CN109134642A - 加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物 - Google Patents

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Abstract

[问题]为了提供具有均一糖链结构的加成糖链的多肽，其中所述加成糖链的多肽具有干扰素β活性。[解决手段]发现经由包括合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段的步骤，及连接所述加成糖链肽片段与至少2个肽片段的步骤的方法，即可制作具有均一糖链结构且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽。

Description

加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物
本申请是发明名称为“加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物”，国际申请日为2012年9月28日，进入中国国家阶段日期为2014年5月29日，国家申请号为201280058952.8的申请的分案申请。
技术领域
本发明是有关加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物。
背景技术
天然的人类干扰素β(IFN-β)为由166个氨基酸残基构成的糖蛋白质。干扰素β为属于细胞因子家族，已知参与免疫调节作用、抗病毒活性、细胞增殖抑制作用。此外，人类干扰素β在其氨基酸序列的第17位、31位、141位具有3个Cys，在第80位的天冬酰胺具有1个复合型N结合型的寡糖。此外，已知在第31位及141位的Cys具有二硫键。作为药剂的干扰素β利用细胞表达系统制造，根据用于表达的宿主不同，分类为IFN-β-1a或IFN-β-1b。IFN-β-1a为糖蛋白质，而IFN-β-1b不具有寡糖。而已知，具有糖链的IFN-β-1a与IFN-β-1b相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗肿瘤特性方面具有更强力的效能。
此处，糖蛋白质中所含的糖链结构已知对于药物动力学具有强的影响力。尤其，已知在糖链的非还原末端有无唾液酸存在，对于延长血中半衰期方面有影响。然而，有报道指出至今生物合成的IFN-β-1a在其多肽中所具有糖链的结构为不均一的(例如经由CE-TOF-MS分析糖链结构不均一性的结果记载于非专利文献1)。此外，对于从合成的IFN-β或天然存在的IFN-β分离糖链结构实质上均一的IFN-β则均无报道。导致在推测何种糖链结构在生物活性上重要时有障碍。
近年来，利用细胞表达系统的生物技术可制造含有干扰素，如胰岛素、红细胞生成素(Erythropoietin)、G-CSF的生物活性蛋白质制剂。有报道指出对于这些蛋白质制剂中，蛋白质之糖基化模式对于如折叠步骤、构象特性(conformation property,)、稳定性、免疫反应、血中半衰期及生物体系中蛋白质功能等蛋白质的物理特性或化学特性造成变化(非专利文献2)。此外，若考虑到经由非人类型糖链产生的重大免疫原性，加成于这些蛋白质制剂的糖链的结构则优选为人类型的糖链。
这些糖蛋白质制剂其唯一的方法是经由细胞表达系统制造。然而，这些细胞表达系统的技术，如上所述，不能控制到糖链的结构，其结果，造成所制造的糖蛋白质中糖链的结构的不均一性(例如，非专利文献3)。因此，有制造批次间的质量差异性或糖链不能最优化等的问题。因此，长期期待可容易调整糖链结构的均一糖蛋白质的制备方法，但至今，对于经由化学合成，在活体内显示生物活性的人类型均一糖蛋白质的合成尚无报道。
此外，根据这样的细胞表达系统的技术制造的生物活性的糖蛋白质有可能含有病毒或遗传物质。此外，在使用从源自生物的样品所制备的糖链合成生物活性的糖蛋白质时，这些遗传物质等有可能混入。为了制造安全的蛋白质制剂，期待有可适用将这些遗传物质分解的加热处理法。然而，现今对于生物活性的糖蛋白质制剂的加热处理会使糖蛋白质失去活性，对于适用的加热处理法尚无报道。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Anal Bioanall Chem(2011)400：295-303
非专利文献2：Nat.Biotechnol.,2006,24,1241-1252
非专利文献3：J.Biotechnol,42,117-131(1995)
发明内容
(发明要解决的问题)
本发明的目的是提供具有均一糖链结构的加成糖链的多肽，所述加成糖链的多肽具有干扰素β活性。
(解决问题的手段)
本发明的发明人等为了解决上述问题进行深入研究，结果成功地制造具有均一糖链结构的加成糖链的多肽，所述加成糖链的多肽具有干扰素β活性。
亦即，本发明是有关加成糖链的多肽，其是选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽；其特征为上述加成糖链的多肽具有实质上均一的糖链。
此处，于本发明加成糖链的多肽之一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽系经由化学合成制作的。
此外，本发明的另一方面为经由包含：合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段的步骤，以及将上述加成糖链的肽片段与上述至少2个肽片段连接的步骤的方法，而获得的加成糖链的多肽，且
上述加成糖链的多肽是选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽，其中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性。
此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，加成糖链的多肽为经由包含：合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段之步骤，及将上述加成糖链的肽片段与上述至少2个肽片段连接的步骤的方法而获得的加成糖链的多肽，
上述加成糖链的多肽是选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽，其中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性。
此处，在本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，其特征为上述加成糖链的多肽中的糖链为天冬酰胺结合型糖链。
此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，其特征为上述加成糖链的多肽中的糖链为下述式(a)表示的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链。
[化学式1]
[化学式2]
此外，在本发明加成糖链的多肽的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽在相当于干扰素β第31位及第141位的Cys形成二硫键。
此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽是经加热处理的。
此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽具有90％以上的纯度。
此外，本发明另一方面是有关含有上述加成糖链的多肽的组合物，其特征为上述组合物中的加成糖链的多肽是实质上均一的。
此处，于本发明组合物的一个实施方案，其特征为上述组合物中的加成糖链的多肽90％以上是均一的。
此外，于本发明组合物的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽具有90％以上的纯度。
此外，本发明的组合物为含有加成糖链的多肽的组合物，
上述加成糖链的多肽是选自由以下(a)至(d)的多肽：
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽，其中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽，
上述组合物，其特征为组合物中加成糖链的多肽为实质上均一的。
此外，本发明另一方面是有关含有(I)如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽及/或其药学上可接受的盐、及(Ⅱ)药理学上可接受的载体的医药组合物。
此处，于本发明医药组合物的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽中糖链实质上是均一的。
此外，于本发明医药组合物的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽中糖链90％以上是均一的。
此外，于本发明医药组合物的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽具有90％以上的纯度。
此外，于本发明医药组合物的一个实施方案，其特征为所述医药组合物用于治疗或预防干扰素β相关的疾病。
此外，于本发明医药组合物的一个实施方案，其特征为上述干扰素β相关的疾病为选自由包含多形性胶质母细胞瘤(multi-glioblastoma)、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤的脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所组成的组的至少1种疾病。
此外，本发明另一方面为有关干扰素β相关的疾病的治疗或预防方法，其特征为施用有效量的上述加成糖链的多肽。
此处，于本发明干扰素β相关的疾病的治疗或预防方法的一个实施方案，其特征为上述干扰素β相关的疾病为选自由包含多形性胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤的脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所组成的组的至少1种疾病。
此外，本发明的另一方面是有关加成糖链的多肽，其特征在于：所述加成糖链的多肽是选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽，其是在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链的加成糖链的多肽，且是在相当于干扰素β第17位、31位及141位的Cys经保护基保护的加成糖链的多肽。
此处，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽中，上述糖链为下述式(c)表示的、具有存在于糖链非还原末端的唾液酸的经保护的羧基的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链。
[化学式3]
(式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2。此外，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基、Me表示甲基、Ph表示苯基)。
[化学式4]
此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案，其特征为在上述加成糖链的多肽中，相当于上述干扰素β第17位、31位及141位的Cys经由选自由Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、叔丁基、苯甲基及β位经取代的乙基所组成的组的任一种保护基保护。
此外，本发明的另一方面是有关加成糖链的多肽的制造方法，其特征为所述加成糖链的多肽的制造方法包括在Cys经保护的上述加成糖链的多肽中，将经保护基保护的、在相当于上述干扰素β第17位、31位及141位的Cys进行脱保护的步骤。
此处，于本发明加成糖链的多肽的制造方法的一个实施方案，其特征为在将上述Cys进行脱保护步骤之前，进一步包括制备在相当于干扰素β第17位、31位及141位的Cys经由保护基保护的上述加成糖链的多肽的步骤。
此外，于本发明加成糖链的多肽的制造方法的一个实施方案中，其特征为在将Cys的保护基进行脱保护步骤之前，将加成糖链的多肽进行加热处理。
此外，本发明的另一方面是有关加成糖链的多肽，其特征在于其是在选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的加成糖链的多肽；
所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链的加成糖链的多肽，且
上述糖链为下述式(c)表示的存在于糖链非还原末端的唾液酸的羧基经保护的二唾液酸糖链。
[化学式5]
(式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2。此外，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基，Me表示甲基，Ph表示苯基)。
此外，本发明的另一方面是有关加成糖链的多肽的制造方法，其特征在于在具有唾液酸的羧基经保护的糖链的上述加成糖链的多肽中，包括将存在于糖链非还原末端的唾液酸的羧基的保护基进行脱保护的步骤。
此处，在本发明加成糖链的多肽的制造方法的一个实施方案，其特征为在上述唾液酸的羧基脱保护步骤之前，进一步包括制备具有唾液酸的羧基经保护的糖链的上述加成糖链的多肽的步骤。
此外，本发明加成糖链的多肽的制造方法，其特征为进一步包括将上述加成糖链的多肽进行折叠的步骤。
(发明的效果)
本发明加成糖链的多肽由于具有均一的糖链结构，可提供每批次之间的差异性较少，具有干扰素β活性的质量稳定的加成糖链的多肽。此外，可将结合的糖链种类均一化，且可根据目的将糖链结构最优化。
此外，本发明加成糖链的多肽由于可进行热处理，可防止混入病毒或未知的遗传物质。
附图说明
图1为在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，将具有干扰素β的氨基酸序列的第68位至第88位的氨基酸的糖肽片段B与具有第89位至第166位的氨基酸的肽片段C连接(ligating)的步骤的示意图。
图2为在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，将具有干扰素β的氨基酸序列的第1位至第67位的氨基酸的肽片段A与具有第68位至第166位的氨基酸的糖肽片段(B+C)连接的步骤的示意图。
图3为在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，将经由连接而制作的具有干扰素β的氨基酸序列的第1位至第166位的氨基酸的糖肽片段(A+B+C)的特定半胱氨酸还原为丙氨酸的步骤的示意图。
图4是表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，经由连接而制作的具有干扰素β的氨基酸序列第1位至第166位的氨基酸的糖肽片段(A+B+C)，对于还原为丙氨酸步骤后之糖肽片段(A+B+C)进行半胱氨酸的保护基的脱保护步骤的示意图。
图5表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(11)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图6表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(11)的氨基酸序列。
图7表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(12)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图8表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(12)的氨基酸序列。
图9表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(13)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图10表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(13)的氨基酸序列。
图11表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(14)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图12表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(14)的氨基酸序列。
图13表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(15)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图14表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(15)的氨基酸序列。
图15表示经由HPLC测定在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(15)的纯度时的数据。
图16表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(5)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图17表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(5)的氨基酸序列。
图18表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(6)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图19表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(6)的氨基酸序列。
图20表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(7)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图21表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(7)的氨基酸序列。
图22表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(8)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图23表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(8)的氨基酸序列。
图24表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(9)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图25表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(9)的氨基酸序列。
图26表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(10)的HPLC数据(A)。
图27表示在制造本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(10)的氨基酸序列。
图28表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(10)经由HPLC测定纯度时的数据。
图29表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(18)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图30表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(19)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图31表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(20)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图32表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(21)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图33表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(22)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图34表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(23)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图35表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(24)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图36表示本发明加成糖链的多肽的一个实施方案的，在第17位、31位、141位的Cys经Acm基保护的加成二苯甲基二唾液酸糖链的多肽(7)的氨基酸序列的示意图，及将该加成二苯甲基二唾液酸糖链的多肽(7)加热处理前及加热处理后经由HPLC及ESI-MS分析的数据。图36a及36c表示加热处理前的ESI-MS数据，图36b及36e为加热处理后的ESI-MS数据。此外，图36d表示加热处理前HPLC分析的数据，图36f表示加热处理后HPLC分析的数据。
图37表示本发明加成糖链的多肽的一个实施方案的，在第17位、31位、141位的Cys无保护的、加成二苯甲基二唾液酸糖链的多肽(8)的氨基酸序列的示意图，及将该加成二苯甲基二唾液酸糖链的多肽(8)加热处理前及加热处理后经由HPLC及ESI-MS分析的数据。图37a及37c表示加热处理前的ESI-MS数据，图37b及37e为加热处理后的ESI-MS数据。此外，图37d表示加热处理前HPLC分析的数据，图37f表示加热处理后HPLC分析的数据。
图38表示本发明的一个实施方案的化学合成的加成糖链的多肽(未加热处理)的对IFN-α/β受体2的受体亲和性分析的数据。
图39表示本发明的一个实施方案的经化学合成的加成糖链的多肽(加热处理)的对IFN-α/β受体2的受体亲和性分析的数据。
图40表示将本发明的一个实施方案的化学合成的加成糖链的多肽施用到老鼠时，药物动力学分析的数据。此外，对照区使用经由生物合成制作的IFNβMochida。于图40，A表示静脉施用时的数据，B表示皮下施用时的数据。
图41表示本发明的一个实施方案的化学合成的加成糖链的多肽的抗肿瘤活性的数据。此外，对照区使用PBS(媒介物组)及经由生物合成制作的IFNβMochida。
图42表示对本发明的一个实施方案的化学合成的加成糖链的多肽，比较经加热处理的与未加热处理的抑制细胞增殖活性能力的数据。
图43表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中，将具有干扰素β的氨基酸序列的第68位至第75位的氨基酸的肽片段B2与具有第76位至第88位的氨基酸的糖肽片段B1连接的步骤的示意图。
图44表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中，将经由连接制作的具有干扰素β的氨基酸序列的第68位至第88位的氨基酸的糖肽片段(B1+B2)的特定半胱氨酸的硫醇基(-SH)甲基化为甲硫基(-SMe)的步骤的示意图。
图45表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中，将在糖肽片段(B1+B2)上具有经甲基化的硫醇基(-SMe)的半胱氨酸转换为丝氨酸的分子内酰基转移化步骤的示意图。
图46表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(25)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图47表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的肽片段(26)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图48表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(27)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图49表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(28)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
图50表示在本发明制造加成糖链的多肽的一个实施方案中制造的糖肽片段(29)的HPLC数据(A)及ESI-MS数据(B)。
具体实施方式
本说明书中，“干扰素β”或“IFN-β”为具有序列编号1表示的166个氨基酸的序列的多肽。此外，干扰素β在下述氨基酸序列中的第31位与第141位的半胱氨酸(Cys)之间具有二硫键。此外，在本说明书中，“干扰素β”优选具有下述氨基酸序列(序列编号1)且相当于具有糖链的人类型干扰素β-1a。此外，干扰素β-1a具有加成到下述氨基酸序列中的第80位的天冬酰胺的糖链。
Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu20-Leu-Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr30-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile40-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe50-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr60-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-Ala-Ile-Phe70-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn80-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn90-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr100-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp110-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu120-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu130-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His140-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile150-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu160-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn166
于本说明书中，“氨基酸”在其最广泛的含义上使用，不仅包含天然的氨基酸，亦包含如氨基酸变异体及衍生物之非天然氨基酸。考虑该广泛定义，本领域技术人员将理解本说明书中的氨基酸可列举例如天然蛋白质原性L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体及衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等天然非蛋白质原性氨基酸及具有本领域公知的为氨基酸特征的特性的经化学合成的化合物等。非天然氨基酸的实例可列举α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸式氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸及α-甲基-组氨酸等)、在侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)及侧链中之羧酸官能基氨基酸经磺酸基取代的氨基酸(磺丙氨酸等)。在优选的方面中，本发明化合物中所含的氨基酸仅由天然氨基酸组成。
于本说明书中，氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成时，经取代等的氨基酸个数只要能保持干扰素β活性即可，并无特别限制，而是意味着例如约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个的氨基酸是不同的。亦包含在整个氨基酸序列长度20％以内，优选10％以内的氨基酸是不同的情况。经取代或经加成的氨基酸可为天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物，优选为天然氨基酸。
于本说明书中，“肽片段”是指当制造本发明加成糖链的多肽时，具有最终加成糖链的多肽的氨基酸序列的一部分序列的肽片段。此外，在本说明书中，“加成糖链的肽片段”或“糖肽片段”是指在这样的肽片段的氨基酸序列中，含有加成糖链的氨基酸的肽片段。本发明加成糖链的多肽经由将加成糖链的肽片段与至少2个肽片段连接而制造。
于本发明中，“干扰素β的类似物”为与干扰素β结构上类似的多肽及/或具有与干扰素β重复的结构的多肽，可列举例如干扰素β的1个氨基酸或多个氨基酸经保守性取代的多肽、干扰素β改变体、具有干扰素β活性的干扰素β的片段、具有干扰素β活性的延长的干扰素β。
于本说明书中，“1个或多个氨基酸经保守性取代”是指氨基酸取代中，原来的氨基酸与取代的氨基酸的亲水性指数及/或疏水性指数类似的取代，在这些取代的前后，干扰素β活性不会产生明显降低或消失。
在本说明书中，“干扰素β改变体”为干扰素β的改变体，包含干扰素β天然存在的变异体或将干扰素β人工改变的化合物，这些改变可列举例如干扰素β的1个或多个氨基酸残基的烷基化、酰化(例如乙酰化)、酰胺化、羧基化、形成酯、形成二硫键、糖基化、脂质化、磷酸化、羟基化、标签成分的结合等。
在本说明书中，“具有干扰素β活性的干扰素β的片段”为从干扰素β的N末端及/或C末端，缺失1个或1个以上的氨基酸，且对干扰素β受体维持活性的肽。
于本说明书中，“具有干扰素β活性的延长的干扰素β”为在干扰素β的N末端及/或C末端加成1个以上的氨基酸且维持干扰素β活性的肽。
如上所述的干扰素β类似物可列举例如已知的第1位的Met缺失、第17位的Cys以Ser取代的干扰素β-1b的氨基酸序列。
本发明加成糖链的多肽包含具有与序列编号1表示的氨基酸序列80％以上同源性的氨基酸序列的多肽，其中，所述加成糖链的多肽在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性。于本发明加成糖链的多肽中，与序列编号1具有80％以上相同性时，优选可具有85％以上、90％以上、95％以上、99％以上的同源性。
于本说明书中，“相当于干扰素β中特定位置的氨基酸”只要在附加糖链的多肽中无氨基酸的附加、缺失等，则是指在对应干扰素β氨基酸序列的同一位置的氨基酸。此外，于加成糖链的多肽的氨基酸序列内，氨基酸的加成、缺失存在时，则是指位于考虑到因氨基酸的加成、缺失而引起的氨基酸序列上的移动的位置的氨基酸。例如，于从第1位至第4位具有Met1-Ser2-Tyr3-Asn4-的序列的加成糖链的多肽中，在第2位与第3位的氨基酸之间加成1个氨基酸(Trp)时(Met-Ser-Trp-Tyr-Asn-)，相当于第3位氨基酸(Tyr)的氨基酸是指在加成糖链的多肽中，经由插入Trp，向C末端侧移动1位的氨基酸(Tyr)。
于本说明书中，“糖链”为由1个以上的单元糖(单糖及/或其衍生物)连接形成的化合物。由2个以上的单元糖连接时，各个单元糖之间，经由脱水缩合而在彼此之间产生糖苷键而彼此结合。这些糖链可列举例如活体中所含的一系列的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸及它们的复合物及衍生物)，以及经分解的多糖、糖蛋白质、蛋白多糖、糖胺多糖、糖脂(glycolipids)等从复合活体分子分解或衍生的糖链等，但不只限于这些。糖链可为直链型，亦可为支链型。
此外，于本说明书中，“糖链”亦包含糖链的衍生物，糖链的衍生物可列举例如构成糖链的糖为下述糖的糖链：具有羧基的糖(例如C-1位经氧化而成为羧酸的醛糖酸(例如D-葡萄糖经氧化之D-葡糖酸)、末端的C原子成为羧酸的糖醛酸(D-葡萄糖经氧化而成D-葡糖醛酸))、具有氨基或氨基衍生物的糖(例如D-葡糖胺、D-半乳糖胺等)、同时具有氨基及羧基两者的糖(例如N-乙醇酰神经氨糖酸(N-glycoylneuraminic acid)、N-乙酰基胞壁酸等)、经脱氧化的糖(例如，2-脱氧-D-核糖)、含有硫酸基的硫酸化糖、含有磷酸基的磷酸化糖等，但不只限于这些。
于本发明中，优选的糖链为加成于加成糖链的多肽中时，干扰素β活性不会消失的糖链。
这些本发明加成糖链的多肽中糖链并无特别限制，可为在活体内作为复合糖质(glycoconjugate)(糖肽(或糖蛋白质)、蛋白多糖、糖脂等)存在的糖链，亦可为在活体内不作为复合糖质存在的糖链。
从对活体内施用本发明加成糖链的多肽的观点而言，优选的是在活体内作为复合糖质存在的糖链。相关的糖链可列举为在活体内作为糖肽(或糖蛋白质)结合于肽(或蛋白质)的糖链的N-结合型糖链、O-结合型糖链等。优选使用N-结合型糖链。N结合型糖链可列举例如高甘露糖(high-mannose)型、复合(complex)型、混成(hybride)型，特别优选为复合型。
于本发明优选的方面中，本发明加成糖链的多肽中的糖链为复合型糖链。复合型糖链是指含有2种以上的单糖，且具有以下表示的基本结构及Galβ1-4GlcNAc表示的乳糖胺结构的糖链。
[化学式6]
本发明使用的优选复合型糖链可列举例如下述通式表示的糖链等：
[化学式7]
[式中，R1及R2为相同或不同，表示
[化学式8]
。Ac表示乙酰基]。
此外，于本发明，复合型糖链包括双触角复合型糖链。双触角复合型糖链是指在基本结构末端的2个甘露糖分别结合由0至3个糖构成的单触角糖链的那些糖链。双触角复合型糖链优选为例如以下表示的二唾液酸糖链、
[化学式9]
单唾液酸糖链、
[化学式10]
[化学式10A]
去唾液酸糖链、
[化学式11]
二乙酰葡糖胺糖链、
[化学式12]
二甘露糖糖链、
[化学式13]
等。双触角复合型糖链优选为二唾液酸糖链或去唾液酸糖链，最优选为二唾液酸糖链。
此外，本发明的复合型糖链除了上述的双触角复合型糖链(2分支型复合型糖链)之外，亦包含三触角的复合型糖链(3分支型复合型糖链)、四触角的复合型糖链(4分支型复合型糖链)。例如，三触角、四触角的复合型糖链可列举以下结构式表示的三唾液酸糖链
[化学式14]
[化学式15]
下述结构式表示的四唾液酸糖链
[化学式16]
此外，三触角复合型糖链及四触角复合型糖链可列举从这些三唾液酸糖链及四唾液酸糖链的非还原末端失去1个或多个糖的糖链。
进一步，本发明的复合型糖链亦包含加成海藻糖的那些糖链。加成海藻糖的复合型糖链可列举以下结构式表示的含有海藻糖的复合型糖链：
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
[化学式21]
此外，可列举从这些含有海藻糖的复合型糖链的非还原末端失去1个或复多个糖的糖链。
此外，于本说明书中，“双触角复合型糖链”、“二唾液酸糖链”、“单唾液酸糖链”、“去唾液酸糖链”、“二乙酰葡糖胺糖链”、“二甘露糖糖链”、“三触角复合型糖链”、“四触角复合型糖链”、“含有海藻糖的复合型糖链”除了上述化学式表示的糖链外亦包含结合样式与化学式表示的实例不同的那些糖链，这样的糖链亦优选作为本发明的糖链使用。相关的糖链可列举例如在二唾液酸糖链或单唾液酸糖链中，唾液酸与半乳糖以(α2→3)键结结合的唾液酸糖链或单唾液酸糖链等。
此外，本发明的复合型糖链亦包含具有下述式表示的聚乳糖胺结构或唾液酰基(sialyl)聚乳糖胺结构的糖链。
[化学式22]
(式中，n为2至3的整数)。
[化学式23]
(式中，n为2至3的整数)。
此外，本发明使用的高甘露糖型糖链为在上述复合型糖链的基本结构中进一步结合2个以上甘露糖的糖链。高甘露糖型糖链由于体积大，所以经由在肽中结合高甘露糖型糖链而使血中的稳定性更高。优选为如哺乳类的高甘露糖型糖链等含有5至9个甘露糖的糖链，亦可为如酵母的高甘露糖型糖链，亦可为含有更多甘露糖的糖链。本发明优选使用的高甘露糖型糖链可列举例如：
高甘露糖-5(M-5)：
[化学式24]
高甘露糖-9(M-9)：
[化学式25]
等。
于本发明，优选的糖链可列举例如与人体内作为与蛋白质结合的糖蛋白质存在的糖链(例如“FEBS LETTERS Vol.50,No.3,Feb.1975”中记载的糖链)具有相同结构的糖链(构成糖的种类及它们的结合形式相同的糖链)或从其的非还原末端失去1个或多个糖的糖链。具体而言，可列举下述列举的糖链。
[化学式26]
[化学式27]
[化学式28]
[化学式29]
此外，在本发明一个实施方案中，糖链位于非还原末端的唾液酸的羧基可被修饰。这些糖链可列举如上述列举的糖链中，在非还原末端具有唾液酸的糖链，且在所述糖链中该唾液酸的羧基(-COOH)的氢原子经Bn、Et、Me、CH2COPh、CH2PhOMe、CH2Ph(OMe)2、CH2PhNO2或CH2Ph(NO2)2取代(亦即，该唾液酸的羧基以-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2表示)。
此外，于本发明的一方面中，优选的糖链为具有直链结构的糖链。相关的糖链可列举例如低聚玻尿酸(oligohyaluronic acid)。于本说明书中，低聚玻尿酸为N-乙酰基葡糖胺与葡糖醛酸在直链上交互结合的2至32糖，优选2至16糖，更优选4至8糖的糖链。
本发明使用的低聚玻尿酸中，特别优选的实例可列举将由N-乙酰基葡糖胺及葡糖醛酸构成的单元作为1单元时，为2单元(4糖)以上8单元(16糖)以下的糖链，进一步优选为2单元(4糖)至4单元(8糖)，最优选为2单元(4糖)。
本发明优选使用的玻尿酸可列举例如
4糖的低聚玻尿酸、
[化学式30]
8糖的低聚玻尿酸
[化学式31]
等。
本发明加成糖链的多肽中，糖链加成的氨基酸与天然存在之干扰素β相同，优选加成于中相当于干扰素β的第80位的氨基酸。此外，糖链加成的氨基酸优选为天冬酰胺。
于本发明的优选的方面中，本发明加成糖链的多肽的糖链优选为均一的。于本说明书中，加成糖链的多肽中，糖链为均一的是指在加成糖链的多肽间比较糖链时，肽中的糖链的加成部位、构成糖链的各糖的种类、结合顺序及糖间的结合形式是相同的。具体而言，是指于加成糖链的多肽间，至少有90％以上，优选为95％以上，更优选为99％以上的糖链结构是均一的。
于本说明书中，在含有加成糖链的多肽之组合物中，组合物中的加成糖链的多肽为均一的指在该组合物中所含的加成糖链的多肽间比较糖链及多肽部分时，肽中的糖链加成部位、构成的糖链各糖种类、糖链的结合顺序、糖间的结合形式、构成多肽的氨基酸种类、氨基酸序列的顺序为相同。具体而言，是指在组合物中所含的加成糖链的多肽间，至少有90％以上，优选为95％以上，更优选为99％以上的糖链结构及多肽部分是均一的。
尤其是含有糖肽间的糖链为均一的糖肽的组合物等，具有恒定的性质，尤其在医药品的制造或分析等领域中是优选的。均一的糖链的比例或均一的加成糖链的多肽的比例可经由例如使用HPLC、毛细管电泳、NMR、质量分析等方法测定。
本发明加成糖链的多肽经由将加成糖链的肽片段与至少2个肽片段连接而制造。
(肽片段)
如上所述，这些构成本发明加成糖链的多肽的加成糖链的肽片段及肽片段分别具有干扰素β的氨基酸序列的一部分。亦即，各片段具有将干扰素β的166个氨基酸序列至少分成3组的各个氨基酸序列。
此处，关于片段的数目及各片段之长度，考虑到因各片段合成时的延长导致的收率的降低、将各片段连接时必要的氨基酸种类、因连接步骤的数目导致的收率的降低，优选以优选的片段数在优选的氨基酸位置选择各片段的氨基酸序列。
各片段之长度依片段的制备方法而异，但例如，优选是9至84的长度，更优选是67至78的长度。
此外，连接各片段的方法可以硫醇游离连接(Thiol-free ligation)、施陶丁格连接(Staudinger Ligation)、糖协助连接(Sugar-Assisted Ligation)、硫醇辅助连接(Thiol auxiliary ligation)(Chem.Commu.,2011,47,6201-6207)、(Chem.Commu.,2010,46,21-43)等公知的方法连接，优选可使用自然化学连接法(Native Chemical Ligation：NCL)连接。
使用自然化学连接法时，将从干扰素β的氨基酸序列选择的各片段N末端必须为Cys。选择Cys以外的氨基酸作为各片段N末端的氨基酸时，可选择Ala、His、Lys、Phe、Ser、Thr、Val、Met。例如，片段的N末端为Ala时，可先合成导入了Cys替代N末端的Ala的片段，与其他片段连接后，再将Cys还原为Ala。此外，片段的N末端为Phe或Val时，作为待导入的氨基酸，可使用在β位具有硫醇基的非天然型氨基酸进行连接，之后进行还原处理。设计Ser、Thr作为片段的N末端时，可导入半胱氨酸作为N末端，连接后将该半胱氨酸残基的硫醇基甲基化，接着、经由溴化氰处理，可转换为Ser、Thr。此外，设计His或Lys作为片段的N末端时，导入这些氨基酸作为N末端后，经由利用氨基的亲核进攻(Nucleophilic attack)的连接反应，可形成期待的酰胺键。将其他氨基酸作为片段的N末端时，经由公知的方法，使用自然化学连接法，可构成最终的加成糖链的多肽。
此外，在干扰素β的氨基酸序列中，在所期待的位置不存在半胱氨酸时，最终产物的糖链多肽只要具有干扰素β活性，亦可在所期待的位置导入半胱氨酸，作为片段的N末端。此外，如所期望的，导入的半胱氨酸，可在各肽片段之间之连接步骤后，如上所述被取代为Ala、Ser、Thr。
于制造本发明加成糖链的多肽中，选择作为片段的N末端的氨基酸，从片段数目或最终产物收率的角度而言，优选从Ala、Phe、Val、Ser、Thr选择，更优选从经由还原反应可被取代的Ala、Phe、Val选择。更具体的实例为可将干扰素β中第1位至第67位作为第一片段，将在N末端具有第68位的Ala的第68位至第88位作为第二片段，将在N末端具有第89位的Ala的第89位至第166位作为第三片段。此外，例如上述的第89位至第166位的第三片段可分为第89位至第133位的片段及在N末端具有第134位的Ala的第134位至第166位的片段制造。
(片段的制造方法)
这些肽片段的制造方法可经由生物合成、化学合成或无细胞合成等方法制造。尤其是具有糖链的肽片段的合成，为了要将糖链作成均一的，优选经由化学合成而制造。经由化学合成的制造方法可使用通过固相合成、液相合成等公知的肽合成方法制造加成糖链的多肽的方法。此外，选择Ala作为各片段的N末端时，在将各片段连接后，由于需将替代Ala导入N末端的特定Cys还原为Ala，因此优选预先将不还原的Cys加以选择性保护。如此，于这些情况，经由化学合成制造肽片段是更简便且优选的。
本发明加成糖链的肽片段的制造方法中，作为糖链的结构为均一的加成糖链的多肽的稳定制造方法的具体实例，可使用通过使用加成糖链的Asn作为糖链加成的氨基酸，与肽片段相同，经由藉由固相合成、液相合成等公知的肽合成方法而制造加成糖链的肽片段的方法。这样的方法记载于例如Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,6851-6855。此外，例如于国际公开第2004/005330号说明书(US2005222382(A1))亦有记载，通过引用将其公开内容全部并入本说明书中。
加成糖链的多肽可经由例如以下概略表示的使用加成糖链的天冬酰胺的固相合成而制造。
(1)将经脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸的羧基结合于树脂(resin)。此时，由于氨基酸的氨基氮以脂溶性保护基保护，而可防止氨基酸之间的自缩合，而树脂与氨基酸进行反应而产生结合。
(2)将获得的反应物的脂溶性保护基脱离，形成游离氨基。
(3)将该游离氨基与氨基氮经脂溶性保护基保护的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应。
(4)将上述脂溶性保护基脱离，而形成游离氨基。
(5)将上述(3)及(4)之步骤重复操作1次以上，获得任意数目的任意氨基酸连接而成的末端结合有树脂，其他端具有游离氨基的肽。
(6)最后，用酸将树脂切断，可获得具有所期待的氨基酸序列的肽。
此处，于(1)中，使用以脂溶性保护基保护氨基氮的加成糖链的天冬酰胺替代以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸，只要将该天冬酰胺部分的羧基与树脂的羟基进行反应，即可获得在C末端具有加成糖链的天冬酰胺的加成糖链的肽片段。
此外，在(2)之后或将(3)及(4)重复操作1次以上的任意次数后，在(3)中只要使用以脂溶性保护基保护氨基氮的加成糖链的天冬酰胺替代以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸，即可在任意部位加成糖链。此外，在加成加成糖链的天冬酰胺后再进一步将(3)及(4)重复操作，即可将肽延长。
在结合加成糖链的氨基酸后，将脂溶性保护基脱离，形成游离氨基，之后进行步骤(6)，即可获得在N末端具有加成糖链的天冬酰胺的肽。
于上述的合成方法中所结合的糖链使用具有相同结构的以上所描述的糖链。这些糖链可经由任意的公知的方法获得。具体方法并无特别限制，可利用例如化学合成糖链(例如参照J.Seifert et al.Angew Chem Int.Ed.2000,39,p531-534)或从天然或人工的糖链供给源分离的糖链或市售的糖链。于该方法，具有相同结构的糖链氨基酸并无特别限制，例如从天然或人工糖链供给源将相同结构的糖链分离可根据例如WO2004/058789记载的方法进行。具体而言，从鸡蛋等天然的糖链供给源以Seko et al.,Biochim BiophysActa.1997；1335(1-2)：23-32等中记载的方法将含有糖链天冬酰胺的混合物(唾液酸糖肽(SGP))分离，在该糖链天冬酰胺中导入脂溶性的保护基(例如Fmoc)，以获得糖链天冬酰胺衍生物混合物，供层析仪进行层析，可将该混合物中含有的各种结构的糖链根据其结构而分离。此外，具有或不具有各种保护基的特定结构的糖链天冬酰胺可经由例如大冢化学(股)公司购得。
树脂只要是通常固相合成使用的树脂即可，可使用例如以氯官能化的2-氯三苯甲基氯树脂(默克(merck)公司制造)、以氨基官能化的Amino-PEGA树脂(默克公司制造)、具有羟基的NovaSyn TGT醇树脂(默克公司制造)、Wang树脂(默克公司制造)、HMPA-PEGA树脂(默克公司制造)等。此外，Amino-PEGA树脂与氨基酸之间可有连接子存在，这些连接子可列举例如4-羟甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。亦可使用在C末端的氨基酸预先结合于树脂的H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG树脂(默克公司制造)等。
此外，将C末端酰胺化时，例如可使用以氨基官能化之Rink-Amide-PEGA树脂(默克公司制造)。经由以酸切断该树脂与肽，可将肽的C末端氨基酸酰胺化。
树脂与以脂溶性保护基保护氨基氮的氨基酸的结合中，例如为了使用具有羧基的树脂或以氯官能化的树脂，氨基酸的羧基经由酯键与树脂结合。此外，使用以氨基官能化的树脂时，氨基酸的羧基经由酰胺键与树脂结合。
此外，优选的是2-氯三苯甲基氯树脂，因为于固相合成中将肽链延长时，它可防止位于末端的Cys外消旋化。
可以使用任意氨基酸作为所述氨基酸，可列举例如为天然氨基酸的丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。
脂溶性保护基可列举例如9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙氧基羰基、乙酰基等碳酸酯系或酰胺系的保护基等。在氨基酸中导入脂溶性保护基，例如导入Fmoc基时，可经由加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚氨基碳酸酯及碳酸氢钠，并使它们进行反应而导入。反应可以在0至50℃，优选在室温进行约1至5小时。
以脂溶性保护基保护的氨基酸可使用市售品。可列举例如Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Ser-OH、Boc-Asn-OH、Boc-Val-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Tyr-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Lys-OH、Boc-Arg-OH、Boc-His-OH、Boc-Asp-OH、Boc-Glu-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Thr-OH、Boc-Cys-OH、Boc-Met-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Trp-OH、Boc-Pro-OH。
此外，作为以脂溶性保护基保护的氨基酸，且在侧链导入保护基的氨基酸可列举例如Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Boc-Met-OH、Boc-Thz-OH。此外，于本说明书中，Thz表示噻唑烷型Cys(Thiazolidine-4-carboxylic acid)。
此外，经由固相合成等合成肽片段时，优选具有N末端以Boc基保护的氨基酸，因为在肽片段合成后需要硫酯化时，可抑制因氨基引起的亲核反应所导致的副反应。
此外，在加成糖链的多肽的氨基酸序列中，期望加成连接子时，可以在固相合成的过程中使用经脂溶性保护基保护的连接子替代上述以脂溶性保护基保护的氨基酸，即可在优选的位置插入连接子。
使用具有羟基的树脂时，作为酯化催化剂可使用例如1-均三甲苯基磺酰基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等公知的脱水缩合剂。此外，使用2-氯三苯甲基氯树脂时，可使用二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等碱进行酯化。氨基酸与脱水缩合剂的使用比例相对于氨基酸1重量份，脱水缩合剂通常为1至10重量份，优选为2至5重量份。
酯化反应优选经由例如在固相管柱放入树脂，将该树脂以溶剂洗净后，加入氨基酸溶液进行。洗净用溶剂可列举例如二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。将氨基酸溶解的溶剂可列举例如二甲亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应可以在0至50℃，优选在室温进行约10分钟至30小时，优选约15分钟至24小时。
此外，也优选的是，将固相上未反应的羟基使用乙酸酐等进行乙酰化而进行封端。
脂溶性保护基的脱离可经由例如用碱处理进行。碱可列举例如哌啶、吗啉等。此时，优选在溶剂存在下进行。溶剂可列举例如DMSO、DMF、甲醇等。
游离氨基与氨基氮以脂溶性保护基保护的任意氨基酸的羧基的酰胺化反应优选在活化剂及溶剂存在下进行。
活化剂可列举例如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮基磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻(DIPCI)、、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基鏻(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(pentafluorophenol)(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt)等。
相对于氨基氮以脂溶性保护基保护的任意氨基酸，活化剂之使用量为1至20当量，优选为1至10当量，进一步优选为1至5当量。
溶剂可列举例如DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应可以在0至50℃，优选在室温进行约10至30小时，优选为约15分钟至24小时较佳。脂溶性保护基的脱离可以以与上述相同的方式进行。
从树脂切断肽链优选以酸进行处理。酸可列举例如三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)、三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。
肽片段可经由如上所述的固相合成等化学合成而制备，亦可根据本领域技术人员公知的生物合成方法制备。例如，在重组载体(vector)中导入目标的基因，即可表达目标肽片段。本发明使用的重组载体只要是能将宿主细胞转化(transform)即可，根据宿主细胞而使用大肠菌用的质粒、枯草杆菌用的质粒、酵母用的质粒、逆转录病毒、牛痘病毒(vacciniavirus)、杆状病毒(baculovirus)等动物病毒载体等。这些中，在其宿主细胞中有适当地能将蛋白质表达的启动子(promotor)等控制序列的载体是优选的。此外，宿主细胞只要可在重组载体中表达外源基因即可，通常使用大肠菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
用重组载体转染宿主细胞的方法可使用通常常用的方法，例如为大肠菌时，可利用热休克法、氯化钙法或电穿孔法，为酵母时可利用氯化锂法或电穿孔法。此外，动物细胞的转化可使用电穿孔等物理方法、脂质体法或磷酸钙法等化学方法或逆转录病毒等病毒载体进行。此外，导入载体后，优选的是，以本领域技术人员公知的方法，确认目标的DNA序列被正确编入(integrated)。转化体(transformant)的宿主细胞的培养形式只要考虑宿主的营养生理学性质，而选择培养条件即可。
此外，经由生物合成制备的肽优选是经过纯化的。肽的纯化方法可经由通常的一般纯化法进行。例如，若为重组蛋白质，将表达本发明使用的重组蛋白质的菌体或细胞培养后，以公知的方法收集菌体或细胞，悬浮于适当的缓冲液，经由超声波、溶菌酶及/或冷冻融解等而将菌体或细胞破坏后经由离心分离或过滤，而制备肽的粗萃取液(extract)。缓冲液中可含有尿素或盐酸胍等蛋白质变性剂，或TritonX-100TM等表面活性剂。由此操作获得的萃取液或培养上清液中所含的肽的纯化，可根据公知的纯化方法进行。例如，可经由适当选择、组合亲和层析法、离子交换层析法、过滤器、超过滤、凝胶过滤、电泳、盐析、透析等，而进行肽的分离、纯化。
此外，为了使重组蛋白质的纯化容易起见，可先在表达载体中编入各种标签(tag)。标签的实例可使用提高表达效率的标签或提高纯化效率的标签等本领域技术人员公知的标签，可列举例如硫氧还蛋白(thioredoxin)、GST标签、Myc标签、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白质(MBP)等。
在肽片段所期望的N末端不存在连接使用的半胱氨酸时，可在该部位导入半胱氨酸。经由本技术领域公知的任意突变导入法可在所期望的位置突变为半胱氨酸，例如，包括对宿主细胞中导入的核酸分子的易错聚合酶链反应(error-prone PCR)、部位特异性突变导入、组装聚合酶链反应(assembly PCR)、DNA重排(DNA shuffling)、体内突变导入、盒式突变(cassette mutagenesis)导入、循环整体突变(recursive ensemble mutagenesis)导入及指数整体突变(exponential ensemble mutagenesis)导入，然而，不只限于此。
此外，于经由上述的生物合成制备的肽片段中，当进行氨基酸侧链的保护为优选时，可以以本领域技术人员公知的方法进行保护，例如保护半胱氨酸时，可以以甲醛等将N末端的半胱氨酸保护，使用S-9-芴甲基硫醚(S-9-Fluorenyl methyl thioether)(Fm-SR)等将肽中的Cys残基侧链硫醇基选择性保护。
(各片段的连接)
将以上述之方法制备的加成糖链的肽片段与肽片段连接的步骤可使用如上所述的可将2个肽片段链连接的任意公知的方法，可列举例如自然化学连接(NCL，参照日本特表2004-518621等)。NCL为将C末端具有硫酯的肽片段A与N末端具有半胱氨酸的肽片段B在缓冲溶液中混合，经由肽片段B的N末端的半胱氨酸的巯基的亲核进攻而将肽A的C末端的硫酯基脱离，接着经由胺的亲核进攻而将2个肽之间经由天然的肽键进行连接的方法。
因此，如上所述，在连接步骤使用NCL时，将位于N末端侧的多肽C末端硫酯化的步骤需要在连接步骤之前。相关的硫酯化可以通过例如将C末端的羧酸用PyBOP及DIPEA活化，并加入过剩量的烷基硫醇而实现。使用该方法时，为了抑制片段末端氨基酸的α碳原子的立体构型(configuration)，烷基硫醇的添加优选于10℃至-80℃的低温进行，更优选在0℃至-40℃的温度进行。尤其在上述硫酯化之反应中，优选使用苯硫酚替代烷基硫醇。经由添加苯硫酚引起的硫酯化反应，反应速度快，可使反应几乎完全完成。因此，于硫酯反应中，由于可抑制肽片段环化反应的副反应，因此是优选的。
此外，上述硫酯化亦可根据Yamamoto et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,130(2),501-510记载的Fmoc法或Boc法等进行。
NCL通过优选将等摩尔量的结合糖链部分的多肽链与未结合糖链部分的多肽链在缓冲溶液中混合而进行。于优选的方面中，连接反应在具有pH值为6至8的缓冲液中实施，优选的pH范围为6.5至7.5。该缓冲液可为水性、有机性或它们的混合物。连接反应可进一步含有1种或2种以上的催化剂及/或1种或2种以上的还原剂、脂质、其他变性剂或增溶剂等。优选催化剂的实例可列举含有硫醇及膦的物质，可列举例如苯硫酚、苄硫醇、TCEP及烷基膦等。变性剂及/或增溶剂的实例包括胍、尿素水溶液或TFE、HFIP、DMF、NMP等有机溶剂溶液、水、或与胍及尿素水溶液混合的乙腈。连接反应的速度可经由温度而调节，通常可于5℃至55℃、优选于15℃至40℃进行。尤其是IFN-β的连接反应优选以6M至8M胍的条件进行，例如于使用含有6M胍且pH值为6.8至7.8的缓冲液及1％至3％苯硫酚的反应体系中可很好地进行。
此外，连接步骤后的产物与原料的分离困难时，例如可通过利用过量的反应性高的C末端苯硫酯体(thiophenyl ester body)，将作为连接的连接点的半胱氨酸的硫醇基有意地(deliberately)硫酯化。如此，将经由连接所生成的肽侧链的硫醇基进行硫酯化，可提高产物的脂溶性或水溶性，从而容易分离。
此外，经由该操作，生成过量的硫酯化的硫醇基时，使用巯基乙磺酸钠等，可容易的恢复为硫醇基。
此外，设计将Ala作为N末端的各片段时，经由上述的方法可制造在N末端的Ala的位置具有替代的Cys的加成糖链的多肽。因此，于这些情况，于所制备的加成糖链的多肽中，优选将需要还原的氨基酸(Cys)经由还原反应恢复为Ala。
这些将Cys还原为Ala的方法可使用自由基还原、氢化物还原等方法，尤其优选为自由基还原。
自由基还原反应例如可经由在含有肽片段的TCEP等溶剂中添加tBuSH、2-巯基乙磺酸钠或谷胱甘肽而进行。自由基还原反应中使用的溶剂可以包括水、有机溶剂(乙腈等)、缓冲液(磷酸缓冲液等)等，具体而言可列举例如三(羧基乙基)膦溶液(TCEP溶液)。此外，溶剂中可含有增溶剂，例如所述溶剂优选含有6M至8M胍。此外，自由基还原反应优选在pH 7.5至pH 8.0的范围进行，反应温度优选在-15℃至40℃进行。pH若低于7.5，则不能充分反应完全，因此不是优选的。此外，反应时间可为2至6小时。若超过6小时，则峰值开始衰减，因此不是优选的。作为自由基还原反应的实例，所述反应可使用7M胍、0.25M TCEP，在pH值为7.5、20℃、4小时的条件下进行。
此外，于自由基还原反应中，不宜被还原的Cys可经由保护基保护。这些保护基可使用Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、叔丁基、苯甲基及β位经取代的乙基等公知的保护基。
此外，为了使反应进行完全，自由基还原反应优选采用用于放入反应溶液的死体积变小的反应容器。
此外，上述还原步骤之后、当有以Acm基等保护的Cys时，进行Cys的脱保护。
关于脱保护的步骤，例如于Cys的保护基为Acm基时，经由在水、甲醇、乙酸或它们的混合溶液中使用碘、乙酸汞(Ⅱ)、硝酸银(I)或乙酸银(I)等进行反应即可脱保护。此外，保护基为烷氧基甲基时，使用酸水解或银盐、汞盐等即可脱保护。保护基为三苯基甲基时，使用汞(Ⅱ)盐等即可脱保护。
上述反应通常于0℃至80℃，优选于5℃至60℃，进一步优选于10至35℃进行。反应时间优选通常为约5分钟至24小时。其他保护基亦可经由本领域技术人员所公知的方法脱保护。此外，反应完成后经由二硫苏糖醇(dithiothreitol)(DTT)或盐酸等处理后，优选以适当的公知方法(例如，高效液相色谱法(HPLC))进行纯化。
此外，设计将Ser作为N末端的各片段时，经由上述的方法，制造具有在N末端Ser的位置以Cys替代的加成糖链的多肽。因此，于这些情况，在制备之加成糖链的多肽中，将需要转换为Ser的氨基酸(Cys)在连接后转换为Ser。
这些转换步骤可经由例如Cys上的-SH基的甲基化反应、氰化反应及接着的分子内酰基转移反应(translocation reaction)进行。
具体而言，上述转换步骤包括：(1)于含有Cys的肽中，使Cys的-SH基与甲基化试剂进行反应，形成-SMe基(甲基化)的步骤、(2)将(1)步骤获得的肽上的-SMe基与氰化剂进行反应(氰化反应)、该反应之后通过将该肽置于碱性条件下而将-SMe基经由反应中间体转换为-OH基(分子内酰基转移反应)步骤。此外，这些转换步骤记载于例如国际公开2009/017154，通过引用将其公开内容全部并入本说明书中。
作为Cys的-SH基甲基化反应中使用的甲基化试剂只要可将-SH基转换为-SMe基即可，并无特别限制，可列举例如碘甲烷、甲基-4-硝基苯磺酸酯等。
相对于原料肽或原料糖肽的半胱氨酸残基的1残基，甲基化试剂的使用量为1至1000当量。优选为10至100当量。进一步优选为15至30当量。甲基化反应可以在0℃至50℃、优选在20℃至30℃进行约10分钟至30小时，优选为15分钟至1小时。
溶剂可为缓冲溶液，其pH值为7至9，优选为8至9。可列举例如6M盐酸胍液、0.25MTris-盐酸液、3.3mM EDTA溶液经调整pH值为8.6的缓冲溶液等。
从稳定性等的观点而言，氰化剂例如可使用溴化氰、苯基氰酸酯等，优选可使用容易取得的溴化氰。
相对于-SMe基的1残基，氰化剂的使用量可为1至1000当量，优选为10至100当量，更优选为15至30当量。理想地是，氰化剂的反应在0至50℃、优选于30℃至40℃进行约30分钟至100小时，优选为12小时至50小时。
与氰化剂的反应在酸性条件下进行，优选于pH值为2至3进行。通过使用酸性水溶性物质，即可使反应在酸性条件下进行，所述酸性水溶性物质具体而言可为甲酸、三氟乙酸、甲磺酸等。此时，为了防止硫原子的氧化，特别优选的是，将使用的酸性水溶性物质进行除气。此外，从氰化剂稳定性的观点而言，反应优选在遮光下进行。
溶剂可适当使用以上所述的pH值为2至3的水溶性溶剂，例如80％甲酸溶液、70％甲酸溶液、含有2％三氟乙酸/39％乙腈的水溶液等。
此外，于肽中含有蛋氨酸残基作为氨基酸时，优选将蛋氨酸残基的-SMe基与自甲基化反应所获得的-SMe基进行区分。该区分可经由例如导入保护基进行。于本说明书中，导入保护基的蛋氨酸(经保护的蛋氨酸)只要为在氰化反应中不与氰化剂产生反应的化合物即可，并无特别限制，可列举例如亚砜型蛋氨酸(Met(O)：-CH2-CH2-S(＝O)-CH3)。氰化反应后或分子内酰基转移反应后，经保护的蛋氨酸残基可转换为蛋氨酸残基。此外，脱保护的方法可经由本领域技术人员公知的方法适当进行。
分子内酰基转移反应可在与氰化反应时相比更为碱性的条件下进行。经由此，可获得包含具有-OH基的氨基酸残基的肽。
分子内酰基转移反应中的碱性条件只要为比氰化反应更碱性的条件即可，可为酸性或中性，更具体而言，只要是在该条件中，邻接氰化反应所获得的反应中间体的酯键的C原子上的-NH2基不会被质子化的条件即可。从可效率佳的进行将反应中间体转换为具有-OH基的肽的观点而言，可使用弱碱性条件或强碱性条件。
碱性条件可经由添加作为本领域技术人员公知的pH调整剂的碱性化合物(胍、磷酸二钠、Tris、碳酸氢钠、水合肼、50mM氢氧化钠水溶液等)进行。此时，碱性化合物的使用量相对于原料肽可为0.5至1000当量，优选为10至100当量，进一步优选为15至30当量。
理想地，分子内酰基转移在0至50℃，优选在20℃至30℃进行约5分钟至30小时，优选进行约5分钟至1小时，更优选进行约5分钟至10分钟。
反应的猝灭可经由降低pH值进行。可替换地，亦可在不变更pH值下移至经由HPLC的纯化步骤。
此外，选择苏氨酸(Thr)作为肽片段的N末端时，可将具有-SH基的苏氨酸(Thr)衍生物(或该-SH基经由二硫键等保护的苏氨酸衍生物)残基替代Cys，导入肽片段的N末端。导入苏氨酸衍生物的肽片段连接后经由进行上述之甲基化反应、氰化反应及分子内酰基转移反应，可将该肽片段中的苏氨酸衍生物置换为苏氨酸。
此外，在肽片段中导入具有唾液酸的糖链时，优选使用待导入的糖链上的唾液酸的羧基经由包括苯甲基(Bn)等在内的芳基、包括乙基(Et)或甲基(Me)等在内的烷基、二苯基甲基、苯甲酰甲基、烷氧基或硝基等在形成环结构的碳原子的侧链取代的苯甲酰甲基等保护的含有唾液酸的糖链。更具体而言，例如保护唾液酸的羧基为如-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH(Ph)2、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2PH(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2表示的保护基是优选的。如此，将唾液酸的羧基以苯甲基等保护，可防止对酸不稳定的唾液酸的脱离。尤其是于进行后述的加热处理时，亦可防止唾液酸从糖链非还原末端脱离。此外，在唾液酸的羧基导入保护基使制造步骤中经由HPLC等的分离/纯化步骤变容易。
糖链上唾液酸的羧基的保护反应可经由本领域技术人员公知的方法进行。例如经由苯甲基、二苯基甲基、苯甲酰甲基保护的唾液酸的羧基的保护基的脱保护亦可经由本领域技术人员公知的方法进行。例如，脱保护的反应可在碱性条件下经由水解进行，但不只限于以下。脱保护的反应通常于0至50℃，优选于0至40℃，进一步优选于0至30℃进行。反应时间优选通常为约5分钟至5小时。反应完成后经由磷酸或乙酸等弱酸中和后，优选以适当、公知的方法(例如，高效液相色谱法(HPLC))纯化。此外，唾液酸羧基的保护基的脱保护步骤可在折叠步骤之前或折叠步骤之后进行。
此外，上述表示的干扰素β的各制造步骤，可以为1锅法(one-pot)合成。例如，通过制备多个片段，经由多次的连接步骤制造干扰素β时，可将多个连接步骤作成1锅法合成。进一步，于片段连接后半胱氨酸的还原步骤为必要时，除了多个连接步骤之外，之后的半胱氨酸还原步骤亦可以以1锅法合成。
进一步，连接步骤(必要时，半胱氨酸的还原步骤等)之后必要的半胱氨酸的脱保护步骤及糖链唾液酸的脱保护步骤亦可作成1锅法合成。例如，经由将本专利申请说明书中实施例2及3中记载的第1步骤的连接及第2步骤的连接作成1锅化，可将收率提升约1.6倍。
如此，经由将制造步骤1锅化，减少HPLC的步骤，可缩短制造步骤的时间及简便化，进一步可提高收率，因此是优选的。
(折叠步骤)
经由上述方法使加成糖链的肽片段与肽片段结合，且可包括必要的氨基酸的取代步骤，或于脱保护步骤之后将所有部分经连接的加成糖链的多肽进行折叠的步骤。折叠步骤可使用各种公知的方法，可以包括但不只限于，例如在折叠缓冲液中的透析。折叠缓冲液并无限制，可含有例如谷胱甘肽、胱氨酸-半胱氨酸、胍等具有胍基的化合物或其盐，pH值为6.0至9.0。透析可进行多次，且，各透析处理的折叠缓冲液的组成或pH值可相同，亦可不同。
更具体而言，例如经由3次透析进行折叠步骤时，可将第1次的透析在含有8M胍，pH值为8.0至9.0的溶液中进行0.5至6小时，第2次的透析条件为在含有2M至4M胍，pH值为8.0至9.0的溶液中进行6至24小时，第3次的透析在含有1mM至20mM乙酸水溶液，pH值为2.0至4.0的溶液中进行6至24小时。
此外，折叠步骤中使用的折叠缓冲液中含有氧化型及还原型的谷胱甘肽时，优选将氧化型及还原型的浓度比根据加成于多肽的糖链种类适当变更。例如，糖链为二唾液酸糖链时，折叠缓冲液中所含的谷胱甘肽氧化型与谷胱甘肽还原型之比，优选在1：1至4：1的范围内，更优选为1：1至3：1，特别优选为2：1。此外，糖链为去唾液酸糖链时，谷胱甘肽氧化型与谷胱甘肽还原型之比，优选在4：1至16：1的范围内，更优选在6：1至10：1之范围内，特别优选为8：1。
此外，在折叠前将原料溶解时通过将原料作成低浓度，可抑制在不期待的部位的二硫键的形成或聚集等。
多肽折叠可以以解析多肽的立体结构的任意方法确认，包括但不只限于二硫键映射法(mapping)、立体结构抗原决定部位(epitope)的特异性抗体的结合性的评估、X射线解析等。
(加热处理)
此外，经由上述方法制造的加成糖链的多肽可进行加热处理。加热处理优选在折叠步骤之前进行。此外，于糖链多肽中，在糖链的非还原末端具有唾液酸时，优选在唾液酸之羧基以苯甲基等保护的状态进行加热处理。
加热处理可在例如在含有6M至10M的胍(Gn)，pH值为3.5至7的缓冲溶液中，于40℃至60℃的温度条件进行约24至72小时。通过进行加热处理可将有可能造成污染的HIV、HCV、HBV等有包膜病毒钝化。因此，本发明加成糖链的多肽即使实施加热处理，亦可维持其干扰素β活性。
此外，半胱氨酸的硫醇基由于经由加热处理产生副反应的可能性高，在加热处理步骤中优选先将半胱氨酸的硫醇基以Acm基等保护。
(活性)
本发明加成糖链的多肽具有干扰素β活性。于本说明书中，“干扰素β活性”是指具有免疫调节作用、抗病毒活性、抗肿瘤活性等公知的活性中的至少1种活性。
例如，加成糖链的多肽的干扰素β活性可使用实施例12中记载的抗肿瘤活性测定试验等测定。
抗肿瘤活性的测定试验通过例如对具有肿瘤的老鼠，皮下施用作为对象的加成糖链的多肽，经由测定随着时间变化的肿瘤体积即可进行研究。
此外，本发明加成糖链的多肽可提供具有90％以上的纯度。此外，本发明加成糖链的多肽优选具有95％、97％、98％、99.0％、99.5％以上的纯度。
于本说明书中，加成糖链的多肽的纯度是指将从制备目标的加成糖链的多肽时的总产量(g)扣除未反应物等杂质的产量(g)，除以制备加成糖链的多肽时的总产量的值再乘以100的值。此外，制备加成糖链的多肽时的总产量，更具体而言是指在折叠步骤之后，经由HPLC的产物分离步骤获得的目标加成糖链的多肽级分的产量。此外，杂质等亦包含糖链结构不相同的加成糖链的多肽。
此外，作成含有本发明加成糖链的多肽的组合物时，加成糖链的多肽的纯度是指与组合物中所含的其他成分区别的，在组合物中作为1种成分含有的加成糖链的多肽本身的纯度。
这些含有高纯度的加成糖链的多肽的组合物品质恒定，尤其是在医药品的制造或分析等领域是优选的。
此外，加成糖链的多肽之纯度可经由HPLC分析测定。经由HPLC测定的加成糖链的多肽的纯度可以以HPLC区域面积％表示。
(医药组合物)
接着，对含有本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物加以说明。
含有本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物在干扰素β相关的疾病的治疗或预防上有效。如上所述，干扰素β已知有种种作用，相关这些作用之疾病亦有种种。例如，干扰素β相关的疾病包含例如胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤等的脑肿瘤，皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬变及多发性硬化症等。含有本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物在上述疾病的治疗或预防上有效。
此外，含有本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物的施用对象为任意的生物个体，优选为动物，进一步优选为哺乳动物，最优选为人类的个体。
上述医药组合物为使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂，而制剂成通常医药组合物的形式。
这些医药组合物可列举例如片剂、丸剂、散剂、液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、吸入剂、滴眼剂、注射剂等。
医药组合物中所含的本发明加成糖链的多肽的量并无特别限制，可在广范围内适当选择，通常，在医药组合物中，优选含有1重量％至90重量％的本发明加成糖链的多肽，进一步优选含有1重量％至70重量％。
含有本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物亦可进一步含有其他有效成分，亦可与含有其他有效成分的医药组合物组合使用。此外，含有本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物亦可含有作为药学上可接受的盐的加成糖链的多肽，或者亦可含有不同的1种以上本发明加成糖链的多肽作为有效成分。此外，亦可与含有不同的1种以上本发明加成糖链的多肽作为有效成分的医药组合物组合使用。此外，医药组合物中可含有的其他成分可列举本领域技术人员公知的药学上可接受的载体等。
本发明相关的医药组合物的施用方法并无特别限制，可以对应各种制剂形态、病患的年齢、性别、疾病的状态、其他条件的方法施用。为片剂、丸剂、液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂及胶囊剂时的施用方法可列举例如经口施用。此外，为注射剂时，可单独或与葡萄糖、氨基酸等通常的补液混合，在静脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内施用。为栓剂时，可在直肠内施用。为滴眼剂时，适用于结膜囊等眼组织。为吸入剂时，适用于支气管或肺。
上述医药组合物的施用量只要对应用法、病患的年龄、性别、疾病的程度、其他条件适当选择即可，例如，相对于体重1公斤，本发明加成糖链的多肽的施用量可为0.001nmol至9nmol，优选为0.01nmol至0.2nmol。
上述医药组合物的施用次数只要对应用法、病患的年龄、性别、疾病的程度、其他条件适当选择即可，例如3次/1日、2次/1日、1次/1日，进一步对应其血中稳定性，可选择更少频率的施用次数(例如，1次/周、1次/月等)。优选地，上述医药组合物的施用次数为1次以下/1日。
本发明加成糖链的多肽中所加成的糖链可以通过体内的代谢系统容易地分解。此外，在本发明的一方面中，该糖链具有在活体内作为糖肽(或糖蛋白质)结合存在的结构。因此，本发明加成糖链的多肽及含有该肽作为有效成分的医药组合物具有即使在活体内施用，亦不会显示副作用或抗原性，亦无因过敏反应或产生抗体而导致不能得到药效的担忧等优点。
进一步，本发明加成糖链的多肽稳定，可简便地大量供给，从提供品质稳定的高品质医药品的观点而言，非常有用。
此外，本发明还提供了干扰素β相关的疾病的治疗或预防方法，其特征在于：施用有效量的本发明加成糖链的多肽。
此外，本说明书中使用的用语为用于说明特定的实施方案，并不是意图限制发明。
此外，本说明书中使用的“包含”的用语除了文意上明显不同理解之情况，意指所叙述的事项(构件、步骤、要素、数字等)存在，而并未排除这些以外的事项(构件、步骤、要素、数字等)存在。
只要没有不同的定义，此处使用的所有用语(包含技术用语及科学用语)具有与本发明所属技术的技术人员所广泛理解的意思是一样的。此处使用的用语只要未明示不同的定义，可解释为具有与本说明书及相关技术领域中的含义一致的含义，不应解释为理想化或过度形式化的含义。
虽有参照示意图对本发明的实施方案加以说明的情形，但为示意图时，为了明确的说明，有夸张表达的情形。
为了表达多种要素，使用第一、第二等用语，应理解这些要素不应受这些用语的限定。这些用语仅是为了将1个要素与其他要素区别，例如将第一要素以第二要素记载，同样的，第二要素以第一要素记载，亦为不脱离本发明的范围。
以下，参照实施例对本发明作更详细的说明。然而，本发明可根据各种形式而具体化，不应被解释为限于此处记载的实施例。
[实施例]
下述的实施例中例示了将干扰素β的氨基酸序列中第1-166个的氨基酸分为具有第1位至第67位的氨基酸的肽片段A、具有第68位至第88位的氨基酸的糖肽片段B、具有第89位至第166位的氨基酸的肽片段C的3个片段而制造的方法。
更具体而言，例示了包括下述步骤的制造方法：
(I)制备下述式(d)表示之肽片段A、下述式(e)表示之糖肽片段B及下述式(f)表示之肽片段C之步骤。
[化学式32]
[化学式33]
[化学式34]
(Ⅱ)将片段B及片段C经由连接(ligation)而连结(link)，作成片段(B+C)，将片段(B+C)的N末端的噻唑烷型半胱氨酸转换为半胱氨酸的步骤(参照图1)。
(Ⅲ)将片段A及片段(B+C)经由连接而连结，作成片段(A+B+C)的步骤(参照图2)。
(Ⅳ)于片段(A+B+C)中，将用于连接的半胱氨酸还原为丙氨酸的步骤(参照图3)。
(Ⅳ)将半胱氨酸的保护基脱保护的步骤(参照图4)。
此外，于各片段中，用于经由连接而连结的C末端被硫酯化，经由连接的连结所使用的N末端具有半胱氨酸。此外，在上述式(Ⅱ)表示的糖肽片段B中，于C末端侧的连接步骤，为了避免副反应，将N末端侧的半胱氨酸作成噻唑烷型。
上述片段B及片段C的N末端的氨基酸为干扰素β中第68位及第89位的丙氨酸。然而，由于连接需要半胱氨酸，于上述制造例中，将片段B及片段C的N末端氨基酸以半胱氨酸替代丙氨酸而合成，连接后再还原为丙氨酸。
此外，于本说明书中，例如片段(A+B)是指连接在一起的片段A与片段B。
实施例1各肽片段的合成
(1-1.肽片段A-SPh的合成)
于固相合成用管柱中放入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后以DMF充分溶胀。将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2mL)，放入管柱中，于室温搅拌4小时。以DMF及DCM将树脂充分洗净，获得HMPB-PEGA树脂，作为固相合成的固相使用。
将Fmoc-Phe(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行后续肽链的延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基及Boc基保护之氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。
依序使用以下以Fmoc基及Boc基保护的氨基酸连接于固相树脂：Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Met，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ile，Fmoc-Leu-Thr(ΨMe，MePro)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Phe，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ile，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Ile，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Met，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Phe，Fmoc-Gly，Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Boc-Met。其结果，在固相树脂获得Phe-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Thr(ΨMe，MePro)-Leu-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Phe-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Pro-Ile-Asp(OtBu)-Phe-Asn(Trt)-Met-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Gln(Trt)-Phe-Asn(Trt)-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Leu-Phe-Gly-Leu-Leu--Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Met-BocNH的67残基肽(1)(序列编号2)。
将上述获得的肽(1)以DCM及DMF洗净后，以能将树脂充分浸泡的程度加入三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与肽1切割分离。过滤除去经切割分离的树脂，反应溶液在减压下浓缩。将获得的残渣浓缩，获得氨基酸的侧链经保护的肽(1)(序列编号3)：Phe-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Thr(ΨMe，MePro)-Leu-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Phe-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Pro-Ile-Asp(OtBu)-Phe-Asn(Trt)-Met-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Gln(Trt)-Phe-Asn(Trt)-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)--Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Leu-Phe-Gly-Leu-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Met-BocNH。
将具有67残基的氨基酸，且氨基酸侧链经保护的肽(1)100μmol当量移至回收烧瓶(recovery flask)，溶解于DMF(3.0mL)后在氮气氛下冷却至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)后加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接着加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后加入三氟乙酸(0.1mL)，缓缓恢复到室温。恢复到室温后在减压下将反应溶液浓缩。获得的残渣加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌。2小时后再次将该溶液加入另外准备的二乙醚(150mL)中，沉淀后离心分离，除去溶液部分，而获得含有目的肽硫酯体的残渣。获得的残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱(isocratic elution)5分钟，然后线性梯度]纯化，获得C末端为苯硫酯的肽片段A-SPh(1)(序列编号4)：H2N-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys(Acm)-Gln-Lys-Leu-Leu-Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr-Cys(Acm)-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-SPh。
ESI-MS：C378H581N97O106S6：计算值[M+4H]4+2094.16、[M+5H]5+1675.53、[M+6H]6+1396.44，实测值2094.06、1675.43、1396.17
(1-2.加成二唾液酸糖链的肽片段B-SPh的合成)
于固相合成用管柱中放入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后，以DMF充分溶胀。将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2mL)，放入管柱中，于室温搅拌4小时。以DMF及DCM将树脂充分洗净，获得HMPB-PEGA树脂，作为固相合成的固相使用。
将Fmoc-Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，依序缩合氨基酸。
依序使用以下以Fmoc基保护的氨基酸，Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，在固相树脂上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)的8残基肽。对于该8残基肽，将Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护，以DMF洗净后在另外准备的离心沉淀管中将二苯甲基二唾液酸糖链天冬酰胺(g)(547.8mg，200μmol)及DEPBT(59.9mg，200μmol)溶解于DMF/DMSO(1：1混合溶液，3.33mL)，放入固相合成用管柱中，加入DIPEA(52.3μL，300μmol)，于室温搅拌18小时。以DMF及DCM洗净，在固相上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖(dibenzyl-disialooligosaccharide)-FmocNH的9残基糖链肽(序列编号5)。
[化学式35]
将上述获得的固相树脂上的9残基糖链肽的脂溶性保护基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)进行脱保护后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行之后的糖肽链的延长。
将氨基经Fmoc基保护之氨基酸及HOBt(67.6mg，0.50mmol)、DIPCI(73.1μL，0.475mmol)溶解于DMF(6.3mL)，进行15分钟活性化后放入固相合成用管柱中，于室温搅拌1小时后将Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟进行脱保护。反复进行该操作，依序将氨基酸缩合。依序使用以下以Fmoc基及Boc基保护的氨基酸，连接于固相树脂：Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸。其结果，在固相树脂上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN的21残基的加成糖链的肽片段(2)(序列编号6)。
之后，以DCM及DMF洗净后以能将树脂充分浸泡的程度加入三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与加成糖链的肽片段切割分离。过滤除去经切割分离的树脂，反应溶液在减压下浓缩。将获得的残渣浓缩，获得氨基酸的侧链经保护的21残基的糖链肽(2)(序列编号7)：Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN。
将具有21残基的氨基酸、且氨基酸侧链经保护的加成糖链的肽片段(2)100μmol当量移至回收烧瓶，溶解于DMF(3.0mL)后，在氮气氛下冷却至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)后，加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接着加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后加入三氟乙酸(0.1mL)，缓缓恢复到室温。恢复到室温后在减压下将反应溶液浓缩。获得之残渣加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌。2小时后再次将该溶液加入另外准备的二乙醚(150mL)，沉淀后离心分离，除去溶液部分，获得含有目标加成糖链的肽硫酯体的残渣。获得的残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→52：48(26分钟)→5：95(28分钟)，线性梯度]纯化，获得C末端为苯硫酯(thiophenyl ester)的加成二唾液酸糖链的肽片段B-SPh(2)(序列编号8)：HN-Thz-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-SPh。
ESI-MS：C209H314N34O96S2：计算值[M+3H]3+1635.34、[M+4H]4+1226.76，实测值1635.04、1226.51
(1-3.加成去唾液酸糖链的肽片段B-SPh的合成)
于固相合成用管柱中放入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净以DMF充分溶胀。将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2mL)，放入管柱中，于室温搅拌4小时。以DMF及DCM将树脂充分洗净，获得HMPB-PEGA树脂，作为固相合成的固相使用。
将Fmoc-Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后，加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。
依序使用以下以Fmoc基保护的氨基酸，并将其连接于固相树脂上：Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)。其结果，在固相树脂上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)的8残基的肽片段(序列编号9)。对于该8残基的肽片段，将Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(1mL)处理15分钟，进行脱保护，以DMF洗净后在另外准备的离心沉淀管中将去唾液酸糖链天冬酰胺衍生物(h)(547.8mg，200μmol)及DEPBT(59.9mg，200μmol)溶解于DMF/DMSO(1：1混合溶液，3.33mL)，放入固相合成用管柱中，加入DIPEA(52.3μL，300μmol)，于室温搅拌18小时。以DMF及DCM洗净，在固相上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(去唾液酸寡糖(Asialooligosaccharide)-FmocNH的9残基加成糖链的肽片段(序列编号10)。
[化学式36]
将上述获得的固相树脂上的9残基糖链肽的脂溶性保护基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)进行脱保护后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行之后的糖肽链的延长。将氨基经Fmoc基保护的氨基酸及HOBt(67.6mg，0.50mmol)、DIPCI(73.1μL，0.475mmol)溶解于DMF(6.3mL)，进行15分钟活性化后放入固相合成用管柱中，于室温搅拌1小时后将Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟进行脱保护。反复进行该操作，依序将氨基酸缩合。依序使用以下以Fmoc基及Boc基保护的氨基酸，并将其连接于固相树脂上：Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸。其结果，在固相树脂上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(去唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)--Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN的21残基的氨基酸侧链经保护的加成糖链的肽片段(3)(序列编号11)。
以DCM及DMF洗净后以能将树脂充分浸泡的程度加入三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与加成糖链的肽片段(3)切割分离。过滤除去经切割分离的树脂，反应溶液在减压下浓缩。将获得的残渣浓缩，获得氨基酸的侧链经保护的加成糖链的肽片段(3)(序列编号12)：Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(去唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN。
将21残基的氨基酸侧链经保护的加成糖链的肽片段(3)100μmol当量移至回收烧瓶，溶解于DMF(3.0mL)后，在氮气氛下冷却至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)后，加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接着加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后加入三氟乙酸(0.1mL)，缓缓恢复到室温。恢复到室温后在减压下将反应溶液浓缩。获得之残渣加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌。2小时后再次将该溶液加入另外准备的二乙醚(150mL)，沉淀后离心分离，除去溶液部分，获得含有目标加成糖链的肽硫酯体的残渣。获得的残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→52：48(26分钟)→5：95(28分钟)，线性梯度]纯化，获得C末端为苯硫酯的加成去唾液酸糖链的肽片段B-SPh(3)(序列编号13)：HN-Thz-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn(去唾液酸寡糖)-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-SPh。
ESI-MS：C173H268N32O80S2：计算值[M+3H]3+1381.09,[M+4H]4+1036.07,实测值1380.90、1035.92
(1-4.肽片段C的合成)
于固相合成用管柱中放入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净并以DMF充分溶胀。将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2mL)，放入管柱中，于室温搅拌4小时。以DMF及DCM将树脂充分洗净，获得HMPB-PEGA树脂，作为固相合成的固相使用。
将Fmoc-Asn(Trt)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。依序使用以下作为以Fmoc基及Boc基保护的氨基酸，连接于固相树脂上：Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Met，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe-Thr(ΨMe，MePro)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Val，Fmoc-Lys(Boc)-Thr(ΨMe，MePro)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asn(Trt)，Boc-Cys(Trt)。其结果，在固相树脂上获得78残基的肽片段(4)(序列编号14)：Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Ile-Phe-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Ile-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Ala-Cys(Acm)-His(Trt)-Ser(ΨMe，MePro)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Lys(Boc)-Leu-Tyr(tBu)--His(Trt)-Leu-Ile-Arg(Pbf)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Leu-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Met-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)--Thr(ΨMe，MePro)-Phe-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu--Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Thr(ΨMe，MePro)-Lys(Boc)-Leu--His(Trt)-Asn(Trt)-Ile-Gln(Trt)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Cys(Trt)-BocNH。
将上述获得的肽片段(4)加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌3.5小时，将树脂与肽片段(4)切割分离后加入另外准备的二乙醚(150mL)中，沉淀后离心分离，将含有作为目标的肽片段(4)的沉淀物与溶液部分分开，除去溶液部分后目的物以HPLC确认后，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→65：35(5分钟)→30：70(35分钟)→5：95(45分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得作为目标的肽片段C(4)(序列编号15)：H2N-Cys-Asn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys(Acm)-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn。
ESI-MS：C441H688N124O114S3：计算值[M+8H]8+1206.89,[M+9H]9+1072.90,[M+10H]10+965.71,[M+11H]11+804.93,实测值1206.85，1072.87，965.58，877.90，804.90
实施例2去唾液酸IFN-β的合成
具有去唾液酸糖链的活性IFN-β依以下表示的5个步骤合成。
(2-1.第1步骤加成去唾液酸糖链的肽片段B与肽片段C的连接)
将21残基的C末端为苯硫酯体的加成去唾液酸糖链的肽片段B(3)(1.8mg)与78残基的肽片段C(4)(2.5mg)两种片段放入同一回收烧瓶中，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.26mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)制备)后，加入苯硫酚(7.8μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，在反应溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(0.39mL)(通过在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液制备)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有糖肽片段的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→65：35(5分钟)→30：70(35分钟)→5：95(45分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在相当于干扰素β第80位的位置具有去唾液酸糖链的目标的肽片段(11)(序列编号16)(图5及图6)。
ESI-MS：C607H950N156O194S4：计算值[M+10H]10+1367.52,[M+11H]11+1243.29,[M+12H]12+1139.77,[M+13H]13+1052.17,[M+14H]14+977.09,[M+15H]15+912.02,[M+16H]16+855.08,[M+17H]17+804.84,[M+18H]18+760.18,实测值1367.64，1243.33，1139.80，1052.20，977.10，912.03，855.09，804.84，760.18
(2-2.第2步骤肽片段A与加成去唾液酸糖链的肽片段(B+C)的连接)
将上述第1步骤获得的67残基的C末端为苯硫酯的肽(1)(2.3mg)及在相当于干扰素β的第80位的位置具有去唾液酸糖链的肽片段(11)(加成去唾液酸糖链的肽片段(B+C))(68-166)(1.9mg)两种片段放入同一回收烧瓶，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.14mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP溶液制备)后，加入苯硫酚(4.2μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，加入巯基乙磺酸钠(1.1mg)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDOproteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89位的Cys具有游离硫醇基，第80位的Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(12)(序列编号17)(图7及图8)。
ESI-MS：C979H1525N253O300S9：计算值[M+17H]17+1290.86,[M+18H]18+1219.20,[M+19H]19+1155.09,[M+20H]20+1097.38,[M+21H]21+1045.18,[M+22H]22+997.71,[M+23H]23+954.38,[M+24H]24+914.65,[M+25H]25+878.11,[M+26H]26+844.37,[M+27H]27+813.14,[M+28H]28+784.13,[M+29H]29+757.13,实测值1219.21、1155.11、1097.43、1045.23、997.71、954.43、914.67、878.11、844.37、813.17、784.13、757.16
(2-3.第3步骤Cys还原为Ala)
将上述第2步骤获得的第68、89位Cys具有游离硫醇基，第80位Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(12)(1.0mg)放入回收烧瓶，溶解于pH值为7.5的缓冲溶液(0.10mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液制备)后，加入pH值为7.5的0.5M三乙基羧基膦(Tris-ethylcarboxy phosphine)溶液(TCEP溶液)(0.10mL)(TECP，以6M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺制备)、tBuSH(4.2μL)、0.1M VA-044溶液(4.2μL)(将VA-044溶解于水制备)，于室温进行反应。4小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取tBuSH后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89位Cys转换为Ala、第80位Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(13)(序列编号18)(图9及图10)。
ESI-MS：C979H1525N253O300S7：计算值[M+17H]17+1287.09,[M+18H]18+1215.64,[M+19H]19+1151.71,[M+20H]20+1094.18,[M+21H]21+1042.12,[M+22H]22+994.80,[M+23H]23+951.59,[M+24H]24+911.98,[M+25H]25+875.54,[M+26H]26+841.91,[M+27H]27+810.76,[M+28H]28+781.84,[M+29H]29+754.92,实测值1287.05、1215.71、1151.76、1094.23、1042.17、994.88、951.64、911.99、875.61、841.95、810.77、781.85、754.94
(2-4.第4步骤Acm基的脱保护)
将上述第3步骤获得的第80位Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(13)(0.3mg)放入微量离心管(Eppendorf Tube)中，于90％乙酸水溶液(0.03mL)中溶解后，加入乙酸银(0.10mg)，于室温及遮光下进行反应。3.5小时后用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。在反应溶液中加入二硫苏糖醇(1.0mg)，于室温搅拌5分钟后离心分离，除去沉淀物，回收上清液。将回收的上清液以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDOproteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝50：50→50：50(5分钟)→20：80(35分钟)→5：95(35.5分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得第17位、31位及141位的半胱氨酸的Acm基经脱保护、第80位Asn具有去唾液酸糖链的加成糖链的多肽(14)(序列编号19)(图11及图12)。
ESI-MS：C970H1510N250O297S7：计算值[M+17H]17+1274.55,[M+18H]18+1203.80,[M+19H]19+1140.49,[M+20H]20+1083.52,[M+21H]21+1031.97,[M+22H]22+985.11,[M+23H]23+942.32,[M+24H]24+903.10,[M+25H]25+867.01,[M+26H]26+833.70,[M+27H]27+802.86,[M+28H]28+774.23,[M+29H]29+747.56,实测值1274.62、1203.82、1140.53、1083.55、1032.01、985.15、942.38、903.12、867.05、833.72、802.91、774.29、747.55
(2-5.第5步骤折叠步骤)
将上述第4步骤获得的第80位Asn具有去唾液酸糖链的加成糖链的多肽(14)(0.32mg)放入离心沉淀管，溶解于pH值为8.5的缓冲溶液(3.5mL)(以8M盐酸胍液、0.1mMTris溶液制备)后于室温静置。1小时后将该溶液移至透析膜(Spectra/Pro、MWCO；8000)。将该透析膜放入透析外液A(以3M盐酸胍液、0.1mM Tris溶液、8mM还原型谷胱甘肽溶液、1mM谷胱甘肽溶液制备)中，于4℃进行透析。12小时后将该透析膜放入透析外液B(以1M盐酸胍液、0.1mM Tris溶液制备)中，于4℃进行透析。12小时后将该透析膜放入透析外液C(10mM乙酸溶液)中，于4℃进行透析。24小时后将该透析膜从透析外液取出，将透析膜内液移至离心沉淀管。透析膜内液以HPLC分析时，主峰的洗脱时间从阶段透析操作开始时间的17.4分缩短到阶段透析操作完成后的11.6分，以ESI-MS测定该峰时，确认从阶段透析操作开始前的分子量减少2Da的分子量，此处，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝50：50→50：50(5分钟)→20：80(35分钟)→5：95(35.5分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得加成糖链的多肽(15)(序列编号20)(图13及图14)。此外，以HPLC确认该分取液的纯度时，具有99.00％(HPLC区域面积％)的纯度(图15)。之后，将获得的加成糖链的多肽(15)冻结干燥。对于该冻结干燥品，在以10mM乙酸水溶液再溶解时用分光光度计(紫外线吸收法)进行糖蛋白质定量及作为体外活性用试样进行浓度限定。此外，体内活性用试样由将含有加成糖链的多肽(15)，糖蛋白质浓度经限定的10mM乙酸水溶液溶解于作为制剂化(formulatio)用的另外准备的缓冲液(以人血清白蛋白(30mg)、氯化钠(24.4mg)、磷酸氢二钠水合物(7.53mg)、结晶磷酸二氢钠(1.41mg))，再次冻结干燥后用日本药典注射用水溶解而制备。
阶段透析后、HPLC纯化后的ESI-MS：C970H1508N250O297S7：计算值[M+9H]9+2406.37,[M+10H]10+2165.83,[M+11H]11+1969.03,[M+12H]12+1805.03,[M+13H]13+1666.25,[M+14H]14+1547.31,[M+15H]15+1444.22,[M+16H]16+1354.02,[M+17H]17+1274.43,[M+18H]18+1203.68,实测值2406.21、2165.68、1968.85、1804.85、1666.09、1547.16、1444.05、1353.93、1274.39、1203.63
实施例3.二唾液酸IFN-β的合成
具有二唾液酸糖链的活性IFN-β依以下表示的6个步骤合成。
(3-1.第1步骤加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B与肽片段C的连接)
将21残基的C末端为苯硫酯体的加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B(2)(2.2mg)与78残基的肽片段C(4)(2.5mg)两种片段放入同一回收烧瓶中，溶解于pH值为7.3的缓冲溶液(0.21mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)制备)后，加入苯硫酚(6.2μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，在反应溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(0.31mL)(通过在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液而制备)，于室温进行反应。12小时后使用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有糖肽片段的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得目标的相当于干扰素β第80位的位置具有二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(B+C)(5)(序列编号21)(图16及图17)。
ESI-MS：C643H996N158O210S4：计算值[M+10H]10+1443.10,[M+11H]11+1312.63,[M+12H]12+1203.33,[M+13H]13+1110.84,[M+14H]14+1031.57,[M+15H]15+962.87,[M+16H]16+902.75,[M+17H]17+849.70,[M+18H]18+802.55,[M+19H]19+760.37,实测值1443.78，1312.66，1203.36，1110.84，1031.58，962.86，902.76，849.70，802.55，760.36
(3-2.第2步骤肽片段A与加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(B+C)的连接)
将67残基的C末端为苯硫酯的肽片段A(1)(2.9mg)及上述第1步骤获得的于相当于干扰素β第80位的位置具有二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(B+C))(5)(3.3mg)两种片段放入同一回收烧瓶，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.22mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP溶液制备)后加入苯硫酚(7.0μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，加入巯基乙磺酸钠(2.0mg)，于室温进行反应。12小时后使用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后，将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89位Cys具有游离硫醇基、第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(6)(序列编号22)(图18及图19)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S9：计算值[M+16H]16+1419.15,[M+17H]17+1335.73,[M+18H]18+1261.58,[M+19H]19+1195.23,[M+20H]20+1135.52,[M+21H]21+1081.50,[M+22H]22+1032.38,[M+23H]23+987.54,[M+24H]24+946.44,[M+25H]25+908.62,[M+26H]26+873.71,[M+27H]27+841.39,[M+28H]28+811.37,[M+29H]29+783.43,[M+30H]30+757.35,实测值1419.12，1335.73，1261.55，1195.21，1135.48，1081.49，1032.35，987.51，946.42，908.61，873.70，841.39，811.36，783.42，757.36
(3-3.第3步骤Cys还原为Ala)
将上述第2步骤获得的第68、89位Cys具有游离硫醇基、第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(6)(4.0mg)放入回收烧瓶中，溶解于pH值为7.5的缓冲溶液(0.28mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液制备)后，加入pH值为7.5的0.5M三乙基羧基膦溶液(TCEP溶液)(0.28mL)(TECP，以6M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺制备)、加入tBuSH(28μL)、0.1M VA-044溶液(28μL)(将VA-044溶解于水制备)，于室温进行反应。4小时后使用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取tBuSH后，将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDOproteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89位Cys转换为Ala、第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(7)(序列编号23)(图20及图21)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S7：计算值[M+18H]18+1258.02,[M+19H]19+1191.86,[M+20H]20+1132.32,[M+21H]21+1078.44,[M+22H]22+1029.47,[M+23H]23+984.75,[M+24H]24+943.76,[M+25H]25+906.05,[M+26H]26+871.24,[M+27H]27+839.01,[M+28H]28+809.08,[M+29H]29+781.22,实测值1258.02，1191.86，1132.31，1078.39，1029.43，984.73，943.76，906.04，871.25，839.01，809.06，781.17
(3-4.第4步骤Acm基的脱保护)
将上述第3步骤获得的第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(7)(2.9mg)放入微量离心管中，于90％乙酸水溶液(0.13mL)中溶解后，加入乙酸银(0.43mg)，于室温及遮光下进行反应。3.5小时后使用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。在反应溶液中加入二硫苏糖醇(3.0mg)，于室温搅拌5分钟后离心分离，除去沉淀物，回收上清液。将回收的上清液以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDOproteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝50：50→50：50(5分钟)→20：80(35分钟)→5：95(35.5分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得第17位、31位及141位的Acm基经脱保护、第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(8)(序列编号24)(图22及图23)。
ESI-MS：C1006H1556N252O313S7：计算值[M+18H]18+1246.17,[M+19H]19+1180.64,[M+20H]20+1121.65,[M+21H]21+1068.29,[M+22H]22+1019.78,[M+23H]23+975.48,[M+24H]24+934.88,[M+25H]25+897.52,[M+26H]26+863.04,[M+27H]27+831.11,[M+28H]28+801.47,[M+29H]29+773.86，实测值1246.16，1180.60，1121.62，1068.27，1019.74，975.44，934.85，897.49，863.00，831..08，801.45，773.81
(3-5.第5步骤苯甲基的脱保护)
将上述第4步骤获得的第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(8)(1.9mg)放入回收烧瓶中，溶解于8M胍盐溶液(0.17mL)(以盐酸胍盐、20mMTCEP制备)后于室温搅拌。于冰水中冷却后缓缓加入50mM氢氧化钠水溶液(0.85mL)。于冰水中进行反应20分钟后使用缓冲液(2.1mL)(以8M胍溶液、0.2M乙酸钠水溶液制备)中和。用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液直接以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝50：50→50：50(5分钟)→20：80(35分钟)→5：95(35.5分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得第80位Asn具有二唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(9)(序列编号25)(图24及图25)。
ESI-MS：C992H1544N252O313S7：计算值[M+17H]17+1308.81,[M+18H]18+1236.16,[M+19H]19+1171.15,[M+20H]20+1112.64,[M+21H]21+1059.71,[M+22H]22+1011.58,[M+23H]23+967.64,[M+24H]24+927.37,[M+25H]25+890.31,[M+26H]26+856.11,[M+27H]27+824.44,[M+28H]28+795.03,[M+29H]29+767.65,[M+30H]30+742.09，实测值1308.80，1236.17，1171.12，1112.63，1059.67，1011.56，967.63，927.34，890.29，856.09，824.42，795.01，767.63，742.08
(3-6.第6步骤折叠步骤)
将上述第5步骤获得的第80位Asn具有二唾液酸糖链的加成糖链的多肽(9)(1.3mg)放入离心沉淀管，溶解于pH值为8.5的缓冲溶液(13mL)(以8M盐酸胍液、0.1mM Tris溶液制备)后于室温静置。1小时后将该溶液移至透析膜(Spectra/Pro、MWCO；8000)。将该透析膜放入透析外液A(以3M盐酸胍液、0.1mM Tris溶液、2mM还原型谷胱甘肽溶液、1mM谷胱甘肽溶液制备)中，于4℃进行透析。12小时后将该透析膜放入透析外液B(以1M盐酸胍液、0.1mM Tris溶液制备)中，于4℃进行透析。12小时后将该透析膜放入透析外液C(10mM乙酸溶液)中，于4℃进行透析。24小时后将该透析膜从透析外液取出，将透析膜内液移至离心沉淀管。透析膜内液以HPLC分析时，主峰的洗脱时间从阶段透析操作开始时间的28.0分，缩短到阶段透析操作完成后的26.1分，以ESI-MS测定该峰时，确认从阶段透析操作开始前分子量减少2Da的分子量，此处，直接以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝46：54→46：54(5分钟)→34.5：65.5(28分钟)→5：95(28.5分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得加成糖链的多肽(10)(序列编号26)(图26及图27)。此外，以HPLC确认该分取液的纯度时，具有99.36％(HPLC区域面积％)的纯度(图28)。之后，将获得的加成糖链的多肽(10)冻结干燥。对于该冻结干燥品，在以10mM乙酸水溶液再溶解时用分光光度计(紫外线吸收法)进行糖蛋白质定量及作为体外活性用试样进行浓度限定。
此外，体内活性用试样由将含有加成糖链的多肽10，糖蛋白质浓度经限定的10mM乙酸水溶液溶解于作为制剂化用的另外准备的缓冲液(以人血清白蛋白(30mg)、氯化钠(24.4mg)、磷酸氢二钠水合物(7.53mg)、结晶磷酸二氢钠(1.41mg)制备)，再次冻结干燥后用日本药典注射用水溶解而制备。
阶段透析后、HPLC纯化后ESI-MS：C992H1542N252O313S7：计算值[M+10H]10+2224.08,[M+11H]11+2021.98,[M+12H]12+1853.57,[M+13H]13+1711.06,[M+14H]14+1588.92,[M+15H]15+1483.05,[M+16H]16+1390.43,[M+17H]17+1308.69,[M+18H]18+1236.05,实测值2223.88，2021.80，1853.43，1710.91，1588.77，1482.92，1390.35，1308.61，1236.01
于上述实施例2及3，通过将干扰素β的氨基酸序列分为3个片段而制造，但于下述实施例4至6表示将干扰素β的氨基酸序列分为4个片段而制造的实例。
此外，于实施例4至6，通过将具有干扰素β第89位至第166位的氨基酸的肽片段C进一步分为第89位至第134位的片段C1及于N末端具有第134位的Ala的第135位至第166位的片段C2，从总计4个肽片段而制造加成糖链的多肽。
实施例4.肽片段(C1+C2)的合成
(4-1.肽片段C1-SPh的合成)
于固相合成用管柱中放入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后以DMF充分溶胀。将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2mL)，放入管柱中，于室温搅拌4小时。以DMF及DCM将树脂充分洗净，获得HMPB-PEGA树脂，作为固相合成的固相使用。
将Fmoc-Lys(Boc)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护之氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后，加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。
作为以Fmoc基或Boc基保护的氨基酸依序使用Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Met，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe-Thr(ΨMe，MePro)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Val，Fmoc-Lys(Boc)-Thr(ΨMe，MePro)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asn(Trt)，作为以Boc基保护的氨基酸的Boc-L-噻唑烷-4-羧酸，并连接于固相树脂上。其结果，在固相树脂上获得Lys(Boc)-Leu-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Ile-Arg(Pbf)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Leu-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Met-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)--Thr(ΨMe，MePro)-Phe-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu--Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Thr(ΨMe，MePro)-Lys(Boc)-Leu--His(Trt)-Asn(Trt)-Ile-Gln(Trt)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Thz-BocN的46残基的肽片段(16)(序列编号27)。
将具有上述获得的肽片段(16)的固相树脂以DCM及DMF洗净后以能将树脂充分浸泡的程度加入三氟乙醇与乙酸之混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与肽片段(16)切割分离。过滤除去经切割分离的树脂，反应溶液在减压下浓缩。将获得的残渣浓缩，获得氨基酸侧链经保护的肽片段(16)(序列编号28)：Lys(Boc)-Leu-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Ile-Arg(Pbf)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Leu-Ser(ΨMe，MePro)-Ser(tBu)-Met-Leu--Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Thr(ΨMe，MePro)-Phe-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)--Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Thr(ΨMe，MePro)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Asn(Trt)-Ile-Gln(Trt)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Thz-BocN。
将46残基的经保护的肽片段(16)100μmol当量移至回收烧瓶，溶解于DMF(3.0mL)后，在氮气氛下冷却至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)后，加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接着加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后加入三氟乙酸(0.1mL)，缓缓恢复到室温。恢复到室温后在减压下将反应溶液浓缩。获得的残渣加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌。2小时后再次将该溶液加入另外准备的二乙醚(150mL)，沉淀后离心分离，除去溶液部分，获得含有目标肽硫酯体的残渣。获得的残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→65：35(5分钟)→30：70(35分钟)→5：95(45分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得C末端为苯硫酯的肽片段C1-SPh(16)(序列编号29)：HN-Thz-Asn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-SPh。
ESI-MS：C263H412N72O67S3：计算值[M+4H]4+1438.68,[M+5H]5+1151.14,[M+6H]6+959.45,[M+7H]7+822.53,[M+8H]8+719.84实测值1438.51，1151.00，959.34，822.43，719.74
(4-2.肽片段C2的合成)
于固相合成用管柱中放入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后以DMF充分溶胀。将4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2mL)，放入管柱中，于室温搅拌4小时。以DMF及DCM将树脂充分洗净，获得HMPB-PEGA树脂，作为固相合成的固相使用。
将Fmoc-Asn(Trt)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。作为以Fmoc基或Boc基保护的氨基酸依序使用Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(ΨMe，MePro)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Boc-Cys(Trt)，并连接于固相树脂上。其结果，在固相树脂上获得Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Ile-Phe-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Ile-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Ala-Cys(Acm)-His(Trt)-Ser(ΨMe，MePro)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-BocNH的32残基的肽片段(17)(序列编号30)。
将上述获得的肽片段(17)加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌3.5小时，将树脂与肽片段(17)切割分离后加入另外准备的二乙醚(150mL)，沉淀后离心分离，将含有作为目标的肽的沉淀物与溶液部分分开，除去溶液部分后目的物以HPLC确认后以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→65：35(5分钟)→30：70(35分钟)→5：95(45分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得作为目标的肽片段C2(17)(序列编号31)：H2N-Cys-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys(Acm)-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn。
ESI-MS：ESI-MS：C185H282N52O47S2：计算值[M+3H]3+1351.22,[M+4H]4+1013.67,[M+5H]5+811.13,实测值1351.02，1013.51，811.01
实施例5.肽片段C1与肽片段C2的连接
将46残基的C末端为苯硫酯的肽片段C1-SPh(16)(8.7mg)及32残基的肽片段C2(17)(3.5mg)两种片段放入同一回收烧瓶，溶解于pH值为6.8的缓冲溶液(1.0mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)制备)后加入苯硫酚(30μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，在反应溶液中加入甲氧基胺溶液(1.5mL)(通过在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液而制备)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物片段的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→65：35(5分钟)→30：70(35分钟)→5：95(45分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得作为目标的肽片段(18)(序列编号32)(肽片段(C1+C2))(89-166)(图29)。
ESI-MS：C441H688N124O114S4：计算值[M+8H]8+1210.90,[M+9H]9+1076.47,[M+10H]10+968.92,[M+11H]11+880.93,[M+12H]12+807.60,[M+13H]13+745.55,[M+14H]14+692.37,实测值1210.77，1076.46，968.91，880.92，808.50，745.47，692.37
实施例6.去唾液酸IFN-β合成法2
(6-1.加成去唾液酸糖链的肽片段B与肽片段(C1+C2)的连接)
将21残基的C末端为苯硫酯体的加成去唾液酸糖链的肽片段B(3)(1.5mg)与78残基的肽片段(18)(肽片段C1·C2)(2.4mg)两种片段放入同一回收烧瓶中，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.25mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)制备)后，加入苯硫酚(7.4μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，在反应溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(0.37mL)(通过在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液而制备)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后，将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有糖肽片段的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝65：35→65：35(5分钟)→30：70(35分钟)→5：95(45分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得目标的相当于干扰素β第80位的位置具有去唾液酸糖链的肽片段(19)(序列编号33)(加成去唾液酸糖链的肽片段(B+C1+C2))(68-166)(图30)。
ESI-MS：C607H950N156O194S5：计算值[M+10H]10+1370.73,[M+11H]11+1246.21,[M+12H]12+1142.44,[M+13H]13+1054.64,[M+14H]14+979.38,[M+15H]15+914.15,[M+16H]16 857.08,[M+17H]17+806.72,[M+18H]18+761.96,[M+19H]19+721.91,实测值1370.66，1246.14，1142.38，1054.56，979.38，914.08，856.99，806.65，761.92，721.86
(6-2.肽片段A与糖肽片段B+C1+C2的连接)
将67残基的C末端为苯硫酯的肽片段A(1)(3.0mg)及于上述6-1.获得的相当于干扰素β第80位的位置具有去唾液酸糖链的肽片段(19)(加成去唾液酸糖链的肽片段B+C1+C2)(68-166)(3.3mg)两种片段放入同一回收烧瓶，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.24mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP溶液制备)后，加入苯硫酚(7.2μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，加入巯基乙磺酸钠(2.1mg)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDOproteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89、135位的Cys具有游离硫醇基、第80位Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(20)(序列编号34)(图31)。
ESI-MS：C979H1525N253O299S11：计算值[M+17H]17+1293.69,[M+18H]18+1221.88,[M+19H]19+1157.62,[M+20H]20+1099.79,[M+21H]21+1047.47,[M+22H]22+999.90,[M+23H]23+956.47,[M+24H]24+916.66,[M+25H]25+880.03,[M+26H]26+846.22,[M+27H]27+814.92,[M+28H]28+785.85,实测值1292.75，1221.01，1156.79，1098.99，1046.71，999.19，955.78，916.00，879.39，845.63，814.34，785.29
(6-3.Cys还原为Ala)
将上述6-2获得的第68、89、135位Cys具有游离硫醇基，第80位Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(20)(1.1mg)放入回收烧瓶，溶解于pH值为7.5的缓冲溶液(0.20mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液制备)后，加入pH值为7.5的0.5M三乙基羧基膦溶液(TCEP溶液)(0.20mL)(TECP，以6M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺制备)、tBuSH(20μL)、0.1M VA-044溶液(20μL)(将VA-044溶解于水制备)，于室温进行反应。4小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取tBuSH后，将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89、135位Cys转换为Ala、第80位Asn具有去唾液酸糖链的166残基的加成糖链的多肽(21)(序列编号35)(图32)。
ESI-MS：C979H1525N253O300S7：计算值[M+17H]17+1287.09,[M+18H]18+1215.64,[M+19H]19+1151.71,[M+20H]20+1094.18,[M+21H]21+1042.12,[M+22H]22+994.80,[M+23H]23+951.59,[M+24H]24+911.98,[M+25H]25+875.54,[M+26H]26+841.91,[M+27H]27+810.76,[M+28H]28+781.84,[M+29H]29+754.92,实测值1287.11，1215.69，1151.72，1094.20，1042.16，994.83，951.61，911.98，875.57，841.93，810.80，781.88，754.88
上述6-3.获得的加成糖链的多肽(21)经由与2-4.及2-5.中记载的步骤相同条件的Acm基脱保护及折叠步骤，可获得加成糖链的多肽(15)。
实施例7.二唾液酸IFN-β合成法2
(7-1.加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B与肽片段(C1+C2)的连接)
将21残基的C末端为苯硫酯体的加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B(2)(17.9mg)与78残基的肽片段(18)(肽片段(C1+C2))(22.9mg)两种片段放入同一回收烧瓶中，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(2.37mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)制备)后，加入苯硫酚(71.1μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，在反应溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(3.55mL)(通过在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液而制备)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有糖肽片段的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)，等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得目标的在相当于干扰素β的第80位的位置具有二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(22)(序列编号36)(图33)。
ESI-MS：C643H996N158O210S4：计算值[M+11H]11+1315.55,[M+12H]12+1206.00,[M+13H]13+1113.31,[M+14H]14+1033.86,[M+15H]15+965.00,[M+16H]16+904.75,[M+17H]17+851.59,[M+18H]18+804.34,[M+19H]19+762.06,实测值1315.59，1205.97，1113.28，1033.83，964.98，904.74，851.57，804.32，762.02
(7-2.肽片段A与加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(B+C1+C2))
将67残基的C末端为苯硫酯的肽片段A(1)(4.7mg)及于上述7-1.获得的相当于干扰素β第80位的位置具有二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(22)(5.2mg)两种片段放入同一回收烧瓶，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.35mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mMTCEP溶液制备)后，加入苯硫酚(11μL)，于室温进行反应。24小时后以HPLC确认反应后，加入巯基乙磺酸钠(3.3mg)，于室温进行反应。12小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后，将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89、135位Cys具有游离硫醇基，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的肽片段(23)(序列编号37)(图34)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S10：计算值[M+16H]16+1421.16,[M+17H]17+1337.62,[M+18H]18+1263.36,[M+19H]19+1196.92,[M+20H]20+1137.13,[M+21H]21+1083.02,[M+22H]22+1033.84,[M+23H]23+988.93,[M+24H]24+947.77,[M+25H]25+909.90,[M+26H]26+874.94,[M+27H]27+842.57,[M+28H]28+812.52,[M+29H]29+784.53,实测值1421.13，1337.57，1263.35，1196.90，1137.08，1082.99，1033.80，988.89，947.73，909.87，874.92，842.55，812.51，784.50
(7-3.Cys还原为Ala)
将上述7-2.获得的第68、89、135位Cys具有游离硫醇基，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基的肽片段(23)(6.1mg)放入回收烧瓶，溶解于pH值为7.5的缓冲溶液(0.27mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液制备)后，加入pH值为7.5的0.5M三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)(0.27mL)(TECP，以6M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺制备)、tBuSH(100μL)、0.1M VA-044溶液(100μL)(将VA-044溶解于水制备)，于室温进行反应。4小时后以HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液移至离心沉淀管，用二乙醚萃取苯硫酚后，将含有目的物的水层以膜滤器过滤，含有目的物的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝55：45→55：45(5分钟)→25：75(35分钟)→5：95(36分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得在第68、89、135位Cys转换为Ala，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖链的166残基之肽片段(24)(序列编号38)(图35)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S7：计算值[M+18H]18+1258.02,[M+19H]19+1191.86,[M+20H]20+1132.32,[M+21H]21+1078.44,[M+22H]22+1029.47,[M+23H]23+984.75,[M+24H]24+943.76,[M+25H]25+906.05,[M+26H]26+871.24,[M+27H]27+839.01,[M+28H]28+809.08,[M+29H]29+781.22,实测值1258.05，1191.87，1132.37，1078.47，1029.51，984.77，943.79，906.05，871.25，839.04，809.05，781.24
上述7-3.获得的加成糖链的多肽(24)经由与3-4、3-5及3-6中记载的步骤相同条件的Acm基脱保护、苯甲基之脱保护及折叠步骤，可获得加成糖链的多肽(10)。
于上述实施例1至3，设计了在N末端具有Ala的肽片段，并用于连接。因此，于实施例1至3，合成在位于该肽片段N末端的Ala位置导入Cys的肽片段，连接后将Cys还原为Ala。
于以下的实施例，设计在N末端具有Ser的肽片段。亦即，表示合成在Ser的位置导入Cys的肽片段，连接后将Cys转换为Ser的实例。此外，更具体而言，例示了这样的实例：通过将具有在干扰素β的氨基酸序列第68位至第88位的氨基酸的糖肽片段B分为第68位至75位的片段B2及在N末端具有第76位以Cys替代Ser的第76位至88位的片段B1而进行合成，经过将与干扰素β第76位相当的位置的氨基酸为Cys的肽片段(B1+B2)-SR(以下，称为肽片段(B1+B2)-SR(Cys体))经由连接而合成的连接步骤，及将在肽片段(B1+B2)-SR(Cys体)中将与干扰素β第76位相当的位置的Cys转换为Ser的转换步骤后，合成与在干扰素β第76位相当的位置的氨基酸为Ser的肽片段(B1+B2)-SR。
亦即，更具体而言，例示了包含下述步骤的制造方法：
(I)制备下述式(i)表示的肽片段B1的步骤。
[化学式37]
(Ⅱ)制备下述式(j)表示的糖肽B2的步骤
[化学式38]
(Ⅲ)经由将肽B1与糖肽B2连接，制备下述式(k)表示的糖肽，之后将该肽上特定的半胱氨酸转换为丝氨酸的步骤(参照图43至45)
[化学式39]
实施例8.加成二唾液酸糖链的肽片段(B1+B2)-SR的合成
(8-1肽片段B1-SR的合成)
在固相合成用管柱中放入HMPB-ChemMatrix(Biotage公司制造)(0.10mmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后用DCM充分溶胀。
将Fmoc-Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后，加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护之氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。
依序使用Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)作为以Fmoc基保护的氨基酸，在固相树脂上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)的8残基肽。对于该8残基肽，将Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护，以DMF洗净后在另外准备的离心沉淀管中将二苯甲基二唾液酸糖链天冬酰胺衍生物(g)(547.8mg，200μmol)及DEPBT(59.9mg，200μmol)溶解于DMF/DMSO(1：1混合溶液，3.33mL)，放入固相合成用管柱中，加入DIPEA(52.3μL，300μmol)，于室温搅拌18小时。以DMF及DCM洗净，在固相上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile--Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-FmocNH的9残基糖链肽(序列编号39)。
[化学式40]
将上述获得的固相树脂上的9残基糖链肽的脂溶性保护基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)进行脱保护后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行之后的肽链的延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸及HOBt(67.6mg，0.50mmol)、DIPCI(73.1μL，0.475mmol)溶解于DMF(6.3mL)，进行15分钟活化后放入固相合成用管柱中，于室温搅拌1小时后将Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟进行脱保护。反复进行该操作，依序将氨基酸缩合。依序使用Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Boc-Cys(Trt)作为以Fmoc基及Boc基保护的氨基酸，连接于固相树脂。其结果，在固相树脂上获得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-BocNH的13残基的加成糖链的肽片段(25)(序列编号40)。
之后，以DCM及DMF洗净后以能将树脂充分浸泡的程度加入三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与加成糖链的肽片段切割分离。过滤除去经切割分离的树脂，反应溶液在减压下浓缩。将获得的残渣浓缩，获得氨基酸侧链经保护的加成糖链的肽(25)(序列编号41)：Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-BocNH。
将具有13残基的氨基酸，氨基酸侧链经保护之加成糖链的肽片段(25)100μmol当量移至回收烧瓶，溶解于DMF(3.0mL)后在氮气氛下冷却至-15℃至-20℃，加入2-巯基乙磺酸钠(492.5mg，3.0mmol)后，加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接着加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后加入三氟乙酸(0.1mL)，缓缓恢复到室温。恢复到室温后在减压下将反应溶液浓缩。获得的残渣加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌。2小时后再次将该溶液加入另外准备的二乙醚(150mL)，沉淀后离心分离，除去溶液部分，获得含有目标肽硫酯体的残渣。获得之残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝72：28→59：41(26分钟)，线性梯度]纯化，获得C末端为烷基硫酯的加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B1-SR(25)(序列编号42)：H2N-Cys-Thr-Gly-Trp-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-SR(图46)。此外，-SR表示磺酸乙硫酯(ethyl sulfonate thioester)。
(8-2肽片段B2-SPH的合成)
在固相合成用管柱中放入HMPB-ChemMatrix(Biotage公司制造)(0.10mmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后用DCM充分溶胀。
将Fmoc-Ser(tBu)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，于25℃搅拌4小时。
搅拌后以DCM、DMF将树脂洗净。Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。以DMF洗净后，使用以下表示的方法依序将氨基酸缩合，进行其后的肽链延长。
将氨基经Fmoc基保护的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1mL)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)后，加入固相合成用管柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。于室温搅拌20分钟后以DCM及DMF将树脂洗净，Fmoc基以20％哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。反复进行该操作，使用以Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，依序将氨基酸缩合。
依序使用Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸作为以Fmoc基保护的氨基酸，连接于固相树脂。其结果，在固相树脂上获得Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN的8残基的肽片段(26)(序列编号43)。
之后，以DCM及DMF洗净后以能将树脂充分浸泡的程度加入三氟乙醇与乙酸的混合溶液(1：1)，于室温搅拌18小时，将树脂与肽片段切割分离。过滤除去经切割分离的树脂，反应溶液在减压下浓缩。将获得的残渣浓缩，获得氨基酸的侧链经保护的肽(26)(序列编号44)：Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN。
将具有8残基的氨基酸、氨基酸侧链经保护的肽片段(26)100μmol当量移至回收烧瓶，溶解于DMF(3.0mL)后在氮气氛下冷却至-15℃至-20℃。加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)后加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接着加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。于-15℃至-20℃搅拌2小时后，加入三氟乙酸(0.1mL)，缓缓恢复到室温。恢复到室温后在减压下将反应溶液浓缩。向获得的残渣中加入三氟乙酸：水：TIPS(＝95：2.5：2.5)，于室温搅拌。2小时后再次将该溶液加入另外准备的二乙醚(150mL)，沉淀后离心分离，除去溶液部分，获得含有目的之肽硫酯体的残渣。获得的残渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝78：22→68：32(20分钟)，线性梯度]纯化，获得C末端为苯硫酯的肽片段B2-SPh(26)(序列编号45)：HN-Thz-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-SPh(图47)。
(8-3.加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B1-SR与肽片段B2-SPh的连接)
将13残基的C末端为烷基硫酯体的加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B1-SR(0.60mg)及8残基的肽片段B2-SPh(0.16mg)两种片段放入同一回收烧瓶，溶解于pH值为7.2的缓冲溶液(0.15mL)(以8M盐酸胍液、0.2mM磷酸溶液、20mM三(羧乙基)膦溶液(TCEP溶液)制备)，于室温进行反应。14.5小时后用HPLC及ESI-MS确认生成目的物。将反应溶液以膜滤器过滤，含有糖肽片段的滤液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝78：22→56：44(22分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得目标的具有二苯甲基二唾液酸糖链，C末端为经烷基硫酯化的加成糖链的肽片段(B1+B2)-SR(Cys体)(27)(序列编号46)(图48)。
(8-4Cys的甲基化)
将获得的21残基的肽烷基硫酯(27)(5.3mg)(1.03μmol)放入微量离心管中，溶解于pH值为8.6的缓冲溶液(1.09mL)(以8M盐酸胍液、0.25Tris盐酸液、3.3mM EDTA溶液制备)及乙腈(0.36mL)后，于25℃加入甲基-4-硝基苯磺酸酯(5.1mg)。30分钟后加入10％TFA溶液(0.2mL)，使pH值为4后，反应溶液以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝72：55→55：45(34分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得具有原料中所含的半胱氨酸残基的硫原子经甲基化的二苯甲基二唾液酸糖链，且C末端经烷基硫酯化的加成糖链的肽片段(B1+B2)-SR(Cys体)(28)(序列编号47)(图49)。
(8-5经甲基化的Cys的氰基化及氰基化后的分子内酰基转移反应)
将获得的具有半胱氨酸残基的硫原子经甲基化的二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段(28)放入微量离心管中，溶解于0.1mM 80％甲酸溶液(3.3mL)后，于25℃加入溴化氰23.2mg(219μmol)。将反应容器遮光后于37℃进行反应，26.5小时后，将反应溶液在减压下浓缩。
获得的残渣以pH值为8.0的缓冲溶液(以8M盐酸胍液及0.2M磷酸溶液制备)(0.33mL)溶解后，于37℃进行反应。1小时后添加20％哌啶/DMF溶液(3.3μL、1％v/v)，以HPLC确认反应完成后，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、A：B＝72：55→55：45(34分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]纯化，获得21残基的具有二苯甲基二唾液酸糖链，C末端经烷基硫酯化的反应中间体的加成糖链的肽片段(B1+B2)-SR(29)(序列编号48)(图50)。此外，-SR表示磺酸乙基硫酯。
以上述8-5.获得的加成糖链的多肽(29)替代实施例3中加成二苯甲基二唾液酸糖链的肽片段B使用，进行与实施例3相同的操作，可合成二唾液酸IFN-β。
实施例9加热处理方法
(9-1.17,31,141Cys(Acm)-80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β的加热处理)
在10mL的回收烧瓶中放入上述3-3.获得的加成糖链的多肽(7)(17，31，141Cys(Acm)-80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β)(3.7mg)，放入pH值为7.0的0.2M磷酸缓冲液(含有8M胍)(3.3mL；基质浓度(substrate concentration)：50mM)。在用玻璃塞塞住回收烧瓶后，在油浴中于60℃加热。10小时后回复到室温，进行HPLC分析。经由HPLC，ESI-MS确认未分解后(图36)，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝50：50→50：50(5分钟)→20：80(35分钟)→5：95(35.5分钟)]进行脱盐，获得加热处理试样(4.0mg)。
(9-2.80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β的加热处理)
在0.5mL的微量离心管中放入上述3-4.获得的加成糖链的多肽(8)(80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β(30μg))，放入pH值为7.0的0.2M磷酸缓冲液(含有8M胍)(30μL；基质浓度：50mM)。盖上盖子后，在油浴，于60℃加热。10小时后恢复到室温，进行HPLC分析[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μm)、流速：7.0mL/分钟、洗提液A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN、梯度A：B＝50：50→50：50(5分钟)→20：80(35分钟)→5：95(35.5分钟)、等度洗脱5分钟，然后线性梯度]，经由HPLC、ESI-MS确认纯度(图37)。
HPLC及ESI-MS的数据与上述9-1.加热试验所使用的Cys经保护的加成糖链的多肽(7)比较，半胱氨酸未保护的加成糖链的多肽(8)经由加热处理的回收量降低。
实施例10受体亲和性解析
相对于IFN-α/β受体2，未加热或经加热处理的化学合成IFN-β的受体亲和性解析。
相对于IFN-α/β受体2，未加热或经加热处理的化学合成IFN-β的结合亲和性，使用ProteOn XPR36(Bio-rad)以SPR(Surface Plasmon Resonance；表面等离子共振技术)来测定。
具体而言，通过使0.005％Tween20/PBS以30μL/分钟的流速流动，以及使用氨基偶联试剂盒(Bio-rad)，根据说明书，在GLM晶片(Bio-rad)上将10μg/mL的IFN-α/β受体2(10mM乙酸缓冲液，pH4.5)固定化。将实施例3制备的未加热的加成二唾液酸糖链的多肽(10)、或通过将于上述9-1.的经加热处理的加成二唾液酸糖链的多肽供给上述3-4.至3-6.记载的脱Acm步骤、苯甲基的脱保护步骤及折叠步骤而获得的经加热处理的加成二唾液酸糖链的多肽，以0.1％BSA,2mM EDTA/PBS调整为0.31-25nM，以流速50μL/分钟添加于晶片。此外，加成糖链的多肽(10)的分析使用0.31nM、0.93nM、2.8nM、8.3nM、25nM这5种浓度分别实施。结合常数(ka)、离解常数(kd)及结合离解常数(Kd)使用proteOn管理软件进行解析。其结果表示于图38、图39及表1。
图38表示解析对于IFN-α/β受体2，未加热的加成二唾液酸糖链的多肽(10)结合亲和性的曲线图。此外，图39表示解析对于IFN-α/β受体2，经加热处理的加成二唾液酸糖链的多肽结合亲和性的曲线图。如图38、图39及表1所示，本发明经化学合成的加成糖链的多肽即使在加热处理后，亦具有与未加热处理的加成糖链的多肽同等的受体亲和性。
[表1]
未加热处理 加热处理
ka[1/M·sec] 5.5×10<sup>6</sup> 4.3×10<sup>6</sup>
kd[1/sec] 2.7×10<sup>-3</sup> 2.3×10<sup>-3</sup>
Kd[M] 4.9×10<sup>-10</sup> 5.3×10<sup>-10</sup>
实施例11药物动力学解析
将上述实施例制备的本发明相关加成糖链的多肽静脉内及皮下施用时，药物动力学解析的实施例于下述表示。
(11-1.施用液、试剂的制备)
使用实施例2制备的加成去唾液酸糖链的多肽(15)(去唾液酸IFN-β)及实施例3制备的加成二唾液酸糖链的多肽(10)(二唾液酸IFN-β)作为化学合成的IFN-β，添加BSA及磷酸缓冲溶液，冻结干燥。施用前用超纯水(Milli Q水)60μL溶解，用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS、和光纯药工业公司制造)将施用液制备成50万IU/mL。此外，使用经由生物合成制备的注射用IFNβMochida(持田制药)作为对照的IFN-β，使用所提供的注射用水溶解成1200万IU/mL，然后用PBS制备成50万IU/mL。对于EDTA-PBS，加入PBS，以使EDTA-2Na(和光纯药工业公司制造)成为2mM。此外，本实施例药物动力学解析中使用的化学合成的加成糖链的多肽是未经加热处理的那些化学合成的加成糖链的多肽。此外，IFNβmochida为源自人类成纤维细胞的经由生物合成制备的IFNβ-1a。
(11-2.施用及采血)
对于小鼠(BALB/c小鼠、雄性、体重20.45至25.28g)以200万IU/公斤的用量在饱食下从眼窝静脉或背部皮下使用胰岛素用注射筒Myjector29G×1/2(Terumo公司制造)以容量(volume)4mL/公斤施用。为静脉内施用时，于施用前及施用后2、10、30分钟、1、3、6、8小时，为皮下施用时于施用前及施用后10、30分钟、1、2、4、6、8小时从眼窝静脉，使用经肝素处理的血球容积比毛细管(HIRSHMANN LABORGERATE)采血75μL。将采取的血液与同体积的EEDTA-PBS快速混合，离心分离(15000rpm，4℃，10分钟)。采取上清液90μL，作为血浆试样。血浆试样冷冻保存至测定使用时。所用的吸头(tip)和试管是BM机器公司的低吸附性产品。
(11-3.血中浓度的测定)
加成糖链的多肽(IFN-β)的血中浓度测定使用人类干扰素-βELISA试剂盒(Kamakura科技公司制造)。亦即，使用同一试剂盒所附带的稀释液，必要时将血浆试样稀释360、120、12倍，而制备作为测定试样。用于作成标准曲线的标准品，使用与施用时使用的为同一批次的化学合成IFN-β、注射用IFNβmochida，以试剂盒所附带的稀释液而制备成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125IU/mL的标准品。标准曲线根据血浆试样的稀释率，添加空白血浆以使递送量(delivered amount)相同。通过将获得的结果乘以稀释率，并进一步乘以作为抗凝固处理的EDTA-PBS的稀释率2，而算出血中浓度。获得的血浆中IFN-β浓度变化表示于图40。
(11-4.药物动力学参数之计算)
从获得的IFN-β浓度变化，使用矩分析(moment analysis)法，将血浆中浓度曲线下面积(AUC)经由梯形法则算出。此外，根据外推法，求出静脉内施用时的预测初期浓度(C0)、并根据血浆中半衰期(t1/2)、平均保留时间(MRT)及皮下施用时的实测值求出最高血浆中浓度(Cmax)。获得的药物动力学参数表示于表2。
根据图40，经由本发明相关的化学合成所制备的加成糖链的多肽与经由生物合成制备的IFN-β比较，显示同等的血中动力学。
[表2]
实施例12抗肿瘤活性测定试验
(12-1.细胞培养、试剂的制备)
抗肿瘤活性试验使用为人类/伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)的Daudi细胞。培养基使用加入有经56℃钝化处理30分钟的10％牛血清(Fetal Bovine Serum)(GIBCO)和盘尼西林/链霉素(SIGMA公司制造)的RPMI1640(莱富生命科技(invitrogen)公司制造)。培养皿使用Non-treat dish(IWAKI)，于37℃、5％CO浓度条件下培养，以2至3日进行1次传代。
(12-2.荷瘤小鼠的作成法)
将上述12-1.培养的Daudi细胞回收于试管中，离心分离(1300rpm、4℃、3分钟)。用抽吸器(aspirator)除去上清液，加入HBSS(Nacalai公司制造)，将细胞悬浮。接着再次离心分离，除去上清液。该细胞的洗净处理共进行3次。使用血球计计算细胞数，用HBSS作成2×108细胞/mL的细胞悬浮液。在接种Daudi细胞前加入与细胞悬浊液同体积的基质胶(matrigel)(BD)，稀释2倍，作成接种用细胞悬液。将接种用细胞悬液保存于冰上至接种前。麻醉药为将戊巴比妥钠(Somnopentyl)(共立制药公司制造)用PBS稀释为5mg/mL使用。用胰岛素用注射筒Myjector 29G×1/2(Terumo公司制造)，在SCID老鼠(C.B-17/Icr-scid/scidJcl老鼠，雄性)(日本克雷雅公司)腹腔内施用麻醉药250至300μL。确认麻醉导入后，使用电动理发器剃除老鼠右侧腹的毛。用26G1/2之注射针(Terumo公司制造)及1mL的注射筒(Terumo公司制造)皮下接种接种用细胞悬浮液100μL。
(12-3.抗肿瘤活性的测定方法及评估方法)
从上述11-3.之细胞接种处理起约30日后用卡尺(Mitsutoyo公司制造)测定所形成肿瘤组织的长径(mm)及短径(mm)。用获得的数值求出肿瘤体积(mm3)。肿瘤体积以肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)×0.5的公式算出。经时算出肿瘤体积，标绘成曲线，作为抗肿瘤活性能力进行评估。
(12-4.施用液的制备法及施用方法)
将实施例2合成的加成去唾液酸糖链的多肽(15)及实施例3合成的加成二唾液酸糖链之多肽(10)用PBS制备成500万IU/mL。对照的IFN-β使用经由生物合成制备的注射用IFNβmochida(持田制药公司制造)，用所提供的注射用水溶解成1200万IU/mL，用PBS制备成500万IU/mL。施用液于施用前制备。使用上述12-3.测定的肿瘤体积，将荷瘤老鼠分成4组(n＝4/组)。分组时的肿瘤体积约为800mm3。使用制备的施用液在背部皮下以4mL/公斤的容量，使用胰岛素用注射筒Myjector 29G×1/2以成为2000万IU/公斤的用量施用。媒介物施用组将施用液制备时使用的PBS以4mL/公斤的容量施用。分组及第1次施用作为第0天，至第9天连日提供10次背部皮下施用。
(12-5.抗肿瘤活性能力的评价)
使用12-3.表示的方法，于第3、6、8、10、13、15、17天算出肿瘤体积，肿瘤体积随时间的变化表示于图41。
根据图41，本发明相关经由化学合成制备的加成糖链的多肽与经由生物合成制备的IFN-β比较，显示同等或优越的抗肿瘤活性。尤其是加成的二唾液酸糖链为实质均一的本发明加成糖链的多肽(10)与经由生物合成制备之IFN-β比较，显示优越的抗肿瘤活性。
实施例13加热处理后的细胞增殖抑制能力的评价
此外，通过将于上述9-1.经加热处理的加成二唾液酸糖链的多肽供给上述3-4.至3-6.记载的脱Acm步骤、苯甲基的脱保护步骤及折叠步骤，而评估获得的经加热处理的加成二唾液酸糖链的多肽的细胞增殖抑制能力。
具体的细胞增殖抑制能评价依以下叙述的方法进行。
将人类·伯基特氏淋巴瘤细胞株Daudi用含有10％胎牛血清、100U/mL盘尼西林、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(10％FCS-RPMI 1640)悬浮使成为1.25×105个细胞/mL。将细胞悬液以1×104/80μL/孔接种于96孔平底板中，进一步将用10％FCS-RPMI 1640稀释的完全化学合成的IFN-β以20μL/孔添加，于CO2浓度调整为5％的CO2保温箱中，于37℃培养3日。细胞增殖抑制能力以培养第3日的粒线体脱氢酶活性作为指标，使用细胞计数试剂盒(cell counting kit)-8(同仁化学公司制造)，根据试剂盒所附的操作手册进行测定。
此外，使用未加热处理的加成二唾液酸糖链的多肽(10)作为对照。其结果表示于图42。如图42所示，即使为加热处理后的加成糖链的多肽，显示与未加热处理的加成糖链的多肽同等的细胞增殖抑制能力。
序列表
&lt;110&gt; 株式会社糖锁工学研究所（GLYTECH, INC）
&lt;120&gt; 加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物
&lt;130&gt; P1480177PD1
&lt;150&gt; JP2011-218793
&lt;151&gt; 2011-10-01
&lt;160&gt; 48
&lt;170&gt; PatentIn version 3.1
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人（Homo sapiens）
&lt;400&gt; 1
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 67
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (3)..(3)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt;兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (14)..(14)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (16)..(16)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (22)..(22)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (23)..(23)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (25)..(25)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (27)..(27)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (29)..(29)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (30)..(30)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (33)..(33)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (34)..(34)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (35)..(35)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (37)..(37)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (39)..(39)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (42)..(42)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (43)..(43)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (45)..(45)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (48)..(48)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (49)..(49)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (51)..(51)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (52)..(52)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (53)..(53)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (54)..(54)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (58)..(58)
&lt;223&gt; 兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (60)..(60)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (61)..(61)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (64)..(64)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (65)..(65)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (67)..(67)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 2
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe
65
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 67
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (3)..(3)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt;兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (14)..(14)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (16)..(16)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (22)..(22)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (23)..(23)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (25)..(25)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (27)..(27)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (29)..(29)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (30)..(30)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (33)..(33)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (34)..(34)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (35)..(35)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (37)..(37)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (39)..(39)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (42)..(42)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (43)..(43)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (45)..(45)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (48)..(48)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (49)..(49)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (51)..(51)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (52)..(52)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (53)..(53)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (54)..(54)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (58)..(58)
&lt;223&gt; 兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (60)..(60)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (61)..(61)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (64)..(64)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (65)..(65)
&lt;223&gt; Trt
&lt;400&gt; 3
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe
65
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 67
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (67)..(67)
&lt;223&gt; -SPh
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;400&gt; 4
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe
65
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 9
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Fmoc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (3)..(3)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 5
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt;兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (14)..(14)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 6
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt;兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (14)..(14)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Trt
&lt;400&gt; 7
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; -SPh
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 8
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 9
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 9
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Fmoc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (3)..(3)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 10
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt;兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (14)..(14)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 11
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 12
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt;兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (14)..(14)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Trt
&lt;400&gt; 12
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 13
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; -SPh
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 13
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 14
&lt;211&gt; 78
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; 兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (16)..(16)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (20)..(20)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (22)..(22)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (24)..(24)
&lt;223&gt; 兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (25)..(25)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (27)..(27)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (30)..(30)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; 兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (33)..(33)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (35)..(35)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (36)..(36)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (37)..(37)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (38)..(38)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (40)..(40)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (43)..(43)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (44)..(44)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (48)..(48)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (49)..(49)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (50)..(50)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (51)..(51)
&lt;223&gt; 兊Me, Mepro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (52)..(52)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (53)..(53)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (55)..(55)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (56)..(56)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (59)..(59)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (61)..(61)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (64)..(64)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (65)..(65)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (67)..(67)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (70)..(70)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (71)..(71)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (73)..(73)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (75)..(75)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (77)..(77)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (78)..(78)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (78)..(78)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 14
Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu
20 25 30
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys
35 40 45
Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg
50 55 60
Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
65 70 75
&lt;210&gt; 15
&lt;211&gt; 78
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (53)..(53)
&lt;223&gt; Acm
&lt;400&gt; 15
Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu
20 25 30
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys
35 40 45
Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg
50 55 60
Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
65 70 75
&lt;210&gt; 16
&lt;211&gt; 99
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (74)..(74)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)丂丂
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 16
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
20 25 30
Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu
35 40 45
Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr
50 55 60
Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val
65 70 75 80
Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu
85 90 95
Arg Asn
&lt;210&gt; 17
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 17
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 18
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 18
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 19
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 19
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 20
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DISULFID
&lt;222&gt; (31)..(141)
&lt;223&gt;
&lt;400&gt; 20
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 21
&lt;211&gt; 99
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (74)..(74)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 21
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
20 25 30
Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu
35 40 45
Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr
50 55 60
Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val
65 70 75 80
Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu
85 90 95
Arg Asn
&lt;210&gt; 22
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 22
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 23
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 23
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 24
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 24
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 25
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 25
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 26
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; DISULFID
&lt;222&gt; (31)..(141)
&lt;223&gt;
&lt;400&gt; 26
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 27
&lt;211&gt; 46
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (16)..(16)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (20)..(20)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (22)..(22)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (24)..(24)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (25)..(25)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (27)..(27)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (30)..(30)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (33)..(33)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (35)..(35)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (36)..(36)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (37)..(37)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (38)..(38)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (40)..(40)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (43)..(43)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (44)..(44)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 27
Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu
20 25 30
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys
35 40 45
&lt;210&gt; 28
&lt;211&gt; 46
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (12)..(12)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (16)..(16)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (20)..(20)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (22)..(22)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (24)..(24)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (25)..(25)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (27)..(27)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (30)..(30)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (33)..(33)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (35)..(35)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (36)..(36)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (37)..(37)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (38)..(38)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (40)..(40)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (43)..(43)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (44)..(44)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; Boc
&lt;400&gt; 28
Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu
20 25 30
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys
35 40 45
&lt;210&gt; 29
&lt;211&gt; 46
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (46)..(46)
&lt;223&gt; -SPh
&lt;400&gt; 29
Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu
20 25 30
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys
35 40 45
&lt;210&gt; 30
&lt;211&gt; 32
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (3)..(3)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; 兊Me,MePro
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (15)..(15)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (18)..(18)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (19)..(19)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (24)..(24)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (25)..(25)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (27)..(27)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (29)..(29)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (32)..(32)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (32)..(32)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 30
Cys Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile
1 5 10 15
Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
20 25 30
&lt;210&gt; 31
&lt;211&gt; 32
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Acm
&lt;400&gt; 31
Cys Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile
1 5 10 15
Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
20 25 30
&lt;210&gt; 32
&lt;211&gt; 78
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (53)..(53)
&lt;223&gt; Acm
&lt;400&gt; 32
Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu
20 25 30
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Cys Lys Glu
35 40 45
Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn
50 55 60
Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
65 70 75
&lt;210&gt; 33
&lt;211&gt; 99
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (74)..(74)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 33
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
20 25 30
Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu
35 40 45
Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr
50 55 60
Leu Lys Cys Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val
65 70 75 80
Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu
85 90 95
Arg Asn
&lt;210&gt; 34
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 34
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Cys Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 35
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 去唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 35
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 36
&lt;211&gt; 99
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (74)..(74)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 36
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
20 25 30
Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu
35 40 45
Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr
50 55 60
Leu Lys Cys Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val
65 70 75 80
Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu
85 90 95
Arg Asn
&lt;210&gt; 37
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 37
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Cys Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Cys Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 38
&lt;211&gt; 166
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (17)..(17)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (31)..(31)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (141)..(141)
&lt;223&gt; Acm
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (80)..(80)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 38
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
&lt;210&gt; 39
&lt;211&gt; 9
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Fmoc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (3)..(3)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 39
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5
&lt;210&gt; 40
&lt;211&gt; 13
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 40
Cys Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5 10
&lt;210&gt; 41
&lt;211&gt; 13
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (2)..(2)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (10)..(10)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (11)..(11)
&lt;223&gt; Trt
&lt;400&gt; 41
Cys Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5 10
&lt;210&gt; 42
&lt;211&gt; 13
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; -SCH2-CH2-SO3H
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;400&gt; 42
Cys Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu
1 5 10
&lt;210&gt; 43
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; 树脂
&lt;400&gt; 43
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
1 5
&lt;210&gt; 44
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; Boc
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (4)..(4)
&lt;223&gt; Pbf
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (5)..(5)
&lt;223&gt; Trt
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; OtBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (7)..(7)
&lt;223&gt; tBu
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; tBu
&lt;400&gt; 44
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
1 5
&lt;210&gt; 45
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (8)..(8)
&lt;223&gt; SPh
&lt;400&gt; 45
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
1 5
&lt;210&gt; 46
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; -SCH2-CH2-SO3H
&lt;400&gt; 46
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Cys Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 47
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (9)..(9)
&lt;223&gt;Methyl
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; -SCH2-CH2-SO3H
&lt;400&gt; 47
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Cys Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20
&lt;210&gt; 48
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列（Artificial sequence）
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 化学合成
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; MOD_RES
&lt;222&gt; (1)..(1)
&lt;223&gt; 1C 具有噻唑烷基团
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; CARBOHYD
&lt;222&gt; (13)..(13)
&lt;223&gt; 以二苄基保护的二唾液酸寡糖
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; BINDING
&lt;222&gt; (21)..(21)
&lt;223&gt; -SCH2-CH2-SO3H
&lt;400&gt; 48
Cys Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
1 5 10 15
Val Glu Asn Leu Leu
20

Claims (27)

1.加成糖链的多肽，其特征在于，所述加成糖链的多肽是在选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽，且所述加成糖链的多肽具有实质上均一的糖链。
2.如权利要求1所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽经由化学合成而制备。
3.加成糖链的多肽，所述加成糖链的多肽为经由包括合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段的步骤、及将所述加成糖链的肽片段与所述至少2个肽片段连接的步骤的方法而获得的加成糖链的多肽，其特征在于，
所述加成糖链的多肽是在选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽。
4.如权利要求3所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽中的糖链为天冬酰胺结合型糖链。
5.如权利要求4所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽中的糖链为下述式(a)表示的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链，
[化学式1]
[化学式2]
6.如权利要求3至5中任一项所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽在相当于干扰素β第31位及第141位的Cys形成二硫键。
7.如权利要求3至6中任一项所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽经加热处理。
8.如权利要求1或2所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽具有90％以上的纯度。
9.组合物，所述组合物含有如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽，其特征在于，所述组合物中的加成糖链的多肽是实质上均一的。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物中的加成糖链的多肽90％以上是均一的。
11.如权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物中加成糖链的多肽具有90％以上的纯度。
12.医药组合物，其特征为含有：
(I)如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽及/或其药学上可接受的盐，及
(Ⅱ)药理学上可接受的载体。
13.如权利要求12所述的医药组合物，其中，
于所述加成糖链的多肽中，糖链实质上是均一的。
14.如权利要求13所述的医药组合物，其中，
于所述加成糖链的多肽中，糖链90％以上是均一的。
15.如权利要求12至第14中任一项所述的医药组合物，其中，所述加成糖链的多肽具有90％以上的纯度。
16.如权利要求12至15中任一项所述的医药组合物，其特征在于，
所述医药组合用于治疗或预防干扰素β相关的疾病。
17.如权利要求16所述的医药组合物，其中，
所述干扰素β相关的疾病为选自由包含多形性胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤在内的脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所组成的组的至少1种疾病。
18.干扰素β相关的疾病的治疗或预防方法，其特征在于，施用有效量的如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽。
19.如权利要求18所述的治疗或预防方法，其中，
所述干扰素β相关的疾病为选自由包含多形性胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤在内的脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所组成的组的至少一种疾病。
20.加成糖链的多肽，其特征在于，所述加成糖链的多肽是在选自由
(a)由序列编号1表示氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的多肽；
所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链的加成糖链的多肽，且是在相当于干扰素β第17位、31位及141位的Cys经保护基保护的加成糖链的多肽。
21.如权利要求20所述的加成糖链的多肽，其中，所述糖链为下述式(c)表示的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链：
[化学式3]
式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2，而且，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基、Me表示甲基、Ph表示苯基；
[化学式4]
22.如权利要求20或21所述的加成糖链的多肽，其中，在相当于所述干扰素β第17位、31位及141位的Cys被选自由Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、叔丁基、苯甲基及β位经取代的乙基所组成的组的任一种保护基保护。
23.加成糖链的多肽的制造方法，其特征在于，所述加成糖链的多肽的制造方法包括：在权利要求20至22中任一项所述的加成糖链的多肽中，对经保护基保护的相当于所述干扰素β第17位、31位及141位的Cys进行脱保护的步骤。
24.如权利要求23所述的加成糖链的多肽的制造方法，其中，在将Cys的保护基脱保护之前，对所述加成糖链的多肽进行加热处理。
25.加成糖链的多肽，其特征在于，所述加成糖链的多肽是选自由
(a)由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)在由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽中，1个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
(c)干扰素β的类似物；及
(d)相对于由序列编号1表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80％以上同源性的加成糖链的多肽；
所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链的加成糖链的多肽，且
所述糖链为下述式(c)表示的存在于糖链非还原末端的唾液酸的羧基经保护的二唾液酸糖链
[化学式5]
式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2，而且，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基，Me表示甲基，Ph表示苯基。
26.加成糖链的多肽的制造方法，其特征在于，所述加成糖链的多肽的制造方法包括对在权利要求25所述的加成糖链的多肽中的存在于糖链非还原末端的唾液酸的羧基的保护基进行脱保护的步骤。
27.如权利要求23、24及26中任一项所述的加成糖链的多肽的制造方法，其中，所述加成糖链的多肽的制造方法进一步包括将所述加成糖链的多肽进行折叠的步骤。
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