JP6153470B2 - 糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物 - Google Patents

糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
天然のヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）は、１６６個のアミノ酸残基からなる糖タンパク質である。インターフェロンβは、サイトカインファミリーに属し、免疫調整作用、抗ウイルス活性、細胞増殖抑制作用に関与することが知られている。また、ヒトインターフェロンβは、そのアミノ酸配列における１７位、３１位、１４１位に３つのＣｙｓを有しており、８０位のアスパラギンに１本の複合型のＮ結合型オリゴ糖を有している。また、３１位と１４１位のＣｙｓにおいてジスルフィド結合を有していることが知られている。薬剤としてのインターフェロンβは、細胞発現系を利用し製造されており、発現させる宿主の違いによりＩＦＮ−β−１ａまたはＩＦＮ−β−１ｂに分類される。ＩＦＮ−β−１ａは糖タンパク質であるが、一方、ＩＦＮ−β−１ｂはオリゴ糖を有さない。そして、糖鎖を有するＩＦＮ−β−１ａは、ＩＦＮ−β−１ｂと比べて、免疫原性、抗ウイルス活性、および、抗腫瘍特性においてより強力な効能を有していることが知られている。
ここで、糖タンパク質中に含まれる糖鎖構造は、薬物動態に対して強い影響力を有することが知られている。特に、糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸の有無が、血中半減期の延長に影響を有することが知られている。しかしながら、これまでに生合成されたＩＦＮ−β−１ａは、そのポリペプチド中に有する糖鎖の構造が不均一であることが報告されている（例えば、ＣＥ−ＴＯＦ−ＭＳにより糖鎖構造の不均一性を分析した結果が、非特許文献１に記載されている）。また、合成されたＩＦＮ−βや天然に存在するＩＦＮ−βから、糖鎖の構造が実質的に均一であるＩＦＮ−βを単離したことについては報告されていない。よって、どの糖鎖構造が生理活性に重要であるかを推定する障害となっていた。
近年、細胞発現系を利用するバイオテクノロジーは、インターフェロンを含め、インシュリン、エリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦのような生理活性タンパク質製剤の製造を可能としてきた。これらのタンパク質製剤において、タンパク質の糖化パターンは、フォールディング工程や、コンフォメーション特性、安定性、免疫反応、血中半減期、および、生体系におけるタンパク質の機能のようなタンパク質の物理特性や化学特性に変化を与えることが報告されている（非特許文献２）。また、これらのタンパク質製剤に付加される糖鎖の構造は、非ヒト型の糖鎖によって生じる重大な免疫原性を考慮すると、ヒト型の糖鎖であることが好ましい。
このような糖タンパク質製剤は、その唯一の方法として、細胞発現系により製造されてきた。しかしながら、このような細胞発現系の技術は、上述のように、糖鎖の構造までを制御することができず、この結果、製造される糖タンパク質中の糖鎖の構造に不均一性を生じていた（例えば、非特許文献３）。このため、製造ロット間の品質のばらつきや、糖鎖の最適化ができない等の問題点を有していた。よって、糖鎖構造を容易に調整可能である均一の糖タンパク質の調製方法が長い間望まれており、現在のところ、化学合成により生体内で生理活性を示すヒト型の均一な糖タンパク質の合成は報告されていない。
また、このような細胞発現系による技術によって製造される生理活性糖タンパク質はウイルスや遺伝物質を含む可能性がある。また、生体由来の試料から調製した糖鎖を使用して生理活性糖タンパク質を合成する場合にも、このような遺伝物質等の混入の可能性がある。安全なタンパク製剤を製造するためには、これらの遺伝物質を崩壊させることのできる加熱処理法の適用が望まれている。しかしながら、現在のところ、生理活性糖タンパク質製剤に対する加熱処理は、糖タンパク質を失活させてしまい、加熱処理法の適用は報告されていない。
Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌｌ Ｃｈｅｍ （２０１１） ４００：２９５−３０３ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００６， ２４， １２４１−１２５２ Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ４２， １１７−１３１ （１９９５）
本発明は、均一な糖鎖構造を有する糖鎖付加ポリペプチドであって、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、均一な糖鎖構造を有する糖鎖付加ポリペプチドであって、インターフェロンβの活性を有する糖鎖付加ポリペプチドを、製造することに成功した。
即ち、本発明は、
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（ｃ）インターフェロンβの類縁体；および
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有し、かつ、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、実質的に均一な糖鎖を有することを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドに関する。
ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが化学合成により作製されたものであることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、糖鎖付加ペプチドフラグメントと、少なくとも２つのペプチドフラグメントとを合成する工程と、前記糖鎖付加ペプチドフラグメントと前記少なくとも２つのペプチドフラグメントとを連結させる工程を含む方法により得られる糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（ｃ）インターフェロンβの類縁体；および
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有し、かつ、インターフェロンβ活性を有することを特徴とする
糖鎖付加ポリペプチドに関する。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様において、糖鎖付加ポリペプチドは、糖鎖付加ペプチドフラグメントと、少なくとも２つのペプチドフラグメントとを合成する工程と、前記糖鎖付加ペプチドフラグメントと前記少なくとも２つのペプチドフラグメントとを連結させる工程を含む方法により得られた糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（ｃ）インターフェロンβの類縁体；および
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有する糖鎖付加ポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有し、かつ、インターフェロンβ活性を有することを特徴とする
糖鎖付加ポリペプチドに関する。
ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖が、アスパラギン結合型糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖が、下記式（ａ）で表わされるジシアロ糖鎖、または、下記式（ｂ）で表わされるアシアロ糖鎖であることを特徴とする。
（ａ）
（ｂ）
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドがインターフェロンβの３１位および１４１位に相当するＣｙｓが、ジスルフィド結合を形成していることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが加熱処理されていることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが９０％以上の純度を有することを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、前記糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物であって、前記組成物中の糖鎖付加ポリペプチドが実質的に均一であることを特徴とする組成物に関する。
ここで、本発明の組成物の一実施態様においては、前記組成物中の糖鎖付加ポリペプチドが９０％以上均一であることを特徴とする。
また、本発明の組成物の一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、９０％以上の純度を有することを特徴とする。
また、本発明の組成物は、糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物であって、
前記糖鎖付加ポリペプチドは、次の（ａ）〜（ｄ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（ｃ）インターフェロンβの類縁体；および
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有し、かつ、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記組成物中の糖鎖付加ポリペプチドが、実質的に均一であることを特徴とする、
組成物であることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、（Ｉ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、 （ＩＩ）薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
ここで、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖が実質的に均一であることを特徴とする。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖が９０％以上均一であることを特徴とする。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、９０％以上の純度を有することを特徴とする。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記インターフェロンβに関連する疾患が、多膠芽腫、髄芽腫、および、星細胞腫を含む脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、ならびに、多発性硬化症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、前記糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防方法に関する。
ここで、本発明のインターフェロンβに関連する疾患の治療または予防方法の一実施態様においては、前記インターフェロンβに関連する疾患が、多膠芽腫、髄芽腫、および、星細胞腫を含む脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、ならびに、多発性硬化症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（ｃ）インターフェロンβの類縁体；および
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドであり、かつ、インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓが保護基により保護されていることを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドに関する。
ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、前記糖鎖が、下記式（ｃ）で表わされる糖鎖非還元末端に存在するシアル酸のカルボキシ基が保護されたジシアロ糖鎖、または、下記式（ｂ）で表わされるアシアロ糖鎖であることを特徴とする。
（ｃ）
（式中、Ｒは、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２を表わす。なお、式中、Ｂｎはベンジル基を示し、Ｅｔはエチル基を示し、Ｍｅはメチル基を示し、Ｐｈはフェニル基を示す。）
（ｂ）
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、前記インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓが、Ａｃｍ基、アルコキシメチル基、トリフェニルメチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基および、β位が置換されたエチル基からなる群より選択されるいずれか一つの保護基により保護されていることを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、糖鎖付加ポリペプチドの製造方法であって、Ｃｙｓが保護されている前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、保護基により保護されている前記インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓを脱保護する工程を含むことを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドの製造方法に関する。
ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記Ｃｙｓを脱保護する工程の前に、インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓが保護基により保護された前記糖鎖付加ポリペプチドを調製する工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの製造方法の一実施態様においては、Ｃｙｓの保護基を脱保護する工程の前に、糖鎖付加ポリペプチドを加熱処理することを特徴とする。
また、本発明の別の態様は、
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（ｃ）インターフェロンβの類縁体；および
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有する糖鎖付加ポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドであり、
前記糖鎖が下記式（ｃ）により表わされる、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸のカルボキシ基が保護されたジシアロ糖鎖であることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチドに関する。
（ｃ）
（式中、Ｒは、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２を表わす。なお、式中、Ｂｎはベンジル基を示し、Ｅｔはエチル基を示し、Ｍｅはメチル基を示し、Ｐｈはフェニル基を示す。）
また、本発明の別の態様は、糖鎖付加ポリペプチドの製造方法であって、シアル酸のカルボキシ基が保護された糖鎖を有する前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸のカルボキシ基の保護基を脱保護する工程を含むことを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドの製造方法に関する。
ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの製造方法の一実施態様においては、前記シアル酸のカルボキシ基の脱保護の工程の前に、シアル酸のカルボキシ基が保護された糖鎖を有する前記糖鎖付加ポリペプチドを調製する工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの製造方法は、前記糖鎖付加ポリペプチドをフォールディングする工程をさらに含むことを特徴とする。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、均一な糖鎖構造を有するため、ロット間のばらつきが少なく、品質の安定したインターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリぺプチドを提供することができる。また、結合している糖鎖の種類を均一化することができ、糖鎖構造を目的に応じて最適化することが可能である。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、熱処理をすることができるため、ウイルスや未知の遺伝物質の混入を防ぐことが可能である。
図１は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、インターフェロンβのアミノ酸配列における６８位−８８位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメントＢと８９位−１６６位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＣとをライゲーションさせる工程の模式図である。 図２は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、インターフェロンβのアミノ酸配列における１位−６７位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＡと６８位−１６６位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ）とをライゲーションさせる工程の模式図である。 図３は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、ライゲーションにより作製した、インターフェロンβのアミノ酸配列における１位−１６６位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）の特定のシステインを、アラニンへ還元させる工程の模式図である。 図４は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、ライゲーションにより作製した、インターフェロンβのアミノ酸配列における１位−１６６位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）であって、アラニンへの還元工程後の糖ペプチドフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）に対して行うシステインの保護基の脱保護をする工程を示す模式図である。 図５は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１１）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図６は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１１）のアミノ酸配列を示す。 図７は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１２）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図８は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１２）のアミノ酸配列を示す。 図９は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１３）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図１０は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１３）のアミノ酸配列を示す。 図１１は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１４）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図１２は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１４）のアミノ酸配列を示す。 図１３は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１５）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図１４は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１５）のアミノ酸配列を示す。 図１５は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造された糖ペプチドフラグメント（１５）の純度をＨＰＬＣにより測定した際のデータを示す。 図１６は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（５）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図１７は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（５）のアミノ酸配列を示す。 図１８は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（６）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図１９は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（６）のアミノ酸配列を示す。 図２０は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（７）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図２１は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（７）のアミノ酸配列を示す。 図２２は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（８）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図２３は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（８）のアミノ酸配列を示す。 図２４は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（９）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図２５は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（９）のアミノ酸配列を示す。 図２６は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１０）のＨＰＬＣデータ（Ａ）を示す。 図２７は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１０）のアミノ酸配列を示す。 図２８は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造された糖ペプチドフラグメント（１０）の純度をＨＰＬＣにより測定した際のデータを示す。 図２９は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造されるペプチドフラグメント（１８）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３０は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（１９）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３１は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、製造される糖ペプチドフラグメント（２０）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３２は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２１）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３３は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２２）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３４は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２３）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３５は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２４）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図３６は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施の態様である、１７位、３１位、１４１位のＣｙｓがＡｃｍ基で保護されたジベンジルジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（７）のアミノ酸配列の模式図と、当該ジベンジルジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（７）を加熱処理する前および加熱処理後の、ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳによる分析データを示す。図３６ａおよびｃは加熱処理前のＥＳＩ−ＭＳデータを示し、図３６ｂおよびｅは加熱処理後のＥＳＩ−ＭＳデータを示す。また、図３６ｄは、加熱処理前のＨＰＬＣ分析データを示し、図３６ｆは、加熱処理後のＨＰＬＣ分析データを示す。 図３７は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施の態様である、１７位、３１位、１４１位のＣｙｓが無保護のジベンジルジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（８）のアミノ酸配列の模式図と、当該ジベンジルジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（８）を加熱処理する前および加熱処理後の、ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳによる分析データを示す。図３７ａおよびｃは加熱処理前のＥＳＩ−ＭＳデータを示し、図３７ｂおよびｅは加熱処理後のＥＳＩ−ＭＳデータを示す。また、図３７ｄは、加熱処理前のＨＰＬＣ分析データを示し、図３７ｆは、加熱処理後のＨＰＬＣ分析データを示す。 図３８は、本発明の一実施の態様である、化学合成した糖鎖付加ポリペプチド（非加熱処理）のＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２に対する受容体親和性解析のデータを示す。 図３９は、本発明の一実施の態様である、化学合成した糖鎖付加ポリペプチド（加熱処理）のＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２に対する受容体親和性解析のデータを示す。 図４０は、本発明の一実施の態様である、化学合成した糖鎖付加ポリペプチドをマウスに投与した際の薬物動態解析のデータを示す。なお、対照区として、生合成により作製されたＩＦＮβモチダを使用した。図４０において、Ａは静脈投与した際のデータを示し、Ｂは皮下投与した際のデータを示す。 図４１は、本発明の一実施の態様である、化学合成した糖鎖付加ポリペプチドの抗腫瘍活性を示すデータである。なお、対照区として、ＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）、および、生合成により作製されたＩＦＮβモチダを使用した。 図４２は、本発明の一実施の態様である、化学合成した糖鎖付加ポリペプチドにおいて、加熱処理したものと非加熱処理のものとで、細胞増殖抑制活性能を比較したデータを示す。 図４３は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、インターフェロンβのアミノ酸配列における６８位−７５位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＢ２と７６位−８８位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメントＢ１とをライゲーションさせる工程を示す模式図である。 図４４は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、ライゲーションにより作製した、インターフェロンβのアミノ酸配列における６８位−８８位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）の特定のシステインのチオール基（−ＳＨ）を、メチルチオ基（−ＳＭｅ）へメチル化する工程を示す模式図である。 図４５は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において、糖ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）上の、メチル化されたチオール基（−ＳＭｅ）を有するシステインが、セリンへと変換される分子内アシル転位化工程を示す摸式図である。 図４６は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２５）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図４７は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造されるペプチドフラグメント（２６）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図４８は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２７）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図４９は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２８）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。 図５０は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造する一実施の態様において製造される糖ペプチドフラグメント（２９）のＨＰＬＣデータ（Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳデータ（Ｂ）を示す。
本明細書において、「インターフェロンβ」または「ＩＦＮ−β」とは、配列番号１で表わされる１６６個のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。なお、インターフェロンβは、下記アミノ酸配列における３１位と１４１位のシステイン間においてジスルフィド結合を有している。また、本明細書において、「インターフェロンβ」とは、好ましくは、下記アミノ酸配列（配列番号１）を有し、かつ、糖鎖を有するヒト型のインターフェロンβ−１ａに相当するものである。なお、インターフェロンβ−１ａは、下記アミノ酸配列において、８０位のアスパラギンに糖鎖が付加している。
Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ１０−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ２０−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ３０−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ４０−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ５０−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ６０−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ７０−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ８０−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ９０−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ１００−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ１１０−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ１２０−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３０−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ１４０−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ１５０−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ１６０−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ１６６
本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体および誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；およびアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
本明細書中において、アミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたという場合、置換等されるアミノ酸の個数は、インターフェロンβ活性を保持する限り特に限定されないが、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または、１０個程度アミノ酸が相違していることを意味する。あるいは、全体のアミノ酸配列の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内のアミノ酸が相違する場合も含まれる。置換または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。
本明細書において、「ペプチドフラグメント」とは、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを製造するにあたり、最終的な糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列の一部の配列を有するペプチドフラグメントをいう。また、本明細書において、「糖鎖付加ペプチドフラグメント」または「糖ペプチドフラグメント」とは、このようなペプチドフラグメント中のアミノ酸配列において、糖鎖付加アミノ酸を含むペプチドフラグメントをいう。本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、糖鎖付加ペプチドフラグメントと、少なくとも２つのペプチドフラグメントを連結させることにより製造される。
本発明において、「インターフェロンβの類縁体」とは、インターフェロンβと構造上類似したポリペプチドおよび／またはインターフェロンβと重複した構造を有するポリペプチド、例えば、インターフェロンβのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたポリペプチド、インターフェロンβ改変体、インターフェロンβ活性を有するインターフェロンβのフラグメント、インターフェロンβ活性を有する伸長インターフェロンβが挙げられる。
本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数および／または疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、インターフェロンβ活性の明らかな低下または消失を生じない置換をいう。
本明細書中において、「インターフェロンβ改変体」とは、インターフェロンβの改変体であって、インターフェロンβの天然に存在する変異体、またはインターフェロンβを人工的に改変した化合物を含み、そのような改変としては、例えば、インターフェロンβの１または複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
本明細書中において、「インターフェロンβ活性を有するインターフェロンβのフラグメント」とは、インターフェロンβのＮ末端および／またはＣ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつインターフェロンβ受容体に活性を維持したペプチドである。
本明細書中において、「インターフェロンβ活性を有する伸長インターフェロンβ」とは、インターフェロンβのＮ末端および／またはＣ末端に１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、かつインターフェロンβ活性を維持したペプチドである。
上述するようなインターフェロンβの類縁体としては、例えば、１位のＭｅｔが欠損し、１７位のＣｙｓがＳｅｒに置換されたインターフェロンβ−１ｂとして知られているアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドであり、かつ、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドを含む。本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、配列番号１と８０％以上の相同性を有する場合には、好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上の相同性を有することができる。
本明細書において、「インターフェロンβにおける特定の位置に相当するアミノ酸」とは、糖鎖付加ポリペプチドにおいてアミノ酸の付加、欠失等がない限り、インターフェロンβのアミノ酸配列に対応する同一の位置のアミノ酸をいう。また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列内において、アミノ酸の付加、欠失が存在する場合には、アミノ酸の付加、欠失によるアミノ酸配列上の移動を考慮した位置にあるアミノ酸をいう。例えば、１位から４位までにＭｅｔ１‐Ｓｅｒ２‐Ｔｙｒ３‐Ａｓｎ４‐の配列を有する糖鎖付加ポリペプチドにおいて、２位と３位のアミノ酸の間に１つのアミノ酸（Ｔｒｐ）が付加された場合（Ｍｅｔ‐Ｓｅｒ‐Ｔｒｐ‐Ｔｙｒ‐Ａｓｎ‐）、３位のアミノ酸（Ｔｙｒ）に相当するアミノ酸とは、糖鎖付加ポリペプチドにおいて、Ｔｒｐの挿入によりＣ末端側に１つ移動したアミノ酸（Ｔｙｒ）をいう。
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシ基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基またはアミノ基の誘導体を有する糖（例えば、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシ基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において、好ましい糖鎖は、糖鎖付加ポリペプチド中に付加された場合に、インターフェロンβ活性を消失させない糖鎖である。
このような、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（または糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。
生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）としてペプチド（またはタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、
を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。


また、本発明において、複合型糖鎖には、２本鎖複合糖鎖を含む。２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０〜３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
モノシアロ糖鎖、
アシアロ糖鎖、
ジグルクナック糖鎖、
ジマンノース糖鎖、
等が好ましい。２本鎖複合型糖鎖としては、ジシアロ糖鎖またはアシアロ糖鎖がより好ましく、最も好ましくは、ジシアロ糖鎖である。
また、本発明の複合型糖鎖には、上記の２本鎖複合型糖鎖（２分岐型複合型糖鎖）の他、３本鎖の複合型糖鎖（３分岐型複合型糖鎖）、４本鎖の複合型糖鎖（４分岐型複合糖鎖）も含む。例えば、３本鎖、４本鎖の複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされる、トリシアロ糖鎖
下記構造式で表わされるテトラシアロ糖鎖
を挙げることができる。また、３本鎖複合型糖鎖および4本鎖複合型糖鎖としては、これらのトリシアロ糖鎖およびテトラシアロ糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
さらに、本発明の複合型糖鎖には、フコースが付いたものも含む。フコースが付いた複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされるフコース含有複合型糖鎖
を挙げることができる。また、これらのフコース含有複合型糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
また、本明細書中において「２本鎖複合型糖鎖」、「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」、「３本鎖複合型糖鎖」、「４本鎖複合型糖鎖」、「フコース含有複合型糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖またはモノシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
また、本発明の複合型糖鎖には、下記式で表わされるポリラクトサミン構造またはシアリルポリラクトサミン構造を有する糖鎖も含む。
（式中、ｎは２〜３の整数である。）
（式中、ｎは２〜３の整数である。）
また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５〜９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース−５（Ｍ−５）
ハイマンノース−９（Ｍ−９）
等を挙げることができる。
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。具体的には、下記に列挙される糖鎖を挙げることができる。
なお、本発明の一実施の態様において、糖鎖は、非還元末端に位置するシアル酸のカルボキシ基が修飾されていてもよい。このような糖鎖としては、上記で挙げる糖鎖のうち非還元末端にシアル酸を有する糖鎖であって、かつ、当該シアル酸のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）の水素原子が、Ｂｎ、Ｅｔ、Ｍｅ、ＣＨ２ＣＯＰｈ、ＣＨ２ＰｈＯＭｅ、ＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、ＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、ＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２で置換された（すなわち、当該シアル酸のカルボキシ基が、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２で表わされる）糖鎖を挙げることができる。
また、本発明の一態様において、好ましい糖鎖は、直鎖構造を有する糖鎖である。かかる糖鎖としては、例えば、オリゴヒアルロン酸が挙げられる。本明細書において、オリゴヒアルロン酸とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に２〜３２糖、好ましくは２〜１６糖、より好ましくは４〜８糖、直鎖上に結合した糖鎖をいう。
本発明に用いられるオリゴヒアルロン酸のうち、特に好ましいものとして、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位とした場合、２単位（４糖）以上８単位（１６糖）以下の糖鎖が挙げられ、さらに好ましくは、２単位（４糖）〜４単位（８糖）、最も好ましくは２単位（４糖）である。
本発明に好ましく用いられるヒアルロン酸としては、例えば、
４糖のオリゴヒアルロン酸、
８糖のオリゴヒアルロン酸
等が挙げられる。
本発明の糖鎖付加ポリペプチド中の糖鎖が付加するアミノ酸は、天然に存在するインターフェロンβと同様に、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に付加していることが好ましい。また、糖鎖が付加するアミノ酸は、アスパラギンであることが好ましい。
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの糖鎖は、均一であることが好ましい。本明細書において、糖鎖付加ポリペプチドにおいて糖鎖が均一とは、糖鎖付加ポリペプチド間において糖鎖を比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、および糖間の結合様式が同一であることをいう。具体的には、糖鎖付加ポリペプチド間において、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上で糖鎖の構造が均一であることを言う。
また、本明細書において、糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物における組成物中の糖鎖付加ポリペプチドが均一とは、当該組成物中に含まれる糖鎖付加ポリペプチド間において糖鎖およびポリペプチド部分を比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、糖鎖の結合順序、糖間の結合様式、ポリペプチドを構成するアミノ酸の種類、アミノ酸の配列順序が同一であることをいう。具体的には、組成物中に含まれる糖鎖付加ポリペプチド間において、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上で糖鎖の構造およびポリペプチド部分が均一であることを言う。
特に、糖ペプチド間において糖鎖が均一である糖ペプチドを含む組成物等は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合や均一な糖鎖付加ポリペプチドの割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、糖鎖付加ペプチドフラグメントと少なくとも２つのペプチドフラグメントを連結されることにより製造される。
（ペプチドフラグメント）
このような、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを構成する糖鎖付加ペプチドフラグメントおよびペプチドフラグメントは、上述するように、それぞれがインターフェロンβのアミノ酸配列の一部を有する。すなわち、各フラグメントは、インターフェロンβの１６６個のアミノ酸配列を少なくとも３つに分割した、それぞれのアミノ酸配列を有する。
ここで、フラグメントの数、および、各フラグメントの長さは、各フラグメント合成時の伸長による収率の低下、各フラグメントを連結させる際に必要なアミノ酸の種類、連結工程の回数による収率の低下を考慮して、好ましいフラグメント数およびアミノ酸位置で、各フラグメントのアミノ酸配列を選択することが好ましい。
各フラグメントの長さは、フラグメントの調製方法により異なるが、例えば、９〜８４の長さとすることが好ましく、６７〜７８の長さとすることがより好ましい。
また、各フラグメントを連結させる方法としては、Ｔｈｉｏｌ−ｆｒｅｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ， Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ， Ｓｕｇａｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ， Ｔｈｉｏｌ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ（Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕ．， ２０１１， ４７， ６２０１−６２０７）， （Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕ．， ２０１０， ４６， ２１−４３）等、公知の方法で連結させることができ、好ましくは、ネイティブケミカルライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ：ＮＣＬ）を用いて連結させることができる。
ネイティブケミカルライゲーション法を用いる際には、インターフェロンβのアミノ酸配列より選択される各フラグメントのＮ末端をＣｙｓとする必要がある。Ｃｙｓ以外のアミノ酸を各フラグメントのＮ末端のアミノ酸として選択する場合には、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｍｅｔを選択することができる。例えば、フラグメントのＮ末端をＡｌａとした場合には、Ｎ末端のＡｌａの代わりにＣｙｓを導入したフラグメントを合成しておき、他のフラグメントとライゲーション後に、ＣｙｓをＡｌａに還元することが可能である。また、フラグメントのＮ末端をＰｈｅまたはＶａｌとした場合には、導入するアミノ酸として、β位にチオール基を有する非天然型アミノ酸を用いて、ライゲーションを行い、その後還元処理することが可能である。Ｓｅｒ、ＴｈｒをフラグメントのＮ末端として設計する場合には、Ｎ末端としてシステインを導入し、ライゲーション後に当該システイン残基のチオール基のメチル化、続くシアノジェンブロマイド処理により、Ｓｅｒ、Ｔｈｒへ変換させることができる。また、ＨｉｓまたはＬｙｓをフラグメントのＮ末端として設計する場合には、これらのアミノ酸をＮ末端として導入後、アミノ基の求核攻撃を利用したライゲーション反応により望むアミド結合を形成させることが可能となる。その他のアミノ酸をフラグメントのＮ末端とする場合も、公知の方法により、ネイティブケミカルライゲーション法を適用し、最終的な糖鎖付加ポリペプチドを構成することができる。
または、インターフェロンβのアミノ酸配列において所望の位置にシステインが存在しない場合には、最終生産物である糖鎖ポリペプチドがインターフェロンβ活性を有する限り、所望の位置にシステインを導入しフラグメントのＮ末端とすることも可能である。また、望ましい限りにおいて、導入されたシステインは、各ペプチドフラグメント同士のライゲーションの工程後、上記のようにＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒへ置換することもできる。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドの製造において、フラグメントのＮ末端として選択するアミノ酸としては、フラグメント数や最終生成物の収率の点において、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒから選択することが好ましく、還元反応により置換可能であるＡｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌから選択することがより好ましい。より具体的な例としては、インターフェロンβにおける１−６７位までを第一フラグメントとし、６８位のＡｌａをＮ末端に有する６８―８８位までを第二フラグメントとし、８９位のＡｌａをＮ末端に有する８９−１６６位までを第三フラグメントとすることができる。また、例えば、上記の８９−１６６位の第三フラグメントは、８９−１３３位のフラグメントと、１３４位のＡｌａをＮ末端に有する１３４−１６６位のフラグメントに分けて製造することも可能である。
（フラグメントの製造方法）
このようなペプチドフラグメントの製造方法は、生合成、化学合成または無細胞合成等の方法によって製造することができる。特に、糖鎖を有するペプチドフラグメントの合成は、糖鎖を均一とするために、化学合成により製造することが好ましい。化学合成による製造方法としては、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法を用いることができる。また、各フラグメントのＮ末端としてＡｌａを選択するような場合には、各フラグメントをライゲーション後、Ａｌａの代わりにＮ末端へ導入した特定のＣｙｓをＡｌａに還元する必要があるため、還元しないＣｙｓを予め選択的に保護しておくことが好ましい。よって、このような場合には、化学合成によりペプチドフラグメントを製造することが簡便であり好ましい。
本発明の糖鎖付加ペプチドフラグメントの製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加ポリペプチドの安定した製造方法の具体例としては、糖鎖が付加したアミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、ペプチドフラグメントと同様に、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ペプチドフラグメントを製造する方法を用いることができる。このような方法は、例えば、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００８， ４７， ６８５１‐６８５５に記載されている。また、例えば、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））にも記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
糖鎖付加ポリペプチドは、例えば、以下に概略を示す糖鎖付加アスパラギンを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシ基を樹脂（レジン）へ結合させる。この場合、アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンとアミノ酸とが反応して結合が起こる。
（２）得られた反応物の脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とアミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシ基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加アスパラギンを有する糖鎖付加ペプチドフラグメントを得ることができる。
また、（２）の後、または、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用いれば、任意の箇所に糖鎖を付加することができる。また、糖鎖付加アスパラギンを付加した後に、さらに、（３）と（４）とを繰り返して、ペプチドを伸長させることもできる。
糖鎖付加アミノ酸を結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（６）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加アスパラギンを有するペプチドを得ることができる。
上記の合成方法において結合される糖鎖は、同一の構造を有する上述の糖鎖を用いる。このような糖鎖としては、任意の公知の方法により得ることができる。具体的な手法としては、限定されることなく、例えば、糖鎖を化学合成すること（例えば、Ｊ．Ｓｅｉｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ．Ｅｄ． ２０００， ３９， ｐ５３１−５３４参照）や、天然または人工の糖鎖給源から分離したものや市販されているものを利用することができる。当該手法において、同一の構造を有する糖鎖アミノ酸としては、限定されることなく、例えば、天然または人工の糖鎖給源からの同一構造の糖鎖の分離は、例えば、ＷＯ２００４／０５８７８９に記載の方法により行うことができる。具体的には、鶏卵などの天然の糖鎖給源から、Ｓｅｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９７；１３３５（１−２）：２３−３２などに記載の方法で糖鎖アスパラギンを含む混合物（シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ））を単離し、該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基（例えば、Ｆｍｏｃ）を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得、これをクロマトグラフィーに供することにより、該混合物に含まれる種々の構造の糖鎖を、その構造に応じて分離することができる。また、種々の保護基を有するまたは有しない特定の構造の糖鎖アスパラギンは、例えば、大塚化学株式会社より入手可能である。
樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、塩素で官能化された２−クロロトリチルクロリド樹脂（メルク社製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｉｔｙｌ ＮｏｖａＰＥＧ樹脂（メルク社製）等も用いることができる。
また、Ｃ末端をアミド化する場合には、例えば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることができる。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
樹脂と脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸との結合は、例えば、水酸基を有する樹脂や塩素で官能化された樹脂を使用するには、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂へエステル結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合には、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂にアミド結合により結合させる。
なお、２―クロロトリチルクロリド樹脂は、固相合成においてペプチド鎖を伸長する際、末端にあるＣｙｓのラセミ化を防止することができる点において、好ましい。
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを挙げることができる。
また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨを挙げることができる。なお、本明細書において、Ｔｈｚは、Ｃｙｓのチアゾリジン型（Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を示す。
なお、固相合成等によりペプチドフラグメントを合成する際には、Ｎ末端をＢｏｃ基で保護されたアミノ酸とすることで、ペプチドフラグメント合成後にチオエステル化が必要な際、アミノ基が起こす求核反応による副反応を抑えることができる点で好ましい。
また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、固相合成の過程において、上記の脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
水酸基を有する樹脂を用いる場合、エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。また、２−クロロトリチルクロリド樹脂を用いる場合、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等の塩基を用いることでエステル化を行うことができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、ジクロロメタン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
また、この時固相上の未反応の水酸基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが良い。
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えば、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
ペプチドフラグメントは、上記のように固相合成等の化学合成により作製することができるが、当業者に公知の生合成による方法によっても調製が可能である。例えば、組換えベクターに目的の遺伝子を導入することで、目的のペプチドフラグメントを発現させることができる。本発明で用いる組換えベクターとしては、宿主細胞を形質転換し得るものであればよく、宿主細胞に応じて大腸菌用のプラスミド、枯草菌用のプラスミド、酵母用のプラスミド、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。これらには、その宿主細胞にてタンパク質を適切に発現させ得るプロモーター等の制御配列を有しているものが好ましい。また、宿主細胞としては、組換えベクターにて外来性遺伝子を発現できる物であればよく、一般的には、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
宿主細胞に組換えベクターを移入する方法としては、一般的に常用されている方法を用いればよく、例えば、大腸菌の場合は、ヒートショック法、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法、酵母の場合は塩化リチウム法やエレクトロポレーション法が利用できる。また、動物細胞の形質転換は、エレクトロポレーション等の物理的方法、あるいは、リポソーム法やリン酸カルシウム法等の化学的方法、あるいはレトロウイルス等のウイルスベクターを用いて行なうことができる。また、ベクター導入後は、当業者に周知の方法により、目的のＤＮＡ配列が正しく組込まれていることを確認することが好ましい。形質転換体である宿主細胞の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。
また、生合成により作製されるペプチドは、精製されていることが好ましい。ペプチドの精製方法は通常の一般的な精製により行うことができる。たとえば、組換えタンパク質であれば、本発明で使用される組換えタンパク質を発現する菌体あるいは細胞を培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりペプチドの粗抽出液を調製する。緩衝液中には、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた抽出液、あるいは培養上清中に含まれるペプチドの精製は、公知の精製方法によって行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過、ゲルろ過、電気泳動、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、ペプチドの分離、精製を行うことが可能である。
また、組換えタンパク質の精製を容易にするために、発現ベクターに種々のタグを組み込んでおくこともできる。タグの例としては、発現効率を向上させるタグや、精製効率を向上させるタグ等、当業者に周知のタグを使用することができ、例えば、チオレドキシン、ＧＳＴタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）などが挙げられる。
また、ペプチドフラグメントの所望のＮ末端にライゲーションに使用するシステインが存在しない場合には、当該部位にシステインを導入することもできる。例えば、宿主細胞に導入する核酸分子に、エラープローンＰＣＲ、部位特異的変異導入、アセンブリＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、ｉｎ ｖｉｖｏ変異導入、カセット変異導入、リカーシブアンサンブル変異導入（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、およびエクスポネンシャルアンサンブル変異導入（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の任意の変異導入法によって、所望の部位をシステインに変異させることが可能である。
また、上記のように生合成により作製されたペプチドフラグメントにおいて、アミノ酸側鎖の保護が好ましい場合には、当業者に周知の方法で保護することができる。例えば、システインを保護する際には、Ｎ末端のシステインをホルムアルデヒド等で保護し、ペプチド中のＣｙｓ残基側鎖チオール基をＳ−９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ （Ｆｍ−ＳＲ）などを用いて選択的に保護することができる。
（各フラグメントの連結）
上記のような方法で作製された糖鎖付加ペプチドフラグメントとペプチドフラグメントとを連結する工程には、上述するような、２本のペプチドフラグメント鎖を連結できる任意の公知の方法を用いることができ、例えば、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ、特表２００４−５１８６２１等を参照）を挙げることができる。ＮＣＬは、Ｃ末端にチオエステルを有するペプチドフラグメントＡと、Ｎ末端にシステインを有するペプチドフラグメントＢとを緩衝溶液中で混合し、ペプチドフラグメントＢのＮ末端にあるシステインのスルフヒドリル基の求核攻撃により、ペプチドＡのＣ末端のチオエステル基を脱離させ、続くアミンの求核攻撃によって２つのペプチド同士を天然のペプチド結合を介して連結する方法である。
したがって、上述するように、連結工程にＮＣＬを用いる場合には、Ｎ末端側に位置するポリペプチドのＣ末端をチオエステル化する工程が、連結工程に先立って必要となる。かかるチオエステル化は、例えば、Ｃ末端のカルボン酸をＰｙＢＯＰおよびＤＩＰＥＡを用いて活性化させ、過剰のアルキルチオールを加えることで達成することができる。この手法を用いる場合、フラグメント末端のアミノ酸のα炭素の立体配置を抑制するため、アルキルチオールの添加は１０℃〜−８０℃の低温にて行うのが好ましく、０℃〜−４０℃の温度で行うことがより好ましい。特に、上記チオエステル化の反応においては、アルキルチオールの代わりに、チオフェノールを用いることが好ましい。チオフェノールの添加によるチオエステル化反応は、反応速度が速く、反応をほぼ完結させることができる。このため、チオエステル反応中に、ペプチドフラグメントの環化反応の副反応を抑えることができ、好ましい。
また、上記チオエステル化は、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００８， １３０ （２）， ５０１ −５１０に記載のＦｍｏｃ法やＢｏｃ法などによっても行うことができる。
ＮＣＬは、好ましくは当モル量の糖鎖結合部分のポリペプチド鎖と糖鎖非結合部分のポリペプチド鎖とを、緩衝溶液中で混合することにより行う。好ましい態様において、ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８を有する緩衝液中で実行され、好ましいｐＨの範囲は６．５〜７．５である。この緩衝液は、水性、有機性、またはその混合物であってもよい。ライゲーション反応はさらに、１種または２種以上の触媒および／または１種または２種以上の還元剤、脂質、他の変性剤または可溶化剤などを含むことができる。好ましい触媒の例としては、チオールおよびホスフィン含有物質、たとえばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰおよびアルキルホスフィンなどが挙げられる。変性剤および／または可溶化剤の例には、グアニジン、尿素水溶液またはＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰなど有機溶媒溶液、水、またはグアニジンおよび尿素水溶液と混合したアセトニトリルが含まれる。ライゲーション反応の速度は温度により調節することができるが、通常は５〜５５℃、好ましくは１５〜４０℃で行うことができる。特に、ＩＦＮ−βのライゲーション反応は、６〜８Ｍグアニジンの条件で行う事が好ましく、例として、６Ｍグアニジンを含む、ｐＨ６．８〜７．８の緩衝液と、１〜３％チオフェノールとを用いる反応系において良好に進行する。
なお、ライゲーション工程後の生成物と原料との分離が困難な場合には、例えば、反応性の高いＣ末端チオフェニルエステル体を過剰量利用することで、ライゲーションの連結点となったシステインのチオール基を故意にチオエステル化させることができる。このように、ライゲーションにより生成されたペプチド側鎖のチオール基をチオエステル化させることで、生成物の脂溶性または水溶性を高め分離を容易にすることができる。
なお、この操作により過剰にチオエステル化させたチオール基が生成された場合には、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム等を用いて、容易にチオール基へもどすことが可能である。
なお、ＡｌａをＮ末端として各フラグメントを設計した場合には、上記の方法により、Ｎ末端のＡｌａの位置に、代わりにＣｙｓを有する糖鎖付加ポリペプチドが製造される。よって、このような場合には、作製された糖鎖付加ポリペプチド中において、還元が必要なアミノ酸（Ｃｙｓ）を還元反応により、Ａｌａに戻すことが好ましい。
このようなＣｙｓをＡｌａに還元する方法としては、ラジカル還元、ヒドリド還元等の方法を使用することができ、特にラジカル還元が好ましい。
ラジカル還元の反応は、例えば、ペプチドフラグメントを含むＴＣＥＰ等の溶媒中に、ｔＢｕＳＨ、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、または、グルタチオン等を添加することにより行うことができる。ラジカル還元反応に使用される溶媒としては、水、有機溶媒（アセトニトリルなど）、バッファー（リン酸バッファーなど）等を用いることができ、具体的には、例えば、トリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）を挙げることができる。また、溶媒中には可溶化剤を含むことができ、例として、６Ｍ〜８Ｍグアニジンを含む事が好ましい。また、ラジカル還元反応は、ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０の範囲で行うことが好ましく、反応温度は、−１５〜４０℃で行うことが好ましい。ｐＨが７．５より低くなると、反応が完結しないため好ましくない。また、反応時間は、２〜６時間とすることができる。６時間を超えると、ピークの減衰が始まり好ましくない。ラジカル還元反応の例としては、７Ｍグアニジン、０．２５Ｍ ＴＣＥＰを用いて、ｐＨ７．５、２０℃、４時間の条件下で行うことができる。
なお、ラジカル還元反応において、還元されることが好ましくないＣｙｓは、保護基により保護させることができる。このような保護基としては、Ａｃｍ基、アルコキシメチル基、トリフェニルメチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基および、β位が置換されたエチル基等公知の保護基を用いることができる。
また、ラジカル還元反応は、反応溶液を入れるデットボリュームが少なくなるような反応容器を採用することが反応を完結させるために好ましい。
また、上記還元工程の後、Ａｃｍ基等で保護されているＣｙｓがある場合には、Ｃｙｓの脱保護を行う。
脱保護の工程は、例えば、Ｃｙｓの保護基がＡｃｍ基である場合は、水、メタノール、酢酸、またはこれらの混合溶液中において、ヨウ素、酢酸水銀（ＩＩ）、硝酸銀（Ｉ）、または、酢酸銀（Ｉ）等を用いて反応させることにより脱保護することができる。また、保護基がアルコキシメチル基である場合は酸加水分解あるいは銀塩、水銀塩等を用いて脱保護することができる。保護基がトリフェニルメチル基である場合は、水銀（ＩＩ）塩等を用いて脱保護することができる。
上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜２４時間程度である。その他の保護基も、当業者に周知の方法により脱保護することができる。また、反応終了後は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）や塩酸等により処理した後、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
また、ＳｅｒをＮ末端として各フラグメントを設計した場合には、上記の方法により、Ｎ末端のＳｅｒの位置に、代わりにＣｙｓを有する糖鎖付加ポリペプチドが製造される。よって、このような場合には、作製された糖鎖付加ポリペプチド中において、Ｓｅｒへの変換が必要なアミノ酸（Ｃｙｓ）を、ライゲーション後に、Ｓｅｒへと変換する。
このような変換工程としては、例えば、Ｃｙｓ上の−ＳＨ基のメチル化反応、シアン化反応およびそれに続く分子内アシル転位反応により行うことができる。
より具体的には、上記変換工程は、（１）Ｃｙｓを含むペプチドにおいて、Ｃｙｓの−ＳＨ基にメチル化剤を反応させて、−ＳＭｅ基を形成させる（メチル化）工程と、（２）（１）の工程により得られたペプチド上の−ＳＭｅ基とシアン化剤とを反応させ（シアン化反応）、その反応の後、当該ペプチドを塩基性条件下におくことにより、−ＳＭｅ基を反応中間体を経て−ＯＨ基へと変換する（分子内アシル転位反応）工程とを含む。なお、このような変換工程は、例えば国際公開２００９／０１７１５４に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
Ｃｙｓの−ＳＨ基のメチル化反応に用いるメチル化剤としては、−ＳＨ基を−ＳＭｅ基へ変換できるものであれば特に限定されず、例えば、ヨードメタン、メチル−４−ニトロベンゼンスルホネート等を挙げることができる。
メチル化剤の使用量は、原料ペプチドあるいは原料糖ペプチドのシステイン残基１残基に対して、１〜１０００当量とする。好ましくは、１０〜１００当量がよい。さらに好ましくは、１５〜３０当量がよい。メチル化反応は、０〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜１時間程度行うのが良い。
溶媒としては緩衝溶液がよく、そのｐＨは７〜９を示すものがよく、好ましくは８〜９を示すものがよい。例えば、６Ｍグアニジン塩酸液、０．２５Ｍトリス塩酸液、３．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液にて調整したｐＨ８．６の緩衝溶液等を挙げることができる。
また、シアン化剤としては、例えば、安定性等の観点から、臭化シアン、フェニルシアネート等を用いることができ、好ましくは、入手容易な臭化シアンを用いることができる。
シアン化剤の使用量は、−ＳＭｅ基１残基に対して、１〜１０００当量とすることができ、好ましくは、１０〜１００当量、より好ましくは、１５〜３０当量とすることができる。シアン化剤との反応は、０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で、約３０分〜１００時間程度、好ましくは１２時間〜５０時間程度行うことが望ましい。
シアン化剤との反応は、酸性条件下で行い、特に、好ましくはｐＨ２〜３で行う。酸性水容性物質、具体的には、蟻酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸等の使用に依り、反応を酸性条件下で行うことができる。この際、使用する酸性水溶性物質は、硫黄原子の酸化防止のため脱気したものであることが特に好ましい。また、シアン化剤の安定性の観点から、反応は遮光下で行うことが好ましい。
溶媒としては、上記のｐＨ２〜３を示す水溶性溶媒、例えば、８０％蟻酸溶液、７０％蟻酸溶液、２％トリフルオロ酢酸／３９％アセトニトリル含有水溶液等を好適に用いることができる。
なお、ペプチド中にアミノ酸としてメチオニン残基が含まれる場合には、メチオニン残基の−ＳＭｅ基とメチル化反応で得られる−ＳＭｅ基とを区別することが好ましい。この区別は、例えば、保護基の導入により行うことができる。本明細書中において、保護基が導入されたメチオニン（保護メチオニン）としては、シアン化反応におけるシアン化剤と反応しない化合物であれば特に限定されず、例えば、スルホキシド型メチオニン（Ｍｅｔ（Ｏ）：−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ３）を挙げることができる。シアン化反応後または分子内アシル転位反応後に、保護メチオニン残基は、メチオニン残基へと変換させることができる。なお、脱保護の方法は、当業者に周知の方法により適宜行うことができる。
分子内アシル転位反応は、シアン化反応時と比較してより塩基性条件下とすることで行うことができる。これにより、―ＯＨ基を有するアミノ酸残基を含むペプチドが得られる。
分子内アシル転位反応における塩基性条件は、シアン化反応と比較してより塩基性条件であれば酸性又は中性であってもよく、より特定すれば、シアン化反応で得られた反応中間体のエステル結合に隣接するＣ原子上の−ＮＨ２基がプロトン化されない条件であればよい。反応中間体から−ＯＨ基を有するペプチドへの変換を効率よく行うという観点からは、弱塩基性条件又は強塩基性条件を用いることができる。
塩基性条件は、当業者に公知のｐＨ調整剤である塩基性化合物（グアニジン、燐酸二ナトリウム、トリス、炭酸水素ナトリウム、ヒドラジン含水物、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液等）を添加することにより行うことができる。このとき、塩基性化合物の使用量は、原料ペプチドに対して、０．５〜１０００当量とすることができ、好ましくは、１０〜１００当量、より好ましくは、１５〜３０当量とすることができる。
分子内アシル転位は、０〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃で、約５分〜３０時間程度、好ましくは５分〜１時間、より好ましくは５分〜１０分程度行うことが望ましい。
反応の終了は、ｐＨを下げることにより行うことができる。または、そのままｐＨを変化させずに、ＨＰＬＣ等による精製工程に移ることも可能である。
なお、ＴｈｒをペプチドフラグメントのＮ末端として選択した場合には、Ｃｙｓの代わりに、−ＳＨ基を有するトレオニン（Ｔｈｒ）誘導体（または、当該―ＳＨ基がジスルフィド結合等により保護されたトレオニン誘導体）残基をペプチドフラグメントのＮ末端に導入することができる。トレオニン誘導体が導入されたペプチドフラグメントは、ライゲーション後に、上記メチル化反応、シアン化反応、および分子内アシル転位反応に供することにより、当該ペプチドフラグメント中のトレオニン誘導体をトレオニンへと置換することができる。
なお、シアル酸を有する糖鎖をペプチドフラグメントへ導入する際には、導入する糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基が、ベンジル（Ｂｎ）基等を含むアリール基、エチル基（Ｅｔ）やメチル基（Ｍｅ）等を含むアルキル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基、アルコキシ基又はニトロ基等により環構造を形成する炭素の側鎖が置換されたフェナシル基等により保護されたシアル酸含有糖鎖を用いることが好ましい。より具体的には、例えば、シアル酸のカルボキシ基を、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ（Ｐh）２、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２で表わされるように保護する保護基が好ましい。このように、シアル酸のカルボキシ基をベンジル基等で保護することにより、酸に不安定なシアル酸の脱離を防ぐことが可能である。特に、後述する加熱処理をする場合にも、シアル酸の糖鎖非還元末端からの脱離を防ぐことが可能となる。また、シアル酸のカルボキシ基への保護基の導入は、製造工程におけるＨＰＬＣ等による分離・精製工程が容易となる。
糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基の保護反応は、当業者に周知の方法により行うことができる。例えばベンジル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基により保護されたシアル酸のカルボキシ基の保護基の脱保護も、当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、脱保護の反応は、以下に限定されないが、塩基性条件下で加水分解することによって行うことができる。脱保護の反応は、通常０〜５０℃、好ましくは、０〜４０℃、更に好ましくは０〜３０℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜５時間程度である。反応終了後は、リン酸や酢酸などの弱酸によって中和した後、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。なお、シアル酸のカルボキシ基の保護基を脱保護する工程は、フォールディング工程の前または、フォールディング工程の後に行うことができる。
なお、上記で示したインターフェロンβの製造における各工程は、１ポット合成とすることができる。例えば、複数のフラグメントを作成し、複数回のライゲーション工程によりインターフェロンβを製造する場合には、複数のライゲーション工程を１ポット合成とすることができる。さらに、フラグメント連結後に、システインの還元工程が必要な場合には、複数のライゲーション工程に加えて、その後のシステインの還元工程も１ポット合成とすることができる。
さらに、ライゲーション工程（必要な場合には、システインの還元工程等）の後に必要な、システインの脱保護工程と糖鎖のシアル酸の脱保護工程も１ポット合成とすることができる。例えば、本願明細書中の実施例２および３に記載の第１工程のライゲーションと第２工程のライゲーションとを１ポット化することにより、収率を約１．６倍向上させることが可能である。
このように、製造工程を１ポット化することにより、ＨＰＬＣ工程の削減による製造工程時間の短縮及び簡便化を図ることができ、さらには収率を向上させることができ、好ましい。
（フォールディング工程）
上記の方法により糖鎖付加ペプチドフラグメントとペプチドフラグメントとが結合され、必要なアミノ酸の置換の工程や、脱保護工程の後に、全ての部分が連結された糖鎖付加ポリペプチドをフォールディングさせる工程を含むことができる。フォールディング工程は、種々の公知の手法を用いることができるが、限定されることなく、例えば、フォールディングバッファー中での透析を含むことができる。フォールディングバッファーは、限定されることなく、例えば、グルタチオン、シスチンーシステイン、グアニジンなどのグアニジン基を有する化合物またはその塩を含み、ｐＨは６．０〜９．０とすることができる。透析は、複数回行うことができ、また、各透析処理のフォールディングバッファーの組成やｐＨは同一であっても異なっていてもよい。
より具体的には、例えば３回の透析によりフォールディング工程を行う場合には、１回目の透析を、８Ｍグアニジンを含むｐＨ８．０〜９．０の溶液中で０．５〜６時間行い、２回目の透析条件を２Ｍ〜４Ｍグアニジンを含むｐＨ８．０〜９．０の溶液中で６〜２４時間行い、３回目の透析を１ｍＭ〜２０ｍＭ酢酸水溶液を含むｐＨ２．０〜４．０の溶液中で６〜２４時間行うことができる。
また、フォールディング工程に用いるフォールディングバッファー中に酸化型および還元型のグルタチオンを含む場合には、酸化型および還元型の濃度の比を、ポリペプチドに付加している糖鎖の種類によって適宜変更することが好ましい。例えば、糖鎖がジシアロ糖鎖である場合には、フォールディングバッファー中に含まれるグルタチオン酸化型とグルタチオン還元型の比を、１：１〜４：１の範囲内とすることが好ましく、１：１〜３：１とすることがより好ましく、特に２：１とすることが好ましい。また、糖鎖がアシアロ糖鎖である場合には、グルタチオン酸化型とグルタチオン還元型の比を、４：１〜１６：１の範囲内とすることが好ましく、６：１〜１０：１の範囲内とすることがより好ましく、特に８：１とすることが好ましい。
なお、フォールディング前の原料を溶解する際に原料を低濃度にすることで、ジスルフィド結合の意図しない部位での形成や、アグリゲーション等を抑制することができる。
ポリペプチドがフォールディングしたことは、ポリペプチドの立体構造を解析する任意の手法で確認することができ、これには、限定されることなく、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、Ｘ線解析などが含まれる。
（加熱処理）
また、上記の方法により製造される糖鎖付加ポリペプチドは、加熱処理をすることもできる。加熱処理は、フォールディング工程の前に行うことが好ましい。また、糖鎖ポリペプチド中において糖鎖の非還元末端にシアル酸を有する場合には、シアル酸のカルボキシ基がベンジル基等で保護されている状態で加熱処理することが好ましい。
加熱処理は、例えば、６Ｍ〜１０Ｍのグアニジン（Ｇｎ）を含むｐＨ３．５〜７のバッファー溶液中において、４０℃〜６０℃の温度条件で、約２４〜７２時間行うことができる。加熱処理を行うことで、コンタミネーションのおそれのあるＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等のエンベロープウイルスの不活化をすることができる。そして、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、加熱処理を加えた場合であっても、そのインターフェロンβ活性を維持することができる。
また、システインのチオール基は、加熱処理により副反応を生じる可能性が高いため、加熱処理工程においては、システインのチオール基を、Ａｃｍ基等で保護しておくことが好ましい。
（活性）
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、インターフェロンβ活性を有している。本明細書において、「インターフェロンβ活性」とは、免疫調整作用、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性等公知の活性のうち少なくとも１つの活性を有することを意味する。
例えば、糖鎖付加ポリペプチドのインターフェロンβ活性は、実施例１２に記載の抗腫瘍活性測定試験などを用いて測定することができる。
抗腫瘍活性の測定試験は、例えば、腫瘍を有するマウスに、対象となる糖鎖付加ポリペプチドを皮下投与し、経時的な腫瘍体積の測定により調べることができる。
なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、９０％以上の純度を有するものとして提供することができる。また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、より好ましくは、９５％、９７％、９８％、９９．０％、９９．５％以上の純度を有している。
本明細書において、糖鎖付加ポリペプチドの純度とは、目的とする糖鎖付加ポリペプチド作製時の全収量（ｇ）から未反応物等の不純物を除いた収量（ｇ）を、糖鎖付加ポリペプチドの作製時の全収量で割った値に１００をかけた値をいう。なお、糖鎖付加ポリペプチド作製時の全収量とは、より具体的には、フォールディング工程の後に続く、ＨＰＬＣによる生成物の分離工程で得られた目的とする糖鎖付加ポリペプチド分画の収量をいう。また、不純物等には、糖鎖構造が同一でない糖鎖付加ポリペプチドも含まれる。
なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物とする場合において、糖鎖付加ポリペプチドの純度とは、組成物に含まれる他の成分とは区別して、組成物中に１成分として含まれる糖鎖付加ポリペプチド自体の純度をいう。
このように、高純度の糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。
また、糖鎖付加ポリぺプチドの純度は、ＨＰＬＣ分析により測定することができる。ＨＰＬＣにより測定される糖鎖付加ポリペプチドの純度は、ＨＰＬＣエリア面積％で示すことができる。
（医薬組成物）
次に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防に有効である。上述の通り、インターフェロンβには種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、インターフェロンβに関連する疾患には、例えば、膠芽腫、髄芽腫、および、星細胞腫等の脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、ならびに、多発性硬化症等が含まれる。本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、上記疾患の治療または予防に有効である。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物の投与対象は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。
上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、注射剤等が挙げられる。
医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ポリペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ポリペプチドを１〜９０重量％含有させるのが好ましく、１〜７０重量％含有させるのがより好ましい。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、糖鎖付加ポリペプチドを薬学的に許容可能な塩として含むこともできるし、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有することもできる。また、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、医薬組成物に含有させることのできるその他の成分としては、当業者に周知の薬学的に許容される担体等を挙げることができる。
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、またはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。点眼剤の場合は、結膜嚢などの眼組織に適用する。吸入剤の場合には、気管支または肺に適用する。
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ポリペプチドが０．００１〜９ｎｍｏｌ、好ましくは０．０１〜０．２ｎｍｏｌとなる投与量とすることができる。
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ポリペプチドおよび該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
さらに、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
本発明はまた、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防方法も提供する。
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
下記の実施例においては、インターフェロンβのアミノ酸配列における１−１６６個のアミノ酸を、１位−６７位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＡ、６８位−８８位までのアミノ酸を有する糖ペプチドフラグメントＢ、８９位−１６６位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＣの３つのフラグメントに分けて製造する方法を例示する。
より具体的には、下記の工程を含む製造方法を例示する：
（Ｉ）下記式（ｄ）で表わされるペプチドフラグメントＡ、下記式（ｅ）で表わされる糖ペプチドフラグメントＢ、および、下記式（ｆ）で表わされるペプチドフラグメントＣを作製する工程。
（ｄ）
（ｅ）
（ｆ）
（ＩＩ）フラグメントＢとフラグメントＣとをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ｂ＋Ｃ）を作成し、フラグメント（Ｂ＋Ｃ）のＮ末端のチアゾリジン型のシステインをシステインに変換する工程（図１参照）。
（ＩＩＩ）フラグメントＡとフラグメント（Ｂ＋Ｃ）とをライゲーションにより連結させてフラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を作成する工程（図２参照）、
（ＩＶ）フラグメント（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）において、ライゲーションに用いたシステインをアラニンへ還元する工程（図３参照）。
（ＩＶ）システインの保護基を脱保護する工程（図４参照）
なお、各フラグメントにおいて、ライゲーションによる連結に使用するＣ末端はチオエステル化されており、ライゲーションによる連結に使用するＮ末端はシステインを有する。また、上記式（ＩＩ）で表わされる糖ペプチドフラグメントＢは、Ｃ末端側におけるライゲーション工程において、副反応を避けるために、Ｎ末端側のシステインをチアゾリジン型にしている。
上記フラグメントＢおよびフラグメントＣのＮ末端のアミノ酸は、インターフェロンβにおける６８位および８９位のアラニンとなる。しかしながら、ライゲーションにシステインが要求されるため、上記製造例においては、フラグメントＢおよびフラグメントＣのＮ末端のアミノ酸を、アラニンの代わりにシステインとして合成し、ライゲーション後に、アラニンへと還元した。
また、本明細書において、例えば、フラグメント（Ａ＋Ｂ）とは、フラグメントＡとフラグメントＢとが、連結したものを示す。
実施例１ 各ペプチドフラグメントの合成
（１−１． ペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈの合成）
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｂｏｃ−Ｍｅｔを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＰｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−ＢｏｃＮＨの６７残基ペプチド（１）（配列番号２）を得た。
上記で得られたペプチド（１）をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂とペプチド１とを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸の側鎖が保護されたペプチド（１）（配列番号３）：Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−ＢｏｃＮＨを得た。
６７残基のアミノ酸を有し、アミノ酸側鎖が保護されたペプチド（１）１００μｍｏｌ相当を、ナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（３０８μｌ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２６０．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（８５．０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離を行い溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ グラジエント Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオフェニルエステルであるペプチドフラグメントＡ−ＳＰｈ（１）（配列番号４）：Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＳＰｈを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３７８Ｈ５８１Ｎ９７Ｏ１０６Ｓ６： ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ２０９４．１６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ １６７５．５３、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ １３９６．４４， ｆｏｕｎｄ．２０９４．０６、１６７５．４３、１３９６．１７
（１−２． ジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ−ＳＰｈの合成）
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）を順次用い、固相樹脂上にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）の８残基ペプチドを得た。この８残基ペプチドに対して、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にジベンジルジシアロ糖鎖アスパラギン（ｇ）（５４７．８ｍｇ，２００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（５９．９ｍｇ，２００μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１：１混合溶液、３．３３ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ（５２．３μｌ，３００μｍｏＬ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＦｍｏｃＮＨの９残基糖鎖ペプチド（配列番号５）が得られた。
（ｇ）
その後の糖ペプチド鎖の伸長は、上記で得られた固相樹脂上の９残基糖鎖ペプチドの脂溶性保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した後、以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７３．１μｌ，０．４７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．３ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸として，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｂｏｃ−Ｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮの２１残基の糖鎖付加ペプチドフラグメント（２）（配列番号６）を得た。
その後、ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂と糖鎖付加ペプチドフラグメントとを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸側鎖が保護された２１残基の糖鎖ペプチド（２）（配列番号７）：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮを得た。
２１残基のアミノ酸を有し、アミノ酸側鎖が保護された糖鎖付加ペプチドフラグメント（２）の１００μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（３０８μｌ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２６０．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（８５．０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離を行い溶液部分を除くことで目的とする糖鎖付加ペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→５２：４８（２６分）→５：９５（２８分）、ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオフェニルエステルであるジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ−ＳＰｈ（２）（配列番号８）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ―Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＳＰｈを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２０９Ｈ３１４Ｎ３４Ｏ９６Ｓ２： ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １６３５．３４，［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １２２６．７６， ｆｏｕｎｄ．１６３５．０４，１２２６．５１
（１−３． アシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ−ＳＰｈの合成）
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）を順次用いて固相樹脂上に連結した。その結果、固相樹脂上にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）の８残基のペプチドフラグメント（配列番号９）を得た。この８残基のペプチドフラグメントに対して、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にアシアロ糖鎖アスパラギン誘導体（ｈ）（５４７．８ｍｇ，２００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（５９．９ｍｇ，２００μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１：１混合溶液、３．３３ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ（５２．３μｌ，３００μｍｏＬ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＦｍｏｃＮＨの９残基の糖鎖付加ペプチドフラグメント（配列番号１０）が得られた。
（ｈ）
その後の糖ペプチド鎖の伸長は、上記で得られた固相樹脂上の９残基糖鎖ペプチドの脂溶性保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した後、以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７３．１μｌ，０．４７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．３ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｂｏｃ−Ｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄを順次用いて固相樹脂上に連結させた。その結果、固相樹脂にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮの２１残基のアミノ酸側鎖が保護された糖鎖付加ペプチドフラグメント（３）（配列番号１１）を得た。
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂と糖鎖付加ペプチドフラグメント（３）とを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸側鎖が保護された糖鎖付加ペプチドフラグメント（３）（配列番号１２）：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮを得た。
２１残基のアミノ酸側鎖が保護された糖鎖付加ペプチドフラグメント（３）の１００μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（３０８μｌ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２６０．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（８５．０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離を行い溶液部分を除くことで目的とする糖鎖付加ペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、 溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→ ５２：４８（２６分）→５：９５（２８分）、ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオフェニルエステルであるアシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ−ＳＰｈ（３）（配列番号１３）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ―Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ（Ａｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＳＰｈを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１７３Ｈ２６８Ｎ３２Ｏ８０Ｓ２： ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １３８１．０９，［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０３６．０７， ｆｏｕｎｄ．１３８０．９０，１０３５．９２
（１−４． ペプチドフラグメントＣの合成）
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸として，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を順次用いて固相樹脂上に連結させた。その結果、固相樹脂にＡｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＢｏｃＮＨの７８残基のペプチドフラグメント（４）（配列番号１４）を得た。
上記で得られたペプチドフラグメント（４）をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌して、樹脂とペプチドフラグメント（４）とを切り離した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離操作を行い、目的とするペプチドフラグメント（４）を含む沈殿物と溶液部分とを分けた。その後、溶液部分を除去した後、目的物をＨＰＬＣで確認した後、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→６５：３５（５分）→３０：７０（３５分）→５：９５（４５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、目的とするペプチドフラグメントＣ（４）（配列番号１５）：Ｈ２Ｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４４１Ｈ６８８Ｎ１２４Ｏ１１４Ｓ３： ［Ｍ＋８Ｈ］８＋ １２０６．８９，［Ｍ＋９Ｈ］９＋ １０７２．９０，［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ９６５．７１，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ ８０４．９３， ｆｏｕｎｄ．１２０６．８５，１０７２．８７，９６５．５８，８７７．９０，８０４．９０
実施例２ アシアロＩＦＮ−βの合成
アシアロ糖鎖を有する活性ＩＦＮ−βは以下に示す全５工程で合成を行った。
（２−１． 第１工程 アシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢとペプチドフラグメントＣの連結）
２１残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のアシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ（３）（１．８ｍｇ）と７８残基のペプチドフラグメントＣ（４）（２．５ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．２６ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（７．８μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン溶液（０．３９ｍｌ）（０．２Ｍメトキシアミン溶液に２０ｍＭＴＣＥＰ溶液を加え調製）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、糖ペプチドフラグメントを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→６５：３５（５分）→３０：７０（３５分）→５：９５（４５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするインターフェロンβの８０位に相当する位置にアシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（１１）（配列番号１６）を得た（図５および図６）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６０７Ｈ９５０Ｎ１５６Ｏ１９４Ｓ４： ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ １３６７．５２，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ １２４３．２９，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ １１３９．７７，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ １０５２．１７，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ ９７７．０９，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ ９１２．０２，［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ ８５５．０８，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ ８０４．８４，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ ７６０．１８，ｆｏｕｎｄ．１３６７．６４，１２４３．３３，１１３９．８０，１０５２．２０，９７７．１０，９１２．０３，８５５．０９，８０４．８４，７６０．１８
（２−２． 第２工程 ペプチドフラグメントＡとアシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ）との連結）
上記第１工程で得られた、６７残基のＣ末端がチオフェニルエステルペプチド（１）（２．３ｍｇ）とインターフェロンβの８０位に相当する位置にアシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（１１）（アシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ））（６８−１６６）（１．９ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．１４ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（４．２μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（１．１ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（１２）（配列番号１７）を得た（図７および図８）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９７９Ｈ１５２５Ｎ２５３Ｏ３００Ｓ９： ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １２９０．８６，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２１９．２０，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１５５．０９，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １０９７．３８，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０４５．１８，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ ９９７．７１，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９５４．３８，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９１４．６５，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８７８．１１，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８４４．３７，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８１３．１４，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ７８４．１３，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７５７．１３，ｆｏｕｎｄ．１２１９．２１、１１５５．１１、１０９７．４３、１０４５．２３、９９７．７１、９５４．４３、９１４．６７、８７８．１１、８４４．３７、８１３．１７、７８４．１３、７５７．１６
（２−３． 第３工程 ＣｙｓのＡｌａへの還元）
上記第２工程で得られた、６８、８９位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（１２）（１．０ｍｇ）をナスフラスコに入れ、ｐＨ７．５のバッファー溶液（０．１０ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、ｐＨ７．５の０．５Ｍトリスエチルカルボキシホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）（０．１０ｍｌ）（ＴＥＣＰ，６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、トリエチルアミンにて調製）、ｔＢｕＳＨ（４．２μｌ）、０．１ＭＶＡ−０４４溶液（４．２μｌ）（ＶＡ−０４４を水に溶解させ調製）を加え、室温にて反応させた。４時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてｔＢｕＳＨを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９位ＣｙｓがＡｌａに変換され、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（１３）（配列番号１８）を得た（図９および図１０）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９７９Ｈ１５２５Ｎ２５３Ｏ３００Ｓ７： ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １２８７．０９，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２１５．６４，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１５１．７１，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １０９４．１８，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０４２．１２，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ ９９４．８０，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９５１．５９，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９１１．９８，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８７５．５４，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８４１．９１，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８１０．７６，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ７８１．８４，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７５４．９２，ｆｏｕｎｄ．１２８７．０５、１２１５．７１、１１５１．７６、１０９４．２３、１０４２．１７、９９４．８８、９５１．６４、９１１．９９、８７５．６１、８４１．９５、８１０．７７、７８１．８５、７５４．９４
（２−４． 第４工程 Ａｃｍ基の脱保護）
上記第３工程で得られた、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（１３）（０．３ｍｇ）をエッペンドルフチューブに入れ、９０％酢酸水溶液（０．０３ｍｌ）に溶解させた後、酢酸銀（０．１０ｍｇ）を加え、室温にて遮光させながら反応させた。３．５時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液にジチオスレイトール（１．０ｍｇ）を加え、室温で５分間撹拌したのち、遠心分離を行い、沈殿物を除く上澄み液を回収した。その回収した上澄み液をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→５０：５０（５分）→２０：８０（３５分）→５：９５（３５．５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、１７位、３１位、および、１４１位のシステインのＡｃｍ基が脱保護された、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチド（１４）（配列番号１９）を得た（図１１および図１２）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９７０Ｈ１５１０Ｎ２５０Ｏ２９７Ｓ７： ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １２７４．５５，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２０３．８０，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１４０．４９，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １０８３．５２，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０３１．９７，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ ９８５．１１，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９４２．３２，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９０３．１０，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８６７．０１，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８３３．７０，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８０２．８６，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ７７４．２３，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７４７．５６，ｆｏｕｎｄ．１２７４．６２、１２０３．８２、１１４０．５３、１０８３．５５、１０３２．０１、９８５．１５、９４２．３８、９０３．１２、８６７．０５、８３３．７２、８０２．９１、７７４．２９、７４７．５５
（２−５． 第５工程 フォールディング工程）
上記第４工程で得られた、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチド（１４）（０．３２ｍｇ）を遠沈管に入れ、ｐＨ８．５のバッファー溶液（３．５ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液にて調製）に溶解させた後、室温にて静置させた。１時間後、この溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ、ＭＷＣＯ；８０００）に移し替えた。この透析膜を透析外液Ａ（３Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液、８ｍＭ還元型グルタチオン溶液、１ｍＭグルタチオン溶液にて調製）に入れ、４℃にて透析を行った。１２時間後、この透析膜を透析外液Ｂ（１Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液にて調製）に入れ直し、４℃にて透析を行った。１２時間後、この透析膜を透析外液Ｃ（１０ｍＭ酢酸溶液）に入れ直し、４℃にて透析を行った。２４時間後、この透析膜を透析外液から取り出し、透析膜内液を遠沈管に移し替えた。透析膜内液をＨＰＬＣにて分析したところ、主要ピークの溶出時間は段階透析操作開始時間の１７．４分から段階透析操作終了後には１１．６分に短縮しており、このピークをＥＳＩ−ＭＳ測定したところ、段階透析操作開始前分子量から２Ｄａ減少した分子量が確認できた。そこで、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→５０：５０（５分）→２０：８０（３５分）→５：９５（３５．５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し糖鎖付加ポリペプチド（１５）（配列番号２０）を得た（図１３および図１４）。また、この分取液をＨＰＬＣにて純度の確認したところ、９９．００％（ＨＰＬＣエリア面積％）の純度を有していた（図１５）。その後、得られた糖鎖付加ポリペプチド（１５）の凍結乾燥を行った。この凍結乾燥品物に対して、１０ｍＭ酢酸水溶液にて再溶解させたのち、分光光度計（紫外吸収法）を用いて糖タンパク質定量を行い、濃度規定を行いＩｎ ｖｉｔｒｏ活性用サンプルとした。またＩｎ ｖｉｖｏ活性用サンプルとしては糖鎖付加ポリペプチド（１５）を含む、糖タンパク質濃度が規定された１０ｍＭ酢酸水溶液を、製剤化用として別途用意したバッファー（人血清アルブミン（３０ｍｇ）、塩化ナトリウム（２４．４ｍｇ）、リン酸水素ナトリウム水和物（７．５３ｍｇ）、結晶リン酸二水素ナトリウム（１．４１ｍｇ）にて調製）に溶解させ、再度、凍結乾燥した後、日局注射用水を用いて溶解させ調製した。
段階透析後ＨＰＬＣ精製後ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９７０Ｈ１５０８Ｎ２５０Ｏ２９７Ｓ７： ［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ２４０６．３７、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ２１６５．８３，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ １９６９．０３，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ １８０５．０３，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ １６６６．２５，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ １５４７．３１，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ １４４４．２２，［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ １３５４．０２，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １２７４．４３，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２０３．６８，ｆｏｕｎｄ．２４０６．２１、２１６５．６８、１９６８．８５、１８０４．８５、１６６６．０９、１５４７．１６、１４４４．０５、１３５３．９３、１２７４．３９、１２０３．６３
実施例３． ジシアロＩＦＮ−βの合成
ジシアロ糖鎖を有する活性ＩＦＮ−βは以下に示す全６工程で合成を行った。
（３−１． 第１工程 ジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢとペプチドフラグメントＣとの連結）
２１残基のＣ末端がチオフェニルエステル体であるジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ（２）（２．２ｍｇ）と７８残基のペプチドフラグメントＣ（４）（２．５ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．３のバッファー溶液（０．２１ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（６．２μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン溶液（０．３１ｍｌ）（０．２Ｍメトキシアミン溶液に２０ｍＭＴＣＥＰ溶液を加え調製）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、糖ペプチドフラグメントを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするインターフェロンβの８０位に相当する位置にジベンジルジシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ）（５）（配列番号２１）を得た（図１６および図１７）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６４３Ｈ９９６Ｎ１５８Ｏ２１０Ｓ４： ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ １４４３．１０，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ １３１２．６３，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ １２０３．３３，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ １１１０．８４，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ １０３１．５７，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ ９６２．８７，［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ ９０２．７５，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ ８４９．７０，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ ８０２．５５，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ ７６０．３７，ｆｏｕｎｄ．１４４３．７８，１３１２．６６，１２０３．３６，１１１０．８４，１０３１．５８，９６２．８６，９０２．７６，８４９．７０，８０２．５５，７６０．３６
（３−２． 第２工程 ペプチドフラグメントＡとジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ）との連結）
６７残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のペプチドフラグメントＡ（１）（２．９ｍｇ）と上記第１工程で得られた、インターフェロンβの８０位に相当する位置にジベンジルジシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（ジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ））（５）（３．３ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．２２ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（７．０μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（２．０ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（６）（配列番号２２）を得た（図１８および図１９）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０１５Ｈ１５７１Ｎ２５５Ｏ３１６Ｓ９： ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ １４１９．１５，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １３３５．７３，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２６１．５８，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１９５．２３，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １１３５．５２，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０８１．５０，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ １０３２．３８，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９８７．５４，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９４６．４４，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ９０８．６２，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８７３．７１，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８４１．３９，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ８１１．３７，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７８３．４３，［Ｍ＋３０Ｈ］３０＋ ７５７．３５，ｆｏｕｎｄ．１４１９．１２，１３３５．７３，１２６１．５５，１１９５．２１，１１３５．４８，１０８１．４９，１０３２．３５，９８７．５１，９４６．４２，９０８．６１，８７３．７０，８４１．３９，８１１．３６，７８３．４２，７５７．３６
（３−３．第３工程 ＣｙｓのＡｌａへの還元）
上記第２工程で得られた、６８、８９位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（６）（４．０ｍｇ）をナスフラスコに入れ、ｐＨ７．５のバッファー溶液（０．２８ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、ｐＨ７．５の０．５Ｍトリスエチルカルボキシホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）（０．２８ｍｌ）（ＴＥＣＰ，６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、トリエチルアミンにて調製）、ｔＢｕＳＨ（２８μｌ）、０．１ＭＶＡ−０４４溶液（２８μｌ）（ＶＡ−０４４を水に溶解させ調製）を加え、室温にて反応させた。４時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてｔＢｕＳＨを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９位ＣｙｓがＡｌａに変換され、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（７）（配列番号２３）を得た（図２０および図２１）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０１５Ｈ１５７１Ｎ２５５Ｏ３１６Ｓ７： ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２５８．０２，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１９１．８６，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １１３２．３２，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０７８．４４，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ １０２９．４７，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９８４．７５，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９４３．７６，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ９０６．０５，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８７１．２４，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８３９．０１，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ８０９．０８，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７８１．２２，ｆｏｕｎｄ．１２５８．０２，１１９１．８６，１１３２．３１，１０７８．３９，１０２９．４３，９８４．７３，９４３．７６，９０６．０４，８７１．２５，８３９．０１，８０９．０６，７８１．１７
（３−４． 第４工程 Ａｃｍ基の脱保護）
上記第３工程で得られた、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（７）（２．９ｍｇ）をエッペンドルフチューブに入れ、９０％酢酸水溶液（０．１３ｍｌ）に溶解させた後、酢酸銀（０．４３ｍｇ）を加え、室温にて遮光させながら反応させた。３．５時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液にジチオスレイトール（３．０ｍｇ）を加え、室温で５分間撹拌したのち、遠心分離を行い、沈殿物を除く上澄み液を回収した。その回収した上澄み液をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→５０：５０（５分）→２０：８０（３５分）→５：９５（３５．５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、１７位、３１位、１４１位のＡｃｍ基が脱保護された、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（８）（配列番号２４）を得た（図２２および図２３）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１００６Ｈ１５５６Ｎ２５２Ｏ３１３Ｓ７： ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２４６．１７，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１８０．６４，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １１２１．６５，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０６８．２９，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ １０１９．７８，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９７５．４８，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９３４．８８，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８９７．５２，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８６３．０４，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８３１．１１，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ８０１．４７，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７７３．８６，ｆｏｕｎｄ．１２４６．１６，１１８０．６０，１１２１．６２，１０６８．２７，１０１９．７４，９７５．４４，９３４．８５，８９７．４９，８６３．００，８３１．０８，８０１．４５，７７３．８１
（３−５． 第５工程 ベンジル基の脱保護）
上記第４工程で得られた、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（８）（１．９ｍｇ）をナスフラスコに入れ、８Ｍグアニジン溶液（０．１７ｍｌ）（グアニジン塩酸塩、２０ｍＭＴＣＥＰにて調製）に溶解させた後、室温にて撹拌した。氷水にて冷却した後、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（０．８５ｍｌ）をゆっくり加えた。氷水にて２０分間反応させた後、バッファー（２．１ｍｌ）（８Ｍグアニジン溶液、０．２Ｍ酢酸ナトリウム水溶液にて調製）を用いて中和した。反応はＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をそのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→５０：５０（５分）→２０：８０（３５分）→５：９５（３５．５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、８０位Ａｓｎにジシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（９）（配列番号２５）を得た（図２４および図２５）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９９２Ｈ１５４４Ｎ２５２Ｏ３１３Ｓ７： ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １３０８．８１，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２３６．１６，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１７１．１５，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １１１２．６４，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０５９．７１，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ １０１１．５８，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９６７．６４，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９２７．３７，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８９０．３１，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８５６．１１，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８２４．４４，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ７９５．０３，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７６７．６５，［Ｍ＋３０Ｈ］３０＋ ７４２．０９，ｆｏｕｎｄ．１３０８．８０，１２３６．１７，１１７１．１２，１１１２．６３，１０５９．６７，１０１１．５６，９６７．６３，９２７．３４，８９０．２９，８５６．０９，８２４．４２，７９５．０１，７６７．６３，７４２．０８
（３−６． 第６工程 フォールディング工程）
上記第５工程により得られた、８０位Ａｓｎにジシアロ糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチド（９）（１．３ｍｇ）を遠沈管に入れ、ｐＨ８．５のバッファー溶液（１３ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液にて調製）に溶解させた後、室温にて静置させた。１時間後、この溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ、ＭＷＣＯ；８０００）に移し替えた。この透析膜を透析外液Ａ（３Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液、２ｍＭ還元型グルタチオン溶液、１ｍＭグルタチオン溶液にて調製）に入れ、４℃にて透析を行った。１２時間後、この透析膜を透析外液Ｂ（１Ｍグアニジン塩酸液、０．１ｍＭトリス溶液にて調製）に入れ直し、４℃にて透析を行った。１２時間後、この透析膜を透析外液Ｃ（１０ｍＭ酢酸溶液）に入れ直し、４℃にて透析を行った。２４時間後、この透析膜を透析外液から取り出し、透析膜内液を遠沈管に移し替えた。透析膜内液をＨＰＬＣにて分析したところ、主要ピークの溶出時間は段階透析操作開始時間の２８．０分から段階透析操作終了後には２６．１分に短縮しており、このピークをＥＳＩ−ＭＳ測定したところ、段階透析操作開始前分子量から２Ｄａ減少した分子量が確認できた。そこで、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝４６：５４→４６：５４（５分）→３４．５：６５．５（２８分）→５：９５（２８．５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、糖鎖付加ポリペプチド（１０）（配列番号２６）を得た（図２６および図２７）。また、この分取液をＨＰＬＣにて純度の確認したところ、９９．３６％（ＨＰＬＣエリア面積％）の純度を有していた（図２８）。その後、得られた糖鎖付加ポリペプチド（１０）の凍結乾燥を行った。この凍結乾燥品物に対して、１０ｍＭ酢酸水溶液にて再溶解させたのち、分光光度計（紫外吸収法）を用いて糖タンパク質定量を行い、濃度規定を行いＩｎ ｖｉｔｒｏ活性用サンプルとした。
またＩｎ ｖｉｖｏ活性用サンプルとしては糖鎖付加ポリペプチド１０を含む、糖タンパク質濃度が規定された１０ｍＭ酢酸水溶液を、製剤化用として別途用意したバッファー（人血清アルブミン（３０ｍｇ）、塩化ナトリウム（２４．４ｍｇ）、リン酸水素ナトリウム水和物（７．５３ｍｇ）、結晶リン酸二水素ナトリウム（１．４１ｍｇ）にて調製）に溶解させ、再度、凍結乾燥した後、日局注射用水を用いて溶解させ調製した。
段階透析後ＨＰＬＣ精製後ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９９２Ｈ１５４２Ｎ２５２Ｏ３１３Ｓ７： ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ２２２４．０８，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ ２０２１．９８，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ １８５３．５７，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ １７１１．０６，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ １５８８．９２，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ １４８３．０５，［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ １３９０．４３，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １３０８．６９，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２３６．０５，ｆｏｕｎｄ．２２２３．８８，２０２１．８０，１８５３．４３，１７１０．９１，１５８８．７７，１４８２．９２，１３９０．３５，１３０８．６１，１２３６．０１
上記実施例２および３では、インターフェロンβのアミノ酸配列を３つのフラグメントに分けて製造したが、下記実施例４〜６では、インターフェロンβのアミノ酸配列を４つのフラグメントに分けて製造した例を示す。
なお、実施例４〜６においては、インターフェロンβにおける８９位−１６６位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＣを、８９−１３４位のフラグメントＣ１と、１３４位のＡｌａをＮ末端に有する１３５−１６６位のフラグメントＣ２とにさらに分けて、計４つのペプチドフラグメントから糖鎖付加ポリペプチドを製造する。
実施例４． ペプチドフラグメント（Ｃ１＋Ｃ２）の合成
（４−１． ペプチドフラグメントＣ１−ＳＰｈの合成）
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｂｏｃ基で保護したアミノ酸にはＢｏｃ−Ｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄを順次用いて固相樹脂上に連結させた。その結果、固相樹脂にＬｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮの４６残基のペプチドフラグメント（１６）（配列番号２７）を得た。
上記で得られたペプチドフラグメント（１６）を有する固相樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂とペプチドフラグメント（１６）とを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸側鎖が保護されたペプチドフラグメント（１６）（配列番号２８）：Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮを得た。
４６残基の保護ペプチドフラグメント（１６）の１００μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（３０８μｌ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２６０．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（８５．０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離を行い，溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→６５：３５（５分）→３０：７０（３５分）→５：９５（４５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオフェニルエステルであるペプチドフラグメントＣ１−ＳＰｈ（１６）（配列番号２９）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＳＰｈを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２６３Ｈ４１２Ｎ７２Ｏ６７Ｓ３： ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １４３８．６８，［Ｍ＋５Ｈ］５＋ １１５１．１４，［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ９５９．４５，［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ８２２．５３，［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ７１９．８４， ｆｏｕｎｄ．１４３８．５１，１１５１．００，９５９．３４，８２２．４３，７１９．７４
（４−２． ペプチドフラグメントＣ２の合成）
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（１００μｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンを得、固相合成の固相として用いた。
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基で保護したアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ），Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を順次用いて固相樹脂上に連結した。その結果、固相樹脂にＡｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＢｏｃＮＨの３２残基のペプチドフラグメント（１７）（配列番号３０）を得た。
上記で得られたペプチドフラグメント（１７）をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で３．５時間撹拌することで、樹脂とペプチドフラグメント（１７）とを切り離した。その後、別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離操作を行い、目的とするペプチドを含む沈殿物と溶液部分とを分けた。その後、溶液部分を除去した後、目的物をＨＰＬＣで確認した後、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→６５：３５（５分）→３０：７０（３５分）→５：９５（４５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、目的とするペプチドフラグメントＣ２（１７）（配列番号３１）：Ｈ２Ｎ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ： ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１８５Ｈ２８２Ｎ５２Ｏ４７Ｓ２： ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ １３５１．２２，［Ｍ＋４Ｈ］４＋ １０１３．６７，［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ８１１．１３， ｆｏｕｎｄ．１３５１．０２，１０１３．５１，８１１．０１
実施例５． ペプチドフラグメントＣ１とペプチドフラグメントＣ２の連結
４６残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のペプチドフラグメントＣ１−ＳＰｈ（１６）（８．７ｍｇ）と３２残基のペプチドフラグメントＣ２（１７）（３．５ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ６．８のバッファー溶液（１．０ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（３０μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン溶液（１．５ｍｌ）（０．２Ｍメトキシアミン溶液に２０ｍＭＴＣＥＰ溶液を加え調製）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物フラグメントを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→６５：３５（５分）→３０：７０（３５分）→５：９５（４５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするペプチドフラグメント（１８）（配列番号３２）（ペプチドフラグメント（Ｃ１＋Ｃ２））（８９−１６６）を得た（図２９）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４４１Ｈ６８８Ｎ１２４Ｏ１１４Ｓ４： ［Ｍ＋８Ｈ］８＋ １２１０．９０，［Ｍ＋９Ｈ］９＋ １０７６．４７，［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ９６８．９２，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ ８８０．９３，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ ８０７．６０，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ ７４５．５５，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ ６９２．３７，ｆｏｕｎｄ．１２１０．７７，１０７６．４６，９６８．９１，８８０．９２，８０８．５０，７４５．４７，６９２．３７
実施例６．アシアロＩＦＮ−β合成法２
（６−１． アシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢとペプチドフラグメント（Ｃ１＋Ｃ２）との連結）
２１残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のアシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ（３）（１．５ｍｇ）と７８残基のペプチドフラグメント（１８）（ペプチドフラグメントＣ１・Ｃ２）（２．４ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．２５ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（７．４μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン溶液（０．３７ｍｌ）（０．２Ｍメトキシアミン溶液に２０ｍＭＴＣＥＰ溶液を加え調製）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、糖ペプチドフラグメントを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝６５：３５→６５：３５（５分）→３０：７０（３５分）→５：９５（４５分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするインターフェロンβの８０位に相当する位置にアシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（１９）（配列番号３３）（アシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ１＋Ｃ２））（６８−１６６）を得た（図３０）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６０７Ｈ９５０Ｎ１５６Ｏ１９４Ｓ５： ［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ １３７０．７３，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ １２４６．２１，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ １１４２．４４，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ １０５４．６４，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ ９７９．３８，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ ９１４．１５，［Ｍ＋１６Ｈ］１６ ８５７．０８，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ ８０６．７２，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ ７６１．９６，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ ７２１．９１，ｆｏｕｎｄ．１３７０．６６，１２４６．１４，１１４２．３８，１０５４．５６，９７９．３８，９１４．０８，８５６．９９，８０６．６５，７６１．９２，７２１．８６
（６−２ ペプチドフラグメントＡと糖ペプチドフラグメントＢ＋Ｃ１＋Ｃ２の連結）
６７残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のペプチドフラグメントＡ（１）（３．０ｍｇ）と上記６−１．で得られたインターフェロンβの８０位に相当する位置にアシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（１９）（アシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ＋Ｃ１＋Ｃ２）（６８−１６６）（３．３ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．２４ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（７．２μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（２．１ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９、１３５位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（２０）（配列番号３４）を得た（図３１）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９７９Ｈ１５２５Ｎ２５３Ｏ２９９Ｓ１１： ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １２９３．６９，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２２１．８８，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１５７．６２，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １０９９．７９，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０４７．４７，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ ９９９．９０，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９５６．４７，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９１６．６６，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８８０．０３，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８４６．２２，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８１４．９２，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ７８５．８５，ｆｏｕｎｄ．１２９２．７５，１２２１．０１，１１５６．７９，１０９８．９９，１０４６．７１，９９９．１９，９５５．７８，９１６．００，８７９．３９，８４５．６３，８１４．３４，７８５．２９
（６−３ ＣｙｓのＡｌａへの還元）
上記６−２．で得られた、６８、８９、１３５位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（２０）（１．１ｍｇ）をナスフラスコに入れ、ｐＨ７．５のバッファー溶液（０．２０ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、ｐＨ７．５の０．５Ｍトリスエチルカルボキシホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）（０．２０ｍｌ）（ＴＥＣＰ，６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、トリエチルアミンにて調製）、ｔＢｕＳＨ（２０μｌ）、０．１ＭＶＡ−０４４溶液（２０μｌ）（ＶＡ−０４４を水に溶解させ調製）を加え、室温にて反応させた。４時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてｔＢｕＳＨを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９、１３５位ＣｙｓがＡｌａに変換され、８０位Ａｓｎにアシアロ糖鎖を有する１６６残基の糖鎖付加ポリペプチド（２１）（配列番号３５）を得た（図３２）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９７９Ｈ１５２５Ｎ２５３Ｏ３００Ｓ７： ［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １２８７．０９，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２１５．６４，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１５１．７１，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １０９４．１８，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０４２．１２，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ ９９４．８０，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９５１．５９，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９１１．９８，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ８７５．５４，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８４１．９１，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８１０．７６，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ７８１．８４，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７５４．９２，ｆｏｕｎｄ．１２８７．１１，１２１５．６９，１１５１．７２，１０９４．２０，１０４２．１６，９９４．８３，９５１．６１，９１１．９８，８７５．５７，８４１．９３，８１０．８０，７８１．８８，７５４．８８
上記６−３．で得られた糖鎖付加ポリペプチド（２１）は、２−４．および２−５．に記載の工程と同様の条件のＡｃｍ基の脱保護およびフォールディング工程経を経ることで、糖鎖付加ポリペプチド（１５）を得ることができる。
実施例７． ジシアロＩＦＮ−β合成法２
（７−１ ジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢとペプチドフラグメント（Ｃ１＋Ｃ２）との連結）
２１残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ（２）（１７．９ｍｇ）と７８残基のペプチドフラグメント（１８）（ペプチドフラグメント（Ｃ１＋Ｃ２））（２２．９ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（２．３７ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（７１．１μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン溶液（３．５５ｍｌ）（０．２Ｍメトキシアミン溶液に２０ｍＭＴＣＥＰ溶液を加え調製）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、糖ペプチドフラグメントを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするインターフェロンβの８０位に相当する位置にジベンジルジシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（２２）（配列番号３６）を得た（図３３）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６４３Ｈ９９６Ｎ１５８Ｏ２１０Ｓ４： ［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ １３１５．５５，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ １２０６．００，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ １１１３．３１，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ １０３３．８６，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ ９６５．００，［Ｍ＋１６Ｈ］１６ ９０４．７５，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ ８５１．５９，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ ８０４．３４，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ ７６２．０６，ｆｏｕｎｄ．１３１５．５９，１２０５．９７，１１１３．２８，１０３３．８３，９６４．９８，９０４．７４，８５１．５７，８０４．３２，７６２．０２
（７−２ ペプチドフラグメントＡとジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ＋Ｃ１＋Ｃ２））
６７残基のＣ末端がチオフェニルエステル体のペプチドフラグメントＡ（１）（４．７ｍｇ）と上記７−１．で得られたインターフェロンβの８０位に相当する位置にジベンジルジシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（２２）（５．２ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．３５ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ溶液にて調製）に溶解させた後、チオフェノール（１１μｌ）を加え、室温で反応を行った。２４時間後、反応をＨＰＬＣで確認した後、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（３．３ｍｇ）を加え、室温で反応を行った。１２時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９、１３５位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基のペプチドフラグメント（２３）（配列番号３７）を得た（図３４）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０１５Ｈ１５７１Ｎ２５５Ｏ３１６Ｓ１０： ［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ １４２１．１６，［Ｍ＋１７Ｈ］１７＋ １３３７．６２，［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２６３．３６，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１９６．９２，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １１３７．１３，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０８３．０２，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ １０３３．８４，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９８８．９３，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９４７．７７，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ９０９．９０，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８７４．９４，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８４２．５７，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ８１２．５２，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７８４．５３，ｆｏｕｎｄ．１４２１．１３，１３３７．５７，１２６３．３５，１１９６．９０，１１３７．０８，１０８２．９９，１０３３．８０，９８８．８９，９４７．７３，９０９．８７，８７４．９２，８４２．５５，８１２．５１，７８４．５０
（７−３ ＣｙｓのＡｌａへの還元）
上記７−２．で得られた６８、８９、１３５位Ｃｙｓに遊離チオール基を持ち、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基のペプチドフラグメント（２３）（６．１ｍｇ）をナスフラスコに入れ、ｐＨ７．５のバッファー溶液（０．２７ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液にて調製）に溶解させた後、ｐＨ７．５の０．５Ｍトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）（０．２７ｍｌ）（ＴＥＣＰ，６Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、トリエチルアミンにて調製）、ｔＢｕＳＨ（１００μｌ）、０．１ＭＶＡ−０４４溶液（１００μｌ）（ＶＡ−０４４を水に溶解させ調製）を加え、室温にて反応させた。４時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液を遠沈管に移し替え、ジエチルエーテルを用いてチオフェノールを抽出した後、目的物を含む水層をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝５５：４５→５５：４５（５分）→２５：７５（３５分）→５：９５（３６分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、６８、８９、１３５位ＣｙｓがＡｌａに変換され、８０位Ａｓｎにジベンジルジシアロ糖鎖を有する１６６残基のペプチドフラグメント（２４）（配列番号３８）を得た（図３５）。
ＥＳＩ−ＭＳ： Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０１５Ｈ１５７１Ｎ２５５Ｏ３１６Ｓ７： ［Ｍ＋１８Ｈ］１８＋ １２５８．０２，［Ｍ＋１９Ｈ］１９＋ １１９１．８６，［Ｍ＋２０Ｈ］２０＋ １１３２．３２，［Ｍ＋２１Ｈ］２１＋ １０７８．４４，［Ｍ＋２２Ｈ］２２＋ １０２９．４７，［Ｍ＋２３Ｈ］２３＋ ９８４．７５，［Ｍ＋２４Ｈ］２４＋ ９４３．７６，［Ｍ＋２５Ｈ］２５＋ ９０６．０５，［Ｍ＋２６Ｈ］２６＋ ８７１．２４，［Ｍ＋２７Ｈ］２７＋ ８３９．０１，［Ｍ＋２８Ｈ］２８＋ ８０９．０８，［Ｍ＋２９Ｈ］２９＋ ７８１．２２，ｆｏｕｎｄ．１２５８．０５，１１９１．８７，１１３２．３７，１０７８．４７，１０２９．５１，９８４．７７，９４３．７９，９０６．０５，８７１．２５，８３９．０４，８０９．０５，７８１．２４
上記７−３．で得られた糖鎖付加ポリペプチド（２４）は、３−４、３−５、および３−６に記載の工程と同様の条件のＡｃｍ基の脱保護、ベンジル基の脱保護、およびフォールディング工程を経ることで、糖鎖付加ポリペプチド（１０）を得ることができる。
上記実施例１〜３では、ＡｌａをＮ末端に有するペプチドフラグメントを設計し、ライゲーションに用いた。そのため、実施例１〜３においては、当該ペプチドフラグメントのＮ末端に位置するＡｌａの位置にＣｙｓを導入したペプチドフラグメントを合成し、ライゲーション後、ＣｙｓをＡｌａへ還元した。
以下の実施例では、ＳｅｒをＮ末端に有するペプチドフラグメントを設計した。すなわち、Ｓｅｒの位置にＣｙｓを導入したペプチドフラグメントを合成し、ライゲーション後、ＣｙｓをＳｅｒへ変換する例を示す。なお、より具体的には、インターフェロンβのアミノ酸配列における６８位−８８位までのアミノ酸を有するペプチドフラグメントＢを、６８位−７５位のフラグメントＢ２と、７６位のＳｅｒの代わりにＣｙｓをＮ末端に有する７６位−８８位のフラグメントＢ１とに分けて合成し、インターフェロンβの７６位に相当する位置のアミノ酸がＣｙｓであるペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲ（以下、ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲ（Ｃｙｓ体）という）をライゲーションにより合成するライゲーション工程、およびペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲ（Ｃｙｓ体）におけるインターフェロンβの７６位に相当する位置のＣｙｓをＳｅｒへ変換する工程を経て、インターフェロンβの７６位に相当する位置のアミノ酸がＳｅｒであるペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲを合成する例を示す。
すなわち、より具体的には、下記の工程を含む製造方法を例示する：
（Ｉ）下記式（ｉ）で表わされるペプチドフラグメントＢ１を作製する工程。
（ｉ）
（ＩＩ）下記式（ｊ）で表わされる糖ペプチドＢ２を作製する工程
（ｊ）
（ＩＩＩ）ペプチドＢ１と糖ペプチドＢ２を連結することにより、下記式（ｋ）で表わされる糖ペプチドを作製し、その後、当該ペプチド上の特定のシステインをセリンに変換する工程（図４３〜４５参照）
（ｋ）
実施例８．ジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲの合成
（８−１ ペプチドフラグメントＢ１−ＳＲの合成）
固相合成用カラムにＨＭＰＢ−ＣｈeｍＭａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）（０．１０ｍｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）を順次用い、固相樹脂上にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）の８残基ペプチドを得た。この８残基ペプチドに対して、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にジベンジルジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体（ｇ）（５４７．８ｍｇ，２００μｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（５９．９ｍｇ，２００μｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１：１混合溶液、３．３３ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ（５２．３μｌ，３００μｍｏＬ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＦｍｏｃＮＨの９残基糖鎖ペプチド（配列番号３９）が得られた。
（ｇ）
その後の糖ペプチド鎖の伸長は、上記で得られた固相樹脂上の9残基糖鎖ペプチドの脂溶性保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した後、以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７３．１μｌ，０．４７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．３ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。Ｆｍｏｃ基およびＢｏｃ基で保護したアミノ酸として，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＢｏｃＮＨの１３残基の糖鎖付加ペプチドフラグメント（２５）（配列番号４０）を得た。
その後、ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂と糖鎖付加ペプチドフラグメントとを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸側鎖が保護された糖鎖付加ペプチド（２５）（配列番号４１）：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＢｏｃＮＨを得た。
１３残基のアミノ酸を有し、アミノ酸側鎖が保護された糖鎖付加ペプチドフラグメント（２５）の１００μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものに２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（４９２．５ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２６０．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（８５．０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離を行い，溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝７２：２８→５９：４１（２６分）、ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がアルキルチオエステルであるジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ１−ＳＲ（２５）（配列番号４２）：Ｈ２Ｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＳＲを得た（図４６）。なお、−ＳＲは、スルホン酸エチルチオエステルを示す。
（８−２ ペプチドフラグメントＢ２−ＳＰｈの合成）
固相合成用カラムにＨＭＰＢ−ＣｈeｍＭａｔｒｉｘ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）（０．１０ｍｍｏｌ）を入れ、塩化メチレン（ＤＣＭ）、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＣＭで十分に膨潤させた。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（０．５０ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で４時間攪拌した。
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５Ｍ ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｂｏｃ−Ｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄを順次用いて固相樹脂に連結させた。その結果、固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮの８残基のペプチドフラグメント（２６）（配列番号４３）を得た。
その後、ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂とペプチドフラグメントとを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸側鎖が保護されたペプチド（２６）（配列番号４４）：Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｚ−ＢｏｃＮを得た。
８残基のアミノ酸を有し、アミノ酸側鎖が保護されたペプチドフラグメント（２６）の１００μｍｏｌ相当をナスフラスコに移し、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（３０８μｌ，３．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２６０．０ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（８５．０μｌ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテル（１５０ｍｌ）に加え沈殿させた後、遠心分離を行い溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝７８：２２→６８：３２（２０分）、ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｃ末端がチオフェニルエステルであるペプチドフラグメントＢ２−ＳＰｈ（２６）（配列番号４５）：ＨＮ−Ｔｈｚ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ―Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＳＰｈを得た（図４７）。
（８−３ ジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ１−ＳＲとペプチドフラグメントＢ２−ＳＰｈとの連結）
１３残基のＣ末端がアルキルチオエステル体であるジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢ１−ＳＲ（０．６０ｍｇ）と８残基のペプチドフラグメントＢ２−SPｈ（０．１６ｍｇ）の二種類を同じナスフラスコにいれ、ｐＨ７．２のバッファー溶液（０．１５ｍｌ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２ｍＭリン酸溶液、２０ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン溶液（ＴＣＥＰ溶液）にて調製）に溶解させた、室温で反応を行った。１４．５時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液をメンブレンフィルターで濾過し、糖ペプチドフラグメントを含む濾液部分をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７８：２２→５６：４４（２２分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、目的とするジベンジルジシアロ糖鎖を有し、Ｃ末端がアルキルチオエステル化された糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲ（Ｃｙｓ体）（２７）（配列番号４６）を得た（図４８）。
（８−４ Ｃｙｓのメチル化）
得られた２１残基のペプチドアルキルチオエステル（２７）５．３ｍｇ（１．０３μｍｏｌ）をエッペンチューブにいれ、ｐＨ８．６の緩衝溶液（１．０９ｍＬ）（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２５トリス塩酸液、３．３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液にて調製）とアセトニトリル（０．３６ｍＬ）に溶解させた後、２５℃にてメチルー４−ニトロベンゼンスルホネート（５．１ｍｇ）を加えた。３０分後、１０％ＴＦＡ溶液（０．２ｍＬ）加え、ｐＨ４にした後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７２：５５→５５：４５（３４分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、原料に含まれるシステイン残基の硫黄原子がメチル化されたジベンジルジシアロ糖鎖を有し、Ｃ末端がアルキルチオエステル化された糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲ（Ｃｙｓ体）（２８）（配列番号４７）を得た（図４９）。
（８−５ メチル化されたＣｙｓのシアノ化およびシアノ化につづく分子内アシル転移反応）
得られたシステイン残基の硫黄原子がメチル化されたジベンジルジシアロ糖鎖を有するペプチドフラグメント（２８）をエッペンチューブに入れ、０．１ｍＭ ８０％蟻酸溶液（３．３ｍＬ）に溶解させた後、２５℃にて臭化シアン２３．２ｍｇ（２１９μｍｏｌ）を加えた。反応容器を遮光した後、３７℃にて反応を行い、２６．５時間後、反応溶液を減圧下に濃縮した。
得られた残渣にｐＨ８．０の緩衝溶液（８Ｍグアニジン塩酸液と０．２Ｍリン酸溶液にて調製）（０．３３ｍＬ）にて溶解させた後、３７℃にて反応させた。１時間後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３．３μＬ、１％ｖ/ｖ）を添加し、反応が終了していることをＨＰＬＣで確認後、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、Ａ：Ｂ＝７２：５５→５５：４５（３４分）、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製し、反応中間体の２１残基のジベンジルジシアロ糖鎖を有し、Ｃ末端がアルキルチオエステル化された糖鎖付加ペプチドフラグメント（Ｂ１＋Ｂ２）−ＳＲ（２９）（配列番号４８）を得た（図５０）。なお、−ＳＲは、スルホン酸エチルチオエステルを示す。
上記８−５．で得られた糖鎖付加ポリペプチド（２９）を、実施例３におけるジベンジルジシアロ糖鎖付加ペプチドフラグメントＢの代わりに用いることで、実施例３と同様にして、ジシアロＩＦＮ−βを合成することができる。
実施例９ 加熱処理方法
（９−１． １７，３１，１４１Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−８０Ｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＩＦＮ−βの加熱処理）
１０ｍＬのナスフラスコに上記３−３．で得られた糖鎖付加ポリペプチド（７）（１７，３１，１４１Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−８０Ｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＩＦＮ−β）（３．７ｍｇ）を入れ、ｐＨ７．０の０．２Ｍ リン酸緩衝液（８Ｍグアニジンを含む）（３．３ｍＬ；基質濃度：５０ｍＭ）を入れた。ガラス栓をナスフラスコにした後、オイルバスにて６０℃に加温した。１０時間後、室温にもどした後、ＨＰＬＣ分析を行った。分解していないことをＨＰＬＣ，ＥＳＩ−ＭＳにより確認した後（図３６）、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→５０：５０（５分）→２０：８０（３５分）→５：９５（３５．５分）］で脱塩を行い、加熱処理サンプル（４．０ｍｇ）を得た。
（９−２． ８０Ｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＩＦＮ−βの加熱処理）
０．５ｍＬのエッペンドルフチューブに上記３−４．で得られた糖鎖付加ポリペプチド（８）（８０Ｎ（ｄｉｂｅｎｚｙｌ−ｄｉｓｉａｌｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）−ＩＦＮ−β（３０μｇ））を入れ、ｐＨ７．０の０．２Ｍ リン酸緩衝液（８Ｍグアニジンを含む）（３０μＬ；基質濃度：５０ｍＭ）を入れた。蓋をした後、オイルバスにて６０℃に加温した。１０時間後、室温にもどしＨＰＬＣ分析［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ（Ｃ４， ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液 Ａ液：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ、グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→５０：５０（５分）→２０：８０（３５分）→５：９５（３５．５分）ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ５ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ］を行い、ＨＰＬＣ、ＥＳＩ−ＭＳにより純度を確認した（図３７）。
ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳのデータを上記９−１．で加熱試験に使用したＣｙｓが保護された糖鎖付加ポリペプチド（７）と比較すると、システインが無保護である糖鎖付加ポリペプチド（８）は、加熱処理により、回収量が落ちていた。
実施例１０ 受容体親和性解析
ＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２に対する非加熱または加熱処理した化学合成ＩＦＮ−βの受容体親和性解析を行った。
ＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２に対する非加熱または加熱処理した化学合成ＩＦＮ−βの結合親和性は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６ （Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いてＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；表面プラズモン共鳴技術）で測定した。
具体的には、流速３０ μＬ／ｍｉｎで０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを流しながら、アミンカップリングキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて説明書に従い、ＧＬＭチップ （Ｂｉｏ−ｒａｄ）に１０ μｇ／ｍＬのＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２（１０ ｍＭ酢酸緩衝液， ｐＨ４．５）を固定化した。実施例３で作製した非加熱ジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１０）、または、上記９−１．で加熱処理したジシアロ糖鎖付加ポリぺプチドを上記３−４．〜３―６．に記載の脱Ａｃｍ工程、ベンジル基の脱保護工程、および、フォールディング工程に供して得られた加熱処理したジシアロ糖鎖付加ポリペプチドを、０．１％ ＢＳＡ， ２ ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで０．３１−２５ ｎＭに調整し、流速５０ μＬ／ｍｉｎでチップに添加した。なお、糖鎖付加ポリぺプチド（１０）は、０．３１ｎＭ、０．９３ｎＭ、２．８ｎＭ、８．３ｎＭ、２５ｎＭの５つの濃度を用いてそれぞれ実施した。結合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）及び結合解離定数（Ｋｄ）はＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。 その結果を図３８、図３９、および、表１に示す。
図３８は、ＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２に対する非加熱のジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１０）の結合親和性を解析したグラフを示す。また、図３９は、ＩＦＮ−α／β ｒｅｃｅｐｔｏｒ２に対する加熱処理したジシアロ糖鎖付加ポリペプチドの結合親和性を解析したグラフを示す。図３８、図３９、および表１に示すように、本発明の化学合成された糖鎖付加ポリペプチドは、加熱処理後であっても、非加熱処理の糖鎖付加ポリペプチドと同等の受容体親和性を有していた。
実施例１１ 薬物動態解析
上記実施例にて作製される本発明に係る糖鎖付加ポリペプチドを、静脈内および皮下に投与した場合の、薬物動態解析の実施例を下記に示す。
（１１−１． 投与液、試薬の調製）
化学合成したＩＦＮ−βとしては、実施例２で作製したアシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１５）（アシアロＩＦＮ−β）および実施例３で作製したジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１０）（ジシアロＩＦＮ−β）を用い、ＢＳＡ及びリン酸緩衝液溶液を添加し、凍結乾燥を行った。投与直前にミリＱ水６０μＬを用いて溶解し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ溶液（ＰＢＳ、和光純薬工業）を用いて５０万ＩＵ／ｍＬとなるように投与液を調製した。また、対照のＩＦＮ−βとしては、生合成により作製されたＩＦＮβモチダ注射用（持田製薬）を用い、添付の注射用水を用いて１２００万ＩＵ／ｍＬに溶解し、そして、ＰＢＳを用いて５０万ＩＵ／ｍＬに調製した。ＥＤＴＡ−ＰＢＳは、ＥＤＴＡ−２Ｎａ（和光純薬工業）が２ｍＭとなるようにＰＢＳに加えた。なお、本実施例の薬物動態解析に用いた化学合成した糖鎖付加ポリペプチドは、加熱処理をしていないものを用いた。また、ＩＦＮβモチダとは、ヒト繊維芽細胞由来の生合成により作製されたＩＦＮβ―１ａである。
（１１−２． 投与および採血）
マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス、雄性、体重２０．４５〜２５．２８ｇ）に対し、２００万ＩＵ／ｋｇの用量で、飽食下で、眼窩静脈もしくは背部皮下から、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ社）を用いて容量４ｍＬ／ｋｇで投与した。静脈内投与時は投与前、および投与後２、１０、３０分、１、３、６、８時間に、皮下投与時は、投与前、および投与後１０、３０分、１、２、４、６、８時間に眼窩静脈からヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（ＨＩＲＳＨＭＡＮＮ ＬＡＢＯＲＧＥＲＡＴＥ）を用いて７５μＬ採血した。採取血液と同体積のＥＤＴＡ−ＰＢＳと速やかに混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。上清を９０μＬ採取し、血漿サンプルとした。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。チップおよびチューブはビーエム機器社の低吸着性のものを使用した。
（１１−３． 血中濃度測定）
糖鎖付加ポリペプチド（ＩＦＮ−β）の血中濃度の測定は、ヒトインターフェロン−β ＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス）を用いた。すなわち、血漿サンプルは同じくキット付属希釈液を用いて、必要に応じ、３６０、１２０、１２倍の希釈を調製し、測定サンプルとした。検量線を作成するためのスタンダードとして、投与に用いたものと同一ロットの化学合成ＩＦＮ−β、ＩＦＮβモチダ注射用を用い、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５ＩＵ／ｍＬになるようにキット付属希釈液で調製した。検量線には、血漿サンプルの希釈率に応じ、同じ持ち込み量となるようにブランク血漿を添加した。得られた結果より、希釈率を掛け、さらに抗凝固処理としてのＥＤＴＡ−ＰＢＳでの希釈率２を掛けることにより、血中濃度を算出した。得られた血漿中ＩＦＮ−β濃度推移を図４０に示した。
（１１−４． 薬物速度論的パラメータの算出）
得られたＩＦＮ−βの濃度推移からモーメント解析手法を用い、血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出した。また、外挿法により静脈内投与時の予測初期濃度（Ｃ０）、さらに血漿中半減期（ｔ１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および皮下投与時の実測値より最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を求めた。得られた薬物速度論的パラメータを表２に示す。
図４０より、本発明に係る化学合成により作製された糖鎖付加ポリペプチドは、生合成により作製されたＩＦＮ−βと比較して、同等の血中動態を示した。
実施例１２ 抗腫瘍活性測定試験
（１２−１． 細胞培養、試薬の調製）
抗腫瘍活性試験には、ヒト・バーキットリンパ腫であるＤａｕｄｉ細胞を用いた。培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、５６℃で３０分間非働化処理したＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＧＩＢＣＯ）を１０％、ペニシリン・ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を加えたものを用いた。培養プレートは、Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で培養し、２〜３日に１度継代を行った。
（１２−２． 担がんマウスの作成法）
上記１２−１．で培養したＤａｕｄｉ細胞をチューブに回収し、遠心分離（１３００ｒｐｍ、４℃、３分）した。上清をアスピレーターを用いて除き、ＨＢＳＳ（ナカライ）を加え、細胞を懸濁した。次に再度遠心分離を行い、上清を除いた。この細胞洗浄処理を計３回行った。そして、血球計算板を用いて細胞数を計算し、２×１０８Ｃｅｌｌ／ｍＬになるようにＨＢＳＳを用いて細胞懸濁液を作成した。Ｄａｕｄｉ細胞接種直前に、細胞懸濁液と同体積のマトリゲル（ＢＤ）を加えて２倍希釈し、接種用細胞懸濁液を作成した。接種用細胞懸濁液は接種直前まで、氷上に保存した。麻酔薬として、ソムノペンチル（共立製薬）をＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウス、雄性）（日本クレア）に、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ）を用いて、麻酔薬を２５０〜３００μＬ腹腔内投与した。麻酔が導入された事を確認後、バリカンを使用してマウスの右わき腹の毛を刈った。２６Ｇ１／２の注射針（テルモ）と１ｍＬの注射筒（テルモ）を用いて、接種用細胞懸濁液を１００μＬ皮下接種した。
（１２−３． 抗腫瘍活性の測定方法と評価方法）
上記１１―３．の細胞接種処理からおよそ３０日後、ノギス（Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ）を用いて形成された腫瘍組織の長経（ｍｍ）と短径（ｍｍ）を測定した。得られた数値を用いて、腫瘍体積（ｍｍ３）を求めた。腫瘍体積は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝長経（ｍｍ）×短経（ｍｍ）×短経（ｍｍ）×０．５の式を用いて算出した。腫瘍体積を経時的に算出し、グラフにプロットすることで、抗腫瘍活性能として評価した。
（１２−４． 投与液の調製法および投与方法）
実施例２で合成したアシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１５）および実施例３で合成したジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１０）を、ＰＢＳを用いて５００万ＩＵ／ｍＬに調製した。対照のＩＦＮ−βとしては、生合成により作製されたＩＦＮβモチダ注射用（持田製薬）を用い、添付の注射用水を用いて１２００万ＩＵ／ｍＬに溶解し、そして、ＰＢＳを用いて５００万ＩＵ／ｍＬに調製した。投与液の調製は、投与直前に行った。上記１２−３．で測定した腫瘍体積を用いて、担がんマウスを４群に群分けした（ｎ＝４／群）。群分け時の腫瘍体積は、およそ８００ｍｍ３であった。調製した投与液を用いて、背部皮下に２０００万ＩＵ／ｋｇの用量になるよう４ｍＬ／ｋｇの容量でインスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２を用いて投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群には、投与液調製時に用いたＰＢＳを４ｍＬ／ｋｇの容量で投与した。群分け&投与１回目をｄａｙ０とし、ｄａｙ９まで連日１０回背部皮下投与を行った。
（１２−５． 抗腫瘍活性能の評価）
１２−３．に示した方法を用いて、ｄａｙ３、６、８、１０、１３、１５、１７に腫瘍体積を算出し、経時的な腫瘍体積の変化を図４１に示した。
図４１より、本発明に係る化学合成により作製された糖鎖付加ポリペプチドは、生合成により作製されたＩＦＮ−βと比較して、同等または優れた抗腫瘍活性を示した。特に、ジシアロ糖鎖が実質的に均一に付加している本発明の糖鎖付加ポリペプチド（１０）は、生合成により作製されたＩＦＮ−βと比較して、優れた抗腫瘍活性を示した。
実施例１３ 加熱処理後の細胞増殖抑制能の評価
また、上記９−１．で加熱処理したジシアロ糖鎖付加ポリペプチドを上記３−４．〜３−６．に記載の脱Ａｃｍ工程、ベンジル基の脱保護工程、および、フォールディング工程に供して得られた加熱処理したジシアロ糖鎖付加ポリペプチドの細胞増殖抑制能を評価した。
具体的な細胞増殖抑制能評価は下記のように行った。
ヒト・バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを１０％Ｆａｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ， １００ Ｕ／ｍＬ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００ μｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０）を用いて１．２５×１０５個／ｍＬとなるよう懸濁した。細胞懸濁液を１×１０４／８０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴平底プレートに播種し、さらに１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈された完全化学合成ＩＦＮ−βを２０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、ＣＯ２濃度を５％に調整したＣＯ２インキュベーター中で３７℃、３日間培養した。細胞増殖抑制能は、培養３日目のミトコンドリア脱水素酵素活性を指標として、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（同仁化学）を用いてキット添付のマニュアルに従って測定を行った。
また、対照として、非加熱処理のジシアロ糖鎖付加ポリペプチド（１０）を使用した。その結果を図４２に示す。図４２に示すように、加熱処理後の糖鎖付加ポリペプチドであっても、非加熱処理の糖鎖付加ポリペプチドと、同等の細胞増殖抑制能を示した。

Claims (21)

  1. （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
    （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、９０％以上の相同性を有するポリペプチド；
    からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有し、かつ、インターフェロンβ活性を有する、複数の糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記糖鎖付加ポリペプチドが化学合成により作製されたものであり、
    前記糖鎖付加ポリペプチドは、細胞発現系によって得られた糖鎖付加ポリペプチドではなく、
    前記組成物中の複数の糖鎖付加ポリペプチド間で、糖鎖が９０％以上均一であることを特徴とする、
    組成物。
  2. 前記糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖が、アスパラギン結合型糖鎖であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖が、下記式（ａ）で表わされるジシアロ糖鎖、または、下記式（ｂ）で表わされるアシアロ糖鎖であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。

    （ａ）
    （ｂ）
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物中のインターフェロンβの３１位および１４１位に相当するＣｙｓが、ジスルフィド結合を形成していることを特徴とする、組成物。
  5. 加熱処理されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記組成物中の複数の糖鎖付加ポリペプチドが、９０％以上の純度を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. （Ｉ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物、および、
    （ＩＩ）薬理学的に許容される担体
    を含むことを特徴とする、
    医薬組成物。
  8. 請求項７に記載の医薬組成物であって、
    前記複数の糖鎖付加ポリペプチド間で、糖鎖が９０％以上均一であることを特徴とする、
    医薬組成物。
  9. 前記複数の糖鎖付加ポリペプチドが、９０％以上の純度を有することを特徴とする、請求項７または８に記載の医薬組成物。
  10. 請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
    インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする、医薬組成物。
  11. 請求項１０に記載の医薬組成物であって、
    前記インターフェロンβに関連する疾患が、多膠芽腫、髄芽腫、および、星細胞腫を含む脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、ならびに、多発性硬化症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする、
    医薬組成物。
  12. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物、または、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を、ヒトを除く対象に投与することを特徴とする、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防方法。
  13. 請求項１２に記載の治療または予防方法であって、
    前記インターフェロンβに関連する疾患が、多膠芽腫、髄芽腫、および、星細胞腫を含む脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、ならびに、多発性硬化症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする、
    治療または予防方法。
  14. 糖鎖付加ポリペプチドであって、前記糖鎖付加ポリペプチドは、
    （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
    （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、９０％以上の相同性を有し、インターフェロンβ活性を有するポリペプチド；
    からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドであり、かつ、インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓが保護基により保護されており、
    前記糖鎖付加ポリペプチドは、細胞発現系によって得られた糖鎖付加ポリペプチドではないことを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチド。
  15. 請求項１４に記載の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、前記糖鎖が、下記式（ｃ）で表わされるジシアロ糖鎖、または、下記式（ｂ）で表わされるアシアロ糖鎖であることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチド。
    （ｃ）
    （式中、Ｒは、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２を表わす。なお、Ｂｎはベンジル基を示し、Ｅｔはエチル基を示し、Ｍｅはメチル基を示し、Ｐｈはフェニル基を示す。）
    （ｂ）
  16. 請求項１４または１５に記載の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、前記インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓが、Ａｃｍ基、アルコキシメチル基、トリフェニルメチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、および、β位が置換されたエチル基からなる群より選択されるいずれか一つの保護基により保護されていることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチド。
  17. 糖鎖付加ポリペプチドの製造方法であって、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、保護基により保護されている前記インターフェロンβにおける１７位、３１位、および１４１位に相当するＣｙｓを脱保護する工程を含むことを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチドの製造方法。
  18. 請求項１７に記載の糖鎖付加ポリペプチドの製造方法であって、Ｃｙｓの保護基を脱保護する工程の前に、糖鎖付加ポリペプチドを加熱処理することを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチドの製造方法。
  19. 糖鎖付加ポリペプチドであって、前記糖鎖付加ポリペプチドは、
    （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
    （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、９０％以上の相同性を有し、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチド；
    からなる群より選択されるポリペプチドにおいて、インターフェロンβにおける８０位に相当するアミノ酸に糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドであり、
    前記糖鎖付加ポリペプチドは、細胞発現系によって得られた糖鎖付加ポリペプチドではなく、
    前記糖鎖が下記式（ｃ）により表わされる、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸のカルボキシ基が保護されたジシアロ糖鎖であることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチド。
    （ｃ）
    （式中、Ｒは、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２を表わす。なお、Ｂｎはベンジル基を示し、Ｅｔはエチル基を示し、Ｍｅはメチル基を示し、Ｐｈはフェニル基を示す。）
  20. 糖鎖付加ポリペプチドの製造方法であって、請求項１９に記載の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸のカルボキシ基の保護基を脱保護する工程を含むことを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチドの製造方法。
  21. 前記糖鎖付加ポリペプチドをフォールディングする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１７、１８、および２０のいずれか一つに記載の糖鎖付加ポリペプチドの製造方法。
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