JP5517620B2 - ペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
特に、従来、典型的なNCL法においては、連結される2つのペプチド断片のうち、片方は、N末端においてシステイン残基を有していなければならず、また、連結後において得られるペプチドも連結部位においてシステイン残基を有することになるため、最終的に得ようとする所望のペプチド(又は糖ペプチド)におけるシステイン残基を連結部位として、NCL法を設計し適用するほかなかった。そこで、本発明は、得ようとする所望のペプチドにおけるシステイン残基以外にも、セリン残基やトレオニン残基に対応する部分を連結部位としたライゲーション法を設計可能とする、ペプチド及び糖ペプチドの新規な製造方法を提供する。
このように、本発明は、糖ペプチド中に豊富に存在するセリンやトレオニンをライゲーション法による連結部位として設計可能とする、ライゲーション法を用いたペプチド及び糖ペプチドの新規な製造方法を提供する。
すなわち、本発明は、
-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
システイン残基を含むペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
式(1)で示されるトレオニン誘導体A
(a)ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-SMe基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記-SMe基を-OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(b)及び(c):
(b)ペプチド中の-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得る工程;
(a)工程(o)で得られたペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
セリン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含むペプチドを得る工程;
(a)工程(o)で得られたペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
トレオニン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、トレオニン誘導体残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して上記式(1)で示されるトレオニン誘導体Aをアミノ酸残基として含むペプチドを得る工程;
(a) 工程(o)で得られたペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記-SH基を-OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
システイン残基を含む糖ペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)糖ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
(a)糖ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチド又は糖ペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチド又は糖ペプチド(ここで、第1のペプチド又は糖ペプチド及び第2のペプチド又は糖ペプチドの少なくとも一方は糖ペプチドである)とを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得る工程;
(a)工程(o)で得られた糖ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
セリン残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド:
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、
Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含む糖ペプチドを得る工程;
(a)工程(o)で得られた糖ペプチド中のシステイン残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
トレオニン残基を含む糖ペプチドの製造方法であって、
(o)C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド:
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、
Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、トレオニン誘導体残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して上記式(1)で示されるトレオニン誘導体Aをアミノ酸残基として含む糖ペプチドを得る工程;
(a) 工程(o)で得られた糖ペプチド中のトレオニン誘導体A残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法を提供し得る。
-糖Asn-X-Y-
(式中、
糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、
Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Yは、式(2)で示されるトレオニン誘導体A残基
で示される構造を含む糖ペプチドを提供し得る。
(d)保護メチオニン残基を脱保護する工程;
を工程(b)又は(c)の後、特に工程(c)の後に含むことが好ましい場合がある。
本発明において、実施態様によっては、工程(b)は、酸性条件下、特にpH2〜3で行うことが好ましい場合がある。
本発明において、実施態様によっては、工程(b)で用いるシアン化剤は、好ましくは臭化シアンであり得る。
本発明において、糖鎖は、実施態様によっては、以下の式(4)で表される糖鎖が好ましい場合がある。
本発明の製造方法で得られるペプチド又は糖ペプチドは、実施態様によっては、全ての構成アミノ酸が、生体内にペプチド又は糖ペプチドの構成アミノ酸として存在するアミノ酸であることが好ましい場合がある。
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させる工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させる工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程。
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
である。
カルボキシル基が式-C(=O)-SR(式中、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)で表されるα-カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得る工程;
及び、上記の工程(a)〜(c)を含む工程を経ることにより、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得ることである。
C末端が以下の式で表される第1の糖ペプチド:
-糖Asn-X-C(=O)-SR
(式中、糖Asnは糖鎖が付加したアスパラギンであり、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基以外の部分であり、Rは、ベンジル基、アリール基又はアルキル基から選択され、これらは置換基によりさらに置換されていてもよい。)
と、-SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して-SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得る工程;
及び、上記の工程(a)〜(c)を含む工程を経ることにより、-OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドを得ることである。
まず、トレオニンのアミノ基及びカルボキシル基を保護したものを用意する。それぞれの保護基は以降の反応で目的のペプチドが得られる限り特に限定されないが、例えば、アミノ基をBoc基で保護し、カルボキシル基をTMSE(トリメチルシリルエチル)基で保護したものを用いることができる。次に公知の手法を用いてβ位の水酸基をメシル化する。次いで、例えばDBUとチオ酢酸を用いて、このメシル基をチオアセチル基へと置換する(D. Crich et al, J. Am. Chem. Soc., 129, 10064(2007)参照)。
-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-
(式中、aは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは0〜4の整数を示す。);
C1-10ポリメチレン;
-CH2-R3-
(ここで、R3は、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が1つ脱離して生ずる基である);
等を挙げることができる。
(3)この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基が保護された所望のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
(4)上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
(5)上記(3)及び(4)の工程を必要に応じて繰り返すことにより、所望の数の所望のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
また、Amino-PEGAレジン(樹脂)とアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸(HMPA)、4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)-ブチル酢酸(HMPB)等を挙げることができる。
脂溶性保護基を導入するには、例えばFmoc基を導入する場合には9-フルオレニルメチル-N-スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は0〜50℃、好ましくは室温で、約1〜5時間程度行うのが良い。
この時固相上の未反応の官能基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、1〜20当量、好ましくは1〜10当量、さらに好ましくは、1〜5当量とするのが好ましい。
また、上述のようにして得られた、-SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチド又は糖ペプチドに、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法を用いて糖鎖を付加することで、-SH基を有するアミノ酸を含む糖ペプチドを得ることもできる。
さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。
なお、本明細書中において、「ライゲーション法」とは、特許文献1に記載の天然型化学的ライゲーション法(Native Chemical Ligation、NCL法)のみならず、後述の実施例に記載のように、非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体(例えば、式(1)のトレオニン誘導体A、保護メチオニン、糖鎖付加アミノ酸等)を含むペプチドについて、上記天然型化学的ライゲーション法を応用する場合をも含む。ライゲーション法により、連結部位に天然アミド結合(ペプチド結合)を有するペプチドを製造することができる。
ライゲーション法に用いる、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)は、特許文献1に記載のように、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。
(a)ペプチド中の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む工程行う。以下、原料としてペプチドを用いた場合について例示する。
工程(a)のメチル化において用いるメチル化剤はペプチド中の-SH基を-SMe基に変換することができるものであれば特に限定されず、例えば、ヨードメタン、メチル-4-ニトロベンゼンスルホネート等を挙げることができる。
メチル化剤の使用量は、原料ペプチドの-SH基1残基に対して、1〜1000当量とすることができ、好ましくは、10〜100当量、より好ましくは、15〜30当量とすることができる。メチル化反応は、0〜50℃、好ましくは20〜30℃で、約10分〜30時間程度、好ましくは15分〜1時間程度行うことが望ましい。
工程(b)において用いるシアン化剤としては、例えば、安定性等の観点から、臭化シアン、フェニルシアネート等を用いることができ、好ましくは、入手容易な臭化シアンを用いることができる。
シアン化剤の使用量は、-SMe基1に対して、1〜1000当量とすることができ、好ましくは、10〜100当量、より好ましくは、15〜30当量とすることができる。シアン化剤との反応は、0〜50℃、好ましくは30〜40℃で、約30分〜100時間程度、好ましくは12時間〜50時間程度行うことが望ましい。
工程(b)で得られる反応中間体の一例は、以下の構造で示されるエステル体である。
工程(c)においては、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体のO-からN-への分子内アシル転移によって-OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドが得られる。
工程(c)における塩基性条件は、工程(b)と比較してより塩基性条件であれば酸性又は中性であってもよく、より特定すれば、工程(b)で得られた反応中間体のエステル結合に隣接するC原子上の-NH2基がプロトン化されない条件であればよい。反応中間体から-OH基を有するペプチドへの変換を効率よく行うという観点からは、弱塩基性条件又は強塩基性条件を用いることができる。
工程(c)における塩基性条件が弱塩基性である場合、さらにpHを下げて工程(c)を終了することもできるが、そのままpHを変化させずに、HPLC等による精製工程に移ることも可能である。
保護メチオニン残基を含むペプチドを原料とした場合、さらに所望により以下の工程(d)を、工程(b)又は(c)の後に行う:
(d)保護メチオニンを脱保護する工程。
このようにして、メチオニン残基を有するペプチドを得る場合についても本発明の製造方法を適用することができる。
まず、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を、上記で得たペプチド(特に、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に2つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸;リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に2以上のアミノ基を持つアミノ酸;セリン、トレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸;システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸;アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸等を含むペプチド。特に、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン又はグルタミンを含むペプチド)と反応させることにより製造する。上記反応は、通常0〜80℃、好ましくは、10〜60℃、更に好ましくは15〜35℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常30分〜5時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法(例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー(HPLC))で精製するのが良い。
具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体と、上記で得たペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、HPLCで精製することにより糖鎖が付加された糖ペプチドを得ることができる。
固相合成用カラムにWang resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DCMで十分に膨潤させた。Fmoc−Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及びN−メチルイミダゾール(0.375mmol)をDCM(2mL)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、25℃にて1時間攪拌した。なお、DCMは1.5mLとすることもできる。攪拌後、樹脂をDCM及びDMFで十分に洗浄し、Fmoc基を20%ピペリジン/DMF溶液(2mL)で15分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は10分間行うこともできる。DMFで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
ESI−MS:Calcd for C17H30N4O6S:[M+1H]1+ 419.2、found、419.1
ESI−MS:Calcd for C16H28N4O7:[M+1H]1+ 389.4、found、389.2
ESI-MS:Calcd for C16H28N4O7:[M+1H]1+ 389.4、found、389.1
固相合成用カラムにWang resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DCMで十分に膨潤させた。Fmoc−Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及びN−メチルイミダゾール(0.375mmol)をDCM(2mL)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、25℃にて1時間攪拌した。なお、DCMは1.5mLとすることもできる。攪拌後、樹脂をDCM及びDMFで十分に洗浄し、Fmoc基を20%ピペリジン/DMF溶液(2mL)で15分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は10分間行うこともできる。DMFで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
ESI−MS:Calcd for C35H64N9O11S:[M+1H]1+ 819.0、found、818.8
ESI−MS:Calcd for C34H62N9O12:[M+1H]1+ 788.9、found、788.5
ESI-MS:Calcd for C34H62N9O12:[M+1H]1+ 788.9、found、788.7
固相合成用カラムにWang resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DCMで十分に膨潤させた。Fmoc−Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及びN−メチルイミダゾール(0.375mmol)をDCM(2mL)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、25℃にて1時間攪拌した。なお、DCMは1.5mLとすることもできる。攪拌後、樹脂をDCM及びDMFで十分に洗浄し、Fmoc基を20%ピペリジン/DMF溶液(2mL)で15分間処理し脱保護した。なお、本脱保護処理は10分間行うこともできる。DMFで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
ESI−MS:Calcd for C66H100N18O14S:[M+2H]2+ 701.4、found、701.5
ESI−MS:Calcd for C65H100N18O15:[M+2H]2+ 686.4、found、686.5
ESI-MS:Calcd for C65H100N18O15:[M+2H]2+ 686.4、found、686.4
固相合成用カラムにAmino−PEGA resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DMFで十分に膨潤させた。4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及びN−エチルモルホリン(0.25mmol)をDMF(2ml)に溶解させてカラムに入れ、25℃で4時間攪拌した。樹脂をDMF及びDCMで十分に洗浄し、HMPB−PEGA resinを得、これを固相合成用の固相担体として用いた。
DMFで洗浄後、1残基のペプチド2μmol相当の樹脂をエッペンチューブに移した。下記式(9)で表される糖鎖アスパラギン(10mg,3.6μmol)とDEPBT(2mg,6μmol)をDMF(0.12mL)に溶解させ、エッペンチューブに入れ、DIPEA(0.68μl,4μmol)を加えて25℃で18時間攪拌した。
DMFで洗浄後、1残基のペプチド4.3μmol相当の樹脂をエッペンチューブに移した。式(9)で表される糖鎖アスパラギン(17mg,8.6μmol)とDEPBT(6mg,8.6μmol)をDMF:DMSO=4:1、0.29mLに溶解させ、エッペンチューブに入れ、DIPEA(1.5μl,8.6μmol)を加えて25℃で18時間攪拌した。
ESI−MS:Calcd for C165H265N31O74S:[M+2H]2+ 1300.7、found、1300.4
ESI-MS:Calcd for C164H263N31O75:[M+2H]2+ 1290.6、found、1290.7
固相合成用カラムにWang resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DCMで十分に膨潤させた。Fmoc−Ala(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及びN−メチルイミダゾール(0.375mmol)をDCM(1.5mL)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、25℃にて2時間攪拌した。攪拌後、樹脂をDCM及びDMFで十分に洗浄し、Fmoc基を20%ピペリジン/DMF溶液(2mL)で15分間処理し脱保護した。DMFで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
ESI−MS:Calcd for C16H28N4O7:[M+1H]1+ 464.2、found、464.5
固相合成用カラムにAmino−PEGA resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DMFで十分に膨潤させた。4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ酪酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及びN−エチルモルホリン(0.25mmol)をDMF(2mL)に溶解させてカラムに入れ、25℃で2時間攪拌した。樹脂をDMF及びDCMで十分に洗浄し、HMPB−PEGA resinを得、これを固相合成用の固相担体として用いた。
ESI-MS:Calcd for :[M+3H]3+ 1388.5、found、1388.6
固相合成用カラムにTrt chloride resin(メルク社製)(100μmol)を入れ、塩化メチレン(DCM)、DMFで十分に洗浄した後、DCMで十分に膨潤させた。ろ過後、Fmoc−Gly(0.20mmol)、DIPEA(0.4mmol)をDCM(0.66mL)に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、25℃にて2時間攪拌した。攪拌後、樹脂をDCM:MeOH:DIPEA=17:2:1、DCM及びDMFで十分に洗浄した後、Fmoc基を20%ピペリジン/DMF溶液(1mL)で20分間処理し脱保護した。DMFで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
ESI-MS:Calcd for C34H59N9O15:[M+1H]1+ 834.41、found、835.1
Boc−Thr(300mg,1.37mmol)を蒸留したDMF(6.85mL,200mM)に溶かした後にN−(3−Dimethylaminopropyl)−N’−ethylcarbodiimide hydrochloride(786mg,4.1mmol)とHOBt(370mg,2.74mmol)を加え、0℃で15分撹拌した後、TMSEtOH(1.95mL,13.7mmol)を加え、0℃で撹拌した。20時間後、TLCで反応終了確認後、反応溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水で中和し、水で2回、飽和食塩水で1回分液洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過を行い、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒、酢酸エチル:ヘキサン=1:3)で精製し、Boc−Thr−TMSエステル(収量:342mg,収率:78%)を得た。
配列番号1は、実施例1の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号2は、実施例1の、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号3は、実施例1の、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号4は、実施例1の、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号5は、実施例2の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号6は、実施例2の、アミノ酸配列である。
配列番号7は、実施例2の、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号8は、実施例2の、アミノ酸配列である。
配列番号9は、実施例3の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号10は、実施例3の、アミノ酸配列である。
配列番号11は、実施例3の、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号12は、実施例3の、アミノ酸配列である。
配列番号13は、実施例4の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号14は、実施例4の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号15は、実施例4の、糖鎖が付加された、ベンジルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
配列番号16は、実施例4の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号17は、実施例4の、アミノ酸配列である。
配列番号18は、実施例4の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号19は、実施例4の、糖鎖が付加された、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号20は、実施例4の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号22は、実施例5の、メチオニンスルホキシドを有する、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号23は、実施例5の、メチル化されたシステイン及びメチオニンスルホキシドを有する、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号24は、実施例5の、アセチル化されたアミノ酸配列である。
配列番号25は、実施例6の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号26は、実施例6の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号27は、実施例6の、糖鎖が付加された、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号28は、実施例6の、糖鎖が付加された、ベンチルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
配列番号29は、実施例6の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号30は、実施例6の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号31は、実施例6の、糖鎖が付加された、メチル化されたシステインを有するアミノ酸配列である。
配列番号32は、実施例6の、糖鎖が付加されたアミノ酸配列である。
配列番号33は、実施例7の、保護基を有するアミノ酸配列である。
配列番号34は、実施例7の、ベンチルチオエステル基を有するアミノ酸配列である。
配列番号35は、実施例7の、保護基及びトレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号36は、実施例7の、トレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号37は、実施例7の、トレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号38は、実施例7の、トレオニン誘導体を有するアミノ酸配列である。
配列番号39は、実施例7の、アミノ酸配列である。
Claims (10)
- ライゲーション法より得られた−SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記−SH基を−OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)ペプチド中の−SH基とメチル化剤とを反応させる工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させる工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程;
を含む、前記製造方法。 - ライゲーション法より得られた−SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドにおいて、前記−SH基を−OH基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)ペプチド中の−SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記−SH基を−SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、−OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法。 - ライゲーション法より得られたシステイン残基を含むペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とするペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)ペプチド中のシステイン残基の−SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記−SH基を−SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法。 - 前記反応中間体がエステル体である、請求項2又は3に記載のペプチドの製造方法。
- −OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式−C(=O)−SR(式中、Rは、ベンジル基である。)で表されるα−カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、−SH基を有するアミノ酸残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結して−SH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドを得る工程;
(a)工程(o)で得られたペプチド中の−SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記−SH基を−SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、−OH基を有するアミノ酸残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法。 - セリン残基を含むペプチドの製造方法であって、
(o)カルボキシル基が式−C(=O)−SR(式中、Rは、ベンジル基である。)で表されるα−カルボキシチオエステル基で置換されたアミノ酸残基をC末端に含む第1のペプチドと、システイン残基をN末端に含む第2のペプチドとを、ライゲーション法により連結してシステイン残基を含むペプチドを得る工程;
(a)工程(o)で得られたペプチド中のシステイン残基の−SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記−SH基を−SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させることにより反応中間体を生成する工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含むペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法。 - 前記反応中間体がエステル体である、請求項5又は6に記載のペプチドの製造方法。
- ライゲーション法より得られた−SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記−SH基を−OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)糖ペプチド中の−SH基とメチル化剤とを反応させる工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させる工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件とする工程;
を含む、前記製造方法。 - ライゲーション法より得られた−SH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドにおいて、前記−SH基を−OH基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)糖ペプチド中の−SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記−SH基を−SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、−OH基を有するアミノ酸残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法。 - ライゲーション法より得られたシステイン残基を含む糖ペプチドにおいて、前記システイン残基をセリン残基に変換することを特徴とする糖ペプチドの製造方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)糖ペプチド中のシステイン残基の−SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記−SH基を−SMe基に変換する工程;
(b)工程(a)で得られた−SMe基とシアン化剤とを酸性条件下で反応させることにより、反応中間体を生成する工程;及び
(c)ヒドラジン含水物を添加することにより、工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、セリン残基を含む糖ペプチドに変換する工程;
を含む、前記製造方法。
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