, psi, koci, bydlęcy, koński i świński. Interferon beta ssaków można otrzymać przez hybrydyzację międzygatunkową przy użyciu jednoniciowego DNA pochodzącego z DNA ludzkiego interferonu beta jako sondy do hybrydyzacji w celu wyizolowania cDNA interferonu beta z ssaczych bibliotek cDNA. Wśród metod, które można zastosować do izolowania i klonowania sekwencji genu dla interferonu są metody, które można znaleźć w patentach USA zebranych powyżej. Szczególnie

PL 200 586 B1 ważny jednakże jest patent USA 4,738,931 (Kwiecień 19, 1988) opisujący DNA zawierający gen ludzkiego interferonu beta.

Niniejszy wynalazek dotyczy również cząsteczek zrekombinowanego DNA zawierających wspomniane powyżej sekwencje DNA. Zrekombinowane cząsteczki DNA według tego wynalazku są zdolne do kierowania ekspresją polipeptydów według wynalazku w transformowanym nimi gospodarzu. Sekwencje DNA kodujące polipeptyd według wynalazku muszą być połączone funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję dla takiej ekspresji. W celu zapewnienia odpowiedniej transkrypcji zrekombinowanych konstruktów, korzystne jest, jeżeli odpowiednia sekwencja promotora/wzmacniacza jest włączona do zrekombinowanego wektora, pod warunkiem, że promotor/sekwencja kontrolująca ekspresję jest zdolna do kierowania transkrypcją sekwencji nukleotydowej kodującej glikozylowany interferon beta. Promotory, które mogłyby być zastosowane do kontrolowania ekspresji białek fuzyjnych w oparciu o immunoglobulinę obejmują, ale nie wyłącznie, region promotorowy SV40 (Benoist and Chambon, Naturę 290:304-310), zawierające promotor długie powtórzenia 3' wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i wsp., 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:144-1445), sekwencje regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster i wsp.., 1982, Nature 296:39-42), roślinne wektory ekspresyjne zawierające region promotorowy syntazy nopaliny (Herrera-Estrella i wsp., Nature 303:209-213) i promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (Gardner i wsp., 1981 Nucl. Acids Res. 9:2871) oraz promotor fotosyntetycznego enzymu karboksylazy rybulozobisfosforanowej (Herrera-Estrella i wsp., 1984, Nature 310:115-120); elementy promotorowe z drożdży i innych grzybów, takich jak promotor Gal 4, promotor ADC (dehydrogenezy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej), promotor alkalicznej fosfatazy i następujące zwierzęce regiony kontrolujące transkrypcję, które wykazują specyficzność tkankową i zostały zastosowane w zwierzętach transgenicznych: region kontrolny genu elastasy I, który jest aktywny w komórkach trzustki (Swift i wsp.., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz i wsp.., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425515); wzmacniacze lub promotory genu insuliny, które są aktywne w komórkach beta trzustki (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); wzmacniacze lub promotory genu immunoglobuliny, które są aktywne w komórkach limfoidalnych (Grosschedl i wsp.., 1984, Cell 38:647-658; Adames i wsp., 1985, Nature 318:533-538; Alexander i wsp.., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); wczesny promotor cytomegalowirusa i regiony wzmacniacza (Boshart i wsp., 1985, Cell 41 :521530); region kontrolny mysiego wirusa gruczołów mlecznych, który jest aktywny w komórkach jądrowych, sutka, limfoidalnych i tucznych (Leder i wsp.,

1986, Cell 45:485-495); region kontrolny genu albuminy, który jest aktywny w wątrobie (Pinkert i wsp.,

1987, Genes and Devel. 1 :268-276); region kontrolny genu alfafetoproteiny, który jest aktywny w wątrobie (Krumlauf i wsp., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer i wsp., 1987, Science 235:53-58); region kontrolny genu alfa 1-antytrypsyny, który jest aktywny w wątrobie (Kelsey i wsp., 1987. Genes and Devel. 1: 161171); region kontrolny genu beta-globiny, który jest aktywny w komórkach mieloidalnych (Mogram i wsp., 1985, Nature 315:338-340; Kollias i wsp.., 1986, Cell 46:89-94; region kontrolny genu dla białka podstawowego mieliny, który jest aktywny w oligodendrocytach w mózgu (Readhead i wsp.., 1987, Cell 48:703-712); region kontrolny genu dla lekkiego łańcucha 2 miozyny, który jest aktywny w mięśniach szkieletowych (Sani, 1985. Nature 314:283-286) oraz region kontrolny genu dla gonadotropowego hormonu uwalniającego, który jest aktywny w podwzgórzu (Mason i wsp., 1986. Science 234: 1372-1378). Prokariotyczne systemy ekspresyjne, takie jak promotor LAC lub promotor beta-laktamazy (Villa-Kamaroff, i wsp., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:3727-3731) nie są szczególnie korzystne, ponieważ wyrażony interferon beta nie będzie glikozylowany. Pomimo tego prokariotyczne układy ekspresyjne, które umożliwiają glikozylację interferonu beta bądź w gospodarzach prokariotycznych, bądź eukariotycznych są również objęte zakresem wynalazku.

Wektory ekspresyjne, które można zastosować, obejmują między innymi następujące wektory albo ich pochodne: ludzkie albo zwierzęce wirusy, takie jak wirus krowianki, wektory oparte o adenowirusy i retrowirusy; wirusy owadzie, takie jak bakulowirusy, wektory drożdżowe; wektory bakteriofagowe (np. lambda), wektory DNA plazmidowe i kosmidowe, żeby wymienić tylko niektóre. W szczególności przydatne układy ekspresyjne dla korzystnych gospodarzy eukariotycznych obejmują wektory zawierające sekwencje kontrolujące ekspresję z SV40, bydlęcego wirusa papiloma, cytomegalowirusa. Ponadto, w obrębie każdego specyficznego wektora ekspresyjnego, można wybrać rozmaite miejsca dla wstawienia tych sekwencji DNA. Miejsca te są zazwyczaj wyznaczone przez endonukleazy restrykcyjne, które je przecinają. Są one dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Będzie można się zorientować, że dany wektor ekspresyjny przydatny w tym wynalazku nie musi mieć miejsca dla endonukleazy

PL 200 586 B1 restrykcyjnej dla wstawiania wybranego fragmentu DNA. Zamiast tego wektor może być połączony z fragmentem alternatywnymi sposobami.

Wektor ekspresyjny i miejsce wybrane do wstawienia wybranego fragmentu DNA i funkcjonalnego połączenia go w z sekwencją kontrolującą ekspresję jest zdeterminowany przez wiele czynników, takich jak ilość miejsc wrażliwych na konkretny enzym restrykcyjny, rozmiar polipeptydu, to, jak łatwo polipeptyd jest proteolitycznie degradowany i temu podobne. Wybór wektora i miejsca wstawienia danego DNA jest określony przez równowagę między tymi czynnikami.

Zrekombinowane konstrukty można wprowadzać do komórek gospodarza, które mają zdolność do ekspresji białka fuzyjnego przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, włączając w to transformację (na przykład przy zastosowaniu technik z dekstranem- DEAE albo fosforanem wapnia) transfekcji, mikroiniekcji, infekcji, działa komórkowego i elektroporacji. Można zastosować dowolny typ komórki gospodarza, przy założeniu, że sekwencje zrekombinowanego DNA dla białka fuzyjnego będą odpowiednio transkrybowane do mRNA w tym typie komórki i komórka może glikozylować białko. Ponadto, konstrukty zrekombinowanego kwasu nukleinowego mogą być zastosowane do wywarzania zwierząt transgenicznych, które nie są ludźmi zdolnych do wytwarzania białek fuzyjnych w oparciu o immunoglobulinę. W korzystnych wykonaniach komórką gospodarza jest komórka ssaka, taka jak komórka COS albo CHO.

Pomyślne włączenie tych konstruktów polinukleotydowych do danego wektora ekspresyjnego można wykazać przy zastosowaniu trzech ogólnych podejść: (a) hybrydyzacji DNA-DNA, (b) obecności albo nieobecności funkcji genu „markerowego” oraz (c) ekspresję wstawionych sekwencji. W pierwszym podejściu, obecność genu interferonu-beta-1a wstawionego do wektora ekspresyjnego można wykryć poprzez hybrydyzację DNA-DNA przy zastosowaniu sond zawierających sekwencje, które są homologiczne do wstawionego genu białka fuzyjnego. W drugim podejściu, zrekombinowany układ wektor/gospodarz można zidentyfikować i wyselekcjonować w oparciu o obecność albo nieobecność pewnych funkcji genu markerowego (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, takie jak G418, fenotyp po transformacji, tworzenie się ciał okluzyjnych w bakulowirusie, itd.), powodowane przez wstawienie obcych genów do wektora. Przykładowo, jeżeli polinukleotyd jest wstawiony tak, aby przerwać sekwencję genu markerowego w wektorze, rekombinanty zawierające wstawkę można zidentyfikować przez brak funkcji genu markerowego. W trzecim podejściu, zrekombinowane wektory ekspresyjne można zidentyfikować przez testowanie produktu obcego genu wyrażanego przez zrekombinowany wektor. Takie testy mogą opierać się na przykład na właściwościach fizycznych albo funkcjonalnych produktu genu w systemach badań biologicznych.

Będzie oczywiste, że nie wszystkie kombinacje gospodarz/wektor ekspresyjny będą funkcjonować z równą wydajnością przy wyrażaniu sekwencji DNA kodujących polipeptydy według tego wynalazku. Jednakże, konkretny wybór kombinacji gospodarz-wektor ekspresyjny może być dokonany przez specjalistów po uwzględnieniu przedstawionych tu zasad nie wychodząc poza zakres wynalazku.

W najkorzystniejszych białkach fuzyjnych, mutant interferonu-beta-1a jest połączony za pośrednictwem swojego końca C z co najmniej częścią regionu Fc immunoglobuliny. Interferon-beta-1a tworzy część aminokońcową, a region Fc tworzy część karboksykońcową. W tych białkach fuzyjnych region Fc ogranicza się do domeny stałej regionu zawiasowego oraz domen CH2 i CH3. Regiony Fc w tych fuzjach mogą również ograniczać się do części regionu zawiasowego, części mającej zdolność do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych mostków disiarczkowych, domen CH2 i CH3 albo ich funkcjonalnych ekwiwalentów. Te regiony stałe mogą pochodzić od dowolnego źródła ssaczego (korzystnie człowieka) i mogą pochodzić z odpowiedniej klasy i/lub izotypu, włączając w to IgA, IgD, IgM, IgE oraz IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

Zrekombinowane cząsteczki DNA, które kodują fuzje Ig można otrzymać dowolną metodą znaną w tej dziedzinie (Maniatis i wsp.., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.) albo otrzymać z dostępnych publicznie klonów. Sposoby wytwarzania genów, które kodują stałe regiony ciężkich albo lekkich łańcuchów immunoglobulin, są przedstawione na przykład przez Robinson i wsp., zgłoszenie PCT, publikacja nr W087-02671. Sekwencję cDNA kodującą cząsteczkę lub fragment interferonu można łączyć bezpośrednio z cDNA kodującym ciężkie regiony stałe Ig albo można łączyć przez sekwencję łącznikową. W dalszych wykonaniach wynalazku można wytworzyć zrekombinowany układ wektorowy w celu umieszczenia tam sekwencji kodujących interferon beta w prawidłowej ramce odczytu z syntetycznym regionem zawiasowym. Ponadto, może być pożądane dołączenie, jako części zrekombinowanego układu wektorowego, kwasów nukleinowych odpowiadających regionom flankującym po stronie 3' genu immunoglobuliny, włączając w to miejsca

PL 200 586 B1 cięcia/poliadenylacji RNA i sekwencje leżące poniżej. Ponadto, może być pożądane wstawienie sekwencji sygnałowej przed sekwencją kodującą białko fuzyjne z immunoglobuliną w celu ułatwienia wydzielania cząsteczki stanowiącej fuzję z komórki transformowanej zrekombinowanym wektorem.

Można wytworzyć dimerowe cząsteczki stanowiące fuzję, jak również monomeryczne i multimeryczne cząsteczki zawierające białka fuzyjne. Takie multimery można wytworzyć przy zastosowaniu tych regionów Fc, albo ich części, z cząsteczek Ig, które są zwykle multiwalentne, takich jak pentamery IgM i dimery IgA. Jest zrozumiałe, że polipeptyd stanowiący łańcuch J może być potrzebny do utworzenia i stabilizacji pentamerów IgM i dimerów IgA. Alternatywnie, multimery białek fuzyjnych z interferonem-beta-1a można wytwarzać stosując białka z powinowactwem do regionu Fc cząsteczek Ig, takiego jak białko A. Przykładowe białka fuzyjne: inerferon-beta-1a/imunoglobulina mogą wiązać się z kulkami agarozowymi z białkiem A.

Te poliwalentne postaci są przydatne, ponieważ mają wiele miejsc wiążących się z receptorem interferonu beta. Przykładowo, biwalentny rozpuszczalny interferon-beta-1a może składać się z dwóch tandemowych powtórzeń aminokwasów od 1 do 166 w Id. Sekw. Nr: 2 (albo kodowanych przez kwasy nukleinowe numerowane od 1 do 498 w Id. Sekw. Nr: 1) rozdzielonych przez region łącznikowy, gdzie powtórzenia są dołączone do co najmniej części regionu stałego immunoglobuliny. Można również skonstruować inne postaci poliwalentne, na przykład przez połączenie chemiczne fuzji interferonu-beta-1a z dopuszczalną klinicznie cząsteczką nośnikową, polimerem wybranym z grupy składającej się z Fikolu, glikolu polietylenowego albo dekstranu przy zastosowaniu konwencjonalnych technik łączenia. Alternatywnie, interferon-beta-1a można łączyć chemicznie z biotyną i umożliwić następnie wiązanie się koniugatu biotyna-interferon beta Fc z awidyną, co prowadzi w rezultacie do tetrawalentnych cząsteczek awidyna/biotyna/interferon beta. Fuzje interferon-beta-1a/Ig można następnie wiązać kowalencyjnie z dinitrofenolem (DNP) albo trinitrofenolem (TNP), a otrzymany w rezultacie koniugat precypitować z anty-DPN albo z anty-TNP-IgM w celu utworzenia koniugatów dekamerowych o wartościowości 10 dla miejsc wiązania interferonu beta przez receptor.

Białka, fragmenty i białka fuzyjne interferonu-beta-1a można izolować i oczyszczać zgodnie ze standardowymi warunkami oczyszczania, takimi jak ekstrakcja, precypitacja, chromatografia, chromatografia powinowactwa, elektroforeza i temu podobne. Przykładowo, białka i fragmenty interferonu-beta można oczyszczać przez przepuszczanie roztworu zawierającego białko fuzyjne przez kolumnę zawierającą immobilizowane białko A albo białko G, które wybiórczo wiąże się z częścią Fc białka fuzyjnego. Patrz na przykład Reis K.J., i wsp., J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); Zgłoszenie PCT, Publikacja Nr W087/00329. Chimerowe przeciwciało można następnie wymywać przez traktowanie chaotropową solą albo przez wymywanie uwodnionym kwasem octowym.

Alternatywnie, białka interferonu i cząsteczki DNA będące fuzją z immunoglobulinami można oczyszczać na kolumnach z przeciwciałem anty-interferonowym albo kolumnach z przeciwciałem anty-immunoglobulinowym w celu uzyskania zasadniczo czystego białka. Termin „zasadniczo czysty” ma oznaczać białko wolne od zanieczyszczeń, które naturalnie mu towarzyszą. Zasadniczą czystość można wykazać przez pojedynczy prążek w elektroforezie.

Przykładem przydatnego białka fuzyjnego interferon-beta-1a/Ig jest białko z Id. Sekw. Nr: 2, które jest wydzielane do pożywki hodowlanej przez komórki eukariotyczne zawierające plazmid ekspresyjny pCMG261 (patrz Przykład 2). Białko to składa się z dojrzałego interferonu-beta-1a sfuzowanego z częścią regionu zawiasowego i domenami stałymi CH2 CH3 mysiej Ig. Zawiera ono dostateczną część mysiej immunoglobuliny, aby była rozpoznawane przez białko wiążące Fc, Białko A.

Inne białka fuzyjne zawierające ludzki interferon-beta-1a są pokazane: (a) w Id. Sekw. Nr: 3 i 4 dla DNA i wydedukowanej sekwencji aminokwasowej, odpowiednio, dla fuzji znacznik his-interferon-beta-1a (pokazanej również na Fig. 1) oraz; (b) w Id. Sekw. Nr: 1 dla cDNA kodującego białko fuzyjne interferon-beta-1a/Ig z Id. Sekw. Nr: 2 (pokazane również na Fig. 2).

Inne warianty fuzji polipeptydowych interferonu

Pochodne białek według wynalazku obejmują również formy strukturalne wyjściowych białek, które zachowują aktywność biologiczną. Na przykład na skutek obecności jonizowalnych grup aminowych i karboksylowych, białka fuzyjne mogą występować w postaci soli kwaśnych lub zasadowych albo mogą być w postaci obojętnej. Poszczególne reszty aminokwasowe mogą być również zmodyfikowane przez utlenienie albo redukcję. Ponadto, pierwszorzędowa struktura aminokwasowa (włączając w to końce N i/lub C) albo glikan interferonu-beta-1a mogą być zmodyfikowane („derywatyzowane przekształcone w pochodne”) przez utworzenie kowalencyjnych albo agregacyjnych koniugatów z innymi cząstkami chemicznymi, takimi jak grupy glikozylowe, polimery glikoli polialkilenowych, takie jak glikol

PL 200 586 B1 polietylenowy (PEG: patrz jednocześnie złożone i wspólnie przekazane zgłoszenia numery seryjne 60/104,491 i 60/720,237) lipidy, fosforan, grupy acetylowe i temu podobne, albo przez utworzenie mutantów sekwencji aminokwasowej.

Inne pochodne interferonu beta/Ig obejmują kowalencyjne albo agregacyjne koniugaty interferonu beta albo jego fragmentów z innymi białkami albo polipeptydami, tak jak na przykład przez syntezę w zrekombinowanej hodowli jako dodatkowe N-końce albo C-końce. Przykładowo, przyłączonym peptydem może być polipeptydowa sekwencja sygnałowa (albo liderowa) w regionie N-końcowym białka, która kotranslacyjnie albo potranslacyjnie kieruje przeniesieniem białka z miejsca jego syntezy do miejsca działania wewnątrz albo na zewnątrz błony albo ściany komórkowej (np. lider drożdżowego czynnika alfa). Białka receptorowe dla interferonu beta mogą zawierać peptydy dodane dla ułatwienia oczyszczania albo identyfikacji interferonu beta (np. fuzje histydyna/interferon-beta-1a). Sekwencja aminokwasowa interferonu beta może również być połączona z peptydem Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)(Hoop i wsp.., Bio/Technology 6: 1204,1988). Ta ostatnia sekwencja jest wysoce antygenna i dostarcza epitopu związanego w sposób odwracalny ze swoistym przeciwciałem monoklonalnym, umożliwiając szybki test i łatwe oczyszczanie wyrażonego zrekombinowanego białka. Sekwencja ta jest również specyficznie cięta przez bydlęcą śluzówkową enterokinazę przy reszcie występującej bezpośrednio za parą Asp-Lys.

Inne analogi obejmują białko fuzyjne Fc z interferonem beta albo jego aktywnymi biologicznie fragmentami, w których sekwencje interferonu beta różnią się od tych pokazanych w Id. Sekw. Nr: 2, 4, 6 albo 8 jedną lub większą liczbą konserwatwnych podstawień aminokwasowych albo jedną lub większą liczbą niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych, albo delecjami czy insercjami, które nie upośledzają aktywności biologicznej wyizolowanego białka. Konserwatywne podstawienia obejmują typowo podstawienie jednego aminokwasu drugim o podobnych właściwościach, takie jak podstawienia w obrębie następujących grup: waliny, alaniny i glicyny; leucyny i izoleucyny; kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego; asparaginy i glutaminy; seryny i treoniny; lizyny i argininy; fenyloalaniny i tyrozyny. Niepolarne hyfrofobowe aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne obojętne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Aminokwasy naładowane dodatnio (zasadowe) obejmują argininę, lizynę i histydynę. Aminokwasy naładowane ujemnie (kwaśne) obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Inne podstawienia konserwatywne będą dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Przykładowo, dla aminokwasu alaniny, konserwatywne podstawienie można wybrać spośród D-alaniny, glicyny, beta-alaniny, L-cysteiny i D-cysteiny. Dla lizyny, podstawieniami może być dowolna spośród D-lizyny, argininy, D-argininy, homoargininy, metioniny, D-metionininy, ornityny, albo D-ornityny. Generalnie, podstawienia, dla których można spodziewać się, że indukują zmiany we właściwościach funkcjonalnych wyizolowanych polipeptydów są tymi, w których: (i) reszta polarna np. seryna lub treonina jest podstawiona (albo podstawiona przez) resztą hydrofobową, np. leucyną, izoleucyną, fenyloalaniną albo alaniną; (ii) reszta cysteinowa jest podstawiona (albo podstawiona przez) dowolną inną resztą; (iii) reszta mająca elektrododatni łańcuch boczny, np. lizyna, arginina lub histydyna jest podstawiona (albo podstawiona przez) resztą mającą elektroujemny łańcuch boczny, np. kwasem glutaminowym lub kwasem asparaginowym; albo (iv) reszta mająca duży łańcuch boczny np. fenyloalaninę, jest podstawiona (albo podstawiona przez) resztą nie mającą takiego łańcucha bocznego np. glicyną. Wynalazkiem objęte są mutanty, które są naturalnymi mutantami, indukowanymi mutantami, które hybrydyzują w warunkach ostrych albo łagodnych z kwasami nukleinowymi, które kodują polipeptydy, takie, jak Id. Sekw. Nr: 2, 4, 6 albo 8.

Uzyskaliśmy mutanty interferonu-beta-1a, które są dalszymi wariantami cząsteczki interferonubeta-1a. Te cząsteczki interferonu-beta-1a mogą być szczególnie przydatne ze względu na to, że nadają nowe właściwości, których nie ma interferon-beta-1a typu dzikiego (patrz Przykład 1). Pokrótce, przeprowadziliśmy analizę mutacyjną ludzkiego interferonu-beta-1a przez mapowanie reszt wymaganych do aktywności i wiązania receptora. Dostępność trójwymiarowej struktury krystalicznej ludzkiego interferonu-beta-1a (patrz. Karpusas i wsp.., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818) umożliwia identyfikowanie, podstawień alaninowych (lub serynowych), reszt eksponowanych wobec rozpuszczalnika dostępnych dla oddziaływań z receptorem interferonu beta, i zachowanie aminokwasów uczestniczących w wiązaniach wewnątrzcząsteczkowych. Zaprojektowano tabelę piętnastu kolejnych mutacji alaniny, które zamieniają dwie i osiem reszt w obrębie odrębnych regionów każdej z helis (A, B, C, D, E) i pętli (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) interferonu-beta-1a. Patrz Przykład 1.

PL 200 586 B1

Aminokońcowy znacznik histydynowy (znacznik „his”) dołączono w celu oczyszczania przez powinowactwo mutantów wyrażanych w komórkach ssaczych (Id. Sekw. Nr: 2: Fig. 1). Konsekwencje funkcjonalne takich mutacji badano w testach antywirusowych i proliferacyjnych. Opracowano nieradioaktywne testy wiązania w celu przeanalizowania tych mutacji pod kątem ich wiązania z komórkowym receptorem powierzchniowym inetreronu-beta (komórkowy receptor powierzchniowy IFNAR1/2). Ponadto, zastosowano test w oparciu o ELISA wykorzystujący białko fuzyjne IFNAR2-ektodomena/Fc do wiązania interferonu w celu mapowania oddziaływań pomiędzy powierzchniami interferonu-beta-1a i IFNAR2 (Patrz Przykład 1). Te analizy mutacyjne pokazały, że i końce N i C są w części cząsteczki interferonu beta, która nie jest ważna dla wiązania receptora albo funkcji biologicznych.

Zidentyfikowaliśmy trzy typy efektów, powodowanych przez ukierunkowaną mutagenezę. Efekty te mogą być w pewnych warunkach korzystne dla opracowywania leków z interferonem. Te trzy typy efektów są następujące: (a) mutanty o wyższej aktywności antywirusowej niż itnetreron-beta-1a typu dzikiego (np. mutant C1); (b) mutanty, które wykazują aktywność zarówno w testach antywirusowych, jak i antyproliferacyjnych, ale dla których aktywność antyproliferacyjna jest nieproporcjonalnie niższa niż aktywność antywirusowa w porównaniu z intetreronem-beta-1a typu dzikiego (np. mutanty C1, D i DE1); oraz (c) funkcjonalni antagoniści (np. A1, B2, CD2 i DE1), wykazujący aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne, które są nieproporcjonalnie niskie w odniesieniu do wiązania się z receptorem w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego.

Ponadto, wiązanie pomiędzy częścią stanowiącą interferon-beta-1a (X) i drugą, niebędącą intetreronem-beta-1a częścią Z (np. regionem Fc immunoglobuliny) można również uzyskać przez dowolną reakcję chemiczną, która wiąże dwie cząsteczki razem tak długo, o ile immunoglobulina i interferon-beta-1a zachowują swoje aktywności. To chemiczne połączenie może obejmować wiele mechanizmów chemicznych, takich jak wiązanie kowalencyjne, wiązanie przez powinowactwo, interkalację, wiązanie skoordynowane i tworzenie kompleksów. Reprezentatywne czynniki więżące (tj. łączniki „Y” we wzorze ogólnym) w celu otrzymania wiązania kowalencyjnego między interferonem-beta-1a i częścią immunoglobulinową mogą obejmować związki organiczne, takie jak tioestry, karbodiimidy, estry sukcynimidowe, diizocyjaniany, takie jak tolileno-2,6-diizocyjanian, gluteraldehydy, diazobenzeny i heksametylenodiaminy, takie jak bis-(p-diazoniobenzoiloetylenodiamina, bifunkcjonalna pochodna imidoestrów, takich jak dimetylodipimidan oraz bis-aktywne związki fluorowe, takie jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen. Nie jest przeznaczeniem tej listy wyczerpanie różnych klas chemicznych czynników wiążących znanych w dziedzinie. Wiele z nich jest dostępnych w handlu, takich jak N-sukcynimidylo-3-(2-pirydyloditio)propionian (SPDP), chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidowy (EDC);4-sukcynimidylooksykarbonylo-alfa-metylo-alfa-(2-pirydyloditio)toluen (SMPT; Pierce Chem. Co., Cat. #21558G).

Zastosowanie wynalazku

Białko fuzyjne według tego wynalazku można zastosować w kompozycjach terapeutycznych wszędzie tam gdzie wymagane jest leczenie interferonem beta. Te cząsteczki mają normalne zalety towarzyszące białkom fuzyjnym, konkretnie fuzji z Ig, a mianowicie zmienioną farmakokinetykę i farmakodynamikę, prowadzące do zwiększonego okresu półtrwania i czasu przebywania w układzie naczyniowym. Ponadto, szczególnie korzystne białka glikozylowanego interferonu-beta-1a, jakkolwiek podobne w swojej strukturze do interferonu-beta-1b, są wielokrotnie bardziej aktywne biologicznie niż nieglikozylowany interferon beta 1b. Patrz Runkel i wsp., 1998, Pharm. Res. 15:641-649.

Stwierdzono, że produkty według wynalazku są przydatne ze względu na utrzymany czas półtrwania leczniczego interferonu-beta-1a i mogą być na przykład wytwarzane do podawania leczniczego przez rozpuszczenie w wodzie albo dopuszczalnym podłożu ciekłym. Podawanie przeprowadza się drogą pozajelitową, w aerozolu albo doustną. Drobno cząsteczkowe zawiesiny koloidalne można wytworzyć do podawania pozajelitowego w celu uzyskania przedłużonego działania albo drogą doustną, podczas gdy preparat aerozolowy może mieć postać płynną albo suchego pudru. W stanie suchym, zliofilizowanym albo w preparatach roztworów, fuzje interferonu-beta-1a według niniejszego wynalazku powinny mieć dobrą stabilność przy przechowywaniu.

Polipeptydy terapeutyczne według wynalazku można stosować w profilaktyce albo leczeniu dowolnego stanu albo choroby, w której składnik interferon-beta-1a jest skuteczny. Ponadto, białka fuzyjne, zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku można wykorzystywać przy diagnozowaniu części składowych, stanów lub chorób w układach biologicznych albo próbkach jak również dla celów diagnostycznych w układach niefizjologicznych.

PL 200 586 B1

Osobniki leczone polipeptydami według wynalazku obejmują ssaki, a korzystniej ludzi. W zależności od specyficznego stanu albo choroby, którą się zwalcza, zwierzęciu można podawać białka fuzyjne zawierające interferon-beta-1a w dowolnej odpowiedniej skutecznej leczniczo i bezpiecznej dawce, co specjalista w tej dziedzinie może łatwo określić bez wykonywania doświadczeń. Z powodu istnienia barier gatunkowych w przypadku interferonów typu I, może być konieczne wytworzenie białka fuzyjnego z interferonem, jak tu opisano, dla interferonów z odpowiednich gatunków.

Aktywność antyproliferacyjna interferonu-beta-1a jest dobrze znana. W szczególności, niektóre opisane tu fuzje interferonu-beta-1a są przydatne do leczenia nowotworów i raków, takich jak mięsak kościopochodny, chłoniak, ostra białaczka limfocytowa, rak sutka, czerniak i rak nosogardzieli, jak również chorób autoimmunologicznych takich jak zwłóknienie, toczeń i stwardnienie rozsiane. Ponadto, należy się spodziewać, że aktywność antywirusowa wykazywana przez białka fuzyjne, w szczególności pewne opisane tu muteiny interferonu-beta-1a można stosować do leczenia chorób wirusowych, takich jak zakażenie ECM, grypa i inne choroby dróg oddechowych, wścieklizna i zapalenie wątroby. Należy się również spodziewać, że aktywności immunomodulacyjne interferonu-beta-1a wykazywane przez opisane tu białka, można zastosować do leczenia chorób autoimunologicznych i zapalnych, takich jak zwłóknienie, stwardnienie rozsiane. Zdolność interferonów do hamowania wytwarzania nowych naczyń krwionośnych (angiogeneza i neowaskularyzacja) umożliwiają zastosowanie polipeptydów według wynalazku do leczenia chorób związanych z rozwojem naczyń krwionośnych, takich jak retynopatia cukrzycowa, retinopatia fibroplazja pozasoczewkowa, zwyrodnienie plamki, odrzucenie przeszczepu rogówkowego, jaskra z nowymi naczyniami krwionośnymi, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, rubeoza i zespół Osler-Webber'a. Ponadto, aktywność przeciwśródbłonkowa jest znana od pewnego czasu i jednym z potencjalnych mechanizmów działania interferonu może być przeciwdziałanie aktywności komórek śródbłonkowych przez hamowanie wytwarzania albo skuteczności czynników naczyniotwórczych wytwarzanych przez komórki nowotworowe. Niektóre nowotwory naczyniowe, takie jak naczyniaki krwionośne, są szczególnie podatne na leczenie interferonem. Leczenie interferonem alfa jest jedynym udokumentowanym leczeniem tej choroby. Spodziewane jest, że leczenie białkami fuzyjnymi interferonu-beta-1a według wynalazku będzie dawało zasadnicze korzyści farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, ponieważ należy się spodziewać, że koniugat pozostanie dłuższy czas w naczyniach krwionośnych niż interferony nie będące koniugatem, prowadząc zatem do bardziej wydajnej i skutecznej terapii do stosowania jako czynnik przeciwdziałający rozwojowi naczyń. Patrz Przykład 9.

Fuzje polimer-interferon-beta-1a można podawać jako takie, albo w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych estrów, soli i innych fizjologicznie funkcjonalnych pochodnych. W takich farmaceutycznych i leczniczych kompozycjach, interfero-beta-1a jest korzystnie stosowany łącznie z jednym albo większą liczbą dopuszczalnych farmaceutycznie nośników i ewentualnie z innymi składnikami leczniczymi. Nośniki(-i) muszą być dopuszczalne farmaceutycznie w tym znaczeniu, że pozostają zgodne z innymi składnikami kompozycji i nie są nadmiernie szkodliwe dla ich biorcy. Interferon-beta-1a jest dostarczany w ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu farmakologicznego, jak opisano powyżej w ilości odpowiedniej dla osiągnięcia żądanej dawki dziennej.

Kompozycje obejmują takie, które są odpowiednie do podawania pozajelitowego, jak i niepozajelitowego, a konkretne sposoby podawania obejmują podawanie doustne, doodbytnicze, dopoliczkowe, miejscowe, donosowe, dooczne, podskórne, śródskórne, dożylne, przezskórne, dooponowe, dostawowe, dotętnicze, podpajęczynówkowe, dooskrzelowe, dolimfatyczne, dopochwowe i domaciczne. Korzystne są kompozycje przydatne do podawania doustnego, donosowego i pozajelitowego.

Gdy interferon-beta-1a jest stosowany w kompozycjach zawierających roztwór ciekły, zaletą kompozycji jest możliwość podawania doustnie albo pozajelitowo. Gdy interferon-beta-1a jest stosowany w kompozycji płynnej zawiesiny albo jako proszek w kompozycji biokompatybilnego nośnika, korzystne jest podawanie kompozycji doustnie, doodbytniczo albo dooskrzelowo.

Gdy interferon-beta-1a jest stosowany bezpośrednio w postaci sproszkowanego materiału stałego, korzystne jest podawanie interferonu-beta-1a doustnie. Alternatywnie, może być podawany donosowo albo dooskrzelowo przez nebulizację proszku w nośniku gazowym w celu wytworzenia zawiesiny gazowej proszku, która jest wdychana przez pacjenta z układu oddechowego zawierającego odpowiednie urządzenie do nebulizacji.

Kompozycje zawierające polipeptydy według wynalazku mogą konwencjonalnie być obecne w jednostkowej postaci dawkowania i mogą być wytworzone dowolnym sposobem znanym w dziedzinie farmacji. Takie sposoby generalnie obejmują etap połączenia składnika(-ów) aktywnego(-ych) z nośnikiem,

PL 200 586 B1 który stanowi jeden albo więcej składników dodatkowych. Typowo, kompozycje można przygotować przez jednorodne i dokładne mieszanie składnika(-ów) aktywnego(-ych) z nośnikiem płynnym, miałko rozdrobnionym nośnikiem stałym albo obydwoma, a następnie, jeśli to konieczne, formowanie produktu w postać dawek żądanej kompozycji.

Kompozycje według niniejszego wynalazku odpowiednie do podawania doustnego mogą być w postaci pojedynczych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki, tabletki albo pastylki do ssania, każda zawierająca określoną uprzednio ilość składnika aktywnego w postaci proszku lub granulek, albo zawiesiny w płynie wodnym lub nie-wodnym, takim jak syrop, eliksir, emulsja albo porcje do łykania.

Tabletki można wytworzyć przez sprasowywanie albo formowanie, ewentualnie z jednym albo większą liczbą składników dodatkowych. Sprasowane tabletki można wytworzyć przez sprasowywanie w odpowiednim urządzeniu, gdzie składnik aktywny jest w postaci wolno unoszącej się, takiej jak proszek albo granulki, które ewentualnie miesza się z czynnikiem wiążącym, rozsadzającym, poślizgowym, rozpuszczalnikiem obojętnym, składnikiem powierzchniowo czynnym albo czynnikiem rozładowującym. Formowane tabletki zawierające mieszaninę sproszkowanych koniugatów polimerowych z odpowiednim nośnikiem można wytwarzać przez formowanie w odpowiedniej maszynie.

Syropy można wytwarzać przez dodawanie składników aktywnych do stężonego wodnego roztworu cukru, na przykład sacharozy, do którego można dodawać dowolny składnik(-i) dodatkowy(-e). Taki(e) dodatkowe dodatkowy(-e) składnik(-i) może(gą) obejmować środki smakowe, odpowiednie środki konserwujące, czynniki opóźniające krystalizację cukrów, czynniki zwiększające rozpuszczalność dowolnych innych składników, takie jak alkohol polihydroksylowy, na przykład glicerol lub sorbitol.

Kompozycje przydatne do podawania pozajelitowego zwykle zawierają sterylny preparat wodny aktywnego połączenia, który korzystnie jest izotoniczny z krwią biorcy (np. fizjologiczny roztwór soli). Takie kompozycje mogą obejmować czynniki zawieszające i zagęszczające oraz inne systemy makrocząsteczkowe, które są zaprojektowane do kierowania związku do składników krwi albo jednego lub większej liczby narządów. Kompozycje mogą być przygotowane w postaci jednodawkowej albo wielodawkowej.

Kompozycje do rozpylania donosowego zawierają oczyszczone roztwory wodne aktywnych koniugatów ze środkami konserwującymi i czynnikami izotonicznymi. Korzystne jest doprowadzenie takich kompozycji do pH i stanu izotoniczności odpowiedniego dla błon śluzówkowych nosa.

Kompozycje do podawania doodbytniczego mogą być obecne jako czopki z odpowiednim nośnikiem, takim jak masło kokosowe, utwardzone tłuszcze albo utwardzone kwasy tłuszczowe.

Kompozycje do oczu, takie jak krople do oczu można wytwarzać podobnymi metodami jak rozpylone płyny do nosa, z tą różnicą, że pH i parametry izotoniczności są korzystnie dopasowane do warunków panujących w oku.

Kompozycje miejscowe zawierają białka fuzyjne według wynalazku rozpuszczone albo zawieszone w jednym albo większej ilości podłóż, takich jak olej mineralny, wazelina, alkohole polihydroksylowe albo inne podłoża stosowane do miejscowych kompozycji farmaceutycznych.

Poza wspomnianymi powyżej składnikami, kompozycje według wynalazku mogą zawierać ponadto jeden albo większą liczbę składników dodatkowych wybranych spośród rozpuszczalników, buforów, środków smakowych, środków rozsadzających, środków powierzchniowo czynnych, środków zagęszczających, środków poślizgowych, środków konserwujących (włączając w to przeciw-utleniacze) i temu podobne.

Odpowiednie białka fuzyjne do stabilizowania in vitro interferonu-beta-1a w roztworze, mogą służyć jako korzystne przykładowe zastosowanie dla celów nieleczniczych. Takie białka fuzyjne mogą być wykorzystywane na przykład do zwiększania oporności na enzymatyczny rozkład interferonu-beta-1 a i dostarczają sposobów wydłużenia czasu przechowywania, stabilności w temperaturze pokojowej i trwałości odczynników i zestawów do badań naukowych.

Następujące dalej Przykłady dostarczono w celu zilustrowania niniejszego wynalazku i nie powinny być traktowane jako jego ograniczenie. Należy rozumieć, że opisane tu doświadczenia in vivo na zwierzętach mogą być zmienione, tak, że możliwe są modyfikacje i warianty podstawowej metodologii. Przykładowo, w Przykładzie 7 specjalista będzie mógł zastosować inny test neopteryny albo zmienić liczbę i rodzaj zastosowanego zwierzęcia naczelnego. Modyfikacje i warianty Przykładów są też traktowane jako mieszczące się w duchu i zakresie wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Badania struktury/aktywności ludzkiego interferonu-beta-1a z zastosowaniem mutacji-podstawień alanina/seryna: analiza miejsc wiązania receptora i domen funkcjonalnych

PL 200 586 B1

A. Część ogólna

Intensywną analizę mutacyjną ludzkiego interferonu-beta-1a(IFN-beta-1a) podjęto przez mapowanie reszt wymaganych do aktywności i wiązania receptora. Dostępność 3-D struktury krystalicznej ludzkiego IFN-beta (Karpusas, M. i wsp. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11813-11818) umożliwiła nam zidentyfikowanie podstawień alaninowych(albo serynowych) reszt eksponowanych na działanie rozpuszczalnika, dostępnych dla oddziaływań z receptorem i do zachowania aminokwasów uczestniczących w wiązaniach wewnątrzcząsteczkowych. Zaprojektowano wzór 15 mutacji alaninowych, które zastępowały reszty między 2 a 8 w różnych regionach każdej z helis (A, B, C, D i E)) i pętli (AB, CD, DE). W celu oczyszczania przez powinowactwo dołączono aminokońcowy znacznik składający się z 6 reszt histydynowych, jak również sekwencję łącznikową enterokinazy w celu usunięcia części aminokońcowej. Otrzymane interferony są określane wymiennie jako „his znakowany-interferon(IFN)-beta” albo His6-interferon-beta” itp.

Przy zastosowaniu konstruktu genu IFN-beta typu dzikiego jako matrycy do mutagenezy skonstruowano rozmaite plazmidy ekspresyjne ze znakowanym his-(IFN)-beta. Strategia mutagenezy obejmowała najpierw wprowadzenie pojedynczych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych w genie znakowanego his IFN-beta typu dzikiego, a następnie zastąpienie odmiennych sekwencji DNA między wybranymi miejscami restrykcyjnymi syntetycznymi dupleksami oligonukleotydowymi, które kodują mutacje z mi alaninowymi (lub serynowymi). Na koniec, zmutowane geny IFN wklonowano do plazmidu, który kierował ekspresją w komórkach ssaczych w linii komórkowej 293 ludzkiej nerki.

Funkcjonalne konsekwencje tych mutacji testowano w testach antywirusowych i antyproliferacyjnych. Opracowano nieradioaktywny test wiązania IFN w celu analizowania tych mutantów pod kątem wiązania się z receptorem powierzchniowym („kompleks”IFNAR1/2”) ludzkich komórek chłoniaka Daudi Burkitt'a. Ponadto, opracowano test do mapowania oddziaływań powierzchniowych pomiędzy mutantami his-IFN-beta i IFNAR2, który wykorzystuje białko fuzyjne IFNAR2/Fc, zawierające domenę zewnątrzkomórkową IFNAR2 będącego białkiem receptora IFN, z domenami zawiasową, CH2 i CH3 ludzkiej IgG1.

1. Wytwarzanie genu interferonu beta jako matrycy dla mutagenezy

Naszą strategię wytwarzania mutantów IFN-beta z podstawieniami alaninowymi (albo serynowymi) zastosowano najpierw do wytworzenia zmodyfikowanego genu IFN-beta, który koduje białko typu dzikiego, ale który zawiera pojedyncze miejsca restrykcyjne rozmieszczone wzdłuż genu. Pojedyncze miejsca restrykcyjne zastosowano do wymiany sekwencji typu dzikiego na syntetyczne dupleksy oligonukleotydowe, które kodują zmutowane kodony. W celu uzyskania kasety ekspresyjnej z ludzkim IFN-beta-1a odpowiedniej do wytwarzania zmutowanych genów, cDNA IFN-beta (GenBank nr dostępu #E00029) powielono przez PCR. W celu przeprowadzenia ukierunkowanej mutagenezy genu w plazmidzie nieposiadającym specyficznych miejsc restrykcyjnych, które będą wytwarzane przez mutagenezę konieczne było wstępne klonowanie genu IFN-beta w plazmidzie pMBJ107, pochodnej pACYC184, patrz Rose i wsp., 1988, Nucleic Acids Res. 16 (1) 355).

Startery PCR zastosowane do klonowania sekwencji kodujących ludzkiego genu IFN-beta umożliwiły nam również wprowadzenie sekwencji łącznikowej enterokinazy przed i w ramce z genem IFN-beta (starter PCR 5'

5'TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAG C-3' (Id. Sekw. Nr: 9: „BET-021”) i starter PCR 3' 5-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTG-TAAGTC-3'(Id. Sekw. Nr: 10: „BET-022”) oraz flankujące miejsca dla enzymów restrykcyjnych (BspEI i Xhol) przydatne do klonowania w miejscach plazmidu pMJB107. Otrzymany DNA jest określany jako fragment A PCR.

Wydajną sekwencję sygnałową z ludzkiej cząsteczki adhezyjnej z komórek naczyń (VCAM-1) oraz znacznik z sześcioma histydynami wprowadzono do ostatecznego konstruktu z drugiego fragmentu DNA wytworzonego z pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 jest pochodną pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z której usunięto gen EBNA-1 i która niesie sekwencję sygnałową VCAM-1(VCAMss) połączoną powyżej i w ramce ze znacznikiem z sześcioma histydynami. Starterami PCR, które zastosowano do wytworzenia części kasety VCAMssl/znacznik histydynowy były KID-369 (starter PGR 5'

5'AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3': Id. Sekw. Nr: 11) i KID421 (starter PCR 3' 5'CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3': Id. Sekw. Nr: 12) zawierające flankujące miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych (Notl i BspEI), które umożliwiają wycięcie fragmentu B DNA.

PL 200 586 B1

W celu wytworzenia wektora plazmidowego, który niesie sekwencję sygnałową VCAM-1, znacznik histydynowy i gen interferonu-beta, przeprowadzono trójskładnikową ligację oczyszczonych fragmentów DNA z wektora plazmidowego pMJB107 (przeciętego Notl i Xhol), fragmentu A PCR (przeciętego BspEI i Xhol) i fragmentu B (przeciętego Notl i BspEI). Do transformacji komórek E. coli JA221 lub XL1-Blue użyto plazmidu po ligacji, a kolonie oporne na ampicylinę wybrano i testowano pod kątem wstawki przez analizę mapy restrykcyjnej. Otrzymano preparaty DNA na dużą skalę i sekwencję wstawki weryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Otrzymany konstrukt nazwano pCMG260.

2. Wytwarzanie mutantów z podstawieniami alaninowymi ludzkiego interferonu-beta w pCMG260

Plazmidu pCMG260 użyto jako matrycy do wielu rund mutagenezy (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), która wprowadza pojedyncze miejsca restrykcyjne w pozycjach wzdłuż sekwencji kodującej białka IFN-beta, ale nie zmienia otrzymanej w rezultacie sekwencji białka. Poddane mutagenezie plazmidy zastosowano do transformacji szczepów E. coli JA221 i XL1-Blue, a zrekombinowane kolonie selekcjonowano na oporność na chloramfenikol. Kolonie oporne na chloramfenikol testowano dalej na obecność żądanych pojedynczych miejsc cięcia dla enzymu restrykcyjnego za pomocą analizy mapy restrykcyjnej DNA. Otrzymany plazmid IFN-beta, pCMG275.8, zawierał pełen zestaw pojedynczych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych, a sekwencję DNA genu weryfikowano. Pełna sekwencja DNA zmodyfikowanego genu interferonu beta, zawierającego znacznik histydynowy, oraz z sekwencją kodującą białko typu dzikiego jest pokazana na Fig. 1.

Pełen zestaw mutacji z podstawieniami alaninowymi jest przedstawiony w Tabeli 1. Nazwy mutantów określają specyficzne regiony strukturalne (helisy albo pętle), do których wprowadzono mutacje. Cały zestaw podstawień alaninowych (serynowych) dotyczy mutacji w 65 ze 165 aminokwasów ludzkiego IFN-beta.

Wytworzono zestaw mutantów pCMG275.8, przez wymianę odcinków DNA między pojedynczymi miejscami restrykcyjnymi przez syntetyczne dupleksy oligonukleotydowe, które niosły informację genetyczną przedstawioną w Tabeli 2. W celu wytworzenia plazmidów z rozmaitymi podstawieniami alaninowymi, oczyszczony z żelu wektor pCMG275.8 (przecięty odpowiednim enzymem restrykcyjnym, jak pokazano na liście poniżej dla każdego regionu strukturalnego IFN-beta) i dupleksy oligonukleotydowe (kodujące sekwencje nici są przedstawione w Tabeli 2) poddawano razem ligacji. Mieszanin ligacyjnych użyto do transformowania szczepu E. coli JA221, a zrekombinowane kolonie selekcjonowano na oporność na ampicylinę. Kolonie oporne na ampicylinę testowano na obecność wstawionych mutacji przez poszukiwanie odpowiednich miejsc restrykcyjnych. Dla dwóch mutantów (A2 i CD2), strategia klonowania zakładała zastosowanie dwóch syntetycznych dupleksów oligonukleotydowych (pokazanych w Tabeli 2), które niosą komplementarne wystające końce, aby umożliwić im ligację ze sobą i z wektorem zawierającym szkielet IFN-beta w ligacji trójskładnikowej. Następująca lista ilustruje miejsca, które zastosowano do klonowania zmodyfikowanych oligonukleotydów z Tabeli 2. Schemat klonowania (część B pokazuje pozycje pojedynczych miejsc restrykcyjnych w genie interferonu beta)

helisa A	BspEI do MunI lub Bg1ll do Pstl
pętla AB	MunI do Pstl lub MunI do BsaHI
helisa B	BspHI do Bsa1 lub BsaHI do Bsal
helisa C	Bsal do Xbal
pętla CD	Xbal do BspHI lub Xbal do Dralll
helisa D	BspHI do Dralll
pętla DE	BspHI do Pvul
helisa E	Pvul to BstEII

PL 200 586 Β1

Tabela 1:

Pozycje podstawień alaninowych mutacji ^HUIFN-B ' 10 20 30 40 50

IFN-β MSYNLLGFLQRS SNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIΡΕΕΙKQLQQFQKE

Al -A-AA--A--A-----------------------------------------A2 --------------AA-AA--AA-----------------------------AB1 ---------------------------AAA-AA-------------------AB2 -----------------------------------AA-A--A----------AB3 --------------------------------------------AAAAA-AAA |_helix A_| |_AB loop___

70 80 90 100

IFN-β DAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKE

BI ----------A--AS----------------------------------------B2 -----------------AAA-----------------------------------Cl ---------------------------AS--AA--S-------------------C2 --------------------------------------A---A--AA--------CDI -------------------------------------------------AA--AAA |_helix B_| |_| |_CD loop_

110 120 130 140 150 ISO

IFN-β DFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN

CD2 AA-A--A--A----------------------------------------------β ------------------A-AA--A-------------------------------DE1 --------------------------AA----------------------------DE2 -----------------------------AA-------------------------g --------------------------------------A---A--A--A-------CD loop_| |_helix D_j_helix E_j

Linia określana jako INF-β przedstawia sekwencję INF-β typu dzikiego. Dla każdego mutanta pokazano podstawienia alaninowe lub serynowe reszt INF-β, a kreski poniżej odpowiednich regionów oznaczają sekwencję typu dzikiego. Struktury helis oraz pętli pokazano jako linie proste pod sekwencjami mutantów. Pętla DE rozciąga się pomiędzy helisami D i E. Wytworzono dwa dodatkowe mutanty z podstawieniami alaninowymi (H93A, H97A oraz HI21 A), a następnie analizowano w teście antywirusowym w celu zbadania efektów zamocowania tych histydyn, które helatują cynk w strukturze dimerycznej. Oba mutanty zachowały aktywność formy nie zmutowanej w testach antywirusowych, co sugeruje, że dimcryzacja z udziałem cynku nie jest istotna dla aktywności IFN-β.

PL 200 586 Β1

Tabela 2

Al	Id. Sekw. Nr: 13	CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTT
	BET-053	GGAGCCCTACAAGCTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAA
		GCTCCTGTGGC
A2	Id. Sekw. Nr: 14	GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCC
	BET-039	TTGAATGGGAGGCTTGAATACT
	Id. Sekw. Nr: 15	GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAG
	BET-041	ATTAAGCAGCTGCA
AB1	Id. Sekw. Nr: 16	AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGG
	BET-080	ATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AB2	Id. Sekw. Nr: 17	AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGG
	BET-082	GCTGCATTTGCTATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AB 3	Id. Sekw. Nr: 18	AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGG
	BET-084	ATGAACTTTGACA
	Id. Sekw. Nr: 19	TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCA
	BET-086	GCTGA
BI	Id. Sekw. Nr: 20	CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCG
	BET-110	CTAGCATTTTCAGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGG
		AA
B2	Id. Sekw. Nr: 21	CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCT
	BET-112	TTGCTATTTTCGCTGCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGG
		AA
Cl	Id. Sekw. Nr: 22	GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTC
	BET-114	TATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTTCTAG
C2	Id. Sekw. Nr: 23	GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTC
	BET-092	GCTCATCAGATAGCACATCTGGCTGCAGTTCTAG
CDI	Id. Sekw. Nr: 24	CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGG
	BET-094	AAAACT

PL 200 586 B1

CD2	Id. Sekw. Nr: 25	CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGG
	BET-096	AAAAGCAATGAGCGCGCTGCACCTGAAAAGA
	Id. Sekw. Nr: 26	TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGA
	BET-106	GTACTCACACTGT
Dl	Id. Sekw. Nr: 27	CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAA
	BET-108	TTGCTGCATACCTGGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
DE1	Id. Sekw. Nr: 28	CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGA
	BET-116	TTCTGCATTACCTGAAGGCCGCTGCATACTCACACTGT
		GCCTGGACGAT
DE 2	Id. Sekw. Nr: 29	CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGA
	BET-118	TTCTGCATTACCTGAAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGT
		GCCTGGACGAT
El	Id. Sekw. Nr: 30	CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTG
	BET-104	CAAGACTTACAG

B. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych EBNA 293

Geny IFN-beta typu dzikiego i zmutowane geny IFN-beta, połączone z sekwencją sygnałową VCAM-1, znacznikiem histydynowym i sekwencją łącznikową enterokinazy oczyszczono z żelu jako 761 zasadowe fragmenty restrykcyjne NotI i BamHI. Oczyszczone geny sklonowano w przeciętym NotI i BamHI wektorze plazmidowym pDSW247, który jest pochodną pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, Ca). Plazmid pDSW247 jest wektorem ekspresyjnym do przejściowej ekspresji białek w komórkach ludzkiej nerki EBNA293 (Invitrogen, Carlsbad, Ca). Zawiera on wczesny promotor genu cytomegalowirusa i elementy regulacyjne EBV, które są wymagane do uzyskiwania wysokiej ekspresji genów w tym układzie, jak również markery selekcyjne dla E. coli (oporność na ampicylinę) i komórek EBNA293 (oporność na higromycynę). Poddane ligacji plazmidy użyto do transformacji komórek E. coli JA221 lub XL1-Blue, a kolonie oporne na ampicylinę wybrano i testowano pod kątem wstawki przez analizę mapy restrykcyjnej. Otrzymano preparaty DNA na dużą skalę, a sekwencję wstawki zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Pozytywne klony zawierające żądane zmutagenizowane sekwencje zastosowano do transfekowania komórek ludzkiej nerki EBNA293.

Schemat strategii klonowania i ekspresji jest przedstawiony na Fig. 12.

C. Ekspresja i oznaczenie ilościowe mutantów IFN-beta-1a z podstawieniami alaninowymi

Ludzkie komórki EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. (1989) J. Virol. 63: 3016-3025) utrzymywano jako subkonfluentne hodowle w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminy i 250 ng/ml genetycyny Geneticin (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Plazmidy ekspresyjne pDSW247 transfekowano przejściowo do komórek EBNA 293 przy użyciu protokołu z lipofektaminą (Gibco/BRL, Life Technologies). Kondycjonowaną pożywkę zbierano 3-4 dni po transfekcji, usuwano debris komórkowe przez wirowanie i stężenie his-IFN-beta oznaczano ilościowo w teście ELISA.

Test ELISA przeprowadzono używając króliczych poliklonalnych przeciwciał (IgG oczyszczone na białku A, przeciwciała wytworzone przeciw oczyszczonemu ludzkiemu IFN-beta-1a) do opłaszczenia 96-studzienkowych płytek ELISA, a biotynylowanej postaci tych samych poliklonalnych króliczych przeciwciał użyto jako odczynnika drugorzędowego do umożliwienia wykrywania interferonu przy zastosowaniu

PL 200 586 B1 połączonej ze streptawidyną peroksydazy z chrzanu (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove. PA). W celu sporządzenia standardowej krzywej rozcieńczeń użyto serię rozcieńczeń interferonu-beta-1a (s^przedawan^y jako AVONEX® ^przez Biogen, Mc.). Kon^dycjonowane ^po^żyw^ki z bansfeMantów EBNA zawierające his-IFN-beta rozcieńczano tak, aby otrzymać próbki o stężeniach w zakresie od 10 ng/ml do 0,3 ng/ml w teście ELISA. W celu potwierdzenia stężeń IFN-beta w pożywkach, określonych przez ELISA, przeprowadzono analizę Western blot. Zredukowane supernatanty z hodowli i standardy IFNbeta-1a poddano SDS-PAGE w 10-20% żelach gradientowych (Novex, San Diego, CA) i przeniesiono na filtry PDVF. Prążki wykazujące reakcję immunologiczną wykrywano przy zastosowaniu króliczej poliklonalnej surowicy odpornościowej anty-IFN-beta-1a (#447, Biogen, Inc., drugiej surowicy odpornościowej, którą uzyskano przeciw IFN-beta-1a), a następnie traktowano połączoną z HRP oślą antykróliczą IgG (Jackson ImmunoResearch, W. Grove. PA).

D. Badanie mutantów interferonu-beta pod kątem wiązania się z receptorem

Właściwości wiązania się z receptorem mutantów interferonu-beta opisanych w części C oceniano przy pomocy dwóch różnych testów wiązania. W jednym z nich mierzono wiązanie mutantów interferonu-beta z białkiem fuzyjnym, IFNAR2/Fc, składającym się z zewnątrzkomórkowej domeny łańcucha receptora ludzkiego IFNAR2 połączonej ze stałą częścią ludzkiej IgG. IFNAR2-Fc wyrażono w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) i oczyszczono zgodnie z instrukcją producenta (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, nr katalogowy #20334) metodą chromatografii powinowactwa do białka A-sefaroza. Wiązanie mutantów interferonu-beta do IFNAR2-Fc zmierzono metodą ELISA. Płytki ELISA przygotowano przez opłaszczenie studzienek 96-studzienkowych płaskodennych płytek przez noc w temperaturze 4°C używając 50 μΙ/na studzienkę mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiej IgG1 (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) o stężeniu 10 μg/ml w buforze opłaszczającym (50 mM NaHCO₃, 0,2 mM MgCl₂, 0,2 mM CaCl₂, pH 9,6). Płytki płukano dwukrotnie PBS zawierającym 0,05 % Tween20 i blokowano 0,5 % odtłuszczonym suchym mlekiem w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po dodatkowym dwukrotnym płukaniu do każdej studzienki dodawano 50 μl roztworu 1 μg/ml IFNAR2-Fc w 0,5 % mleku w PBS zawierającym 0,05 % Tween-20 i inkubowano jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie płytki płukano dodatkowo jeszcze dwa razy. Wiązanie mutantów interferonu-beta z IFNAR2-Fc mierzono przez dodanie 50 μl/studzienkę mutanta interferonu-beta w kondycjonowanej pożywce, seryjnie rozcieńczono w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i inkubowano przez dwie godziny w 4°C. Rozcieńczenia zmutowanego interferonu-beta typowo były w zakresie od około 1 μM do 10 pM. Po przepłukaniu interferon-beta związany z płytkami wykrywano przez dodanie 50 μl/studzienkę mieszaniny składającej się z poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-interferonowego (# 447, Biogen, Inc.) w rozcieńczeniu 1:1000 oraz oślego przeciwciała przeciw króliczej IgG wyznakowanego peroksydazą chrzanową (HRP) (Jackson ImmunoResearch) i inkubowano 15 minut w 4°C. Po dwóch płukaniach dodawano substrat HRP, po czym płytkę inkubowano w 4°C przed odczytem w czytniku płytek ELISA przy długości fali 450 nm. Wyniki wykreślano jako absorbancję wobec stężenia zmutowanego interferonu-beta, a powinowactwo wiązania zmutowanego interferonu-beta z IFNAR2-Fc określano przez dostosowanie danych do prostego hiperbolicznego równania wiązań. Wyniki takich analiz przedstawiono na Fig. 3, na której powinowactwo wiązań dla każdego mutanta, określone w minimum 3 niezależnych eksperymentach, wyrażono jako procent w stosunku do wartości uzyskanych dla His6-dzikiego typu interferonu-beta.

Drugą analizę wiązań z receptorem stosowano do pomiaru powinowactwa, z którym mutanty interferonu-beta wiążą się z komórkami Daudi wyrażającymi oba łańcuchy receptora, IFNAR1 i IFNAR2, które razem składają się na receptor interferonu-beta. Taka analiza oparta na FACS korzysta z blokujących przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw domenom zewnątrzkomórkowym IFNAR1, EA12 (Biogen Inc.), aby odróżnić wolny receptor od receptora, z którym związany jest interferon-beta. Komórki Daudi (20 μl przy 2,5 x 10⁷ komórek/ml) umieszczono w studzienkach 96-studzienkowych płytek o dnach w kształcie-V, a następnie inkubowano 1 godzinę w 4°C z różnymi stężeniami zmutowanego interferonubeta (20 μl w buforze FACS, 5% FBS, 0,1% NaN₃ w PBS). Żądane seryjne rozcieńczenia zmutowanego interferonu-beta wynoszą od 0,5 μM w dół do 0,5 pM. Do każdej studzienki dodawano 100 ng biotynylowanego mysiego anty-IFNAR1 monoklonalnego przeciwciała EA12 (10 μΙ), a następnie płytki inkubowano 2 minuty w temperaturze pokojowej przed dwukrotnym przemyciem buforem FACS (4°C). Komórki inkubowano 30 minut w 4°C z 50 μl/studzienkę roztworu koniugatu R-fikoerytryna-streptawidyna o rozcieńczeniu 1:200 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), płukano 2 razy buforem FACS, zawieszono w 300 (μΙ buforu FACS zawierającego 0,5% paraformaldehydu, po czym przenoszono do polistyrenowych

PL 200 586 B1 probówek 12x75 mm (Falcon 2052). Następnie próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej na FACScan (Becton Dickinson). Wyniki wykreślano jako średnią intensywność fluorescencji kanałowej (MFCI) w funkcji stężenia zmutowanego interferonu-beta; powinowactwo wiązań określano jako stężenie zmutowanego interferonu-beta dające 50% zahamowania barwienia przeciwciała. Każdy mutant badany był wiele razy. Na Fig. 4 przedstawiono powinowactwa wiązań receptora dla każdego mutanta interferonu-beta, określone niniejszą metodą, wyrażone jako procent powinowactwa zmierzonego dla His6-dzikiego typu interferonu-beta-1a w każdym doświadczeniu.

E. Testowanie mutantów interferonu-beta pod kątem funkcji

Mutanty interferonu-beta badano również pod kątem aktywności funkcjonalnej stosując testy in vitro dotyczące aktywności antywirusowej oraz pod kątem zdolności interferonu-beta do hamowania proliferacji komórek. Dla każdego mutanta przeprowadzano minimum trzy badania antywirusowe, każde z trzema punktami zbierania danych. Do każdego badania jako odniesienie włączono His6-interferon-beta-1a dzikiego typu. Testy antywirusowe przeprowadzono traktując przez noc komórki A549 ludzkiego raka płuc (ATCC CCL 185) serią dwukrotnych rozcieńczeń zmutowanego interferonu-beta przy stężeniach, które obejmowały zakres między pełną ochroną antywirusową i brakiem ochrony przed zabijaniem komórek przez wirusa. Następnego dnia komórki prowokowano przez dwa dni wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (ECMV) w rozcieńczeniu, które prowadziło do całkowitego zabicia komórek przy braku interferonu. Następnie płytki wywoływano przy zastosowaniu metabolicznego barwnika MTT (2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfo-fenylo]-2H-tetrazolo-5-karboksyanilid) (M-5655-Sigma-St.Louis, MO). Roztwór podstawowy MTT przygotowano w stężeniu 5 mg/ml w PBS i sterylizowano przez filtrowanie, po czym 50 μΙ tego roztworu rozcieńczano do hodowli komórkowych (100 μΙ/studzienkę). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut, roztwór MTT/pożywka odrzucano, komórki przepłukiwano 100 μl PBS i w końcu metabolizowany barwnik rozpuszczono w 100 μl 1,2 N kwasu solnego i 90% izopropanolu. IIość komórek, które przeżyły (co wykrywano przez obecność zabarwienia) oznaczano przez absorbancję przy 450 nm. Wyniki analizowano wykreślając absorbancję wobec stężenia zmutowanego interferonu-beta, a aktywność każdego mutanta określono jako stężenie, przy którym 50% komórek zostało zabitych. Na Fig. 5 przedstawiono aktywność każdego mutanta wyrażoną jako procent aktywności zmierzonej dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym w każdym doświadczeniu.

Mutanty interferonu-beta badano również pod kątem działania w testach antyproliferacyjnych. Ludzkie komórki chłoniaka Daudi Burkitt'a (ATCC#CCL 213) posiano w ilości 2x10⁵ komórek/ml RPMI 1620 uzupełnionej 10% zdefiniowaną płodową surowicą cielęcą (Hyclone, Logan, Utah) i 2 mM L-glutaminy. Każda studzienka zawierała również podane stężenie zmutowanego interferonu-beta w objętości końcowej 100 μl pożywki/studzienkę; stężenie używanego interferonu-beta wybrano tak, aby pokryć zakres od maksymalnego zahamowania proliferacji komórek Daudi do braku zahamowania (tj. pełnej proliferacji). Dla każdego stężenia badanego mutanta interferonu-beta zbierano dane eksperymentalne w dwóch powtórzeniach, a do wszystkich eksperymentów włączano dwa zestawy komórek nie traktowanych. Komórki inkubowano dwa dni w 30°C w inkubatorze z 5% CO₂, po czym do każdej studzienki dodano 1 μ Ci trytowanej tymidyny ( (metylo-³H tymidyna), Amersham TRK758) w 50 μl pożywki i inkubowano dalej przez 4 godziny. Komórki zebrano przy pomocy urządzenia do zbierania z płytek LKB, a wbudowanie trytowanej tymidyny mierzono przy zastosowaniu beta-czytnika do płytek LKB. Wartości z powtórzonych eksperymentów uśredniono i wyliczono odchylenie standardowe. Wyniki przedstawiano jako średnie zliczenie/minutę wobec stężenia zmutowanego interferonubeta, a aktywność każdego mutanta zdefiniowano jako stężenie wymagane do uzyskania 50% zaobserwowanego maksymalnego zahamowania wzrostu. Dla każdego mutanta przeprowadzono wielokrotne badania. Na Fig. 4 przedstawiono wyniki wyrażone jako procent aktywności stwierdzanej dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem his w każdym eksperymencie.

F. Właściwości mutantów interferonu-beta

Stwierdzono, że intrferon-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym w testach antywirusowych i antyproliferacyjnych wykazuje aktywności, które były w obu przypadkach około 3 razy niższe niż odpowiadające aktywności znalezione dla interferonu-beta-1a typu dzikiego bez znacznika. Ponieważ wszystkie mutanty interferonu-beta A1-E zawierają identyczne sekwencje znacznika tag na końcu N, wpływ mutacji na właściwości cząsteczki określano przez porównanie aktywności tych mutantów w badaniach antywirusowych, antyproliferacyjnych i wiązania w stosunku do aktywności obserwowanej dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym. Działając w ten sposób zakładamy, że różnice w aktywności mutantów A1-E w porównaniu z interferonem-beta-1a typu

PL 200 586 B1 dzikiego ze znacznikiem histydynowym są ilościowo i jakościowo mniej więcej takie same, jak efekty, jakie z tymi samymi mutacjami uzyskuje się przy braku N-końcowego znacznika his. Równoznaczne założenie dla konstruktów zawierających znacznik albo fuzję innych rozpuszczalnych cytokin w wielu przypadkach okazało się prawdziwe przy stosowaniu przez badaczy techniki skaningowej mutagenezy alaninowej, szczególnie gdy aktywność funkcjonalna in vitro konstruktów zawierających znacznik albo fuzję jest zbliżona do cytokiny typu dzikiego, jak w przypadku tu przedstawionym. Patrz na przykład Pearce K.H. Jr, i wsp.., J. Biol. Chem. 272:20595-20602 (1997) i Jones J.T., i wsp.., J. Biol. Chem. 273:11667-11674 (1998).

Dane przedstawione na Fig. 3-6 sugerują trzy rodzaje efektów spowodowanych ukierunkowaną mutagenezą. W pewnych warunkach efekty te mogą być korzystne dla rozwoju leków interferonowych. Trzy rodzaje efektów są następujące: (a) mutanty z aktywnością antywirusową wyższą niż w przypadku interferonu-beta-1a typu dzikiego (np. mutant C1); (b) mutanty, które wykazują aktywność w obu testach, zarówno antywirusowych jak i antyproliferacyjnych, ale dla których aktywność antyproliferacyjna jest nieproporcjonalnie niska w stosunku do aktywności antywirusowej w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego (np. mutanty C1, D i DE1); oraz (c) funkcjonalni antagoniści (np. A1, B2, CD2 i DE1), którzy wykazują aktywności antywirusową i antyproliferacyjną nieproporcjonalnie niższe w stosunku do wiązania receptora w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego. Można zauważyć, że niektóre mutanty należą do więcej niżej jednej klasy. Przegląd tych klas przedstawiono dalej. Jakkolwiek scharakteryzowaliśmy te klasy mutantów w odniesieniu do wymienionych przykładów, należy zdawać sobie sprawę, że inne mutacje w tych regionach mogą mieć podobny lub nawet większy wpływ na aktywność.

a) Mutant C1 ma aktywność antywirusową około 6 razy wyższą niż interferon-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem his. Przewiduje się, że mutant ten, i inne tego typu, mogą być przydatne w zmniejszaniu ilości interferonu-beta, który należy podawać, aby osiągnąć żądany poziom działania antywirusowego. Oczekuje się, że obniżając ilości podawanego białka zmniejszy jego immunogenność i może również zredukować działania ubocznego wynikające z toksyczności niezwiązanej z mechanizmem działania. Przewiduje się, że mutacje w tej klasie będą korzystne w sytuacjach, gdy terapeutyczna korzyść przy podawaniu interferonu-beta wynika z jego działania antywirusowego, i gdzie efekty antyproliferacyjne przyczyniają się do toksyczności lub niepożądanych efektów ubocznych.

b) Względne aktywności (% dzikiego typu) mutantów z podstawieniami alaninowymi w testach antywirusowych i antyproliferacyjnych przedstawiono na Fig. 7. U większości mutantów (położonych na liniach przekątnych) obserwuje się skoordynowaną zmianę aktywności (tzn. aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne różnią się o ten sam współczynnik od aktywności interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym). Kilka mutantów, jednakże, wykazuje większe zróżnicowanie w aktywności w jednym teście w stosunku do drugiego, a w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym, co widać jako odsunięcie się od linii przekątnej. Trzy takie mutanty przedstawiono w Tabeli poniżej. Mutant C1 wykazuje aktywność antywirusową około 6-krotnie wyższą niż interferon-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym, ale jego aktywność w teście antyproliferacyjnym jest podobna jak u typu dzikiego. Mutant C1 wykazuje zatem aktywność antywirusową zwiększoną 5,2-krotnie ponad aktywność antyproliferacyjną w stosunku do interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym. Podobnie mutant D wykazuje 65% aktywności typu dzikiego w teście antywirusowym, ale tylko 20% w stosunku do aktywności typu dzikiego w teście antyproliferacyjnym, tak więc aktywność antywirusową ma podwyższoną 3,4-krotnie w stosunku do swej aktywności antyproliferacyjnej w porównaniu z typem dzikim. Mutant DE1 wykazuje 26% aktywności typu dzikiego w teście antywirusowym i tylko 8,5% w teście antyproliferacyjnym, a więc ma aktywność antywirusową zwiększoną 3,0-krotnie w stosunku do swojej aktywności antyproliferacyjnej w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym. Jeżeli białka tego mutanta podaje się w stężeniu wystarczającym do osiągnięcia żądanego poziomu aktywności antywirusowej, wykażą one istotnie niższy poziom aktywności antyproliferacyjnej niż białka typu dzikiego. Mutacje w tej klasie, podobnie jak mutanty w klasie (a), są prawdopodobnie przydatne w sytuacjach, w których korzyść terapeutyczna przy podaniu interferonu-beta wynika z efektów antywirusowych i gdzie efekty antyproliferacyjne przyczyniają się do toksyczności i niepożądanych skutków ubocznych.

PL 200 586 B1

Mutant	Aktywność antywirusowa (AV) (% typu dzikiego)	Aktywność antyproliferacyjna (AP) (% typu dzikiego)	AV/AP
C1	571	109	5,2
D	65	19	3,4
DE1	26	8,5	3,0

(c) Mutanty o aktywnościach antywirusowych i antyproliferacyjnych, które są niskie w odniesieniu do wiązania się z receptorem w porównaniu z interferonem-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym (patrz Tabela, poniżej). Mutant A1 wykazuje aktywności antywirusowe i antyproliferacyjne, które są 2-krotnie i 1,8-krotnie wyższe niż te, które stwierdza się dla interferonu-beta-1a typu dzikiego ze znacznikiem histydynowym, ale wiążą się z pokrewnym receptorem na komórkach Daudi z powinowactwem 29-krotnie wyższym niż typ dziki. Wiązanie mutanta z receptorem IFN-beta jest zwiększone około 15 razy w porównaniu z antywirusową i antyproliferacyjną aktywnością białek. Podobnie, mutanty B2, CD2 i DE1 wykazują wzmożone wiązanie w stosunku do aktywności antywirusowej, odpowiednio 4,6-, 4,6- i 18-krotnie, a w stosunku do aktywności proliferacyjnej odpowiednio, 3, 5-, 15- i 54-krotnie. Przewiduje się, że białka te będą przydatne jako funkcjonalni antagoniści endogennego IFN-beta i prawdopodobnie innych endogennych interferonów Typu I, ponieważ mają zdolność do wiązania się z receptorem i zajmowania receptora, a zatem będą dawać jedynie małą część odpowiedzi funkcjonalnej w docelowych komórkach, obserwowanej dla IFN-beta typu dzikiego.

Mutant	Aktywność antywirusowa (AV) (% typu dzikiego)	Aktywność antyproliferacyjna (AP) (% typu dzikiego)	Aktywność wiązania komórek (% typu dzikiego)	Wiązanie/AV	Wiązanie/AP
A1	200	180	2900	15	16
B2	7,1	9,2	33	4,6	3,5
CD2	150	46	690	4,6	15
DE1	26	8,5	460	18	54

G. Powiązanie mutein z trójwymiarową strukturą interferonu

Jakkolwiek opublikowane struktury krystaliczne nieglikozylowanych form mysiego/szczurzego interferonu beta (T. Senda, S. Saitoh and Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon-β at 2,15 A Resolution. J. Mol. Biol 253: 187-207 (1995) i ludzkiego interferonu alfa-2b (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P. Reichert, P.P Trotta, T.L. Nagabhushan and M.R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-a2b Revealed by X-ray Crystallography. Structure. 4: 14531463 (1996) dostarczyły modeli dla szkieletu polipeptydowego ludzkiego interferonu-beta, ostatnio określiliśmy strukturę interferonu-beta-1a w postaci glikozylowanej (M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb, and S.E Goelz. The Crystal Structure of Human Interferon-β at 2.2 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818 (1997)).

Wyniki naszych analiz dotyczących mutacji można podsumować w odniesieniu do struktury trójwymiarowej interferonu-beta-1a (tu nie przedstawiona). Niektóre zmutowane reszty spowodowały obniżenie aktywności (2 do 5-razy). Mutowane obszary odpowiadają podstawieniom przedstawionym w Tabelach 1 i 2.

Mutacje, które mają największy wpływ na funkcję, prowadziły do dramatycznego spadku zarówno aktywności, jak i wiązania komórkowego receptora powierzchniowego. Mutacje w tym regionie (helisa A2, pętla AB i AB2 oraz helisa E) odpowiadają mutacjom w miejscu wiązania się z IFNAR2, ponieważ żaden z tych mutantów nie wiąże się z IFNAR/Fc w naszym teście.

Jakkolwiek te mutacje, które były ważne dla wiązania IFNAR 2, wpływały również na wiązanie się z komórką, na właściwości wiązania się z powierzchnią komórki mają również wpływ reszty w innych regionach cząsteczki (helisa B1, helisa C2). Można zauważyć w modelu trójwymiarowym (nie przedstawionym) pokazującym wpływ podstawień alaninowych, że N-końcowe, C-końcowe i glikozylowane

PL 200 586 B1 regiony helis C w cząsteczce IFN-beta-la nie są położone w miejscu wiązania się z receptorem. Mutacje w tych obszarach nie zmniejszają aktywności biologicznej ani nie zmniejszają wiązania się z powierzchniowym receptorem komórkowym.

P r z y k ł a d 2: Konstrukcja plazmidów do ekspresji białek fuzyjnych z interferonem-beta-1a (IFN-beta/Fc)

Technologię PCR zastosowano do wytworzenia plazmidu ekspresyjnego zawierającego sekwencję DNA ludzkiego IFN-beta połączoną z częścią Fc cząsteczki łańcucha ciężkiego mysiej IgG2a. Plazmid wektorowy pDSW247 (Patrz Przykład 1) jest pochodną pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z której usunięto gen EBNA-1. Plazmidu tego użyto do konstrukcji wektora ekspresyjnego przydatnego do przejściowej ekspresji białek w komórkach ludzkiej nerki EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen. E. S., i wsp.. 1995, Gene 156, 235-239). Został on zaprojektowany w taki sposób, aby zawierał sekwencję sygnałową z ludzkiej cząsteczki adhezyjnej z komórek naczyń (VCAM-1) w ramce odczytu i powyżej sekwencji interferonu beta oraz sekwencję łącznikową enterokinazy na granicy między sekwencjami interferonu beta i Ig.

Kasetę ekspresyjną dla białka fuzyjnego złożono z kilku fragmentów DNA. W celu otrzymania fragmentu DNA kodującego ludzki gen IFN-beta, cDNA subklonu ludzkiego IFN-beta (GenBank nr dostępu #E00029) zastosowano jako matrycę do PCR wykorzystującego startery (5'GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC ( Id. Sekw. Nr: 31: „BET-025”) i

5'GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG (Id. Sekw. Nr: 32: „BET-026”), która zawiera również miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego (Bsal) powyżej pierwszego kodonu IFN-beta. Starter 3' PCR (Id. Sekw. Nr: 32: BET 026) dla genu IFN-beta wyeliminował kodon terminacyjny IFN-beta i wbudował w ramce odczytu sekwencję łącznikową enterokinazy (DDDDK) oraz końcowe miejsce dla enzymu restrykcyjnego (Xhol), przydatne do klonowania w wektorze ekspresyjnym. Miejsce Bsal wprowadzone powyżej sekwencji kodującej IFN-beta umożliwiło nam dołączenie przez ligację sekwencji sygnałowej VCAM-1 i sekwencji kodującej genu IFN-beta w ramce odczytu. Ta sekwencja sygnałowa VCAM-1 została również wytworzona przez PCR przy zastosowaniu pary starterów 5'-CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3' (Id. Sekw. Nr: 33: „BET-023” 5'-GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3' (Id. Sekw. Nr: 34: „BET-024”), które zawierają miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego (Notl, do ligacji miejsca klonowania Notl pDSW247) po stronie 5' i miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego (Bsal, do ligacji fragment PCR IFN-betala 5') po stronie 3'. Matrycą do reakcji PCR było cDNA ludzkiej cząsteczki adhezyjnej z komórek naczyń (VCAM-1) (GenBank numer dostępu X53051).

W celu wytworzenia fuzji genowej IFN-beta-1a/Fc zastosowano następujące procedury. Fragment mysiej IgG2a wyizolowano z pEAG293 przez oczyszczenie z żelu fragmentu DNA po trawieniu SalI + BamHI. Plazmid pEAG293 to sklonowane w Bluescript IISK+ (Stratagene, LaJolla CA, catalogue #212205) domeny zawiasowa, CH2 i CH3 mysiej IgG2a (GenBank numer dostępu VOO798). Para starterów do PCR 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3' (Id. Sekw. Nr: 35), gdzie S=C lub G, M=A lub C, R=A lub G, W=A lub T, i 5'-CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3' (Id. Sekw. Nr: 36) wytwarzała flankujące miejsca Sall i Notl na końcach 5' i 3' kasety, odpowiednio. Kaseta dla domeny Fc mysiej IgG2a różni się od sekwencji w GenBank jedną zasadą (kodon V369), co jest mutacją cichą. A zatem z tej kasety Fc IgG2a Fc wytwarzane jest białko Fc typu dzikiego.

Fragment DNA zawierający sekwencję sygnałową VCAM-1 połączoną z genem huIFNbeta z C-końcową sekwencją łącznikową enterokinazy, wycięto z pCMG258 przez trawienie Notl i BamHI i oczyszczono w żelu. Miejsce SalI obecne w wyjściowym plazmidzie pDSW247 znajduje się bezpośrednio w ramce z sekwencją kodującą genu IFNbeta. Wektor plazmidowy pDSW247 otrzymano jako oczyszczony z żelu fragment Notl + BamHI (patrz Przykład 1). Przeprowadzono trójskładnikową ligację przy zastosowaniu wspomnianych wyżej fragmentów w celu złożenia końcowego wektora ekspresyjnego kodującego fuzję IFNbeta-1a/IgG2a. Ten plazmid ekspresyjny nazwano pCMG261 i zawiera on sekwencję sygnałową VCAM-1 połączoną z genem dojrzałego ludzkiego IFNbeta, sekwencją łącznikową enterokinazy oraz domeną Fc mysiej IgG2a. Pełna sekwencja DNA (Id. Sekw. Nr: 1) i (Id. Sekw. Nr:2) białka fuzyjnego jest pokazana na Fig. 2.

P r z y k ł a d 3: Wytwarzanie fuzji białkowej interferonu-beta-1a w komórkach ssaczych

Zrekombinowany wektor do ekspresji IFN-beta/Fc, pCMG261 był przejściowo transfekowany do komórek ludzkiej nerki EBNA 293 w celu uzyskania ekspresji białka fuzyjnegoIFN-beta-1a według wynalazku. Ten zrekombinowany plazmid ekspresyjny transfekowano przy zastosowaniu protokołu

PL 200 586 B1 lipofektaminy (nr katalogowy #18324-020, Life Techonologies) do komórek ludzkiej nerki EBNA 293 zgodnie z protokołem producenta (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Hawley-Nelson, P., Ciccarone, V., Gebeyehu, G. Jessee, J., Felgner, P. L. (1993) Focus 15.73) przy zastosowaniu 1-3 mikrogramów plazmidowego DNA na 100 mm szalkę hodowlaną z komórkami EBNA 293. Dzień po lipofektaminowej transfekcji komórek, pożywkę wymieniano na pożywkę hodowlaną (pożywka Dulbecco's Modified Eagle's medium, uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą, 4 mM glutaminy i 250 ug/ml genetycyny (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Kondycjonowaną pożywkę zbierano 3-4 dni po transfekcji i stężenie IFN-beta-1a oznaczano ilościowo jak opisano poniżej.

Wytwarzanie białka fuzyjnego IFN-beta/Fc w układach ekspresji w komórkach ssaczych i komórkach prokariotycznych można również uzyskać po przeniesieniu regionu kodującego białko dla białka fuzyjnego do wektorów ekspresyjnych odpowiednich dla tych układów. Alternatywne układy ekspresyjne obejmują układy ekspresji w komórkach ssaczych, takich jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) (Barsoum, J. (1995, Methods in Mol. Biol. 48, rozdział 18. 225-237) i mysie komórki NS-0 (Rossman, C. i wsp. 1996, Protein Expression and Pur. 7. 335-342) oraz komórki nerki zielonej małpy COS7 (Ettinger, R. i wsp. 1996, Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 93:23, 13102-13107). Inne eukariotyczne układy ekspresyjne, które mogą mieć zastosowanie, to drożdże Pichia pastoris (Eldin, P. E. i wsp.. 1997, J. Immun. Methods, 201, 67-75 ) i Saccharomyces cerevisiae (Horwitz, A. H., 1988, Proc. Natil. Acad. Sci. USA, 85, 8678-8682).

Oznaczenie ilościowe poziomów ekspresji białka IFN-beta-1a-Fc w supernatantach z hodowli transfekowanych komórek EBNA 293 przeprowadzono przy zastosowaniu testu ELISA z użyciem frakcji IgG króliczych poliklonalnych przeciwciał przeciwko INF-beta-1a oczyszczonej na białku A (antygenem był oczyszczony IFN-beta-1a, Biogen, Inc.) do opłaszczenia 96-studzienkowych płytek. Przeciwciało wykrywa IFN-beta-1a jako standard i supernatanty w pożywce hodowlanej w zakresie stężeń interferonu między 10 ng/ml i 0,3 ng/ml. Biotynylowane królicze poliklonalne przeciwciała anty-IFN-beta-1a (te same przeciwciała co powyżej) i połączoną ze streptawidyną peroksydazę chrzanową użyto do wykrywania związanych interferonów. W celu potwierdzenia wartości z testu ELISA, przeprowadzono analizę Western blot, w której zredukowane supernatanty z hodowli i standardy IFN-beta-1a poddano SDS-PAGE w 5-20% żelach Tris-glicyna (Novex, San Diego, CA), przeniesiono na filtry PDVF (Amersham Life Science, Inc., Cleveland. OH) i wykrywano przy użyciu różnych poliklonalnych surowic króliczych (otrzymanych przeciw IFN-beta-1a), a następnie oślich anty-króliczych przeciwciał IgG połączonych z peroksydazą chrzanową (Jackson ImmunoResearch, W. Grove. PA).

P r z y k ł a d 4: Aktywność antywirusowa białka fuzyjnego IFN-beta-1a/mysia IgG2a

Ludzkie komórki raka płuc (A549) traktowano wstępnie przez 24 godziny IFN-beta-1a lub IFN-beta-mysia IgG2a (61,41,27, 18, 12, 8,2, 5,5, 3,7, 2,5, 1,6 pg/ml) przed prowokacją wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV). Po dwóch dniach inkubacji z wirusem, żywe komórki barwiono roztworem XTT:sól wewnętrzna PMS (2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolo-5-karboksanilidu:metosiarczan fenazyny, w stężeniu 333 ug/ml i 2 ng/ml, odpowiednio, w buforowanym fosforanem roztworze soli) i wykrywano przez spektroskopię przy 450 nM. Test przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla każdego stężenia IFN.

Na Fig 8. odchylenia standardowe są pokazane jako pionowe kreski. 50% efekt cytopatyczny IFN-beta-1a określono na około 0,4 pM. Stwierdzono, że 50% efekt cytopatyczny IFN-beta-mysi IgG2a wyniósł 0,15 pM.

P r z y k ł a d 5: Konstrukcja i wytwarzanie białka fuzyjnego ludzki interferon beta-1a/Fc ludzka IgG1

A. Konstrukcja białka fuzyjnego ludzki interferon beta-1a/Fc ludzka IgG1

Technologię PCR zastosowano do wytworzenia i ekspresji plazmidu zawierającego sekwencję DNA ludzkiego IFN beta połączonego z częścią Fc (domenami zawiasową, CH2 i CH3) cząsteczki łańcucha ciężkiego ludzkiej IgG1.

Konstrukt EBNA: Wektor plazmidowy pCH269 jest pochodną pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z której usunięto gen EBNA-1. Plazmidu tego użyto do konstrukcji wektora ekspresyjnego do przejściowej ekspresji białek w komórkach ludzkiej nerki EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen. E. S., i wsp. 1995, Gene 156, 235-239).

Kasetę do ekspresji białka fuzyjnego złożono z trzech fragmentów DNA: fragmentu Notl/Sall kodującego sekwencję sygnałową VCAM-I i połączoną w ramce z sekwencją kodującą ludzki IFN beta, fragmentu Sall/Notl kodującego domeny zawiasową, CH2 i CH3 ludzkiej IgG1 oraz fragmentu Not I wektora ekspresyjnego EBNA pCH269.

PL 200 586 B1

Dwa odrębne fragmenty Notl/Sall kodujące sekwencję sygnałową dojrzałej VCAM-1 połączonej w ramce z ludzkim genem IFN beta wytworzono przez technologię PCR. Matrycą do PCR był plazmid pCMG258 (patrz Przykład 2 powyżej), który koduje sekwencję sygnałową dojrzałej VCAM-1 połączonej w ramce z ludzkim genem IFN beta, który sam jest połączony w ramce z sekwencją łącznikową enterokinazy. Użyto dwóch zestawów starterów do PCR. Jeden zestaw starterów (5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (Id. Sekw. Nr: 37) i 5'-ATACGCGTCGA-CGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3': (Id. Sekw. Nr: 38) wprowadził zmianę aminokwasową z G na C w pozycji 162. Fragment ten jest nazwany ludzkim IFN beta-C162.

Drugi zestaw starterów (5'AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (Id. Sekw. Nr: 39) i 5'TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3' Id. Sekw. Nr: 40)) również wprowadził podstawienie aminokwasowe G 162 na C 162 i zmienił sekwencję łącznikową enterokinazy (DDDDK) na sekwencję łącznika GGGGS połączoną w ramce po stronie 3' z ludzkim genem IFN beta. Fragment ten jest nazwany ludzkim IFN beta-C162/G4S. Obydwa zestawy starterów zawierają po stronie 5' miejsce Not I dla umożliwienia ligacji w pCH269 i miejsce cięcia Sall po stronie 3' dla umożliwienia ligacji z fragmentem Sall/Notl ludzkiej IgG1.

Fragment ludzkiej IgG1, który koduje fragment domen zawiasowej, CH2 i CH3 ludzkiej IgG1 wytworzono przez trawienie enzymami restrykcyjnymi (Sall/Notl) plazmidu pEAG409, pochodnej plazmidu SAB144 (opisanego w patencie USA 5547853). Fragment wycięto i oczyszczono z żelu. Wektor plazmidowy pCH269 do ekspresji EBNA strawiono Notl i oczyszczono z żelu.

Dwa konstrukty będące fuzją: ludzki IFN beta-Fc ludzkiej IgG1 wytworzono w trójskładnikowej ligacji. Jeden konstrukt, nazwany ZL6206 zawierał łącznik G4S; drugi konstrukt, nazwany ZL5107, jest bezpośrednią fuzją. Pełne sekwencje DNA i białka otwartych ramek odczytu bezpośredniej fuzji (patrz Fig. 1) są pokazane w Id. Sekw. Nr: 41 i Id. Sekw. Nr: 42, odpowiednio. Pełne sekwencje DNA i białka otwartych ramek odczytu fuzji z łącznikiem (patrz. Fig. 11) są pokazane w Id. Sekw. Nr: 43 i Id. Sekw. Nr: 44, odpowiednio.

Konstrukt CHO:

Wytworzono konstrukt do stabilnej ekspresji w CHO fuzji: ludzki IFN beta-Fc ludzkiej IgG1, który składał się z ludzkiego IFN beta połączonego bezpośrednio z Fc ludzkiej IgG1. Fragment IFN beta-Fc ludzkiej IgG1 wycięto z plazmidu ZL51 07 NotI i oczyszczono z żelu; poddano go ligacji w miejscu Notl pEAG347 (wektor ekspresyjny zawierający tandem wczesnego promotora SV40 z późnym głównym promotorem adenowirusa [pochodzącym z plazmidu pAD2beta], a pojedyncze miejsce do klonowania Notl, po którym następują sygnały terminacji późnej transkrypcji SV40 i poli A [pochodzące z plazmidu pCMVbeta]. pEAG347 zawiera szkielet plazmidowy pochodzący z pUC19 oraz dhfr pochodzący z pSY2dhfr do selekcji MTX i amplifikacji w transfekowanych komórkach CHO.

B. Wytwarzanie białka fuzyjnego ludzki interferon-beta-1a/Fc ludzkiej IgG1 w komórkach ssaczych

Przejściowa transfekcja konstruktów z fuzją ludzkiego IFN beta do komórek EBNA293:

Zrekombinowane wektory ekspresyjne dla IFN-beta/Fc ludzkiej IgG1 opisane powyżej transfekowano przejściowo do komórek EBNA293 ludzkiej nerki w celu uzyskania ekspresji białka fuzyjnego IFN-beta-1a. Te zrekombinowane plazmidy ekspresyjne transfekowano przy zastosowaniu protokołu z lipofektaminą (nr katalogowy #18324-020, Life Technologies) do komórek EBNA293 ludzkiej nerki zgodnie z protokołem opisanym powyżej w Przykładzie 3.

Stabilna transfekcja konstruktów z fuzją ludzkiego IFN beta (bez łącznika) do komórek CHO dhfr:

Opisany powyżej wektor ekspresyjny zawierający dhfr dla ludzkiego interferonu-beta-1a/Fc ludzkiej IgG1 (bez łącznika) transfekowano stabilnie do komórek CHO dhfr- w celu uzyskania białka fuzyjnego IFN-beta-1a według wynalazku. Ten zrekombinowany plazmid ekspresyjny transfekowano przez elektroporację, a selekcję pozytywnych klonów przeprowadzono zgodnie z następującym protokołem:

Wytrącony plazmidowy DNA (20 μο) strawiony Bglll, zawieszono w 800 μΙ buforu HEPES i dodawano do 10x10⁷ komórek CHO/ml. Po elektroporacji, komórki hodowano w pełnej pożywce DMEM przez dwa dni. Komórki rozdzielono następnie na 20-40 10 cm płytek z pełną pożywką DMEM/dializowaną 10% FBS i hodowano przez 5 dni przed przeniesieniem na dwa tygodnie komórek na pożywkę selekcyjną ze wzrastającymi stężeniami (50-200 ng/ml) MTX w DMEM. Po dwóch tygodniach, pojedyncze kolonie komórek selekcjonowano i namnażano. Supernatanty pochodzące z 22 klonów CHO badano w testach antywirusowych.

Aktywność

Aktywność antywirusową białka fuzyjnego określano w testach CPE jak opisano w Przykładzie 4. Opierając się na aktywności specyficznej 60 MU/mg standardu interferonu-betala użytego w teście,

PL 200 586 B1 aktywność (EBNA) wyrażanego przejściowo białka fuzyjnego interferon-beta-la/Fc ludzkiej IgG1 z łącznikiem wynosiła 900 U/ml, a aktywność bez łącznika wynosiła 440 U/ml. Aktywność wyrażanego w komórkach CHO białka fuzyjnego interferon-beta-1a/Fc ludzkiej IgG1 wynosiła 50 U/ml.

P r z y k ł a d 6: Pomiar aktywności antywirusowej interferonu-beta-1a w osoczu myszy traktowanej interferonem-beta-1a i białkiem fuzyjnym interferon-beta-1a/mysia IgG2a

Myszom (C57/B16) wstrzykiwano dożylnie do żyły ogonowej 50000 jednostek interferonu-beta-1a albo 50000 jednostek białka fuzyjnego interferon-beta-1a/mysia IgG2a. Równą objętość buforu fosforanowego podawano jako kontrolę.

Krew była pobierana przez skrwawianie pozaoczodołowe w różnych punktach czasowych (natychmiast, 0,25, 1,4, 24 i 48 godzin) po iniekcji interferonu beta. Na każdy punkt czasowy przypadały przynajmniej trzy myszy. Pełną krew zbierano do probówek zawierających antykoagulant, komórki usuwano, a pozostałe osocze zamrażano do czasu badania. Próbki osocza rozcieńczano 1:10 w pożywce testowej wolnej od surowicy i przepuszczono przez filtr strzykawkowy 0,2 μίτι.

Rozcieńczone próbki miareczkowano w oznaczonych studzienkach 96-studzienkowej płytki do hodowli tkankowych zawierających komórki A549. Na każdej płytce testowano rozcieńczenia standardu interferonu-beta--a (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 i 0,6 U/ml AVONEX) oraz 4 próbki osocza. Komórki wstępnie potraktowano próbkami na 24 godziny przed prowokacją wirusem EMC. Po dwudniowej inkubacji z wirusem żywotne komórki wybarwiono przez 1 godzinę roztworem MTT (5 mg/ml w buforze fosforanowym), przepłukano buforem fosforanowym i solubilizowano za pomocą 1,2 N HCl w isopropanolu. Studzienki odczytano przy 450 nm. Krzywe standardowe przygotowuje się dla każdej płytki i stosuje do określenia aktywności inerferonu-beta-1a w każdej testowanej próbce. Aktywności w próbkach od różnych myszy są wykreślone na Fig. 9 wobec punktów czasowych.

Powolniejszy ubytek fuzji interferonu-beta-1a z krążenia w funkcji czasu wskazuje, że okres póltrwania próbki białka fuzyjnego jest znacznie dłuższy niż kontrolnego niezmodyfikowanego interferonu-beta-1a. Drugi, bardzo znaczący wniosek z badań, jest taki, że bardzo mało białka fuzyjnego ubyło w fazie rozprowadzania, czego dowodzi podobnie wysoki poziom aktywności w punktach czasowych po 15 i po 60 minutach. Dane te wskazują, że w przeciwieństwie do kontrolnego interferonu-beta-1a, dystrybucja białka fuzyjnego interferonu-beta-1a jest ograniczona głównie do układu naczyniowego.

P r z y k ł a d 7: Porównanie farmakokinetyki i farmakodynamiki u zwierząt naczelnych

Badania porównawcze przeprowadzono na białku fuzyjnym interferonu-beta-1a i natywnym in^ter^feronⁱe-t>e^ta-¹a (jak.o ⁱn^ter^feronⁱe-^be^ta-¹a ^AVONEX®w ¹⁰⁰ m^M fosforanu sodą ²⁰⁰ m^M IMaCh ^{pH 7,}2 w celu określenia ich względnej trwałości i aktywności u zwierząt naczelnych. W niniejszych badaniach farmakokinetyka i farmakodynamikę białka fuzyjnego interferonu-beta-1a u naczelnych porównuje się z danymi dla natywnego interferonu-beta-1a, a racjonalne wnioski mogą być rozszerzone na ludzi.

Zwierzęta i metody

Plan badań

Jest to grupa równoległych badań z powtarzalną dawką w celu oceny porównawczej farmakokinetyki i farmakodynamiki fuzji białkowej interferonu-beta-1a i interferonu-beta-1a,który nie jest w postaci fuzji.

Do badań wykorzystuje się zdrowe zwierzęta naczelne (najlepiej małpę rezus). Przed dozowaniem wszystkie zwierzęta będą ocenione pod względem stanu zdrowia przez Laboratorium Chorób Zwierząt dwa razy w ciągu 14 dni przed testem podania substancji; jedna ocena musi być przeprowadzona w ciągu 24 godzin przed pierwszym testem podania substancji. Tylko zdrowe zwierzęta mogą otrzymać substancję testową. Ocena obejmuje ogólne badanie fizyczne oraz pobranie krwi przed dawką w celu określenia wyjściowej patologii klinicznej i wyjściowego poziomu przeciwciał przeciw interferonowi-beta-1a. Wszystkie zwierzęta będą zważone oraz będzie zmierzona temperatura ciała w czasie 24 godzin przed podaniem substancji testowej.

Wybiera się dwanaście osobników i przypisuje się do trzech grup, aby otrzymać interferon-beta-1a w ilości 1 MU/kg albo jako fuzję albo nie jest w postaci fuzji, ale poza tym identyczny inerferon-beta1a. Podania dokonuje się drogą podskórną (SC) albo dożylną (IV). Sześć samców otrzyma substancję testową drogą IV (3/traktowanie), a innych 6 samców otrzyma testowaną substancją drogą SC (3/traktowanie). Wszystkie zwierzęta nie mogły mieć do tej pory kontaktu z interferonem-beta. Każde zwierzę otrzyma dawkę dwukrotnie; dawki będą podawane w odstępach czterech tygodni. Objętość dawki wyniesie 1,0 ml/kg.

Krew pobiera się do testów farmakokinetycznych w 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 i 96 godzin po każdej iniekcji. Próbki krwi do pomiarów biologicznego markera odpowiedzi wywołanej

PL 200 586 B1 interferonem, neopteryny surowiczej, pobierane są po 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504 godzinach po podaniu badanego leku.

Ocena w czasie trwania badań obejmuje obserwacje kliniczne prowadzone po 30 minutach i 1 godzinie od podania dawki w celu wykrycia objawów toksyczności Codzienne obserwacje zwierząt przebywających w klatkach będą przeprowadzone w celu zaprotokołowania ogólnego samopoczucia, toksycznych objawów, dyskomfortu oraz zmian w zachowaniu. Ciężar ciała i temperatura ciała będą rejestrowane w regularnych odstępach czasu przez okres 21 dni po dawce.

Metody badań

Poziomy interferonu-beta w surowicy są oznaczane ilościowo przy wykorzystaniu efektu cytopatycznego (CPE). Badania CPE mierzą poziom aktywności antywirusowej, w której pośredniczy interferon. Poziom aktywności antywirusowej w tej próbce odzwierciedla ilość cząsteczek aktywnego interferonu zawartych w próbce w czasie pobierania krwi. Takie podejście jest standardową metodą w celu oceny farmakokinetyki interferonu-beta. Metoda CPE stosowana w obecnych badaniach wykrywa zdolność interferonu-beta do ochrony komórek ludzkiego raka płuc (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) przed cytotoksycznością spowodowaną wirusem zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMC). Komórki preinkubuje się przez 15 do 20 godzin z próbkami surowicy, aby umożliwić indukcję i syntezę białek indukowanych przez interferon, które następnie wywołują odpowiedź antywirusową. Następnie dodaje się wirusa EMC i inkubuje przez dalsze 30 godzin przed określeniem cytotoksyczności przy zastosowaniu barwienia fioletem krystalicznym. Wewnętrzny wzorzec interferonu-beta, jak również wzorzec wewnętrzny interferonu-beta-1g są testowane równocześnie z próbkami na każdej płytce badawczej. Wzorzec jest kalibrowany wobec referencyjnego wzorca, naturalnego interferonu z ludzkich fibroblastów (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Każda płytka testowa zawiera również studzienki kontrolne wzrostu komórek, nie zawierające ani żadnego rodzaju interferonu beta, ani EMC, oraz studzienki do kontroli wirusów, zawierające komórki i EMC ale nie zawierające interferonu-beta. Przygotowuje się również płytki kontrolne zawierające wzorce i próbki w celu określenia wpływu, jeżeli jest, próbek na wzrost komórek. Płytki takie barwione są bez dodatku wirusów.

Próbki i wzorce są testowane w dwóch powtórzeniach na każdej z dwóch powtórzonych płytek testowych, co daje cztery wyniki na próbkę. Podawana jest średnia geometryczna stężenia z czterech powtórzeń. Granica wykrywania w tym teście wynosi 10 jednostek (U)/ml.

Stężenie neopteryny surowiczej określone jest w jednostkach farmakologii klinicznej przy użyciu dostępnych handlowo testów.

Farmakokinetyka i metody statystyczne

Do dopasowania danych do modeli farmakokinetycznych zastosowano oprogramowanie RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT). Dla każdej grupy wykreślane są średnie geometryczne stężenia względem czasu. Ponieważ wyniki badań wyrażone są w rozcieńczeniach, bardziej odpowiednie do rozważenia są średnie geometryczne niż średnie arytmetyczne. Poziomy interferonu w surowicy są dopasowane do wartości wyjściowych, a stężenia niewykrywalne w surowicy ustalono na 5 U/ml, co odpowiada połowie niższej granicy detekcji.

Dla danych infuzji IV dwukompartmentowy model infuzji IV jest dopasowany do wykrywalnych stężeń w surowicy dla każdego osobnika, a dane SC są dopasowane do dwukompartmentowego modelu iniekcji.

Obliczane są następujące parametry farmakokinetyczne:

(i) obserwowane maksymalne stężenie C_max (U/ml);

(ii) powierzchnia pod krzywą od 0 do 48 godzin, AUC z zastosowaniem zasady trapezoidalnej;

(ii) okresu półtrwania eliminacji;

oraz, z danych infuzyjnych IV (jeżeli stosuje się IV):

(iv) okres półtrwania dystrybucji (h) (v) klirens (ml/h) (vi) pozorna objętość dystrybucji, Vd (l).

Oprogramowanie WinNonlin (versja 1,0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC) zastosowano do obliczenia okresów półtrwania eliminacji po iniekcjach S.C. i I.M.

W przypadku neopteryny dla każdej grupy przedstawiana jest średnia arytmetyczna w funkcji czasu. Oblicza się E_max, to jest maksymalną zmianę od linii wyjściowej. C_max, AUC i E_max poddane są jednokierunkowej analizie wariancji w celu porównania grup z dozowaniem. C_max i AUC są przekształcane logarytmicznie przed analizą; przedstawiane są średnie geometryczne.

PL 200 586 B1

P r z y k ł a d 8: Efekty antyangiogenne białka fuzyjnego interferonu-beta-la

Określenie zdolności fuzji interferonu-beta-1a do hamowania proliferacji komórek śródbłonkowych in vitro.

Ludzkie żylne komórki śródbłonkowe (Cell Systems, Cat. #2V0-P75) i ludzkie skórne mikronaczyniowe komórki śródbłonkowe (Cell Systems, Cat. #2M1-C25) utrzymuje się w hodowli w pożywce CS-C Medium Kit (Cell Systems, Cat. #4Z0-500). Dwadzieścia cztery godziny przed badaniem komórki trypsynizuje się i zawiesza w pożywce testowej, 90% M199 i 10% wołowej surowicy płodowej (FBS), i doprowadza się do pożądanej gęstości komórek. Komórki następnie wysiewa się w 24- lub 96-studzienkowych płytkach pokrytych żelatyną w ilościach 12500 komórek/studzienkę lub 2000 komórek/studzienkę, odpowiednio.

Po całonocnej inkubacji pożywkę testową zastępuje się świeżą pożywką zawierającą 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego zasadowego czynnika wzrostowego fibroblastów (Becton Dickinson, Cat. #40060) i różnymi stężeniami białek interferonu-beta-1a jako fuzji albo nie w postaci fuzji lub dodatnią kontrolą (jako dodatnia kontrola może być używana endostatyna, jak również przeciwciało wobec bFGF). Objętość końcowa doprowadzana jest do 0,5 ml w 24-studzienkowej płytce lub 0,2 ml w 96-studzienkowej płytce.

Po siedemdziesięciu dwóch godzinach komórki są trypsynizowane w celu policzenia metodą Coultera, zamrożone do anlizy fluorescecyjnej CyQuant lub znakowane [3H] tymidyną.

W omawianych testach in vitro bada się cząsteczki ludzkiego interferonu-beta pod względem wpływu na proliferację komórek śródbłonkowych, co mogłoby wskazywać na efekty antyangiogenne in vivo. Patrz O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen and J. Folkman. (1997). Endostatin: An Endogenenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 88, 277-285.

P r z y k ł a d 9: Model in vivo do testowania efektów antyangiogennych i neowaskularyzacyjnych fuzji interferonu-beta-1a/Ig

Opracowano różne modele do testowania efektów antyangiogennych i neowaskularyzacyjnych opisywanych tu cząsteczek. Niektóre z tych modeli opisano w patentach USA 5,733,876 (31 marca, 1998: „Method of inhibiting angiogenesis”) i 5,135,919 (4 sierpnia, 1992: „Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis”). Inne badania obejmują test wolnej od osłony błony z komórek omoczniowych (CAM) S. Taylor and J. Folkman; Nature, 297, 307 (1982) oraz R. Crum, S. Szabo and J. Folkman; Science, 230, 1375 (1985); antyangiogenny model testu grzbietowego pęcherzyka płucnego myszy według Folkmana J. i wsp.; J. Exp. Med., 133, 275 (1971) oraz test mikrokieszonki rogówkowej według Gimbrone, M.A. Jr. i wsp.., J. Natl. Cancer Inst. 52,413 (1974), w którym unaczynienie rogówki jest indukowane u dorosłych samców szczurów szczepu Sprague-Dawley (Charles River, Japan) przez implantowanie w każdej rogówce 500 ng zasadowego FGF (wołowego, R&D Systems Inc.) impregnowanego w peletkach EVA (kopolimer etylen-octan winylu).

Inne metody testowania fuzji interferonu-beta Ig pod kątem efektów antyangiogennych w modelu zwierzęcym obejmują (nie ograniczając się do tego) protokoły dotyczące poszukiwań nowych środków potencjalnie antynowotworowych, jak opisano w oryginale Cancer Chemotherapy Reports, Part 3, Vol. 3, Nr2, Wrzesień 1972 i w Suplemencie In Vivo Cancer Models, 19761982, NIH Publication Nr. 84-2635, Luty 1984. Ze względu na bariery gatunkowe na interferony Typu I, aby zbadać antyangiogenną aktywność fuzji interferonu-beta na modelach gryzoni, wytworzono preparaty fuzji interferon-beta gryzoni /Ig. Takie metody poszukiwań są zilustrowane przez protokół do testowania działań antyangiogennych fuzji mysiego interferonu-beta/Ig na podskórnie implantowanego raka płuc Lewisa.

Pochodzenie linii nowotworowej:

Powstała spontanicznie w 1951 r. jako rak płuc u myszy C57BL/6.

Podsumowanie przebiegu testu: Fragment nowotworu implantowano podskórnie w regionie pachowym myszy B6D2F1. Testowany środek (tzn. białko fuzyjne) został podany w różnych dawkach podskórnie (SC) lub śródotrzewnowo (IP) w różnych dniach po implantacji nowotworu. Mierzonym parametrem jest mediana czasu przeżycia. Wyniki wyrażono jako procent kontrolnego czasu przeżycia.

Zwierzęta:

Rozwój: Myszy C57BL/6

Testowanie: Myszy B6D2F1

Waga: Ciężar myszy powinien mieścić się w zakresie ± 3 g z minimalnym ciężarem 18 g dla samców i 17 g dla samic.

PL 200 586 B1

Płeć: Do jednego eksperymentu zarówno do testów jak i kontroli używa się zwierząt jednej płci.

Pochodzenie: Jedno źródło, jeśli możliwe, dla wszystkich zwierząt w danym eksperymencie.

Wielkość eksperymentu:

Dziesięć zwierząt w jednej grupie testowej.

Transfer nowotworu:

Rozwój:

Fragment: Przygotować 2-4 mm fragmenty z s.c. (podskórnego) nowotworu dawcy

Czas: 13-15 dni

Miejsce: Implantować fragment s.c. w rejon pachowy z punkcją w rejonie pachwinowym.

Testowanie:

Fragment: Przygotować 2-4 mm fragmenty z s.c. nowotworu dawcy.

Czas: 13-15 dni.

Miejsce: Implantować fragment s.c. w rejon pachowy z punkcją w rejonie pachwinowym.

Plan testowania:

Dzień 0: Implantować nowotwór. Założyć hodowlę bakteryjną. Przetestować składnik dodatniej kontroli w każdym nieparzystym eksperymencie. Przygotować materiały.

Rejestrować codziennie śmierć zwierząt.

Dzień 1: Sprawdzić hodowle. Odrzucić eksperymenty o ile nastąpiła kontaminacja. Zwierzęta dobierać losowo. Traktować zgodnie z instrukcją (w dniu 1 i w dniach następnych).

Dzień 2: Sprawdzić ponownie hodowle. Odrzucić eksperyment, jeżeli wystąpi kontaminacja.

Dzień 5: Porównać Dzień 2 z dniem początkowego testu oceny toksyczności czynnika.

Dzień 14: Kontrolować dzień wczesnych śmierci zwierząt.

Dzień 48: Kontrolować dzień bez przyjmowania.

Dzień 60: Zakończyć i ocenić eksperyment. Zbadać makroskopowo płuca pod kątem nowotworu.

Kontrola jakości:

Zaplanować podawanie związku będącego kontrolą pozytywną (NSC26271(Cytoksan w dawce 100 mg/kg/iniekcję)) w każdym eksperymencie nieparzystym dotyczącym podania dootrzewnowego tylko w Dniu 1. Niższy limit testu/kontroli dla kontroli pozytywnej wynosi 140%. Akceptowalna średnia przeżycia nie badanej kontroli wynosi 19-35,6 dni.

Ocena:

Mierzonym parametrem jest mediana czasu przeżycia. Obliczono średnią ciężaru ciała zwierzęcia w Dniu 1 i Dniu 5 obliczona, obliczono stosunek test/kontrola dla wszystkich testowanych prób. Obliczany jest średni ciężar ciała zwierzęcia w dniu rozpoczęcia i w ostatnim dniu eksperymentu. Stosunek test/kontrola obliczany jest dla wszystkich grup z przeżyciem >65% w Dniu 5. Stosunek test/kontrola o wartości <86% wskazuje na toksyczność. Zbyt duża różnica zmiany ciężaru ciała (test minus kontrola) może również być oceniana jako toksyczność.

Kryteria aktywności:

Jeżeli wyjściowy stosunek test/kontrola jest większy niż lub równy 140%, bierze się pod uwagę konieczność wykazania umiarkowanej aktywności. Powtarzalna wartość stosunku test/kontrola większa lub równa 150% wskazuje na znaczącą aktywność.

PL 200 586 Β1 <110> BIOGEN, INC.

<120> Fuzje białkowe z interferonem beta i ich zastosowanie <130> A064PCTSEQ <140> PCT/US99/24200 <141> 1999-10-15 <150> 60/120,237 <151> 1999-02-16 <150> 60/104,491 <151> 1998-10-16 <160> 44 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <2i3> mysi <400> i atgagctaca acttgcttgg attcccacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaaLc ctaaggaact tttacttcat taacagactt acaggttacc Lccgaaacga cgatgatgac aaggtcgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc cgggaaa

PL 200 586 Β1 <210> 2 <211> 399 <212> PRT <213 > mysi

<400> 2

Leu

Gly

Phe

Leu

Gin 10

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe 15

Gin

Met 1

Ser Tyr

Asn

Leu 5

Cys

Gin Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr 30

Cys

Leu

Lys

Asp Arg 35

Met

Asn

Phe

Asp

Ile 40

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys 45

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe Gin 50

Lys

Glu

Asp

Ala 55

Ala

Leu

Thr

Ile

Tyr 60

Glu

Met

Leu

Gin

Asn 65

Ile Phe

Ala

Ile

Phe 70

Arg

Gin

Asp

Ser

Ser 75

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn 80

Glu

Thr Ile

Val

Glu 85

Asn

Leu

Leu

Ala

Asn 90

Val

Tyr

His

Gin

Ile 95

Asn

His

Leu Lys

Thr 100

Val

Leu

Glu

Glu

Lys 105

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp 110

Phe

Thr

Arg

Gly Lys 115

Leu

Met

Ser

Ser

Leu 120

His

Leu

Lys

Arg

Tyr 125

Tyr

Gly

Arg

Ile

Leu His 130

Tyr

Leu

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

Ser

His 140

Cys

Ala

Trp

Thr

Ile 145

Val Arg

Val

Glu

Ile 150

Leu

Arg

Asn

Phe

Tyr 155

Phe

Ile

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly Tyr

Leu

Arg 165

Asn

Asp

Asp

Asp

Asp 17 0

Lys

Val

Asp

Lys

Thr 175

His

Thr

Cys Pro

Pro 180

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu 185

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro 190

Ser

Val

Phe

Leu Phe 195

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys 200

Asp

•Thr

Leu

Met

Ile 205

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu Val 210

Thr

Cys

Val

Val 215

Val

Asp

Val

Ser

His 220

Glu

Asp

Pro

Glu

PL 200 586 Β1

Val 225

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr 230

Val

Asp Gly Val

Glu 235

Val

His

Asn

Ala

Lys 240

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

245

250

255

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

260

265

270

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

275

280

285

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

290

295

300

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

305

310

315

320

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

325

330

335

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

340

345

350

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

355

360

365

Trp

Gln

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

370

375

380

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

385

390

395

<210> 3 <211> 549 <212> DNA <213> mysi <400> 3 tccgggggcc atcatcatca tcatcatagc tccggagacg atgatgacaa gatgagctac 60 aacttgcttg gattcctaca aagaagcagc aattttcagt gtcagaagct cctgtggcaa 120 ttgaatggga ggcttgaata ctgcctcaag gacaggatga actttgacat ccctgaggag 180 attaagcagc tgcagcagtt ccagaaggag gacgccgcat tgaccatcta tgagatgctc 240 cagaacatct ttgctatttt cagacaagat tcatctagca ctggctggaa tgagactatt 300 gttgagaacc tcctggctaa tgtctatcat cagataaacc atctgaagac agtcctggaa 360 gaaaaactgg agaaagaaga tttcaccagg ggaaaactca tgagcagtct gcacctgaaa 420 agatattatg ggaggattct gcattacctg aaggccaagg agtacagtca ctgtgcctgg 480

PL 200 586 Β1 accatagtca gagtggaaat cctaaggaac ttttacttca ttaacagact tacaggttac 540 ctccgaaac 549 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <2i3> _my_Si <400> 4

Ser Gly Gly His His His His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp 15 10 15

Lys Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe 20 25 30

Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys 35 40 45

Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu 50 55 60

Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu 65 70 75 80

Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp 85 90 95

Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile 100 105 110

Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe 115 120 125

Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly 130 135 140

Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp

145 150 155 160

Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg

165 170 175

Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 <210> 5 <211> 60

PL 200 586 Β1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gatctagcaa tgctgcctgt gctgccctcc tggctgcctt gaatgggagg cttgaatact 60 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t 51 <210> 7 <211> 76 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aattgaatgg gagggctgca gcttgcgctg cagacaggat gaactttgac atccctgagg 60 agattaagca gctgca 76 <210> 8 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ala 1

Ala

Thr Thr Gly 5

Ala Ala Thr

Gly Gly 10

Gly

Ala Gly Gly

Cys 15

Thr

Thr

Gly

Ala

Ala

Thr

Ala

Cys

Thr

Gly

Cys

Cys

Thr

Cys

Ala

Ala

Gly

20

25

30

Gly

Ala

Cys

Ala

Gly

Gly

Ala

Thr

Gly

Ala

Ala

Cys

Thr

Thr

Thr

Gly

40 45

Ala Cys Ala 50 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9

PL 200 586 B1

ttctccggag	acgatgatga	caagatgagc
<210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 10 cgtcagagct	gaaatcctag	caaactttgc
<210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 11 ggtggtctca	catgagctac	aacttgcttg
<210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 12 gccctcgagt	cgaccttgtc	atcatcgtcg
<210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 13 caagcttgct	agcggccgcg	g
<210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 14 ggtggtctca	catggcttga	gaagctgc

tacaacttgc ttggattcct acaaagaagc 60 attcattgca agacttacag 50 gattcctaca aagaagc 47 tttcggaggt aacctgtaag 50 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15

PL 200 586 Β1

aggtsmarct	gcagsagtcw
<210> 16 <211> 36 <212> DNA <213 > Homo	sapiens
<400> 16 ctgagctcat	ttacccggag	tccgggagaa	gctctt
<210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 17 agcttgctag	cggccgcggc	ctcactggct	tca
<210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 18 atacgcgtcg	acgtttcgga	ggtaacatgt	aagtctg
<210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 19 agcttgctag	cggccgcggc	ctcactggct	tca
<210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 20 tacacgtcga	cgctgccacc	accgccgttt	cggaggtaac
<210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Homo	sapiens

atgtaagt-ct <400> 21

PL 200 586 Β1

gccgctcgag	ttatcagttt	cggaggtaac	ctgtaagtc			39
<210> 22 <211> 72 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 22 ggaatgcttc agacagttct	aattgttgct ag	gcactcctga	gcaatgtcta	tcatcagata	aaccatctga	60 72
<210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 23 ggaatgagac ctgcagttct	cattgttgag ag	aacctcctgg	ctaatgtcgc	tcatcagata	gcacatctgg	60 72
<210> 24 <211> 44 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 24 ctagctgcaa	aactggctgc	agctgatttc	accaggggaa	aact		44
<210> 25 <211> 69 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 25 ctagaagaaa	aactggagaa	agaagcagct	accgctggaa	aagcaatgag	cgcgctgcac	60

ctgaaaaga	69
<210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 26 tattatggga ggattctgca ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t	51
<210> 27 <211> 76 < 212 > DNA

PL 200 586 B1 <213> Homo sapiens <400> 27

catgagcagt ggagtactca	ctgcacctga cactgt	aaagatatta	tggggcaatt	gctgcatacc	tggcagccaa	60 76
<210>	28
<211>	87
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	28
catgagcagt	Ctgcacctga	aaagatatta	tgggaggatt	ctgcattacc	tgaaggccgc	60
tgcatactca	cactgtgcct	ggacgat				87
<210>	29
<211>	87
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	29
catgagcagt	ctgcacctga	aaagatatta	tgggaggatt	ctgcattacc	tgaaggcaaa	60
ggagtacgct	gcatgtgcct	ggacgat				87
<210>	30
<211>	50
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	30
cgtcagagct	gaaatcctag	caaactttgc	attcattgca	agacttacag		50
<210>	31
<211>	47
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	31
ggtggtctca	catgagctac	aacttgcttg	gattcctaca	aagaagc		47
<210>	32
<211>	50
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	32

gccctcgagt cgaccttgtc atcatcgtcg tttcggaggt aacctgtaag

PL 200 586 Β1

<210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 33 caagcttgct	agcggccgcg	g
<210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 34 ggtggtctca	catggcttga	gaagctgc
<210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> mysi
<400> 35 aggtsmarct	gcagsagtcw
<210> 36 <211> 36 <212> DNA <2i3> mysi
<400> 36 ctgagctcat	ttacccggag	tccgggagaa	gctctt
<210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 37 agcttgctag	cggccgcggc	ctcactggct	tca
<210> 38 <211> 37 <212> DNA < 213 > Homo	sapiens
<400> 38

atacgcgtcg acgtttcgga ggtaacatgt aagtctg

PL 200 586 B1 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 agcttgctag cggccgcggc ctcactggct tca 33 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tacacgtcga cgctgccacc accgccgttt cggaggtaac atgtaagtct g 51 <210> 41 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41

atgcctggga	agatggtcgt	gatccttgga	gcctcaaata	tactttggat	aatgtttgca	60
gcttctcaag	ccatgagcta	caacttgctt	ggattcctac	aaagaagcag	caattttcag	120
tgtcagaagc	tcctgtggca	attgaatggg	aggcttgaat	actgcctcaa	ggacaggatg	180
aactttgaca	tccctgagga	gattaagcag	ctgcagcagt	tccagaagga	ggacgccgca	240
ttgaccatct	atgagatgct	ccagaacatc	tttgctattt	tcagacaaga	ttcatctagc	300
actggctgga	atgagactat	tgttgagaac	ctcctggcta	atgtctatca	tcagataaac	360
catctgaaga	cagtcctgga	agaaaaactg	gagaaagaag	atttcaccag	gggaaaactc	420
atgagcagtc	tgcacctgaa	aagatattat	gggaggattc	tgcattacct	gaaggccaag	480
gagtacagtc	actgtgcctg	gaccatagtc	agagtggaaa	tcctaaggaa	cttttacttc	540
attaacagac	ttacatgtta	cctccgaaac	gtcgacaaaa	ctcacacatg	cccaccgtgc	600
ccagcacctg	aactcctggg	gggaccgtca	gtcttcctct	tccccccaaa	acccaaggac	660
accctcatga	tctcccggac	ccctgaggtc	acatgcgtgg	tggtggacgt	gagccacgaa	720
gaccctgagg	tcaagttcaa	ctggtacgtg	gacggcgtgg	aggtgcataa	tgccaagaca	780
aagccgcggg	aggagcagta	caacagcacg	taccgtgtgg	tcagcgtcct	caccgtcctg	840
caccaggact	ggctgaatgg	caaggagtac	aagtgcaagg	tctccaacaa	agccctccca	900
gcccccatcg	agaaaaccat	ctccaaagcc	aaagggcagc	cccgagaacc	acaggtgtac	960
accctgcccc	catcccggga	tgagctgacc	aagaaccagg	tcagcctgac	ctgcctggtc	1020
aaaggcttct	atcccagcga	catcgccgtg	gagtgggaga	gcaatgggca	gccggagaac	1080
aactacaaga	ccacgcctcc	cgtgttggac	tccgacggct	ccttcttcct	ctacagcaag	1140
ctcaccgtgg	acaagagcag	gtggcagcag	gggaacgtct	tctcatgctc	cgtgatgcat	1200
gaggctctgc	acaaccacta	cacgcagaag	agcctctccc	tgtctcccgg	gaaatga	1257

<210> 42 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 200 586 Β1 <400> 42

Met 1

Pro

Gly

Lys

Met 5

Val

Val

Ile

Leu

Gly 10

Ala

Ser

Asn

Ile

Leu 15

Trp

Ile

Met

Phe

Ala

Ala

Ser

Gln

Ala

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

20

25

30

Leu

Gln

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

Gln

Cys

Gln

Lys

Leu

Leu

Trp

Gln

Leu

35

40

45

Asn

Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr

Cys

Leu

Lys

Asp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

Ile

50

55

60

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys

Gln

Leu

Gln

Gln

Phe

Gln

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

65

70

75

80

Leu

Thr

Ile

Tyr

Glu

Met

Leu

Gln

Asn

Ile

Phe

Ala

Ile

Phe

Arg

Gln

85

90

95

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

Glu

Thr

Ile

Val

Glu

Asn

Leu

Leu

100

105

110

Ala

Asn

Val

Tyr

His

Gln

Ile

Asn

His

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Glu

Glu

115

120

125

Lys

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp

Phe

Thr

Arg

Gly

Lys

Leu

Met

Ser

Ser

Leu

130

135

140

His

Leu

Lys

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Arg

Ile

Leu

His

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

145

150

155

160

Glu

Tyr

Ser

His

Cys

Ala

Trp

Thr

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

165

170

175

Asn

Phe

Tyr

Phe

Ile

Asn

Arg

Leu

Thr

Cys

Tyr

Leu

Arg

Asn

Val

Asp

180

185

190

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

195

200

205

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

210

215

220

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

225

230

235

240

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

PL 200 586 Β1

245 250 255

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 260 265 270

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 275 280 285

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 290 295 300

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

305 310 315 320

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

325 330 335

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 340 345 350

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 355 360 365

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 370 375 380

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

385 390 395 400

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

405 410 415

Gly Lys <210> 43 <211> 1272 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atgcctggga agatggtcgt gatccttgga gcctcaaata tactttggat aatgtttgca gcttctcaag ccatgagcta caacttgctt ggattcctac aaagaagcag caattttcag tgtcagaagc tcctgtggca attgaatggg aggcttgaat actgcctcaa ggacaggatg aactttgaca tccctgagga gattaagcag ctgcagcagt tccagaagga ggacgccgca ttgaccatct atgagatgct ccagaacatc tttgctattt tcagacaaga ttcatctagc actggctgga atgagactat tgttgagaac ctcctggcta atgtctatca tcagataaac

PL 200 586 B1

catctgaaga	cagtcctgga	agaaaaactg	gagaaagaag	atttcaccag	gggtttactc	420
atgagcagtc	tgcacctgaa	aagatattat	gggaggattc	tgcattacet	gttggccttg	480
gagtacagtc	actgtgcctg	gaccatagtc	agagtggaaa	tcctaaggaa	cttttacttc	540
attaacagac	ttacatgtta	cctccgaaac	ggcggtggtg	gcagcgtcga	caaaactcac	600
acatgcccac	cgtgcccagc	acctgaactc	ctggggggac	cgtcagtctt	cctcttcccc	660
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	720
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	780
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	840
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aa tggcaaęgg	agtacaagtg	caaggtctcc	900
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatcfccca	aagccaaagg-	gcagccccga	960
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	cctggtctgc	1020
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	1080
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgt	tggactccga	cggctccttc	1140
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1200
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1260
cccgggaaat	ga					1272
<210> 44
<211> 423
<212> PRT
<213> Homo	sapiens
<400> 44

Met 1

Pro

Gly

Lys

Met 5

Val

Val

Ile

Leu

Gly 10

Ala

Ser

Asn

Ile

Leu 15

Trp

Ile

Met

Phe

Ala

Ala

Ser

Gin

Ala

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

20

25

30

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin

Cys

Gin

Lys

Leu

Leu

Trp

Gin

Leu

35

40

45

Asn

Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr

cys

Leu

Lys

Asp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

Ile

50

55

60

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

65

70

75

80

Leu

Thr

Ile

Tyr

Glu

Met

Leu

Gin

Asn

Ile

Phe

Ala

Ile

Phe

Arg

Gin

85

90

95

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

Glu

Thr

Ile

Val

Glu

Asn

Leu

Leu

100

105

110

Ala

Asn

Val

Tyr

His

Gin

Ile

Asn

His

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Glu

Glu

115

120

125

Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu

PL 200 586 Β1

130 135 140

His 145

Leu

Lys

Arg

Tyr

Tyr 150

Gly

Arg

Ile

Leu

His 155

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys 160

Glu

Tyr

Ser

His

Cys

Ala

Trp

Thr

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

165

170

175

Asn

Phe

Tyr

Phe

Ile

Asn

Arg

Leu

Thr

Cys

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gly

Gly

180

185

190

Gly

Gly

Ser

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

195

200

205

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

210

215

220

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

225

230

235

240

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

245

250

255

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

260

265

270

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

275

280

285

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

290

295

300

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

305

310

315

320

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

325

330

335

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

340

345

350

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Se-

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

355

360

365

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

370

375

380

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

³⁸⁵ 390

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 405

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420

395

His Asn His 410

400

Tyr Thr Gin Lys Ser 415

PL 200 586 B1

Claims (21)

1. Polipeptyd zawierający:

(a) mutant interferonu-beta-1 a (IFN-β) wybrany z grupy składającej się z mutantów IFN-β o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Tabeli 1 jako A1, B1, C1, CD1 i CD2 i (b) domenę zawiasową, domeny CH2 i CH3 immunoglobuliny.

2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że immunoglobulina jest ludzką immunoglobuliną.

3. Polipeptyd według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że immunoglobuliną jest IgG.

4. Polipeptyd według zastrz. 3, znamienny tym, że IgG jest IgG1.

5. Polipeptyd według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 10.

6. Polipeptyd według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 11.

7. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że ma glikozylowany aminokwas w sekwencji aminokwasowej.

8. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że mutant interferonu beta-1a (IFN-β) ma derywatyzowany aminokwas w sekwencji aminokwasowej.

9. Polipeptyd według zastrz. 8, znamienny tym, że mutant interferonu beta-1a (IFN-β) jest derywatyzowany glikolem polialkilenowym.

10. Polipeptyd według zastrz. 9, znamienny tym, że glikol polialkilenowy jest związany z N-końcem sekwencji aminokwasowej.

11. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd określony w zastrz. 1.

12. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana cząsteczką kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 11.

13. Sposób wytwarzania polipeptydu określonego w zastrz, 1, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 12 w warunkach umożliwiających ekspresję polipeptydu i izolację wyrażonego polipeptydu.

14. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu określonego w zastrz. 1.

15. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku.

16. Zastosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia raka, chorób autoimmunologicznych, choroby zapalnej, choroby wirusowej lub choroby naczyniopochodnej.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobą wirusową jest zakażenie ECM, grypa, zakażenie dróg oddechowych, wścieklizna, zapalenie wątroby.

18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobą autoimmunologiczną jest toczeń lub stwardnienie rozsiane.

19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobą zapalną jest zwłóknienie.

20. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobą naczyniopochodną jest retinopatia cukrzycowa, retinopatia wcześniacza, degradacja plamki, odrzucenie przeszczepu rogówkowego, jaskra neowaskularna, fibroplazja pozasoczewkowa, rubeoza lub zespół Osler-Webber.

21. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że chorobą nowotworową jest mięsak osteolityczny, chłoniak, ostra białaczka limfocytarna, rak sutka, czerniak, rak nosogardzieli lub naczyniak krwionośny.