MXPA01003790A

MXPA01003790A - Proteinas de fusion beta - interferon y sus usos.

Info

Publication number: MXPA01003790A
Application number: MXPA01003790A
Authority: MX
Inventors: Adrian Whitty
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2002-09-18
Also published as: JP2010268810A; SK5102001A3; NO20011861L; WO2000023472A2; CY1105173T1; IL142350A0; KR20010085932A; DK1121382T3; IS5887A; US7527946B2; ES2265693T3; KR100767649B1; IL142350A; BR9915548A; CZ20011330A3; AU766190B2; WO2000023472A3; ATE327254T1; HUP0200414A2; PT1121382E

Abstract

Se describe un polipeptido de fusion que tiene la secuencia de aminoacidos X-Y-Z o una porcion de la misma, que comprende la secuencia de aminoacidos de un interferon beta glicosilado (X); Y es una unidad enlazante opcional; y Z es un polipeptido que comprende por lo menos una porcion de un polipeptido distinta del interferon beta glicosilado. Se prefiere que X sea interferon beta-la humano. Tambien se describen mutantes de interfer6n beta-la.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN BETA-INTERFERON Y SUS USOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En la actualidad, el uso de polipéptidos y proteinas para el tratamiento sistémico de enfermedades específicas es muy aceptado en la práctica de la medicina. El papel que estas substancias desempeñan en la terapia es tan importante que muchas actividades de investigación se orientan hacia la síntesis grandes cantidades mediante la tecnología de ADN recombinante. Muchos de estos polipéptidos son moléculas endógenas que son muy potentes y específicas para provocar sus acciones biológicas. Un importante factor que limita la utilidad de estas sustancias proteicas en la aplicación a la que se destinan, es que cuando se administran por vía parenteral, se eliminan del organismo en un tiempo corto. Es posible que esto suceda como resultado del metabolismo mediante las proteasas o por depuración utilizando las rutas normales para la eliminación de proteínas, por ejemplo, a través de filtración en los ríñones. Los problemas asociados con estas vías de administración de proteínas son muy conocidos en la industria farmacéutica y con el fin de resolverlas se utilizan varias estrategias. Los interferones son una familia de péptidos a la que se ha enfocado mucho trabajo clínico y los esfuerzos para mejorar su administración y bioasimilación. Los interferones se han probado en una diversidad de estados clínicos de enfermedad. El uso del interferón beta humano, uno de los miembros de esa familia, se ha establecido mejor en el tratamiento de la esclerosis múltiple. Recientemente, se han autorizado en Europa y en los Estados Unidos dos formas de interferón beta recombinante, para el tratamiento de esclerosis múltiple. Una forma es el interferón beta la (comercializado con el nombre comercial AVONEX® de Biogen, Inc., Cambridge, MA) en adelante denominado en forma indistinta "interferón beta-la" o "IFN beta-la" o "IFNß-la" . La otra forma es "interferón beta-Ib" (comercializado con el nombre comercial BETASERON®, Berlex, Richmond CA) , en adelante "interferón beta-Ib" . El interferón beta-la se produce en células de mamíferos utilizando la secuencia del gen humano natural y está glicosilado, mientras que el interferón beta- Ib se produce en bacterias E. coli utilizando una secuencia de gen humano modificado que contiene una sustitución manipulada genéticamente cisteína a serina en el aminoácido en posición 17 y no está glicosilado . Con anterioridad, se ha comparado en forma directa las potencias relativas in vitro del interferón beta-la y el interferón beta-Ib en ensayos funcionales y se ha demostrado que la actividad específica del interferón beta-la es aproximadamente 10 veces mayor que la actividad específica del interferón beta-Ib (Run el et al., 1998, Pharm. Res. 15:641-649). A partir de estudios diseñados para identificar la base estructural de estas diferencias en la actividad, se identificó la glicosilación como la única de las diferencias estructurales conocidas, entre los productos, que influye en la actividad específica. El efecto del carbohidrato se manifestó en gran parte a través de su papel estabilizante de la estructura. El efecto estabilizante del carbohidrato se hizo evidente en a través de experimentos de desnaturalización térmica y mediante análisis SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) . La ausencia de glicosilación también se correlacionó con un aumento en la agregación y un aumento en la sensibilización a la desnaturalización térmica. La eliminación enzimática del carbohidrato del interferón beta-la con PNGasa F provocó una abundante precipitación del producto desglicosilado. Estos estudios indicaron que a pesar de la conservación de secuencia entre el interferón beta-la y el interferón beta-Ib, son entidades bioquímicas distintas y por lo tanto mucho de lo que se conoce acerca del interferón beta-Ib no puede aplicarse al interferón beta- la y viceversa.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se han explotado las ventajas que posee el interferón beta glicosilado con respecto a las formas no glicosiladas. En particular, se ha desarrollado una composición de interferón beta-la con actividad aumentada relativa al interferón beta-Ib y que también tiene las ventajosas propiedades de las proteínas de fusión, por lo general, sin pérdida efectiva de actividad en comparación con las formas de interferón beta-la que no son proteínas de fusión. De este modo, si se hacen las modificaciones de tal manera que los productos (proteínas de fusión interferón beta-la) conserven todas o la mayor parte de sus actividades biológicas, se pueden obtener las siguientes propiedades: farmacocinética y farmacodinámica alteradas que dan lugar a un incremento en la vida media y cambios en la distribución tisular (por ejemplo, habilidad para permanecer en la vasculatura durante períodos de tiempo más largos) . Esta formulación es un avance considerable en la técnica médica y farmacéutica que podría contribuir de manera significativa en el manejo de varias enfermedades en las cuales el interferón tiene alguna utilidad, por ejemplo, en la esclerosis múltiple, fibrosis y otras enfermedades inflamatorias o autoinmunes, distintos tipos de cáncer, hepatitis y otras enfermedades virales y enfermedades caracterizadas por neovascularización. En Pl261 particular, la habilidad para permanecer durante períodos de tiempo más largos en la vasculatura permite utilizar el interferón beta-la para inhibir angiogénesis y potencialmente atravesar la barrera hematoencefálica. En particular, la invención se relaciona con un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos X-Y-Z, en donde X es un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos o una porción de la misma, consistente en la secuencia de aminoácidos del interferón beta; Y es una unidad enlazante opcional; y Z es un polipéptido que comprende por lo menos una porción de un polipéptido distinto del interferón beta. La unidad opcional Y la unidad Z requerida pueden estar enlazadas a un N terminal o bien a un C terminal del interferón beta (X) . De preferencia, X es un interferón beta-la humano. En las modalidades preferidas, Z es por lo menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina y puede derivarse de una inmunoglobulina de la clase seleccionada entre IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Si la clase es IgG, entonces se selecciona entre IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. La región constante de las IgM e IgE humanas contiene 4 regiones constantes CH1, (bisagra), CH2 , CH3 y CH4 , mientras que la región constante de las IgG, IgA e IgD contiene 3 regiones constantes CH1, (bisagra), CH2 y CH3. En proteínas de fusión de la invención que más se prefieren, la región constante contiene por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3. En otras modalidades, la unidad Z es por lo menos una porción de un polipéptido que contiene dominios tipo inmunoglobulina. Entre los ejemplos de esos otros polipéptidos se incluyen CDl, CD2 , CD4 y los miembros de los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad clase I y clase II. Otra modalidad de la invención es una proteína de fusión que tiene una región amino terminal que consiste de la secuencia de aminoácidos del interferón beta o una porción del mismo y que tiene una región carboxi terminal que comprende por lo menos una porción de una proteína distinta del interferón beta. La porción carboxi, de preferencia, es por lo menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina, derivada de una inmunoglobulina de la clase seleccionada entre IgM, IgG, IgD, IgA e IgE . En las proteínas de fusión que más se prefieren, la región constante contiene por lo menos los dominios bisagra, CH2 y CH3. Otra modalidad de la invención es una proteína de fusión cuya unidad interferón beta (por ejemplo, X en la fórmula anterior) ha experimentado mutación para dar muteinas con actividad antiviral y/o antiproliferativa intensificadas de manera selectiva u otras propiedades ventajosas relativas a las formas sin mutar del interferón p?2e? beta-la. Aún otra modalidad de la invención es un ADN aislado que codifica para las proteínas de fusión descritas arriba y una secuencia de control de expresión, en donde la secuencia de control de expresión está funcionalmente enlazada al ADN . El alcance de la invención incluye también células hospederas transformadas con las secuencias de AD? recombinante de la invención. La invención se relaciona además con un método para producir un polipéptido recombinante que comprende: proporcionar una población de células hospederas según la invención; desarrollar la población de células en condiciones mediante las cuales se exprese el polipéptido codificado por el AD? recombinante; y aislar el polipéptido expresado. Otro aspecto de la invención es una proteína de fusión interferón beta-la que comprende interferón beta-la y un polipéptido adicional con el cual no está asociado nativamente, en forma substancialmente pura, la proteína de fusión tiene una actividad antiviral que es aproximadamente igual a la actividad antiviral del interferón beta-la que carece del polipéptido adicional. Aún otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión interferón beta-la. Todavía otro aspecto de la invención es un método para inhibir angiogénesis y neovascularización utilizando los polipéptidos de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIQURAS Figura 1. ADNc y secuencia de aminoácidos deducida de un interferón beta de fusión etiquetado con histidina (denominado también "his IFN-beta" o "His6-etiquetada") . Se muestran las secuencias completas de ADN y proteínas del his IFN-beta . La secuencia señal VCAM-1 desdoblada deja 3 residuos amino terminal (SerGlyGly) en dirección al extremo 5' de la etiqueta de histidina (His6, posiciones 4-9) . La secuencia enlazante de enterocinasa (AspAspAspAspLys) está separada de la etiqueta de histidina mediante un separador (posiciones 10-12, SerSerGly) . La secuencia de la proteína IF? beta-la natural abarca las posiciones (Metl8-Asnl83) .

Figura 2. AD?c y secuencia de aminoácidos deducida para un interferón beta-la/Fc de fusión. Se muestran las secuencias completas de AD? y proteínas del IF? beta-la humano/Fc de ratón. La secuencia de la proteína IF? beta-la humano abarca los residuos de aminoácidos 1-166 (secuencias de AD? 1-498) . La secuencia enlazante de enterocinasa P12.61 abarca residuos de aminoácidos 167-171 (secuencias de TADN 499-513) . La secuencia proteica de cadena pesada de la IgG2a murina abarca residuos 172-399 (secuencias de 7ADN 514-437) .

Figura 3. Unión de mutantes de interferón beta sustituido con alanina a una proteína de fusión dimérica constituida por el dominio extracelular de la cadena del receptor de interferón tipo I, IFNAR2/Fc. Las afinidades de unión de mutantes de IFN sustituido con alanina (Al-E) a la cadena del receptor IFNAR2 se determinaron según se describe en el Ejemplo 1 (subsección D) . El histograma presenta las afinidades de unión en este ensayo, relativas al his-IFN-beta tipo silvestre (% t.s.) . Los valores % t.s. se calcularon como (afinidad del his-IFN-beta tipo silvestre) / (afinidad de IFN-beta mutante) x 100. Se presenta el % t.s. (x) para ensayos múltiples (n = 3) y un % t.s. promedio para el conjunto experimental. Los mutantes A2, ABl, AB2 y E no se unieron a IFNAR2 a concentraciones 500 veces más elevadas que el his-IFN-beta t.s. EC 50 (*) .

Figura 4. Unión de mutantes de interferón beta sustituido con alanina a los complejos del receptor de superficie celular de interferón tipo I ("complejo IFNAR1/2") expresados en células de linfoma de Daudi Burkitt. Las P12S1 propiedades de unión a receptor de los mutantes con sustitución de alanina (Al-E) se determinaron utilizando un ensayo de unión a receptor de superficie celular, basado en FACS, tal como se describe en el Ejemplo 1 (subsección D) . El histograma presenta las afinidades de unión a receptor en este ensayo, relativas al his-IFN-beta tipo silvestre (% de tipo silvestre) . El % t . s . o % de tipo silvestre para cada mutante se calculó como (afinidad del his-IFN-beta t.s. (tipo silvestre) )/ (afinidad de IFN-beta mutante) x 100. Se presentan los valores % t.s. (o) de ensayos múltiples en el histograma y un promedio de los valores % t.s. para el conjunto experimental (x) .

Figura 5. Actividades antivirales de mutantes de interferón beta sustituido con alanina. Las actividades antivirales de los mutantes de sustitución con alanina (Al-E) se determinaron en células humanas A549 estimuladas con virus EMC (encefalomiocarditis) según se describe en el Ejemplo 1 (subsección E) . El histograma presenta las afinidades de unión a receptor en este ensayo, relativas al his-IFN-beta tipo silvestre (% t.s.) . El % t.s. se calculó como la inversa de la concentración de IFN-beta mutante (50% cpe) /concentración de his-IFN-beta t.s. (50% CPE) x 100. Se muestra el % t.s. (o) para ensayos múltiples y el promedio P1261 del conjunto de datos experimentales (x) .

Figura 6. Actividades antiproliferativas de mutantes de interferón beta sustituido con alanina. Se determinó La actividad antiproliferativa de los mutantes de sustitución con alanina (Al-E) en células de linfoma de Daudi Burkitt según se describe en el Ejemplo 1 (subsección E) . El histograma presenta las afinidades de unión a receptor en este ensayo, relativas al his-IFN-beta tipo silvestre (% t . s . ) . El % t . s . se calculó como (concentración de has IFN-beta (50% de inhibición del crecimiento) /concentración de IFN-beta mutante (50% de inhibición del crecimiento) x 100. Se presenta el % t.s. (o) para ensayos múltiples y el promedio del conjunto de datos experimentales (x) .

Figura 7. Actividades antiviral y antiproliferativa relativas de mutantes de interferón beta sustituido con alanina. Se compararon las actividades relativas de mutantes de sustitución con alanina (Al-E) en los ensayos antiviral (eje x) y antiproliferación (eje y) . Para esta comparación se utilizó el por ciento promedio del his-IFN-beta tipo silvestre (% t . s . (x) ) presentado en las Figuras 5 y 6. Aquellos mutantes con una pérdida/ganancia coordinada quedarían en la línea vertical o muy cercanas a la misma. Aquellos mutantes en las que hay una desproporción de Pl261 pérdida/ganancia en las actividades antiviral y antiproliferación quedarían muy afuera de la línea diagonal (DE1, D, Cl) . La significación se determinó a partir de la consideración de las desviaciones estándar inherentes al promedio de los valores % t.s. empleados.

Figura 8. Actividad antiviral de la fusión interferón beta-la/lg. La actividad del interferón beta-la (utilizado como AVONEX®) o fusión interferón beta-la/lg2a murina a las concentraciones indicadas en el eje X se evalúo en ensayos antivirales utilizando células humanas de carcinoma de pulmón (A549) estimuladas con virus EMC. Después de dos días de incubación con virus, las células viables se tiñeron con MTT, las placas se leyeron a 450 nm y la absorbancia que es un reflejo de la viabilidad celular se presenta en el eje Y. Las desviaciones estándar se muestran como barras de error. La concentración del interferón beta-la (utilizado como intermediario a granel AVONEX®) que dio 50% OD450 máxima y por lo tanto 50% de exterminio viral ("50% de efecto citopático") fue de aproximadamente 0.4 pM y el 50% de efecto citopático para la fusión de interferón beta-la fue de aproximadamente 0.15 pM.

Figura 9. Mediciones de actividad antiviral de P1261 interferón beta en el plasma de ratones tratados con fusión interferón beta-la/Fc o interferón beta-la. Se inyectaron ratones por vía intravenosa con 500,000 unidades de interferón beta-la (utilizado en forma de intermediario a granel AVONEX®) o bien con 50,000 unidades de fusión interferón beta-la/Fc. Después de la inyección de interferón, se extrajo sangre de estos ratones a través de sangrado retro-orbital a diferentes tiempos, según se muestra en el eje X. Hay por lo menos 3 ratones desangrados en cada punto de tiempo, se prepara el plasma y se congela hasta el momento en el que se evalúa la actividad del interferón beta en los ensayos antivirales utilizando células humanas de carcinoma de pulmón (A549) estimuladas con virus de encefalomiocarditis. Las células viables se tiñeron con una solución de MTT, las placas se leyeron a 450 nm, para determinar la absorbancia que es un reflejo de la viabilidad celular y la actividad del interferón beta. Se generaron curvas estándar para cada placa utilizando interferón beta-la como AVONEX® y se utilizaron para determinar la cantidad de actividad de interferón beta en cada muestra. Se presentan los datos de los animales en forma individual.

Figura 10. Secuencias proteicas y de ADN completo de los marcos de lectura abiertos de una fusión directa de IF? beta humano e IgGl Fc humano (ZL5107) .

Figura 11. Secuencias proteicas y de ADN completo del marco de lectura abierto de una proteína de fusión que consiste de IFN beta humano/enlazante G4S/lgGlFC (ZL6206) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias citadas en la descripción detallada las cuales se considera forman parte de la presente, como referencia, a menos que se establezca de otro modo. En la presente se utilizan los términos siguientes : I. Definiciones: Interferón.- Un "interferón" (denominado también "IFN") es un polipéptido pequeño de cadena simple, específico de la especie, producido por las células de mamíferos como respuesta a la exposición de una variedad de inductores como virus, polipéptidos, mitógenos y lo semejante. El interferón que más se prefiere utilizar en la invención es el interferón beta humano glicosilado, que está glicosilado en el residuo 80 (Asn 80) y que de preferencia se produce por medio de las tecnologías de ADN recombinante . Este interferón beta glicosilado preferido se denomina "interferón-beta-la" (o "IFN beta-la" o IFN ß-la" o "interferón beta-la" o "interferón-beta-la" o P1261 "interferón-ß la", que se utilizan de manera indistinta). El término "interferón beta-la" también abarca todas las formas mutantes (es decir, Ejemplo 1) siempre que estos mutantes también estén glicosilados en el residuo Asn 80. Son conocidos los métodos de ADN recombinante para producir proteínas, incluidos los interferones. Ver por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al.) y 4,470,461 (Kaufman) . Los polinucleótidos de interferón beta-la preferidos que pueden utilizarse en los métodos presentes de la invención, se derivan de las secuencias genéticas de interferón beta tipo silvestre de varios vertebrados, de preferencia mamíferos y se obtienen utilizando métodos que son muy conocidos para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo, los métodos que se describen en las siguientes patentes: Patente de los Estados Unidos No. 5,641,656 (otorgada el 24 de enero de 1997: 7ADN que codifica proproteína de interferón tipo I avícola e interferón tipo I avícola maduro) , Patente de los Estados Unidos No. 5,605,688 (25 de febrero de 1997, interferones tipo I recombinantes de perro y de caballo) , Patente de los Estados Unidos No. 5,231,176 (27 de julio de 1993, molécula que codifica un interferón de leucocito humano) , Patente de los Estados Unidos No. 5,071,761 (10 de diciembre de 1991, secuencia de ADN que codifica para subsecuencias de P1261 interferones de linfoblastoides LyIFN-alfa-2 y LylFN-alfa-3), Patente de los Estados Unidos No. 4,970,161 (13 de noviembre de 1990, secuencia de ADN que codifica para gamma interferón humano) ; Patente de los Estados Unidos No. 4,738,931 (19 de abril de 1988, ADN que contiene un gen de interferón beta humano), Patente de los Estados Unidos No. 4,695,543 (22 de septiembre de 1987, gen GX-1 de interferón alfa humano), Patente de los Estados Unidos No. 4,456,748 (26 de junio de 1984, 7ADN que codifica subsecuencias de diferentes interferones de leucocitos que se presentan en forma natural) . Se pueden utilizar mutantes de interferón beta-la según la presente invención. Las mutaciones se desarrollan por medio de los métodos convencionales de mutagénesis dirigida, conocidos para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Además, la invención proporciona polinucleótidos de interferón beta-la funcionalmente equivalentes que codifican para polipéptidos de interferón beta-la funcionalmente equivalentes. Un primer polinucleótido que codifica para interferón beta- la es "funcionalmente equivalente" comparado con un segundo polinucleótido que codifica para interferón beta- la, si cumple por lo menos una de las siguientes condiciones: (a) : el "equivalente funcional" es un primer P1261 polinucleótido que se hibrida al segundo polinucleótido en condiciones estándar de hibridación y/o se degenera a la primera secuencia de polinucleótidos. Con mayor preferencia, codifica para un interferón mutante que tiene la actividad (terapéutica) de un interferón beta- la; (b) el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que codifica en la expresión para una secuencia de aminoácidos codificada por el segundo polinucleótido . En resumen, el término "interferón" incluye en forma no exclusiva, los agentes enunciados arriba, así como sus equivalentes funcionales. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "equivalente funcional" se refiere por lo tanto a una proteína interferón beta-la o a un polinucleótido que codifica la proteína interferón beta-la, con el mismo efecto ventajoso o un efecto mejorado en el receptor mamífero que el interferón del cual se considera un equivalente funcional . Como apreciará el técnico con experiencia ordinaria en la técnica, una proteína funcionalmente equivalente puede producirse mediante las técnicas recombinantes, por ejemplo, al expresar un "ADN funcionalmente equivalente" . Por consiguiente, la presente invención abarca proteínas interferón beta-la codificadas por ADNs que se presentan en forma natural, así como ADNs que no existen en forma P12S1 natural que codifican la misma proteína que la codificada por el ADN que se presenta en forma natural . Debido a la degenerción de las secuencias codificantes de nucleótidos, se pueden utilizar otros polinucleótidos para codificar el interferón beta-la. Estos incluyen todas las secuencias anteriores o porciones de las mismas que se modifican por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácidos dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Dichas secuencias modificadas se consideran como equivalentes de estas secuencias. Por ejemplo, Phe (F) se codifica por dos codones, TTC o TTT, Tyr (Y) se codifica por TAC o TAT e His (H) se codifica por CAC o CAT. Por otro lado, Trp ( ) se codifica por un solo codón TGG. Por consiguiente, se considerará que para una secuencia de ADN dada, que codifica un interferón particular habrá muchas secuencias de ADN degeneradas que codifiquen para el mismo. Se considera que estas secuencias de ADN degeneradas quedan dentro del alcance de la invención. "Fusión", se refiere a un enlace covalente colineal de dos o más proteínas o fragmentos de las mismas a través de sus cadenas peptídicas principales individuales, con mayor preferencia a través de la expresión genética de una molécula de polinucleótido que codifica aquellas proteínas. Se prefiere que las proteínas P1261 o fragmentos de las mismas sean de diferentes fuentes. Así, las proteínas de fusión preferidas incluyen una proteína interferón beta-la o un fragmento de la misma enlazada en forma covalente a una segunda unidad que no es un interferón. Específicamente, una "fusión interferón beta- la/lg" es una proteína que comprende una molécula de interferón beta de la invención (es decir, interferón beta- la) o un fragmento de la misma, cuyas terminales N- o C- están enlazadas a un N terminal de una cadena de inmunoglobulina en donde una porción de la N terminal de la inmunoglobulina está sustituida con el interferón beta. Una especie de fusión interferón beta-la/lg es una "fusión interferón beta-la/Fc" que es una proteína que comprende una molécula de interferón beta de la invención (es decir, interferón beta-la) enlazada por lo menos a una parte del dominio constante de una inmunoglobulina. Una fusión Fc preferida comprende una molécula de interferón beta de la invención enlazada a un fragmento de un anticuerpo que ' contiene el dominio C terminal de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. También, el término "proteína de fusión" se refiere a una proteína interferón beta enlazada químicamente a través de una molécula mono- o heterofuncional a una segunda unidad que no es una proteína interferón beta y se obtiene por síntesis de novo a partir P1261 de proteína purificada, en la forma que se describe más adelante . "Recombinante", en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a una proteína derivada de sistemas de expresión recombinantes de mamíferos. La proteína expresada en la mayoría de cultivos bacterianos, por ejemplo, E. coli, estará libre de glicanos, por lo cual estos sistemas de expresión no son los preferidos. La proteína expresada en levaduras puede tener estructuras de oligosacáridos que son distintas de las que se expresan en células de mamíferos. "Biológicamente activo", en el sentido en el que se utiliza a lo largo de la especificación, como una característica del interferón beta-la, significa que una molécula particular comparte con las modalidades de la invención expuesta aquí, suficiente homología en la secuencia de aminoácidos, para ser capaz de manifestar actividad antiviral según se determina en un ensayo antiviral in vitro, del tipo del que se muestra en el Ejemplo 1, como se describe más adelante. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "composición terapéutica" se refiere a que comprende las proteínas de la invención y otros ingredientes fisiológicamente compatibles. La composición terapéutica puede contener excipientes como agua, minerales y vehículos como proteínas. "Aminoácido", unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. Existen veinte aminoácidos que se encuentran en forma natural en péptidos, pollpéptidos y proteínas, de los cuales todos son isómeros L. El término también incluye los análogos de los aminoácidos y los isómeros D de los aminoácidos proteicos y sus análogos. Un aminoácido "derivado" es un aminoácido natural o no natural, en el cual la cadena lateral o grupo terminal que existe en forma normal (o la unidad de azúcar en el caso del interferón beta-la) está modificada por reacción química. Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, gamma carboxilación, beta carboxilación, pegilación, sulfatación, sulfonación, fosforilación, amidización, esterificación, N-acetilación, carbobencilación, tosilación y otras modificaciones conocidas en la técnica. Un "polipéptido derivado" es un polipéptido que contiene uno o más aminoácidos derivados y/o uno o más azúcares derivados, si el polipéptido está glicosilado. "Proteína", cualquier polímero que en esencia consiste de cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque le término "polipéptido" a menudo se utiliza con referencia a polipéptidos relativamente grandes y "péptido" con referencia a polipéptidos pequeños, en la técnica el uso de estos términos se traslapa y varía. El término "proteína" P12S1 en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se señale de otro modo . "Equivalente funcional" de un residuo de aminoácido es un aminoácido que tiene propiedades fisicoquímicas semejantes al residuo de aminoácido que se reemplazó por el equivalente funcional . "Mutante", cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular, cualquier cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o modificación) en una secuencia de polinucleótidos tipo silvestre o cualquier cambio en una proteína tipo silvestre. Los términos "muteína" y "mutante" se utilizan en forma indistinta. "Tipo silvestre", la secuencia de polinucleótidos que existe en forma natural de un exón de una proteína o una porción de la misma, o secuencia proteica o porción de la misma, respectivamente, tal como existe normalmente in vivo. "Condiciones estándar de hibridación", condiciones salinas y de temperatura prácticamente equivalentes al intervalo de 0.5 X SSC a 5 X SSC y 65°C tanto para la hibridación como para el lavado. El término "condiciones estándar de hibridación" en el sentido en el que se utiliza en la presente, es por lo tanto una P1261 definición para la operación y abarca un intervalo de condiciones de hibridación. Por ejemplo, las condiciones bastante estrictas pueden incluir hibridación con amortiguador de tamizaje de placa (polivinilpirrolidona al 0.2%, Ficoll 400 al 0.2%; albúmina sérica de bovino al 0.2%, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5); NaCl ÍM; pirofosfato de sodio 0.1%; SDS 1% (dodecil sulfato de sodio)); sulfato de dextrana al 10% y 100 µg/mL de ADN de esperma de salmón, sonicado, desnaturalizado a 65°C durante 12 a 20 horas y lavado con 75 mM de NaCl/7.5 mM de citrato de sodio (0.5 x SSC) /SDS (dodeciisulfato de sodio) al 1% a 65°C. Por ejemplo, las condiciones moderadas incluyen hibridación con amortiguador de tamizaje de placa, sulfato de dextrana al 10% y 110 µg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, desnaturalizado a 55°C durante 12 a 20 horas y lavado con 300 mM de NaCl/30 mM de citrato de sodio (2.0 X SSC) /SDS al 1% a 55°C. Ver también, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, Secciones 6.3.1-6.3.6 (1989) . "Secuencia de control de expresión", una secuencia de polinucleótidos que controlan y regulan la expresión de genes cuando están funcionalmente enlazados a esos genes. "Funcionalmente enlazados", una secuencia de polinucleótidos (ADN, ARN) está funcionalmente enlazada a P1261 una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótidos. El término "funcionalmente enlazado" incluye el tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) al frente de la secuencia de polinucleótidos que se exprese y conserve el marco de lectura correcto que permita la expresión de la secuencia de polinucleótidos bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótidos . "Vector de expresión", un polinucleótido, por ejemplo, un plásmido de ADN o fago (entre otros ejemplos comunes) que permite al menos la expresión de un gen cuando se introduce el vector de expresión en una célula hospedero. El vector puede o no ser capaz de replicarse en una célula. "Aislado" (utilizado en forma indistinta con "prácticamente puro"), cuando se aplica a un ácido nucleico, es decir, secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos, se refiere a un polinucleótido ARN o ADN, una porción de polinucleótido genómico, ADNc o un polinucleótido sintético que por su origen o manipulación: (i) no está asociado con todo el polinucleótido como lo está en forma natural (por ejemplo, está presente en una P1261 célula hospedero como un vector de expresión o una porción del mismo) ; o (ii) está enlazado a un ácido nucleico u otra unidad química distinta de la unidad a la que está enlazado en forma natural; o (iii) no se presenta en la naturaleza. "Aislado" se refiere también a una secuencia polinucleotídica que está: (i) amplificada in vitro, por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) ; (ii) sintetizada químicamente; (iii) producida por vía recombinante por clonación; o (iv) purificada, por ejemplo, por hidrólisis y separación en gel. Así, "ácido nucleico prácticamente puro" es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo a una o ambas secuencias codificantes a las cuales por lo general está contiguo en el genoma que se encuentra en forma natural del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. El ADN prácticamente puro incluye también un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias adicionales. "Aislado" (utilizado en forma indistinta con "prácticamente puro"), cuando se aplica a polipéptidos se refiere a un polipéptido o una porción del mismo, que debido a su origen o manipulación: (i) está presente en una célula hospedero como el producto de expresión de una porción de un vector de expresión; o (ii) está enlazado a una proteína u otra unidad química distinta de la unidad a P12S1 la que está enlazado en forma natural; o (iii) no se presenta en la naturaleza. "Aislado" también se refiere a una proteína que está: (i) sintetizada químicamente; o (ii) se expresa en una célula hospedero y se purifica separándola de sus proteína asociadas. El término por lo general se refiere a un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los que se encuentra en forma natural. De preferencia, el polipéptido también está separado de substancias como anticuerpos o matrices de gel (poliacrilamida) utilizadas para purificarlo. "Promotor heterólogo", en el sentido en el que se utiliza en la presente, es un promotor que no está asociado en forma natural con un gen o un ácido nucleico purificado. "Homólogo", en el sentido en el que se utiliza en la presente, es sinónimo del término "identidad" y se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas polipeptídicas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición de las secuencias que se comparan está ocupada por la misma subunidad monomérica base o aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina) , entonces las respectivas moléculas son homologas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de coincidencias o posiciones P1261 homologas compartidas por las dos secuencias, dividido entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son coincidentes u homologas, entonces las dos secuencias son 60% homologas. Como ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten 50% de homología (3 de las 6 posiciones son coincidentes) . Por lo general, se hace una comparación cuando dos secuencias están alineadas para dar homología máxima. Dicha alineación se puede proporcionar utilizando, por ejemplo, el método de Needleman et al., J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), implementado en forma adecuada mediante programas de cómputo como el programa Align (DNAstar, Inc.). Las secuencias homologas comparten residuos de aminoácidos similares o idénticos, en donde los residuos similares son substituciones conservativas por residuos de aminoácidos correspondientes o "mutaciones puntuales permitidas" de los mismos en una secuencia de referencia alineada. Al respecto, una "sustitución conservativa" de un residuo en una secuencia de referencia, se refiere a aquellas sustituciones que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, por ejemplo, que son similares en cuanto a forma, tamaño, carga eléctrica, propiedades químicas, incluida la habilidad para formar enlaces de hidrógeno o covalentes o lo semejante. Sustituciones conservativas que en especial P12S1 se prefieren, son aquellas que satisfacen los criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" en Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Supl . 3, Capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978) . Los términos "secuencia polinucleotídica" y "secuencia nucleotídica" también se usan aquí en forma indistinta. Los términos "neovascularización" y "angiogénesis" en el sentido más amplio se refieren al restablecimiento de nuevos vasos sanguíneos. En particular, "angiogénesis" también se refiere al restablecimiento de nuevos vasos sanguíneos en un sitio tumoral . "IFNAR2", "IFNAR1", "IFNARl/2" se refieren a las proteínas que se sabe constituyen el receptor de interferón tipo I de superficie celular. La porción extracelular (ectodominio) de la cadena IFNAR2 sola puede unirse al interferón alfa o beta. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo de tejidos, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e inmunología, las cuales son parte de la experiencia en la técnica. Estas técnicas se describen en la literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A P1261 Laboratory Manual, 2a Ed. (Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Vols. I y II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195 (Mullís et al.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed.), Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (Wu et al., eds.), Academic Press, Nueva York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds.), 1987, Cold Spring harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Waiker, eds.), Academic Press, Londres 1987; Handbook of Experimental I munology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring harbor Laboratory Press.

II . Producción y expresión de proteínas de fusión La presente invención se relaciona con un sistema para la generación de proteínas de fusión de interferón beta-la. En particular, la presente invención se relaciona con estas proteínas y también con las moléculas de ADN P1261 recombinante utilizadas en su producción. La producción de los polipéptidos de esta invención se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, es posible producir interferón beta-la de longitud completa o formas truncas de interferón beta-la, mediante técnicas de ADN recombinante conocidas que utilizan ADNc (ver más adelante) . Se puede diseñar un gen que codifica el polipéptido interferón beta-la deseado, con base en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado. Luego se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar el gen. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos se puede utilizar para construir un gen traducido a la inversa. Un oligómero de ADN que contiene una secuencia nuleotídica capaz de codificar para interferón beta-la, puede hacerse en una sola etapa. De manera alternativa, se pueden sintetizar varios oligonucleótidos más pequeños que codifican para porciones del interferón beta-la deseado y luego ligarse juntos. De preferencia, la secuencia de ADN que codifica la unidad de interferón beta-la se generará en forma de varios oligonucleótidos separados que se enlazan posteriormente.

(Ver Ejemplo 2) . Los oligonucleótidos separados por lo general contienen colas de hebra simple en 5 ' o en 3 ' para ensamblado de complementariedad.

P1261 Una vez ensamblados, los genes preferidos se caracterizarán por secuencias que son reconocidas por endonucleasas de restricción (que incluyen sitios de restricción únicos para ensamblado directo en un vector de expresión o clonación) , codones preferidos tomando en consideración el sistema de expresión del hospedero que se va a utilizar (de preferencia una célula de mamífero) y una secuencia que cuando se transcribe, produce un ARN estable traducido en forma eficiente. El ensamblado adecuado se puede confirmar mediante secuenciación nucleotídica, mapa de restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en un hospedero adecuado. Es posible aislar ADNcs de interferón beta de mamífero mediante el uso de una secuencia de ADN de interferón beta humano como una sonda para seleccionar una biblioteca de ADNc de mamífero particular mediante hibridación por cruzamiento de especie. El interferón beta de mamífero utilizado en la presente invención incluye, por ejemplo, interferón beta de primate, humano, murino, canino, felino, bovino, equino y porcino. El interferón beta de mamífero se puede obtener mediante hibridación por cruzamiento de especie, utilizando un ADNc de hebra simple derivado de la secuencia de ADN de interferón beta humano como una sonda de hibridación para aislar ADNcs de interferón beta a partir de bibliotecas de ADNc de mamífero. Entre los métodos que pueden utilizarse para aislar y clonar secuencias genéticas de interferón, están los que se encuentran en las Patentes de los Estados Unidos mencionadas antes. Sin embargo, es de importancia particular lo que se expone en la Patente de los Estados Unidos No. 4,738,931 (19 de abril de 1988) que describe 7?DN que contiene un gen de interferón beta humano. La presente invención también se relaciona con moléculas de ADN recombinante que comprende las secuencias de ADN anteriormente mencionadas. Las moléculas de ADN recombínante de esta invención son capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos de la invención en hospederos transformados con las mismas. Una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido de fusión de la invención, debe estar funcionalmente enlazado a una secuencia de control de expresión para dicha expresión. A fin de proporcionar una transcripción adecuada de las construcciones recombinantes de la invención, de preferencia se puede incorporar al vector recombinante una adecuada secuencia promotor/intensificador, siempre que la relación promotor/secuencia de control de expresión, sea capaz de conducir la transcripción de una secuencia nucleotídica que codifica un interferón beta glicosilado. Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión de la proteína de fusión a base de P1261 inmunoglobulina, incluyen en forma no exclusiva, la región promotora temprana SV40 (Benoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3 ' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:144-1445), las secuencias reguladoras del gen metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión vegetales que comprenden la región promotora hopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) o el promotor ARN 35S del virus mosaico de la coliflor (Gardner et al., 1981, Nucí. Acids Res. 9:2871) y el promotor para la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores provenientes de levaduras u otros hongos como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa) , promotor PGK (fosfoglicerol cinasa) , promotor fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional animales, que exhiben especificidad tisular y que se han utilizado en animales, transgénicos: región de control del gen de elastasa I que es activa en células pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; Mac Donald, 1987, Hepatology 7:425-515); activadores o promotores del P12S1 gen de insulina que son activos en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); activadores o promotores del gen de inmunoglobulina que son activas en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); las regiones promotoras y activadoras tempranas del citomegalovirus (Boshart et al., 1985, Cell 41:521-530); región de control del virus tumoral mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y cebadas (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); región de control del gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel, 1:268-276); región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel, 1:161-171); región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94; región de control del gen de proteína básica mielina que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región de control génico de la cadena ligera 2 de miosina que es activa en músculo esquelético P12S1 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science 234:1372-1378). Los sistemas de expresión procarióticos como el LAC o el promotor beta lactamasa (Villa-Kamaroff , et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3727-3731) no son los preferidos en la presente puesto que el interferón beta expresado no estará glicosilado. Sin embargo, los sistemas de expresión procarióticos que permitan la glicosilación del interferón beta ya sea en hospederos procarióticos o eucarióticos están comprendidas dentro del alcance de la invención. Los vectores de expresión que se pueden utilizar, incluyen en forma no exclusiva, los siguientes vectores o sus derivados: virus de humanos o de animales como los vectores basados en virus vaccinia, adenovirus o retrovirus; virus de insectos como baculovirus; vectores de levaduras; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN cósmido y plásmido por nombrar unos pocos. Específicamente, los vectores de expresión útiles para los hospederos eucarióticos preferidos incluyen vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, papilomavirus bovino, citomegalovirus. Además, dentro de cada vector de expresión específico, se pueden seleccionar varios sitios para la inserción de estas P1261 secuencias de ADN. Es común que estos sitios se designen por la endonucleasa de restricción que los corta. Son muy conocidos por los expertos en la técnica. Se comprenderá que un vector de expresión dado, que sea útil en la presente invención, no necesita tener un sitio de endonucleasa de restricción para la inserción del fragmento de ADN elegido. En lugar de esto, el vector puede unirse mediante el fragmento por medios alternos . El vector de expresión y el sitio elegido para la inserción de un fragmento de ADN seleccionado y la unión funcional a una secuencia de control de expresión, se determina por una variedad de factores como : el número de sitios susceptibles a una enzima de restricción particular, el tamaño del polipéptido, la facilidad con la que el polipéptido se degrada proteolíticamente y lo semejante. La elección de un vector y el sitio de inserción para un ADN dado se determina mediante un balance de estos factores . Las construcciones recombinantes de la invención se pueden introducir en células hospedero que sean capaces de expresar la proteína de fusión mediante el uso de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluida la transformación (por ejemplo, utilizando técnicas DEAE-dextrana o fosfato de calcio) , transfección, microinyección, infección, disparo celular y electroporación. Es posible utilizar cualquier tipo de P12S1 célula hospedero, siempre que las secuencias de ácido nucleico recombinante de la proteína de fusión, se transcriban en forma adecuada a un ARNm en ese tipo de célula y que la célula pueda glicosilar la proteína. Además, se pueden utilizar las construcciones de ácido nucleico recombinante de la invención para crear animales transgénicos no humanos con la capacidad de producir la proteína de fusión basada en inmunoglobulina. En modalidades preferidas de la invención, la célula hospedero es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula COS o CHO. La incorporación satisfactoria de estas construcciones de polinucleótidos en un vector de expresión dado se puede identificar por medio de tres enfoques generales: (a) hibridación ADN-ADN, (b) presencia o ausencia de funciones genéticas "marcadoras" y (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia del gen de interferón beta-la insertado en un vector de expresión, se puede detectar por hibridación ADN-ADN mediante el uso de sondas que comprenden secuencias que son homologas al gen de la proteína de fusión insertado. En el segundo enfoque, el sistema vector recombinante/hospedero se puede identificar y seleccionar con base en la presencia o ausencia de ciertas funciones genéticas "marcadoras" (por ejemplo, actividad de timidina P126X cinasa, resistencia a antibióticos como G418, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.) originadas por la inserción de genes ajenos en el vector. Por ejemplo, si el polinucleótido se inserta para interrumpir una secuencia genética marcadora del vector, se pueden identificar los recombinantes que contienen el inserto por la ausencia de la función genética marcadora. En el tercer enfoque, los vectores de expresión recombinantes se pueden identificar mediante ensayo del producto genético ajeno expresado por el vector recombinante. Por ejemplo, dichos ensayos, pueden estar basados en las propiedades físicas o funcionales del producto genético en sistemas de bioensayo. Se comprenderá que no todas las combinaciones hospedero/vector de expresión funcionarán con la misma eficiencia al expresar secuencias de ADN que codifican los polipéptidos de esta invención. Sin embargo, los expertos en la técnica podrán hacer una selección particular de la combinación hospedero-vector de expresión, después de considerar los principio expuestos aquí sin desviarse del alcance de la invención. La modalidad preferida de la invención prevé proteínas de fusión y secuencias de ADN que codifican para esas proteínas. Estas proteínas de fusión tienen una región amino terminal caracterizada por la secuencia de P1261 aminoácidos del interferón beta-la y una región carboxi terminal que comprende un dominio de proteína distinta del interferón beta-la. Una fórmula genérica preferida para una proteína de este tipo es una proteína que tiene una secuencia primaria de aminoácidos X-Y-Z, en donde X es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos o una porción del mismo, que consiste de la secuencia de aminoácidos del interferón beta humano; Y es una unidad enlazante opcional; y Z es un polipéptido que comprende por lo menos una porción de un polipéptido distinto del interferón beta humano. En una modalidad, la unidad Z puede ser una porción de un polipéptido que contiene dominios tipo inmunoglobulina. Ejemplos de esos otros polipéptidos incluyen CDl, CD2 y CD4 y miembros de los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad clase I y clase II. Ver ejemplos de estos polipéptidos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,565,335 (Capón et al . ) . La unidad Z puede incluir, por ejemplo, una pluralidad de residuos de histidina o de preferencia, la región Fc de una inmunoglobulina. "Fc" se define aquí como un fragmento de un anticuerpo que contiene el dominio C terminal de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En las proteínas de fusión que más se prefieren, el polipéptido interferón beta-la está fusionado a través de su terminal C por lo menos a una porción de la región Fc P1261 de una inmunoglobulina. El interferón beta-la forma la porción amino terminal y la región Fc forma la porción carboxi terminal. En estas proteínas de fusión, la región Fc de preferencia está limitada a la región bisagra de dominio constante y los dominios CH2 y CH3. La región Fc en estas fusiones también puede estar limitada a una porción de la región bisagra, la porción que es capaz de formar puentes disulfuro intermoleculares y a los dominios CH2 y CH3 o los equivalentes funcionales de los mismos. Las regiones constantes pueden derivarse de cualquier fuente de mamífero (de preferencia humano) y pueden derivarse de cualquier clase y/o isotipo apropiados, incluidas las IgA, IgD, IgM, IgE e IgGl y IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. Las moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican las fusiones Ig pueden obtenerse por cualquier método conocido en la técnica (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, N.Y.) u obtenerse de clones disponibles al público. Los métodos para la preparación de genes que codifican las regiones constantes de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas las muestra, por ejemplo, Robinson R. et al., Solicitud PCT, Publicación No. WO87-02671. La secuencia de /ADNc que codifica la molécula o fragmento de interferón puede unirse directamente al ADNc que codifica las regiones constantes pesadas de Ig o puede P12S1 unirse a través de una secuencia enlazante. En otras modalidades de la invención, se puede crear un sistema de vector recombinante para acomodar secuencias que codifican para interferón beta en el marco de lectura correcto con una región bisagra sintética. Además, sería conveniente incluir, como parte del sistema de vector recombinante, ácidos nucleicos que correspondan a la región flanqueante 3 ' de un gen de inmunoglobulina que incluya los sitios de desdoblamiento de ARN/poliadenilación y las secuencias en dirección al extremo 3'. Además, sería deseable manipular una secuencia señal en dirección al extremo 5 ' de las secuencias codificantes de la proteína de fusión inmunoglobulina con el fin de facilitar la secreción de la molécula fusionada a partir de una célula transformada con el vector recombinante. La presente invención proporciona moléculas de fusión diméricas, así como moléculas monoméricas o multiméricas que comprenden proteínas de fusión. Estos multímeros pueden generarse mediante la utilización de aquellas regiones Fc o porciones de las mismas, de moléculas de Ig que por lo general son multivalentes como los pentámeros de IgM o los dímeros de IgA. Se entiende que es posible que se necesite un polipéptido de cadena J para formar y estabilizar pentámeros de IgM y dímeros de IgA. De manera alternativa, se pueden formar multímeros de P12S1 proteínas de fusión de interferón beta-la utilizando una proteína con afinidad por la región Fc de moléculas Ig, como la Proteína A. Por ejemplo, se pueden unir una pluralidad de proteínas de fusión interferón beta-la/inmunoglobulina a perlas de Proteína A-agarosa. Estas formas polivalentes son útiles puesto que poseen múltiples sitios de unión a receptor del interferón beta. Por ejemplo, un interferón beta-la divalente soluble puede consistir de dos secuencias repetidas en tándem de aminoácidos 1 a 166 de SEQ ID NO: 2 (o aquellas codificadas por ácidos nucleicos numerados de 1 a 498 de SEQ ID NO:l) (unidad X en la fórmula genérica) separadas por una región enlazante (unidad Y) , las secuencias de repetición se unen por lo menos a una porción de un dominio constante de inmunoglobulina (unidad Z) . También se pueden construir formas polivalentes alternas, por ejemplo, mediante acoplamiento químico de fusiones interferón beta-la/lg con cualquier molécula portadora clínicamente aceptable, un polímero seleccionado del grupo que consiste de Ficoll, polietilenglicol o dextrano, mediante el uso de técnicas de acoplamiento convencionales. De manera alternativa, el interferón beta-la se puede acoplar químicamente a biotina y el conjugado biotina-interferón beta-la se une entonces a la avidina, lo que da origen a moléculas tetravalentes avidina/biotina/interferón beta-la. Las fusiones interferón P1261 beta-la/lg también se pueden acoplar en forma covalente al dinitrofenol (DNP) o al trinitrofenol (TNP) y el conjugado que se obtiene se precipita con anti-DNP o anti-TNP-IgM, para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10 para sitios de unión a receptor de interferón beta. Las proteínas interferón beta-la, fragmentos y proteínas de fusión de la invención se pueden aislar y purificar según condiciones convencionales, por ejemplo, extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía por afinidad, electroforesis y lo semejante. Por ejemplo, las proteínas de interferón y fragmentos pueden purificarse al pasar una solución de las mismas a través de una columna que tenga sobre sí un receptor de interferón inmovilizado (ver Patente de los Estados Unidos No. 4,725,669) . La molécula de interferón que se une, luego puede eluirse mediante un tratamiento con sal caotrópica o por elución con ácido acético acuoso. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina pueden purificarse al pasar una solución que contenga la proteína de fusión a través de una columna que contiene Proteína A o Proteína G inmovilizadas, las cuales se unen de manera selectiva a la porción Fc de la proteína de fusión. Ver, por ejemplo, Reis, K.J., et al., J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); Solicitud PCT, Publicación No. W087/00329. El anticuerpo quimérico puede eluirse entonces por tratamiento con una sal caotrópica o por elución con ácido acético acuoso. De manera alternativa, las proteínas de interferón y las moléculas de fusión con inmunoglobulina pueden purificarse en columnas de anticuerpos anti-interferón o en columnas de anticuerpos anti-inmunoglobulina para dar proteína substancialmente pura. El término "substancialmente pura" quiere decir que la proteína está libre se las impurezas que se asocian con la misma en forma natural. La pureza substancial se puede evidenciar por medio de electroforesis, a través de una sola banda. Un ejemplo de una proteína de fusión interferón beta-la/lg que es útil en esta invención, es la de SEQ ID N0:2, que se segrega en un cultivo celular de células eucarióticas que contienen el plásmido de expresión pCMG261 (ver Ejemplo 2) . Esta proteína consta de interferón beta-la humano maduro, fusionado con una porción de la región bisagra y los dominios constantes CH2 y CH3 de Ig murina.

Esta contiene una porción suficiente de la inmunoglobulina murina para ser reconocida por la proteína de unión a Fc, Proteína A. Se muestran otras proteínas de fusión de la invención que incorporan el interferón beta-la humano: (a) en SEQ ID NOS : 3 y 4 para el ADNc y las secuencias de aminoácidos deducidas, con respecto a una fusión de P1261 interferón beta-la marcado con histidina (que también se muestra en la Figura 1) y (b) en SEQ ID NO: 1 para el ADNc que codifica la proteína de fusión interferón beta-la/lg de SEQ ID NO : 2 (que también se muestra en la Figura 2) . Las proteínas de interferón beta-la preferidas de la invención incluyen la novedosa secuencia de ADN de "empalme" SEQ ID NO: 5 y aminoácido SEQ ID NO: 6. La SEQ ID NO: 5 representa los 11 codones de tripletes en cada lado del empalme entre el ADN del interferón beta humano y el ADN que codifica una región constante de inmunoglobulina humana (ver Ejemplo 5: SEQ ID NOS: 41 y 42). Específicamente, en la SEQ ID NO: 5, el ADN que codifica para el interferón beta-la humano termina en el triplete de nucleótidos 568-570 (AAC) y el ADN que codifica para una región constante de IgGl humana inicia en el triplete (GAC) que comienza con el nucleótido número 574 de SEQ ID NO: 41. La secuencia de "empalme" de aminoácidos deducida correspondiente se representa en SEQ ID NO: 6 y está basada en la SEQ ID NO:42. Se define otra secuencia de "emplame" única que incluye una secuencia enlazante en la construcción de ADN final (Ver Ejemplo 5: SEQ ID NOS:43 y 44) . Este ADN de "empalme" y la secuencia de aminoácidos se representan en la SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente, que muestran los 11 codones de tripletes en cada lado del empalme directamente entre el extremo del la secuencia de P12S1 interferón beta-la (nucleótido número 570 en SEQ ID NO: 43) y la secuencia enlazante (nucleótidos 571 a 585 en SEQ ID NO: 43; GGGGS en SEQ ID NO: 8) . Las secuencias "empalme" de 7?DN se pueden usar como sondas de ADN y pueden ser el ADN mínimo necesario para hibridación en condiciones estándar a cualquier secuencia de ADN que codifica para cualquier proteína de fusión interferón beta-la/lg. Sin embargo, siempre que la sonda completa se hibride en ambos lados del empalme y que ambos lados del empalme interferón beta/región constante participen en la hibridación, es posible que existan secuencias más pequeñas. Además, las personas con experiencia ordinaria en la técnica comprenderán que las secuencias de ADN mayores a SEQ ID NO: 5 ó 7 también serán adecuadas para la hibridación. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede probar si una sonda particular como las SEQ ID NO: 5 ó 7 tienen la capacidad de hibridarse en los dos lados del empalme al marcar el extremo 5 ' de cada oligonucleótido de sentido de hebra única o un oligonucleótido antisentido de hebra única con un fosfato de ATP marcado en forma adecuada utilizando una polinucleótido cinasa. Una secuencia de la invención se debe hibridar a las dos sondas de oligonucleótidos y de este modo marcarse por las mismas. Por otra parte se entiende que la invención abarca secuencias degeneradas por P1261 completo que codifican el empalme SEQ ID NO: 5 ó 7.

III. Otras variantes de polipéptidos de fusión de interferón Los derivados de proteínas de la invención también incluyen varias formas estructurales de la proteína primaria, que conservan la actividad biológica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, la proteína de fusión de interferón beta puede estar en forma de sales básicas o acidas o puede estar en forma neutra. Los residuos de aminoácidos individuales también se pueden modificar por oxidación o reducción. Además, la estructura primaria de aminoácidos (incluidos los extremos N terminal y/o C terminal) o el glicano del interferón beta-la puede modificarse ("derivarse") al formar conjugados covalentes o de agregación con otras unidades químicas, por ejemplo, grupos glicosilos, polímeros de polialquilenglicol como polietilen glicol (PEG: ver la solicitud co-pendiente y cedida conjuntamente Serie No. 60/104,491 y 60/720,237), lípidos, fosfato, grupos acetilo y lo semejante o al generar secuencias mutantes de aminoácidos . Otros derivados de interferón beta-la/lg incluyen derivados covalentes o de agregación de interferón beta o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, por P1261 ejemplo, mediante síntesis en cultivo recombinante, como N terminales o C terminales adicionales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica señal (o guía) en la región N terminal de la proteína la cual en forma cotraduccional o postraduccional dirige la transferencia de la proteína de su sitio de síntesis a su sitio de función, dentro o fuera de la membrana o pared celular (por ejemplo, la guía del factor alfa de levadura) . Las proteínas del receptor de interferón beta pueden estar constituidas por péptidos adicionados que facilitan la purificación o identificación del interferón beta (por ejemplo, fusiones histidina/interferón beta-la) . La secuencia de aminoácidos de interferón beta también se puede enlazar al péptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Esta última secuencia es bastante antigénica y proporciona un epítopo unido en forma reversible mediante un anticuerpo monoclonal específico, que permite un ensayo rápido y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia también se desdobla de manera específica por medio de enterocinasa de mucosa de bovino en el residuo inmediato siguiente del par Asp-Lys. Otros análogos incluyen proteína de fusión interferón beta Fc o sus fragmentos con actividad biológica cuyas secuencias de interferón beta se distinguen de las P1261 que se muestran en SEQ ID N0:2, 4, 6 u 8 en una o más sustituciones de aminoácidos conservativos, en una o más sustituciones de aminoácidos no conservativos o por deleciones o inserciones que no anulan la actividad biológica de la proteína aislada. Las sustituciones conservativas por lo general incluyen la sustitución de un aminoácido por otro con características similares, por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Otras sustituciones conservativas pueden ser deducidas con facilidad por personas con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, puede efectuarse una sustitución conservativa a partir de cualquiera de los aminoácidos D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para lisina, un reemplazo puede ser a partir de P1261 cualquiera entre D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-orinitina. Por lo general, las sustituciones de las que se espera que induzcan cambios en las propiedades funcionales de polipéptidos aislados son aquellas en las que: (i) un residuo polar, por ejemplo, serina o treonina, se sustituyen por (o con) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo cisteína se substituye por (o con) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se sustituye por (o con) un residuo que también una cadena lateral electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, la fenilalanina se sustituye por (o con) uno que no tenga cadena lateral, por ejemplo, glicina. Se incluyen en la invención moléculas aisladas que son: variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos, proteínas codificadas por ADN que se hibrida en condiciones bastante estrictas o moderadas a un ácido nucleico que codifica un polipéptido, por ejemplo, SEQ ID NOS: 2, 4, 6 u 8. Se desarrollaron mutantes de interferón beta-la que son otras variantes de la unidad interferón beta-la de la invención. Estas unidades interferón beta-la pueden ser útiles en especial, puesto que presentan propiedades novedosas que no se encuentran en el interferón beta-la tipo silvestre (ver Ejemplo 1) . En forma breve, se realizó un análisis mutacional del interferón beta-la humano con el propósito de localizar los residuos requeridos para la actividad y la unión a receptor. La disponibilidad de la estructura cristalina 3-D del interferón beta-la humano (ver Karpusas et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. 94:11813-11818) permite identificar, las sustituciones para alanina (o serina) , los residuos expuestos a disolvente disponibles para las interacciones del receptor de interferón beta y conservar los aminoácidos implicados en enlaces intramoleculares. Se diseñó un conjunto de quince mutaciones que rastrean alanina que se reemplazaron entre dos y ocho residuos a lo largo de distintas regiones de las hélices (A, B, C, D, E) y los bucles (ABl, AB2 , AB3 , CDl, CD2, DE1, DE2) de interferón beta-la. Ver Ejemplo 1. Se incluyó una etiqueta de histidina aminoterminal (etiqueta "his") para la purificación por afinidad de mutantes expresados en células de mamífero (SEQ ID NO: 2: Figura 1) . Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se evaluaron en ensayos antivirales y antiproliferación. Se desarrolló un ensayo de unión no radioactiva, con el fin de analizar estos mutantes con respecto a su unión al receptor celular de superficie del P1261 interferón beta (receptor de superficie celular IFNARl/2) . Además, se utilizó un ensayo basado en ELISA que emplea una proteína de fusión ectodominio de IFNAR2/Fc para unir el interferón, a fin de localizar las interacciones de superficies entre el interferón beta-la y el IFNAR2 (ver Ejemplo 1) . Estos análisis mutacionales demostraron que las terminales N- y C- se sitúan en una porción de la molécula de interferón beta que no es importante para la unión a receptor o la función biológica. Se han identificado tres tipos de efectos ocasionados por mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser ventajosos para el desarrollo de medicamentos de interferón en ciertas circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a) mutantes con actividad antiviral mayor a la del interferón beta-la tipo silvestre (por ejemplo, mutante Cl) ; (b) mutantes que presentan actividad tanto en ensayos antivirales como antiproliferación, pero para los cuales la actividad antiproliferación es desproporcionadamente baja con respecto a la actividad antiviral, en comparación con el - his-interferón beta tipo silvestre (por ejemplo, mutantes Cl, D y DEl) , y (c) antagonistas funcionales (por ejemplo, Al, B2 , CD2 y DEl), que muestran actividades antivirales y antiproliferativas que son desproporcionadamente bajas con respecto a la unión a receptor, en comparación con el his- P1261 interferón beta-la tipo silvestre. Además, el acoplamiento entre la unidad interferón beta-la (X) y la segunda unidad, que no es interferón beta-la, Z (por ejemplo, una región Fc de una inmunoglobulina) , también se puede llevar a cabo por medio de cualquier reacción química que una a las dos moléculas, siempre que la inmunoglobulina y el interferón beta-la conserven sus actividades respectivas. Este enlace químico puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión de coordinación y formación de complejos. Los agentes de acoplamiento representativos (es decir enlazantes "Y" en la fórmula genérica) que desarrollan unión covalente entre las unidades interferón beta-la y la inmunoglobulina, pueden incluir compuestos orgánicos como tioésteres, carbodiimidas, esteres de succinimida, diisocianatos como tolilen-2 , 6-diisocianato, glutaraldehídos, diazobencenos y hexametilen diaminas como bis- (p-diazonio-benzoil) -etilendiamina, derivados bifuncionales de imidoésteres como dimetil adipimidato y compuestos de flúor bis-activos como 1, 5-diflúor-2 , 4-dinitrobenceno. Esta lista no pretende ser exhaustiva para las diversas clases de agentes de acoplamiento químico que se conocen en la técnica. Muchos de estos se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, propionato de N-succinimidil-3- (2-pirididiltio) P1261 (SPDP), clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilamino-propil) carbodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio) -tolueno (SMPT: Pierce Chem. Co. , Cat.#21558G) .

IV. UTILIDAD DE LA INVENCIÓN Las proteínas de fusión de esta invención se pueden utilizar en composiciones terapéuticas cuando se requiera terapia con interferón beta. Estas moléculas tienen las ventajas normales que se asocian con las proteínas de fusión, en particular fusiones Ig; en especial, una farmacocinética y farmacodinámica que conduce a un aumento en la vida media y un aumento en el tiempo de residencia en la vasculatura. Además, las proteínas interferón beta-la glicosilado que se prefieren en particular, aunque similares en estructura al interferón beta-Ib, son mucho más activas biológicamente que el interferón beta-Ib no glicosilado. Ver, Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15:641-649. Se ha encontrado que los productos de la invención son útiles para mantener la vida media del interferón beta-la terapéutico y se pueden preparar para administración terapéutica, por ejemplo, al disolverlos en agua o en un medio líquido aceptable. La administración es por vía parenteral, aerosol u oral. Se pueden preparar P12G1 suspensiones coloidales finas para administración parenteral a fin de producir un efecto de depósito o para vía oral, mientras que la formulación en aerosol puede ser de naturaleza líquida o polvo seco. En el estado seco, liofilizado o en formulaciones en solución, las fusiones de interferón beta-la de la presente invención deben tener buena estabilidad en almacenamiento. Las proteínas terapéuticas de la presente invención se pueden utilizar para la profilaxis o tratamiento de cualquier condición o enfermedad para las cuales el interferón beta-la es eficaz. Además, las proteínas de fusión de la presente invención se pueden utilizar en diagnóstico de constituyentes, condiciones o estados de enfermedad en sistemas o muestras biológicos, así como para fines de diagnóstico en sistemas no fisiológicos . En el uso terapéutico, la presente invención prevé un método para tratar un sujeto animal que tiene o en forma latente es susceptible a esas condiciones o estados de enfermedad y que necesita del tratamiento, que comprende administrar a ese animal una cantidad eficaz de una proteína de fusión de la presente invención que sea terapéuticamente eficaz para esa condición o estado de enfermedad. Los sujetos que se van a tratar mediante las fusiones de la presente invención, incluyen sujetos P1261 mamíferos y con preferencia superlativa sujetos humanos. Dependiendo de la condición o estado de enfermedad específicos que se van a combatir, a los sujetos animales se les puede administrar proteínas de fusión de interferón beta-la de la invención en cualquier dosificación terapéuticamente eficaz y segura, que puede ser determinada con facilidad por los expertos en la técnica sin excesiva experimentación. Debido a las barreras de especie de los interferones tipo I, puede ser necesario generar proteínas de fusión de interferón tal como se describe aquí, con interferones provenientes de la especie apropiada. Es muy conocida la actividad antiproliferación celular del interferón beta-la. En particular, algunas de las fusiones de interferón beta-la que se describen aquí, son útiles para tratar tumores y diferentes tipos de cáncer, por ejemplo, sarcoma osteogénico, linfoma, leucemia linfocítica aguda, carcinoma de mama, melanoma y carcinoma nasofaríngeo y también condiciones autoinmunes como fibrosis, lupus y esclerosis múltiple. Además se espera que la actividad antiviral que muestran las proteínas de fusión, en especial ciertas muteínas de interferón beta-la descritas aquí, pueda utilizarse en el tratamiento de enfermedades virales, por ejemplo, infección ECM, influenza y otras infecciones de las vías respiratorias, rabia y hepatitis. También se espera que las actividades P1261 inmunomoduladoras del interferón beta-la que presentan las proteínas descritas aquí, pueda utilizarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, como fibrosis y esclerosis múltiple. La habilidad de los interferones para inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis y neovascularización) permiten que las proteínas de la invención se utilicen en para tratar enfermedades angiogénicas, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía prematura, degeneración macular, rechazo de injerto córneo, glaucoma neovascular, fibroplastia retrolental, rubeosis y síndrome de Osler-Webber. Además, la actividad antiendotelial del interferón se conoce desde hace tiempo y un mecanismo potencial de la acción del interferón puede ser interferir con la actividad celular endotelial al inhibir la producción o la eficacia de factores angiogénenicos producidos por células tumorales. Algunos tumores vasculares, por ejemplo los hemangiomas, son en especial sensibles al tratamiento con interferón. El tratamiento con interferón alfa es el único tratamiento documentado para esta enfermedad. Se espera que el tratamiento con las proteínas de fusión de interferón beta-la de la invención ofrezca beneficios farmacéuticos considerables en términos de farmacocinética y farmacodinámica, puesto que se espera que el conjugado permanezca en la vasculatura durante un período de tiempo P1261 más largo que los interferones no conjugados, lo cual conduce a una terapia más eficiente y eficaz para emplearse como un agente antiangiogénico. Ver Ejemplo 9. Las fusiones polímero-interferón beta-la de la invención pueden administrarse como tal, así como en forma de esteres y sales farmacéuticamente aceptables y otros derivados fisiológicamente funcionales de los mismos. En estas formulaciones farmacéuticas y de medicamentos, el interferón beta-la de preferencia se utiliza junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y de manera opcional cualquier otro ingrediente terapéutico. Los vehículos deben ser farmacéuticamente aceptables en sentido de que sean compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no indebidamente nocivos para el receptor de los mismos. El interferón beta-la se suministra en una cantidad eficaz para lograr el efecto farmacológico que se desea, según se describió antes y en una cantidad apropiada para lograr la dosis diaria conveniente. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración parenteral así como no parenteral y las modalidades de administración específicas incluyen la administración oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoidea, bronquial, linfática, vaginal e P12S1 intrauterina. Se prefieren las formulaciones adecuadas para administración oral, nasal y parenteral. Cuando el interferón beta-la se utiliza en una formulación que comprende una solución líquida, la formulación se puede administrar en forma conveniente por vía oral o parenteral. Cuando el interferón beta-la se emplea en una formulación en suspensión líquida o como un polvo en una formulación con vehículo biocompatible, la formulación se puede administrar en forma conveniente por vía oral, rectal o bronquial. Cuando el interferón beta-la se utiliza directamente en la forma de un sólido pulverizado, el interferón beta-la se puede administrar en forma conveniente por vía oral. De manera alternativa, se puede administrar por vía nasal o bronquial, a través de la nebulización del polvo en un gas portador, para formar una dispersión gaseosa del polvo la cual es aspirada por el paciente desde un circuito de respiración que comprende un dispositivo nebulizador adecuado. Las formulaciones que comprenden las proteínas de la presente invención, pueden presentarse en forma conveniente como dosis unitarias y se pueden preparar por cualquiera de los métodos muy conocidos en la técnica de farmacia. Estos métodos por lo general incluyen el paso que consiste en asociar el ingrediente activo con un vehículo P12S1 constituido por uno o más ingredientes adicionales . Por lo general, las formulaciones se preparan al asociar en forma íntima y uniforme el ingrediente o ingredientes activos con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o con los dos y si es necesario, convertir el producto en formas de dosificación de la formulación deseada. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral se pueden presentar como unidades discretas, por ejemplo, cápsulas, cachets, tabletas o trociscos, cada una con un contenido de una cantidad predeterminada de los ingredientes activos como polvo o granulos; o una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso, por ejemplo, un jarabe, un elíxir, una emulsión o una poción. Una tableta se puede hacer por compresión o por moldeo, con uno o más ingredientes adicionales opcionales. Las tabletas comprimidas se pueden preparar en un equipo de compresión adecuado, con el compuesto activo en forma de libre flujo como polvo o granulos, los cuales opcionalmente se mezclan con aglutinantes, desintegrantes, lubricantes, diluyentes inertes, agentes tensoactivos o agentes de descarga. Las tabletas moldeadas constituidas por una mezcla del conjugado polimérico en polvo con un vehículo adecuado, se pueden hacer por moldeo en un equipo adecuado. Un jarabe puede hacerse al adicionar el compuesto activo a una solución acuosa concentrada de un azúcar, por ejemplo de sacarosa, a la cual también se le pueden adicionar ingredientes adicionales. Estos ingredientes adicionales pueden incluir saborizantes, conservadores adecuados, agentes para retardar la cristalización del azúcar y agentes para aumentar la solubilidad de cualquiera de los otros ingredientes, por ejemplo, alcohol polihidroxilado como glicerol o sorbitol. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral en forma conveniente comprenden una preparación acuosa estéril del conjugado activo, que de preferencia es isotónica con la sangre del receptor (por ejemplo, solución salina fisiológica) . Estas formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el compuesto a componentes sanguíneos de uno o más órganos . Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosis unitaria o de multidosis. Las formulaciones de rocío nasal comprenden soluciones acuosas purificadas del conjugado activo con agentes conservadores y agentes isotónicos. Dichas formulaciones de preferencia se ajustan a un pH y a un estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales . Las formulaciones para administración rectal P1261 pueden presentarse como supositorio con un vehículo adecuado, por ejemplo, manteca de cacao, grasa hidrogenadas o ácidos carboxílicos grasos hidrogenados. Las formulaciones oftálmicas como las gotas para los ojos, se preparan por un método similar al rocío nasal, con la excepción de que el pH y los factores isotónicos de preferencia se ajustan para igualar a los del ojo. Las formulaciones tópicas comprenden los conjugados de la invención disueltos o suspendidos en uno o más medios, por ejemplo, aceite mineral, petróleo, alcoholes polihidroxilados u otras bases utilizadas para formulaciones farmacéuticas tópicas. Además de los ingredientes anteriormente mencionados, las formulaciones de esta invención pueden incluir además uno o más ingredientes adicionales seleccionados entre diluyentes, amortiguadores, agentes saborizantes, desintegrantes, agentes tensoactivos, espesantes, lubricantes, conservadores (incluidos los antioxidantes) y lo semejante. Por consiguiente, la presente invención prevé el suministro de proteínas de fusión adecuadas para estabilización in vitro de interferón beta- la en solución, como una aplicación ilustrativa preferida de una aplicación no terapéutica. Las proteínas de fusión se pueden emplear, por ejemplo, para aumentar la resistencia a la degradación enzimática del interferón beta-la y proporcionar un medio para mejorar la vida media, la estabilidad a la temperatura ambiente y la robustez de los reactivos y estuches de investigación. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y no deben considerarse como limitativos de la misma. En particular, se comprenderá que los experimentos con animales in vivo, que aquí se describen, se pueden variar de manera que son posibles otras modificaciones y variaciones de metodología básica. Por ejemplo, en el Ejemplo 7 una persona con experiencia ordinaria en la técnica podría utilizar otros ensayos de neopterina o podría modificar el número y tipo de los primates utilizados. Estas modificaciones y variaciones a los Ejemplos deben considerarse dentro del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1: Estudios de estructura/actividad del interferón beta-la humano, que utilizan mutaciones con sustitución alanina/serina: análisis de sitios de unión a receptor y dominios funcionales . A. Vista general Se llevó a cabo un análisis mutacional exhaustivo del interferón beta-la humano (IFN beta-la) con el propósito de localizar los residuos requeridos para la P1261 actividad y la unión a receptor. La disponibilidad de la estructura cristalina 3-D del IFN beta humano (Karpusas, M. et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. 94:11813-11818) permite identificar, las sustituciones para alanina (o serina) , los residuos expuestos a disolvente disponibles para las interacciones del receptor y conservar los aminoácidos implicados en enlaces intramoleculares. Se diseñó un conjunto de 15 mutaciones de sustitución de alanina que se reemplazaron entre 2 y 8 residuos a lo largo de distintas regiones de cada una de las hélices (A, B, C, D, E) y los bucles (AB, CD y DE) . Se incluyó una etiqueta amino terminal que consistió de 6 residuos histidina, para la purificación por afinidad, así como un sitio de la secuencia enlazante enterocinasa para eliminar la extensión amino terminal . Los interferones resultantes se denominan en forma indistinta "his-interferón (IFN) -beta etiquetado" o "His6-interferón beta" y lo semejante. Varios plásmidos de expresión mutantes de his- (IFN) -beta etiquetado, se construyeron por medio de una construcción génica IFN-beta tipo silvestre como molde de mutagénesis. La estrategia de mutagénesis implicó primero introducir sitios únicos de hidrólisis con enzimas de restricción a lo largo de todo el gen his- (IFN) -beta etiquetado tipo silvestre, luego reemplazar distintas secuencias de ADN entre los sitios de restricción elegidos, P12S1 con oligonucleótidos dúplex sintéticos que codificaron las mutaciones de sustitución de la alanina (o serina) . Por último, los genes IFN mutantes se subclonaron en un plásmido que dirigió la expresión celular de mamífero en una línea celular humana de riñon 293. Las consecuencias funcionales de estas mutaciones se evaluaron en ensayos antivirales y antiproliferación. Se llevó a cabo un ensayo no radioactivo de unión de IFN, a fin de analizar estos mutantes con respecto a su unión al receptor de superficie ("complejo IFNARl/2") de células de linfoma de Daudi Burkitt. Además, se desarrolló un ensayo para localizar superficies de interacción entre mutantes de his-IFN-beta e IFNAR2 que empleó una proteína de fusión IFNAR2/FC, constituida por el dominio extracelular IFNAR2 de la proteína receptor de IFN fusionado con los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgGl humana. 1. Creación de un gen de interferón beta como molde para mutagénesis La estrategia para generar mutantes de IFN-beta sustituidos con alanina (o serina) fue crear primero un gen de IFN-beta modificado que codificara la proteína tipo silvestre pero que portara sitios únicos de hidrólisis para enzimas de restricción, dispersos en todo el gen. Los sitios únicos se utilizaron para intercambiar secuencias P12S1 tipo silvestre por oligonucleótidos dúplex sintéticos, que codificaran los codones mutados . A fin de obtener un cásete de expresión de IFN beta-la humano adecuado para la creación de genes mutantes, el ADNc de IFN-beta (GenBank acceso #E00029) se amplificó por PCR. Fue necesaria una clonación inicial del gen de IFN beta al plásmido pMJB107, un derivado de pACY184, ver Rose et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16(1)355, a fin de realizar la mutagénesis del gen dirigida al sitio en un plásmido que careciera de los sitios de restricción específicos que se generarían a través de la mutagénesis. Los cebadores de PCR utilizados para subclonar las secuencias codificantes del gen de IFN beta humano, también permitieron introducir una secuencia enlazante de enterocinasa en dirección al extremo 5 ' y en el marco de lectura del gen de IFN beta (51 cebador PCR 5 ' TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGA AGC-3' (SEQ ID NO : 9 : "BET-021" Y 3' cebador PCR 5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3 ' (SEQ ID NO : 10 : "BET-022") y sitios flanqueantes de enzimas de restricción (BspEI y Xho I) útiles para clonar a sitios pMJB107 de plásmido. El 7ADN resultante se denomina fragmento A de PCR. Una secuencia señal eficiente procedente de la secuencia señal de la molécula-1 de adhesión celular P1261 vascular humana (VCAM-1) y una etiqueta de seis histidinas, se introdujeron en la construcción final a partir de un segundo fragmento de ADN generado de pDSW247 (fragmento B) . El plásmido pDSW247 es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del cual se ha eliminado el gen EBNA-1 y que porta la secuencia señal VCAM-1 (VCAMs) fusionada en dirección al extremo 5 ' y en marco con una etiqueta de seis histidinas. Los cebadores PCR que se utilizaron para generar la unidad del cásete VCAMss-1/etiqueta histidina fueron KID-369 (5' cebador PCR 5'-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3 • : SEQ ID NO: 11) y KID-421 (3' cebador PCR 5 ' -CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3':SEQ ID NO: 12) que incorpora sitios flanqueantes de hidrólisis de enzima de restricción (Notl y BspEI) que permiten la eliminación del fragmento B ADN. Para crear un vector plásmido que portara la secuencia señal VCAM-1, la etiqueta his y el gen de interferón beta se realizó una ligación de tres vías por medio de fragmentos de ADN purificados en gel provenientes del vector plásmido pMJB107 (Notl y Xhol desdoblados) , fragmento A PCR (BspEI y Xhol desdoblados) y fragmento B (Notl y BspEI desdoblados) . Se utilizó el plásmido ligado para transformar ya sea células JA221 o XLl-Blue de E. coli y se adulteraron y probaron colonias resistentes a ampicilina con respecto a insertos, mediante análisis de P1261 mapa de restricción. Se hizo Maxiprep DNA y la secuencia del inserto se verificó por secuenciación de ADN. La construcción resultante se denominó pCMG260. 2. Creación de mutantes de sustitución de alanina de interferón beta humano en pCMG260. El plásmido pCMG260 se utilizó como molde para varios ciclos de mutagénesis (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim) , el cual introdujo sitios únicos de hidrólisis de restricción, en posiciones a lo largo de la secuencia codificante de la proteína de IFN beta, pero no cambió la secuencia resultante de la proteína. Los plásmidos mutagenizados se utilizaron para transformar ya sea las cepas JA221 o XLl-Blue de E.coli y las colonias recombinantes seleccionadas para la resistencia a cloranfenicol. Las colonias resistentes a cloranfenicol se analizaron además para verificar la presencia del sitio de enzima de restricción único, mediante análisis de localización de restricción de ADN. El plásmido IFN beta resultante, pCMG275.8, contenía el conjunto completo de sitios únicos de hidrólisis para enzimas de restricción y se verificó la secuencia de 7?DN del gen. La" secuencia completa de ADN del gen de his-interferón-beta etiquetado, modificado, junto con la secuencia codificante de proteína tipo silvestre, se P1261 presentan en la Figura 1. El conjunto completo de mutaciones de sustitución de alanina se representa en la Tabla 1 (página siguiente) . Los nombres de los mutantes especifican las regiones estructurales (hélices y bucles) en las que se introdujeron mutaciones. El conjunto completo de sustituciones de alanina (serina) dio origen a la mutación de 65 de los 165 aminoácidos del IFN beta humano. El conjunto de mutantes se generó a partir de pCMG275.8 al reemplazar segmentos de ADN entre los sitios de restricción únicos, con oligonucleótidos dúplex sintéticos, que portaban la información de codificación genética representada en la Tabla 2 (ver más adelante) . Para crear los diversos plásmidos mutantes de sustitución de alanina, se ligaron entre sí el vector pCMG275.8 purificado en gel (hidrolizado con la enzima de restricción apropiada, como se indica en la lista de abajo, para cada región estructural de IFN beta) y oligonucleótidos dúplex (las secuencias de la hebra codificante se muestran en la Tabla 2) . Las mezclas de ligación se utilizaron para transformar la cepa JA221 de E. coli y colonias recombinantes seleccionadas con respecto a resistencia a ampicilina. Las colonias resistentes a ampicilina se analizaron para verificar la presencia de la inserción de las mutaciones, mediante la localización de los sitios de P12SX enzimas de restricción apropiados. Para dos mutantes (A2 y CD2) , la estrategia de clonación implicó la utilización de dos dúplex de oligonucleótidos sintéticos (que se muestran en la Tabla 2) , que portan extremos sobresalientes complementarios que les permiten ligarse entre sí y con la cadena principal del vector-IFN beta en una ligación de tres vías. La siguiente lista ilustra los sitios que se utilizaron para clonar los oligonucleótidos mutados de la Tabla 2. El esquema de clonación (subsección B) muestra las posiciones de estos sitios únicos en el gen de interferón beta. Hélice A BspEI a Muñí o Bglll a Pst I Bucle AB Muñí a PstI o Muñí a BsaHI Hélice B BspHI a Bsal o BsaHI a Bsal Hélice C Bsal a Xbal Bucle CD Xbal a BspHi o Xbal a DralII Hélice D BspHI a DralII Bucle DE BspHI a Pvul Hélice E Pvul a BstEII Tabla 1: P1261 Posiciones de mutaciones de sustituciones de alanina de ^IFN-ß 20 30 40 50 i i . .i i .1 . IFN-ß MSYNIJ IF Ql SOTOC^^ Al -A-AA--A — A A2 AA-AA—-A asi AAA-A ¿B2 AA-A--A SB3 „ : AAAAA-AAA , hélice 1 , bucle AB i 70 80 90 XOO l I I SFN-ß DAA :nmMLQm:F I^^ Bl - — AS- B2 -A8A- Cl -AS — A — S- C2 -A--A&- CDl -AA— AAA hélice B Lhucle CD 110 130 140 150 160 I i ! I IEN-ß DFTRGAIíMSSL?ÍLKRy GRimYLKAKBYSHC? ^ CD2 AA-A — A — D -A-AA— - DEl -AA- DE2 -AA- E -A--- A— A— - bucle CD -{ - hélice D hélice E La línea designada IFN-ß muestra la secuencia de IFN-ß humana tipo silvestre: Las sustituciones de alanina o serina de los residuos de IFN-ß se muestran para cada una de los mutantes y los guiones debajo de las regiones relevantes, indican las secuencias tipo silvestre. Las estructuras de hélice y bucles están indicadas como líneas sólidas debajo de los mutantes. El bucle DE atraviesa la P1261 separación entre las hélices D y E . Dos mutantes de sustitución de alanina adicionales (H93A, H97A y H121A) se generaron y analizaron en ensayos antivirales para evaluar los efectos de la mutación de estas histidinas, las cuales forman quelatos de cinc en el dímero de estructura de corteza. De estos mutantes ambas conservan toda la actividad del tipo silvestre en ensayos antivirales, que sugieren que la formación del dímero mediado por cinc no es importante para la actividad del IFN-ß.

P12S1 TABLA 2 : Al SEQ ID CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAAG NO : 13 CTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC BET-053 A2 SEQ ID GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGGC NO : 14 TTGAATACT BET-039 SEQ ID NO: 15 GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA BET-041 ABl SEQ ID AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGACAT NO : 16 CCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA BET-080 AB2 SEQ ID AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCTAT NO : 17 CCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA BET- 082 AB3 SEQ ID AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACA NO : 18 BET-084 SEQ ID TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA NO : 19 BET-086 Bl SEQ ID CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCAGA NO : 20 CAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA BET- 110 B2 SEQ ID CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCGCT NO : 21 GCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAA BE -112 Cl SEQ ID GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATAAA NO : 22 CCATCTGAAGACAGTTCTAG BET -114 C2 ?EQ ID GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATAGC P1261 NO : 23 ACATCTGGCTGCAGTTCTAG BET-092 CDl SEQ ID CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT NO: 24 BET-094 CD2 SEQ ID CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGAGCG NO:25 CGCTGCACCTGAAAAGA BET-096 SEQ ID TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACACTGT NO: 26 BET-106 Dl SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATACCT NO: 27 GGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT BET-108 DEl SEQ ID CATGAOCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCT NO: 28 GAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT BET-116 DE2 SEQ ID CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTG NO: 29 AAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT BET-118 El SEQ ID CGTCAGAGCTGAAATCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG NO: 30 BET-104 B. Construcción de plásmidos de expresión EBNA 293 Los genes de IFN-beta mutante y de tipo silvestre, fusionados con la secuencia señal VCAM-1, la etiqueta his y la secuencia enlazante de enterocinasa, se purificaron en gel como fragmentos de restricción Notl y P1261 BamHI par de bases 761. Los genes purificados se subclonaron en el vector plásmido pDSW247 hidrolizado en Notl y BamHI, que es un derivado de pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El plásmido pDSW247 es un vector de expresión para la expresión transitoria de proteína en células humanas de riñon EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Contiene el promotor del gen temprano de citomegalovirus y elementos reguladores EBV que se requieren para la expresión genética de alto nivel en ese sistema, así como marcadores seleccionables para E. coli (resistencia a ampicilina) y células EBNA 293 (resistencia a higromicina) . Los plásmidos ligados se utilizaron para transformar ya sea células JA221 o XLl-Blue de E. coli y se adulteraron y probaron colonias resistentes a ampicilina con respecto a insertos, mediante análisis de mapa de restricción. Se hizo Maxiprep DNA y la secuencia del inserto se verificó por secuenciación de ADN. Los clones positivos que mostraron las secuencias mutagenizadas deseadas se utilizaron para transfectar células humanas de riñon EBNA 293. La expresión general de clonación y expresión se presenta en la Figura 12.

P1261 C. Expresión y cuantificación de mutantes de sustitución de alanina en IFN beta-la Las células humanas ÉBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T (1989), J. Virol. 63:3016-3025) se mantuvieron como cultivos subconfluentes en medio Dulbecco ' s Modified Eagle ' s complementado con suero fetal de bovino al 10%, 2mM de glutamina y 250 µg/ml de Geneticina (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Los plásmidos de expresión pDSW247 se transfectaron de manera transitoria en células EBNA 293 utilizando el protocolo de lipofectamina (Gibco-BRL, Life Technologies) . El medio acondicionado se cosechó a los 3 ó 4 días postransfección, el desecho celular se eliminó por centrifugación y la concentración de his-IFN beta se cuantifico mediante ELISA. El ensayo ELISA se realizó utilizando anticuerpos de conejo policlonales (IgG purificada con Proteína A, se han producido anticuerpos para IFN beta-la purificado) para recubrir placas ELISA de 96 pozos y se utilizó una forma biotinilada de la misma Ig policlonal de conejo como un reactivo secundario que permite la detección de interferón utilizando peroxidasa de rábano enlazada a estreptavidina (HRP: Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA) . Una serie de diluciones de interferón beta-la (como AVONEX® comercializado por Biogen Inc.) se utilizó para generar curvas de concentración estándar. Los his-IFN beta que P1261 contenían medio acondicionado proveniente de trasfectantes EBNA 293, se diluyeron para obtener muestras con concentraciones variables entre 10 ng/ml y 0.3 ng/ml en el ensayo ELISA. Para confirmar las concentraciones del IFN beta en el medio determinadas por ELISA, se realizó análisis por transferencia western. Los sobrenadantes de cultivo reducido y los patrones de IFN beta-la s sometieron a electroforesis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodeciisulfato de sodio) en geles con gradiente de 10% a 20% (Novex, San Diego, CA) y se transfirieron a membranas de PDVF (difluoruro de polivinilideno) . Las bandas inmunorreactivas se detectaron con antisuero anti-IFN beta-la policlonal de conejo (#447, Biogen, Inc., un segundo antisuero que se había producido contra IFN beta-la) y a continuación por tratamiento con IgG anti-conejo de asno enlazado a HRP (Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA) .

D. Evaluación de mutantes de interferón beta por su unión a receptor Las propiedades de unión al receptor de mutantes de interferón beta descritas en C, se evaluaron utilizando dos ensayos de unión diferentes. Un ensayo midió la unión de los mutantes del interferón beta a una proteína de fusión, IFNAR/Fc, que comprende el dominio extracelular de P1261 la cadena del receptor IFNAR2 fusionada a una parte de la región constante de una IgG humana. El IFNAR2/Fc se expresó en células ováricas de hámster chino (CHO) y se purificó mediante cromatografía por afinidad en proteína A sepharose, según las instruccionees del fabricante (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, catálogo #20334). La unión de los mutantes del interferón beta al IFNAR2-FC se midió en un ensayo con formato ELISA. Las placas de ELISA se prepararon recubriendo placas de 96 pozos de fondo plano durante la noche a 4°C, con 50 µl/pozo de anticuerpo monoclonal anti-IgGl humana de ratón (CDG5-AA9) , Biogen, Inc.) a 10 µg/ml en amortiguador de recubrimiento (50 mM de NaHC03, 0.2 mM de MgCl2, 0.2 mM de CaCl2, pH 9.6) . Las placas se lavaron dos veces con PBS con un contenido de Tween 20 al 0.05% y se bloquearon con leche en polvo desgrasada al 0.5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente . Después de dos lavados más, se adicionaron en cada pozo 50 µl de 1 µg/ml de IFNAR2-FC en leche al 0.5% en PBS con un contenido de Tween 20 al 0.05% y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego las placas se lavaron dos veces más. La unión de los mutantes de interferón beta a IFNAR2-Fc, se midió por medio de la adición de 50 µl/pozo de interferón beta mutante en medio acondicionado, diluido en serie en medio Dulbecco's Modified Eagle 's (DMEM) complementado con suero fetal de bovino al 10% y se incubó durante 2 horas a P1261 4°C. Las diluciones de la mutante de interferón beta por lo general varió entre aproximadamente 1 µM y 10 pM. Después de lavar, el interferón beta unido a las placas se detectó por medio de la adición de 50 µl/pozo de una mezcla consistente en una dilución 1:1000 de un anticuerpo anti-interferón policlonal de conejo (#447 Biogen, Inc.) más IgG anti-conejo de asno marcada con peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch) e incubación durante 15 minutos a 4°C. Después de dos lavados, se adicionó sustrato HRP y la placa se incubó a 4°C antes de leer en un lector de placas de ELISA a una absorbancia de 450 nm. Los datos se graficaron como absorbancia contra concentración de interferón beta mutante y la afinidad por la unión del interferón beta mutante al IFNAR2-FC se determinó ajustando los datos a una ecuación de unión hiperbólica simple. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 3, en la que la afinidad de unión por cada mutante, determinada en experimentos por triplicado, se expresa como porcentaje de la que se mide para interferón beta-la tipo silvestre His6. Se utilizó un segundo ensayo de unión al receptor para medir la afinidad con la cual el interferón beta mutante se une a células Daudi que expresan las dos cadenas del receptor, IFNAR1 e IFNAR2 , que juntas constituyen el receptor para el interferón beta. Este ensayo basado en la P1261 técnica de citometría de fluoresceína, FACS (clasificador celular con activación de fluoresceína) , utilizó un anticuerpo monoclonal bloqueador dirigido contra el dominio extracelular de IFNAR1, EA12 (Biogen, Inc.), para distinguir receptor sin ocupar (libre) del receptor al cual el interferón beta se unió. Se colocaron células Daudi (20 µl a 2.5 x 107 células/ml) en placas ELISA de fondo V de 96 pozos y se incubaron por 1 hora a 4°C con varias concentraciones de interferón beta mutante (20 µl en amortiguador FACS; FBS al 5%, NaN3 al 0.1% en PBS). Las diluciones en serie convenientes de mutantes de interferón beta variaron de 0.5 µM a 0.5 pM. A cada pozo se adicionaron 100 ng de anticuerpo monoclonal anti-IFNARl murino biotinilado EA12 (10 µl) y las placa se incubaron por 2 minutos adicionales a temperatura ambiente, antes de lavar dos veces con amortiguador FACS (4°C) . Luego las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C con 50 µl/pozo de una dilución 1:200 de R-Ficoerítrina conjugada con estreptavidina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) , se lavaron dos veces en amortiguador FACS, se resuspendieron en 300 µl de amortiguador FACS con un contenido de paraformaldehído al 0.5% y se transfirieron en tubos de poliestireno de 12x75 mm (Falcon 2052) . Luego las muestras se analizaron por citometría de flujo en FACScan (Becton Dickinson) . Los datos se graficaron como la media P1261 de la intensidad de florescencia de canal (MFCI) contra la concentración de interferón beta mutante; las afinidades de unión se definieron como la concentración de mutante de interferón beta que dio 50% de inhibición de tinción de anticuerpos. Cada mutante se probó varias veces. La Figura 4 muestra las afinidades de unión al receptor para cada mutante de interferón beta, determinadas por este método, expresado como un porcentaje de la afinidad medida para His6-interferón-beta tipo silvestre, en cada experimento.

E. Evaluación de mutantes de interferón beta por la función Los mutantes de interferón beta también se probaron con respecto a la actividad funcional utilizando ensayos in vi tro para la actividad antiviral y para la habilidad del interferón beta para inhibir la proliferación celular. En cada mutante se realizaron un mínimo de tres ensayos antivirales, cada uno con puntos de datos por triplicado. El His6-interferón-beta tipo silvestre se incluyó como referencia en cada experimento. Los ensayos antivirales se realizaron tratando células humanas de carcinoma de pulmón A549 (ATCC CCL 185) durante la noche con diluciones al doble en serie de interferón beta mutante a concentraciones que abarcaron el intervalo entre la total protección antiviral y la no protección contra el exterminio celular viral. Al siguiente día, las células se P1 61 estimularon durante dos días con virus de encefalomiocarditis (ECMV) a una dilución que dio como resultado el exterminio celular completo en ausencia del interferón. Luego las placas se revelaron con el colorante metabólico MTT (2, 3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -2H-tetrazolio-5-carboxianilida) (M-5655, Sigma, St . Louis, MO) . Se preparó una solución de reserva de MTT a 5 mg/ml en PBS y se filtró en condiciones estériles y 50 µl de esta solución se diluyeron en cultivos celulares (100 µl por pozo) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos, la solución MTT/medio se desechó, las células se lavaron con 100 µl de PBS y por último el colorante metabolizado de solubilizó en 100 µl de ácido clorhídrico 1.2N en isopropanol al 90%. Las células viables (según se evidenció por la presencia del colorante) se cuantificaron por absorbancia a 450 nm. Los datos se analizaron al graficar la absorbancia contra la concentración de mutante de interferón beta y la actividad de cada mutante se definió como la concentración a la cual se exterminaron 50% de las células. La Figura 5 muestra la actividad de cada mutante en cada experimento, expresada como un porcentaje de la actividad medida para his-interferón-beta tipo silvestre etiquetado. Los mutantes de interferón beta también se evaluaron por su función en un ensayo antiproliferación. Se P1261 sembraron células humanas de linfoma de Daudi Burkitt (ATCC # CCL 213) a 2 x 105 células/ml en RPMI 1620 complementado con suero fetal de becerro definido al 10% (Hyclone, Logan Utah) y 2 mM de L-glutamina. Cada pozo también contenía una concentración dada de mutante de interferón beta en un volumen final total de 100 µl de medio por pozo; las concentraciones de interferón beta utilizadas se seleccionaron para abarcar el intervalo desde la inhibición máxima de proliferación celular Daudi hasta la no inhibición (es decir proliferación total) . Se emplearon puntos experimentales por duplicado para cada concentración de mutante de interferón beta probado y se incluyó un conjunto duplicado de células sin tratar en todos los experimentos. Las células se incubaron durante dos días a 37°C en incubadores con C02 al 5%, después de adicionó a cada pozo 1 µCi por pozo de timidina tritiada ( (metil-3H) timidina, Amersham TRK758) en 50 µl de medio y se incubó por otras 4 horas más. Las células se recolectaron utilizando un recolector de placa LKB y la incorporación de timidina tritiada se midió por medio del lector de placa LKB beta. Los duplicados de los valores experimentales se promediaron y se determinó la desviación estándar. Los datos se graficaron como conteos medios por minuto contra la concentración de mutante de interferón beta y la actividad de cada mutante se definió como la concentración P1261 requerida para dar 50% de la máxima inhibición de crecimiento observada. Se realizaron varios ensayos para cada mutante. La Figura 6 muestra los resultados de cada experimento, expresados como un porcentaje de la actividad encontrada para his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado.

F. Propiedades de los mutantes del interferón beta En ensayos antivirales y antiproliferación se encontró que el interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado con histidina, tiene actividades que fueron cada una aproximadamente 3 veces menores a las actividades correspondientes encontradas para interferón beta-la tipo silvestre sin marcar. Debido a que todos los mutantes Al-E de interferón beta contienen la secuencia de etiqueta his idéntica en sus N terminales, los efectos de las mutaciones en las propiedades de la molécula se determinaron por comparación de las actividades de estos mutantes en ensayos antivirales, antiproliferación y de unión, con la actividad observada para el his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado. Al hacerlo, se supone que las variaciones en las actividades de mutantes Al-E comparadas con el his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado, son cualitativa y cuantitativamente casi las mismas que los efectos que estas mismas mutaciones tendrían en ausencia de P1261 la etiqueta his N terminal. La suposición equivalente para construcciones de fusión o etiquetadas de otras citocinas solubles es en general considerada como verdadera por los expertos que practican la técnica de mutagénesis con rastreo de alanina, en especial cuando la actividad funcional in vi tro de la construcción de fusión o etiquetada es cercana a la de la citocina de tipo silvestre como en este caso. Ver, por ejemplo, Pearce K.H. Jr. et al., J. Biol . Chem. 272:20595-20602 (1997) y Jones J.T., et al., J". Biol . Chem. 213 -. 11661 - 1161 (1998). Los datos que se muestran en las Figuras 3 a 6 sugieren tres tipos de efectos que fueron ocasionados por la mutagénesis dirigida. Estos efectos pueden ser ventajosos para el desarrollo de medicamentos de interferón en ciertas circunstancias. Los tres tipos de efectos son los siguientes: (a) mutantes con actividad antiviral mayor a la del interferón beta-la tipo silvestre (por ejemplo, mutante Cl) ,- (b) mutantes que presentan actividad tanto en ensayos antivirales como antiproliferación, pero para los cuales la actividad antiproliferación es desproporcionadamente baja con respecto a la actividad antiviral, en comparación con el interferón beta-la tipo silvestre (por ejemplo, mutantes Cl, D y DEl) , y (c) antagonistas funcionales (por ejemplo, Al, B2 , CD2 y DEl), que muestran actividades antivirales y antiproliferativas P1261 que son desproporcionadamente bajas con respecto a la unión a receptor, en comparación con el interferón beta-la tipo silvestre. Se puede observar que algunos mutantes quedan en más de una clase. Estas .clases se revisan más adelante. Mientras que se han caracterizado estas clases de mutantes con respecto a aquellos ejemplos enunciados, se puede apreciar que otras mutaciones en estas regiones pueden dar lugar a efectos en la actividad similares o aun intensificados : a) El mutante Cl posee actividad antiviral que es aproximadamente 6 veces mayor que la del his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado. Se pronostica que este mutante y otros de este tipo sean útiles para reducir la cantidad de interferón beta que debe administrarse para lograr un nivel de efecto antiviral dado. Al disminuir la cantidad de proteína administrada se espera reducir la inmunogenicidad de la proteína y es posible que también se reduzcan los efectos secundarios de las toxicidades que no se basan en mecanismos. Se pronostica que las mutaciones en esta clase sean ventajosas en situaciones en las que el beneficio terapéutico de la administración de interferón beta, se derive de sus efectos antivirales y en las que los efectos antiproliferación contribuyan a la toxicidad o a efectos secundarios no deseados . (b) Las actividades relativas (% tipo silvestre) P1261 de los mutantes sustituidos con alanina en el ensayo antiviral y antiproliferación se comparan en la Figura 7. Se observan cambios coordinados en las actividades (es decir, actividades antiviral y antiproliferación que se difieren por el mismo factor de las actividades del his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado) en la mayoría de los mutantes (aquellos que quedan en la línea diagonal) . Sin embargo, varios mutantes muestran alteraciones mayores en la actividad en un ensayo con respecto a otro, en comparación con el his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado, como se evidencia por el desplazamiento de la diagonal . Tres de esos mutantes se muestran en la Tabla de abajo. La mutante Cl muestra actividad antiviral que es 6 veces mayor que la del his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado, pero su actividad en el ensayo antiproliferación es similar a la de tipo silvestre. Así, el mutante Cl tiene actividad antiviral que se intensifica por un factor de 5.2 con respecto a su actividad antiproliferación, relativa al his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado. Del mismo modo, el mutante D muestra 65% de la actividad del tipo silvestre en el ensayo antiviral, pero sólo 20% de la actividad del tipo silvestre en el ensayo antiproliferación y así tiene actividad antiviral que se intensifica 3.4 veces con respecto a su actividad antiproliferación en comparación con el tipo P1261 silvestre. El mutante DEl muestra 26% de la actividad del tipo silvestre en el ensayo antiviral pero sólo 8.5% en el ensayo antiproliferación y de este modo tiene actividad antiviral que se intensifica 3.0 veces con respecto a su actividad antiproliferación en comparación con el his- interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado. Cuando se administran a una concentración suficiente para lograr un nivel deseado de actividad antiviral, estas proteínas mostrarán niveles considerablemente menores de actividad antiproliferativa que las proteínas tipo silvestre. Las mutaciones en esta clase, como las de la clase (a) se espera que sean ventajosas en situaciones en donde el beneficio terapéutico de la administración del interferón beta se derive de sus efectos antivirales y en donde los efectos antiproliferativos contribuyan a la toxicidad o a efectos secundarios no deseados . (c) Mutantes con actividades antiviral P1261 antiproliferativa que son bajas con respecto a la unión al receptor, en comparación con el his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado (ver Tabla abajo) . El mutante Al muestra actividades antiviral y antiproliferativa que son 2.0 veces y 1.8 veces mayores a las que se observan para el his-interferón-beta-la tipo silvestre etiquetado, pero se une al receptor cognado en células Daudi con una afinidad que es 29 veces mayor a la del tipo silvestre. La unión de este mutante al receptor de IFN beta, se intensifica así aproximadamente 15 veces en comparación con las actividades antiviral y antiproliferación de la proteína. Del mismo modo, los mutantes B2, CD2 y DEl muestran intensificación de la unión con respecto a la actividad antiviral de 4.6, 4.6 y 18 veces, respectivamente y con respecto a la actividad antiproliferación de 3.5, 15 y 54 veces. Se pronostica que estas proteínas puedan ser útiles como antagonistas funcionales de la actividad del IFN-beta endógeno y posiblemente de otros interferones Tipo I endógenos, porque tienen la habilidad de unirse al receptor y ocuparlo y aún generar sólo una pequeña fracción de la respuesta funcional en las células blanco de la que se observaría con el IFN-beta tipo silvestre.

P12S1 G. Relación de la muteína con tres estructuras dimensionales del interferón Mientras que las estructuras cristalinas publicadas para una forma no glicosilada de interferón beta murino (T. Senda, S. Saitoh y Y. Mitsui. Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon-ß at 2.15 Á Resolution. J. Mol . Biol . 253: 187-207 (1995)) y para interferón alfa-2b humano (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza, P., Reichert, P.P. Trotta, T.L. Nagabhushan y M.R. Walter. Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-a2 Revealed by X-ray Crystallography. Structure, 4: 1453-1463 (1996) ) han proporcionado modelos para la cadena polipeptídica principal de interferón beta humano, en años recientes se ha resuelto la estructura para el interferón beta-la y su estado glicosilado (M. Karpusas, M. Nolte, C.B.Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb y S.E. Goelz. The Crystal Structure of Human Interferon-ß at 2.2 Á P12S1 resolution. Proc. Nati . Acad. Sci . USA 94:11813-11818 (1997) ) . Los resultados del análisis mutacional se puede resumir con respecto a la estructura 3D del interferón beta-la (no se presentó aquí) . Ciertos residuos de mutaciones generaron una reducción en la actividad (reducida de 2 a >5 veces) . Las regiones que mutaron corresponden a las sustituciones dadas en las Tablas 1 y 2. Las mutaciones que son más importantes en cuanto a su efecto en la función dieron lugar a una dramática reducción tanto den la actividad como en la unión a receptor de superficie celular. Las mutaciones en esta región (hélice A2 , bucle AB & AB2 y hélice E) corresponden a mutaciones en el sitio de unión IFNAR2, ya que ninguno de estos mutantes se unió a IFNAR/Fc en nuestro ensayo. Mientras que aquellas mutaciones que fueron importantes para la unión IFNAR2 también influyeron en la unión celular, las propiedades de unión a superficie celular también son influenciadas por los residuos en otras regiones de la molécula (hélice Bl, hélice C2) . Se puede observar en los modelos 3D (que no se muestran) que representan los efectos de los mutantes de sustitución de alanina que las regiones N terminal, la C terminal y la hélice C glicosilada de la molécula de IFN beta-la no se sitúan dentro del sitio de unión al receptor. Las P12S1 mutaciones en estas regiones no reducen la actividad biológica o la unión a receptor de superficie celular.

Ejemplo 2: Construcción de plásmidos para expresión de proteína de fusión de interferón beta-la (IFN-beta/Fc) Se empleó la tecnología de PCR para crear una plásmido de expresión que codifica para la secuencia de ADN de IFN-beta humano fusionada a la porción Fc de la molécula de cadena pesada de IgG2a murina. El vector plásmido pDSW247 (ver Ejemplo 1) es un derivado de pCEP4 ( (Invitrogen, Carlsbad, CA) , del cual se ha cancelado el gen EBNA 293-1. Este plásmido se utilizó para la construcción de un vector de expresión útil para la expresión transitoria de proteína en células humanas de riñon EBNA 293 ((Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen E.S. et al., 1995, Gene 156, 235-239). Fue diseñado para contener una secuencia señal de la molécula-I de adhesión celular vascular humana (VCAM-1) en marco de lectura y en dirección al extremo 5 ' de la secuencia de interferón beta y una secuencia enlazante de enterocinasa en la unión de las secuencias del interferón beta y de Ig. El cásete de expresión de proteína de fusión se ensambló a partir de varios fragmentos de ADN. Para obtener un fragmento de ADN que codifica para el gen IFN beta humano, el subclon ADNc de IFN beta humano (GenBank acceso P1261 #E00029) se utilizó como molde para PCR utilizando cebadores (5'- GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC(SEQ ID NO: 31: "BET-025") y 5'-GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG (SEQ ID NO:32 : "BET-026") que también incorpora un sitio de hidrólisis para enzima de restricción (Bsal) en dirección al extremo 5' del primer codón del IFN beta. El cebador de PCR 3' (SEQ ID NO : 32 :BET-026) para el gen IFN beta eliminó el codón de terminación de IFN beta e incorporó tanto una secuencia enlazante de enterocinasa en marco (DDDDK) y un sitio de enzima de restricción terminal (Xhol) , útil para subclonación en el vector de expresión. El sitio Bsal se introdujo en dirección al extremo 5' de la secuencia codificante de IFN beta, lo cual permitió ligar la secuencia señal VCAM-1 en dirección al extremo 5' y en marco de lectura con la secuencia codificante del gen de IFN beta. Esta secuencia señal VCAM-1 también se generó por PCR utilizando pares cebadores 5' -CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3 ' (SEQ ID NO: 33:"BET-023" y 5 ' -GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 34: "BET-024") que contenía un sitio de hidrólisis para enzima de restricción (Notl, para ligación en el sitio de clonación Notl de pDSW247) y un sitio de hidrólisis para enzima de restricción 3' (Bsal, para ligación en el fragmento 5' PCR del IFN beta-la) . El molde P1261 para PCR fue el ADNc de la molécula-1 de adhesión celular vascular humana (VCAM-1) (GenBank número de acceso X53051) . Para generar el gen de la fusión IFN beta-la/Fc se llevaron a cabo los siguientes procedimientos. El fragmento IgG2a murino se eliminó de pEAG293 mediante purificación en gel de un fragmento de digestión de ADN Salí + BamHI . El plásmido pEAG293 es un subclon Bluescript IISK+ (Stratagene, LaJolla CA, catálogo #212205) de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG2a murina (GenBank número de acceso V00798) . Los pares cebadores PCR 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3' (SEQ ID NO: 35), en donde S=C o G, M=A o C, R=A o G, W=A o T, y 5'-CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3' (SEQ ID NO: 36) generaron los sitios flanqueantes Salí y Notl en los extremos 5' y 3' del cásete, respectivamente. El cásete del dominio Fc de IgG2a murino difiere de la secuencia GenBank en una sola base (codón V369) , que crea una mutación silenciosa. Por consiguiente, la proteína Fc tipo silvestre se expresa a partir de este cásete Fc de IgG2a. El fragmento de ADN que contenía la secuencia señal VCAM-1 fusionada al gen huIFN-beta con la secuencia enlazante de enterocinasa C terminal, se extirpó de pCMG258 por una digestión de Notl a BamHI y se purificó en gel. El sitio Salí estaba presente en el plásmido pDSW247 original y está colocado inmediato en la dirección al extremo 3 ' y P1261 en marco de lectura con la secuencia codificante del gen IFN beta. El vector plásmido pDSW247 se preparó como un fragmento Notl + BamHI purificado en gel (ver Ejemplo 1) . Se realizó una ligación de 3 vías, utilizando los fragmentos antes mencionados, para ensamblar el vector de expresión final que codifica la fusión IFN beta-la/IgG2a. Este plásmido de expresión se denominó pCMG261 y contiene la secuencia señal VCAM-1 en una fusión con el gen para IFN beta humano maduro, secuencia enlazante enterocinasa y dominio Fc de IgG2a murina. El ADN completo (SEQ ID NO:l) y la secuencia proteica (SEQ ID NO: 2) de la proteína de fusión, se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 3. Producción de protexna de fusión de interferón beta-la en células de mamíferos El vector de expresión IFN-beta/Fc recombinante, pCMG261 se transfectó de manera transitoria en células humanas de riñon EBNA 293 para lograr la expresión de una proteína de fusión de IFN beta-la de la invención. Este plásmido de expresión recombinante se transfectó mediante el protocolo de lipofectamina (catálogo #18324-020, Life Technologies) en células humanas de riñon EBNA 283 según el protocolo del fabricante (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Hawley-Nelson, P. Ciccarone, V., Gebeyehu, G. Jessee, J., Felgner, P.L. (1993) Focus 15.73) que utiliza de 1 a 3 P12S1 microgramos de ADN plásmido para una caja de cultivo de 100 mm de células EBNA 293. Al día siguiente de la transfección de las células con lipofectamina, el medio se reemplazó con medio de crecimiento (medio Dulbecco's Modified Eagle 's, suero fetal de bovino al 10%, 4 mM de glutamina, 250 microgramos de Gentecina/ml (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . El medio acondicionado se cosechó 3 o 4 días más tarde y se determinó la concentración de IFN beta-la, tal como se describe más adelante. La producción de una proteína de fusión IFN beta/Fe en otras células de mamífero y de sistemas de expresión en células procariotas, también se pudo realizar en la transferencia de la región codificante de la proteína por la proteína de fusión a los vectores de expresión apropiados para aquellos sistemas. Los sistemas de expresión alternativos incluirían sistemas de expresión de células de mamíferos, por ejemplo, células ováricas de hámster chino (CHO) (Barsoum, J. (1995, Methods in Mol. Biol. 48, capítulo 18, 225-237) y células murinas NS-0 (Rossman, C. et al., 1996, Protein Expression and Pur. 7, 335-342) y células renales de mono verde COS7 (Ettinger, R. et al. 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 23, 13102-13107) . Otros sistemas de expresión eucarióticos que serían aplicables sería la levadura Pichia pastoris (Eldin, P.E. et al., 1997, J. Immun. Methods, 201, 67-75) y Sacharomyces cerevisiae (Horwitz, A.H., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8678-8682) . La cuantificación de los niveles de expresión de la proteína IFN beta-la-Fc en los sobrenadantes de los cultivos de las células EBNA 293 transfectadas, se realizó mediante ELISA utilizando un fracción IgG purificada con proteína A de anticuerpos policlonales de conejo anti-IFN beta-la (el antígeno fue IFN beta-la purificado, Biogen, Inc.) para recubrir placas de 96 pozos. El anticuerpo detecta patrones de IFN beta-la y sobrenadantes de cultivo en una concentración de interferón que varía entre 10 ng/mL y 0.3 ng/mL. Se utilizaron anti-IFN beta-la policlonal biotinilado de conejo (los mismos anticuerpos anteriores) y peroxidasa de rábano enlazada a estreptavidina, para detectar interferones unidos. Para confirmar valores ELISA, se realizó un análisis por transferencia western, en el que los sobrenadantes de cultivo reducidos y los patrones de IFN beta-la se corrieron en geles con Tris-glicina de 5 a 20% (Novex, San Diego, CA) , se transfirieron a una membrana PVDF (Amersham Life Science, Inc., Cleveland, OH) y se detectaron con un suero policlonal de conejo diferente (producido contra IFN beta-la) y a continuación con anticuerpos de asno anti-IgG de conejo ligados a peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) .

P1261 Ejemplo 4: Actividad antiviral de protexna de fusión IFN beta-la/IgG2a murina Células de humanas de carcinoma de pulmón (A549) se sometieron a pretratamiento durante 24 horas con IFN beta-la o IFN beta-IgG2a murina (61, 41, 27, 18, 12, 8.2, 5.5, 3.7, 2.5, 1.6 página/mL) antes de estimular con virus de encefalomiocarditis (EMCV) . Después de dos días de incubación con el virus, las células viables se tiñeron con una solución de XTT: PMS (2 , 3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxianilida, sal interna de metosulfato de fenazina, a 333 µg/mL y 2 ng/mL, respectivamente, en solución salina amortiguada de fosfato) y se detectaron por espectroscopia a 450 nm. El ensayo se llevó a cabo utilizando puntos de datos por triplicado para cada concentración de IFN. En la Figura 8 las desviaciones estándar se muestran como barras de error. Se determinó que el 50% de efecto citopático para el IFN beta-la fue de aproximadamente 0.4 pM. Se encontró que el 50% de efecto citopático para IFN beta-la/IgG2a murina fue de 0.15 pM.

P1261 Ejemplo 5: Construcción y producción de una protexna de fusión interferón beta-la humano/Fc de IgGl humana A. Construcción de protexna de fusión interferón beta-la humano/Fc de IgGl humana Se empleó tecnología de PCR para crear un plásmido de expresión que codifica la secuencia de ADN de IFN beta humano fusionada con la porción Fc (dominios bisagra, CH2 y CH3) de la molécula de cadena pesada de IgGl humana . Construcción EBNA : El vector plásmido pCH269 es un derivado del pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) a partir del cual se eliminó en gen EBNA-1. El plásmido se utilizó para la construcción de un vector de expresión útil para la expresión transitoria de proteína en células renales humanas EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA; Shen E.S., et al., 1995, Gene 156, 235-239). El cásete de expresión de proteína de fusión se ensambló a partir de tres fragmentos de ADN: un fragmento Notl/Sall que codifica la secuencia señal VCAM-1 en marco y fusionado a la secuencia que codifica para IFN beta, un fragmento Sall/Notl que codifica los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la IgGl humana y un fragmento Notl del vector de expresión pCH269 de EBNA. Por tecnología de PCR se generaron dos distintos fragmentos Notl/Sall que codifican la secuencia señal VCAM- P12S1 1 madura en marco de lectura y fusionada al gen de IFN beta humano. El molde de PCR fue el plásmido pCMG258 (ver Ejemplo 2 arriba) que codifica la secuencia señal VCAM-1 en marco de lectura y fusionada al gen de IFN beta humano, que en sí está en marco de lectura y fusionado a la secuencia enlazante de enterocinasa. Se utilizaron dos conjuntos de cebadores PCR. Un conjunto de cebadores (5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3 ' (SEQ ID NO: 37) Y 5'-ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3 ' : (SEQ ID NO: 38)) introdujo un cambio de aminoácidos de G a C en la posición 162. Este fragmento se denominó IFN beta-162 humano. El segundo conjunto de cebadores (5 ' -AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3 ' (SEQ ID NO: 39) y 5'-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3 ' : (SEQ ID NO:40)) también introdujo la sustitución de aminoácidos G162 a C162 y cambió la secuencia enlazante de enterocinasa (DDDDK) a una secuencia enlazante GGGGS en marco y fusionada en 3 ' al gen IFN beta humano. Este fragmento se denominó IFN beta-162 humano/G4S. Los dos conjuntos de cebadores contienen un sitio 5' Notl que permite la ligación al pCH269 y un sitio de hidrólisis 3 ' Salí que permite la ligación con el fragmento Sall/Notl de la IgGl humana . El fragmento de la IgGl humana que codifica los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la IgGl humana se preparó P1261 mediante digestión con la enzima de restricción (Sal I/Not I) del plásmido pEAG409, un derivado del plásmido SAB144 (descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,547,853). El fragmento se extirpó y se purificó en gel. El plásmido pCH269 del vector de expresión de EBNA se sometió a digestión con Notl y se purificó en gel. Se generaron dos construcciones de fusión IFN beta-Fe de IgGl humana, a través de dos ligaciones de tres vías. Una construcción, denominada ZL6206 contiene el enlazante G4S; la otra construcción, denominada ZL5107, es una fusión directa. Las secuencias de ADN completo y de la proteína de los marcos de lectura abiertos de la fusión directa (ver Figura 10) se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 42, respectivamente. Las secuencias de ADN completo y de la proteína de los marcos de lectura abiertos de la fusión del enlazante (ver Figura 11) se muestran en la SEQ ID NO: 43 y la SEQ ID NO: 44, respectivamente.

Construcción CHO: Se generó una construcción de expresión estable en CHO de la fusión IFN beta humano-Fc IgGl, constituida por el IFN beta humano enlazado directamente a la Fc de IgGl humana. El fragmento IFN beta humano-Fe de IgGl humana se extirpó del plásmido ZL5107 con Notl y se purificó en gel; se ligó en el sitio Notl del pEAG347 (un vector de P1261 expresión que contiene promotores tempranos SV40 y tardíos principales de Adenovirus [derivados del plásmido pAD2beta] , un sitio de clonación Notl único, seguida de terminación por transcripción tardía de SV40 y señales poli A [derivadas del plásmido pCMVbeta] . El pEAG347 contiene una cadena de plásmido derivada de pUC19 y un dhfr derivado de pSV2dh.fr para selección MXT y amplificación en células CHO transfectadas) .

B. Producción de protexna de fusión interferón beta-la humano/Fc de IgGl humana en células de mamífero Transfección transi toria de construcciones de fusión de IFN beta en células EBNA 293 : Los vectores de expresión IFN beta/Fe de IgGl humana recombinantes descritos antes, se transfectaron en células renales humanas EBNA 293 para lograr la expresión de una proteína de fusión IFN beta-la de la invención.

Estos plásmidos de expresión recombinantes se transfectaron por el protocolo de lipofectamina (catálogo #18324-020, Life Technologies), en células renales humanas EBNA 293 según el protocolo descrito en el Ejemplo 3 anterior. Transfección estable de la construcción de la fusión IFN beta-la/Fc de IgGl humana (sin enlazante) en células dhfr- CHO: El vector de expresión recombinante de IFN beta- P1261 la/Fe de IgGl humana (sin enlazante) que contiene dhfr, descrito antes, se transfectó en forma estable en células dhfr-CHO para lograr la expresión de una proteína de fusión de IFN beta-la, de la invención. Este plásmido de expresión recombinante se transfectó por electroporación y la selección de clones positivos se llevó a cabo según el protocolo siguiente: El ADN plásmido (20 mcg) que se sometió a digestión con Bgl II se precipitó, se resuspendió en 800 mcl de amortiguador HEPES y se adicionó a 10 x 107 células CHO/ml . Después de la electroporación, las células se cultivaron en medio DMEM completo durante 2 días. Luego, las células se repartieron en 20 a 40 cajas de 10 cm con DMEM completo/FBS al 10% dializado y se cultivaron durante 5 días antes de cambiar las células al medio de selección con concentraciones en escala (50 a 200 ng/ml) de MTX en DMEM por dos semanas. Al término de las dos semanas, se seleccionaron colonias únicas de células y se seleccionaron y se expandieron. Los sobrenadantes derivados de 22 clones CHO se probaron en ensayos antivirales.

Actividad: La actividad antiviral de las proteínas de fusión se determinó en ensayos CPE tal como se describe en el Ejemplo 4. Con base en la actividad específica de 60 MU/mg P1261 del interferón beta-la estándar que se utiliza en este ensayo, la actividad de la proteína de fusión expresada de manera transitoria (EBNA) interferón beta-la humano/Fc de IgGl humana con en el enlazante fue de 900 U/ml y la actividad sin un enlazante fue de 440 U/ml . La actividad de la proteína de fusión interferón beta-la humano/Fc de IgGl humana expresada en CHO fue de 50 U/ml .

Ejemplo 6: Medición de la actividad antiviral del interferón beta-la en el plasma de ratones tratados con nterferón beta-la y protexna de fusión interferón beta-la/IgG2a murina Se inyectaron ratones (C57/B16) por vía intravenosa a través de la vena de la cola, con 50,000 unidades de interferón beta-la (a granel) o 5,000 unidades de proteína de fusión interferón beta-la-IgG2a murina. Se utilizó un volumen igual de amortiguador de fosfato, como control . La sangre se muestrea a través de sangrado retro-orbital a diferentes puntos * de tiempo (de inmediato, a 0.25, 1, 4, 24 y 48 horas) después de la inyección de interferón beta. Por lo menos hay 3 ratones por punto de tiempo. La sangre se recolecta en tubos que contienen anticoagulante, las células se eliminan y el plasma que se obtiene se congela hasta el momento del ensayo. Las P12S1 muestras de sangre se diluyen 1:10 en medio de ensayo libre de suero y se pasan a través de un filtro de jeringa de 0.2 um. Las muestras diluidas se titulan entonces en pozos designados de una placa de cultivo tisular de 96 pozos que contiene las células A549. Un patrón de interferón beta-la (10, 6.7, 4.4, 2.9, 1.3, 0.9 y 0.6 U/ml de AVONEX) y 4 muestras se corrieron en cada placa. Las células se trataron previamente con las muestras durante 24 horas antes de estimular con virus EMC. Después de dos días de incubación con el virus, las células viables se tiñeron con una solución de MTT (a 5 mg/ml en amortiguador de fosfato) por 1 hora, se lavaron con amortiguador de fosfato y se solubilizaron con HCl 1.2N en isopropanol. Los pozos se leyeron a 450 nm. Se generaron curvas patrón para cada placa y se utilizaron para determinar el grado de actividad del interferón beta- la en cada muestra. En la Figura 9, la actividad en las muestras procedentes de los diferentes ratones está graficada contra los puntos de tiempo. La pérdida más lenta del interferón beta-la en la circulación como una función del tiempo, indica que la vida media de la muestra de proteína de fusión es mucho más prolongada ' que la del control de interferón beta-la sin modificar. Un segundo hallazgo bastante significativo a partir del estudio, fue que muy poca cantidad de la P1261 proteína de fusión se perdió durante la fase de distribución, como se hizo evidente por los altos niveles de actividad similares en los_ puntos de tiempo de 15 y 60 minutos. Los datos indicaron que, a diferencia del interferón beta-la de control, la distribución de la proteína de fusión de interferón beta-la, en gran parte está limitada a la vasculatura.

Ejemplo 7: Farmacocinética y f rmacodinámica comparativas en primates Se realizaron estudios comparativos con interferón beta-la de fusión e interferón beta-la nativo (en la forma de intermediario a granel no formulado AVONEX®, interferón beta-la en 100 mM de fosfato de sodio, 200 mM de NaCl, pH 7.2) para determinar su actividad y estabilidad relativas, en primates. En estos estudios, la farmacocinética y la farmacodinámica de la fusión de interferón beta-la en primates, se comparó con las del interferón beta-la nativo y se pueden extrapolar inferencias razonables a los humanos.

Animales y métodos Diseño del estudio Este es un estudio de grupo paralelo, de dosis repetida, para evaluar la farmacocinética y la P1261 farmacodinámica comparativas de la proteína de fusión de interferón beta-la y el interferón beta-la sin fusión. Para este estudio se utilizaron primates sanos (de preferencia monos rhesus) . Antes de dosificar, todos los animales se evaluaron para detectar signos de enfermedad y salud, por medio de un laboratorio veterinario, en dos ocasiones 14 días antes de probar la administración del producto; se debe hacer una evaluación 24 horas antes de la primera administración del producto de prueba. Sólo los animales sanos recibirán el producto de prueba. Las evaluaciones incluirán un examen físico general y extracciones sanguíneas previas a la dosificación para la patología clínica de línea base y el nivel de anticuerpos de línea base para el interferón beta-la. Todos los animales se pesarán y las temperaturas corporales se registrarán 24 horas antes de la administración del producto de prueba. Se inscribieron doce sujetos y se asignaron en grupos de tres para recibir 1 MU/kg de interferón beta-la ya sea fusionado o sin fusionar pero por lo demás son interferones beta-la idénticos. La administración se realizó o bien por vía subcutánea (SC) o intravenosa (IV) . Seis animales machos recibieron el producto de prueba por la vía IV (3/tratamiento) y otros 6 animales machos recibieron el producto de prueba por vía SC P12S1 (3/tratamiento) . Todos los animales deben estar libres de tratamientos previos con interferón beta. Á cada animal se le dosificará en dos ocasiones; las dosis estarán espaciadas por cuatro semanas. El volumen de dosis será de 1.0 mL/kg . Para la prueba de farmacocinética la sangre se extrae a las 0, 0.83, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 y 96 horas después de cada inyección. Las muestras sanguíneas para mediciones del marcador de respuesta biológica inducida por interferón, neopterina sérica, se extrajeron a las 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 y 504 horas después de la administración del medicamento del estudio . Las evaluaciones durante el período del estudio incluyen observaciones clínicas realizadas 30 minutos antes y 1 hora postdosis, para detectar signos de toxicidad. Se realizan observaciones diarias en las jaulas y se registran la apariencia general, los signos de toxicidad, la incomodidad y los cambios en el comportamiento. Los pesos y las temperaturas corporales se registran en intervalos regulares a través de 21 días postdosis.

Métodos de ensayo Los niveles séricos de interferón beta se cuantifican por medio de un bioensayo de efecto citopático P1261 (CPE) . El ensayo CPE mide niveles de actividad antiviral mediada por interferón. El nivel de actividad antiviral en una muestra refleja el número de moléculas de interferón activo contenidas en esa muestra al momento que la sangre se extrae. Este enfoque ha sido el método estándar para evaluar la farmacocinética del interferón beta. El ensayo CPE utilizado en el presente estudio detecta la habilidad del interferón beta para proteger células humanas de carcinoma de pulmón (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) de la citotoxicidad debida al virus de encefalomiocarditis (EMC) . Las células se someten a incubación previa de 15 a 20 horas con muestras de suero que permitan la inducción y la síntesis de proteínas inducibles por interferón que luego presentan una respuesta antiviral. Después, el virus EMC se adiciona y se incuba 30 horas más, antes de que se haga la evaluación de la citotoxicidad por medio de una tinción con violeta cristal (cloruro de metilrosanilina) . En forma simultánea se prueba con las muestras un patrón interno de interferón beta así como un patrón interno de interferón beta-Ig, en cada placa de ensayo. Este patrón se calibra contra un patrón de referencia de interferón de fibroblasto humano natural (WHO Second International Standard for Inferieron, Human Fibroblast, Gb-23-902-53) . Cada placa de ensayo también incluye, pozos de control de crecimiento celular que no contienen interferón beta de P12S1 ninguna clase ni EMC y pozos de control de virus que contienen células y EMC pero no interferón beta. También se preparan placas de control que contienen el patrón y las muestras para determinar el efecto de las muestras, si lo hay, en el crecimiento celular. Estas placas se tiñen sin la adición de virus . Las muestras y los patrones se prueban por duplicado en cada una de las dos placas de ensayo duplicadas, que dan cuatro puntos de datos por muestra. Se reporta la media geométrica de la concentración de las cuatro réplicas. El límite de detección en este ensayo es de 10 unidades (U) /ml . Las concentraciones séricas de neopterina se determinan en la unidad de farmacología clínica por medio de ensayos que se encuentran disponibles comercialmente.

Métodos farmacocinéticos y estadísticos Se utilizó software RstripTM (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) para ajustar los datos a los modelos farmacocinéticos. La media geométrica de las concentraciones se gráfico por tiempo, para cada grupo. Puesto que los resultados de los ensayos se expresan en diluciones, las medias geométricas se consideran más apropiadas que las medias aritméticas. Los niveles de interferón sérico se ajustan con respecto a los valores de P1261 línea base y las concentraciones séricas no detectables se fijan a 5 U/ml, lo cual representa la mitad del límite inferior de detección. Para los datos de infusión IV, se ajusta un modelo de infusión IV de dos compartimientos, a las concentraciones séricas detectables para cada sujeto y los datos de SC se ajustan a un modelo de inyección de dos compartimientos . Se calculan los siguientes parámetros farmacocinéticos: (i) concentración máxima observada, Cmax(U/ml) ; (ii) área bajo la curva de 0 a 48 horas, AUC que utiliza la regla trapezoidea; y de los datos de infusión IV (si se emplea IV) : (iii) vida media de eliminación; (iv) vida media de distribución (h) ; (v) depuración (ml/h) ; (vi) volumen de distribución aparente, Vd(L). Se utilizó el software WinNonlin (Versión 1.0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC) para calcular las vidas medias de eliminación después de las inyeccioens SC e IM. Para neopterina, se presentan para cada grupo las medias aritméticas por tiempo. Se calcula Emax, el cambio máximo con respecto a la línea base. Cmax, AUC y Emax p?2e? se someten a una análisis de varianza de una vía para comparar los grupos de dosificación. Cmax y AUC se transforman logarítmicamente antes del análisis: se reportan las medias geométricas.

Ejemplo 8: Efectos antiangiogénicos de la fusión de interferón beta-la. Evaluación de la habilidad de una fusión de interferón beta-la para inhibir la proliferación celular endotelial in vitro Células endoteliales venosas humanas (Cell Systems, Cat . #2V0-P75) y células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (Cell Systems, Cat.#2Ml-C25) se conservaron en cultivo con el sistema CS-C Médium Kit ((Cell Systems, Cat . # 4Z0-500) . Veinticuatro horas antes del experimento, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en medio de ensayo, M199 al 90% y suero fetal de bovino al 10% (FBS) y se ajustaron a la densidad celular deseada. Luego las células se depositaron en placas de 24 ó 96 pozos recubiertas con gelatina, ya sea a 12,500 células/pozo o a 2,000 células/pozo, respectivamente. Después de incubación durante la noche, el medio de ensayo se reemplazó con medio recién preparado que contenía 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblasto básico recombinante humano (Becton Dickinson, Cat . # 40060) y varias concentraciones de proteínas interferón beta-la de P1261 fusión y sin fusión o un control positivo (es posible utilizar endostatina como control positivo, como lo fue un anticuerpo a bFGF) . El volumen final se ajusta a 0.5 ml en la placa de 24 pozos o a 0.2 ml en la placa de 96 pozos. Después de setenta y dos horas, las células se tripsinizaron para conteo Coulter, se congelaron para lectura en fluorescencia CyQuant o se marcaron con [3H] timidina. Estos ensayos in vitro prueban las moléculas de interferón beta humano de la invención con respecto a sus efectos en la proliferación celular endotelial que pueden ser indicativos de efectos antiangiogénicos in vivo. Ver O'Reilly, M.S., T. Boehm, Y. Shing, N. Fukal , G. Vasios, W. Lañe, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen y J. Folkman. (1997) . Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 88, 277-285.

Ejemplo 9. Modelo in vivo para probar efectos antiangiogénicos y de neovascularización de la fusión xnte ferón beta-la/lg Se han desarrollado una variedad de modelos para probar los efectos antiangiogénicos y antineovascularización de la moléculas descritas aquí.

Algunos de estos modelos se han descrito en las Patentes de los Estados Unidos No. 5,733,876 (31 de marzo de 1998: P1261 "Method of inhibiting angiogenesis) y No. 5,135,919 (4 de agosto de 1992) : "Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis") . Otros ensayos incluyen la prueba de membrana corioalantoides sin cubierta (CAM) de S. Taylor y J. Folkman: Nature, 297, 307 (1982) y R. Crum, S.Szabo y J. Folkman; Science, 230, 1375 (1985); el modelo de angiogenesis del método de la bolsa de aire dorsal de ratón, de Folkman, J. et al., J. Exp. Med., 133, 275 (1971) y el ensayo de la microbolsa córnea de rata, de Gimbrone, M.A.Jr. et al., J. Nati. Cáncer Inst . 52, 413 (1974) en el que la vascularización córnea se induce en ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley (Charles River, Japón) al implantar en cada córnea 500 ng de FGF básico (bovino, R & D Systems, Inc.) impregnado en granulos de EVA (copolímero etileno-acetato de vinilo) . Otros métodos para probar las fusiones interferón beta/Ig con respecto a sus efectos antiangiogénicos en un modelo animal, incluyen (en forma no exclusiva) protocolos para seleccionar nuevos agentes anticáncer potenciales según se describe en el original Cáncer Chemoterapy Reports, Parte 3, Vol. 3, No. 2, septiembre de 1972 y el suplemento In Vivo Cáncer Models, 1976-1982, NIH Publication No. 84-2635, febrero de 1984. Debido a las barreras de especie de los interferones Tipo I, para evaluar la actividad antiangiogénica de las fusiones de P12S1 interferón beta en modelos de roedores, se generaron preparaciones de fusión interferón beta-la de roedor/lg. Estos métodos de selección se ejemplifican mediante un protocolo para probar los efectos antiangiogénicos de fusiones interferón beta-la murino/lg en carcinoma de pulmón de Lewis implantado subcutáneamente.

Origen de la línea tumoral : Surge de manera espontánea en 1951 como un carcinoma de pulmón en un ratón C57BL/6. Resumen de los procedimientos de prueba : Se implanta subcutáneamente un fragmento de tumor en la región axilar de un ratón B6D2F1. El agente de prueba (es decir una proteína de fusión de la invención) se administra en varias dosis, por vía subcutánea (SC) o intraperitoneal (IP) en varios días, posteriores a la implantación del tumor. El parámetro que se mide es la mediana del tiempo de supervivencia. Los resultados se expresan como porcentaje del tiempo de supervivencia del control . Animales: Propagación: Ratón C57BL/6. Prueba: Ratón B6D2F1. Peso: Los ratones deben estar en un intervalo de peso con variación de 3 g, con un peso mínimo de 18 g para machos y 17 g para hembras.

P1261 Sexo : En un experimento todos los animales de prueba y de control correspondían a un sexo. Fuente: De ser posible, una fuente para todos los animales en un experimento.

Tamaño del experimento : Diez animales por grupo de prueba. Transferencia de tumor: PROPAGACIÓN: Fragmento : Se prepara un fragmento de 2 a 4 mm de un tumor donador s.c. Tiempo: Día 13-15 Sitio: Implante del fragmento s.c. en la región axilar con una punción en la región inguinal . PRUEBA: Fragmento : Se prepara un fragmento de 2 a 4 mm de un tumor donador s.c. Tiempo: Día 13-15 Sitio: Implante del fragmento s.c. en la región axilar con una punción en la región inguinal. Programa de prueba: Día 0 Implantar el tumor. Corrida de cultivos bacterianos . Prueba del compuesto de control positivo en cada experimento impar. Preparar materiales. Registrar muertes diarias.

Día 1: Revisar los cultivos. Descartar el experimento si está contaminado. Aleatorizar los animales. Tratar según instrucciones (en el día 1 y en los días siguientes) . Día 2: Revisar los cultivos. Descartar el experimento si está contaminado. Día 5 : Ponderar el Día 2 y el día de la evaluación inicial de la toxicidad del agente de prueba. Día 14: Controlar el día de muerte prematura. Día 48: Controlar día sin toma. Día 60: Terminar y evaluar el experimento. Examinar el engrosamiento pulmonar por el tumor. Control de calidad: Programar el compuesto de control positivo (NSC 26271 (Cytoxan a una dosis de 100 mg/kg/inyección) ) en cada experimento impar, el régimen para este es intraperitoneal sólo en el día 1. El límite inferior de la prueba/control para el control positivo es 140%. La mediana aceptable del tiempo de supervivencia del control sin tratar es de 19 a 35.6 días. Evaluación: El parámetro medido es la mediana del tiempo de supervivencia. Calcular la media de los pesos corporales de los animales para el día 1 y el día 5, calcular la relación prueba/control para todos los grupos de prueba. Se calcula P1261 la media de los pesos corporales de los animales para el día inicial y para el día de la evaluación final . La relación prueba/control se calcula para todos los grupos de prueba con >65% de supervivientes en el día 5. Un valor de la relación prueba/control <86% indica toxicidad. Una diferencia excesiva en el cambio de peso corporal (prueba menos control) también puede considerarse para evaluar la toxicidad. Criterio para la actividad: Una relación inicial prueba/control mayor o igual a 140% se considera necesaria para demostrar una actividad moderada. Un valor reproducible de la relación prueba/control mayor o igual a 150% se considera relacionado con actividad significativa.

P1261

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos X-Y-Z, en donde X es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos o una porción de la misma, que comprende la secuencia de aminoácidos de un interferón beta glicosilado; Y es una unidad enlazante opcional; y Z es un polipéptido que comprende por lo menos una porción de un polipéptido distinta del interferón beta glicosilado.
2. El polipéptido aislado según la reivindicación 1, en donde X es interferón beta-la.
3. El polipéptido aislado según la reivindicación 1, en donde X es un mutante que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: (a) el mutante tiene una actividad antiviral mayor que la del interferón beta-la tipo silvestre, en donde la actividad antiviral se mide mediante la lisis celular inducida por virus; (b) el mutante tiene con respecto al interferón beta-la tipo silvestre, actividad antiviral mayor que la actividad antiproliferativa; (c) el mutante se une al receptor de interferón, pero cuando se compara con el interferón beta-la tipo silvestre, tiene actividad antiviral disminuida y actividad antiproliferativa reducida con relación a su actividad de unión a receptor. P1261
4. El polipéptido aislado según la reivindicación 2, en donde el interferón beta-la está derivado .
5. El polipéptido aislado según la reivindicación 4, en donde el derivado es un polímero de polialquilenglicol .
6. El polipéptido aislado según la reivindicación 1, en donde Z es por lo menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina.
7. El polipéptido aislado según la reivindicación 6, en donde la por lo menos una porción de una región constante se deriva de una inmunoglobulina de la clase seleccionada de las clases IgM, IgG, IgD, IgA e IgE.
8. El polipéptido aislado según la reivindicación 7, en donde la clase es IgG.
9. El polipéptido aislado según la reivindicación 6, en donde la por lo menos una porción de la región constante comprende por lo menso uno de los dominios bisagra, CH2 y CH3.
10. Una proteína de fusión que tiene una región amino terminal que consiste de la secuencia de aminoácidos de un interferón beta glicosilado o una porción del mismo y que tiene una región carboxi terminal que comprende por lo menos una porción de una proteína distinta del interferón beta glicosilado. P12S1
11. La proteína aislada según la reivindicación 10, en donde X es interferón beta-la.
12. La proteína asilada según la reivindicación 10, en donde X es un mutante que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: (a) el mutante tiene una actividad antiviral mayor que la del interferón beta-la tipo silvestre, en donde la actividad antiviral se mide mediante la lisis celular inducida por virus; (b) el mutante tiene con respecto al interferón beta-la tipo silvestre, actividad antiviral mayor que la actividad antiproliferativa; (c) el mutante se une al receptor de interferón, pero cuando se compara con el interferón beta-la tipo silvestre, tiene actividad antiviral disminuida y actividad antiproliferativa reducida con relación a su actividad de unión a receptor.
13. La proteína aislada según la reivindicación 11, en donde el interferón beta-la está derivado.
14. La proteína aislada según la reivindicación 13, en donde el derivado es un polímero de polialquilenglicol.
15. La proteína aislada según la reivindicación 10, en donde la por lo menos una porción de la proteína distinta del interferón beta es por lo menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina.
16. La proteína aislada según la reivindicación P12S1 15, en donde la por lo menos una porción de la región constante se deriva de una inmunoglobulina de la clase seleccionada de las clases IgM, IgG, IgD, IgA e IgE.
17. La proteína aislada según la reivindicación 16, en donde la clase es IgG.
18. La proteína aislada según la reivindicación 15, en donde la por lo menos una porción de la región constante comprende por lo menos uno de los dominios bisagra, CH2 y CH3.
19. Una secuencia de ADN aislada que codifica para la proteína de las reivindicaciones 1 y 10.
20. Un ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 19 y una secuencia de control de expresión, en donde la secuencia de control de expresión está enlazada funcionalmente al ADN.
21. Una célula hospedera transformada con la secuencia de ADN recombinante de la reivindicación 20.
22. Un método para producir un polipéptido recombinante, que comprende: (a) proporcionar una población de células hospederas según la reivindicación 21; (b) desarrollar esa población de células en condiciones por las cuales se exprese el polipéptido codificado por el ADN recombinante; y (c) aislar el polipéptido expresado.
23. Una proteína de fusión de interferón beta que comprende un interferón beta glicosilado y un P12S1 polipéptido adicional con el cual no se encuentra asociado en forma nativa, en forma substancialmente purificada.
24. La proteína de fusión según la reivindicación 23, en donde el interferón beta es interferón beta-la humano.
25. La proteína de fusión según la reivindicación 24, en donde la proteína de fusión tiene una actividad antiviral que se selecciona del grupo que consiste de : (a) una actividad antiviral mayor que la del interferón beta-la tipo silvestre, en donde la actividad antiviral se mide mediante la lisis celular inducida por virus; (b) una actividad antiviral mayor que la actividad antiproliferativa, con respecto al interferón beta-la tipo silvestre; (c) una actividad que incluye actividad de unión a receptor, pero en comparación con el interferón beta-la tipo silvestre, tiene actividad antiviral disminuida y actividad antiproliferativa reducida con relación a su actividad de unión a receptor.
26. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión de interferón beta de las reivindicaciones 1, 10 y 23.
27. Un método para inhibir angiogénesis en un sujeto, que comprende administrarle una cantidad eficaz de la composición según la reivindicación 26. P1261
28. El polipéptido aislado según la reivindicación 3, en donde la mutante está derivada.
29. El polipéptido aislado según la reivindicación 27, en donde el derivado es un polímero de polialquilenglicol .
30. La proteína aislada según la reivindicación 12, en donde el mutante está derivado.
31. La proteína aislada según la reivindicación 29, en donde el derivado es un polímero de polialquilenglicol . P12S1