SK287491B6 - Fúzne proteíny interferónu- beta-1a a ich použitie - Google Patents

Abstract

Je opísaný polypeptid obsahujúci mutant interferónu-beta-1a (IFN-beta) a kĺbovú oblasť, doménu CH2 a doménu CH3 imunoglobulínu, spôsob jeho výroby a jeho farmaceutické použitie na liečenie alebo prevenciu zápalového, autoimúnneho, angiogenetického, nádorového alebo vírusového ochorenia.

Description

Predkladaný vynález sa týka fúzneho polypeptidu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu X-Y-Z alebo aspoň jej časť, sekvencia obsahuje aminokyselinovú sekvenciu glykozylovaného interferónu-beta (X), pričom Y je voliteľná spojovacia časť a Zje polypeptid obsahujúci aspoň časť polypeptidu iného, než je glykozylovaný interferón-beta. Výhodne je X ľudský interferón-beta-la. Vynález sa tiež týka mutantov interferónu-beta-la.

Doterajší stav techniky

Použitie polypeptidov a proteínov na systémové liečenie špecifických ochorení je teraz bežne prijímanou lekárskou praxou. Úloha, akú hrajú látky tohto typu v terapii, je taká dôležitá, že mnohé výskumy sú zamerané na syntézu veľkého množstva týchto látok technológiou rekombinantnej DNA. Mnohé z týchto molekúl sú endogénne molekuly, ktoré sú veľmi účinné a špecifické vo svojom biologickom účinku.

Hlavným faktorom, ktorý obmedzuje užitočnosť látok proteínového charakteru na ich zamýšľané aplikácie, je to, že pri parentálnom podávaní sú z tela za veľmi krátky čas eliminované. K tomu dochádza preto, že sú metabolizované proteázami, lebo sa na ich eliminácii podieľa bežná clearancia metabolickými cestami eliminácie proteínov, ako je napr. filtrácia v obličkách. Problémy spojené s uvedenými spôsobmi podávania proteínov sú vo farmaceutickom priemysle dobre známe a boli preto použité rôzne stratégie, ako ich riešiť.

Peptidová rodina, ktorá je cieľom klinického výskumu a mnohých snáh o zlepšenie podávania a biostimulácie, je rodina interferónov. Interferóny boli testované pri mnohých ochoreniach. Použitie humánneho interferónu beta, jedného člena tejto rodiny, je už zavedené na liečenie roztrúsenej mozgovo-miechovej sklerózy (sclerosis multiplex). Dve formy rekombinantného interferónu beta boli povolené v Európe a v USA na liečenie tejto choroby. Jedna forma je interferón-beta-la (ochranná známka AVONEX^R, výrobca Biogen, Inc., Cambrige, MA). Termíny „interferón-beta-la“ alebo „INF-beta-la alebo ΙΝΕ-β-la“ alebo „interferón-β-la“ sú v opise vynálezu používané celkom zameniteľné. Inou formou je interferón-beta-1 b (ochranná známka BETASERON^R, Berlex, Richmond, CA), ďalej označovaný ako „interferón-beta-lb“. Interferón beta-la je produkovaný v cicavčích bunkách pomocou prirodzenej sekvencie ľudského génu a je glykozylovaný, zatiaľ čo interferón beta-lb je produkovaný v bunkách E. coli pomocou modifikovanej sekvencie ľudského génu, ktorý obsahuje substitúciu, kde cysteín je nahradený serínom v pozícii 17 a nie je glykozylovaný.

Už skôr bola priamym spôsobom porovnaná relatívna aktivita in vitro interferónu beta-la a interferónu beta-lb vo funkčnom teste a bolo ukázané, že špecifická aktivita interferónu beta-la je približne lOx vyššia než špecifická aktivita interferónu beta-lb (Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). V štúdiách, ktorých cieľom bolo zistiť štruktúrne príčiny rozdielných aktivít, bola identifikovaná glykozylácia ako jediný známy štruktúrny rozdiel medzi uvedenými dvoma produktmi, ktorý ovplyvňuje špecifickú aktivitu. Vplyv sacharidov sa prejavoval najmä účinkom na stabilizáciu štruktúry. Stabilizujúci účinok sacharidov na štruktúru bol evidentný pri experimentoch s tepelnou denaturáciou a v analýze SEC. Neprítomnosť glykozylácie tiež korelovala so zvýšenou agregáciou a zvýšenou citilivosťou na tepelnú denaturáciu. Enzymatické odstránenie sacharidov z interferónu beta-1 a pomocou PNGázy F viedlo k extenzívnej precipitácii deglykozylovaného produktu.

Tieto štúdie ukazujú, že aj napriek konzervatívnej aminokyselinovej sekvenci interferónu beta-la a interferónu beta-lb ide o odlišné biochemické jednotky a väčšina poznatkov o interferóne beta-lb nemôže byť aplikovaná na interferón beta-la a naopak.

Podstata vynálezu

Vynález využíva výhody glykozylovaného interferónu-beta v porovnaní s neglykozylovanou formou. Najmä bola vyvinutá kompozícia obsahujúca interferón-beta-la so zvýšenou aktivitou vzhľadom na interferón beta-lb, ktorý má tiež užitočné vlastnosti fúzneho proteínu všeobecne bez toho, aby došlo k strate aktivity v porovnaní s formami interferónu beta-la, ktoré nie sú vo forme fúzneho proteínu. Teda boli uskutočnené také modifikácie, že produkty (t. j. fúzne proteíny interferónu-beta-la) si uchovávajú celú alebo väčšinu svojej biologickej aktivity a pritom boli dosiahnuté nasledujúce vlastnosti: zmenená farmakokinetika a farmakodynamika vedúca k dlhšiemu biologickému polčasu a zmenám tkanivovej distribúcie (napr. schopnosť zostať dlhší čas v cievach). Takáto kompozícia predstavuje podstatný pokrok v odbore medicíny a farmácie a bola by významným príspevkom na liečenie ochorení, kde interferón preukázal svoju užitočnosť, ako je napr. skleróza multiplex, fibróza a ďalšie zápalové a autoimunitné ochorenia, rôzne druhy rakovín, hepatitída a ďalšie vírusové ochorenia a ochorenia charakterizované neovaskularizáciou. Najmä schopnosť zostávať dlhší čas v cievnom systéme umožňuje, aby bol interferón-beta la použitý na inhibíciu angiogenézy a potenciálne tiež na prestúpenie hematoencefalickej bariéry.

Predkladaný vynález sa najmä týka izolovaného polypeptidu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu X-Y-Z, kde X je polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, alebo aspoň jej časť, zodpovedajúca aminokyselinovému interferónu-beta, Y je voliteľná spojovacia časť a Z je polypeptid obsahujúci aspoň časť polypeptidu iného než je interferón-beta. Voliteľná časť (skupina) Y a nutná časť Z sú naviazané buď na N- alebo C-koniec interferónu-beta (X). Výhodný je X ľudský interferón-beta-la.

Vo výhodných uskutočneniach Zje aspoň časť konštantného úseku imunoglobulínu a môže pochádzať z imunoglobulínu vybraného z triedy IgM, IgG, IgA a IgE. Pokiaľ je imunoglobulín z triedy IgG, potom ide o jeden z IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Konštantný úsek ľudského IgM a IgE obsahuje 4 konštantné úseky a síce CH1 (kĺb), CH2, CH3 a CH4, zatiaľ čo konštantný úsek ľudského IgG, IgA a IgD obsahuje len 3 konštantné úseky a síce CH1 (kĺb), CH2 a CH3. V najvýhodnejšom fúznom proteíne podľa vynálezu obsahuje konštantný úsek aspoň úsek kĺbu a domény CH2 a CH3.

V inom uskutočnení je časť Z aspoň časť polypeptidu, ktorý obsahuje domény podobné imunoglobulínu. K príkladom takýchto polypeptidov patrí CD1, CD2, CD4 a členovia hlavných histokompatibilných antigénov I. a II. triedy.

Ďalším uskutočnením vynálezu je fuzny proteín majúci amino-koncový úsek, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu interferónu-beta alebo jej časť a karboxy-koncový úsek, ktorý obsahuje aspoň časť proteínu, iného než je interferón-beta. Karboxy-koncový úsek je výhodný aspoň časťou konštantného úseku imunoglobulínu pochádzajúceho z triedy imunoglobulínov IgM, IgG, IgD, IgA alebo IgE. V najvýhodnejšom fúznom proteíne konštantný úsek obsahuje aspoň kĺbový úsek a domény CH2 a CH3.

Ďalším uskutočnením vynálezu je fúzny proteín, ktorého interferón-beta časť (t. j. X v uvedenom vzorci) bola mutovaná, čím vznikli muteíny so selektívne zvýšenou antivírusovou a/alebo antiproliferačnou aktivitou alebo s inými výhodnými vlastnosťami v porovnaní s nemutovanými formami interferónu-beta-la.

Ešte ďalším uskutočnením predkladaného vynálezu je izolovaná DNA kódujúca fuzny proteín opísaný skôr. Vynález sa týka tiež rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje izolovanú DNA kódujúcu opísaný fúzny proteín a expresnú kontrolnú sekvenciu (t. j. sekvenciu riadiacu expresiu), kde expresná kontrolná sekvencia je operatívne spojená s DNA. Vynález zahŕňa tiež hostiteľské bunky transformované rekombinantnou DNA podľa vynálezu.

Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy rekombinantného polypeptidu, ktorý spočíva v tom, že sa poskytne populácia hostiteľských buniek podľa vynálezu, táto populácia hostiteľských buniek sa kultivuje v podmienkach, kde je exprimovaný polypeptid kódovaný rekombinantnou DNA a nakoniec sa tento rekombinatný polypeptid izoluje.

Ďalší aspekt vynálezu sa týka fuzneho proteínu interferónu-beta-la, ktorý obsahuje interferón-beta-la a ďalší polypeptid, s ktorým nie je v prírode asociovaný, v podstate čistej forme, pričom fuzny proteín (skrátene fúzia) má antivírusovú aktivitu, ktorá je približná s antivírusovou aktivitou interferónu-beta-la postrádajúceho ďalší polypeptid.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je farmaceutická kompozícia obsahujúca terapeuticky účinné množstvo fúzneho proteínu interferónu-beta-la.

Ešte ďalší aspekt vynálezu sa týka inhibície angiogenézy a neovaskularizácie použitím polypeptidov podľa vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1. cDNA sekvencia a dedukovaná aminokyselinová sekvencia fúzie interferónu-beta s hisitidínovou značkou (tiež označované ako „his INF-beta“ alebo „His₆-značený“ (6x His opísaný ako SEQ ID NO: 63))

Na obrázku sú uvedené úplná DNA sekvencia (SEQ ID NO: 3) a proteínová sekvencia (SEQ ID NO: 4) histidínom značeného IFN-beta-la. Štiepená signálna sekvencia VCAM-1 zanechá 3 zvyšky amino-konca (SerGlyGly) „upstream“ od histidínovej značky (His₆ (SEQ ID NO: 63), pozícia 4 až 9). Sekvencia enterokinázovej spojky (linkera) (AspAspAspAspLys) (SEQ ID NO: 62) je od histidínovej značky oddelená oddeľujúcou sekvenciou (spacerom) (SerSerGly, pozície 10 až 12). Prírodná sekvencia proteínu IFN-beta-la predstavuje sekvenciu Metl8 až Asnl83.

Obr. 2. cDNA sekvencia a dedukovaná aminokyselinová sekvencia fúzie interferónu-beta-la/Fc

Na obrázku sú uvedené úplná DNA sekvencia (SEQ ID NO: 1) a proteínová sekvencia (SEQ ID NO: 2) fúzie „ľudský IFN-beta-la/myší Fc“. Sekvencia ľudského IFN-beta-la proteínu predstavuje zvyšky 1 až 166 (pozície DNA sekvencií 1 až 498). Sekvencia enterokinázovej spojky (linkera) (AspAspAspAspLys) zaujíma aminokyselinové zvyšky 167 až 171 (pozície DNA sekvencií 499 až 513). Sekvencia ťažkého reťazca myšieho IgG2a zaujíma aminokyselinové zvyšky 172 až 399 (pozícia DNA sekvencie 514 až 437).

Obr. 3. Väzba mutantov interferónu-beta so substituovaným alanínom na dimémy fuzny proteín obsahujúci extracelulámu doménu receptora interferónu typu I, IFNAR2/Fc

Väzbové afinity alanínom substituovaných mutantov IFN (Al až E) na receptor IFNAR2 boli stanovené postupom, ako je opísané v príklade 1 (časť D). Histogram predstavuje väzobné afinity v teste v porovnaní s väzobnými afinitami divého typu his-IFN-beta (v % d. t., divého typu). Hodnoty % d. t. boli vypočítané nasledovne: (afinita divého typu his-IFN-beta/afmita mutovaného IFN-beta) x 100. Sú uvedené hodnoty % d. t. (O) pre jednotlivé experimenty (n=3) a priemerné hodnoty % d. t. (x) pre experimentálny súbor. Mutanty A2, AB1, AB2 a E neviažu IFNAR2/Fc v koncentrácii 500 x vyššej, ako je EC50 divého typu (d. t.) his-IFN-beta (*).

Obr. 4. Väzba mutantov interferónu-beta-1 so substituovaným alanínom na povrchový komplex receptora interferónu typu I (komplex IFNAR1/2) exprimovaný na bunkách Daudi z Burkittovho lymfómu

Receptorové väzbové vlastnosti mutantov so substituovaným alanínom (Al-E) boli stanovené pomocou väzbového testu na povrchový bunkový receptor založeného na analýze FACS, ako bol opísaný v príklade 1 (časť D). Histogram predstavuje väzbové afinity v teste v porovnaní s väzbovými afinitami divého typu hisIFN-beta (v % d. t., divého typu). Hodnoty % d. t. na každý mutant boli vypočítané nasledovne: (afinita divého typu his-IFN-beta/afmita mutovaného IFN-beta) x 100. Sú uvedené hodnoty % d. t. (O) na jednotlivé experimenty a priemerné hodnoty % d. t. (X) na experimentálny súbor.

Obr. 5. Antivírusové aktivity mutantov interferónu-beta so substituovaným alanínom

Antivírusové aktivity mutantov so substituovaným alanínom (Al-E) boli stanovené na ľudských bunkách A549 infikovaných EMC vírusom ako bolo opísané v príklade 1 (časť E). Histogram predstavuje aktivitu v teste v porovnaní s aktivitou divého typu his-IFN-beta (v % d. t., divého typu). Hodnoty % d. t. pre každý mutant boli vypočítané nasledovne: (koncentrácia divého typu his-IFN-beta (50 % cpe)/koncentrácia mutovaného IFN-beta (50 % cpe) x 100. Sú uvedené hodnoty % d. t. (O) pre viacnásobné pokusy a priemerné hodnoty z pokusného súboru (x).

Obr. 6. Antiproliferačné aktivity mutantov interferónu-beta so substituovaným alanínom

Antiproliferačné aktivity mutantov so substituovaným alanínom (Al-E) boli stanovené na Daudiho bunkách Burkittovho lymfómu, ako bolo opísané v príklade 1 (časť E). Histogram predstavuje aktivity v teste v porovnaní s aktivitou divého typu his-IFN-beta (v % d. t., divého typu). Hodnoty % d. t. pre každý mutant boli vypočítané nasledovne: (koncentrácia divého typu his-IFN-beta (50 % inhibície rastu/ koncnetrácia mutovaného IFN-beta (50 % inhibície rastu) x 100. Sú uvedené hodnoty % d. t. (O) na viacnásobné experimenty a priemerné hodnoty % d. t. (x) pre experimentálny súbor.

Obr. 7. Relatívne antivírusové a antiproliferačné aktivity mutantov interferónu-beta so substituovaným alanínom

Relatívne aktivity mutantov so substituovaným alanínom (Al-E) boli porovnané v teste antivírusovej (os x) a antiproliferačnej (os y) aktivity. Na toto porovnanie boli použité hodnoty priemerného % divého typu his-IFN-beta (% d. t., x) uvedené na obr. 5 a 6. Mutanty, ktoré vykazujú koordinované zmeny v oboch aktivitách, sa objavia priamo na vertikálnej línii alebo v jej blízkosti. Mutanty vykazujúce stratu/prírastok antivírusovej aktivity, ktorá nie je úmerná zmene v antiproliferačnej aktivite, sa objaví výrazne mimo diagonály (DE1, D, Cl). Významnosť bola stanovená na základe smerodajných odchýlok príslušných k použitej priemernej hodnote % d. t.

Obr. 8. Antivírusová aktivita fúzie interferónu-beta-la/Ig

Aktivita interferónu-beta-la (bol použitý AVONEX^R), lebo fúzia interferón-beta-la/myší Ig2a v koncentráciách uvedených na osi x boli hodnotené v antivírusovom teste použitím buniek ľudského pľúcneho karcinómu (A549) infikovaných vírusom EMC. Po dvojdennej inkubácii za prítomnosti vírusu boli živé bunky zafarbené MTT a misky boli vyhodnotené na čítacom zariadení pri 450 nm a absorbancia, ktorá je odrazom životnosti buniek je uvedená na osi y. Smerodajné odchýlky sú uvedené ako súvislé úsečky. Koncentrácia interferónu-beta-la (bol použitý ako surový medziprodukt AVONEX^R), ktorá poskytla 50 % maxima pri 450 nm a teda pri ktorej došlo k 50 % usmrteniu buniek vírusom („50 % cytopatický účinok“) bola 0,4 pM a 50 % cytopatický účinok na fuzovaný interferón-beta-la bol približne 0,15 pM.

Obr. 9. Meranie antivírusovej aktivity interferónu-beta v plazme myší ošetrených fúziou interferónu-beta-la/Fc alebo interferónom-beta-la

Myšiam bolo injikované buď 50 000 jednotiek interferónu-beta-la (surový medziprodukt AVONEX^R), alebo 50 000 jednotiek fúzie interferónu-beta-la/Fc. Krv z týchto zvierat sa získala retroorbitálnym odberom v rôznych časoch po injekcii, ako ukazuje os x. Na každý časový bod bola odobraná krv aspoň z troch myší, bola pripravená plazma a zamrazená až do stanovenia aktivity interferónu-beta v antivírusovom teste s bunkami ľudského pľúcneho karcinómu (A549) po infekcii vírusom encefalomyokarditídy. Živé bunky sa zafarbili roztokom MTT, doštičky sa potom zmerali pri 450 nm na stanovenie absorbancie, ktorá je odrazom životnosti buniek a aktivity interferónu-beta. Na každej doštičke sa tiež pripravili štandardné (kalibračné) krivky použitím interferónu-beta-la ako AVONEX^R a použili sa na kvantitatívne stanovenie aktivity interferónu-beta v každej vzorke. Na grafe sú zobrazené dáta jednotlivých zvierat.

Obr. 10. Úplná sekvencia a proteínová sekvencia otvorených čítacích rámcov priamej fúzie ľudského IFN-beta a ľudského IgGIFc (ZL5107).

Obr. 11. Úplná DNA sekvencia a proteínová sekvencia otvoreného čítacieho rámca fúzneho proteínu „ľudský IFN-beta/G4S linker/ľudský IgGIFc (ZL6206).

Obr. 12. Schematické znázornenie celkovej klonovacej a expresnej stratégie.

Úplná odborná literatúra citovaná v opise je formou odkazu zahrnutá do opisu, pokiaľ nie je uvedené inak.

V opise vynálezu sú používané nasledujúce termíny:

I. Definície „Interferón“ (skrátene označovaný ako IFN) je malý, druhovo špecifický, jednoreťazcový polypeptid, ktorý sa tvorí v bunkách cicavcov ako reakcia na expozíciu rôznych induktorov, ako sú napr. vírusy, polypeptidy, mitogény a pod. Najvýhodnejší interferón podľa vynálezu je glykozylovaný ľudský interferón-beta, ktorý je glykozylovaný na 80. zvyšku (Asn80) a výhodne je pripravený technikami rekombinantnej DNA. Výhodný glykozylovaný interferón je označovaný „interferón beta-la“ (alebo tiež „IFN-beta-la“, „IFN-β-la“, „interferón beta la“ alebo „intreferón^-la“, pričom všetky uvedené názvy sú používané zameniteľné). Termín „interferón-beta-la“ podľa vynálezu zahŕňa aj mutované formy interferónu (pozri príklad 1) za predpokladu, že aj tieto mutanty sú glykozylované na 80. zvyšku (Asn80). Metódy prípravy proteínov technikami rekombinantnej DNA sú známe vrátane prípravy rôznych interferónov pozri napr. patenty US č. 4 399 216, 5 149 636 a 5 179 017 (Axel et al.) a 4 470 461 (Kaufman).

Výhodné interferón-beta-la polynukleotidy, ktoré možno použiť podľa predkladaného vynálezu, boli odvodené zo sekvencií interferónu divého typu rôznych stavovcov výhodne cicavcov a boli získané metódami, ktoré sú odborníkovi známe a boli opísané, pozri napr. patent US 5 641 656 (udelený 24. júna 1997, DNA kódujúci vtáčí interferónový pro-proteín typu I a zrelý vtáčí interferón typu I), patent US 5 605 688 (25. februára 1997 - rekombinantné psie a konské interferóny typu I), patent US 5 231 176 (27. júla 1993, DNA molekula kódujúca ľudský leukocytámy interferón), patent US 5 071 761 (10. decembra 1991, DNA sekvencia kódujúca subsekvencie ľudských lymfoblastoidných interferónov LyIFN-alfa-2 a LyIFN-alfa-3), patent US 4 970 161 (13. novembra 1990, DNA sekvencia kódujúca ľudský interferón gama). Patent US 4 738 931 (19. apríla 1988, DNA sekvencia obsahujúca gén ľudského interferónu beta), patent US 4 695 543 (22. septembra 1987, ľudský gén alfa-interferónu Gx-1) a US 4 456 748 (26. júna 1984, DNA sekvencia kódujúca subsekvenciu rôznych prirodzene sa vyskytujúcich leukocytových interferónov).

Vo vynáleze sa môžu použiť tiež mutanty interferónu-beta-la. Mutácie sa pripravujú v odbore známymi metódami cielenej mutagenézy. Okrem toho vynález poskytuje funkčne ekvivalentné polynukleotidy interferónu-beta-la, ktoré kódujú funkčne ekvivalentné polypeptidy interferónu-beta-la.

Prvý polynukleotid interferónu-beta-la je „funkčne ekvivalentný“ v porovnaní s druhým polynukleotidom interferónu-beta-la, pokiaľ spĺňa aspoň jednu z nasledujúcich podmienok:

a) „funkčne ekvivalentný“ je prvý polynukleotid, ktorý hybridizuje s druhým polynukleotidom za štandardných hybridizačných podmienok a/alebo je degenerovanou sekvenciou vzhľadom na sekvenciu druhého polynukleotidu, najvýhodnejšie kóduje mutant interferónu majúci (terapeutickú) aktivitu interferónu-beta-la,

b) „funkčne ekvivalentný“ je prvý polynukleotid, ktorý kóduje expresiu aminokyselinovej sekvencie kódovanej druhým polynukleotidom.

Možno zhrnúť, že všeobecný termín „interferón“ zahŕňa, ale nie je obmedzený iba na ne, všetky agensy uvedené v predchádzajúcom texte a tiež ich funkčné ekvivalenty. Termín „funkčný ekvivalent“ v opise vynálezu sa týka proteínu interferónu-beta-la alebo polynukleotidu kódujúceho interferón-beta-la, ktorý má rovnaký alebo lepší prospešný účinok na cicavčieho príjemcu ako pôvodný interferón, na ktorý sa funkčný ekvivalent vzťahuje. Odborníkovi je zrejmé, že funkčne ekvivalentný protein môže byť pripravený rekombinantnou technikou, t. j. expresiou „funkčne ekvivalentnej“ DNA. Teda predmetom predkladaného vynálezu sú tiež interferóny kódované prirodzene sa vyskytujúcou DNA a tiež kódované DNA, ktorá sa prirodzene nevyskytuje, ale kóduje rovnaký protein, ako je kódovaný prirodzene sa vyskytujúcou DNA. Vďaka degenerácii nukleotidových kódujúcich sekvencií sa môžu použiť iné polynukleotidy na kódovanie interferónov. K nim patria celé alebo časti uvedených sekvencií, ktoré boli zmenené substitúciou rôznych kodónov, ktoré kódujú rovnaký aminokyselinový zvyšok v sekvencií, ide teda o umlčanú zámenu. Takéto zamenené sekvencie sa považujú za ekvivalenty týchto sekvencií. Tak napr. Phe (F) je kódovaný dvoma kodónmi a síce TTC alebo TTT, Tyr (T) je kódovaný TAC alebo TAT a His (H) je kódovaný CAC alebo CAT. Na druhej strane Trp (W) je kódovaný jediným kodónom TGG. Teda je jasné, že pre danú sekvenciu DNA kódujúcu konkrétny interferón existuje mnoho degenerovaných DNA sekvencií, ktoré ho kódujú. Tieto degenerované sekvencie sú tiež predmetom predkladaného vynálezu.

„Fúzia“ (tiež fúzny polypeptid alebo fúzny protein) označuje kolineáme spojenie dvoch alebo viac proteínov alebo ich fragmentov prostredníctvom peptidovej kostry, a to výhodne tak, že sa exprimuje polynukleotidová molekula kódujúca tieto proteíny. K výhodným fúznym proteínom patrí interferón-beta-la alebo jeho fragment kovalentne spojený s druhou časťou, ktorá je odlišná od interferónu. Špecificky fúzny protein alebo fúzia „interferón-beta/Ig“ je protein obsahujúci molekulu interferónu-beta podľa predkladaného vynálezu (t. j. interferónu-beta-la) alebo jej fragment, ktorej N-koniec alebo C-koniec je naviazaný na N-koniec imunoglobulínového reťazca, pričom časť N-konca imunoglobulínu je nahradená interferónom-beta-la. Druhom interferón-beta/Ig fúzneho proteínu je fúzny protein „interferón-beta/Fc“, čo je protein obsahujúci molekulu interferónu-beta podľa predkladaného vynálezu (t. j. interferón-beta-la) spojenú s aspoň časťou konštantnej domény imunoglobulínu. Výhodná Fc fúzia obsahuje obsahujúcu molekulu interferónu-beta podľa vynálezu spojenú s fragmentom protilátky obsahujúcim C-koncovú doménu ťažkého imunoglobulínového reťazca.

Termín „fúzny protein“ znamená tiež protein interferónu-beta chemicky viazaný prostredníctvom monoalebo heterofunkčnej molekuly na druhú časť, ktorá je odlišná od proteínu interferónu-beta a je pripravený de novo z petrifikovaného proteínu, ako bude ďalej opísané.

Termín „rekombinantý“ znamená v opise vynálezu protein pochádzajúci z rekombinantných cicavčích expresných systémov. Protein exprimovaný vo väčšine bakteriálnych kultúr, ako je napr. E. coli, bude bez glykánov a preto takýto expresný systém nie je výhodný. Protein exprimovaný v kvasinkách môže obsahovať oligosacharidové štruktúry, ktoré sú odlišné od štruktúr exprimovaných v cicavčích bunkách.

Termín „biologicky aktívny“ používaný v predkladanom opise ako charakteristika interferónu-beta-la znamená, že príslušná molekula má s opísanými uskutočneniami vynálezu homológiu v sekvencií aminokyselín dostatočnú na to, že vykazuje antivírusovú aktivitu pri meraní in vitro antivírusovým testom rovnakého typu, aký je v príklade 1 (pozri opis ďalej).

Termín „terapeutická kompozícia“ v opise vynálezu označuje kompozície obsahujúce proteíny podľa vynálezu a ďalšie fyziologicky kompatibilné prísady. Terapeutická kompozícia ďalej obsahuje expicienty, ako je napr. voda, minerály a nosiče ako napr. proteíny.

Termín „účinné množstvo“ činidla alebo prípravku označuje také množstvo, ktoré poskytuje požadovaný výsledok alebo prejavuje vplyv na určité ochorenie, ktoré je liečené.

„Aminokyselina“ je monoméma jednotka peptidu, polypeptidu alebo proteínu. Existuje dvadsať aminokyselín, ktoré sa nachádzajú v prirodzene sa vyskytujúcich peptidoch, polypeptidoch alebo proteínoch a všetky sú L-izoméry. Vynález zahŕňa tiež analógy aminokyselín a D-izoméry aminokyselín tvoriacich proteíny a ich analógy.

„Derivovaná“ aminokyselina je prírodná aminokyselina alebo aminokyselina nevyskytujúca sa v prírode, kde normálne sa vyskytujúci postranný reťazec alebo koncové skupiny (alebo cukrová časť v prípade interferónu-beta-la) sú modifikované chemickou reakciou. K takýmto modifikáciám patrí napr. gama-karboxylácia, beta-karboxylácia, PEGylácia, sulfatácia, sulfonácia, fosforylácia, amidizácia, esterifikácia, N-acetylácia, karbobenzylácia, tosylácia a ďalšie modifikácie, ktoré sú odborníkom známe. Takže „derivovaný polypeptid“ je polypeptid obsahujúci jednu alebo viac derivovaných aminokyselín a/alebo jeden alebo viac derivovaných cukrov, pokiaľ ide o glykozylovaný polypeptid.

„Protein“ je polymér zložený v podstate z ktorýchkoľvek z dvadsiatich proteínových aminokyselín. Aj keď termín „polypeptid“ sa často používa na označenie relatívne veľkých polypeptidov a termín „peptid“ sa často používa na označenie relatívne malých polypeptidov, použitie týchto termínov v odbore sa často prekrýva a je premenné. V tomto texte sa používa termín „protein“ na označenie peptidov, proteínov aj polypeptidov, pokiaľ nie je výslovne uvedené inak.

„Funkčný ekvivalent“ aminokyselinového zvyšku je aminokyselina, ktorá má podobné fyzikálno-chemické vlastnosti, ako aminokyselinový zvyšok, ktorý bol nahradený funkčným ekvivalentom.

Termín „mutant“ (prípadne „mutácia“) označuje akúkoľvek zmenu v genetickom materiáli organizmu, konkrétne je to akákoľvek zmena (t. j. delécia, substitúcia, adícia alebo alternácia) v polynukleotidovej sekvencií divého typu alebo akákoľvek zmena v proteíne divého typu. Termín „muteín“ sa používa zameniteľné s termínom mutant.

Termín „divý typ“ označuje prirodzene sa vyskytujúcu polynukleotidovú sekvenciu exónu proteínu alebo jej časť alebo aminokyselinovú sekvenciu proteínu alebo jej časť, tak ako sa normálne vyskytuje in vivo.

„Štandardné hybridizačné podmienky“ sú podmienky definované koncentráciou solí a teplotou v podstate zhodnej s podmienkami 0,5 x SSC až 5 x SSC a 65 °C, a to tak na vlastnú hybridizáciu ako aj premývanie.

Používaný termín „štandardné hybridizačné podmienky“ je preto operačná definícia zahŕňajúca celý rad rôznych hybridizačných podmienok. Podmienky s vysokou stringenciou znamenajú napr. hybridizáciu v pufri na skríning plakov (0,2 % polyvinylpyrolidón, 0,2 % Ficoll 400™, 0,2 % hovädzí sérový albumín (BSA), 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), IM NaCl, 0,1 % hydrogenfosoforečnan sodný, 1 % SDS) s 10 % dextránsulfátom a 100 pg/ml denaturovanej sonifíkovanej DNA lososích spermií pri 65 °C po 12 až 20 hodín a premývanie v 75 mM NaCl/7,5 mM citrát sodný (0,5 x SSC)/1 % SDS pri 65 °C. Podmienky s nízkou stringenciou sú napr. hybridizácia v pufri na skríning plakov s 10 % dextránsulfátom a 110 pg/ml denaturovanej sonifíkovanej DNA lososích spermií pri 55 °C po 12 až 20 hodín a premývanie v 300 mM NaCl/30 mM citrát sodný (2,0 x x SSC/1 % SDS pri 55 °C (pozri Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, Inc., New York, 6.3.1 - 6.3.6, 1989).

„Expresná kontrolná sekvencia“ je polynukleotidová sekvencia, ktorá riadi a reguluje expresiu génov, keď je s týmito génmi operatívne spojená.

„Operatívne spojená“ znamená v prípade polynukleotidovej sekvencie (DNA, RNA), že je „operatívne spojená“ s expresnou kontrolnou sekvenciou, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tejto polynukleotidovej sekvencie. Termín „operatívne spojená“ znamená, že pred polynukleotidovou sekvenciou, ktorá má byť exprimovaná, je vhodný štartovací signál (napr. ATG) a že sekvencia je v správnom čítacom rámci, ktorý dovoľuje expresiu polynukleotidovej sekvencie pod kontrolou expresnej kontrolnej sekvencie a teda produkciu požadovaného polypeptidu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvenciou.

„Expresný vektor“ je polynukleotid, väčšinou DNA plazmid alebo fág (ako najbežnejšie príklady z ďalších), ktorý dovoľuje expresii aspoň jedného génu, keď je vektor vnesený do hostiteľskej bunky. Vektor môže, ale nemusí byť schopný replikácie v hostiteľskej bunke.

Termín „izolovaný“ (používaný v predkladanej prihláške zameniteľné s termínom „v podstate čistý“), pokiaľ sa týka nukleových kyselín, t. j. polynukleotidových sekvencii, ktoré kódujú polypeptidy, znamená RNA alebo DNA polynukleotid, časť genómového polynukleotidu, cDNA alebo syntetický polynukleotid, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zachádzania s ním: i) nie je spojený so všetkými polynukleotidmi, s ktorými je spojený v prírode (napr. je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný vektor alebo jeho časť), ii) je spojený s nukleovou kyselinou alebo inou chemickou skupinou, ktoré sa odlišujú od tých, s ktorými je spojený v prírode, alebo iii) nevyskytuje sa v prírode. Ako „izolovaná“ sa ďalej označuje polynukleotidová sekvencia, ktorá je : i) amplifikovaná in vitro napr. metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ii) syntetizovaná chemicky, iii) rekombinantne pripravená klonovaním alebo IV) purifikovaná, napr. štiepením a gólovou separáciou.

Takže „v podstate čistá nukleová kyselina“ je nukleová kyselina, ktorá nie je bezprostredne súvislo spojená s jednou alebo oboma sekvenciami, s ktorými je normálne súvislo spojená v prírode sa vyskytujúcim genómom organizmu, z ktorého je izolovaná. V podstate čistá DNA je tiež rekombinantná DNA, ktorá je časťou hybridného génu kódujúceho ďalšiu sekvenciu.

Termín „izolovaný“ (používaný v predkladanej prihláške zameniteľné s termínom „v podstate čistý“), pokiaľ ide o polypeptidy, znamená polypeptid alebo jeho časť, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zachádzania s ním: i) je prítomný v hostiteľskej bunke ako expresný produkt úseku expresného vektora, alebo ii) je spojený s inými proteínmi alebo chemickými skupinami, než s tými, s ktorými je spojený v prírode, alebo iii) nevyskytuje sa v prírode. Ako „izolovaný“ sa ďalej označuje polypeptid, ktorý i) bol chemicky syntetizovaný, ii) bol exprimovaný v hostiteľskej bunke a purifíkovaný od asociovaných proteínov. Výhodne je izolovaný polypeptid purifíkovaný tiež od ďalších látok, ako sú napr. protilátky alebo gélový matrix (polyakrylamid), ktoré sa používajú na purifikáciu.

„Heterológny promótor“ je promótor, ktorý v prírode nie je spojený s génom alebo purifikovanou nukleovou kyselinou.

Termín „homológny“ je používaný ako synonymum pre „identický“ a týka sa sekvenčnej podobnosti dvoch polypeptidov alebo molekúl alebo dvoch nukleových kyselín. Keď je jedna určitá pozícia v dvoch porovnávaných sekvenciách obsadená rovnakou bázou alebo aminokyselinou (napr. pozícia v dvoch molekulách DNA je obsadená adenínom alebo pozícia v dvoch polypeptidoch je obsadená lyzínom), potom dve porovnávané molekuly sú v tejto pozícií homologické. Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu zhodných alebo homologických pozícií, ktoré majú dve sekvencie delený celkovým počtom pozícií a vynásobený 100. Tak napr. ak 6 z 10 pozícií je zhodných alebo homologických, potom tieto sekvencie sú zo 60 % homologické. Alebo napr. DNA sekvencie CTGACT a CAGGTT majú 50 % homológiu (3 pozície zo 6 sú zhodné). Všeobecne sa porovnávanie uskutočňuje, keď sú sekvencie vzájomne priradené tak, aby bolo dosiahnuté maximálnej homológie. Takéto priradenie a porovnanie je možné uskutočniť metódou, ktorú publikoval Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), a ktorá je štandardne implementovaná v príslušných počítačových programoch, ako je napr. program „Align“ (DNAstar, Inc.). Homologické sekvencie majú zhodné alebo podobné zvyšky aminokyselín, kde podobné aminokyselinové zvyšky sú konzervatívne substitúcie alebo tzv. „povolené“ bodové mutácie zodpovedajúcich aminokyselinových zvyškov vzhľadom na zodpovedajúce priradené referenčné sekvencie. V tomto zmysle „konzervatívne substitúcie“ aminokyselinového zvyšku v referenčnej sekvencii znamenajú substitúciu aminokyselinou, ktorá je fyzikálne alebo funk čne podobná zodpovedajúcemu zvyšku v referenčnej sekvencii, teda napr. má podobnú veľkosť, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti vrátane schopnosti vytvárať kovalentné alebo vodíkové väzby a pod. Zvlášť výhodné sú kovalentné substitúcie, ktoré spĺňajú kritéria definované ako „prijateľné bodové mutácie“ v publikácii Dayhoff et al., Atlas od Proteín Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, Nat. Biomed. Res. Foundation, WashingtonD. C., 1978.

Termíny „polynukleotidová sekvencia“ a „nukleotidová sekvencia“ sú používané v opise zameniteľné.

Termíny „angiogenéza“ a „neovaskularizácia“ sú používané v najširšom význame a znamenajú vytváranie nových krvných ciev.

Najmä angiogenéza sa týka tiež vytvárania nových krvných ciev.

Termíny „IFNAR2“, „IFNAR1“ a „IFNAR1/2“ označujú proteíny, ktoré tvoria interferónový receptor typu I na povrchu buniek. Extraceluláma časť (ektodoména) receptora IFNAR2 sama môže viazať interferón beta alebo alfa.

Pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu boli použité štandardné metódy bunkovej biológie, bunkových kultúr, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú odborníkom známe. Tieto metódy boli publikované v odbornej literatúre. Pozri napr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover, ed.), 1985, Oligonukleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4 683 195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

II. Produkcia a expresia fúznych proteínov

Predkladaný vynález sa týka systému vytvárania fúznych proteínov interferónu-beta-la. Vynález sa najmä týka týchto proteínov a tiež molekúl rekombinantnej DNA používaných na jej produkciu.

Polypeptidy podľa vynálezu možno produkovať rôznymi metódami, ktoré sú odborníkom známe. Tak napr. interferón-beta-la úplnej dĺžky alebo skrátený interferón-beta-la sa môžu pripraviť známymi metódami rekombinantnej DNA použitím cDNA (pozri ďalej).

Gén kódujúci požadovaný polypeptid interferónu-beta-la sa môže konštruovať na základe aminokyselinovej sekvencie požadovaného polypeptidu. Na syntézu génu sa potom použijú štandardné metódy. Tak napr. aminokyselinová sekvencia sa použije na konštrukciu „spätne preloženého“ génu. Oligomér DNA obsahujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu interferón-beta-la sa môže syntetizovať v jedinom kroku. Alternatívne môže byť pripravených niekoľko menších oligonukleotidov kódujúcich časti požadovaného interferónu-beta-la a tie sa potom ligáciou spoja dohromady. Výhodne sa DNA sekvencia kódujúca interferón-beta-la pripraví ako niekoľko samostatných oligonukleotidov, ktoré sa následne navzájom pospájajú (pozri príklad 2). Jednotlivé nukleotidy typicky obsahujú 5'- alebo 3'-presahy (presahujúce úseky), ktoré umožňujú spojenie na základe komplementarity.

Po zostavení výhodné gény budú charakteristické tým, že budú rozpoznávané reštrikčnými endonukleázami (vrátane jedinečných reštrikčných miest na priame vkladanie do kolonovacích alebo expresných vektorov), preferovaných využitím kodónov vzhľadom na hostiteľský expresný organizmus, ktorý sa bude používať (výhodne cicavčie bunky) a tým, že po transkripcií produkujú stabilne a účinne translátovanú RNA. Správne zostavenie možno overiť sekvenovaním, reštrikčným mapovaním a/alebo expresiou biologicky aktívneho polypeptidu vo vhodnom hostiteľovi.

Cicavčia cDNA pre interferón-beta môže byť izolovaná pomocou vhodnej DNA sekvencie ľudského interferónu-beta-la ako sondy na skríning konkrétnej cicavčej DNA knižnice medzidruhovou hybridizáciou. V predkladanom vynáleze bol použitý interferón-beta z cicavcov, ako sú napr. primáty, človek, myš, pes, mačka, krava, kôň a prasa. Cicavčí interferón-beta možno získať medzidruhovou hybridizáciou a síce použitím jednoreťazcovej cDNA ľudského interferónu-beta ako hybridizačnej sondy na izoláciu cDNA pre interferónbeta z cicavčích cDNA knižníc. K metódam, ktoré sa môžu byť použité na izoláciu a klonovanie sekvencii interferónového génu, patria metódy opísané v citovaných patentoch USA. Relevantný je hlavne patent US 4 738 931 (19. apríl 1988), opisujúci DNA obsahujúci gén ľudského interferónu-beta.

Predkladaný vynález sa tiež týka molekúl rekombinantnej DNA, ktoré obsahujú uvedené sekvencie DNA.

Molekuly rekombinantnej DNA podľa vynálezu sú schopné riadiť expresiu polypeptidu podľa vynálezu v hostiteľovi, ktorý je nimi transformovaný. Aby bolo dosiahnuté expresie, musí sekvencia DNA kódujúca fúzny polypeptid podľa vynálezu byť operatívne spojená s expresnou kontrolnou sekvenciou. Aby bolo do siahnuté zodpovedajúcej transkripcie rekombinantného konštruktu podľa vynálezu, do rekombinantného vektora sa výhodne vloží vhodná sekvencia promótor/enhanceru, za predpokladu, že sekvencia promótor/enhancer je schopná riadiť transkripciu sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej glykozylovaný interferón-beta. K promótorom, ktoré sa môžu použiť na riadenie expresie fúznych proteínov založených na imunoglobulíne patrí bez toho, aby tento výpočet bol obmedzujúci, skorý promótor SV40 (Benoist a Chambon, 1981, Náture 290: 304-310), promótor obsiahnutý v 3'-koncovej dlhej terminálnej repetícii (LRT) vírusu Rousovho sarkómu (Yamamoto, et al., 1980, Celí 22: 787-797), thymidín-kinázový promótor z herpes vírusu (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144-1445), regulačná sekvencia metalotionínového génu (Brinster et al., 1982, Náture 296: 39-42), rastlinné expresné vektory obsahujúce promótor nopalínsyntetázy (HerreraEstrella et al., Náture 303: 209-213) alebo 35S RNA promótor z vírusu mozaiky karfiolu (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) a tiež promótor fotosyntetického enzýmu ribulózabisfosfátkarboxylázy (Herrera-Estrella et al., 1984, Náture 310: 115-120); promótorové elementy z kvasiniek alebo iných húb, ako je napr. Gal4 promótor, promótor ADC (alkoholdehydrogenázy), promótor PGK (fosfoglycerolkinázy), promótor alkalickej fosfatázy a tiež nasledujúce zvieracie transkripčné kontrolné úseky, ktoré vykazujú tkanivovú špecificitu a boli použité pri transgénnych zvieratách: kontrolný úsek génu elastázy I, ktorý je aktívny v bunkách pankreasu (Swift et al., 1984, Celí 38: 639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425515); zosilňovače (enhancery) alebo promótory génu na inzulín, ktoré sú aktívne v beta-bunkách pankreasu (Hanahan, 1985, Náture 315: 115-122); enhancery alebo promótory imunoglobulínových génov, ktoré sú aktívne v lymfatických bunkách (Grosschedl et al., 1984, Celí 38: 647-658; Adames et al., 1985, Náture 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Celí. Biol. 7: 1436-1444); úsek promótora a enhancera skorých génov cytomegalovírusu (Boshart et al., 1985, Celí 41: 521530); kontrolný úsek myší vírus nádoru prsnej žľazy, ktorý je aktívny v bunkách semeníkov a pŕs a lymfatických tukových bunkách (Leder et al., 1986, Celí 45: 485-495); kontrolný úsek albumínového génu, ktorý je aktívny v pečeni (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-267); kontrolný úsek génu na alfafetoproteín, ktorý je aktívny v pečeni (Krumlauf et al., 1985, Mol. Celí. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); kontrolný úsek génu alfa 1-antitrypsínu, ktorý je aktívny v pečeni (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1: 161-171); kontrolný úsek beta-globínového génu, ktorý je aktívny v myeloidných bunkách (Mogram et al., 1985, Náture 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Celí 46: 89-94); kontrolný úsek génu na myelínový bázický proteín, ktorý je aktívny v oligodendrocytoch mozgu (Readhead et al., 1987, Celí 48: 703-712); kontrolný úsek ľahkého reťazca 2 myozínu, ktorý je aktívny v kostrovom svalstve (Sani, 1985, Náture 314: 283-286); a kontrolný úsek génu hormónu uvoľňujúceho gonadotropíny, ktorý je aktívny v hypotalame (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378). Prokaryotické expresné systémy, ako napr. LAC promótor alebo beta-laktamázový promótor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731) nie sú výhodné na predkladaný vynález, lebo takto exprimovaný interferón-beta by nebol glykozylovaný.

Viacmenej prokaryotické expresné systémy, ktoré umožnia glykozyláciu interferónu-beta buď v prokaryotickom alebo eukaryotickom hostiteľovi, sú tiež predmetom predkladaného vynálezu.

Expresné vektory, ktoré môžu byť použité, sú napríklad bez toho, aby bol však tento výpočet obmedzujúci, nasledujúce vektory alebo ich deriváty: ľudské alebo zvieracie vírusy, ako je vírus vakcínie, vektory založené na adenovírusoch alebo retrovírusoch, hmyzie vírusy alebo bakulovírusy, kvasinkové vektory (napr. lambda) a plazmidové a kozmidové DNA vektory, aby sme menovali aspoň niektoré. Špecificky k užitočným expresným vektorom pre výhodné eukaryotické hostitele patria vektory obsahujúce expresné kontrolné sekvencie z SV40, hovädzieho papilloma vírusu a cytomegalovírusu. Vnútri každého špecifického vektora sa vyberú rôzne miesta na vloženie požadovanej DNA sekvencie. Tieto miesta sú väčšinou definované reštrikčnými endonukleázami, ktoré v týchto miestach štiepia DNA. Odborníkovi je to dobre známe. Je tiež jasné, že daný expresný vektor užitočný na vynález nemusí mať reštrikčné endonukleázové miesta na inzerciu vybraného fragmentu DNA. Miesto toho sa vektor spojí s fragmentom alternatívnym spôsobom.

Expresný vektor, miesto vybrané na inzerciu vybraného fragmentu DNA a operatívne spojenie na expresnú kontrolnú sekvenciu sú určené mnohými rôznymi faktormi, ako je napr. počet miest štiepiteľných konkrétnym reštrikčným enzýmom, veľkosť polypeptidu, citlivosť polypeptidu na proteolytickú degradáciu a pod. Výber vektora a inzerčných miest pre danú DNA je potom daný bilanciou týchto faktorov.

Rekombinantné konštrukty podľa vynálezu sa vnesú do buniek, ktoré sú schopné exprimovať fuzny proteín, metódami, ktoré sú odborníkom známe. K týmto metódam patrí transformácia (napr. metódou s DEAEdextránom alebo kalciumfosfátom), transfekcia, mikroinjekcia, infekcia, vstreľovanie do bunky a elektroporácia bunky. Môže byť použitá akákoľvek hostiteľská bunka, za predpokladu, že sekvencia rekombinantnej nukleovej kyseliny bude adekvátne transkribovaná do RNA v bunkách tohto typu a že tieto bunky sú schopné glykozylovať proteín. Okrem toho akékoľvek konštrukty rekombinantnej nukleovej kyseliny podľa vynálezu môžu byť použité na vytvorenie transgénnych zvierat s výnimkou človeka, schopných produkovať fúzne proteíny založené na imunoglobulíne. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú hostiteľské bunky COS alebo CHO.

Úspešnú inkorporáciu týchto polynukleotidových konštruktov do daného expresného vektora je možné identifikovať všeobecne tromi možnými postupmi: (a) DNA-DNA hybridizáciou, (b) prítomnosťou či absenciou funkcií „markerových“ génov a (c) expresiou vloženej sekvencie. V prvom z uvedených prípadov sa prítomnosť génu interferónu-beta-la v expresnom systéme deteguje hybridizáciou DNA-DNA použitím sondy, ktorá obsahuje sekvenciu homologickú s vloženým génom fúzneho proteínu. V druhom prípade sa rekombinantný systém vektor/hostiteľ identifikuje a selektuje na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitej markerovej funkcie (napr. tymidínkinázová aktivita, rezistencia na antibiotiká ako napr. G418, transformovaný fenotyp, vytváranie oklúznych teliesok pri bakulovírusoch a pod.) spôsobené vložením cudzorodého génu do vektora. Tak napr. keď je polynukleotid vložený do vektora tak, že prerušuje sekvenciu markerového génu, rekombinanty obsahujúce inzert sú identifikované na základe absencie funkcie markerového génu. V treťom prípade je rekombinantný expresný vektor identifikovaný testovaním expresie cudzorodého génového produktu z rekombinantného vektora. Takéto testy sú napr. založené na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach génového produktu v biologických testovacích systémoch.

Treba mať na pamäti, že všetky kombinácie hostiteľ/expresný vektor fungujú s rovnakou účinnosťou pri expresii DNA kódujúcej polypeptid podľa vynálezu. Ale odborník môže uskutočniť konkrétny výber kombinácie hostiteľ/expresný vektor pri uvážení princípov stanovených v predkladanom vynáleze bez toho, aby sa odchýlil od vynálezcovskej myšlienky predkladaného vynálezu.

Výhodné uskutočnenie predkladaného vynálezu zahŕňa fúzne proteíny a sekvencie DNA, ktoré tieto proteíny kódujú. Tieto fúzne proteíny majú amino-koncový úsek charakterizovaný aminokyselinovou sekvenciou interferónu-beta-la a karboxy-koncový úsek obsahujúci doménu proteínu iného, než je interferón-betala. Generický vzorec výhodného fúzneho proteínu je proteín majúci aminokyselinovú sekvenciu X-Y-Z, kde X je polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, alebo aspoň jej časť, zodpovedajúci aminokyselinovej sekvencii ľudského interferónu-beta, Y je voliteľná spojovacia časť (linker) a Z je polypeptid obsahujúci aspoň časť polypeptidu iného, než je ľudský interferón-beta. V jednom uskutočnení časť Z je časť polypeptidu, ktorý obsahuje imunoglobulínu podobnú doménu. K príkladom takýchto polypeptidov patria CD1, CD2, CD4 a členovia I. a II. triedy antigénov hlavného histokompatibilného systému (na príklady týchto polypeptidov pozri tiež prihlášku US 5 565 335, Capon et al.).

Časť Z obsahuje napr. niekoľko hisitidínových zvyškov, alebo výhodný Fc úsek imunoglobulínu, pričom „Fc“ je definovaný ako fragment protilátky obsahujúci C-koncovú doménu ťažkého reťazca imunoglobulínu.

V najvýhodnejšom uskutočnení fúzneho proteínu podľa vynálezu je polypeptid interferónu-beta-la fúzovaný prostredníctvom svojho C-konca a aspoň časťou Fc úseku imunoglobulínu. Interferón-beta-la tak vytvára amino-koncovú časť a Fc vytvára karboxy-koncovú časť fúzneho proteínu. V týchto fuznych proteínoch je výhodne obmedzený na kĺbový úsek konštantnej domény a domény CH2 a CH3. Fc fragment týchto fuznych proteínov môže byť tiež obmedzený na časť kĺbového úseku, ktorá je schopná tvoriť intermolekulárne disulfidické mostíky a domény CH2 a CH3 alebo zodpovedajúci funkčný ekvivalent. Takéto konštantné úseky môžu pochádzať z akéhokoľvek cicavca (výhodne človeka) a môžu byť získané z akejkoľvek triedy a/alebo izotypu protilátky vrátane IgA, IgD, IgM, IgE a IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.

Molekuly rekombinantnej nukleovej kyseliny kódujúce Ig fúzie možno pripraviť akoukoľvek metódou v odbore známou (pozri Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory to Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) alebo použitím verejne dostupných klonov. Metódy prípravy génov, ktoré kódujú konštantné úseky ťažkých a ľahkých reťazcov imunoglobulínov, boli opísané napr. v Robinson, R. et al., medzinárodná patentová prihláška PCT publikovaná ako W087/02671. Sekvencia cDNA kódujúca molekulu interferónu alebo jej fragment môže byť priamo spojená s DNA sekvenciou kódujúcou konštantný úsek ťažkého reťazca imunoglobulínu alebo môže byť spojená prostredníctvom spojovacej sekvencie (linkera). V inom uskutočnení vynálezu je rekombinantný expresný systém vytvorený tak, že obsahuje sekvenciu kódujúcu interferón-beta v správnom čítacom rámci so syntetickým úsekom na kĺbovú oblasť protilátky. Okrem toho môže byť potrebné vložiť, ako časť rekombinantného vektorového systému, nukleové kyseliny zodpovedajúce 3'-koncovému úseku lemujúcemu imunoglobulínový gén obsahujúci miesta na štiepenie a polyadenyláciu RNA a „downstream“ sekvencie. A ďalej môže byť potrebné vložiť signálnu sekvenciu do polohy „upstream“ od kódujúcej sekvencie imunoglobulínového fúzneho proteínu, aby sa umožnila sekrécia fuznej molekuly z buniek transformovaných rekombinantným vektorom.

Predkladaný vynález poskytuje dimérne fúzne molekuly a tiež monoméme alebo multiméme molekuly obsahujúce fúzne proteíny. Takéto multiméme molekuly môžu byť pripravené použitím takých Fc úsekov Ig molekúl, alebo ich častí, ktoré sú obvykle multivalentné, ako sú napr. pentaméry IgM alebo diméry IgA. Je zrejmé, že polypeptid J reťazca je potrebný na vytvorenie a stabilizáciu pentaméru IgM a diméru IgA. Alternatívne multiméry fúznych proteínov interferónu-beta-la môžu byť pripravené použitím proteínu s afinitou naFc úsek Ig molekúl, ako je napr. proteín A. Tak napr. mnohé fúzne proteíny interferón-beta-la/imunoglobulín môžu byť naviazané na agarózové perličky s proteínom A.

Tieto polyvalentné formy sú užitočné, lebo majú mnoho väzobných miest na receptor interferónu-beta-la. Napr. bivalnetný rozpustný interferón-beta-la je zložený z dvoch tandémovo sa opakujúcich sekvencii ami nokyselín 1 až 166 v sekvencií SEQ ID NO: 2 (alebo kódovaný úsekom 1 až 498 sekvencie SEQ ID NO: 1) (časť X v generickom vzorci) oddelených spojovacím úsekom (časť Y) a táto repetícia je spojená s aspoň časťou konštantnej domény imunoglobulínu (časť Z). Pozmenené polyvalentné formy môžu byť skonštruované, napr. chemickým naviazaním fúzie interferón-beta-la/Ig na klinicky prijateľnú nosičovú molekulu, polymér vybraný zo skupiny obsahujúci Ficoll, polyetylénglycol alebo dextrán a síce obvyklými metódami konjugácie. Alternatívne môže byť interferón-beta-la chemicky konjugovaný sbiotínom a tento konjugát biotín-interferón-beta-Fc sa potom naviaže na avidín, čím vznikne tetravalentná molekula avidín/biotín/interferón-beta. Fúzia interferón-beta-la/Ig môže byť tiež kovalentne naviazaná na dinitrofenol (DNP) alebo trinitrofenol (TNP) a výsledný konjugát potom precipitovaný pomocou anti-DNP alebo anti-TNPIgM, čím sa vytvoria dekaméme konjugáty s valenciou 10 na väzobné miesta na receptor interferónu-beta.

Proteiny interferónu-beta-la a ich fragmenty a fuzne proteiny podľa vynálezu môžu byť izolované a purifíkované obvyklými metódami, ako je napr. extrakcia, precipitácia, chromatografia, afinitná chromatografia, elektroforéza a pod. Napr. interferónové proteiny a ich fragmenty sa môžu purifikovať tak, že sa ich roztok nanesie na kolónu obsahujúcu imobilizované receptory interferónu (pozri napr. patent US 4 725 669). Naviazané molekuly interferónu sa potom eluujú použitím chaotropnej soli alebo použitím vodného roztoku kyseliny octovej. Imunoglobulínové fuzne proteiny môžu byť purifikované tak, že prechádzajú cez obsahujúci imobilizovaný proteín A alebo proteín G, ktoré selektívne viažu úsek Fc fúzneho proteínu (pozri napr. Reis,

K. J., et al., J. Immunol. 132: 30983102 (1984); PCT prihláška publikovaná ako W087/00329). Chimérická protilátka sa potom eluuje použitím chaotropnej soli alebo použitím vodného roztoku kyseliny octovej.

Alternatívne sa molekuly fúzneho proteínu interferónu a imunoglobulínu na získanie v podstate čistého proteínu purifikujú na kolóne s anti-interferónovou protilátkou alebo na kolóne s anti-imunoglobulínovou protilátkou.

Termínom „v podstate čistý“ je mienený proteín zbavený nečistôt, ktoré sú s ním v prirodzenom stave spojené. V podstate čistý stav je možné dokázať výskytom jedného pásu na elektroforéze.

Príkladom užitočného fúzneho proteínu interferón-beta-la/Ig podľa vynálezu je proteín sekvencie SEQ ID NO: 2, ktorý je secemovaný v bunkovej kultúre eukaryotických buniek obsahujúcich expresný plazmid pCMG261 (pozri príklad 2). Tento proteín sa skladá zo zrelého ľudského interferónu-beta-la fúzovaného s časťou kĺbového úseku a konštantnými doménami CH2 a CH3 myšieho Ig. Pritom obsahuje úsek myšieho imunoglobulínu dostatočný na to, aby bol rozpoznaný Fc väzbovým proteínom a síce proteínom A.

Ďalšie fuzne proteiny podľa vynálezu obsahujúce ľudský interferón-beta-1 sú uvedené: (a) ako sekvencie SEQ ID NO: 3 a 4, ukazujúce cDNA a dedukovanú aminokyselinovú sekvenciu his-označenej fúzie interferónu-beta-f a (tiež ukázaná na obr. 1) a (b) sekvencia SEQ ID NO: 1 pre cDNA kódujúcu fúzny proteín interferón-beta-la/Ig so sekvenciou SEQ ID NO: 2 (ukázaný tiež na obr. 2).

Výhodné proteiny interferónu-beta-la podľa vynálezu obsahujúce novú „spojovaciu“ sekvenciu DNA SEQ ID NO: 5 a aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 predstavujúcu kodóny 11 tripletov na oboch stranách spoja medzi DNA ľudského interferónu -beta a DNA kódujúcou konštantný úsek ľudského imunoglobulínu (pozri príklad 5: sekvencia SEQ ID NO: 41 a 42).

Špecificky, sekvencia SEQ ID NO: 5 kódujúca ľudský interferón-beta-la končí nukleotidovým tripletom 568-570 (AAC) a DNA kódujúcou konštantný úsek ľudského IgGl začína tripletom (GAC)začínajúc nukleotidom č. 574 v sekvencií SEQ ID NO: 41. Zodpovedajúca dedukovaná aminokyselinová „spojovacia“ sekvencia je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 6 a je založená na sekvencií SEQ ID NO: 42. Bola definovaná aj ďalšia jedinečná „spojovacia“ sekvencia, ktorá zahŕňa linkerovú sekvenciu vo výslednom DNA konštrukte (pozri príklad 5: sekvencia SEQ ID NO: 43 a 44). Táto sekvencia „spojovacej“ DNA a príslušná aminokyselinová sekvencia sú uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 7 a 8, ktoré ukazujú kodóny 11 tripletov na oboch stranách spoja priamo medzi koncom sekvencie interferónu-beta-la (nukleotid č. 570 v sekvencií SEQ ID NO: 43) a sekvenciou linkera (nukleotidy 571 až 585 v sekvencií SEQ ID NO: 43, GGGGS (SEQ ID NO: 64) v sekvencií SEQ ID NO: 8).

„Spojovacie“ DNA sekvencie môžu byť použité ako DNA sondy a sú to minimálne DNA potrebné na hybridizáciu za štandardých podmienok s akoukoľvek DNA sekvenciou kódujúcou fúzny proteín interferónbeta-la/Ig. Viacmenej za predpokladu, že celá sonda hybridizuje s oboma stranami spojovacej sekvencie a obe strany spoja interferón-beta/konštantný úsek sa podieľajú na hybridizácii, môžu existovať aj menšie sekvencie. Navyše odborníkovi je zrejmé, že DNA sekvencie väčšie ako sekvencia SEQ ID NO: 7 sú tiež vhodné na hybridizáciu. Odborník môže ľahko otestovať, či konkrétna sonda, ako napr. sekvencia SEQ ID NO: 5 alebo 7, je schopná hybridizácie na oboch stranách spojenia a to tak, že označia 5'-koniec buď jednoreťazcového „sense“ oligonukleotidu, alebo jednoreťazcového „anti-sense“ oligonukleotidu vhodne značeným fosfátom z ATP použitím polynukleotidkinázy. Sekvencie podľa vynálezu musia hybridizavať s oboma a teda označenými oligonukleotidovými sondami. Odborníkovi je tiež zrejmé, že vynález zahŕňa tiež úplne degenerované sekvencie kódujúce spojovaciu sekvenciu SEQ ID NO: 5 alebo 7.

III. Ďalšie varianty interferónových fúznych polypeptidov

K derivátom proteinov podľa vynálezu patria tiež rôzne štruktúrne formy primárnych proteinov, ktoré si uchovávajú biologickú aktivitu. Vďaka prítomnosti ionizovateľnej aminoskupiny a karboxylové skupiny môžu byť fúzne proteíny interferónu-beta napr. vo forme kyslých alebo bázických solí, alebo môžu byť v neutrálnej forme. Jednotlivé aminokyselinové zvyšky môžu byť modifikované oxidáciou alebo redukciou. A ďalej primárna aminokyselinová štruktúra (vrátane N- a/alebo C- koncových úsekov) alebo glykánová časť interferónu-beta môžu byť modifikované (derivované) vytváraním kovalentných alebo agregovaných konjugátov s inými chemickými skupinami, ako sú napr. glykozylované skupiny, polyalkylenglykolové polyméry ako napr. polyetylénglykol (PEG: pozri súčasne prejednávané prihlášky rovnakého prihlasovateľa č. 60/104,491 a 60/120,237), lipidy, fosfáty, acetylové skupiny a pod., a alebo vytváraním mutácii aminokyselinových sekvencií.

K ďalším derivátom interferónu-beta/Ig patria kovalentné alebo agregované konjugáty interferónu-beta alebo jeho fragmentov s inými proteínmi alebo polypeptidy, ktoré sú pripojené syntézou v rekombinantnej kultúre ako dodatočné C- alebo N-konce. Tak napr. konjugovaný peptid môže byť signálna (alebo tzv. vedúca) polypeptidová sekvencia v N-koncovom úseku proteínu, ktorá pri translácii (kotranslačne) alebo po translácii (posttranslačne) smeruje prenos proteínu z miesta jeho syntézy do miesta jeho pôsobenia vnútri bunky alebo v bunkovej membráne alebo bunkovej steny (napr. vedúca sekvencia alfa-faktora kvasiniek). Receptorové proteíny interferónu-beta môžu obsahovať peptidy pridané na uľahčenie purifikácie alebo identifikácie interferónu-beta (napr. fúzia histidín/interferón-beta-la). Aminokyselinová sekvencia interferónu-beta môže byť tiež spojená s peptidom Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 61) (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Táto sekvencia je silno antigénna a poskytuje epitop reverzibilne viazaný špecifickou monoklonálnou protilátkou, čo umožňuje rýchle testovanie a ľahké čistenie exprimovaného rekombinantného proteínu. Táto sekvencia je tiež špecificky štiepená enterokinázou z hovädzej sliznice v mieste zvyšku bezprostredne nasledujúcom po dvojici Asp-Lys.

K ďalším analógom patria fúzne proteíny interferónu-beta s Fc alebo ich biologicky aktívne fragmenty, ich sekvencie interferónu-beta sa líšia od sekvencií uvedených ako sekvencie SEQ ID NO: 2, 4, 6 alebo 8 jednou alebo viacerými konzervatívnymi zámenami aminokyselín alebo jednou či viacerými nekonzervatívnymi zámenami a/alebo deléciami alebo inzerciami, ktoré nenarušujú biologickú aktivitu izolovaného proteínu. Ku konzervatívnym substitúciám typicky patria substitúcie jednej aminokyseliny druhou aminokyselinou s podobnými vlastnosťami, ako sú napr. substitúcia v rámci nasledujúcich skupín: valín, alanín a glycín, leucín a izoleucín; kyselina asparágová a glutámová, asparagín a glutamín; serín a treonín; lyzín a arginín; a fenylalanín a tyrozín. K nepolámym hydrofóbnym aminokyselinám patrí alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryptofán a metionín. K polárnym neutrálnym aminokyselinám patrí glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. K pozitívne nabitým (bázickým) aminokyselinám patrí arginín, lyzín a histidín. K negatívne nabitým (kyslým) aminokyselinám patrí kyselina asparágová a kyselina glutámová. Ďalšie konzervatívne substitúcie sú odborníkovi jasné. Tak napr. na konzervatívnu substitúciu aminokyseliny alanínu je možné vybrať ktorúkoľvek z aminokyselín, ako je D-alanín, glycín, beta-alanín, L-cysteín a D-cysteín. Za lyzín je možné vybrať ako náhradu ktorúkoľvek z aminokyselín D-lyzín, arginín, D-arginín, homoarginín, metionín, D-metionín, omitín a D-omitín. Všeobecné substitúcie, pri ktorých sa dá očakávať, že spôsobia zmeny vo funkčných vlastnostiach izolovaných polypeptidov, sú prípady, keď: i) polárny zvyšok, napr. serín alebo treonín, je nahradený (alebo sa použije na nahradenie) hydrofóbnym zvyškom, napr. leucínom, izoleucínom, fenylalanínom alebo alanínom, ii) cysteínový zvyšok je nahradený (alebo sa použije na nahradenie) iným zvyškom a alebo iii) zvyšok majúci elektropozitívny vedľajší reťazec napr. lyzín, arginín alebo histidín, je nahradený (alebo sa použije na nahradenie) zvyškom majúcim elektronegatívny vedľajší reťazec, ako je napr. kyselina glutámová alebo asparágová, alebo iv) zvyšok majúci objemný vedľajší reťazec, ako je napr. fenylalanín, je nahradený (alebo sa použije na nahradenie) zvyškom, ktorý nemá taký vedľajší reťazec, napr. glycínom. Vynález tiež zahŕňa izolované molekuly, ktoré sú alelickými variantami, prirodzenými mutantmi, indukovanými mutantmi alebo proteínmi, ktoré sú kódované DNA hybridizujúcou za podmienok vysokej či nízkej stringencie s nukleovými kyselinami kódujúcimi polypeptid so sekvenciami SEQ ID NO: 2, 4, 6 alebo 8.

Pôvodcovia pripravili ďalšie mutanty interferónu-beta-la, ktoré sú ďalšími variantmi časti interferónu-beta-la vproteíne podľa vynálezu. Tieto interferón-beta-1 a časti môžu byť zvlášť užitočné, pokiaľ prejavujú nové vlastnosti, ktoré nemá interferón-beta-la divého typu (pozri príklad 1). Stručne zhrnuté, uskutočnila sa mutačná analýza ľudského interferónu-beta-1 a s cieľom mapovať aminokyselinové zvyšky nutné na aktivitu a väzbu receptora. Dostupnosť trojrozmernej kryštálovej štruktúry ľudského interferónu-beta-la (pozri Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818) umožnila identifikovať, na alanínové (alebo serínové) substitúcie zvyšky, ktoré sú vystavené rozpúšťadlu a sú dostupné na interakcie s receptorom interferónu-beta a pritom zachovať aminokyselinové zvyšky podieľajúce sa na vytváraní intramolekulárnych väzieb. Pripravil sa panel 15 alanínových „skenovacích“ mutantov, kde sa nahradilo 2 až 8 zvyškov v určitých oblas tiach závitníc (A, B, C, D, E) a slučiek (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) interferónu-beta-la (pozri príklad 1).

Amino-koncová histidínová značka („his“ tag) bola vložená na afinitnú purifikáciu mutantov exprimovaných v cicavčích bunkách (sekvencia SEQ ID NO: 2, obr. 1). Funkčné dôsledky týchto mutácií boli vyhodnotené pomocou antivírusových a antiproliferačných testov. Vyvinul sa tiež nerádioaktívny väzobný test na analýzu schopností mutantov viazať sa na receptor interferónu-beta na povrchu buniek (Bunkový povrchový receptor IFNAR1/2). Navyše sa použil test založený na ELISA-teste používajúci fúzny proteín „ektodoména IFNAR2/Fc“ na naviazanie interferónu na mapovanie povrchových interakcií medzi interferónom-beta-la a IFNAR2 (pozri príklad 2). Tieto mutačné analýzy ukázali, že N- a C-konce ležia v časti molekuly interferónu-beta, ktorá nie je dôležitá na väzbu receptora alebo na biologickú funkciu.

Identifikovali sa tri druhy účinkov, ktoré boli spôsobené cielenou mutagenézou. Tieto účinky môžu byť za určitých okolností výhodné pri vývoji interferónových liečiv. Tieto tri účinky sú nasledujúce: a) mutanty s vyššou antivírusovou aktivitou než interferón-beta-1 a divého typu s his-značkou (napr. mutant Cl), b) mutanty aktívne tak v antivírusovom, ako aj antiproliferačnom teste, ale ich antiproliferačná aktivita bola neúmerne nízka v porovnaní s antivírusovou aktivitou, vzhľadom na interferón-beta-la divého typu s hisznačkou (napr. mutanty Cl, D a DE1) a c) funkčne antagonistické mutanty (napr. Al, B2, CD2 a DE1), ktoré vykazujú antivírusovú aj antiproliferačnú aktivitu, ktorá bola neúmerne nízka v porovnaní s väzbovou aktivitou na receptor, vzhľadom na interferón-beta-la divého typu.

Okrem toho aj spojenie medzi interferónovou časťou (X) a druhou časťou (Z), ktorá je odlišná od interferónu-beta-la (napr. Fc fragment imunoglobulínu) môže byť spôsobené chemickou reakciou, ktorá bude viazať obe molekuly tak dlho, pokiaľ si imunoglobulín a interferón-beta-la zachovajú svoje aktivity. K takýmto chemickým spojeniam patrí napr. kovalentná väzba, afinitná väzba, interkalácia, koordinačná väzba a vytvorenie komplexu. Príkladom spojovacích činidiel (t. j. linkera Y v generickom vzorci), ktorá vytvorí kovalentné väzby medzi interferónovou a imunoglobulínovou časťou, patria organické zlúčeniny ako napr. tioestery, karbodiimidy, sukcínimidestery, diizokyanáty, ako je tolyén-2,6-diizokyanát, glutaraldehydy, diazobenzény a hexametyléndiamíny, ako je napr. bis-(p-diazóniumbenzoyl)-etyléndiamín, bifunkčné deriváty imidoesterov, ako je dimetyladipimidát abiaktívne zlúčeniny flóru ako je l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzén. Tento výpočet nie je samozrejme vyčerpávajúcim zoznamom rôznych tried chemických väzobných činidiel v odbore známych. Mnohé z nich sú tiež komerčne dostupné ako napr. N-sukcínimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát (SPDP), hydrochlorid l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimidu (EDC); 4-sukcínimidyloxykarbonylalfa-metyl-al-fa-(2-pyridylditio)-toulén (SMPT: Pierce Chem. Co., katalóg, č. 21558G).

IV. Využitie vynálezu

Fúzne proteíny podľa vynálezu sa môžu využiť v terapeutických kompozíciách tam, kde je potreba použiť liečenie interferónom. Tieto molekuly majú výhody fuznych proteínov, hlavne íuznych proteínov s Ig, ide hlavne o zmenenú farmakokinetiku a farmakodynamiku, ktorá vedie k predĺženému biologickému polčasu a predĺženému času zotrvania v cievnom systéme. Okrem toho zvlášť výhodné proteíny glykozylovaného interferónu-beta-la, hoci sú štruktúrne podobné interferónu-beta-lb, majú mnohonásobne vyššiu biologickú aktivitu než neglykozylovaný interferón-beta-1 b (pozri Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649).

Dokázalo sa, že produkty podľa vynálezu boli užitočné na udržanie biologického polčasu terapeutického interferónu-beta-la a môžu byť na terapeutické podávanie upravené napr. rozpustením vo vode alebo v inom vhodnom kvapalnom médiu. Podávanie sa uskutočňuje parentálnym alebo perorálnym spôsobom alebo vo forme aerosólu. Na perorálne podávanie môžu byť pripravené jemné koloidné suspenzie na dosiahnutie depotného účinku pri parentálnom podávaní alebo pri perorálnom podávaní, zatiaľ čo aerosólové prípravky sú povahou kvapalné prípravky alebo vo forme suchého prášku. Fúzie interferónu-beta-la podľa predkladaného vynálezu by mali mať dobrú stabilitu pri skladovaní v suchom lyofilizovanom stave alebo ako kvapalné prípravky.

Terapeutické proteíny podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité na profylaxiu alebo na liečenie akéhokoľvek ochorenia alebo poruchy, pre ktoré je účinnou zložkou interferónu-beta-la. Okrem toho fúzne proteíny podľa vynálezu sa môžu použiť na diagnózu zložiek, stavov alebo ochorení v biologických systémoch alebo vzorcoch, rovnako ako na diagnostiku v iných než fyziologických systémoch.

Pri terapeutickom využití predkladaný vynález predpokladá využitie na liečenie zvieraťa, ktoré buď už trpí alebo je latentné náchylné na ochorenie a vyžaduje teda také liečenie, ktoré spočíva v tom, že sa zvieraťu podáva účinné množstvo fuzneho proteínu podľa vynálezu, ktoré je terapeuticky účinné na dané ochorenie alebo poruchu. K subjektom, ktoré budú liečené fúznymi proteínmi podľa vynálezu patria zvieratá a predovšetkým človek. V závislosti od ochorenia alebo stavu, ktoré majú byť liečené, zvieraťu sa podáva fúzny proteín interferónu-beta-la podľa vynálezu v akejkoľvek terapeuticky účinnej a bezpečnej dávke, ktorú odborník ľahko stanoví bez nutnosti nadmerného experimentovania. Vzhľadom na medzidruhovú bariéru na interferóny typu I je nevyhnutné pripraviť fúzne proteíny interferónu-beta-la podľa vynálezu vždy s interferónmi zo zodpovedajúceho biologického druhu.

Antiproliferačná bunková aktivita interferónu-beta-la je dobre známa. Konkrétne niektoré fúzie interferónu-beta-la opísané v predkladanej prihláške sú užitočné na liečenie nádorových a rakovinových ochorení, ako je napr. osteognénny sarkóm, lymfóm, akútna lymfocytáma leukémia, karcinóm prsníka, melanóm a nasofarygeálny karcinóm a tiež autoimunitných ochoreniach, ako je napr. fibróza, lupus a roztrúsená mozgovomiechová skleróza. Tiež sa dá očakávať, že antivírusová aktivita, ktorú prejavujú fuzne proteíny podľa vynálezu, sa využije na liečenie vírusových ochorení, ako je napr. infekcia ECM, chrípka a ďalšia infekcia respiračného traktu, hepatitída a besnota. Tiež sa dá očakávať, že imunomodulačná aktivita, ktorú prejavujú fúzne proteíny podľa vynálezu sa využije na liečenie autoimunitných a zápalových ochorení, ako je napr. fibróza arostrúsená mozgovomiechová skleróza. Schopnosť interferónu-beta-la inhibovať vytváranie nových krvných ciev (t. j. inhibovať angiogenézu a neovaskularizáciu) predurčuje fúzne proteíny podľa vynálezu na použitie pri liečení angiogénnych ochorení, ako je napr. diabetická retinopatia, retinopatia predčasne narodených, makuláma degenerácia, odvrhnutie štepu rohovky, neovaskulámy glaukóm, retrolentálna fibroplázia, rubeóza a Osler-Weberov syndróm. Okrem toho antiendotelová aktivita interferónu je už nejaký čas známa a jeden z možných mechanizmov pôsobenia interferónu môže byť narušenie aktivity endotelových buniek tým, že inhibuje produkciu alebo aktivitu angiogénnych faktorov produkovaných nádorovými bunkami. Niektoré cievne nádory, ako napr. hemangiómy, sú zvlášť citlivé na liečenie interferónom. Liečenie interferónom alfa je zatiaľ jediným doloženým spôsobom liečenia tohto ochorenia. Možno očakávať, že liečenie fuznymi proteínmi interferónu-beta-la podľa vynálezu poskytne značný farmaceutický prospech v zmysle zlepšenej farmakokinetiky a farmakodynamiky lebo konjugáty zostávajú v cievach po dlhší čas než nekonjugované interferóny, čo umožňuje oveľa účinnejšiu terapiu použitím konjugátov ako antiangiogénneho liečiva (pozri príklad 9).

Fúzie polymér-interferón-beta-la podľa vynálezu môžu byť podávané samotné alebo vo forme farmaceutický prijateľných esterov, solí alebo iných fyziologicky aktívnych derivátov. V týchto farmaceutických prípravkoch je interferón-beta-la výhodne používaný spoločne s jedným alebo viac farmaceutický prijateľnými nosičmi a voliteľné akýmikoľvek ďalšími terapeutickými zložkami. Nosič musí byť farmaceutický prijateľný v tom zmysle, že musí byť kompatibilný s ostatnými zložkami v prípravku a nesmie byť nadmerne škodlivý pre príjemcu. Prípravok interferónu-beta-la sa podáva v množstve účinnom na dosiahnutie požadovaného farmakologického účinku, ako už bolo opísané a takýchto čiastočných množstvách, aby bolo dosiahnuté požadovanej dennej dávky.

K vhodným liekovým formám patria formy na parentálne a iné podávanie, k vhodným špecifickým spôsobom podávania patria napr. podávanie perorálne, rektálne, bukálne, topické, nazálne, oftalmické, subkutánne, intramuskuláme, intravenózne, transdermálne, intratekálne, intraartikuláme, intraarteriálne, subarachoidálne, bronchiálne, lymfatické, vaginálne a intrautéme. Výhodné sú liekové formy na perorálne, nazálne a parentálne podávanie.

Pokiaľ je interferón-beta-la použitý v prípravku, ktorý obsahuje tekutý roztok, prípravok sa výhodne podáva perorálne alebo parentálne. Pokiaľ je intreferón-beta-la použitý v prípravku, ktorý je vo forme tekutej suspenzie alebo suchého prášku formulovaný spoločne s biologicky kompatibilným nosičom, potom sa môže výhodne podávať perorálne, rektálne alebo bronchiálne.

Pokiaľ je interferón-beta-la použitý v prípravku priamo ako pevná látka vo forme prášku, výhodne sa môže podávať perorálne. Alternatívne sa môže podávať nazálne alebo bronchiálne, pomocou nebulizácie prášku v nosičovom plyne, keď sa vytvára disperzia prášku v plyne, ktorú pacient vdychuje a síce použitím vhodného nebulizačného zariadenia.

Prípravky obsahujúce fuzne proteíny podľa predkladaného vynálezu sa výhodne formulujú do jednotkových liekových foriem a síce akýmikoľvek metódami, ktoré sú odborníkom vo farmácii známe. Tieto metódy všeobecne obsahujú krok, keď sa účinná zložka zmieša s nosičom a prípadne ďalšími pomocnými zložkami. Typicky sa prípravky pripravujú uniformným a dokonalým zmiešaním účinnej zložky (či viac účinných zložiek) s kvapalným nosičom, jemne rozotretým pevným nosičom alebo oboma a potom sa produkt podľa potreby formuluje do požadovaných liekových foriem.

Prípravky podľa vynálezu vhodné na perorálne podávanie sú v podobe diskrétnych jednotiek, ako sú napr. tobolky, oplátky, tablety alebo pastilky, kde každá takáto forma obsahuje predom stanovené množstvo účinnej zložky v podobe prášku alebo granulátu alebo v tekutej forme, vodnej alebo bezvodej, ako je napr. sirup, elixír, emulzia alebo pena.

Tablety sa pripravujú lisovaním alebo odlievaním, prípadne s jednou alebo viac pomocnými zložkami. Lisované tablety sa pripravujú lisovaním na vhodných zariadeniach, kde sa používa účinná zložka vo voľnej sypkej forme, ako je prášok alebo granulát, ktorá sa prípadne miesi s nápojmi, uvoľňujúcimi činidlami, lubrikantmi a inertnými riedidlami, povrchovo aktívnymi činidlami a uvoľňovacími činidlami, odlievané tablety obsahujú zmes práškového polymérového konjugátu s vhodným nosičom a pripravujú sa odlievaním pomocou vhodného zariadenia.

Sirup sa pripraví pridaním účinnej látky do koncentrovaného vodného roztoku cukru, napr. sacharózy, ku ktorému sa pridajú ešte ďalšie pomocné prísady. K takýmto prísadám patria príchute, konzervačné činidlá, činidla spomaľujúce kryštalizáciu cukru a činidlá zvyšujúce rozpustnosť ostatných zložiek, ako sú napr. polyhydroxyalkoholy, ako je glycerol alebo sorbitol.

Liekové formy vhodné na parentálne podávanie výhodne obsahujú sterilné vodné prípravky aktívneho proteínu, ktoré sú výhodne izotonické s krvou príjemcu (napr. fyziologický soľný roztok). Takéto prípravky obsahujú tiež suspendujúce činidlá a zahusťovadlá alebo iné mikročasticové systémy, ktoré sú určené na zacielenie zlúčeniny na krvné zložky alebo do jedného či viac orgánov. Prípravky sú buď v jednodávkovej alebo viacdávkovej liekovej forme.

Prípravky vo forme nosného spreja obsahujú purifikované vodné roztoky aktívneho konjugátu s konzervačnými a izotonickými činidlami. Tieto prípravky majú obvykle pH a tonicitu upravené tak, aby boli kompatibilné s nosnou sliznicou.

Liekové formy na rektálne podávanie sú obvykle čapíky, kde vhodným nosičom je kakaové maslo, hydrogenované tuky alebo hydrogenované mastné karboxylové kyseliny.

Oftalmické prípravky ako napr. očné kvapky sú pripravené podobne ako nosné spreje, s tým rozdielom, že pH a tonicita sú nastavené kompatibilne na oko.

Topické prípravky obsahujú konjugáty podľa vynálezu rozpustené alebo suspendované v jednom alebo viac médiách, ako je napr. minerálny olej, vazelína, polyhydroxyalkoholy alebo iná farmaceutická báza na topické prípravky.

Okrem uvedených zložiek môžu prípravky podľa vynálezu ešte ďalej obsahovať jednu alebo viac doplnkových zložiek, ako sú napr. riedidlá, pufre, príchute, rozvoľňujúce činidlá, povrchovo aktívne látky, zahusťovadlá, lubrikanty, konzervačné látky (vrátane antioxidantov) a ďalšie.

Teda predkladaný vynález poskytuje fúzne proteíny vhodné na in vitro stabilizáciu interferónu-beta-la v roztoku, čo je príklad výhodne inej než terapeutickej aplikácie vynálezu. Fúzne proteíny môžu byť tiež využité na zvýšenie tepelnej stability a odolnosti proti enzymatickej degradácii interferónu-beta-la a poskytujú tak spôsob, ako zvýšiť čas skladovateľnosti, stabilitu pri teplote miestnosti a trvanlivosť reagencií a súprav používaných na výskum.

Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu vynálezu a nijako jeho predmet neobmedzujú. Je zrejmé, že najmä tu opísané in vivo experimenty so zvieratami sa môžu uskutočniť rôznymi spôsobmi, takže sú možné rôzne modifikácie a variácie základných opísaných metód. Tak napr. v príklade 7 môže odborník použiť iný neopterínový test alebo môže zmeniť druh či počet primátov v pokuse. Všetky takéto modifikácie a variácie patria do rozsahu predkladaného vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Štúdie štruktúry/aktivity ľudského interferónu-beta-la s použitím substitučných mutácií alanín/serín: analýza väzobných miest receptora a funkčných domén.

Prehľad

Uskutočnila sa obsiahla mutačná analýza ľudského interferónu-beta-la (INF-beta-la) s cieľom mapovať zvyšky nutné na aktivitu a väzbu receptora. Dostupnosť trojrozmernej (3-D) kryštálovej štruktúry ľudského IFN-beta (Karpusas, M. Et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 11813-11818) umožnila pôvodcom identifikovať substitúciu alanínu (alebo serínu) zvyškov vystavených rozpúšťadlu dostupných na receptorové interakcie a ponechať aminokyseliny zapojené do intramolekulámych väzieb. Navrhol sa panel 15 alanínových substitúcií, ktoré nahradili 2 až 8 zvyškov v priebehu rozdielnych oblastí každého helixu (A, B, C, D) a slučiek (AB, CD2, DE). Na účely afinitnej purifíkácie bola začlenená aminokoncová histidínová značka obsahujúca 6 histidínových zvyškov, ako aj enterokinázová spojovacia sekvencia (linker) na odstránenie aminokoncovej extenzie. Výsledné interferóny sú nazývané ako „interferón(IFN)-beta so značkou his“ alebo „His-interferón-beta“ alebo „His₆-interferón-beta“ a pod.

Skonštruovali sa rôzne mutácie expresných plazmidov IFN-beta so značkou his s použitím génového konštruktu s divým typom IFN-beta ako templátu na mutagenézu. Stratégia mutagenézy vyžadovala najskôr vnesenie štiepneho miesta jedinečného reštrikčného enzýmu prostredníctvom génu IFN-beta so značkou his a potom nahradenie presných sekvencií DNA medzi vybranými reštrikčnými miestami syntetickými oligonukleotidovými duplexmi, ktoré kódovali alanínové (alebo serínové) substitučné mutácie. Nakoniec sa mutované gény IFB subklonovali do plazmidu, ktorý riadil expresiu cicavčích buniek v bunkovej línii 293 z ľudských obličiek.

Funkčné následky týchto mutácií sa hodnotili antivírusovými a antiproliferačnými testami. Bol vyvinutý nerádioaktívny väzbový test na IFN, ktorý analyzoval väzbu týchto mutantov na povrchový receptor („IFNAR1/2 komplex) buniek Daudi ľudského Burkittovho lymfómu. Navyše bol vyvinutý test na mapovanie povrchov pri interakciách medzi mutantmi his-IFN-beta a IFNAR2, ktorý používal fúzny proteín

IFNAR2/-Fc, zložený z extracelulámej domény proteínu IFNAR2 receptora IFN fúzovanej na kĺbovú doménu, doménam CH2 a CH3 ľudského IgGl.

1. Vytvorenie génu interferónu-beta ako templátu na mutagenézu

Pri stratégii pôvodcov na tvorenie mutantov IFN-beta substituovaných alanínom (alebo serínom) najskôr vznikol modifikovaný gén IFN-beta, ktorý kódoval proteín divého typu, ale ktorý niesol štiepne miesta jedinečných reštrikčných enzýmov v géne. Jedinečné miesta boli použité na zámenu sekvencií divého typu syntetickými oligonukleotidovými duplexami, ktoré kódovali mutované kodóny. Aby sa získala expresná kazeta ľudského IFN-beta-la vhodná na tvorbu mutovaných génov, bola cDNA IFN-beta (GenBank prístupové č. E00029) amplifikovaná pomocou PCR. Bolo nevyhnutné počiatočné klonovanie génu IFN-beta do plazmidu pMJB107, derivátu pACYC184, (pozri Rose, et. al., 1988, Nucleic Acids Res., 16(1), 355), aby sa mohla uskutočňovať miestne cielená mutagenéza génu v plazmide, ktorému chýbali špecifické reštrikčné miesta vytvárané počas mutagenézy.

Priméry na PCR použité na subklonovanie kódujúcich sekvencií génu ľudského IFN-beta tiež umožnili pôvodcom zaviesť enterokinázovú spojovaciu sekvenciu v protismere a v rámci s génom IFN-beta:

'-PCR primér: 5'-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 9: „BET-021“), a

-PCR primér:

'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3' (sekvencia SEQ ID NO: 10: „BET-022“)

A hraničnej oblasti miest reštrikčných enzýmov (BspEI a Xhol) užitočné na klonovanie do miest plazmidu pMJB107. Výsledná DNA bola nazvaná PCR fragment A.

Výkonná signálna sekvencia z ľudskej adhéznej molekuly cievnej bunky-1 (VCAM-1) a značka („tag“) šiestich histidínov boli vnesené do konečného konštruktu z druhého fragmentu DNA vytvoreného z pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z ktorého bol odstránený gén EBNA-1, a ktorý nesie signálnu sekvenciu VCAM-1 (VCAMss) fúzovanú v protismere a v rámci so značkou šiestich histidínov. Priméry PCR, ktoré boli použité na vytvorenie kazetovej skupiny VCAMss-1/histidínová značka, boli KID-369 (5'PCR primér): 5 '-AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3' (sekvencia SEQ ID NO: 11) a KID-421 (3 'PCR primér):

'-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 12) začleňujúce hraničné štiepne miesta reštrikčných enzýmov (Notl a BspEI), ktorá umožnila excíziu fragmentu B DNA.

Na vytvorenie plazmidového vektora, ktorý niesol signálnu sekvenciu VCAM-1, značku his a gén interferón-beta, uskutočňovali pôvodcovia trojcestnú ligáciu s použitím DNA fragmentov purifikovaných cez gél z plazmidového vektora pMJB107 (štiepeného Notl aXhoľ), PCR fragmentu A (štiepeného ÄsyEI aATml) a fragmentu B (štiepeného Notl a ÄspEI). Ligovaný plazmid bol použitý na transformáciu buniek E. coli buď JA221 alebo XLl-Blue a boli vyberané kolónie rezistentné na ampicilín a testované na výskyt inzertov analýzou reštrikčných máp. Bola izolovaná DNA pomocou Maxiprepu a sekvencia inzertu bola overená sekvenovaním DNA. Výsledný konštrukt bol nazvaný pCMG260.

2. Príprava mutantov ľudského interferónu-beta v pCMG260 substitúciou alanínu

Plazmid pCMG260 sa použil ako templát na niekoľkokrát opakovanú mutagenézu (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), ktorá zaviedla jedinečné reštrikčné štiepne miesta do pozícií v priebehu kódujúcej sekvencie proteínu IFN-beta, ale nezmenila výslednú sekvenciu proteínu. Mutované plazmidy boli použité na transformáciu buď JA221 alebo XLl-Blue kmeňa E. coli a rekombinantné kolónie boli vyberané podľa rezistencie na chloramfenikol. Kolónie rezistentné na chloramfenikol sa ďalej testovali na výskyt požadovaného miesta jedinečného reštrikčného enzýmu pomocou analýzy reštrikčných máp DNA. Výsledný plazmid IFN-beta, pCMG275.8, obsahoval úplnú sadu jedinečných štiepnych miest reštrikčných enýmov a DNA overila sa sekvencia génu. Kompletná sekvencia DNA modifikovaného génu interferón-beta so značkou his, spoločne s kódujúcou sekvenciou proteínu divého typu, sú uvedené na obrázku 1.

Kompletný súbor alanínových substitučných mutácií je uvedený v tabuľke 1 (SEQ ID NO: 60 a 45-59). Názvy mutantov špecifikujú štrukturálne oblasti (helixy a slučky), do ktorých boli vnesené mutácie. Panel všetkých mutácií alanínových (serínových) substitúcií má za následok mutácie 65 až 165 aminokyselín ľudského IFN-beta.

Panel mutantov bol vytvorený z pCMG275.8 nahradením segmentov DNA medzi jedinečnými reštrikčnými miestami syntetickými oligonukleotidovými duplexami, ktoré niesli genetickú kódujúcu informáciu uvedenú v tabuľke 2. Aby sa vytvorili plazmidy s rôznymi alanínovými substitučnými mutantmi, ligovali sa spolu vektor pCMG275.8 purifikovaný cez gél (štiepený príslušným reštrikčným enzýmom, ako je uvedené na zozname ďalej v texte, na každú štrukturálnu oblasť IFN-beta) a oligonukleotidové duplexy (kódujúce sekvencie vlákien sú uvedené v tabuľke 2). Ligačné zmesi sa použili na transformáciu JA221 kmeňa E. coli a rekombinantná kolónie sa vybrali podľa rezistencie na ampicilín. Kolónie rezistentné na ampicilín boli testované na výskyt inzertov s mutáciami prostredníctvom skríningu na príslušné miesta reštrikčných enzýmov. Na dva mutanty (A2 a CD2) stratégia klonovania vyžadovala použitie dvoch duplexov syntetických oligonukleotidov (uvedených v tabuľke 2), ktoré niesli komplementárne presahujúce konce, aby bolo možné ligovať ich k sebe navzájom a na kostru vektora IFN-beta v trojcestnej ligácii. Nasledujúci zoznam ukazuje miesta, ktoré boli použité na klonovanie mutovaných oligonukleotidov z tabuľky 2. Schéma klonovania (pododdiel B) ukazuje pozície týchto jedinečných miest v géne interferónu beta.

ÄspEI až Munl alebo BgZII až PstI Munl až PstI alebo Munl až ÄsaHI

A helix Slučka AB

B helix

C helix

Slučka CD2

D helix

Slučka DE

E helix

BspHI až B.sal alebo B.saHI až Bsal

Bsal až Xbal

Xbal až B.spHI alebo Xbal až DralII

BspHI až DralII

BspHI až Pvul

Pvul až B.síEIľ

Tabuľka 1

Pozície alanínových substitučných mutácií ^ΗΙ ΊΕΝ-β

10 30 10 «0 SO

«... . ».....· .. , .1......| ......t ...

IFN-β ΜδΏΠ^ΡΙΛΚβδΝΚΟαΟΚΙΛΜςΐίΚΪΒΙιΕΥΟΧΛΟΒΜΝΡΟΙΡΕΕΙΚΟ^ΟΟΡΟΚΕ Al -A-AA—A—A-----------------------------------------A2 --------------AA-AA—AA-----------------------------ABI -------------i.-------------AAA-AA-------------------AB2 -----------------------------------AA-A—A----------AB3 --------------------------------------------ΑΑΑΑΑ-ΑΆΑ

I_________.helix A___________j |___________AB loop_____________[ <0 70 eo so 100 i . .. i .., l.....· . . J......

IFN-β ΟΑΑ^ΤΧΥΕΜΙΛΝΙΓΑΙΡβΟϋΞδετσΗΝΕΤίνΕΝΙΙΛΝνΥΗΟΙΝΙ&ΚΓνηΕΕία^ΕΚΕ BI --------—A—AS----------------------------------------B2 -----------------AAA-----------------------------------d ---------------------------AS—AA—S-------------------C2 --------------------------------------A A—AA--------CD1 -------------------------------------------------AA—-AAA

I___________.helix B__| j_______________________________j f_CD loop_

IFN-β

CD2 D

DE1 DE2

E

110 120 130 140 1S0 140

I.....t . I......«. .< ... ¹

DFTRGAUaSSLHUCRYYGRIUiYLKAKEYSHCAWTrVRVEILRNFYRINRLTGYLRN AA-A—A—-A----------------------------------------------------------------A-AA—A---------------------------------------------------------AA---------------------------------------------------------AA---------------------------------------------------------------A---A—A—A-------CD loop-ι j_____helix D____| j_______helix E_----------[

K tab. 1: Riadok označený IFN-β ukazuje divý typ sekvencie ľudského IFN-β alanínové alebo serínové substitúcie zvyškov IFN-β sú ukázané pre každý mutant a čiarky, pod relevantnými oblasťami, označujú sekvencie divého typu. Štruktúry helixov a slučiek sú uvedené ako plné čiary pod mutantmi. Slučka DE preklenuje medzeru medzi helixmi D a E. Boli vytvorené dva ďalšie alanínové substitučné mutanty (H93A, H97A a H121 A) a analyzovali sa v antivírusových testoch na stanovenie účinku mutácií týchto histidínov, ktoré tvoria cheláty so zinkom v kryštálovej štruktúre diméru. Oba tieto mutanty si podržali plnú aktivitu divého typu v antivírusových testoch, čo svedčí o tom, že zinkom sprostredkovaná tvorba diméru nie je dôležitá na aktivitu IFN-β.

Tabuľka 2

Al	SEQ ID NO: 13 BET-053	CCGGAGÄCGATGAIGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTÄCAAG
A2	SEQ ID
GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCIGGCTGCCTTGAATGGGAGGO
	NO: 14	TTGAATACT
	ΒΞΤ-039
	SEQ ID
	NO: 15	GCCTCÄAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGÄTTAA.GCACCTGCA
	BET-041

ABI SEQ ID

AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCäGACäGGATGAACTTTGACAT

NC;16 CCCTGAGGäGATTAAGCAGCTGCÄ

BET-OSO

Α32 SEQ ID

AATTGÄATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTľGCOÄT

NO: 17 CCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA

3ET-082

A33 SEQ ID aatoäätgggaggcttgaatäctgcctcaaggacaggatgaacttcgacä

NO: 13

BET-034

SEQ ID

NO: 19

BET-036

SEQ ID

NC: 20

CGCCGCGTCGÄCCATCTATGÄGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTľCÄGA CAAGATTCArcrAGCÄCTGGCTGGAÄ

SET-110

SEQ ID CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGC'

NO: 21 GCAGCTrCATCTAGCÄCTGGCTGGAA

SET-112

Cl SEQ ID

GGAÄTGCTTCÄATTGTTGCTGCACŤCCTGAGCAÄTGTCTA’TCATCAGATAAA

NO: 22 CCATCTCAAGACAGTTCTAG

BET-114

C2 SEQ ID

GGAATGAGACCäTTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCäGäTäGC

	NO: 23 SET-092	acatctggctgcacttctag
CDI	SEQ ID NO; 24 BET-0S4	ctagctgc.vaactggctgcagctgatttcaccaggggaaääct
CD2	SEQ ID	CTAGAAGAAÄAS.CTGGAGAÄAGAAGCAGC'rACCGCT^AAAAGCAATGAGCG
	NO: 25 BET-0S5	CGCTGCACCTGAAÄAGA
	SEQ ID »0:25 3ET-1CS	'TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAÄGGCCÄ.AGGAGTAC'rCACACTGT
Dl	SEQ XD	CATGAGCAGTCTCCACCTGAAAAGATATTATCGGGCAATTGC'TGCATACCT
	»0:27 SET-108	GGCAGCCAAGGAGTAC7CACACTGT
DE1	SEQ ID	catgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcättacct
	140:23 SET-116	GAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGÄT
DE2	SEQ ID	CÄTGÄGCAGTOTGOAOCTGAJvAÄGATATTATGGGAC-GÄTTCTGCATTACC'rG
	NO: 29 3ET-118	AäGGCääAGGAGíACGCTGCATGTGCCTGGACGÄT
E1	SEQ ID NO: 30 BET-1C4	CGTCAGAGCTGAäATCCTAGCAAACTTTGCATTCäTTGCAAGACTTäCäG

B. konštrukcia expresných plazmidov EBNA 293

Gén divého typu a mutovaný gén IFN-beta, fúzované so signálnou sekvenciou VCAM-1, značkou his a enterokinázovou spojovaciou sekvenciou, boli purifikované cez gél ako reštrikčné fragmenty Nôti a BamHI s veľkosťou 761 bázových párov. Purifikované gény boli subklonované do plazmidového vektora pDSW247, čo je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), štiepeného Nôti a BamHI, ako je ukázané v schéme. Plazmid pDSW247 je expresný vektor na prechodnú expresiu proteínu v bunkách EBNA 293 z ľudských obličiek (Invitirogen, Carlsbad, CA). Obsahuje cytomegalovírusový promótor skorého génu a EBV regulačné prvky, ktoré sú nevyhnutné na vysokú hladinu génovej expresie v tomto systéme, ako aj markery selekcie na E. coli (rezistencia na ampicilín) a na bunky EBNA 293 (rezistencia na hygromycín). Ligované plazmidy boli použité na transformáciu buď JA221 alebo XLl-Blue kmeňov E. coli a kolónie rezistentné na ampicilín boli vyberané a testované na výskyt inzertov analýzou reštrikčných máp. Izolovala sa DNA pomocou maxiprepu a sekvencie inzertov sa overili sekvenovaním DNA. Pozitívne klony prejavujúce požadované mutované sekvencie boli použité na transfekciu buniek EBNA 293 ľudských obličiek tak, ako je opísané ďalej.

Všeobecné klonovacie a expresné stratégie sú uvedené na obrázku 12.

C. Expresia a kvantifikácia IFN-beta-i a alanínových substitučných mutantov

Ľudské bunky EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Chittenden, T. 1989, J. Virol. 63, 3016-3025) boli udržiavané ako subkonfulentné kultúry v Eagleho médiu modifikovanom podľa Dulbecca doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom, 2 mM glutamínom a 250 g/ml geneticínu (Life technologies, Gaithersburg, MD). Expresné plazmidy pDSW247 boli prechodne transfekované do buniek EBNA 293 s použitím protokolu s lipofektamínom (Gibco/BRL, Life Technologies). Kondicionované médiá sa odobrali 3-4 dni po transfekcii, zvyšky buniek sa odstránili centrifugáciou a koncentrácia his-IFN-beta bola kvantifikovaná testom ELISA.

ELISA sa uskutočnila použitím polyklonálnych králičích protilátok (metódou proteínu A purifikovanej IgG, protilátky boli pestované proti purifikovanému ľudskému IFN-beta-la) na naviazanie na 96-jamkové doštičky na testy ELISA a biotinylovaná forma toho istého polyklonálneho králičieho IgG bola použitá ako sekundárna reagencia na umožnenie detekcie interferónu s použitím chrenovej peroxidázy konjugovanej so streptavidínom (HRP: Jackson Immuno Research, W. Grove, PA). Na vytvorenie štandardných kriviek koncentrácie bol použitý rad riedení interferónu-beta-la. Kondicionované médiá z EBNA transfektant obsahujúce his-IFN-beta boli nariedené tak, aby sa získali vzorky s koncentráciami v rozmedzí od 10 ng/ml do 0,3 ng/ml v teste ELISA. Aby boli koncentrácie IFN-beta v médiu zistené testom ELISA potvrdené, bola uskutočnená analýza westemovým prenosom. Redukované supematanty z tkanivových kultúr a štandardy IFN-beta-la boli podrobené SDS-PAGE na géloch s gradientom 10 - 20 % (Novex, San Diego, CA) a prenesené na membrány PDVF. Imunoreaktívne pásy sa detegovali králičím polyklonálnym antisérom anti-IFN-beta-la (č. 447, Biogen, Inc., druhé antisérum, ktoré bolo pestované proti IFN-beta-la) a potom nasledovalo ošetrenie somárím proti-králičím IgG konjugovaným s HRP (Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA).

D. Hodnotenie mutantov interferónu-beta na väzbu na receptor

Vlastnosť viazať receptor mutantov interferónu-beta opísaných v časti C bola hodnotená použitím dvoch odlišných väzbových testov. Jeden test meral väzbu mutantov interferónu-beta na fúzny proteín, IFNAR2/Fc, zahrnujúci extracelulámu doménu ľudského receptora IFNAR2 fúzovanú na časť konštantnej oblasti ľudského IgG. IFNAR2-Fc bol exprimovaný v bunkách ovárií čínskeho škrečka (CHO) a purifikovaný prostredníctvom afinitnej chromatografíe s proteínom A Sepharose™ podľa inštrukcií výrobcu (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. č. 20334). Väzba mutantov interferónu-beta na IFNAR2-Fc bola meraná v teste ELISA. Doštičky na test ELISA boli pripravené cez noc pri 4 °C naviazaním 50 μΐ/jamku myšej proti-ľudskej IgGl monoklonálnej protilátky (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) vkoncerácii 10 g/ml vo väzbovom pufri (50 mM NaHCO₃, 0,2 MM MgCl₂, 0,2 mM CaCl₂, pH 9,6) na 96-jamkové doštičky s plochým dnom. Doštičky boli dvakrát premyté s PBS obsahujúcim 0,05 % Tween-20™ a blokované s 0,5 % netučným sušeným mliekom v PBS 1 hodinu pri teplote miestnosti. Po dvoch ďalších premytiach sa do každej jamky pridalo 50 μΐ 1 g/ml IFNAR2-Fc v 0,5 % mlieku v PBS obsahujúcom 0,05 % Tween-20™ a inkubované 1 hodinu pri teplote miestnosti a doštičky sa potom ešte dvakrát premyli. Väzba mutantov interferónu-beta na IFNAR2-Fc bola meraná pridaním 50 μΐ/jamku mutantov interferónu-beta v kondiciovanom médiu, sériovo riedenom Eagleho médiom modifikovaným podľa Dulbecca (DMEM) doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom a inkubáciou 2 hodiny pri 4 °C. Riedenie mutantov interferónu-beta sa typicky pohybovalo od približne 1 M dolu k 10 pM. Na premytie bol interferón-beta naviazaný na doštičky detegovaný pridaním 50 μΐ/jamku zmesi skladajúcej sa z 1 : 1000 riedenej králičej polyklonálnej anti-interferónovej protilátky (č. 447) plus somárieho protikráličieho IgG značeného chrenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch) a uskutočňovala sa inkubácia 15 minút pri 4 °C. Po dvoch premytiach bol pridaný HRP substrát a doštička sa inkubovala pri 4 °C pred odpočtom na čítacom zariadení na doštičky ELISA pri absorbancii 450 nm. Dáta sa vyniesli ako absorbancia proti koncentrácii mutantov interferónu-beta a afinita väzby mutantov interferónu-beta na IFNAR2-Fc sa určila vynesením dát do jednoduchej hyperbolickej väzobnej rovnice. Výsledky z týchto analýz sú ukáza né na obrázku 3, na ktorom je väzobná afinita každého mutanta, zisťovaná aspoň v troch nezávislých pokusoch, vyjadrená ako percento afinity meranej pre His₆-divý typ interferónu-beta-la. Druhý test väzby receptora bol použitý na meranie afinity, s ktorou sa mutanty interferónu-beta viažu na bunky Daudi exprimujúce oba receptorové reťazce, IFNAR 1 a IFNAR 2, ktoré dohromady obsahujú receptor pre interferón-beta. Tento test založený na FACS používal blokujúcu monoklonálnu protilátku namierenú proti extracelulámej doméne IFNAR1, EA12 (Biogen, Inc.) na odlíšenie neobsadeného (voľného receptora od receptora, na ktorý bol naviazaný interferón-beta. Bunky Daudi (20 μΐ pri 2,5 x 10⁷ buniek/ml) boli nanesené na 96-jamkové doštičky pre test ELISA s dnom v tvare V a inkubované 1 hodinu pri 4 °C s rôznymi koncentráciami mutantov interferónu-beta (20 μΐ v pufrí FACS, 5 % FBS, 0,1 % NaN₃ v PBS). Žiaduce sériové riedenia mutantov interferónu-beta sa pohybovali v rozmedzí od 0,5 M do 0,5 pM. Ku každej jamke sa pridalo 100 ng biotinylovanej myšej anti-IFNARl monoklonálnej protilátky EA12 (10 μΐ) a doštičky sa inkubovali ďalšie dve minúty pri teplote miestnosti pred dvojitým premytím pufrom FACS (4 °C). Potom sa bunky inkubovali 30 minút pri 4 °C s 50 μΐ/jamku 1 : 200 nariedeného streptavidínu konjugovaného s R-fykoerytrínom (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), dvakrát premyté pufrom FACS, resuspendované v 300 μΐ pufru FACS obsahujúcom 0,5 % paraformaldehyd a prenesené do polystyrénových skúmaviek 12 x 75 (Falcon 2052). Potom sa vzorky analyzovali prietokovou cytometriou na prístroji FACscan (Becton Dickinson). Dáta sa vyniesli do grafu ako priemerná intenzita fluorescencie kanálu (MFCI) proti koncentrácií mutantov interferónu-beta, väzbové afinity boli definované ako koncentrácia mutantov interferónu-beta poskytujúca 50 % inhibicie zafarbenia protilátky. Každá mutácia sa testovala niekoľkonásobne. Obrázok 2 ukazuje väzbovú afinitu na receptor na každý mutant interferónu-beta, zistený touto metódou, vyjadrenou ako percento afinity meranej pre His₆-divý typ interferónu-beta-la v každom pokuse.

E. Hodnotenie funkcie mutantov interferónu-beta

Mutanty interferónu-beta boli tiež testované na fúnkčnú aktivitu s použitím in vitro testov na antivírusovú aktivitu a na schopnosť interferónu-beta inhibovať bunkovú proliferáciu. Na každom mutante boli uskutočnené minimálne tri antivirusové testy, každý v troch opakovaniach. His₆-divý typ interferónu-beta-la bol do každého pokusu zahrnutý ako referencia. Antivirusové testy sa uskutočnili ošetrením buniek A549 z ľudského pľúcneho karcinómu (ATCC CCL 185) cez noc dvojkovým sériovým riedením mutantov interferónu-beta v koncentráciách, ktoré preklenuli rozsah medzi plnou antivirusovou ochranou a žiadnou ochranou pred usmrtením buniek vírusom. Nasledujúci deň boli bunky stimulované v čase dvoch dní vírusom encefalomyokarditídy (ECMV) v riedení, ktoré malo za následok úplnú smrť buniek pri chýbaní interferónu. Doštičky potom boli vyvíjané s metabolickým farbivom MTT (2,3-bis[2-metoxy-4-nitro-5-sulfo-fenyl]-2/7-tetrazólium-5-karboxyanilid) (M-5655, Sigma, St. Louis, MO). Zásobný roztok MTT sa pripravil v koncentrácii 5 mg/ml v PBS a sterilizovaný filtráciou a 50 μΐ tohto roztoku bolo nariedené do tkanivových kultúr (100 μΐ na jamku). Po inkubácii pri teplote miestnosti počas 30-60 minút bol roztok MTT/médium odstránený, bunky boli premyté s 100 μΐ PBS a nakoniec bola metabolizovaná farba solubilizovaná v 100 μΐ 1,2N kyseliny chlorovodíkovej v 90 % izopropanolu. Životaschopné bunky (ako je dokázané prítomnosťou farbiva) boli kvantifikované pri absorbancii pri 450 nm. Dáta boli analyzované vnesením do grafu absorbancie proti koncentrácií mutantov interferónu-beta a aktivita každého mutanta bola definovaná ako koncentrácia, v ktorej bolo usmrtené 50 % buniek. Obrázok 5 ukazuje aktivitu každého mutanta vyjadrenú ako percento aktivity meranej pre divý typ interferónu-beta-la so značkou his v každom pokuse.

U mutantov interferónu-beta bola tiež hodnotená funkcia v antiproliferačnom teste. Bunky Daudi ľudského Burkittovho lymfómu (ATCC č. CCL 213) boli vysiate v koncentrácií 2 x 10⁵ buniek/ml v RPMI 1620 doplnenom 10 % definovaným fetálnym teľacím sérom (Hyclone, Logan, Utah) a 2 mM L-glutamínom. Každá jamka tiež obsahovala danú koncentráciu mutantov interferónu-beta v konečnom celkovom objeme 100 μΐ média na jamku, použité koncentrácie interferónu-beta boli vybrané tak, aby preklenuli rozsah od maximálnej inhibicie proliferácie Daudi buniek k žiadnej inhibícii (t. j. plná proliferácia). Každá koncentrácia testovaných mutantov interferónu-beta bola použitá v duplikátoch a vo všetkých pokusoch bola zaradená séria neošetrených buniek v duplikátoch. Bunky boli inkubované dva dni pri 37 °C, v inkubátoroch s 5 % CO₂ a potom sa do každej jamky pridalo 1 Ci tymidínu s tríciom ((metyl-³H) tymidín, Amersham TRK758) v 50 μΐ média a inkubovaný ďalšie 4 hodiny. Bunky sa odobrali s použitím prístroja LKB na odber buniek z doštičiek a merala sa inkorporácia tymidínu s tríciom použitím čítacieho zariadenia na doštičky LKB beta. Duplikáty experimentálnych hodnôt boli spriemerované a určené ako štandardné odchýlky. Dáta boli vynesené do grafu ako priemerné počty za minútu proti koncentrácií mutantov interferónu-beta a aktivita každého mutanta bola definovaná ako koncentrácia požadovaná poskytnúť 50 % maximálnej pozorovanej inhibicie rastu. Pre každý mutant boli uskutočnené niekoľkonásobné testy. Obrázok 6 ukazuje výsledky vyjadrené ako percento aktivity nájdenej pre divý typ interferónu-beta-la so značkou his v každom pokuse.

F. Vlastnosti mutantov interferónu-beta

Bolo zistené, že divý typ interferónu-beta-la s histidínovou značkou mal v antivírusových a antiproliferačných testoch aktivitu, ktorá bola približne 3-krát nižšia ako zodpovedajúca aktivita nájdená u naznačeného divého typu interferónu-beta-la. Pretože zo všetkých mutantov interferónu-beta obsahovali Al-E na svojich N-koncoch totožnú sekvenciu značky his, boli účinky mutácií na vlastnosti molekuly určované porovnaním aktivít týchto mutantov v antivírusových, antiproliferačných a väzbových testoch s aktivitou pozorovanou na divý typ interferónu-beta-la so značkou his. Pri uskutočňovaní tohto porovnávania pôvodcovia predpokladali, že odchýlky aktivít mutantov Al-E, v porovnaní s divým typom interferónu-beta-la so značkou his sú kvalitatívne a kvantitatívne približne rovnaké, ako účinok, ktorý by tiež mutanty mali v neprítomnosti N-koncovej značky his. Zodpovedajúci predpoklad na značené alebo fúzne konštrukty iných rozpustných cytokínov je všeobecne predpokladaný za platný odborníkmi pracujúcimi s technikou alanínovej skenovacej mutagenézy („alanine scanning mutagenesis“), hlavne keď in vitro funkčná aktivita značeného alebo fúzneho konštruktu je blízka aktivite divého typu cytokínu, ako je tomu v tomto prípade (pozri napr. Pearce, K. H. Jr., et al., J. Biol. Chem., 272, 20595-20602, 1997 a Jones, J. T., et. Al., J Biol. Chem. 273, 11667-11674, 1998).

Dáta ukázané na obrázkoch 3-6 naznačujú tri typy účinku, ktorý bol vyvolaný cielenou mutagenézou. Tento účinok môže byť výhodný na vývoj interferónových liečiv za istých okolností. Tieto tri typy účinku sú:

a) mutanty s vyššou antivírusovou aktivitou, než je aktivita divého typu interferónu-beta-la (napr. mutantu Cl), b) mutanty, ktoré prejavujú aktivitu v oboch testoch, antivírusovom alebo proliferačnom, ale u ktorých je antiproliferačná aktivita disproporčne nízka vzhľadom na antivírusovú aktivitu v porovnaní s divým typom interferónu-beta-la (napr. mutanty Cl, D a DE1) a c) funkčné antagonisty (napr. Al, B2, CD2 a DE1), ktoré vykazujú antivírusovú a antiproliferačnú aktivitu, ktorá je disproporčne nízka vzhľadom na väzbu receptora v porovnaní s divým typom interferónu-beta-la. Je možné pozorovať, že niektoré mutanty patria do viac ako jednej skupiny. Tieto skupiny sú uvedené v prehľade ďalej. Aj keď pôvodcovia charakterizovali tieto skupiny mutantov vzhľadom na tieto príklady uvedené v zozname, je nutné si uvedomiť, že ďalšia mutácia v týchto oblastiach môže mať za následok podobný alebo dokonca zvýšený vplyv na aktivitu:

a) Mutant Cl má antivírusovú aktivitu, ktorá je približne 6-krát väčšia ako aktivita divého typu interferónu-beta-la so značkou his. Predpokladá sa, že tento mutant a ďalšie rovnakého typu sú užitočné na zníženie množstva interferónu-beta, ktorý musí byť podávaný na dosiahnutie daného stupňa antivírusového účinku. Očakáva sa, že zníženie množstva podávaného proteínu zredukuje imunogenicita proteínu a môže tiež znížiť vedľajšie účinky toxicity, ktorá nie je založená na mechanizme účinku. Predpokladá sa, že mutácie v tejto skupine sú výhodné v situáciách, keď terapeutický prospech podávania interferónu-beta vyplýva z jeho antivírusových účinkov a keď antiproliferačné účinky prispievajú k toxicite alebo nežiaducim vedľajším účinkom.

b) Relatívne aktivity (% divého typu) alanínových substitučných mutantov v antivírusovom a antiproliferačnom teste sú porovnané na obrázku 7. U väčšiny mutantov (ktoré sú uvedené na diagonálnej čiare) možno pozorovať koordinovane zmenené aktivity (t. j. antivírusové a antiproliferačné aktivity, ktoré sa líšia o rovnaký faktor od aktivít divého typu interferónu-beta-la so značkou his). Ale niekoľko mutantov vykazuje väčšie odchýlky v aktivite v jednom teste relatívne k druhému, v porovnaní s divým typom interferónu-beta-la so značkou his, ako je dokázané posunom od diagonálnej línie. Tieto tri mutanty sú uvedené v tabuľke ďalej. Mutant Cl vykazuje antivírusovú aktivitu, ktorá je ~6-krát väčšia, ako je aktivita divého typu interferónubeta-la so značkou his, ale jeho aktivita v antiproliferačnom teste je podobná aktivite divého typu. Mutant Cl má teda antivírusovú aktivitu, ktorá je zvýšená faktorom 5,2 proti jeho antiproliferačnej aktivite, relatívne k divému typu interferónu-beta-1 a so značkou his. Podobne mutant D prejavuje 65 % aktivity divého typu v antivírusovom teste, ale iba 20 % aktivity divého typu v antiproliferačnom teste a teda má antivírusovú aktivitu, ktorá je zvýšená 3,4-krát oproti jeho antiproliferačnej aktivite v porovnaní s divým typom. Mutant DE1 prejavuje 26 % aktivity divého typu v antivírusovom teste, ale iba 8,5 % v antiproliferačnom teste a má teda antivírusovú aktivitu, ktorá je zvýšená 3,0-krát oproti jeho antiproliferačnej aktivite v porovnaní s divým typom interferónu-beta-la so značkou his. Keď sú podávané v koncentrácii postačujúcej na dosiahnutie požadovaného stupňa antivírusovej aktivity, ukazujú tieto mutanty proteínov podstatne nižšiu úroveň antiproliferačnej aktivity, ako je proteín divého typu. Predpokladá sa, že mutácia v tejto skupine, ako tie v skupine a) sú výhodné v situáciách, keď terapeutický prospech podávania interferónu-beta vyplýva z jeho antivírusových účinkov a keď antiproliferačné účinky prispievajú na toxicitu alebo nežiaduce vedľajšie účinky.

Mutant	Antivírusová (AV) aktivita (% divého typu)	Antiproliferačná (AP) aktivita (% divého typu)	AV/AP
Cl	571	109	5,2
D	65	19	3,4
DE1	26	8,5	3,0

c) Mutanty s antivírusovou a antiproliferačnou aktivitou, ktorá je nízka vzhľadom na väzbu receptora, v porovnaní s divým typom interferónu-beta-la so značkou his (pozri tabuľku). Mutant Al prejavuje antivírusovú a antiproliferačné aktivity, ktoré sú 2,0-krát a 1,8-krát väčšie ako aktivity pozorované u divého typu interferónu-beta-la so značkou his, ale viaže sa na analogický receptor na bunkách Daudi s afinitou, ktorá je 29-krát väčšia, ako je u divého typu. Väzba tohto mutantu na receptor IFN-beta je teda zvýšená približne 15-krát v porovnaní s antivírusovou a antiproliferačnou aktivitou proteínu. Podobné mutanty B2, CD2 aDEl vykazujú zvýšenie väzby proti antivírusovej aktivite 4,6-, 4,6- a 18-krát, podľa poradia, a proti antiproliferačnej aktivite 3,5-, 15- a 54-krát. Predpokladá sa, že tieto proteíny sú užitočné ako funkčné antagonisty aktivity endogenného IFN-beta a možno aj ďalších endogenných interferónov typu I, pretože majú schopnosť viazať a obsadiť receptor a navyše vyvolať iba malú časť funkčnej odpovede v cieľových bunkách, aká by bola pozorovaná u divého typu IFN-beta.

Mutant	Antivírusová aktivita (AV) (% hmotn.)	Antiproliferačná aktivita (AP) (% hmotn.)	Väzobná aktivita na bunky (% hmotn.)	Väzba/AV	Väzba/AP
Al	200	180	2900	15	16
B2	7,1	9,2	33	4,6	3,5
CD2	150	46	690	4,6	15
DE1	26	8,5	460	18	54

G. Vzťah muteínu k trojrozmernej štruktúre interferónu

Zatiaľ čo publikované kryštálové štruktúry neglykozylovanej formy myšieho interferónu-beta (T. Senda, S. Saitoh a Y. Mitsui, Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon- at 2.15 Resolution, J. Mol. Biol., 253, 187-207, 1995) a ľudského interferónu alfa-2b (R. Radhakrishnan, L. J. Walter, A. Hrúza, P. Reichert, P. P. Trotta, T. L. Nagabhushan a M. R. Walter, Zinc Mediated Dimer of Human Interferon-2b Revealed by X-ray Crystallography, Structure, 4, 1453-1463, 1996) poskytli modely na polypeptidovú kostru ľudského interferónu-beta, pôvodcovia nedávno doriešili štruktúru interferónu-beta-la v jeho glykozylovanom stave (M. Karpusas, M. Nolte, C. B. Benton, W. Meier, W. N. Lipscomb a S. E. Goelz, The Crystal Structure od Human Interferon- at 2,2 Resolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 11813-11818, 1997).

Výsledky mutačných analýz pôvodcov môžu byť zhrnuté vzhľadom na trojrozmernú štruktúru interferónu-beta-la (neuvedené). Niektoré mutácie vyvolali zníženie aktivity (2- až 5-krát znížené). Mutované oblasti zodpovedali substitúciám uvedenými v tabuľkách 1 a 2.

Mutácie, ktoré sú najvýznamnejšie, čo sa týka ich účinku na funkciu, mali za následok dramatické zníženie tak aktivity, ako aj väzby bunkového povrchového receptora. Mutácie v tejto oblasti (A2 helix, AB a AB2 slučky a E helix) zodpovedajú mutáciám vo väzbovom mieste IFNAR2, pretože žiadny z týchto mutantov neviazal v testoch pôvodcu IFNAR/Fc.

Aj keď tieto mutácie, ktoré boli dôležité na väzbu IFNAR2, tiež ovplyvnili bunkovú väzbu, väzbové vlastnosti bunkového povrchu sú tiež ovplyvnené zvyšky v ďalších oblastiach molekuly (BI helix, C2 helix). Na trojrozmerných modeloch (neuvedených), ktoré zobrazujú pôsobenie alanínových substitučných mutantov, je možné pozorovať, že N-koncová oblasť, C-koncová oblasť a glykozylovaná oblasť C helixu molekuly IFN-beta-la neleží vo väzbovom mieste receptora. Mutácie v týchto oblastiach neznížili biologickú aktivitu alebo väzbu bunkového povrchového receptora.

Príklad 2

Konštrukcia plazmidov na expresiu fuzneho proteínu interferón-beta-la (IFN-beta/Fc)

Na vytvorenie expresného plazmidu bola použitá technológia PCR kódujúceho DNA sekvenciu ľudského IFN-beta fuzovanú na Fc časť molekuly ťažkého reťazca myšieho IgG2a. Plazmidový vektor pDSW247 (pozri príklad 1) je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z ktorého bol odstránený gén EBNA-1. Tento plazmid bol použitý na konštrukciu expresného vektora na prechodnú expresiu proteínu v bunkách EBNA 293 z ľudských obličiek (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen, E. S., et. Al., 1995, Gene, 156, 235-239). Navrhol sa tak, aby obsahoval signálnu sekvenciu ľudskej adhéznej molekuly cievnej bunky I (VCAM-1) v rámci a v protismere od sekvencie interferónu beta a sekvencií Ig.

Expresná kazeta fuzneho proteínu bola zostavená z niekoľkých fragmentov DNA. Aby sa získal fragment DNA kódujúci ľudský gén IFN-beta, bol použitý cDNA subklon ľudského IFN-beta (GenBank prístupové č. E00029) ako templát na PCR s použitím priméru: 5'-GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC (sekvencia SEQ ID NO: 31: „BET-025“) a 5'-GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG (sekvencia SEQ ID NO: 32: „BET -026“), ktoré tiež obsahovali štiepne miesto reštrikčného enzýmu (Bsaľ) v protismere od prvého kodónu IFN-beta. 3'PCR primér (sekvencia SEQ ID NO: 32 BET-026) pre gén IFN-beta eliminoval terminančý kodón IFN-beta a inkorporoval ako do rámca enterokinázovú spojovaciu sekvenciu (DDDDK) (SEQ ID NO: 62) tak terminálne miesto reštrikčného enzýmu (Xhoí), použiteľné na subklonovanie do expresného vektora. Miesto Bsal zavedené v protismere od kódujúcej sekvencie IFN-beta umožnilo pôvodcom ligovať signálnu sekvenciu VCAM-1 do protismeru a v rámci s kódujúcou sekvenciou génu IFN-beta. Táto signálna sekvencia VCAM-1 bola tiež vytváraná pomocou PCR s použitím párov primérov:

'-CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3 '(sekvencia SEQ ID NO: 33: „BET-023“ a

5'-GGTGGTCTCACATGGCTTGAGAAGCTGC-3'(sekvencia SEQ ID NO: 34: „BET-024“), ktoré obsahovali 5'-štiepne miesto reštrikčného enzýmu (Notl, na ligáciu do klonovacieho miesta Notl v pDSW247) a 3'-štiepne miesto reštrikčného enzýmu (Bsal, na ligáciu do 5'-PCR fragmentu interferónu-beta-la). Templátom na PCR bola cDNA ľudskej adhéznej molekuly cievnej bunky I (VCAM-1) (GenBank prístupové číslo X53051).

Aby bol vytvorený fúzny gén IFN-beta-la/Fc, boli uskutočnili sa nasledujúce postupy. Fragment myšieho IgG2a sa odstránil z pEAG293 gélovou purifíkáciou DNA fragmentu po štiepení Sali + ÄawHI. Plazmid pEAG293 je subklon kĺbovej domény, domén CH2 a CH3 myšieho IgG2a (GenBank prístupové číslo V00798) vBluescript IISK+ (Stratagene, LaJolla CA, katalóg. Č. 212205). Nasledujúce páry primérov na PCR:

5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3'(sekvencia SEQ ID NO: 35), kde S=C alebo G, M=A alebo C, R=A alebo G, W=A alebo T a

-CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTT-3 '(sekvencia SEQ ID NO: 36) vytvorili hraničné miesta Sali a Notl na 5'- a 3'-konci kazety, v príslušnom poradí. Kazeta myšej domény IgG2a Fc sa líši od sekvencie z GenBank v jednej báze (kodón V369), vytvárajúca umlčanú mutáciu. Z tejto IgG2a Fc kazety je teda exprimovaný divý typ proteínu Fc.

DNA fragment obsahujúci signálnu sekvenciu VCAM-1 fúzovanú na gén huIFN-beta s C-koncovou enterokinázovou spojovacou sekvenciou bol vystrihnutý z pCMG258 štiepením s Notl až SazwHI a purifikovaný na géli. Miesto Sali sa vyskytovalo na pôvodnom plazmide pDSW247 a je lokalizované hneď v smere a v rámci s kódujúcou sekvenciou IFN-beta. Plazmidový vektor pDWS247 bol pripravený purifíkáciou na géli fragmentu Notl + BawHI (pozri príklad 1). Aby sa zostavil konečný expresný vektor kódujúci fúziu IFN-beta-l/IgG2, uskutočnila sa trojcestná ligácia s použitím uvedených fragmentov. Tento expresný plazmid bol nazvaný pCMG261 a obsahoval signálnu sekvenciu VCAM-1 vo fúzii s génom pre zrelý ľudský IFN-beta, enterokinázovú spojovaciu sekvenciu a Fc doménu myšieho IgG2a. Kompletná DNA (sekvencia SEQ ID NO: 1) a proteínová (sekvencia SEQ ID NO: 2) sekvencia fúzneho proteínu sú uvedené na obrázku 2.

Príklad 3

Produkcia fúzneho proteínu interferónu-beta-la v cicavčích bunkách

Expresný vektor rekombinantného IFN-beta/Fc, pCMG261, bol prechodne transfekovaný do buniek EBNA 293 z ľudských obličiek, aby bola dosiahnutá expresia fúzneho proteínu IFN-beta-la podľa vynálezu. Tento rekombinantný expresný plazmid bol transfekovaný podľa lipofektaminového protokolu (katalóg, č. 18324-020, Life Technologies) do buniek EBNA 283 z ľudských obličiek podľa protokolu výrobcu (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Hawley-Nelson, P., Ciccarone, V., Gebeyehu, G. Jessee, J., Felgner, P. L., 1993, Focus 15.73) s použitím 1 až 3 g plazmidovej DNA na 100 mm misky na tkanivové kultúry na bunky EBNA 293. Deň po lipofektamínovej transfekcii buniek boli médiá nahradené rastovým médiom (Eagleho médiom modifikovaným podľa Dulbecca, 10 % fetálne bovinné sérum, 4 mM glutamín, 250 g Gentecínu/ml (Life Technologies, Gaithersburg, MD)). Kondicionované médiá boli odobraté 3 až 4 dni neskôr a určili sa koncetrácie IFN-beta-l-Fc tak, ako je opísané.

Produkcia fúzneho proteínu IFN-beta/Fc v iných cicavčích bunkách a expresných systémoch na prokaryotické bunky sa môže tiež uskutočniť po prenesení proteínovej kódujúcej oblasti pre fúzny proteín do príslušných expresných vektorov na tieto systémy. Alternatívne expresné systémy zahrnujú cicavčie bunkové expresné systémy, ako sú napríklad bunky ovárií čínskeho škrečka (CHO) (Barsoum, J., 1995, Methods v Mol. Biol. 48, kapitola 18, 225-237) a myšie bunky NS-O (Rossman, C. Et. At., 19996, Proteín Expression and Pur., 7, 335-342) a bunky obličiek opice COS7 (Ettinger, R. Et. Al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:23, 13102-13107). Ďalšie eukaryotické expresné systémy, ktoré by mohli byť použiteľné, sú kvasinky Pichia pastoris (Eldin, P. E. et. AL, 1997,1. Immun. Methods, 201, 67-75) a Saccharomyces cerevisiae (Horwitz, A.

H., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8678-8682).

Kvantifikácia stupňa expresie proteínu IFN-beta-la-Fc v tkanivových supematantoch z transfekovaných buniek EBNA 293 sa uskutočnila pomocou testu ELISA s použitím IgG frakcie králičích polyklonálnych protilátok anti-IFN-beta-la purifikovaných metódou proteínu A (antigén bol purifikovaný IFN-beta-la, Biogen, Inc.) na naviazanie na 96-jamkové doštičky. Protilátka deteguje štandardy IFN-beta-la a tkanivové supematanty v rozmedzí koncentrácie interferónu medzi 10 ng/ml a 0,3 ng/ml. Na detekciu naviazaných inter ferónov sa použili biotinylované králičie polyklonálne anti-IFN-beta-la (rovnaké protilátky, ako je uvedené) a chrenová peroxidáza konjugovaná so streptavidínom. Na potvrdenie hodnôt získaných z testu ELISA sa uskutočnila alanýza westemovým prenosom, keď redukované tkanivové supematanty a štandardy IFN-beta-1 boli separované na 5 - 20 % Tris-glycínových géloch (Novex, San Diego, CA), prenesené na membrány PVDF (Amersham Life Science, Inc., Cleveland, OH) a detegované odlišným králičím polyklonálnym sérom (pestovaným proti IFN-beta-la) a potom nasledovali somárie proti-králičie IgG protilátky konjugované s chrenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).

Príklad 4

Antivírusová aktivita fúzneho proteínu IFN-beta-la/myšia IgG2a

Bunky ľudského pľúcneho karcinómu (A549) boli najskôr ošetrené 24 hodín s IFN-beta-la alebo IFN-beta-myší IgG2a (61, 41, 27, 18, 12, 8,2, 5,5, 3,7, 2,5, 1,6 pg/ml) pred stimuláciou vírusom encefalomyokarditídy (EMCV). Po dvojdennej inkubácii s vírusom boli živé bunky farbené roztokom XTT:PMS (2,3-bis(2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2//-tetrazólium-5-karboxanilid, vnútorná soľ: fenazinmetosulfát, v koncentrácii 333 g/ml a 2 ng/ml, v danom poradí, v pufŕovanom soľnom roztoku) a detegované spektroskopiou v 450 nM. Test sa uskutočnil trojnásobným opakovaním na každú koncentráciu IFN. Na obrázku 8 sú ukázané štandardné odchýlky ako súvislé úsečky. Bolo zistené, že 50 % cytopatický účinok na IFN-beta-la bol približne 0,4 pM. Pre IFN-beta myší IgG2a bol 50 % cytopatický účinok 0,15 pM.

Príklad 5

Konštrukcia a produkcia fúzneho proteínu „ľudský interferón beta-la/ľudský IgGl Fc“

A. Konštrukcia fuzneho proteínu ľudský interferón beta-la/ľudský IgGl Fc

PCR technológia bola použitá na vytvorenie expresného plazmidu kódujúceho DNA sekvenciu ľudského IFN beta fuzovanou s časťou Fc (kĺbová doména, domény CH2 a CH3) molekuly ťažkého reťazca ľudského IgGl.

EBNA konštrukt:

Plazmidový vektor pCH269 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), z ktorého bol odstránené gén EBNA-L Plazmid sa použil na konštrukciu expresného vektora použiteľného na prechodnú expresiu proteínu v bunkách EBNA 293 z ľudských obličiek (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen, E. S., et. al., 1995, Gene, 156, 235-239).

Expresná kazeta fúzneho proteínu bola zostavená z troch fragmentov DNA: fragment Not\ISal\ kódujúci signálnu sekvenciu VCAM-1 v rámci a fuzovanú so sekvenciou kódujúcou ľudský IFN beta, fragment Sall/Nott kódujúci kĺbovú doménu, domény CH2 a CH3 ľudského IgGl a fragment Nôti EBNA expresného vektora pCH269.

Dva nezávislé fragmenty NotUSall kódujúce zrelú signálnu sekvenciu VCAM-1 v rámci a fuzovanú na gén ľudského IFN beta boli vytvorené technológiou PCR. PCR templát bol plazmid pCMG258 (pozri príklad 2), ktorý kóduje zrelú signálnu sekvenciu VCAM-1 v rámci a fuzovanú na gén ľudského IFN beta, ktorý sám je tiež v rámci a fúzovaný na enterokinázovú spojovaciu sekvenciu. Použili sa dve sady primérov na PCR. Jedna sada primérov:

5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (sekvencia SEQ ID NO: 37) a '-ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3 '(sekvencia SEQ ID NO: 38) vniesla zmenu aminokyselín od G do C v pozícii 162. Tento fragment bol nazvaný ľudský IFN beta-C 162. Druhá sada primérov:

-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3 '(sekvencia SEQ ID NO: 39) a '-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3' (sekvencia

SEQ ID NO: 40) tiež zaviedla substitúciu aminokyselín G162 až C162 a zmenila enterokinázovú spojovaciu sekvenciu (DDDDK) (SEQ ID NO: 62) na GGGGS (SEQ ID NO: 64) spojovaciu sekvenciu v rámci a fuzovanú na ľudský gén IFN beta. Tento fragment bol nazvaný ľudský IFN beta-C 162/G4S. Obe sady primérov obsahovali 5 ’-iVoíI miesto na umožnenie ligácie do pCH269, a Sali štiepne miesto na umožnenie ligácie s fragmentomSalUNotl ľudského IgGl.

Ľudský fragment IgGl, ktorý kóduje kĺbovú doménu a domény CH2 a CH3 ľudského IgGl, bol pripravený pomocou štiepenia reštrikčnými enzýmami (SaU/Notl) plazmidu pEAG409, derivátu plazmidu SABI44 (opísaného v patente US 5 547 853). Fragment bol vyrezaný a purifíkovaný cez gél. EBNA expresný vektorový plazmid pCH269 bol štiepený Nôti a purifíkovaný cez gél.

Dva fúzne konštrukty ľudského IFN beta-ľudského IgGl Fc boli vytvorené dvoma trojcestnými ligáciami. Jeden konštrukt, nazývaný ZL6206, obsahoval spojovaciu sekvenciu G4S, druhý konštrukt, nazývaný ZL5107, je priama fúzia. Kompletná sekvencia DNA a proteínu otvoreného čítacieho rámca priamej fúzie (pozri obrázok 10) sú uvedené v sekvencii SEQ ID NO: 41 a v sekvencii SEQ ID NO: 42, podľa poradia.

Kompletná sekvencia DNA a proteínu otvoreného čítacieho rámca fúzie spojovacej sekvencie (pozri obrázok 11) sú uvedené v sekvencií SEQ ID NO: 43 a v sekvencií SEQ ID NO: 44, podľa poradia.

CHO konštrukt:

Bol vytvorený konštrukt v bunkách CHO s trvalou expresiou fúzie „ľudský IFN beta-ľudský IgGl Fc“, ktorý obsahoval ľudský IFN beta priamo spojený s ľudským IgGl Fc. Fragment ľudský IFN- beta-ľudský IgGl Fc bol vystrihnutý z plazmidu ZL5107 s Nôti a purifikovaný cez gél, bol ligovaný do miesta Nôti v pEAG347 (expresný vektor obsahujúci tandem skorého promótora SV40a hlavného neskorého adenovírusového promótora (pochádzajúceho z plazmidu pAD2beta), jedinečné klonovacie miesto Nôti nasledované signálmi na neskoré ukončenie transkripcie SV40 a polyA (pochádzajúce z plazmidu pCMVbeta). pEAG347 obsahuje plazmidovú kostru pochádzajúcu z pUC 19 a dhfŕ pre MTX selekciu a amplifikáciu v transfekovaných bunkách CHO).

B. produkcia fúzneho proteínu ľudský interferón-beta-la/ľudský IgGl Fc Prechodná transfekcia fuznych konštruktov ľudského IFN beta do buniek EBNA293:

Opísané rekombinantné expresné vektory IFN-beta/ľudský IgGl Fc boli prechodne transfekované do buniek EBNA 293 z ľudských obličiek na dosiahnutie expresie fúzneho proteínu IFN-beta-la podľa vynálezu. Tieto rekombinantné expresné plazmidy boli transfekované podľa lipofektamínového protokolu (katalóg, č. 18324-020, Life Technologies) do buniek z ľudských obličiek EBNA 293 podľa protokolu opísaného v príklade 3.

Stabilné transfekcie dhfr-CHO buniek fúznym konštruktom „ľudský IFN-beta-la/ľudský IgGl Fc“ (bez spojovacej sekvencie):

Expresný vektor dhfr obsahujúci rekombinantý IFN-beta/ľudský IgGl Fc (bez spojovacej sekvencie), ktorý už bol opísaný, sa trvalé transfekoval do buniek, aby sa dosiahla expresie fúzneho proteínu IFN-beta-la podľa vynálezu. Tento rekombinantný expresný plazmid bol transfekovaný elektroporáciou a selekcia pozitívnych klonov sa uskutočnila podľa nasledujúceho protokolu:

Plazmidová DNA (20 g) štiepená s Bglll sa precipitovala, resuspendovala v 800 μΐ pufru HEPES a pridala k 10 x 10⁷ buniek/ml CHO. Po elektroporácii boli bunky pestované 2 dni v kompletnom médiu DMEM. Potom sa bunky rozdelili na 20 až 40 10 cm misiek s kompletným DMEM/dialyzovaným 10 % FBS a pestovali 5 dní pred prenesením buniek na selekčné média so stúpajúcou koncentráciou (50 - 200 ng/ml) MTX v DMEM počas dvoch týždňov. Na konci dvoch týždňov sa selektovali jednotlivé kolónie buniek a namnožili. Supematanty pochádzajúce z 22 klonov CHO boli testované v antivírusových testoch.

Aktivita

Antivírusová aktivita fúznych proteínov sa zisťovala v testoch CPE, ako je opísané v príklade 4. Na základe špecifickej aktivity 60 MU/mg štandardu interferónu-beta-la použitého v tomto teste, bola aktivita prechodne (EBNA) exprimovaného fuzneho proteínu ľudský interferón-beta-la/ľudský IgGl Fc so spojovacou sekvenciou 900 U/ml a aktivita bez spojovacej sekvencie bola 440 U/ml. Aktivita fuzneho proteínu exprimovaného v bunkách CHO ľudský interferón-beta-la/ľudský IgGl Fc bola 50 U/ml.

Príklad 6

Meranie antivírusovej aktivity interferónu-beta-la v plazme myší ošetrených interferónom-beta-la a fúznym protínom interferón-beta-la/myší IgG2a

Myšiam (C57/B16) sa podala do žily v chvoste i.v. injekcia 50 000 jednotiek interferónu-beta-la (voľného) alebo 5000 jednotiek fúzneho proteínu interferón-beta-la-myší IgG2a. Ako kontrola sa podal rovnaký objem fosfátového pufru.

Krv sa odoberala retroorbitálnymi krvnými odbermi v rôznych časových bodoch (okamžite, 0,25, 1, 4, 24 a 48 hodín) po injekcii interferónu beta. V každom časovom bode boli aspoň tri myši. Úplná krv sa odoberala do skúmaviek obsahujúcich antikoagulans, bunky sa odstránili a zvyšná plazma sa zmrazila až do času testovania. Vzorky plazmy sa nariedili 1 : 10 médiom bez séra a ponechali sa pretiecť cez 0,2 mm filter v striekačke.

Nariedené vzorky potom boli titrované do určených jamiek na 96-jamkovej doštičke na tkanivové kultúry obsahujúce bunky A549. Na každej doštičke sa testovali riedenia štandardov interferónu-beta-1 a (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 a 0,6 U/ml AVONEX) a štyri vzorky plazmy. Bunky boli vopred ošetrené so vzorkami po 24 hodín pred stimuláciou vírusom EMC. Po dvojdennej inkubácií s vírusom boli životaschopné bunky farbené roztokom MTT (5 mg/ml vo fosfátovom pufri) počas 1 hodiny, premyté fosfátovým pufrom a solubilizované s 1,2N HCl v izopropanole. Jamky potom boli odčítané pri 450 nm. Na každú doštičku boli vytvorené štandardné krivky a použité na určenie množstva aktivity interferónu-beta-la v každej testovanej vzorke. Aktivita vo vzorkách od rôznych myší sa vyniesla do grafu proti časovým bodom na obrázku 9.

Pomalšia strata fúzie interferónu-beta-la z krvného obehu ako funkcia času ukazuje, že biologický polčas vzorky fúzneho proteínu je oveľa dlhší ako polčas nemodifikovaného kontrolného interferónu-beta-la. Druhé veľmi významné zistenie z tejto štúdie bolo to, že veľmi málo fúzneho proteínu bolo strateného v priebehu distribučnej fázy, ako bolo dokázané podobnými vysokými hladinami aktivity v 15 a 60 minútach. Dáta ukazujú, že na rozdiel od kontrol interferónu-beta-la, je distribúcia fúzneho protínu interferónu-beta-la prevažne obmedzená na cievne zásobenie.

Príklad 7

Porovnávacie farmakokinetické a farmakodynamické štúdie na primátoch

Komparatívne štúdie sa uskutočnili s fúziou interferónu-beta-la a natívnym interferónom-beta-la (ako neformulovaný voľný medziprodukt AVONEX^R interferónu-beta-la v 100 mM fosfáte sodnom, 200 mM NaCl, pEl 7,2) na zistenie ich relatívnej stability a aktivity na primátoch. V týchto štúdiách boli porovnávané farmakokinetiká a farmakodynamiká fúzie interferónu-beta-la u primátov s natívnym interferónom-beta-la a racionálne závery môžu byť rozšírené na človeka.

Zvieratá a metódy Návrh štúdia

Toto bola štúdia s paralelnými skupinami a opakovanými dávkami na vyhodnotenie komparatívnej farmakokinetiky a farmakodynamiky fúzneho proteínu interferónu-beta-la a nefuzovaného interferónu-beta-la.

Na túto štúdiu sa použili zdravé primáty (výhodne makak „rhesus“, Macaca mullata). Pred podávaním dávok sa u všetkých zvierat vyšetrili príznaky ochorení veterinárom pri dvoch príležitostiach behom 14 dní pred prvým podávaním testovanej zlúčeniny, jedno vyšetrenie muselo byť v priebehu 24 hodín pred prvým podaním testovanej zlúčeniny. Iba zdravé zvieratá dostali testovanú zlúčeninu. Vyhodnotenie zahŕňalo všeobecné fyzikálne vyšetrenie a krvné odbery pred podaním dávky na vyšetrenie základných klinických patologických ukazovateľov a východiskové hladiny protilátok proti interferónu-beta-la. Všetky zvieratá boli zvážené a behom 24 hodín pred podaním testovanej zlúčeniny bola zaznamenávaná telesná teplota.

Zaregistrovaných bolo dvanásť zvierat, ktoré sa rozdelili do skupín po troch, pričom dostávali 1 MU/kg interferónu-beta-la buď ako fuzovaný alebo nefúzovaný, ale inak identický interferón-beta-la. Podávanie sa uskutočnilo buď subkuntánne (SC) alebo intravenózne (IV). Šesť samcov dostalo testovanú zlúčeninu IV spôsobom (3/ošetrenie) a ďalších 6 samcov dostalo testovanú zlúčeninu SC spôsobom (3/ošetrenie). Všetky zvieratá museli byť nedotknuté ošetrením interferónom-beta, teda tzv. naivné. Každému zvieraťu boli podávané dávky v dvoch časoch, dávky boli oddelené štyrmi týždňami. Objem dávky bol 1,0 ml/kg.

Na farmakokinetické testovania sa odoberala krv v 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72 a 96 hodín po každej injekcii. V 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504 hodín po podávaní študovaného liečiva sa tiež odoberali vzorky krvi na meranie markera biologickej reakcie indukovanej interferónom, sérového neopterínu.

Hodnotenia počas obdobia štúdie zahŕňajú klinické vyšetrovania známok toxicity uskutočňované 30 minút a 1 hodinu po podaní dávky. Uskutočnili sa denné pozorovania cez klietku a zaznamenával sa celkový vzhľad, príznaky toxicity, nepokoj a zmeny správania. Počas 21 dní po podaní dávky bola zaznamenávaná telesná hmotnosť a telesná teplota.

Testovacie metódy

Hladiny interferónu-beta v sére sa kvantifikovali použitím testu na hodnotenie cytopatického účinku (CPE). Test CPE meral stupeň antivírusovej aktivity sprostredkovanej interferónom. Stupeň antivírusovej aktivity vo vzorke odráža počet molekúl aktívneho interferónu obsiahnutých vo vzorke v okamihu, keď je odoberaná krv. Tento prístup bol štandardnou metódou na stanovenie farmakokinetiky interferónu-beta. Test CPE použitý v predkladanej štúdii deteguje schopnosť interferónu-beta chrániť bunky ľudského pľúcneho karcinómu (A549, č. CCL-185, ATCC, Rockville, MD) pred cytotoxicitou spôsobenou vírusom encefalomyokarditídy (EMC). Bunky boli vopred inkubované 15 až 20 hodín so vzorkami séra, aby sa umožnila indukcia a syntéza proteínov, ktoré je možné indukovať interferónom, a ktoré potom zvyšujú antivírusovú reakciu. Potom bol pridaný vírus EMC a inkubovaný ďalších 30 hodín pred tým, než sa vyhodnotila cytotoxicita s použitím farbenia kryštálovou violeťou. Na každej testovanej doštičke sa súčasne so vzorkami testoval vnútorný štandard interferónu-beta, ako aj vnútorný štandard interferónu-beta-Ig. Tento štandard bol kalibrovaný proti referenčnému štandardu prirodzeného interferónu ľudských fibroblastov (WHO Second Intemational Štandard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-53). Každá testovaná doštička tiež zahŕňala jamky s kontrolou bunkového rastu, ktoré neobsahovali ani interferón-beta akéhokoľvek druhu, ani EMC a jamky s vírusovou kontrolou, ktoré obsahovali bunky a EMC, ale neobsahovali interferón-beta. Na zistenie účinku, ak bol nejaký, vzoriek na bunkový rast boli tiež pripravené kontrolné doštičky obsahujúce štandardy a vzorky. Tieto doštičky boli zafarbené bez pridania vírusu.

Vzorky a štandardy sa testovali v duplikátoch na každej z dvoch opakujúcich sa testovacích doštičiek, poskytujúce štyri údaje o vzorke. Uviedol sa geometrický priemer hodnôt koncentrácie zo štyroch opakovaní. Limit detekcie v tomto teste je 10 jednotiek (U)/ml.

Sérové koncentrácie neopterínu boli určované na oddelení klinickej farmakológie s použitím komerčne dostupných testov.

Farmakokinetické a štatistické metódy

Softvér RstripTM (MicroMath, Inc., Sált Lake City, UT) sa použil na prekladanie (fitovanie) dát pomocou farmakokinetických modelov. Geometrické priemery hodnôt koncentrácie boli vynesené do grafu oproti času na každú skupinu. Pretože výsledky testu sú vyjadrené ako riedenie, sú geometrické priemery považované za vhodnejšie, než aritmetické priemery. Hladiny sérového interferónu sa porovnávali podľa východiskových hodnôt a nedetegovateľné koncentrácie v sére boli stanovené na 5 U/ml, čo predstavovalo jednu polovicu spodného limitu detekcie.

Pre dáta zo IV infúzií bol fítovaný IV infúzny model s dvoma kompartmentami na detegovateľné koncentrácie v sére na každý subjekt a SC dáta boli fitované podľa injekčného modelu s dvoma kompartmentami.

Vypočítali sa nasledujúce farmakokinetické parametre:

i) pozorovaná vrcholová koncentrácia, C_max (U/ml), ii) oblasť pod krivkou od 0 do 48 hodín, AUC sa vypočítala pomocou lichobežníkového pravidla, iii) polčas eliminácie, a z dát získaných pri IV infúzii (keď bol použitý IV spôsob podávania):

iv) polčas distribúcie (hodiny, h),

v) clearancia (ml/h), iv) zjavný distribučný objem, Vd (1).

Na výpočet polčasu eliminácie po SC a IM injekcii bol použitý softvér WinNonlin (verzia 1.0, Scientifíc Consulting inc., Apex, NC).

Pre neopterín sú uvedené hodnoty aritmetického priemeru v každej skupine. Vypočítala sa E_max, maximálna hodnota zmeny proti základnej hodnote. C^, AUC a E_max boli potom analyzované jednosmernou analýzou rozptylu na porovnanie skupín líšiacich sa dávkami. Hodnoty C_max a AUC sa logaritmický transformovali pred analýzou, uvádzané sú geometrické priemery.

Príklad 8

Antiangiogénne účinky fúzie interferónu-beta-la: Hodnotenie schopnosti fúzie interferónu-beta-la inhibovať proliferáciu endotelových buniek in vitro

Bunky z ľudského cievneho endotelu (Celí Systems, katalóg, č. 2V-P75) a bunky endotelu kožných kapilár (Celí Systems, katalóg, č. 2M1-C25) sa udržiavali v kultúre s médiom zo súpravy CS-C Médium Kit (Celí Systems, katalóg, č. 4Z-500). Dvadsaťštyri hodín pred pokusom sa bunky ošetrili trypsínom, resuspendovali v testovacom médiu, 90 % M199 a 10 % fetálne hovädzie sérum (FBS) a upravili na požadovanú hustotu. Potom sa bunky vysiali na 24 alebo 96 jamkové doštičky potiahnuté želatínou, s hustotou 12 500 buniek/jamka alebo 2000 buniek/jamka.

Po inkubácii cez noc bolo testovacie médium nahradené čerstvým médiom obsahujúcim 20 ng/ml ľudského rekombinantného bázického fíbroblastového rastového faktora bFGF (Becton Dickinson, katalóg, č. 400600) a rôzne koncentrácie fúzovaných alebo nefúzovaných proteínov interferónu-beta-la alebo pozitívnej kontroly (ako pozitívnu kontrolu možno použiť endostatín alebo protilátku na bFGF). Celkový objem bol nastavený na 0,5 ml v 24-jamkovej doštičke alebo 0,2 ml v 96-jamkovej doštičke.

Po 72 hodinách sa bunky ošetrili trypsínom na počítanie na Coultere, zamrazili na odčítanie fluorescencie CyQuant alebo značili (³H) tymidínom.

Tento in vitro test slúžil na hodnotenie molekúl ľudského interferónu-beta podľa vynálezu z hľadiska účinku na proliferáciu endotelových buniek, ktorá môže byť indikátorom antiangiogénnych účinkov in vivo. Pozri napr. O'Reilly, M. S., T. Boehm., Y. Shing, N. Fúkal, G. Vasios, W. Lane, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, J. Folkman, 1997, Endostatín: An Endogenous Inhibítor of Angiogenesis and Tumor Growth, Celí, 88, 277-285.

Príklad 9

In vivo model na testovanie antiangiogénneho a antineovaskularizačného účinku fúzie interferónu-beta-la/Ig

Na testovanie antiangiogénnych a antineovaskularizačných účinkov molekúl podľa vynálezu bol vyvinutý celý rad modelov. Niektoré z týchto modelov boli opísané v patentoch US 5 733 876 (31. marca 1998, „method of inhibiting angiogenesis“) a 5 135 919 (4. august 1992, „Method and pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis“). K ďalším testom patrí napr. test s chorioalantoidnou membránou bez škrupiny (CAM) podľa S. Taylor a J. Folkman, Náture, 297, 307, 1982 a R. Crum, S. Szabo a J. Folkman, Science, 230, 1375, 1985, model angiogenezy s vzdušným dorzálnym vakom u myší podľa J. Folkman, et. al., J. Exp.

Med., 133, 275, 1971 a test s mikrokapsou rohovky podľa Gimbrone, M. A. Jr. et. al., Natl. Cancer Inst., 52, 413, 1974, kde je vaskularizácia rohovky indukovaná u dospelých samcov laboratórnych potkanov kmeňa Sprague-Dawley (Charles River, Japonsko) implantáciou 500 ng bázického FGF (hovädzie, R and D systems, Inc.) impregnovaného v EVA (kopolymér etylén-vinylacetátu) peletoch do každej rohovky.

K ďalším metódam testovania fúzií interferónu-beta/Ig na antiangiogénne účinky na zvieracom modeli patria (aj keď výpočet tým nie je obmedzený) skríningové testy nových potenciálnych protirakovinových liečiv, ako bolo opísané v pôvodnej publikácii Cancer Chemoterapy Reports, Part 3, Vol. 3, No. 2, septembra 1972 a v dodatku In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publ. No. 84-2635, február 1984. Vzhľadom na medzidruhovú bariéru na interferóny typu I, na hodnotenie antiangiogénnej aktivity fúzií interferónu-beta na modeloch hlodavcov, boli pripravené prípravky fúzií interferónu-beta/Ig hlodavcov. Skríningové metódy sú ukázané na príklade protokolu na testovanie antiangiogénneho účinku fúzií myšieho interferónu-beta/Ig na subkuntánne implantovaný Lewisov pľúcny karcinóm.

Pôvod nádorovej línie

Vznikla spontánne vr. 1951 ako karcinóm pľúc u myší C57BL/6.

Súhrn testovacích procedúr

Fragment nádoru bol implantovaný subkutánne do axilámej oblasti myší B6D2F1. Testované činidlo (napr. fuzny proteín podľa vynálezu) bol podávaný v rôznych dávkach subkutánne (SC) alebo intraperitoneálne (IP) po niekoľko dní po implantácii nádoru. Meraným parametrom potom bol medián času prežitia. Výsledky sú uvedené ako percentá času prežitia kontroly.

Zvieratá

Propagácia nádory: myši C57BL/6 Testovacie zvieratá: myši B6D2F1 Hmotnosť: myši by mali mať hmotnosť s rozpätím 3 g s minimálnou hmotnosťou u samcov 18 g a samíc ^{17 g}

Pohlavie: zvieratá jedného pohlavia sú použité na test aj kontrolu v jednom pokuse Zdroj: jeden zdroj, pokiaľ je to možné, pre všetky zvieratá v jednom pokuse

Rozsah experimentu zvierat v jednej testovacej skupine

Prenos nádoru

Propagácia nádoru: Fragment: pripraviť 2 až 4 mm fragment nádoru SC darcovského nádoru Čas: 13. až 15. deň

Miesto: fragment implantovaný SC do axilárnej oblasti vpichom v ingvinálnej oblasti Testovanie:

Fragment: príprava fragmentu o veľkosti 2-4 mm z s.c. darcovského tumoru

Čas: 13. až 15. deň

Miesto: implantácia fragmentu s.c. do axilámej oblasti vpichom v ingvinálnej oblasti.

Testovacia schéma:

Deň 0: implantácia tumoru. Založenie bakteriálnych kultúr. Testovanie pozitívnej kontrolnej zlúčeniny v každom experimente s párnym číslom. Príprava materiálu. Denný záznam úmrtia

Deň 1: kontrola kultúr. Odstránenie kontaminovaného experimentu. Randomizácia zvierat. Ošetrovanie podľa inštrukcií (v deň 1 a nasledujúce dni).

Deň 2: Opätovná kontrola kultúr. Odstránenie kontaminovaného experimentu.

Deň 5: Hodnotenie dňa 2 a deň počiatočného testu vyhodnotenia toxicity prípravku.

Deň 14: Kontrolný deň skorého úmrtia.

Deň 48: Kontrolný deň.

Deň 60: Koniec a vyhodnotenie experimentu. Vyšetrenie tumoru pľúc iba podľa oka.

Kontrola kvality:

Stanovenie pozitívnej kontrolnej zlúčeniny (NSC 26271 (Cytoxan v dávke 100 mg/kg/injekcie)) v každom experimente s párnym číslom, ktorého režim bol v deň 1 iba intraperitoneálny. Spodný limit testu/kontroly na pozitívnu kontroluje 140 %. Prijateľný medián prežitia u neošetrenej kontroly bol 19 až 35,6 dňa.

Vyhodnotenie:

Meraný parameter je medián prežitia. Výpočet priemernej telesnej hmotnosti zvierat v deň 1 a v deň 5, výpočet pomeru test/kontrola na všetky testované skupiny. Sú vypočítané priemerné telesné hmotnosti zvierat v dni odpočítania a v deň konečného vyhodnotenia. Pomer test/kontrola je vypočítaný na všetky testované 5 skupiny s > 65 % prežívajúcich na 5. deň. Pomer test/kontrola < 86 % indikuje toxicitu. Na hodnotenie toxicity môže byť tiež použitá neprimeraná zmena telesnej hmotnosti (test mínus kontrola).

Merítka aktivity:

Východiskový pomer test/kontrola väčší alebo rovnajúci sa 140 % je považovaný za nevyhnutný na dô10 kaz miernej aktivity. Reprodukovateľná hodnota priemeru test/kontrola väčšia alebo rovnajúca sa 150 % je považovaná za významnú aktivitu.

Zoznam sekvencií

<no> «am·, αβκζαν UMEĽ, LAUHA WaO'EUtoXSR, HUraQT MOCHMAN, PAULA ‘120» INTEÄFERÓN-BETA FÚZNE PROTEÍNY A POUŽITIA <130» A06* CDN US <140> <141» <150* 09/8321«9 <1$1> 2001-frí-Xl <150» PCTAíS99/24200 <151» 1W9«1O-15 <150» 60/120.237 <151» 1W0Í 1« <150» 60/104.491 <i5i> ιΗβ-ώ-ιβ <160» M «170» Patentln Ver. 3.3 <210» 1 <2U> 1197 <212» DNA <2l3> Umelá sekvencia <220» <223» opi» umelej sekvencie? Syntetický konltrukt <220» <221» COS <222> (1),.(1197) c*O9> 1 no age tac aac ttg ctt goi ttc cta caa aga age tgc aat ttt cag 48 Net ser Tyr A«n Leu lcu Gly Phe Leu Gin Arg ser sar am Phe Gin 15 10 15 tgt cag aag ctc ccg tgg cm ttg aat Mg agg ctt gaa tac tgc ctc M cys Gin Lys Leu Leu trp Gin Leu *sn Gly Arg utu Glu Tvr cys Leu 20 25 30 aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag itt aag cm etg cap 244 lys asp Ara het Asn Phe Asp 11« Pro clu Glu íle Lys Gin Leu Gin 35 4« is cag ttc cag aag Mg aac gcc oca ttg acc atc tat gag atg ctc cm 192 Gin Ph« Gin Lys Glu J5p «1« Ale l«u Thr il« Tgr Glu net Leu Gin aac atc ttt get att ttc aga caa gat tca tet age act ggc tgg aat 2*0 Asn U» Phe Ala íle Phe Arg Gin Asp ser ser ser Thr Gly Trp *sn 65 70 71 80 e>g ect att git gag aac ctc ag ggc aat gtc Ut cac cag at* aac 2M Clu Thr xl« v»l Glu asn ueu u«u Aia am» val tyr wis Gin íle am» as 50 »5 ent ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 33$ Hli l«u ty» Thr v«1 teu Glu Glu lys t«t Glu lys Glu Asp rh< rhr 100 105 110 agg Ma aaa ctc arg age agt Ctg cac ag aaa aga tat tat ggg agg 38< Arg Gly l^s Leu Piet Str ser Leu His Leu Lys Arg T^r Tyr G!y *rg »tt ctg ca*. tac ctg aag gcc aag gag tac age cac tgt gcc teg acc 432 íle c«u His Tyr teu cys ala lys Glu tvf ur h1s Cys Ala Trp rnr 130 WS 140 * - ata gtc aga gtg gaa atc cta agg wc ttt tac ttc att aac aga ctt 480 11« V*] Are val Glu jlg Leu Arg asi» Phe Phe 11* am *ro teg aca gat tac ctc ega »*c gac gat gat gac sag gtc gac aaa act cac 5ž« Thr Gly Tyr Leu Arg Asn **p A»p Mp *sp tys val Asp Lys Thr η1ϊ 165 170 VS aca tgc cca ecg tgc cca gca cct ga* ctc ctg gog aga ccg tc* gtc 578 Thr cys Pre Pro cys WO Ala Pro Glu Leu Leu G»y Gly Pro ser val 180 US 190 ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac *« ctc atg atc tcc cgg acc 824 H»e teu Phe Pro rro ty* pro lv» A»p Thr l«u Het r?e ser Arg Thr IM 200 20$ cct gag gtc aca tgc gt? gca gta gac gta age cac gaa gac cct geg m pre clu Val Thr Cys val val val Asp V»l Sar sHa Glu Asp r r* alu 210 215 220 gtc aag ttc aac tgg cac gtg gac xt gte gag gtg tat aat gcc aag 720 val lys Phe A»n Trp Tyr val Atp ž'y Val Glu val wís Asn Ala ,y« 225 239 23$ 140 aca aag ccg cgg gag gag csg tac aac age acg tac cgt gto gte age Τ6Λ Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr ash Ser Thr tyr Arg val val s«r 243 150 25$ Sf .cÍe S'S CCfl 5?c S?9 ?*c Ϊ ct’ w W< aae ??9 *« “9 «1« Val teu Thr val teu Gin Asp Trp teu *»n ž'y Lys Glu Tyr Lys 260 28$ 270 tgc aag gtc tcc aac »aa occ ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc 8fr« vy» uys val »«r **n i_y# Ala Liu pro Ala. Pre iie <73 Uyi 275 280 285 tcc ua gcc aaa gag cag ccc ega gaa cca c*g gte tac acc ctg ccc 912 s<r *1fc ty’ e’y β1η ŕre Ar9 «lu ’ro Gin val Tyr thr u«u ero 290 295 JOO «a t« cgg gat gag «g acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 960 pro Ser Arg Á*p G1u tev Thr Ly» am Gin Val Ser Leu Thr Leu W5 HO JI5 J20 Ff “* ?9C ’JC M* cc< *Be s*c *JC ptS S‘8 tgg gag «<κ aat ίΜβ val L.y* Gly Phe Tyr Pro Ser *jj xle Ala V»1 Glu Trp Glu Ser Mn 325 330 335

8?

c*9 Gin

ccg ΡΓ0

88 340

MC ASíl

aac Asn

tac Tyr

aap Lys

acc Thr 3*5

acg Thr

cct Pro

CCC Pro

m

ttg Leu 350

gac A»P

tcc Ser

1056

gac Asp

W

tcc Ser 355

ttc Ph·

ttc phe

MC L«U

tac Tyr

age Ser 360

aag Lys

ctc Leu

aec Thr

gtg val

MC b?

aag Lys

age Ser

«99 Arg

1104

t« Trp

cag Gin src

cac Gin

g??

»»r Asn

pitval

ttc Ph· 375

tca Ser

tpc cys

tcc Ser

Sto val

•ts Met 390

cat MÍS

Glu

»«< Ala

ctg Leu

1152

cac

aac

cac

tac

«cg

cap

aag

age

ctc

tcc

ctg

tct

CCC

090

aaa

1197

HÍS 38S

Asn

MÍS

tyr

Thr

Gin 390

cys

Ser

Leu

Ser

Leu 395

Ser

Pro

My

Lys

<ί10» 2 <2ll> 39» <212> PRT <212» _Uraola eekvencia <220>

<223» opis umelej sekvencie

Syntetický konštrukt <400> 2

Met 1

Ser

Tyr

Asn

Leu S

teu

Gly Phe

ueu

Gin 10

Arg

Ser

Ser

Asn

ehe 15

Gin

cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin teu

Asn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

ΊΚ

cys

Leu

Lys

Asp

*5?

Met

Asn

Phe

A>p íle 40

ΡΓΟ

Glu

Glu

n·

Ln

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

Asp

Ala Ala 5$

Leu

Thr

íle

15

Glu

Met

Leu

Gin

Asn 65

Íle

Phe

Ala

íle

pt>e 70

Arg Gin

ASp

ser

ser 75

5«r

Thr

dy

Trp

A$n 80

Glu

rhr

íle

val

Glu 85

Asn

Leu Leu

Ala

Asn 00

val

Tyr

His

Gin

XI· 95

Asn

HÍS

Leu

cys

Thr 100

val

Leu

Glu Glu

$

Leu

Glu

lys

Glu

ÍS

Phe

Thr

Arp

Gly

Lys 115

Leu

Het

Ser

Ser Leu 120

HiS

teu

Lys

Arg

ΙΪ5

Tyr

Gly

Arg

íle

Leu 130

HiS

Tyr

Leu

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

Ser

HIS 140

Cys

Ala

Trp

Thr

tie 145

val

Arg

val

Glu

íle 150

Leu

Arg

Asn

Phe

Tyr 155

Phe

11«

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly

Tyr

Leu

J5?

Asn

ASp

ASP

ASP

Asp 170

Lys

val

ASP

Lys

Thr 175

Hf5

Thr

cys

Pro

Pro 180

cys

pro

Ala

pro

GlU 18$

Ľ«U

Leu

Gly

Gly

Pro 190

Ser

val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

lys

pro

Lys

ASp

Thr

Leu

Met

íle

Ser

Arg

Thr

135

200

705

Pro

Glu 210

val

Thr

cys

val

val 2X5

val

A$p

val

Ser

HÍ5 220

Glu

ASp

Pro

Glu

val 225

»y*

phe

Asn

Trp

Tyr 230

val

Asp

Gly

Val

Glu 235

val

HiS

Asn

Ala

Lys 240

Thr

Lys

pro

Arg

Glu 245

Glu

Gin

Tyr

Α5Π

Ser 250

Thr

Tyr

Arg

val

val 255

Ser

val

Leu

ihr

val 260

Leu

MÍS

Gin

Atp

15?

l«u

Asn

Gly

LVS

Glu 270

Tyr

Lys

Cys

Lys

val 275

Ser

Asn

Lys

ala

Leu 280

Pro

Ala

Pro

Íle

Glu 28$

Lys

Thr

íle

ser

Ala

Lys

Gly

Gin

?ro 295

Arg

GlU

Pru

Gin

val 300

Tyr

Thr

teu

Pro

pro 305

ser

Arg

ASp

Glu

Leu 310

Thr

Lys

Asr>

Gin

val 315

Ser

Leu

Thr

cys

teu 320

val

Lys

Gly

Phe

Tyr 325

pro

Ser

ASp

Tie

Ala 330

val

Glu

Trp

GlU

Ser 335

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu 340

Asn

A$n

ryr

Lys

Thr 345

Thr

ΡΓΟ

pro

Val

Leu 350

ASp

ser

ASP

Gly

ser 355

phe

Phe

Leu

Tyr

ser 360

Lys

Leu

thr

val

je?

t-ys

Ser

Arg

Trp

Gin 370

Gin

Gly

Asn

val

phe 375

Ser

Cys

ser

val

Met 380

His

Glu

Ala

Leu

His 385

Α5Π

His

Tyr

Thr

Glh 390

Lys

ser

ceu

ser

Leu 395

ser

ΡΓΟ

Gty

Lys

<Z10> <211» <21Z> «213»

Í

549

DNA

Umelá sekvencia <220» <225»

Opis umelej sekvencie

Syntetický konštrukt <220» <221» <222»

C05 (3)..049) <400» tcc ser

CM

H<S cat

HiS

S

CM MÍS cat HlS

M0

Lys **9

M*t age Jer tac *KC Aíft «9

Leu ctt Leu cag Gin tgt cys cw

Gin •«p

Lys

MC ueo ctg

Leu tgg Trp

9?

CM

MÍS esa ti n

cat	age	tcc	99*	gac	gat	gat	gac	48
Hl 5	ser 10	ser	Giy	ASp	ASP	Ai?	ASp
ttc	cta	caa	aga	age	age	aat	ttt	96
Phe	Leu	Gin	Arg	ser	Ser	Asn	phe
25				30
ttg Leu	aat Asn	8?	agg Arg	ctt Leu	85	tac ryr	tgc cys	144

ϊ$ <« «5

ctc Leu

aag lg

gac A sp

agg Arg

atg Met

aac Asn

ttt phe 55

gac AJp

atc Zle

eet pro

8«

ss 60

att íle

«ag iy*

cag Gin

ctg Leu

192

cag

cag

ttc

cag

aag

gag

gac

ffCC

9«

ttg

acc

atc

tat

gag

atg

ctc

240

Gin

Gin

Phe

Glrt

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

Leu

Thr

Zle

Tyr

Glu

Met

Leu

65

70

75

80

cag

aac

atc

ttt

get

att

ttc

aga

caa

gat

ttl

xct

agc

act

ggc

tgg

2M

Gin

Asn

íle

Phe

Ala <5

íle

Phe

Arg

Gin

AIS

Ser

Ser

5er

Thr

trp

aat

gag

act

att

gtt

gag

aac

ctc

Ctg

get

aat

gtc

tat

cat

cag

ata

336

Asn

Glu

Thr

íle

val

Glu

Asn

Leu

Leu

Ale

Asn

val

Tyr

HlS

Gin

11«

100

105

110

aac

cat

ctg

aag

aca

gtc

ctg

gaa

aaa

ctg

g*g

aaa

S?1

gat

ttc

384

Asn

HÍS

Lež 115

Lys

Thr

val

Leu

Glu 120

Glu

Lys

Leu

Glu

&

Glu

ASP

Phe

acc

agg

gga

aaa

ctc

atg

agc

agt

ctg

cac

ctg

aaa

aga

tat

tat

999

432

Thr

Arg 130

Gly

tys

Leu

Met

Ser 135

ser

Leu

HiS

Leu

Arg

Tyr

Tyr

Gly

*PS

att

ctg

cat.

tac

ctg

aag

gcc

aag

p»o

tac

agt

cac

tgt

gcc

*98

480

Ϊ3

íle

Leu

HÍS

Tyr

Leu 150

iys

Ala

ty»

Glu

Ser

MÍS

cyt

Ala

Trp 160

acc

ata

gtc

aga

gtg

gaa

atc

cta

agg

aac

ttt

tac

ttc

att

aac

aga

528

Thr

zle

val

Arg

val

Glu

íle

Leu

Arg

Α5Π

Phe

Tyr

Phe

zle

Asn

Arg

165

170

17S

ctt aca ggt tac

Leu Thr Gly Tgr ctc ega aac Leu arg Asn

549 <210» 4 <211> 183 <212» ρλτ <213* Umelá sekvencia <22O>

<22Š> Opis umelej sekvencie:

Syntetický konštrukt <400> 4

Ser 1

Gly

Gly

His

His 5

HÍ>

HiS

Hl 5

HÍS

ser W

Ser Gly

A5P

ASP

*!?

ASp

Lys

Met

ser

T?s

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe 25

Leu

Gin Arg

Ser

ser 30

Asn

Phe

Gin

Cys

Gin 35

eys

Leu

Leu

Trp

Gin 40

Leu

Asn

Gly Arg

Leu 45

Glu

Tyr

Cys

Leu

Lys 50

Aíp

Arg

Met

Asn

phe 55

Aíp

íle

Pro

Glu Glu «0

íle

lys

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

ASP

Ala

Ala

Leu

Thr zle

Tyr

Glu

Met

Leu

65

70

75

80

Gin

Asn

Zle

phe

Ala «5

íle

Phe

*rg

Gin

ASp 90

ser

ser

ser

Thr

°;k

Trp

Asn

GTw

Thr

íle

val

Glu

Asn

teu

Leu

Ala

asfi

val

Tyr

His

Gin

íle

100

105

110

Asn

MÍS

Leu

tys

Thr

val

Leu

Glu

Glu

Lys

Leu

Glu

W?

Glu

A$P

rhe

115

120

125

Thr

Arg

Gly

lys

Leu

Met

Ser

ser

Leu

His

Leu

iys

Arg

Tyr

Tyr

Gly

130

13S

140

Arg 145

íle

Leu

Híí

Tyr

ueu 150

tys

Ala

Lys

Glu

šer

MÍS

cys

Ala

S

Thr

íle

val

Arg

Val

Glu

íle

leu

Arg

A s n

Phe

Tyr

phe

íle

Asn

Α<·9

165

170

175

Leu

Thr

Gly

35

Leu

Arg

Asn

<21Ô> 5 <211> 69 <21ž> D*4Ä <213» Umelá sekvencia <22Ô>

<22J> Opis Umní r· j «akveneio? Syntetický konžtiuKL <22O>

<22i> CDS <222> (11.,(69) <400* S ttc att aac aga phe íle Asr afq ctt aca tgt tac ctc ega aac gtc gac aaa act cac

Leu Thr Cys tyr l«v ar^ Asn val asp Lys Thr His aca thr tgc cca Cys Pro <xg tgc cca gca pro cys Pre Ala 20 <clu> Ď <2ii> n <212> PAT <213> Umelá sekvencia <22O>

<223>Opis umelej sekvencie: Syntetický konštrukt <4Ô0> 6

Phe íle Asn Arg l«u Thr ry* Tyr i .au Arg a«« val *<p i y? r* r

Thr Cys Pro Pro cys Pro Ala

Umelá sekvencia <220» <22?» Opis umelej sekvencie:

Syntetický konÄtrnkt.

<2 20» <221>

<22Z>

COS <«00> 7 ttc »tt MC «9* ct? phe íle Asn Are L«u

5 aca tfit t*c ihr cys Tyr ctc ega

Leu ^A[J

MC

Asn

cca

Fro <210> 8 <211» 27 <212> PRT *213» Umelá sekvencia <220>

<223» Opie umelej Kckvcnciei Syntetický konétrukt <400» 8 ₄ *

Phe íle A$n Arg Leu Thr cyí Tyr Leu ajj as* CTy Gly «1y gij ser val asp Lys Thr His Thr cys Pro Pro Cys Pro

2>

<ziu> <2U>

<212» <213>

ONA

Umelá sekvencia «220» <223»

Opis umelej sekvenciet

Syntetický primár <400> s ttctccpgag acgatgacga caagatgagc tacaacttgc ttggattcet acaaagaagc <210» 10 <211> 39 <212» DNA <213» Umelá sekvencia <22O>

<223» Opis umelej sekvenciet Syntetický primér <400» 10 gccgctcgag ttateagttt eggagoxaac ctgtaagtc <210» 11 <211» 35 <212» tm* <213> Umelá sekvencia <223>Opie umelej sekvencie: Syntetický primér <400» 11 agcttccggg ggccatcaxc atcatcatca taget

sekvencia <220» <223>Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400» u ccaaaoctat gatgatgatg atgatogccc eeaoa <210» 13 <211» «7 <212» MA «213» Umelá sekvencia <220» <2Z3> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonuklectid ccggagacga tgatgacMg atggcttacg ccgctctxgg agccctacaa gettetagea 60 atfttcagtg teagaagete ctgtggc 87 <210» 14 <21J> Umelá sekvencia <220» «223»Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400» 14 gatCtsgcaa tgctgcctgt gctgccctcc rgpctgcctt gaatgggagg crtgaatact 60 <210» 15 <211» 52 <212» MA <213» Umelá sekvencia <220» <223» Opis umelej sekvenci ei

Syntetický oligonukleotid <400> 15 gcctc**99* caggatgaac cttgacatcc ctgaggagat taagcagctg ca 52 <210» 16 <211» 76 <212» MA <213» Umelá ttekvencia <22Q>

<223> Opis umelej sekvencie;

Syntetický oligonukleotid <400> 16 aartgaatgg gagggetgca gcttgcgctg cagacaggat gaactrcgac atccctgagg 60 agattaagca gctgca 76 <210» 17 <211> 76 <212? Dna <?13> Umelá sekvencia <220» <223?

Opis umelej sekvencie:

Syntetický oligonukleotid <4OĎ> 17 aattgaatgg gaggcttgaa xactgcctca aggacagggc tgcatttgct atccctgcag 60 agattaagca gctipca 76 <210> <211» <212» <213»

SI MA

Umelá sekvencia <220» <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <4O0> 18 aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac a Si <210» 19 <211? 43 <2U> t»A.

<213» Omailá sekvoncis <220» <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400» 19 tccctgagga gattgctgca gctgcagctt tcgctgcagc tga 43 <210» <2U>

*212» <2U>

7B

MA

Umelá sekvencia <220» <223>

cgcxgcgttg accatctatg agatgctcflt taacatcgct agcamtca gacaagatte 60 •Utagcact ggctggaa '· <21O> 21 <2U> 71 <212> oma <213>ttoelá sekvencia <223>Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <4O0> 21 cgccpcattg accatctatg agatgctcca gaacatcttt gctattttcg ctgcagcttc W aíctagcact ggctpgaa '9 <210» 22 <211> 72 <212> OMA <213»Umelá sekvencia <220» <223» Opi a umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400 22 ggaatgcttc agacagttct aittgngct geactcctga gcaatgtcta tcatcagata aaccatctga «9 <210> 23 x211> 72 <21Z> MA <213> Umelá sekvencia <2Z0>

<223>Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 23 ggaAtyagac cattgttgag aacctcctgg ctutgtc^c tcatcagata gcacatctgg 60 cxtfcagttct ag 72 <210» 24 <211> 44 <212> DNA <213» Umelá sekvencia <2Zft>

<223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <400> 24 ctagctgcaa aactggctgc agctgatttc accaggggaa aact 44 <210» <211>

*212>

<Z1J>

2$

DNA

Otelá <220* sekvencia <223>

Opis umelej sekvenciei Syntetický oligonukleotid <400> 25 «•gJS**· ««W·®·* icqctnM Mgctngag eeeettgcac so <210» 2« <111» 51 «212» DNA <211> Umelá sekvencia <220» <223> Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid «400» 26 tAttatggga ggattctŕca ttacctsaag gccaaggsgt actcac*ctg t 51 «210» «221» <212» «213» %

WM

Umelá sekvencia <220 <223» Opi® umelej sekvencie:

Syntetický oligonukleotid «400» .

JgaJtKíS ««J“*®“ uwwtí tpKWCMtt gctgcMktc tggctgccaa 60 <21Q> «211» «2X2* «213» <220» <22Í>

DNA

Umelá sekv^nrl»

Opis umelej sekvencie:

Syntetický oligonukleotid <4Mh __ tíľSSS cwatt.cc

<210» 29 <211> 87 «212» CNA «213» Umelá sekvencia <220» «223» Opis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid <4OO> 2» ...n.rafti toaaamjatt ctecatt*«x tga»g9*^aaa cataaocagt ctgcacctga MAgatatta xvgv-w*»· » ggagtacgct gcatgtgcct ggacgat <210» 30 <211» 50 <212> OHA <213> Umelá sekvencia íliSíSpis umelej sekvencie: Syntetický oligonukleotid csíäs^ct ouwectM C4MWC9C *«««»« asacttací <210 31 <211» 47 <212». CHA <213» Umelá sekvencia ält Opis umelej sekvenciei Syntetický primér ätMtnc. c.t».s<tac »*«CS«t« ««rcctac «oaaOC <210 <211» <212» <213» tíito opis umelej sekvencies Syntetický primér

ONA

Umelá sekvencia jSScSet cgaccrtgtc .tcatcgtco tww«t «ccmaig <Z10>

<211» «212» <213» <220* <227»

OKA

Umelá sekvencia

Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400» „„ caagcttgct *g€99”W 9 <?1O>

<211>

<212» <213» «223» Opis umelej sekvencie: Syntetický primér

Umelá sekvencia <400 34 ggtggtctca catggcttga gaagctgc <210» 35 <ZU> Z9 <212» DHA <213> umelá sekvencia <220 <2 23»

Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400 35 aggtsnarct gcagsagtcw <210 <211» <212> <213>

3«

ONA

Umelá sekvencia «220» <ľ23>

Opis umelej Hekveneie: Syntetický primér <400 36 ctgagctcat ttacccggag tccgggagaa gcTctt

<210 37 <211» 33 <2U> OHA <213> Umelá sekvencia <220 <223» Opis umelej eekvencíe: Synteticky primér <400 37 agcttgctag cggccgcggc ctcactggct tca <210 <211» <212» <213» <220 <223>

ONA

Umelá sekvencia

Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400 3í atacgcgtcg acgtttcgga ggtaacatgt aagtctg <210 <211» <212» <213»

DNA

Umelá sekvencia <220 <223» opis umelej sekvencie; Syntetický primér <400^ 39 agcttgctag cggccgcggc ctcactggct tca 33 <210 <211» <212» <213>

OMA

Umelá sekvencia <220 <223>

Opis umelej sekvencie: Syntetický primér <400 40 tacacgtcga cgctgccacc accgccgttx cggaggtaac atguagtct g si <210 <213»· <212» <213»

1257

DMA

Umelá sekvencia <220 <223>

Opis umelej sekvencie: Syntetický konštrukt <220 <221» CD5 <222» (1),.0254} <400 41

atg Met

ect pro

aag Lys

atg Met

gtc val

gtg val

atc 11«

ctt Leu

r.

gcc Ala

tca ser

aat Asn

ata 11«

ctt Leu

Trp

46

1

5

IB

15

ara

atg

ttt

gca

get

tet

caa

gcc

atg

aoc

tac

uc

ttc

ctt

904

ttc

96

MCt

rbe

Aia

Xia

ser

Gin

Ala

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

teu

Gíy

Phe

20

25

30

cta

caa

aga

age

age

aat

ttt

CM

tgt

CM

aag

ctc

ctg

tgg

caa

ttg

144

Leu

Gin

*1?

Ser

ser

ASH

Hie

Gin 40

cys

Gin

tys

lcu

Leu 45

Trp

Gin

teu

aat

W9

agg

ctt

9*«

tac

tgc

ctc

aag

gac

agg

atg

aac

ttt

gac

atc

192

A*n

U

Arg

uew

G1U

Tyr

Leu

tyi

Aip

Arg

Het 60

Asn

Ph·

ASp

íle

CCT

gag

att

aag

CM

ctg

CM

«g

«c

CM

•M

999

oac

CCT

gea

240

Nro 65

čiu

Glu

íle

tyl

Gin 70

Leu

Gin

Gin

phe

Gin 75

Lys

Git!

Asp

Ala

Ala ao

ttg

acc

axe

tat

atg

ctc

cag

aac

atc

ttt

get

att

ttc

aga

caa

263

Leu

Thr

rle

Tyr

Glu es

Met

Leu

Gin

Asn

íle 90

Hie

Ala

zle

Phe

As?

Gin

gat *5?

tca Ser

ter Ser

age Ser

acc Thr

tgg Trp

aac Un

S?

act Thr

att xi«

gtt va!

B?9 Glu

aac asn

«c Leu

ctg Leu

336

100

105

110

aat

9«

tat

cat

cag

ata

aac

cat

etg

aag

aca

gtc

ctg

gaa

gaa

384

Ala

A5rt

val

Tyr

HÍS

Gin

íle

Asn

Hlí

Leu

Lys

Thr

val

Leu

Glu

Glu

1X5 120 125

aaa

ctg

gag

aaa

gaa

gat

ttc

acc

agg

aaa

ctc

atg

S*

agt

ctg

432

l/s

U«U 130

Glu

uy»

*>P

ehe 135

Thr

Arg

Lys

Leu 140

*ιβτ

Ser

Ser

cac

ctg

aaa

aga

tat

tat

gcg

«99

att

ctg

cat

tac

ctg

aag

gcc

aag

480

MÍS 145

Leu

Lys

Arg

Tyr

I?í

Gly

Arg

zle

Leu

Hl 5 155

Tyr

Leu

Lys

A1&

Lys 160

gag

tac

agt

cac

tgt

gcc

tgg

acc

ara

9«

aga

Sta val

9«

atc

cta

agg

528

Glu

Tyr

ser

MÍS

Ala

trp

Thr

íle

val 170

Arg

Glu

íle

Leu 175

Arg

aac

ttt

tac

ttc

att

aac

ag*

ctt

aca

tgt

tac

ctc

ega

aac

gtc

g*c

576

Asn

Phe

Tyr

Phe

íle

Asn

Arg

Leu

Thr

Cys

Tyr

Leu

Arg

Asn

val

ASP

180

185

190

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gaa

ctc

ctg

rara

624

lys

Thr

His 195

Thr

cys

Pro

pro

as

pro

Ala

pro

Glu

Leu 205

ieu

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

672

prg

ser 210

Val

Phe

teu

Phe

pro 215

Prp

lys

Pro

lys

A»p 220

Thr

leu

Met

íle

tcc S«r

cgg Arg

acc Thr

cct pro

9*9 Glu

gtc val

aca Thr

t?c Cys

$ S? Si

gac ASP

S?

age 5er

cac MÍS

gaa Glu

720

225

230

235

240

gac ASp

cct Pro

ra

gtc Val

aag cys 245,

ttc Phe

aac A$n

tgg Trp

tac Tyr

gtg val 250

gac ASP

ra

gtg val

9*9 Glu

gtg val 255

cat HÍS

768

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

9*9

gag

cag

tac

aac

age

tac

cgt

816

ASA

Ala

iy*

Thr 280

Lys

pro

arg

Glu

Glu Gin 265

tyr

Asn

Ser

Thr 270

Tyr

Arg

gtc

age

ste

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc Gly

aag

864

val

m

val

Leu

Thr

val

Leu 280

His

Gin

ASP

Trp

Leu 285

Asn

Lys

QAO

tat

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aa*

9$c

ctc

cca

ra

ccc

atc

9*9

912

Glu

Tyr 290

Lys

cys

Lys

val

ser 295

Asn

Lys

Ala

Leu

pro 300

Pro

íle

Glu

aaa

acc thr

atc íle

tcc ser

aaa cys

gcc Ala 310

aaa L*’

ra

cag Gin

ccc Pro

cg* ΑΓ0 315

gaa. GTu

cca pro

cag gtg Gin val

tac Ώο

960

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

1008

Thr

Leu

ΡΓΟ

Pro

Ser

Arg

A5P

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

val

Ser

Leu

325

330

335

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc Gly

ttc

tat

ccc

age

gac

atc

ra

gtg VB*

gag

tgg

1056

Thr

cys

Leu

val

cys

Phe

Tyr

Pro

ser

ASp

íle

Glu

Trp

340

345

350

B*«

age

aat

ra

cag

ccg

ra

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

?3

1104

Clu

ser

Asn

Gin

Pro

Asn

as»

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

355

360

365

ttg

gac

tcc

gac

ra

tcc

ttc

ttc

ctc

tac

age

aag

ctc

acc

?3

ra

1152

Leu

Asp

ser

ASP

ser

Phe

Phe

teu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

370

375

380 aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat Lys Ser Arg Trp Gin Gin G*y Asn val phe Ser Cys Ser Val Met Μ» 385 J90 395 400

1200 gag get ctg cae aac cac tac acg cag aag age

Glu Ala utu His Asn hí s Tyr W Gin ivs ser 405 410 ctc tcc ctg tet ccc teu Ser Leu Ser Pro

41$

1248 ggg aaa tga Gly Lys

125?

<210> 42 <211> 418 <212* per <213* umelá sekvencia <220* <223>Opis umelej sekvencie:

Syntetický konétrukt <400 42

Met 1

Pro

Gly

lys

wt $

val

val

íle

Leu

clž

Ala

Ser

A$n

íle

teu 15

Trp

Tlr

Met

Phe

Ala

Ala

Ser

Cín

Ala

Ser

Tyr

Asn

L«U

Leu

Gly

Phe

20

25

Leu

Gin

ser

Ser

Asn

Phe

Gin 40

Cys

Gin

tys

Leu

teu 45

Trp

Glft

Leu

Asn

61S

Arg

Leu

Glu

Tyr

Τ»

Leu

tys

Asp

Arg

Met 60

*sn

Phe

ASP

íle

pro 65

Glu

Glu

íle

Lys

Gin 70

Leu

Gin

Gin

phe

Gin 7S

Lys

Glu

ASp

Ala

Ala 80

Leu

Thr

íle

Tyr

Clu

Met

Leu

Gin

Asn

íle

phe

Ala

íle

Phe

Arg

Gin

es

90

95

ASp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

GlU

Thr

íle

val

Glu

Asn

Leu

ceu

100

105

110

Ala

Asn

val 115

Tyr

MÍS

Gin

íle

Asn 120

mt

Leu

Lys

Thr

val 125

Leu

Glu

Glu

Lys

teu 130

Glu

tys

Glu

Asp

Aha 135

Thr

Arg

Gly

uys

L«U 140

Met

Sar

Ser

Leu

m1s 145

Leu

Lys

Arg

Tyr

Gly

Arg

íle

Leu

His 155

Tyr

ueu

lys

Ala

iys 160

Glu

Tyr

ser

w-is

m

Ala

Trp

Thr

íle

val 170

Arg

val

Glu

íle

Leu 175

Arg

ASn

Phe

Tyr

Phe 180

íle

Asn

Arg

Leu

Thr 185

cys

Tyr

Leu

Arg

Asn 190

val

**P

tys

Thr

MÍS 195

Thr

Cys

Pro

pre

a

Pro

AU

*ro

sTu

Leu 205

teu

Gly

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Leu

Phe

Pro

pre

lys

pfo

tys

ASP

Thr

Leu

Met

íle

210

215

220

Ser

ΑΓ9

Thr

Pro

G1U

v«l

Thr

Cy*

val

val val

ASp

val

ser

Hli

G1U

223

230

23$

240

ASp

Pro

Glu

val

ty*

phe

Asn

Trp

Tyr

val aso

Gly

val

Glu

val

Híí

245

250

255

Asn

a1*

vys

Thr

Ly*

pro

Arg

Glu

Glu

Gin Tyr

Asn

ser

Thr

Tyr

Arg

260

265

270

val

val

Ser 275

val

Leu

Thr

val

Leu 280

His

Gin Asp

Trp

Leu 28$

Asn

Gly

uys

Clu

Tyr 290

ty*

Cys

uy*

val

Ser 295

ΑΕΠ

Lys

Al* Leu

Pro 300

Ala

Pro

Ue

Gly

3?5

Thr

íle

Ser

Lys

Al* 310

uys

Gly

Gin

Pro *r^

Glu

pro

Gin

val

&

Thr

Leu

pro

pro

Ser

Arg

ASP

G1U

Leu

Thr Lys

A*h

Gin

val

ser

Leu

32$

330

335

Thr

Cy»

Leu

val

ty*

Gly

Hit

ryr

Pro

Ser Asp

íle

Al*

val

Glu

Trp

340

345

350

Glu

ser

A»n

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

val

355

360

36$

Leu

ASP 370

ser

A*p

Gly

ser

Phe 375

Phe

Leu

Tyr ser

Leu

Thr

val

ASp

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

a* n

val

Phe ser

Cya

ser

Val

HfX

hU

3BS

390

395

400

Glu

Ala

Leu

MÍS

Asn

Hl*

Tyr

Thr

Gin

ty* Ser

Leu

ser

Leu

Ser

Pro

405

410

415

cly uys <210> 43 <211> 1272 <212> DNA <213* Umelá sekvencia <22D>

<223» opi_s umelej sekvencie: Syntetický konŠtrukt <220» <221* O$ <222> (1)..(1269) <400> 43 atg cct gag a«g at; «t Pro Gly Lys Met !

ra ««9 atg ly i.ys Met *í* ctt íle Leu

199

Trp ctt Leu 30 ttc

Gly phe

cta

caa

aga

agc

agc

aat

ttt

cag

tgt

cag

**9

ctc

ctg

*99

caa

ttg

144

Leu

Gin

‘í?

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin 40

Cys

Gin

cys

Leu

l«u 45

Trp

Gin

Leu

aat

999

•gg

cti

gaa

tac

tgc

ctc

aag

gac

*99

*tg

aac

ttt

gac

atc

192

Asn

Arg

Leu

Glu

Tyr

teu

tys

ASP

Arg

Met 60

ASA

phe

ASp

Íle

cct

9*9

gag

att

**g

cag

etg

c?s

c*9

ttc

cag

ug

gag

gac

Bcc

gca

240

Pro

Glu

Glu

íle

Ly*

Gin

t.eu

Gin

Gin

phe

Gin

Ly*

Glu

A*P

Ala

Ala

65

70

75

80

ttg

acc

atc

tat

gag

atg

ctc

cag

aac

atc

ttt

get

att

ttc

aga

caa

288

Leu

Tt%r

11«

Tyr

Glu 85

m

leu

Gin

ASr

íle 90

Phe

Ala

íle

phe

*íí

Gin

gat

CCA

tct

agc

*ct

ggc

tgg

aat

9*9

act

att

gtt

gag

aac

ctc

ctg

J36

Asp

5«r

ser

ser

Thr

Giy

Trp

Asn

Glu

Thr

11 e

val

Glu

Asn

Leu

Leu

100

105

110

get

aat

gtc

tat

cat

c*g

ata

aac

cat

ctg

ug

aca

gtc

ctg

gaa

S«®

36«

Ala

A*n

val

Tyr

His

Gin

xle

Asn

Hl*

teu

Lys

Thr

val

teu

Glu

Glu

115

120

1Z5

aaa

ctg

8*0

aaa

gaa

gat

ttc

acc

agg

gg·

aaa

ctc

atg

*gc

agt

ctg

432

Lys

Leu

G1U

Lys

Glu

ASp

Phe

Thr

Arg

Giy

tys

Lti)

Met

ser

ser

Leu

130

135

140

cac

ctg

aaa

aga

tat

tat

999

*99

att

ctg

cat

tac

ctg

aag

gcc

**9

480

HÍ5 145

Leu

ly*

Arg

Tyr

Kí

Gly

Arg

íle

Leu

His 155

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys 160

P»9

tac

agt

cac

tgt

gee

tgg

acc

•ta

gtc

aga

gtg

ga«

atc

cta

*99

528

Glu

Tyr

Ser

hIs

81

Ala

Trp

Thr

11«

val 170

*rg

val

GlU

Ue

Leu 175

*rg

aac

ttt

tac

ttc

att

aac

•9*

Ctt

aca

tgt

tac

ctc

ega

MC

agc

M t

576

Α5Π

Phe

Tyr

Phe

íle

asp

Arg

Leu

Thr

cys

Tyr

Leu

Aro

Asn

Gly

Gly

180

185

1SÔ

99t

98«

agc

9«

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

cca

ccg

tgc

cca.

gca

cct

624

Gly

Gly

Ser

val

*SP

tys

Thr

NÍS

Thr

cys

pro

pro

cys

Pro

Ala

pro

19$

200

205

9·«

«c

«g

990

gg·

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

CCC

cca

M*

CCC

aag

672

Glu

ueu

Leu

«ly

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Leu

phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

210

215

220

g*c ASP

acc Thr

ctc Leu

atg Met

atc íle

CCC Ser

cgg Arg

acc thr

cct Pro

gtc val

aca ihr

tgc cy*

«3

83

S?

720

225

230

235

240

g«c

9t9

agc

cac

9**

gac

cct

9*9

gtc

•*í

ttc,

aac

tgg

tac

gtg

gac

768

ASp

val

Ser

HÍS

Glu 245

Asp

pro

Glu

val

Kí

Phe

Asn

Trp

Tyr

val 255

A»P

83

9*9 Glu

«3

cat His

aat A*n

9fc Ala

ug Lys

•c* Thr

««9 ty*

cca Pro

cgg Arg

9»9 Glu

cag Gin

tac Tyr

816

260

265

270

aac

»gc

·£«

tac

cgt

gtg

gtc

agc

9tc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

864

Alft

ser

Thr

Tyr

Arg

vai

val

Ser

val

l«u

Thr

val

Leu

His

Gin

ASP

275

280

285

t0S

ctg

aat

9»c

aag

??9

tac

aag

tgc

aag

gtc

CCC

aac

aaa

9«

ctc

912

Trp

LÍU 290

ast

Gly

Lys

G1U

Bs

Lys

cys

t-ys

val

ser 300

ASn

Lys

Ala

teu

cca

9$c

ccc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

999

cag

ccc

ega

960

Pro 305

Ala

Pro

íle

clu

&

Thr

íle

Ser

Lys

Ala 315

tys

Gly

Gin

pro

158

Ρ»

cca

cag

9tg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

cgg

gat

g?9

ctg

acc

seg

1008

Clu

Pro

Gin

val

Thr

Leu

Pro

pro

ser 330

Arg

ASp

Glu

Leu

Thr 335

uys

MC

CM

9tc

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

gec

ttc

tat

ccc

agc

gac

1056

Asn

Gin

val

ser

L«J

Thr

cys

Leu

val

tys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

ASP

340

345

350

atc

9$c

gte

««9

tgg

9?9

agc

aat

gnp

c»9

ccg

9*9

aac

aac

tac

aag

1104

íle

Ala

val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Giy

Gin

Pro

Glu

asp

Asn

Tyr

Lys

355

360

365

acc

cg

cct

CCC

9*9

ttg

gac

tcc

gac

gac

tcc

ttc

ttc

ctc

tac

agc

1152

Thr

Thr 370

pro

Pro

va*

Leu

$

Ser

ASP

Gly

Ser

Phe 380

Phe

Leu

Tyr

Ser

aag

ctc

acc

9*9

gac

aag

«gc

agg

tgg

cag

cag

999

aac

gtc

ttc

tca

1200

Lra

Leu

Thr

val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

val

Phe

Ser

355

390

395

400

tgc

t CC

9«

*tg

cat

9*9

get

ctg

cac

aac

cac

tac

•eg

cag

aag Lys

agc

1248

cys

Ser

val

Met

MÍS

Glu

Ala

Leu

MÍS

Asn

Hit

Tyr

Thr

Gin

Ser

405

410

415

Ctc TCC Leu: Ser ctg tct ccc ggg aaa Leu ser Pro Giy Lys tga

1272 <210>

«211» <212>

«213»

423

PRT Umelá sekvencia <22O>

<2Z3>

Qpi& umelej sekvencie?

Syntetický konštrúkt <400» 44

Met 1

pro

Gly

Lys

Met 5

val

val

Íle

Leu

Ala

Ser

Α3Π

íle

L«W 15

Trp

íle

«*t

ph<

Ala

Ala

ser

Gin

Ala

Met

5 e r

Tyr

Asn

LCU

LCU

Gly

Phe

20

25

30

Leu

Gin

‘5?

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin 40

cys

Gin

lys

Leu

Leu 45

Trp

Gin

Leu

Atn

• ro

Leu

Glu

Tyr

T?

Leu

uys

ASJ>

Ara

Met 60

Α8Λ

rhe

A3P

xle

pro 85

Glu

Glu

IU

Lys

Gin 70

Leu

Gin

Gin

Phe

Gin 7S

Lys

Glu

ASp

Ala

Ala 80

Leu

Thr

zle

tyr

Glu

Met

Leu

Gin

Asn

íle

Phe

Ala

Íle

Phe

Arg

Gin

90 95

ASP

Ser

Ser

Ser 100

Thr

Gly

Trp

Asn

Glu 105

Thr

Jle

val

Glu

Asn 110

Leu

Leu

Ala

Asn

val

Tyr

ΗΊ S

Gin

íle

Asn

His

Leu

tys

Thr

val

Leu

Glu

Glu

115

120

125

tys

Leu 130

Glu

Lys

Glu

ASP

Ph* 135

Thr

Arg

Gly

uys

Leu 140

Met

ser

Ser

Leu

HlS 145

Leu

tys

Arg

Tyr

Ro

sly

Arg

íle

Leu

MÍS 155

Tyr

Leu

lys

Ala

IM

Glu

Tyr

Ser

HÍS

cys lis

aU

Trp

Thr

11«

val 170

Arg

val

Glu

íle

Leu 175

Arg

Asn

Phe

tyr

rhe 180

íle

Asn

Arg

teu

Thr 185

cys

Tyr

Leu

Arg

Asn 190

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser 195

val

ASp

tys

Thr

Híí 200

Thr

Cys

Pro

Pro

B?

Pro

Ala

pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

val

phe

Leu

phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

210

215

220

íl?

Thr

Leu

Met

íle

ser 230

Arg

Thr

pro

Glu

val 235

Thr

Cys

val

val

val 240

Asp

val

ser

His

Glu 245

ASp

Pre

Glu

val

Bš

Phe

Asn

Trp

Tyr

v«1 255

ASp

Gly

val

GlU

val

HlS

ASH

Ala

Lys

Thr

Lys

pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

260

265

270

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

val

ser

val

Leu

Thr

val

Leu

His

Gin

ASP

275

280

285

Trp

Leu 290

Asn

Gly

Lys

G1U

2Š5

Lys

Cys

Lys

val

ser 300

Asn

Lys

Ala

Leu

pro 305

Ala

pro

íle

Glu

1S

Thr

íle

ser

Lys

Ala 315

Lys

Gly

Gin

pro

IB

Glu

Pro

Gin

val

K

Thr

teu

pro

pro

ser 330

Arg

ASp

Glu

Leu

Thr 935

Lys

A»n Gl« v»l ser t*u Thr Cys Leu val Lys Cly Ph· Tyr Pro str Asp 340 345 350

íle

Ala

val

Glu

Trp

Glu

ser

asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

355

360

365

thr

Thr

Pro

Pro

val

Leu

A>P

Ser

*sp

Gly

Ser

rfre

phe

Leu

Tyr

Ser

S70

375

38Ô

Lys 365

Leu

Thr

val

ASP

ser

Arg

Trp

Gin

Gin 335

Gly

Asn

val

Phe

Ser 400

cys

ser

va!

Met

KÍ S

Glu

ala

Leu

HiS

Asn

ttf*

Tyr

Thr

sln

LVS

Ser

405

410

415

Leu ser ueu ser Pro cly Lys

420

Met 1

Ala’

Tyr

Ala

Ala 5

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 3X5

Ala

Ser

Ser

Asn

Phe 15

Gin

Cys

Gin

Lys

L«U 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

teu

Glu

BS

cys

Leu

lys

ASp

Arg 35

«et

Ajň

phe

ASp

íle 40

Pro

Glu

Glu

11*

Ts

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

ASP

Ala 55

Ala

Leu

Thr

íle

Tjr Glu

Met

Leu

Gin

Asn es

íle

Fh* All

íle

Phe 70

Arg

Gin

AS0

ser

ser 75

Ser

Thr

«1y Trp

Asn 80

Glu

Thr

11«

vil

Glu 85

Asn

L«U

LtU

Ala

ASn 90

val

Tyr

Gin

zle 95

ASH

HÍS

Leu

Lys

Thr 100

val

Leu

G1U

GlU

Bs

Leu

Glu

Lys

Glu

u?

phe

Thr

Arg

Gly

iäS

Leu

wet

ser

ser

L«U 120

Hl»

Leu

Lys

Arg

Bs

Tyr Gly Arg

11 c

ueu 130

HU

Tyr

Leu

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

Ser

HlS 140

cys

Ala

Trp

rhr

11« 145

val

Arg

val

Glu

íle 150

Leu

Arg

Asn

ehe

Bs

Phe

íle

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Cly Tyr

Leu

$3

Asn

<21Λ> »6 ·α:ι> im

-*212> «ττ <213> človek <400> 46

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Ala

Ala

1

3

10

15

Cys

Al a.

Ala

Leu 20

Leu

Ala

Ala

ĽČU

Asn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

BS

cys

Leu

Lys

ASP

M

Met

Asn

Phe

ASP

íle 40

Pro

Glu

Glu

íle

uys 45

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

ASP

Ala 55

Ala

Leu

Thr

íle

Glu

Met

Leu

Gin

A$n

íle

Phe

Ala

11«

Phe

Arg

Gin

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

65

70

75

80

Glu

Thr

íle

Val

G1U

Asn

Leu

teu

Ala

Ain

val

ryr

Hit

Gllt

íle

Asn

85

90

95

Mís

Leu

uys

Thr 100

val

Leu

älu

Ulu

Bs

Leu

ulu

Lys

Glu

S?

rbe

rhr

Arg

Gly

cys 115

Leu

Met

$«r

Ser

Leu 120

HU

Leu

Lys

Arg

Bs

Tyr

Gly

Arg

íle

Leu 130

Hl’S

Tyr

Leu

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

Ser

HiS 140

cys

Ala

Trp

Thr

11« 145

val

Arg

val

Glu

íle 150

Leu

Arg

Asn

Phe

Bs

Phe

íle

Asn

Arg

Leu 160

thr

Gly

Tyr

Leu

Í8

Asn

<210>

<211> — <212> pŕt <213> Človek <400» 47

Met ser Tyr Asn L«u Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser ser Asn Phe Gin 15 10 15

cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

Ala

Ala

Ala 30

cys

Ala

Ala

ASp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

íle

Pro

Glu

Glu

11«

Lys

Gin

Leu

Gin

3?

40

45

Gin

Phe 50

Gin

tys

Glu

ASP

Ala 55

Ala

Leu

Thr

11«

BS

G1U

Met

Leu

Gin

Asn

xle

Phe

Ala

íle

Phe

Arg

Gin

ASP

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

65

70

75

80

Glu

Thr

íle

Vil

Glu

Asn

Leu

Leu

Ala

Asn

val

Tyr

HÍÍ

Gin

íle

Asn

85

»0

95

Hit

Leu

Lys

Thr

val

Leu

Glu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp

Phe

Thr

100

105

110

Arg

Gly

18

Leu

Met

Ser

Ser

Leu 120

HiS

Leu

Lys

Arg

B5

Tyr

Gly

Arg

íle

Leu 130

HÍS

Tyr

Leu

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

Ser

His 140

cys

Ala

Trp

Thr

Il«

val

Arg

val

Glu

íle

Leu

Arg

Asn

Phe

Tyr

Phe

íle

Asn

Arg

Leu

145

150

155

180

Thr Gly Tyr Leu

Ar£ Asn <210> 48 <211> 166 <212> PRT <213> človek

<400> 41 Met Ser 1

í Tyr

Asn

Leu 5

Leu Gly

phe

Leu

Gin 10

ΛΓβ

Ser

Ser

Asn

Phe 15

Gin

Cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

A*n 25

Gly

Arg

ieu

Glu

Tí

cys

Leu

Lys

ASP

31

Ale

Ala

Phe

Ala

íle 40

Pre

Al*

Glu

Tie

31

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

ASP

Al« Ala 55

Leu

thr

íle

Tyr 60

Glu

«et

Leu

Gin

Asn 65

íle

Phe

Al*

íle

Phe 70

Arg

Gin

ASp

Ser

Ser 7$

ser

Thr

Gly Trp

Asn 60

Glu

Thr

11«

val

Glu 85

Asn

L«u

Leu

Ala

Asn 90

val

Tyr

HlS

Gin

íle 95

Asn

H11

Leu

Lys

Thr v*l 100

Leu

Glu

Glu

ä?

Leu

Glu

Lys

Glu

13

Phe

Thr

Arg

Gly

3?

Leu

Met

Ser

Ser

Leu 120

HÍÍ

Leu

Lys

Arg

3í

Tyr

Gly

Arg

íle

Leu 130

Ht5

Tyr

Leu

Lys

Ala 13S

Lys

Glu

Tyr

Ser

His 140

Cys

Ala

Trp

Thr

íle 145

val

val

clu

íle 150

Leu

*r9

A«n

Phe

3í

Phe

íle

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly Tyr

Leu

Ϊ3

Asn

<210> <211>

PRT

Člcv«k <212» <213>

<400» 49

Met

Ser

Tyr

A$n

Leu

Leu

Gly

Phe

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin

1

5

10

15

cys

Gin

vys

Leu 20

ceu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

3í

cys

Leu

Lys

ASP

A5?

Met

Asn

Phe

ASp

íle 40

Pro

Glu

Glu

íle

Ala 45

Ala

Ala

Ala

Ala

Phe 50

Ala

Ala

Ala

Ä5P

*3

Ala

Leu

Thr

11«

35

Glu

Met

L«u

Gin

Asn

xlt

Phe

Ale

íle

Phe

Arg

Gin

ASP

Ser

5«r

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

65

70

7S

80

Glu

Thr

íle

val

Glu

Asn

Leu

Leu

Ala

Asn

Val

Tyr

MÍS

Gin

íle

Asn

85

90

95

MÍS

ueu

Lys

Thr 100

val

Leu

Glu

Glu

iíí

Leu

Glu

Lys

Glu

ASP 110

Phe

Thr

Arg

Gly

13

Leu

Met

Ser

Ser

Leu 120

HiS

Leu

Lys

Arg

Tyr 125

tyr

Gly

Arg

M e

Leu

wis

Tyr

Leu

Lys

Ala

lys

Glu

Tyr

ser

HÍS

Cys

Ala Trp

Thr

130

135

140

íle 145

val

Arg

val

Glu

íle 150

Leu

Arg

Ajrt

Phe

3í

Phe

íle

Asn Arg

Leu 150

Thr

Gly

Tyr

Leu

Arg 165

Asn

<212» .PRT <Z13> človek <400» SO

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

teu

Gly

Phe

Leu

Gin

Arg

ser

Ser

Asn

Phe

Gin

1

5

10

15

Cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

35

cys

Leu

Lys

asp

*5?

Met

Asn

ehe

ASP

íle 40

Pro

Glu

Glu

íle

uy4

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

ASp

Ala 55

Ala

Leu

Thr

íle

35

Glu

M«t

LCU

Ala

Asn

íle

Ala

ser

íle

Phe

Arg

Gin

ASp

ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

£5

70

75

80

Glu

Thr

íle

val

Glu

Asn

Leu

Leu

*la

Asn

val

ryr

Mi*

Gin

íle

Asn

85

90

95

HiS

Leu

Lys

Thr 100

val

Leu

Glu

Glu

31

Leu

Glu

Lys

Glu

ts

Phe

Thr

Arg

Gly

ΪΚ

Leu

Met

Ser

ser

Leu 120

MÍS

Leu

Lys

Arg

3í

tyr

Gly

Arg

Zle

Leu 130

His

Tyr

Leu

LyS

Ala 135

Lys

Glu

Týr

Ser

NÍS 140

cys

Ala

Trp

Thr

íle 145

val

Arg

Val

Glu

11« 150

Leu

Arg

ASn

Phe

3í

phe

íle

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly

Tyr

LW

ia

Asn

<210» <211» <2U> <213» <400>

106

PRT

Človek

Met 3.

ser

Tyr

Asn

teu 5

Leu

Gly

Phe

lev

Gin 10

Arg

ser

Ser

Asn

phe 15

Gin

Cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Α3Π 25

Gly

Arg

Leu

Glu

3í

Cys

Leu

Lys

Asp

Ar9

Met

Asn

Phe

ASp

íle

Prv

Glu

Glu

11«

Lys

cín

LCU

Gin

35

40

45

dn

Phe 50

Gin

tys

GlV

ASP

Ala 55

Ala

Lev

Thr

Ha

T&

G1U

Met

teu

Gin

*sn

11 e

Phe

Ala

lU

uhe

Ala

Ala

Ala

S«r

ser

str

Thr

Gly

Trp

Asn

65

70

75

80

Glu

Thr

íle

val

G1U 15

Asn

Leu

Leu

Ala

Asn 90

val

Tyr

His

cín

íle 95

Asn

H-ÍS

Leu

Lys

ihr 100

val

Leu

GlU

Glu

tys 105

l«u

Glu

Lys

Glu

ts

Phe

Thr

Arg

Gly

Lys 115

Leu

Met

S«r

ser

lev 120

H1S

Leu

Lys

Arg

B5

Tyr

Gly

Arg

íl*

Leu

HÍS

Tyr

Leu

iy*

Ala

Lys

Glu

Tyr

ser

His

cys

Ala

Tro

Thr

130

135

140

11«

val

Arg

val

Glu

íle

Leu

Arg

A>n

ehe

Tyr

Phe

He

AS«

ΑΓΒ

Lau

145

150

155

160

Thr

Gly

Tyr

Leu

Í3

Asn

S2 <210>

«211* <212> <213>

166 wrr Človek

MCX

ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin

1

5

10

15

cys

Gin

í-ys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

teu

Asn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

T?5

Cys

Leu

Lys

ASP

Ara

Met

Asn

Phe

ASp

íle

Pro

Glu

GlU

íle

tys

Gin

Leu

Gin

35

40

«5

ô1n

Phe 50

G1«

Lys

Glu

ASp

Ala 55

Ala

LW

Thr

íle

Ί»

GlU

wet

Leu

Gin

Asn

íle

Phe

Ala

íle

Phe

Arg

Gin

ASP

ser

ser

ser

Thr

Gly

Trp

Asn

«5

70

75

60

Ala

Str

n e

Val

Ala

Ala

Leu

Leu

Ser

Asn

val

Tyr

KtS

cín

xle

A«n

es

90

95

MÍS

Lev

Ľys

Thr 100

Val

Leu

Clu

Glu

$

Leu

Glu

Lys

Glu

HS

Phe

Thr

Arg

Gly

ΪΪ!

Leu

Met

Ser

Ser

Leu 120

MÍS

teu

uys

Arg

2í

Tyr

Gly

Arg

11«

Leu 130

Híí

Tyr

L«U

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

Str

HlS 140

CyS

Alt

Trp

Thr

11« 145

val

Arg

val

G1U

íle 150

Lev

Arg

Asn

phe

Bs

Phe

11«

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly

Tyr

Leu

Arg

Asn

1« <2IO> 53 «211» 166 x212> »ar «Zlí* Človek

<400> 53

Phe

«et

Ser

Tyr

Asn

Leu

teu

Gly

Leu

Gin

arg

ser

ser

asn

Phe

Glft

1

5

10

15

cys

Gin

Ľys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

L«U

Clu

ΊΚ

cys

Leu

Lys

Asp

*3

Met

Asn

Phe

ASp

íle 40

pre

Glu

Glu

íle

Gin

teu

Cln

Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

ASp

Ala

Ala

teu

Thr

íle

τϊ£

Clu

Met

L«U

Gin

55

A$n Xlc Pht Ale líc Phe Arg aln ASp Ser $er Ser Lhr Gly ΤΓΒ am 65 70 75 60 elm Thr íle val clu Asn Leu Leu Ala *sn val Ala híí Gin íl* Ala

90 95

His

Leu

Ala

Ala 100

val

Leu

Glu

Clu

ai

Leu

Glu

Lys

Glu

Í3

Phe

Thr

Arg

«ly

ilí

Leu

Met

ser

Ser

Leu 120

MÍS

Ľ«V

Lys

Arg

Bs

Tyr

Gly

Arg

n·

Leu 130

MÍS

Tyr

LCU

Lys

Ala 135

Lys

Glu

Tyr

ser

Η1» 140

cys

Ala

trp

thr

íle 145

val

Arg

val

G1U

11« 150

Leu

Arg

Asn

Phe

m

Phe

xle

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly

Tyr

Leu

16?

Asn

<210» 54 <211* 166 «212» PAT <213> človek <400> 54

Mat 1

Ser

Tyr

Asn

Leu 5

Ltu

Gly

Pht

L«U

Gin 10

Arg

ser

ser

Asn

Phe 15

Gin

cy»

Gin

Lys

L«U 20

Leu

Trp

Cín

Leu

Asn 25

Gly

Arg

Leu

clu

cys

L»U

Lys

ASP

Λ5?

Met

Asn

Phe

Asp

íle 40

pro

Glu

clu

Ila

T,

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

ÄSp

Ala 55

Ala

Leu

Thr

íle

Glu

Met

teu

Gin

Asn «5

ne

Phe

Ala

n«

Phe 70

Arg

Gin

ASP

Ser

ser 75

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn 80

Glu

Thr

íle

val

Glu

Asn

Leu

Leu

Ale

Asn

val

tyr

His

Gin

Íle

Asn

85

90

95

hís

Leu

Lys

Thr 100

val

L*Lí

Ala

Ala

iS

Leu

Ala

Ala

Ala

$S

Phe

Thr

Arg

Gly

a?

Leu

Met

ser

Ser

ueu 120

H1S

Leu

Lys

Arg

Hs

tyr

Gly

Arg

íle

Leu 130

Hlt

tyr

L«U

uy*

Ala 135

iys

Glu

Tyr

Sir

His 140

cys

Ala

Trp

Thr

íle 145

val

Arg

val

Glu

íle 150

Leu

Arg

Asn

ehe

n;

phe

íle

ASrt

Arg

Leu 160

Thr

Qiy

Tyr

Leu

13

Asn

<21C> <2U> <212> «213» človek

<400> $5
rnt 1	$er	Tyr
Cys	Gin	Lys
Lys	ASP	*3
Gin	Phe
	50

A$ft Leu Leu cly Phe tew Gin

10

Leu teu Trp Gin Leu Asn Gly 20 25 «rt Asn Phe Asp xle Pro Glu

Lys Glu asp Ala Ala Leu Thr

ASn íle Mw Ala tie phe Arg Gin Asp ser 65 TO

Glu Thr íle v*1 Glu Atn Leu Leu Ala Asn

90

His Leu Lys Thr val l«u Glu Glu Lys Lau

100 105

Arg Arg Glu íle Ser val Glu

Ser

Leu íle ser tyr

Lys

Ser Asn Phe Gin

Glu		cys	Leu
Ly*	G1rt	Leu	Gin
4$
Glu	*et	Leu	Gin
Thr	Gly	Trp	A$n 80
MÍ5	Gin	íle	asn
		95
Glu	Ala	Ala	Thr
	110

Al*

Gly

Ala

«et

S«r

Ala

Leu 120

HlS

Leu

Lys

*r9 1?5

Tyr

Gly

Arg

íle

lev 130

HÍS

Tyr

Leu

Lys

Ala 135

lys

Glu

Tyr

Ser

His cys 140

Al*

Trp

Thr

Zle 14S

val

Arg

val

Glu

íle 150

teu

Arg

Ajn

Phe

S>

Phe H»

Asn

Arg

Leu 160

Thr

Gly

Tyr

L«U

Arg

Asn

165

<210>

<211> <212> <Z13>

166

PRT človek

<400> $6 Met Ser Tyr

Asn

teu 5

teu

Gly

Phe

Leu

Gin 10

Arg

ser

Ser

Asn

Phe 15

Gin

cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

*sn 25

Gly

Arg

Leu

Glu

35

cys

Leu

Lys

ASP

*3

Met

Asn

Phe

Asp

íle 40

?ro

Glu

Glu

íle

Lys 45

dn

Leu

Gin

Gin

ehe 50

Gin

Lys

Glu

ÄSp

Al* 55

Ala

Leu

Thr

íle

TS

Glu

Met

teu

Gin

Asn 65

íle

phe

Ala

íle

phe ?0

Arg

Gin

ASp

Ser

Ser 75

Ser

Thr

cly

Trp

Asn 80

Glu

Thr

íle

val

Glu 85

ASn

Leu

Leu

Ala

A$R 90

val

Tyr

HiS

Gin

n e 95

Asn

NÍS

Leu

ty*

Thr 100

val

Leu

Glu

Glu

$

Leu

Glu

Lys

Glu

ASP 110

Phe

Thr

Arg 61y

Lys 115

Leu

Kt

Ser

Ser

Leu 120

HiS

Leu

Lys

Arg

Ss

Tyr

Gly

AT 3

íle

Ala 130

Ale

Tyr

Leu

Ala

Al* 135

cys

Glu

Tyr

Ser

MÍS 140

cys

Ale

Trp

Thr

íle 143

val

AFJ

val

GlU

íle 150

Leu

Arg

a s. n

Phe

I??

Phe

zle

Α5Π

Arg

Leu 160

Thr Gly

Tyr

Leu

Ara 165

Asn

<210> 57 <ΖΠ> 166 <212> P»T <213> človek <400» 37

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

L«U

Gly

Phe

Leu

Gin

arg

Ser

ser

Asn

Phe

Gin

1

5

10

15

cys

Gin

Lys

Leu 20

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn 25

Gly

Arg

ueu

Glu

Ίδ

cys

Leu

cys

ASP

Arg

Met

Atn

Phe

Asp

íle

pro

Glu

Glu

Zle

Lys

Gin

Leu

Gin

35

40

45

Gin

Ph* 50

G1 h

Lys

GlU

ASp

Ala 55

Ala

L«u

Thr

íle

Ί5

Glu

Met

Leu

Glň

A$n

íle

Phe

Ala

íle

phe

Arg

Gin

ASp

ser

ser

ser

Thr

Gly

rrp

Asn

65

70

75

80

Glu

Thr

íle

val

Glu

ASfl

Leu

Leu

Ala

Asn

val

Tyr

HÍÍ

Gin

íle

ASn

85

90

95

HÍS

Leu

tys

Thr 100

val

Leu

Glu

Glu

Hl

Lau

Glu

iys

Glu

Asp 110

Phe

Thr

Arg

Gly

Hl

Leu

»et

ser

ser

Leu 120

H-ís

Leu

lys

Arg

n;

Tyr

cly

Arg

íle Leu

í

Tyr

L«U

ty*

Ale

Al· Ala

iyr

Ser

Hit

cyi

Ala

Trp

Thr

1W

Ul

140

11· Val 145

Arg

val

Glu

t!· 130

LW

Arg A>n

rhe

I?s

Phe

tie

A*n

Ary

Lvu 160

Thr Gly

Tyr

Lev

ÍH

A$n

<2W> *211» <212> . <213>

5«

166

F*T človek

Met ser Tyr Asn ueu l«u Gly Phe l«u Gin Arg ser $«r am phe clo 13 1$ 15

cys

Gin

Lys

Leu 20

kcu

Trp

Gin

LCU

Asn 25

Gly

Arg

l«v

oiu

T

cys

Leu

Lys

ASP

Ara

Mtt

Ain

rtse

Ajp

íle

Pro

Glu

Glu

íle

vy*

Gin

Leu

Gin

35

40

45

Gin

Phe 50

Gin

Lys

Glu

*$P

Ala 55

Ala

L«U

Thr

íle

Glu

Met

uev

Gin

Α3Π

11«

Phe

Ala

íle

phe

*rg

Gin

A»P

Ser

Ser

ser

Thr

Gly

Trp

A*n

65

70

75

SO

G1U

Thr

De

val

Glu

Asn

Leu

ueu

«le

Asn

val

Tyr

Hl*

Gin

íle

Asn

«5

90

95

His

Leu

cys

Thr 100

val

lev

Glu

Glu

L«U

Glu

lys

Glu

A SO 110

Phe

Thr

arg

Gly

»3

Lev

Met

ser

Ser

Leu 120

Hl*

ueu

uys

Arg

K

Tyr

«1y

Arg

íle

m

HiS

Tyr

Leu

ty*

Ala 135

• y*

61H

Tyr

Ala

Al* 140

Cyr

Al*

Tí-p

Tfcr

11« 145

val

Arg

val

Glu

íle 150

Leu

Arg

A$n

Phe

T

Phe

I1e

asp

Arg

Letí 160

Thr Gly Tyr

L«V lír·” <210> <?n>

<212>

<213»

<400> 59

Gly

Met

ser

Tyr

Afft

Leu

Leu

Phe

LCU

Gin

Arg

Ser

Ser

*»n

Phe

Gin

1

5

W

15

cy*

Gin

Lys

Leu 20

teu

Trp

Gin

Leu

A*n 25

Gly

Arg

Leu

Glu

T

cys

Leu

Lys

A»P

Arg

Met

A*n

Phe

ASp

íle

Pro

Gly

Glu

íle

Lys

Gin

Leu

Gin

*0 <5

GM

phe

Gin

Lys

GlU

ASP

Ala

Ala

Leu

Thr

I1e

n<;

Glu

Met

l«u

Gin

50

55

60

Asn

n·

Ph«

41«

n·

Phe

Arg

Gin

Asp

Ser

Ser

$«r

Thr

Gly

Trp

AM

65

70

7S

«0

Glu

Thr

íle

val

giw

A*ft

Leu

L«u

Ala

Asn

v»1

Tyr

Hi*

Gin

11«

A*n

«5

90

95

Ml*

LW

tys

Thr

val

L«l

Glu

Glu

«í

Leu

G1U

Lys

GlU

ts

PM

Thr

Arg

Gly

Leu

wet

ser

ser

ueu 120

HÍS

Leu

Lys

Arg

Tyr 125

Tyr

«1y

Arg

ne

iK

Híí

Tvr

Leu

Lys

8!

Lys

Glu

Tyr

Ser

Hl* 140

cyt

Ala

Trp

Thr

íle

val

Arg

Ala

Glu

11«

Leu

Ala

Asn

Phe

Ale

PM

ňe

Ala

Arg

Leu

145

150

155

160

Thr

Gly

Tyr

··“

le?

A»n

<210» <211» <212» <213>

166

PWT

Človek

<400 60 Mi ser Tyr 1

Asn

Leu 5

L4U

Gly

PM

LCU

Gin 1O

Arg

Ser ser

Asn

Phe Gin 15

cys

Gin

tys

Leu 20

ueu trp

Glh

Leu

AM 25

Gly

Arg

Leu Glu

To

Cys

L«U

Lys

ASP

*£!

net

ASO

PM

ASp

íle 40

Pro

Glu

Glu

n. tJJ

Gin

Leu

Gin

Gin

phe $0

Gin

lys

Glu

ÄSp

Alt Alt 55

leu

Thr

He

T^r Glu

Met

Lev

Gin

i?

ne

Phe

Ala

n·

PM 70

Arg

Gin

**í*

Ser

ser 75

Ser Thr

Gly

Trp

Asn 60

elu Ttír

ľle val

G1U BS

Asn

teu

L«U

Ala

AM 90

val

Tyr HU

Glň

Jle Asn M

Mi S

LTU

ty«

TM*· 100

val

LAU

e1w

ciw

Lev

aiu

Ly* alw

n?

Phe

thr

Arg

Gly

&

teu

Met

ser

Ser

Leu 120

HÍS

Lett

ty*

Arg Tjjt ryr Gly

Arg

Xla

Leu 130

rrf»

tyr

l«u

Ly*

Ala 135

Lys

GlU

Tyr

ser

Hi> Cys Ala Trp 140

Thr

íle 14$

val

*rg

Val

Glu

8í

Leu

Arg

Asn

ehe

3í

PM 11« AM Arg

Leu 1«

Thr gly Tyr Leu Arg asn <210> 6 X <2U> 8 <212* p*t

Syntetický peptid <21S> umelá sekvencia <223> opis umelej sekvencie?

«210» 62 f

<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

«223*Opis umelej sekvencie:

Syntetický peptid

<210> 63 <211> 6 <212> Prr <213> Ume lá s ekvencia

Syntetický 6x Ris tag <220>

<223>Opis umelej sekvencie:

<210> 64 <211* 5 <212> PST ^<Z15> Umelá sekvencia <225> Opis umelej sekvencieí Syntetický peptid <400» 64

Claims (23)

1. Polypeptid obsahujúci

a) mutant interferónu-beta-la (IFN-/3) vybraný zo skupiny pozostávajúcej zmutantov IFN-β majúcich aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v tabuľke 1 ako Al, BI, Cl, CD1, CD2 a DE1; a

b) kĺbovú oblasť, doménu CH2 a doménu CH3 imunoglobulínu.

2. Polypeptid podľa nároku 1, pričom imunoglobulínom je ľudský imunoglobulín.

3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, pričom imunoglobulínom je imunoglobulín IgG.

4. Polypeptid podľa nároku 3, pričom imunoglobulínom IgG je imunoglobulín IgGl.

5. Polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 42.

6. Polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 44.

7. Polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6, pričom mutant interferónu-beta-la (IFN-/3) je glykozylovaný na aminokyseline v aminokyselinovej sekvencií.

8. Polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6, pričom mutant interferónu-beta-la (IFN-/3) je derivovaný na aminokyseline v aminokyselinovej sekvencií.

9. Polypeptid podľa nároku 7, pričom mutant interferónu-beta-la (IFN-/3) je derivovaný.

10. Polypeptid podľa nároku 8 alebo 9, pričom mutant interferónu-beta-la (IFN-/3) je derivovaný s polyalkylglykolovým polymérom.

11. Polypeptid podľa nároku 10, pričom polyalkylglykolový polymér je pripojený na N-koniec aminokyselinovej sekvencie mutantu interferónu-beta-la (IFN-/3).

12. DNA kódujúca polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 6.

13. Rekombinantná DNA obsahujúca DNA podľa nároku 12 a kontrolnú sekvenciu expresie, pričom uvedená kontrolná sekvencia expresie je operatívne spojená s uvedenou DNA.

14. Hostiteľská bunka obsahujúca rekombinantnú DNA podľa nároku 13.

15. Spôsob prípravy polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že obsahuje

a) poskytnutie populácie hostiteľských buniek podľa nároku 14;

b) rast uvedených buniek v podmienkach, v ktorých je polypeptid kódovaný rekombinantnou DNA exprimovaný; a

c) izoláciu exprimovaného polypeptidu.

16. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 11 a farmaceutický prijateľný nosič.

17. Použitie polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 11 na prípravu liečiva.

18. Použitie podľa nároku 17, pričom liečivo je na liečenie alebo prevenciu zápalového, autoimúnneho, angiogenetického, nádorového alebo vírusového ochorenia.

19. Použitie podľa nároku 18, pričom vírusovým ochorením je infekcia ECM, chrípka, infekcia respirač5 ného traktu, besnoty alebo hepatitídy.

20. Použitie podľa nároku 18, pričom autoimúnnym ochorenímje lupus alebo skleróza multiplex.

21. Použitie podľa nároku 18, pričom zápalovým ochorením je fibróza.

22. Použitie podľa nároku 18, pričom angiogenetickým ochorenímje diabetická retinopatia, retinopatia nedonosených, degenerácia makuly, odmietnutie rohovkového štepu, neovaskulámy glaukóm, retrolentálna

10 fibroplázia, rubeóza alebo Osler-Weberov syndróm.

23. Použitie podľa nároku 18, pričom nádorovým ochorenímje osteogénny sarkóm, lymfóm, akútna lymfocytová leukémia, rakovina prsníka, melanóm, nazofaringálny karcinóm alebo hemangióm.