KR100804885B1

KR100804885B1 - 경피증의 치료 또는 예방을 위한 ｓａｒｐ-1의 용도

Info

Publication number: KR100804885B1
Application number: KR1020037007278A
Authority: KR
Inventors: 크리스틴 플라테르-지베르크; 크리스틴 파워; 작퀘스 콜린제
Original assignee: 라보라토리스 세로노 에스.에이.
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2008-02-20
Also published as: AU2636602A; HUP0302738A2; DE60128009D1; MXPA03005027A; US20080107627A1; EA200300639A1; WO2002046225A2; CN1323716C; US20050113291A1; EP1806144A2; KR20030076585A; CZ20031855A3; NZ525774A; DE60128009T2; EA005973B1; IL156069A0; PT1411970E; DK1411970T3; HUP0302738A3; BG107941A

Abstract

본원 발명은 경피증, 특히 전신적 경화증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 SARP-1의 용도에 관한다.

Description

경피증의 치료 또는 예방을 위한 ＳＡＲＰ-1의 용도{USE OF SARP-1 FOR TREATMENT AND/OR PREVENTION OF SCLERODERMA}

본원 발명은 경피증 치료에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 경피증, 특히 전신적 경화증의 치료 또는 예방을 위한 SARP-1의 용도에 관한다.

경피증은 피부와 내부 장기의 섬유증으로 특성화되는 결합 조직의 질환으로, 장기 부전 및 사망을 초래한다(Black et al., 1998; Clements and Furst, 1996). 경피증은 광범위한 증상 및 다양한 치료 결과를 보인다. 이는 국소적 경피증, 전신적 경화증, 경피증-유사 질환 및 Sine 경피증으로 구성된다(Smith, 2000). 국소적 경피증은 섬유증과 연관된 드물게 나타나는 피부 질환으로 증상이 피부에 국한되는 반면, 전신적 경화증은 내부 장기 병발에 대한 다양한 위험 및 피부 질환의 정도에서 변이를 보이는 다중시스템 질환이다. 전신적 경화증은 확산되거나 또는 한정될 수 있다. 한정된 전신적 경화증은 CREST라 한다(석회증, 레이노 식도 기능장애, 손가락 경화증, 모세관 확장증). 경피증-유사 질환은 산업 환경에 대한 노출과 관련된 것으로 생각된다. Sine 질환에서는, 피부 변화없이 내부 장기 병발이 진행된다.

경피증, 특히 전신적 경화증의 주요 증상은 과도한 콜라겐 합성과 침착, 내 피 기능장애, 경련, 쇠약, 섬유증에 의한 폐색이다.

경피증은 1백만명당 대략 19명이 발병하는 흔하지 않은 질환이다. 경피증의 원인은 알려져 있지 않다. 하지만, 유전적 소양이 중요하다. 비정상에는 자가면역 및 내피 세포와 섬유아세포의 기능 변화가 포함된다. 실제로, 전신적 경화증은 진단으로부터 5년 이내에 50%가 사망하는 가장 중증도의 자가-면역 질환이다(Silman, 1991).

진단의 측면에서 중요한 임상적 파라미터는 중수수지 관절에 인접한 피부의 비후(thickening)이다. 레이노 증상은 경피증의 빈발하고 보편적인 구성 요소이다. 이는 추위 노출 직후에 피부의 색깔 변화로 진단된다. 허혈과 피부 비후는 레이노 질환의 증상이다.

여러 기초적인 생물학적 과정이 이 질환의 시작, 심각도, 진행에 관여하고, 여기에는 혈관 기능장애, 내피세포 활성화와 손상, 백혈구 축적, 자가-항체 생산 및 결정적으로 무절제한 섬유성 반응이 포함되는데, 이는 죽음을 초래할 수도 있다(Clements and Furst, 1996). 섬유아세포는 이런 질환의 병인에서 중추적인 역할을 한다. 경피증 환자로부터 얻은 일차 섬유아세포는 생체내에서 나타나는 질환의 다양한 특징, 특히 콜라겐과 피브로넥틴의 증가된 세포외 매트릭스 합성과 침착 및 TGFβ와 CTGF와 같은 변형된 성장인자와 사이토킨의 생산을 보인다(Strehlow and Korn, 1998 and LeRoy, 1974).

현재, 경피증의 의학적 치료법은 없다. 혁신적이긴 하지만 위험 부담이 큰 치료요법에서는 자기 줄기세포 이식을 제안하였다(Martini et al., 1999). 특히, 섬유성 과정을 표적으로 하는 경피증 치료법은 현재 존재하지 않는다(Wigley and Boiling, 2000).

질환 위험 및 경피증 진행과 관련된 유전자의 동정은 다양한 질환 단계에서 개입을 위한 효과적인 전략의 개발로 이어질 수 있다.

SARP-1(분비된 아폽토시스-관련 단백질 1)은 7가지 막통 수용체의 곱슬모양(frizzled) 군에서 발견되는 시스테인 풍부한 도메인(CRD 도메인)에 대한 상동성에 기초하는 분비된 곱슬머리모양 관련 단백질로 알려진 일군의 분비된 단백질의 구성원이다(Rather et al., 1997). 곱슬모양 유전자는 초파리속(Drosophila) 및 조절 조직 극성에서 처음 발견되었다(Adler et al., 1987). 곱슬모양 단백질은 배형성동안 세포-세포 상호작용을 조절하는 적어도 16개의 분비된 신호전달 분자로 구성되는 고도로 보존된 Wnt 군에 대한 수용체이다(Smalley and Dale, 1999). Wnt 작용의 기전은 몇몇 시스템에서 인식되었다: 초파리속(Drosophila)과 꼬마 선충(C. elegans)에서 유전학; 세포 배양에서 생화학; 손톱개구리속(Xenopus) 배아에서 이소성 유전자 발현. 생쥐에서 많은 Wnt 유전자는 돌연변이되는데, 이는 매우 특이적인 발달 결함을 초래한다. Wnt와 곱슬모양 단백질의 상호작용에 의해 유발되는 Wnt 신호전달 경로는 몇몇 세포질 릴레이 성분을 통하여 매개되고 다중단백질 β-카테닌 반전(turnover) 복합체의 활성을 억제하여 시토졸 β-카테닌의 축적을 가능하게 하는데, 이후 이는 핵에 진입하고 TCF와 복합체를 형성하여 Wnt 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다(Miller et al., 1999; Kuhl et al., 2000).

Wnt-곱슬모양 상호작용은 별개의 Wnt 결합 단백질인 분비된 곱슬모양 관련 단백질(SFRP)의 제한적 발현을 통하여 조절될 수 있다. SFRP는 N-말단 CRD 도메인을 통하여 Wnt와 결합할 수 있다. 따라서, 이들은 Wnt와 이의 수용체를 격리시켜 이의 작용에 길항할 수 있다(Bafico et al., 1999).

SARP-1은 몇몇 다른 이름, 예를 들면 SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2로 알려져 있다. 뮤린이나 사람 SARP-1의 일부분이나 전장 단백질 및/또는 핵산 서열은 여러 특허 출원, 예를 들면 WO 98/35043, WO 98/13493, EP 0 879 887, WO 99/46281에 기술되어 있다.

기능의 측면에서, 분비된 곱슬모양-관련 단백질(SFRP)은 분비된 Wnt 리간드의 결합에 대하여 막-결합 곱슬모양 수용체와 경쟁함으로써 Wnt 신호전달의 가용성 조절물질로 기능하는 것으로 보인다. SARP-1이외에, 지금까지 알려진 이런 군의 사람 단백질에는 SARP-2(SFRP-1)와 SARP-3(SFRP-5)이 포함된다. 뮤린 SARP-1 및 사람 SARP-2와 -3은 아폽토시스에 대해 세포를 감작화시키거나 또는 아폽토시스 반응을 저해하는 능력을 가진 것으로 보고되었다(Melkonyan et al., 1997). 유방 선암종 세포주에서 발현되는 생쥐 SARP-1과 사람 SARP-2는 친-아폽토시스 자극에 대한 세포 감수성에 반대의 효과를 보였다. SARP-1을 보유하는 세포가 높은 저항성을 갖는 반면, SARP-2를 발현하는 세포는 종양 괴사 인자와 세라미드에 의해 유도된 아폽토시스에 감작화되었다. SARP-1 또는 SARP-2의 발현은 Wnt 매개된 신호 전달의 척도인 β-카테닌의 세포내 수준을 변화시키는데, 이는 SARP가 Wnt-곱슬모양 신호전달 경로를 간섭한다는 것을 암시한다(Melkonyan et al., 1997).

노던 블랏 분석에서 SARP 유전자가 독특한 발현 패턴을 갖는 것으로 확인되 었다(Leimeister et al., 1998). SARP-1은 몇몇 사람 조직에서 2.2-와 1.3-kb 전사체로 존재하는데, 특히 결장과 소장에서 가장 높은 수준으로 존재한다. Chang 등(1999)은 SARP-1 또는 SFRP-2가 소 망막의 속핵층(inner nuclear layer) 전체에서 주로 발현된다고 보고하였다. 망막내에서, SARP-3 또는 SFRP-5는 망막 색소 상피에서 주로 발현된다.

Melkonyan 등(1997)은 체세포 하이브리드의 분석으로 사람 크로모좀 4에서 SARP-1 유전자 지도를 작성하였다. Chang 등(1999)은 방사 하이브리드 분석으로 지도 위치를 4q31.3으로 한정하였다.

변형된 SARP-1 발현이 암과 연관한다는 증거가 늘어나고 있다(WO 98/13493).

본원 발명의 요약

본원 발명은 경피증의 확립된 동물 모델에서 SARP-1의 유익한 효과에 기초한다.

따라서, 본원 발명의 첫 번째 목적은 경피증, 특히 전신적 경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에 SARP-1을 사용하는 것이다. 본원 발명의 두 번째 목적은 경피증, 특히 전신적 경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에 SARP-1을 발현하는 세포 또는 SARP-1에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것이다. SARP-1을 함유하는 제약학적 조성물 및 인체에 SARP-1을 투여하는 단계로 구성되는 치료 방법 역시 본원 발명에 속한다.

도 1 은 유전자 필터 분석으로 측정하는 경우에, 7명의 경피증 환자로부터 유래된 정상 섬유아세포와 병든 섬유아세포에서 SARP-1 mRNA의 발현을 도시한다. 각 시료군(정상 또는 비정상)에 대한 평균(mean) 발현 수준은 (A)에, 중점(median)은 (B)에 제시한다.

도 2 는 실시간 PCR로 측정하는 경우에, 8명의 경피증 환자로부터 유래된 병든/정상 섬유아세포(적은 계대배양 횟수, <5 계대배양)에서 SARP-1 mRNA의 발현율을 도시한다.

도 3 은 GAPDH mRNA 발현과 비교하여 정상적인 사람 피부 섬유아세포(NHDF)에서 SARP-1 mRNA 발현의 실시간 PCR 분석을 도시한다.

도 4 는 GAPDH와 관련된 경피증 환자(n=2)로부터 유래된 비정상 피부 생검과 비교하여 임상적으로 정상적인 사람 피부 생검(n=6)에서 SARP-1 mRNA 발현의 실시간 PCR 분석을 도시한다.

도 5 A와 B는 SARP-1 cDNA의 뉴클레오티드 서열과 추정 아미노산 서열을 연속하여 도시한다. 신호 펩티드에 대한 예상 절단 위치는 화살표로 표시한다.

도 6 은 사람과 뮤린 SARP-1 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 두 서열간 비-상동 잔기는 강조한다(회색).

도 7 은 SARP-1 대조군과 비교하여 트랜스펙션된 세포와 의사(mock) 트랜스펙션된 세포에서 아폽토시스 수준을 도시한다. ^***는 통계학적으로 유의한 감소이다.

도 8 은 사람 피부 섬유아세포 배양액으로부터 수거된 조건 배지에서 전체 MMP-1 활성에 대한 SARP-1 처리의 효과를 도시한다. 섬유아세포는 병든 조직(A, D, F), 건장한 개체(B, C) 또는 경피증 환자의 병들지 않은 부위(E)로부터 유래된다.

도 9 는 자극받지 않은 NIH3T3 세포 및 TGFβ자극된 NIH3T3 세포에서 콜라겐 프로모터 활성에 대한 SARP-1 공동-트랜스펙션(co-transfection)의 효과를 도시한다. (A)는 리포터 분석에서 측정된 형광 단위를 나타내고, (B)는 대조군과 관련된 형광 비율을 제시한다.

도 10 은 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 모델에서 폐당 섬유증 스코어를 도시한다. 운반체, SARP-1 트랜스펙션된 세포, 의사 트랜스펙션된 세포 또는 항-TGF 치료를 제공받은 생쥐에서 측정된 스코어를 도시한다. ^***는 통계학적으로 유의한 감소이다.

본원 발명에서, 분비된 단백질 SARP-1의 발현은 대조군 세포와 비교하여 경피증 환자로부터 유래된 병든 섬유아세포에서 훨씬 낮은 것으로 밝혀졌다. DNA 유전자 필터 마이크로어레이 기술을 활용하여, 경피증 환자의 임상적으로 영향을 받지 않은 피부 부위로부터 분리된 섬유아세포와 비교하여 경피증 환자의 섬유증 병변으로부터 분리된 피부 섬유아세포에서 상이하게 발현되는 유전자를 동정하였다. SARP-1의 발현은 7명의 검사 환자중 5명의 손상 섬유아세포에서 하향 조절되었다. 이에 더하여, 경피증 환자의 비정상 피부의 전체 생검 시료로부터 분리된 전체 RNA 의 실시간 RT-PCR 분석에서는 임상적으로 정상적인 연령, 성별, 해부학적 위치 대합된 대조군 생검과 비교하여 좀더 낮은 수준의 SARP-1 mRNA를 보였다.

상기 결과에 더하여, 유전자 필터 마이크로어레이에 포함된 모든 유전자의 발현 수준을 비교하는 통계학적 방법으로 SARP-1의 하향조절이 환자에서 섬유성 병변과 95%의 연관 가능성을 갖는 것으로 확인되었는데, 이는 상기 질환의 임상적 진행과의 연관을 암시한다.

경피증에서 SARP-1의 유익한 효과는 경피증의 확립된 뮤린 모델인 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 모델에서 확인되었다. 상기 모델에서, SARP-1 발현 세포의 투여는 폐 섬유증의 비율을 현저하게 감소시켰다.

따라서, 본원 발명은 경피증을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조를 위한 사람 SARP-1 수용체와 결합하고 이의 신호전달을 유도하는 물질, 또는 내인성 SARP-1의 방출을 촉진하거나 이의 활성을 강화시키는 물질의 용도에 관한다. 상기 물질은 SARP-1 수용체에 결합하고 이를 통한 신호전달을 유도하는 성숙 SARP-1 자체 또는 이의 임의 단편 및 SARP-1 수용체의 추가적인 작동물질(agonist), 예를 들면 SARP-1 수용체를 지향하는 자극 항체 또는 이의 특이적인 화학적 작동물질일 수 있다.

SARP-1에 연상되고 있는 수용체는 SARP-1의 시스테인 풍부한 곱슬모양(frz) 도메인에 결합하는 것으로 추정되는 Wnt-단백질이다(Lin et al., 1997). 본원 발명에 따른 물질은 시스테인 풍부한 곱슬모양 도메인을 포함하는 SARP-1의 단편일 수도 있다.

적절하게는, 경피증의 치료 및/또는 예방에 사용되는 물질은 다음에서 선택된다:

(a) 성숙 SARP-1;

(b) SEQ ID NO:2를 포함하는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 21 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 24 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 26 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 27 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:2의 아미노산 28 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 37 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(j) (a) 내지 (i)중 한가지의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (i)의 서열중 적어도 한가지와 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 80%이상 또는 90%이상의 동일성을 갖는다;

(k) 다소 엄격한 조건하에 또는 매우 엄격한 조건하에 (a) 내지 (i)중 한가지를 인코드하는 고유 DNA 서열의 보체와 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코드되는 (a) 내지 (i)중 한가지의 뮤테인;

(l) (a) 내지 (i)중 한가지의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열의 임의 변화는 (a) 내지 (i)의 아미노산 서열에서 보존성 아미노산 치환이다;

(m) (a) 내지 (l)중 한가지의 염, 동소체, 융합 단백질, 기능적 유도체, 활 성 분취물 또는 순환 치환된 유도체.

사람 SARP-1의 전장 cDNA는 클론되었고, 도 5 및 첨부된 서열 리스트의 SEQ ID NO:1에 제시한다. 상응하는 아미노산 서열은 도 5 및 첨부된 서열 리스트의 SEQ ID NO:2에 제시한다. 하기 실시예에 보인 바와 같이, SARP-1의 N-말단은 매우 이질성인 것으로 밝혀졌다. SARP-1의 신호 펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295 또는 21 내지 295에 걸쳐 있는 것으로 예상된다. HEK 293 세포에 발현된 정제된 재조합 사람 SARP-1의 N-말단 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 24, 25, 26, 27, 28 또는 37에서 시작하는 성숙 SARP-1의 다른 N-말단 서열 리딩(leading)을 보였다.

본원에서 "SARP-1"은 상기 (a) 내지 (m)에서 의도된 물질중 한가지 또는 전체를 의미한다.

본원에서 "치료 및/또는 예방"은 질환의 형성, 발달, 진행, 또는 이런 질환의 한가지 증상, 여러 증상 혹은 전체 증상의 형성, 발달, 진행의 약화, 감소 또는 부분적인, 실질적인 혹은 완전한 예방이나 차단을 의미한다. 본원 발명은 섬유성 질환, 예를 들면 전술한 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 SARP-1의 용도에 관한다.

본원에서 "경피증"은 도입부에 상세히 설명한 바와 같이, 임의 분류와 정의의 경피증 및 이런 경피증의 한가지이상 증상을 의미한다. 또한, 경피증은 예로써 Smith(2000)에 기술된 것과 같은 경피증과 연관된 것으로 알려진 질환을 의미한다.

본원에서 "경피증"에는 다른 섬유성 질환, 예를 들면 경화증, 간질 폐 섬유 증, 듀피트렌 연축, 켈로이드와 다른 흉터/상처 치료 비정상, 수술후 협착, 반응성 섬유증 및 특히 심근경색이후 만성 심부전이 포함된다.

SARP-1로 치료가능한 추가적인 질환에는 상처 치료 질환, 특히 폐의 만성 염증과 최종적인 섬유증 또는 폐 표면의 흉터를 비롯한 폐에서 상처 치료가 포함된다. 폐 염증이 포함된 질환에는 예로써 특발성 폐 섬유증, 육아종, 기관폐 형성장애, 섬유증식성 ARDS, 폐 증상, 또는 전신적 질환(예, 류머티스 관절염)이 포함된다(Krein et al., 2001).

적절하게는 "경피증"은 국소적, 전신적, 한정적 또는 확산적 증상 및 중복 증상을 의미한다.

국소적 경피증은 피부에 주로 영향을 주지만, 피부아래의 근육과 뼈에도 영향을 줄 수 있다. 하지만, 이는 내부 장기에 영향을 주지는 않는다. 국소적 경피증은 상대적으로 경미하고 유사한 표면 증상, 예를 들면 현미경하에 피부 생검 외형의 측면에서 전신적 경피증과 관련될 수 있다.

전신적 경피증은 여러 유형이나 종류의 증상, 예를 들면 한정되고 확산된 CREST를 포함한다. 전신적 경피증은 전신적 경화증으로 알려져 있다. 이는 진행성 전신적 경화증, 또는 가족성 진행성 전신적 경화증이라고도 한다. 전신적 경피증은 피부, 혈관 및/또는 내부 장기에 영향을 줄 수 있다. 전신적 경피증이 피부에 영향을 주게 되면, 가장 일반적으로 손 및/또는 얼굴의 피부가 딱딱해진다. 전신적 경피증이 혈관에 영향을 주게 되면, 레이놀드병이 초래될 수 있다. 가장 심각한 형태의 전신적 경화증은 내부 장기에 피해를 입혀, 무력 또는 심지어 죽음을 초래할 수 있다. 무엇보다도, 전신적 경화증에는 다음과 같은 증상이 포함된다: 경피증 폐 질환, 경피증 신장 질환, 심장 증상, 피곤이나 한정된 CREST를 비롯한 근육 약화, 위장관 운동장애(dysmotility)와 경련, 중추신경계, 말초신경계, 자율신경계에서 비정상. 신경계 비정상과 관련하여, 수근관 증후군과 이후의 삼차신경통이 가장 일반적이다.

한정적 경피증은 손에 한정되지만, 얼굴과 목이 포함될 수도 있다.

확산적 경피증은 피부 타이트닝(skin tightening)을 포함하고 손목(또는 발목)에도 발생한다. 여러 하위범주의 확산된 전신적 경화증이 존재한다; 예를 들면 "경피증 사인(sine) 경피증", 여기서 내부 장기 섬유증은 나타나지만 피부 타이트닝은 나타나지 않는다; 가족성 진행성 전신적 경화증.

중복 증상은 경화증 환자가 다른 자가면역 질환(예, 루프스, 류머티스 관절염 등)을 보이는 경우, 예를 들면 루프스와 중복된 확산적 경피증을 의미한다. 경피증 증상은 혼성 연결 조직 질환(MCTD) 또는 미분화 연결 조직 질환(UCTD)의 일부 일 수도 있다.

본원에서 "SARP-1"은 서열 리스트의 SEQ ID NO: 2(사람) 또는 SEQ ID NO: 5(뮤린) 서열의 전체 또는 일부분을 포함하는 단백질, 이의 염, 동소체, 뮤테인, 활성 분취물, 기능적 유도체, 순환 치환된 유도체에 관하는데, 여기서 SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2 또는 FRP-3과 같은 상기 단백질의 명칭은 중요하지 않다.

적절하게는, "SARP-1"은 신호 펩티드가 결핍된 성숙 단백질을 의미한다. 신 호 펩티드는 SEQ ID NO: 2에 정의된 SARP-1의 첫 20개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개 또는 36개 아미노산을 보유하는 것으로 예상되는데, 이는 성숙 단백질이 SEQ ID NO: 2의 21, 24, 25, 26, 27, 28 또는 37 내지 295의 아미노산을 포함한다는 것을 의미한다.

도 6에 도시된 바와 같이, SARP-1의 사람 아미노산은 뮤린 서열(SEQ ID NO: 5)과 매우 상동하다. 따라서, 뮤린 SARP-1 및 다른 종으로부터 유래된 단백질은 사람에서 실질적인 면역 반응을 유도하지 않으면서 생물학적 활성을 보일 수 있을 만큼 단백질간에 충분히 높은 상동성이 존재하면 본원 발명에 사용될 수 있다.

또한, "SARP-1"은 경피증에서 원하는 활성을 보이는 SEQ ID: 2 또는 5의 임의 단편, 일부분, 도메인 또는 서브도메인에 관한다. 단백질 단편 또는 상기 단백질의 한가지이상 도메인은 경피증에 유익한 효과, 바람직하게는 전장 단백질에 적어도 필적하는 효과를 보이면 본원 발명에 사용될 수 있다. 유익한 효과는 하기 실시예에서 밝힌 시험관내 혹은 생체내 검사중 한가지, 또는 경피증에서 효과를 입증하는데 적합한 다른 분석법으로 측정할 수 있다. 가령, SARP-1은 시스테인 풍부한 곱슬모양 도메인 및 메탈로프로테이나제(TIMP)의 조직 저해물질과 상동한 네트린-유사 도메인, 즉 NTR 모듈을 포함한다(Banyai and Patthy, 1999). 따라서, SARP-1의 곱슬모양 도메인을 포함하는 단편, 또는 NTR 모듈을 포함하는 단편이 본원 발명에 적합한 단편이다.

본원 발명에서, SARP-1은 자연 발생, 즉 고유 단백질, 또는 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 생산은 진핵 세포, 예를 들면 효모 세포, CHO 세포, 또는 사람 섬유아세포 세포나 세포주에서 실시할 수 있다. 이는 대장균(E. coli)과 같은 원핵 세포에서 생산할 수도 있다.

적절하게는, SARP-1은 하나이상의 부위에서 당화된다. 이는 필요성 및 상기 단백질의 생산이나 분리 소스에 따라 당화되지 않을 수도 있다.

본원에서 "염"은 SARP-1 또는 이의 유사체의 아미노기의 카복실기 염 및 산첨가염을 의미한다. 카복실기 염은 당분야에 공지된 방법으로 만들 수 있는데, 여기에는 무기염, 예를 들면 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염 등 및 유기염기와의 염, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌 혹은 리신과 같은 아민, 피페리딘, 프로케인 등으로 형성된 염이 포함된다. 산첨가염에는 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 임의의 이런 염은 본원 발명과 유관한 SARP-1의 생물학적 활성을 보유해야 한다, 다시 말하면 경피증에 유익한 효과를 발휘해야 한다.

SARP-1의 동소체 또는 접합 변이체는 경피증 질환의 진행 및/또는 이런 질환의 증상을 저해할 수 있으면 본원 발명에 사용될 수 있다. 사람 조직에서 차별적으로 발현되는 것으로 밝혀진 1.3 kb와 2.2 kb 전사체는 예로써 SARP-1의 상이한 이성질체일 수 있는데, 이들 역시 본원 발명에 사용될 수 있다.

본원에서 "뮤테인"은 고유 SARP-1의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나, 결실되거나 또는 1개이상의 아미노산 잔기가 SARP-1의 고유 서열에 부가되는 SARP-1의 유사체를 의미하는데, 상기 뮤테인은 야생형 SARP-1의 활성과 동일하거나 또는 이보다 훨씬 강한 활성을 보유한다. 이들 뮤테 인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 다른 공지된 적합한 기술을 활용하여 만들 수 있다.

임의의 이런 뮤테인은 SEQ D NO: 2에 기재된 바와 같이 SARP-1의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지고, 따라서 SARP-1과 실제 유사한 활성을 가진다. SARP-1 변이체의 활성은 당분야에 공지된 분석법, 특히 하기의 실시예에 상술된 분석법으로 검사할 수 있다. 가령, 섬유아세포에서 콜라겐 합성의 함량을 측정하는 것(실시예 7)은 SARP-1의 활성을 측정하는데 적합한 검사이다.

본원 발명에 따른 뮤테인에는 본원 발명에서 SARP-1을 인코드하는 DNA이나 RNA에 혼성화되는 DNA이나 RNA와 같은 핵산에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. "엄격한 조건"은 혼성화 및 후속의 세척 조건을 나타낸다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al.(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

제한없이, 엄격한 조건에는 연구중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 대략 12 내지 20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에 좌우된다. 혼성 프로브를 사용하는 경우에는 SSC 대신에 테트라메틸 암모늄 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, 1987, 1999).

적절하게는, 이런 뮤테인은 SARP-1의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지고, 따라서 SARP-1과 실제 유사하거나 또는 이보다 더 강한 생물학적 활성을 가진다.

SARP-1의 가장 용이하게 측정되는 활성은 콜라겐 합성을 감소시키는 능력이다. 이런 활성을 측정하는 분석법은 하기 실시예 6에 상세히 기술한다. 뮤테인이 실질적인 콜라겐 감소 활성을 보유하면 SARP-1과 유사한 활성을 갖는 것으로 간주할 수 있다. 따라서, 임의의 뮤테인이 SARP-1과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 지는 실시예 7에서 밝힌 바와 같은 간단한 분석법에 상기 뮤테인을 적용하는 통상적인 실험방법으로 확인할 수 있다.

적절한 구체예에서, 이런 뮤테인은 첨부된 서열 리스트의 SEQ ID NO: 2 서열과 적어도 40% 서열 동일성이나 상동성을 갖는다. 좀더 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%의 서열 동일성이나 상동성을 갖고, 가장 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성이나 상동성을 갖는다.

서열을 비교함으로써 확인된 동일성은 2가지이상 폴리펩티드 서열 또는 2가지이상 폴리뉴클레오티드 서열간 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 각각 비교되는 서열의 전장에서 2가지 폴리뉴클레오티드나 2가지 폴리펩티드의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드, 또는 아미노산 대 아미노산간 대응관계를 반영한다.

정확한 대응관계에 있지 않는 서열에서는 "% 상동성"을 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 2가지 서열은 정렬하여 서열간 최대 상관관계를 제공한다. 이는 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열 또는 양 서열에 삽입성 "공백(gap)"을 포함할 수 있다. % 상동성은 비교되는 각 서열의 전장(이는 동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 특히 적합하다)에서, 또는 좀더 짧고 한정된 길이(국소 정렬)(이는 동등하지 않은 길이의 서열에 좀더 적합하다)에서 측정할 수 있다.

2가지이상 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지된 것이다. 가령, Wisconsin 서열 분석 패키지 9.1판에서 이용가능한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT와 GAP 프로그램은 2가지 폴리뉴클레오티드간 % 동일성 및 2가지 폴리펩티드 서열간 % 동일성과 % 상동성을 측정하는데 이용될 수 있다. BESTFIT는 Smith와 Waterman의 "국소적 상동성" 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 최대 상동성 단일 영역을 찾아낸다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램, 예를 들면 NCBI의 홈페이지(www.ncbi,nlm,nih.gov)를 통하여 입수가능한 BLAST 프로그램(Altschul S.F. et al, 1990, Altschul S.F. et al, 1997) 및 FASTA(Pearson W.R., 1990; Pearson 1988) 역시 당분야에 공지되어 있다.

본원 발명에 사용될 수 있는 SARP-1 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 핵산의 뮤테인에는 본원에 제시된 내용과 안내에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다

본원 발명에 따른 뮤테인에 적합한 변화는 "보존성" 치환이다. SARP-1 폴리 펩티드 혹은 단백질의 보존성 아미노산 치환에는 구성원간 치환에서 상기 분자의 생물학적 기능을 보존하고 유사한 물리화학적 성질을 갖는 일군의 동질성 아미노산이 참여할 수 있다(Grantham, 1974). 기능의 변화없는 아미노산의 삽입 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 이루어질 수 있는데, 특히 30개 이하, 적절하게는 10개 이하의 아미노산이 삽입 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않으면, 기능의 변화없는 아미노산의 삽입 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/삽입에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본원 발명의 목적에 포함된다.

바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.

본원 발명에 따른 SARP-1 폴리펩티드나 단백질의 뮤테인을 수득하는데 사용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체의 생산방법 예에는 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 리신이 치환된 경우는 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에 제시된 바와 같은 임의의 공지된 방법 단계가 포함된다.

"융합 단백질"은 예로써 체액에서 연장된 머무름 시간을 갖는 다른 단백질과 융합된 SARP-1 또는 이의 뮤테인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 분자의 생물 학적 활성, 예를 들면 사람 체내에서 반감기를 향상시킬 수 있는 단백질의 전체 또는 기능적 일부분에 융합된 SARP의 전체 또는 기능적 일부분을 포함하는 융합 단백질은 본원 발명에 적합하다. 적절한 구체예에서, 융합 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함한다. 면역글로불린의 전체 또는 기능적 일부분에 융합된 SARP의 전체 또는 기능적 일부분을 포함하는 융합 단백질은 본원 발명에 적합하다. 이들은 단일체 또는 다합체; 이종- 또는 동종-다합체일 수 있다. 적절하게는, 융합 단백질은 면역글로불린의 불변 영역, 특히 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. 면역글로불린이 IgG1 또는 IgG2 이소타입인 구체예 역시 본원 발명에 적합하다.

따라서, SARP-1은 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면 면역글로불린이나 이의 단편에 융합될 수 있다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 SARP-1 서열과 면역글로불린 서열간에 도입된 삼펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met) 또는 13개 아미노산 링커 서열 Glu-Phe- Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met이다.

본원에서 "기능성 유도체"에는 SARP-1의 유도체 및 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N-이나 C-말단기에 측쇄로 발생하는 작용기로부터 만들어지는 이의 뮤테인과 융합 단백질이 포함되는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말해 SARP-1의 활성과 실질적으로 유사한 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성 성질을 공여하지 않는다면 본원 발명에 포함된다. 따라서, 적절한 구체예에서 기능적 유도체는 아미노산 잔기에서 하나이상의 측쇄로 발생하는 하나 또는 복수의 작용기에 부착되는 적어도 한가지 성분을 포함한다.

본원 발명에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 측쇄가 매우 적합한 성분이다. PEG 측쇄는 항원 부위를 감추고 체액내에서 부착된 물질의 머무름을 증가시킨다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아나 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드, N-아실 성분(예, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체, 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(예, 세릴이나 트레오닐 잔기)의 O-아실 유도체 등이 포함된다.

SARP-1의 "활성 분취물" 및 이의 뮤테인과 융합 단백질에는 단독의, 또는 연관된 분자, 여기에 결합된 잔기(예, 당이나 인 잔기) 혹은 단백질 분자나 당 잔기의 자체 응집체와 결합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되는데, 상기 활성 분취물은 SARP-1과 실질적으로 유사한 활성을 갖는다.

본원 발명은 또한, 경피증을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조를 위한 핵산 분자의 용도에 관하는데, 여기서 핵산 분자는 다음에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다:

(a) 성숙 SARP-1;

(b) SEQ ID NO:2를 포함하는 폴리펩티드;

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 21 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 24 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 26 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 27 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:2의 아미노산 28 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 37 내지 295를 포함하는 폴리펩티드;

(m) (a) 내지 (l)중 한가지의 염, 동소체, 융합 단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 순환 치환된 유도체.

본원 발명에서, SARP-1은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 형태로 인체에 투여될 수도 있다. 따라서, 본원 발명은 경피증을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조를 위한 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터의 용도에 관한다. 적절하게는, 벡터는 SARP-1 코딩 서열의 전체 또는 일부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터이다. 좀더 적절한 구체예에서, 벡터는 유전자 치료 벡터이다. 유전자 치료 벡터는 당분야에 공지된 것으로, 이들 대부분은 바이러스 유래된 벡터, 예를 들면 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.

본원 발명에서, SARP-1은 SARP-1을 생산 및/또는 분비하는 세포 형태로 인체에 투여될 수도 있다. 따라서, 본원 발명은 경피증을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조를 위한 SARP-1을 발현하는 세포의 용도에 관한다. 세포는 SARP-1을 자연적으로 생산하거나 또는 재조합 SARP-1을 생산하도록 트랜스펙션된 세포일 수 있다. 상기 단백질을 높은 함량으로 발현 및 분비하는 세포, 예를 들면 SARP-1을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 다수 보유하는 과다-발현 세포가 바람직하다.

섬유아세포는 섬유증의 조직(machinery)을 대변한다는 점에서, 항-섬유증 및 경피증 치료에 가장 적합한 세포이다. 따라서, SARP-1 발현 섬유아세포가 본원 발명에 사용된다.

본원 발명은 또한, 경피증을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조를 위한 SARP-1의 전체 또는 일부분을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 보유하는 세포에 관한다. 본원 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하도록 유전자 변형된 세포 역시 본원 발명에 속한다.

정상적으로는 침묵하거나 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 않는 세포에서 SARP-1의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화시키기 위한 발현 벡터의 용도 역시 본원 발명에 의도한다. 따라서, 본원 발명에서는 원하는 단백질의 생산을 위하여 내생적 유전자 활성화(EGA)라고 하는 기술을 이용한다.

전신적 경화증은 경피증에서 가장 심각한 질환중의 한가지로, 종종 무력과 죽음을 초래한다. 따라서, 본원 발명의 다른 적절한 구체예는 전신적 경화증에 관하는데, 이는 경피증 질환의 척도이며 전술한 바와 같이 내부 장기의 병발(involvement)로 특성화된다.

여러 병용 치료가 본원 발명에 적합하다. 따라서, 본원 발명의 약물은 다음과 같은 성분을 추가로 함유한다:

ㆍ 인터페론, 특히 인터페론-β

ㆍ 종양 괴사 인자(TNF) 길항물질, 특히 TBPI 및/또는 TBPII

ㆍ 추가적인 항-경피증 작용제

ㆍ ACE 저해물질, 칼슘 채널 차단제, 양성자 펌프 저해물질, NSAID, COX-저해물질, 코르티코스테로이드, 테트라사이클린, 펜톡시필린, 부실라민, 게라닐게라닐 트랜스퍼라제 저해물질, 로테를린, 프롤릴-4-하이드록실라제 저해물질, c-프로테이나제 저해물질, 리실-옥시다제 저해물질, 렐락신, 할로푸기논, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 엔도텔린-1, 산화질소, 안지오텐신 II 저해물질, 항-산화제에서 선택되는 항-경피증 작용제.

모든 치료는 동시적, 순차적 또는 개별적 이용을 의도한다.

현재 경피증에 대한 치료법이 없긴 하지만, 경피증 증상을 치료하는데 여러 작용제 또는 치료약물이 사용되고 있다. 본원 발명에 따른 복합 요법으로 사용될 수 있는 이런 항-경피증 작용제는 Leighton(2001) 또는 Wigley와 Sule(2001)에 요약되어 있다.

인터페론은 바이러스 복제 및 세포 증식에 대한 저해 효과로 잘 알려져 있 다. 가령, 인터페론-

는 면역 및 염증 반응을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 인터페론 β(IFN-β, I형 인터페론)은 항-염증 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

본원 발명의 또 다른 구체예에서, SARP-1은 TNF 길항물질과 병용된다. TNF 길항물질은 여러 방식으로 활성을 나타낸다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 주관하는 TNF 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 TNF 분자 자체와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 TNF에 대한 항체일 수 있다.

대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합이후에 세포 표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 신호전달 경로를 저해할 수 있다(이후, "신호전달 길항물질"). TNF 길항물질은 시험관내에서 감수성 세포주, 예를 들면 TNF가 증식 및 면역글로불린 분비를 유도하는 사람 B 세포에서 고유 TNF 활성에 대한 효과에 관한 후보의 통상적 스크리닝으로 용이하게 동정되고 평가된다. 상기 분석에는 다양하게 희석된, 예를 들면 분석에 사용된 TNF 몰 함량의 0.1 내지 100배의 후보 길항물질의 TNF 제제 및 TNF가 없는 대조군 또는 길항물질 단독이 사용된다(Tucci et al., 1992).

격리 길항물질은 본원 발명에 사용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질 중에서, 높은 친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 수용체 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, 가용성 TNF-RI(p55)과 TNF-RII(p75)가 본원 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 기능성 일부분을 포함하는 이들 수용체의 절 두형은 본원 발명에 특히 바람직한 길항물질이다. 절두된 가용성 TNF I형 수용체와 II형 수용체는 EP914431에서 기술한다.

TNF 수용체의 절두형은 가용성이고 소변과 혈청에서 30 kDa 또는 40 kDa TNF 저해 결합단백질로 검출되는데, 이들은 각각 TBPI과 TBPII라고 한다(Engelmann et al., 1990). 본원 발명에서 TNF 길항물질 및/또는 인터페론과 SARP-1은 동시적, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다.

본원 발명에서, TBPI과 TBPII는 SARP-1과 병용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 수용체 분자의 유도체, 단편, 일부분, 생물학적 활성 단편은 본원 발명에 사용될 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체 분자의 이런 생물학적 활성 등가물이나 유도체는 폴리펩티드의 일부분 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열의 일부분을 의미하는데, 이들은 막-결합된 TNF 수용체와의 상호작용을 저해 또는 차단하는 정도의 친화력으로 TNF와 결합할 수 있다.

다른 적절한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI(TBPI)는 본원 발명에 사용되는 TNF 길항물질이다. 고유와 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 EP308 378; EP 398 327; EP 433 900에서 기술한다.

질병의 초기 단계에서는 TNF-α를 차단하는 것이 바람직하긴 하지만, 후기 단계에서는 TNF 자체가 경피증에 유익한 효과를 발휘할 수 있는 것으로 보고되었다(Abraham et al., 2000). 따라서, 본원 발명은 경피증, 특히 진전된 단계의 질환을 치료 또는 예방하기 위한 SARP-1과 TNF-α의 혼합물에 관한다.

COX 저해물질은 당분야에 공지되어 있다. 특이적인 COX-2 저해물질은 WO 01/00229에서 기술한다.

본원 발명은 경피증, 특히 전신적 경화증을 치료 또는 예방하기 위한 SARP-1 및 선택적으로 한가지이상의 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 제약학적 조성물에 관한다. 제약학적 조성물은 전술한 성분중 한가지, 특히 인터페론, TBP 또는 COX 저해물질을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본원 발명에 따른 제약학적 조성물은 본원 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 SARP-1을 발현하는 세포를 함유할 수 있다.

치료약물의 활성 성분, 다시 말하면 본원 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산, 세포 또는 이들의 조합 및 전술한 물질의 혼합물은 다양한 방식으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 루트에는 피내, 경피(예, 서방 제제), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 국소, 비강내 루트가 포함된다. 치료요법적으로 효율적인 다른 투여 루트, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하도록 하는 유전자 요법을 이용할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반체와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여될 수 있다.

"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 나타내지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 부형제에 녹인 주사용 단위 약형 형태로 만들 수 있다.

장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 부형제(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.

본원 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 인체에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 PCT 특허 출원 WO 92/13095에서 밝힌 바와 같이 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다.

활성 단백질의 치료요법적 효과량은 수용체 유형, 수용체에 대한 본원 발명에 따른 물질의 친화성, 상기 물질에 의한 임의의 잔류 세포독성, 투여 루트, 환자의 임상적 상태를 비롯한 다양한 변수의 함수이다.

"치료요법적 효과량"은 투여된 본원 발명에 따른 물질이 SARP-1 수용체를 활성화시키거나, 또는 생체내에서 이런 수용체를 자극하는 리간드를 불활화시키는 함량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 SARP-1 약동학, 투여 루트, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 신장), 증상의 정도, 병용 치료법, 치료 빈도, 원하는 효과를 비롯한 다양한 인자에 좌우된다. 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.

본원 발명에 따른 폴리펩티드의 용량은 대략 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 대략 0.01 내지 10 ㎎/체중㎏, 좀더 바람직하게는 대략 0.1 내지 5 ㎎/체중㎏, 가장 바람직하게는 대략 1 내지 3 ㎎/체중㎏ 함량으로 사용되긴 하지만, 전술 한 바와 같이 치료요법적으로 자유롭게 선택될 수 있다.

일반적으로, 일일 복용량은 원하는 결과를 달성하는데 효과적인 분할 분량으로 또는 지속 방출 형태로 제공된다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기 분량이나 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 용량으로 실시될 수 있다.

또한, 본원 발명은 경피증, 특히 전신적 경화증을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 본원 발명에 따른 폴리펩티드의 효과량 및 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체를 환자에 투여하는 단계로 구성된다. 대안으로 또는 부가적으로, 본원 발명의 SARP-1을 생산하는 세포 또는 선택적으로 발현 벡터에 포함된 본원 발명의 핵산 분자를 본원 발명에 따라 투여할 수 있다.

발현 벡터는 전신으로 투여될 수 있다. 적절하게는, 발현 벡터는 근육내 주사로 투여된다. 다른 적합한 투여 루트는 특히 폐 섬유증이 병발하는 경우에 흡입이다.

또한, 본원 발명은 SAPR-1의 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 혼합하여 제약학적 조성물을 제조하는 방법 및 SARP-1의 저해 효과량을 개체에 투여하여 관절염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한다.

저널 기사, 초록, 공개되거나 공개되지 않은 미국이나 외국의 특허 출원, 허여된 미국이나 외국의 특허, 또는 임의의 다른 참고문헌을 비롯한 본원에 언급된 모든 참고문헌은 순전히 참조로 한다. 이에 더하여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체 내용은 순전히 참조로 한다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적 방법에 대한 언급은 본원 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 해당 분야에 개시, 설시 또는 암시되었음을 인정하는 것이 아니다.

특정 구체예의 전술한 내용은 본원의 일반적 특성을 설명한 것으로, 당업자는 과도한 실험없이 본원 발명의 포괄적 개념을 벗어나지 않는 범위에서 당분야의 통상적인 기술을 이용하여 이런 특정 구체예를 다양하게 개조 및/또는 변화시킬 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용과 안내에 기초하여, 개시된 구체예의 등가물 범위에 포함된다. 본원에 이용된 전문 용어는 설명을 목적으로 하며, 본원에 제시된 내용과 안내에 비추어 당분야에 통상적인 지식을 가진 자가 용이하게 이해할 수 있다.

본원 발명은 다음의 실시예를 참고하면 좀더 용이하게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 단지 설명하는 것으로 본원 발명의 범위를 한정하지 않는다.

실시예 1: SARP-1은 경피증 환자로부터 얻은 피부 섬유아세포에서 차별적으로 발현된다.

방법

환자 시료

2개의 mm3 펀치 생검은 확산된 피부 전신적 경화증(SSc)을 보이는 9명의 성별과 연령 대합된 환자의 손상된 피부 또는 손상되지 않은 피부(주로 팔뚝 피부)로부터 얻었다. 모든 환자는 전신적 경화증의 진단을 위한 미국 류머티스 학회(American College of Rheumatology)의 기준을 충족시켰다.

섬유아세포 배양

섬유아세포는 이전에 기술된 바와 같이 시험관내 배양으로 상기 생검으로부터 얻었다(Abraham et al., 1991). 간단히 말하면, 생검은 조각으로 절단하고 무균 플라스틱 접시 또는 플라스크에 위시시킨다. 실온에서 15분간 건조시킨 이후, 생검 조각은 조직 배양 플라스틱에 부착시키고, 이후 10% 우태아혈청(FCS), 2 mM L-글루타민, 1 mM 소디움 피루베이트, 100 단위/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신, 2.5 ㎍/㎖ 암포테리신 B를 함유하는 둘베코 변형된 이이글 배지(DMEM)로 구성되는 섬유아세포 성장 배지(FGM)에 배양한다. 5% CO₂의 습한 대기하에 2-3주동안 배양한 이후, 섬유아세포 파생물은 간단한 트립신 처리로 떼어내고 젠타마이신과 암포테리신 B가 없는 FGM에 재배양한다. 실험동안, 2회 내지 5회 계대배양된 섬유아세포가 사용된다. 섬유아세포 표현형은 단층과 3차원 콜라겐 겔 배양액에서 전형적 형태로 확인된다.

RNA 분리

전체 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라, Trizol(Life Technologies)을 이용하여 초기 계대배양에서 합류된 경피증 섬유아세포, 또는 정상적인 사람 피부(포피) 섬유아세포(Promocell)의 일차 배양액으로부터 분리한다. 최종 RNA 펠렛은 1 ㎍/㎕ 농도로 무균 DEPC 처리된 물에 재부유시키고 -80℃에 저장한다.

cDNA 프로브 합성

2 ㎍ 전체 RNA는 1.3 ㎍ 사이토킨 특이적 프라이머(R&D systems cat. no. GAC11)와 혼합하고 70℃에서 2분동안 0.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 배양한다. 이후, 상기 튜브는 2분동안 50℃로 냉각시키고, 그 다음 2 ㎕ 5X 반응 완충액(250 mM Tris-HCl pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 1 ㎕ 10X dNTP 혼합물(5 mM dGTP, 5 mM dCTP, 5 mM dTTP), 3.5 ㎕ α32P-dATP(3000Ci/mmol, Amersham cat. no. PB10204), 0.5 ㎕ DTT(100 mM), 1 ㎕ Superscript II(Life Technologies)를 함유하는 반응 혼합물을 첨가한다. 반응 혼합물은 피펫팅으로 짧게 혼합하고 50℃에서 25분동안 배양한다. 반응은 1 ㎎/㎖ 글리코겐을 함유하는 1 ㎕의 0.1M EDTA pH 8.0을 첨가하여 중단시킨다. 이후, 표지된 cDNA는 제조업자의 지시에 따라, Chromaspin-200 DEPC-H20 칼럼Clontech)을 이용하여 통합되지 않은 디옥시뉴클레오티드로부터 정제한다. cDNA-함유 분취물은 Czerenkov 계수(counting)로 동정한다. 최대 분취물(일반적으로, 수거된 6개중에서 분취물 2)은 1 mM EDTA를 함유하는 0.1 용적의 1M NaOH로 70℃에서 20분동안 처리하여 RNA를 가수분해시키고, 이후 2.5 ㎍ 사람 Cot-1 DNA(Life Technologies)를 함유하는 동등 용적의 1M NaH₂PO₄로 70℃에서 20분동안 중화시킨다. 그 다음, 열 처리된 중화 cDNA 프로브는 혼성화 혼합물에 직접 첨가한다.

유전자 필터 마이크로어레이에 혼성화

유전자 필터 마이크로어레이(사람 사이토킨 발현 어레이, R&D Systems cat no. GA001)는 Hybaid 혼성화 오븐(MWG Biotech)에서, 롤러 병에 0.5 ㎍/㎖ 연어 혈 청 DNA(Life technologies)을 함유하는 5 ㎖ Express Hybridization 용액(Clontech)에 60℃에서 2시간동안 선-혼성화시킨다. 이후, 선-혼성화 용액은 0.25 내지 1x10⁶ cpm/㎖의 특이적 활성도로 cDNA 프로브 제형을 함유하는 새로운 혼성화 용액으로 교체한다. 혼성화는 68℃에서 16-20시간동안 실시한다. 혼성화이후, 필터는 68℃에서 20분/wash 동안 2X SSC/1% SDS로 4회, 15분/wash 동안 0.1X SSC/0.5% SDS로 2회 세척한다. 그 다음, 필터는 Saran wrap^TM에 밀봉하고 실온에서 다양한 시간(4시간 내지 4일)동안 K-형 저장 인 영상 스크린(Biorad)에 노출시킨다.

영상 분석

영상 스크린은 Biorad Personal FX 인 영사기를 이용하여 50 ㎛ 해상도로 스캔하였다. 결과의 16 비트 디지털 파일은 TIF 포맷으로 전환시키고, 영상은 Arrayvision 소프트웨어(Imaging Research Inc.)로 분석한다. 각 시료에서, 필터에 중복으로 스팟된 384개 유전자의 픽셀 강도를 측정한다. 배경 신호를 감하여, 어레이에서 각 스팟 쌍에 대한 평균 픽셀 강도를 얻는다(=발현 수준).

선별된 유전자에서 마이크로어레이 결과의 RT-PCR에 의한 확인

각 환자 시료로부터 얻은 1 ㎍ 전체 RNA는 5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-Hcl, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 각 1 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.5 단위 재조합 RNasin 리보뉴클레아제 저해물질(Promega), 15 단위 AMV 역전사효소(Promega)를 함유하는 20 ㎕ 반응 용적에서 올리고 dT 프라이머(Promega)를 이용하여 역전사시킨 다. 반응 혼합물은 42℃에서 60분동안 배양하고 95℃에서 5분동안 가열하며, 이후 무균수로 200 ㎕로 희석한다. 희석된 역전사효소 반응물은 유전자 필터 제조업자에 의해 제공된 데이터베이스 접근 번호에 기초한 Primer Express 소프트웨어(PE Applied Biosystems)를 이용하여 각 유전자에 맞춤된 특이적 프라이머 쌍으로 Taqman(PE Applied Biosystems 7700)에서 실시간 PCR 분석을 실시한다. 결과는 각 시료에서 하이스키핑 유전자 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH)의 발현에 표준화시키고, 상응하는 정상 환자 시료로 비정상 환자 시료의 발현 값을 나눔으로써 측정된 폴드(fold) 변화로 표시한다.

경피증과 연관된 유전자를 예측하는 통계적 방법

경피증과 연관된 유전자를 예측하는 통계적 방법은 Golub et al., 1999에서 상세히 기술된 근접 분석(neighbor analysis)과 클래스 프레딕터(class predictor)로 실행한다.

결과

유전자 필터 마이크로어레이 분석은 7명의 경피증 환자로부터 얻은 정상과 비정상 섬유아세포 시료에서 실시하였다. 각 환자 시료에 대한 SARP-1 cDNA의 평균(mean) 발현 수준은 도 1A에, 중점(median) 발현은 도 1B에 도시한다. 평균값과 중점값은 정상과 비정상 세포간에 현저하게 상이하고, SARP-1의 정상 발현 수준이 비정상 발현 수준보다 훨씬 높다. 중점은 군내에서 현저하게 상이한 개체의 효과를 최소화시킨다는 점에서, 환자 시료를 처리하는데 통상적으로 사용된다. 여기서, 비정상 섬유아세포는 7명의 검사 환자중 5명에서 정상 섬유아세포와 비교하여 현저히 낮은 수준으로 SARP-1 mRNA를 발현하였다.

마이크로어레이에서 얻은 결과는 SARP-1 특이적 PCR 프라이머를 이용한 환자 시료의 실시간 PCR 분석에 의해 더욱 뒷받침된다. 8명의 검사 개체중 6명에서, 병든 섬유아세포에서 SARP-1이 동일한 환자로부터 얻은 정상 섬유아세포와 비교하여 2배이상 하향조절되었다. 나머지 2명에서, 발현 수준은 정상과 비정상 섬유아세포에서 유사하였다.

동일 환자에서 얻은 정상과 비정상 섬유아세포간에 관찰되는 발현의 차이는 두 개체군간 배양 조건의 차이에 기인하지 않는데, 그 이유는 정상적인 사람 피부 섬유아세포의 일차 배양액에서 SARP-1 mRNA 발현이 세포의 계대배양이후에도 현저하게 변하지 않기 때문이다. 또한, 경피증 환자에서 얻은 비정상 피부의 전체 생검 시료로부터 분리된 전체 RNA의 실시간 RT-PCR 분석에서는 임상적으로 정상적인 연령, 성별, 해부학적 위치 대합된 대조군 생검과 비교하여 좀더 낮은 수준의 SARP-1 mRNA를 보였다.

이에 더하여, SARP-1의 하향조절은 통계학적 방법을 이용한 경피증의 진행과 연관할 가능성이 95%인 것으로 밝혀졌다.

결론

전술한 결과는 건강한 조직과 비교하여 경피증 환자로부터 유래된 병든 조직에서 SARP-1이 부족하다는 것을 보여주는데, 이는 SARP-1의 정상 수준으로의 회복이 이런 질환의 치료에 도움이 될 수 있다는 것을 암시한다. 따라서, SARP-1은 경피증의 적어도 한가지이상 증상의 부분적인 혹은 완전한 저해, 또는 병 진행의 저 해를 달성하는 신규한 약물을 제공할 수 있다.

실시예 2: 사람 SARP-1의 서열을 코딩하는 전체 cDNA의 클로닝

재료와 방법

서열 BLAST 조사는 사람 dbEST(공개된 EST 데이터베이스)에서 SARP-1의 부분 코딩 서열(EMBL 접근 번호: AF017986)로 시작하고, 유관한 EST는 http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Science/index.html에서 ENTREZ로 검색한다. 이후, 다음의 EST와 AF017986 서열을 조합하여 SARP-1의 공통 전체 코딩 서열을 만들었다: AW580647, AW608301, AA976403, W92531.

그 다음, SARP-1의 전장 cDNA 코딩 서열은 0.3 mM dNTP, 1 mM MgSO₄, 5 ㎕ 정상적인 사람 피부(포피) 섬유아세포 cDNA 주형(전술한 바와 같이 만듦), 5 ㎕ 10X Pfx 증폭 완충액(Life Technologies), 1 ㎕ Platinum Pfx DNA 중합효소(Life Technologies)를 함유하는 50 ㎕ 반응 혼합물에서 각 50 pmole의 전술한 공통 서열에 기초하여 다음의 프라이머: SARP-1F 5' GCC AAG CTT CCC ACG ATG CTG CAG GGC CCT(SEQ ID NO: 3)와 SARP-1R 5' GCG CTC GAG CTA GCA CTG CAG CTT GCG GAT(SEQ ID NO: 4)를 이용한 역전사효소 PCR로 클론한다. 반응 혼합물은 94℃에서 2분동안 가열하고, 이후 다음과 같이 PCR을 35회 실시한다: 94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분. 증폭 산물은 1X TAE 완충액(Life Technologies)에서 1% 아가로즈 겔에 분석하고, 예상 분자량(906 bp)으로 이동하는 PCR 산물은 Wizard PCR 정제 키트(Promega)를 이용하여 겔로부터 정제한다.

100 ng 겔-정제된 DNA는 제조업자의 조건에 따라 제한 효소 HindIII과 Xhol(Pharmacia)로 절단하고 전술한 바와 같이 재-정제하며 표준 분자생물학 기술에 따라 T4 DNA 리가아제(New England Biolabs)를 이용하여 HindIII/Xhol 절단된 플라스미드 pcDNA3.1(+)(Invitrogen)에 결찰시킨다. 결찰 산물은 Biorad Gene Pulser를 이용한 에렉트로포레이션으로 대장균(E. coli) 균주 TOP 10 F'(Invitrogen)로 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA는 결과의 콜로니로부터 성장된 5 ㎖ 배양액으로부터 분리하고 T7과 pcDNA3.1AS 프라이머(Invitrogen)로 Applied Biosystems 3700 서열분석기에서 자동서열분석하여 SARP-1의 서열을 확인한다.

결과

시험관내와 생체내에서 SARP-1 활성을 특성화하기 위하여, 전체 사람 cDNA 코딩 서열을 클론하였다. 사람 SARP-1(EMBL 접근 번호 AF017986)의 부분 cDNA 서열을 이용하여, dbEST 공개 데이터베이스에서 중복 EST를 BLAST 프로그램으로 동정하였다. 전체 cDNA 코딩 서열은 다음과 같은 서열로부터 조합되었다: AF017986 AW580647, AW608301, AA976403, W92531. SARP-1의 전장 DNA 서열과 추정 아미노산 서열은 도 5 A와 B에 도시한다. SARP-1의 cDNA 코딩 서열은 예상 개시 코돈과 종결 코돈의 측면에 위치하는 프라이머를 이용한 역전사효소 PCR로 클론하였다. 생성된 SARP-1 cDNA 클론의 서열 분석에서는 뉴클레오티드 수준에서 생쥐 SARP-1의 공개 서열(Melkonyan et al., 1997)과 93% 동일성, 아미노산 서열에서 생쥐 서열과 95% 동일성을 보였다. SARP-1의 정렬된 사람과 생쥐 아미노산 서열은 도 6에 도시한다. SIGNALASE(Von Heijne, 1986) 또는 SIGNALP 프로그램으로 예측된 단백질 서 열은 각각 20개 또는 24개 아미노산의 예상 신호 펩티드를 갖는 295개 아미노산이다(도 5A에 화살표로 표시). 사람과 생쥐 서열간 아미노산 차이는 도 6에서 명확하고, N-말단 신호 펩티드(4개의 아미노산)와 성숙 단백질 서열(2개의 아미노산)에 존재한다.

첨부된 서열 리스트의 SEQ ID NO: 1은 사람 SARP-1 cDNA의 코딩 가닥을 포함하고, SEQ ID NO: 2는 사람 SARP-1의 아미노산 서열을 포함한다. 뮤린 아미노산 서열은 첨부된 서열 리스트의 SEQ ID NO: 5에서 설명한다.

실시예 3: 사람 SARP-1의 N-말단 서열

예상 SARP-1 신호 펩티드는 20개 또는 24개 아미노산 길이를 갖는다(도 5A 참조). 성숙 SARP-1의 정확한 N-말단을 검증하기 위하여, 6개의 잔기 히스티딘 태그를 포함하는 재조합 SARP-1은 HEK-293 세포에서 발현시키고 니켈-킬레이트 칼럼에서 정제한다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE에서 32 kDa 밴드로 이동하는데, 이는 MS로 측정된 질량, 34313 Da와 일치한다.

정제된 재조합 단백질의 N-말단 서열은 Maundrell 등(1997)에 따라 모델 148C 온-라인 페닐티오히단토인 아미노산 분석기가 구비된 Applied Biosystems 모델 494 펄스된 액체상 단백질 서열분석기로 얻는다. 간단히 말하면, 정제된 SARP-1은 1M 요소, 20 mM 메틸아민, 1 mM 디티오트레이톨, 5 ㎍ 트립신(Boehringer Mannheim, 서열분석가능 등급)을 함유하는 90 ㎕의 100 mM Tris-HCl pH 8.5에서 37℃ 하룻밤 배양으로 절단한다. 펩티드는 Brownlee C18 칼럼(220 X 2.1 mm)에서 역상 HPLC(Hewlett Packard HP1090)로 분리한다. 펩티드는 0.1% 트리플루오르아세트 산에서 60분동안 0 내지 55%, 이후 5분동안 55-70% 아세토니트릴 농도구배로 용출한다. 용출 분취물은 수거하고, 신틸레이션 분광법으로 동정된 방사성 ³³P-표지된 포스포펩티드는 모델 148C 온-라인 페닐티오히단토인 아미노산 분석기가 구비된 Applied Biosystems 모델 494 펄스된 액체상 단백질 서열분석기를 이용한 에드먼 분해법(Edman degradation)으로 서열분석한다.

서열 GLFLFGQPDFSYK는 환원되고 알킬화된 단백질의 트립틱(tryptic) 절단체에서 탄뎀 질량 분광법으로 얻는다. 분석은 Cavalli 등(2001)이 밝힌 바와 같이 Nano-Spray 이온 소스가 갖춰진 Q-TOF 질량 분광기(Micromass UK Limited, Manchester, UK)에서 실시한다. 간단히 말하면, 1 ㎍의 정제된 단백질은 10% SDS-PAGE에 분해시킨다. 단백질 밴드는 은-염색된 겔로부터 절제하고 트립신으로 겔내에서 절단한다(Shevchenko et al., 1996). 추출된 펩티드 혼합물은 Nano-Spray 이온 소스가 갖춰진 Q-TOF 질량 분광기(Micromass, Manchester, UK)를 이용한 탄뎀 질량 분광 서열분석(Wilm et al., 1996)으로 분석한다.

결과

미성숙 SARP-1의 이론적 N-말단 서열은 다음과 같다:

1 10 20 30 40 ...

MLQGPGSLLL LFLASHCCLG SARGLFLFGQ PDFSYKRSNC KPIPANLQLC ...

2번째 예상 신호 전달 부위의 위치는 잔기 24와 25(G와 L) 사이이다.

서열분석 실험동안, SARP-1 N-말단의 상당한 이질성이 확인되었다.

한 구체예에서, 2개의 주요 서열이 확인되었는데, 한 서열은 FGQPD, 즉 SEQ ID NO: 2의 아미노산 28에서 시작하고, 다른 서열은 LFGQPD, 즉 SEQ ID NO: 2의 아미노산 27에서 시작하였다.

하지만, 이들 이외에 별도의 정제된 배치에서 4개의 서열이 확인되었다:

LFLFGQPDFS (아미노산 25에서 시작)

FLFGQPDFS (아미노산 26에서 시작)

LFGQPD (아미노산 27에서 시작)

FGQPD (아미노산 28에서 시작)

아미노산 37에서 시작하는 다른 서열이 또한 존재한다: RSNCKPIPAN. 이 서열은 리신 잔기이후의 절단(트립틱 유사 절단)에 기인한다.

이에 더하여, 다른 실험에서 24번 위치에서 시작하는 서열이 확인되었다:

GLFLFGQPDFSYK.

따라서, N-말단은 매우 이질성인 것으로 보이는데, 이는 SARP-1에 내재된 엔도펩티다제 또는 프로테아제에 기인할 수도 있다. 성숙 SARP-1은 차별적인 N-말단을 보유하는 여러 상이한 변이체로부터 만들어 질 수 있다.

실시예 4: SARP-1의 트랜스펙션은 시험관내에서 아폽토시스를 유도한다.

방법

섬유아세포 세포주(생쥐 NIH 세포와 사람 AG1518 세포)와 일차 섬유아세포 배양액(정상적인 사람 피부 섬유아세포 1-5회 계대배양)(Promocell)은 제조업자의 권고에 따라 Geneporter 2(Gene Therapy Systems, San Diego) 또는 Fugene 6(Life Technologies) 트랜스펙션 시약을 이용하여, SARP-1 cDNA 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 pcDNA3.1 또는 pcDNA3.1 단독으로 트랜스펙션시킨다. 아폽토시스는 TiterTace 96 웰 아폽토시스 분석 키트(R&D Systems)를 이용하여 트랜스펙션 24시간후에 측정하고, 세포는 제조업자의 지시에 따라 CyQuant 염료(Molecular Probes)를 이용하여 계산한다.

결과

섬유아세포에 대한 SARP-1의 효과를 평가하기 위하여, 섬유아세포 세포주는 SARP-1 cDNA로 트랜스펙션시키고, 아폽토시스 정도를 평가하였다. 결과는 도 7에 도시한다. SARP-1 트랜스펙션된 세포에서 아폽토시스는 의사 트랜스펙션된(pcDNA3.1) 세포와 비교하여 현저하게 감소하였는데(P=0.0009), 이는 사람 SARP-1이 뮤린 상동체에서 보고된 것과 유사한 활성을 보유한다는 것을 암시한다. 기저 수준의 아폽토시스는 트랜스펙션되지 않은 세포에서 측정되었다. 뉴클레아제 처리된 NIH 3T3 세포는 파지티브 대조군 역할을 하였다. "표지되지 않은" 칼럼은 배경 염색 수준을 보이고, 뉴클레아제 처리("뉴클레아제 처리된")는 파지티브 대조군 역할을 하였다.

실시예 5: TGFβ1 생산에 대한 SARP-1의 효과

TGFβ1은 경피증에서 상향조절되고 경피증의 발병과 연관하는 친-섬유성 사이토킨이다(Kawakami et al., 1998). SARP-1이 섬유아세포에 의한 TGFβ1 생산이나 분비를 하향조절 또는 저해하는 지를 평가하기 위하여, SARP-1은 정제된 단백질 형태의 섬유아세포 배양액에 첨가할 수 있다. 대안으로, SARP-1 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 상기 세포에 트랜스펙션시켜 세포 배양액에서 충분한 함량의 SARP-1을 달성할 수 있다. 다른 가능성은 SARP-1 발현 세포로부터 얻은 배지를 섬유아세포 배양액에 첨가하는 것인데, 상기 배지를 농축하면 충분한 함량의 SARP-1을 얻을 수 있다. 건강하거나 병든 개체, 또는 경피증 환자 피부의 정상 부분이나 병든 부분으로부터 유래된 섬유아세포 세포주 또는 일차 섬유아세포가 본 실험에 사용될 수 있다.

TGFβ1의 함량은 TGFβ1을 위한 Quantikine ELISA 시스템(R&D Systems cat. no. DB100)을 이용하여, 배양된 세포로부터 얻은 조건 배지에서 ELISA로 측정할 수 있다.

실시예 6: 시험관내 사람 섬유아세포에서 MMP-1 활성에 대한 SARP-1 투여의 효과

방법

3'말단에 6XHis 태그에 대한 코딩 서열을 포함하는 사람 SARP-1의 cDNA는 바쿨로바이러스 전달 벡터 pDEST Fastbec에 서브클론한다. C-말단 6XHis 태그된 SARP-1은 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 Sf5 곤충 세포에서 생산하고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제한다.

경피증 환자, 또는 정상 개체의 손상되거나 손상되지 않은 피부로부터 유래되고 적은 회수(2-5)로 계대배양된 사람 섬유아세포는 24시간동안 0, 100 또는 1000 ng/㎖ 재조합 SARP-1로 처리한다. 조건 배지는 수거하고, 세포 파편은 4℃에서 10분동안 1200 rpm으로 원심분리하여 제거한다. MMP-1 활성은 제조업자의 프로 토콜에 따라 MMP-1 플루오로킨(fluorokine) 키트(R&D Systems)를 이용하여 희석되지 않은 배양 배지에서 측정한다. MMP-9 활성 역시 동일 시료에서 측정한다.

결과

MMP-1은 I형 콜라겐의 분해를 주관하는데, 이는 MMP-1 활성의 감소가 과도한 콜라겐 침착이 발생하는 경피증에서 근본적 결함중 한가지의 원인이 된다는 것을 암시한다.

경피증 환자로부터 얻은 피부 섬유아세포는 동일 환자로부터 분리된 손상되지 않은 피부 섬유아세포와 비교하여 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 MMP-1의 발현이 감소하였다. 검출가능한 전체 활성 MMP-1이 환자마다 현저하게 상이하긴 하지만, SARP-1 처리된 섬유아세포는 경피증 환자로부터 유래된 비정상 섬유아세포(도 8A, D, F) 및 경피증 환자의 손상되지 않은 건강한 피부로부터 유래된 섬유아세포(도 8B, C)에서 처리되지 않은 섬유아세포보다 높은 MMP-1 활성을 보였다. 도시된 결과는 3회 측정의 평균이다. MMP-1과는 대조적으로, MMP-9 활성에 대한 SARP-1의 효과는 관찰되지 않았다.

실시예 7: SARP-1 cDNA의 트랜스펙션은 NIH3T3 섬유아세포에서 1α2형 콜라겐 프로모터의 활성을 감소시킨다.

재료와 방법

2 mM 글루타민, 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 10% FCS를 함유하는 DMEM에 유지된 NIH3T3 세포는 백색 벽으로 둘러싸인 투명 바닥 조직 배양 등급의 96 웰 평판(Wallac)에 50% 합류수준으로 도말한다. 다음 날, 세포는 제조업자의 지시에 따라 Geneporter 트랜스펙션 시약을 이용하여 pcDNA3.1 SARP-1 및 3.5 kb 콜라겐 프로모터와 루시페라제 리포터 유전자(Dr. David Abraham, Royal Free Hospital)를 포함하는 pGL3 벡터(Promega)로 공동-트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 30시간후 TGFβ(R&D Systems, 5 ng/㎖)를 첨가한다. 루시페라제 활성은 24-36시간후 Bright-Gio 분석 시스템(Promega)으로 각 웰에 직접 측정한다.

결과

SARP-1의 발현과 콜라겐 합성간 상관관계의 존재를 확인하기 위하여, Col1α2 프로모터-루시페라제 리포터 구조체로 공동-트랜스펙션된 NIH3T3 섬유아세포에서 콜라겐 프로모터 활성에 대한 SARP-1 cDNA의 트랜스펙션 효과를 검사하였다.

콜라겐 프로모터를 포함하는 SARP-1 cDNA-루시페라제 리포터 플라스미드의 공동-트랜스펙션은 SARP-1이 기저 콜라겐 프로모터 활성뿐만 아니라 콜라겐 프로모터 활성의 TGFβ유도된 증가를 억제할 수 있다는 것을 암시하였다. 이들 결과는 SARP-1 유전자 산물이 직접적으로 또는 SARP-1 매개된 신호전달 현상을 통하여 간접적으로, 시험관내 콜라겐 프로모터 활성의 조절에 관여하다는 것을 암시한다.

섬유아세포에서 콜라겐 침착, 합성 및/또는 분비에 대한 SARP-1의 효과를 검사하는 다른 방법은 정제된 SARP-1을 섬유아세포 배양액에 첨가하는 것이다. 대안으로, SARP-1 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 섬유아세포에 트랜스펙션시켜 세포 배양액에서 충분한 농도의 SARP-1을 달성할 수 있다.

다른 가능성은 SARP-1 발현 세포로부터 얻은 배지를 섬유아세포 배양액에 첨 가하는 것인데, 상기 배지를 농축하면 충분한 농도의 SARP-1을 얻을 수 있다. 건강하거나 병든 개체, 또는 경피증 환자 피부의 정상 부분이나 병든 부분으로부터 유래된 섬유아세포 세포주 또는 일차 섬유아세포가 본 실험에 사용될 수 있다.

콜라겐 합성은 Shi-wen 등(1997)이 밝힌 포획 ELISA 시스템(Southern Biotechnology Associates Inc.)으로, 배양된 사람 섬유아세포에서 시험관내 측정할 수 있다.

실시예 8: SARP-1을 과다발현하는 또는 재조합 사람 SARP-1로 처리된 사람 피부 섬유아세포는 경피증의 병인과 연관된 유전자의 변화된 mRNA 발현을 보인다.

재료와 방법

정상적인 사람 피부(포피) 섬유아세포는 섬유아세포 배양 배지(Promocell)에 유지시킨다. 섬유아세포는 사람 TGFβ1의 존부하에 재조합 사람 SARP-1(100 ng/㎖)로 4시간 또는 24시간동안 처리한다. 처리이후 세포는 수거하고, 전체 RNA는 제조업자의 지시에 따라 Trizol^TM시약(Life Technologies)으로 분리한다. ³²P-dATP 표지된 cDNA 프로브는 전술한 바와 같이 상기 RNA로부터 준비하고 R&D Systems 사람 사이토킨 유전자 필터 어레이에 혼성화시키며 전술한 바와 같이 처리한다.

결과

SARP-1은 초기에 아폽토시스 관련된 단백질로 보고되었지만, 이의 정확한 기능은 확인되지 않고 있다. 경피증에서 SARP-1의 역할을 통찰하기 위하여, 경피증 표현형을 모방하는 TGFβ선처리된 사람 피부 섬유아세포에서 섬유아세포 유전자 발 현에 대한 SARP-1 처리의 효과를 측정하였다.

표 IV는 경피증 표현형을 모방하는데 사용되는 TGFα로 4시간동안 자극한 이후에, mRNA가 재조합 SARP-1로 섬유아세포 처리에 영향을 받는다는 것을 보여준다. 세포는 SARP-1로 24시간동안 처리한다. 이들 조건하에, TGFα와 FGF5는 하향 조절되었다. TGFβ1 결합 단백질인 엔도글린의 감소된 발현 및 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성화와 연관된 프로테아제인 푸린(furin)의 증가된 발현이 관찰되었다. 하향 조절되는 다른 mRNA는 TARC이었다. 상기 케모킨은 염증 부위에 피부 귀소(homing) T 세포의 동원과 연관한다. 따라서, SARP-1 투여는 항-염증성 효과를 나타낼 가능성이 있다. TNFR1 아단위 mRNA의 상향조절이 또한 관찰되었다. 이런 관찰의 중요성은 분명하지 않은데, 그 이유는 TNF가 경피증에서 병원 역할 또는 보호 역할을 하는 지와 관련하여 과학 문헌에서 많은 불일치가 존재하기 때문이다.

별도의 실험에서, 경피증 환자로부터 유래된 섬유아세포에서 유전자의 조절은 건강한 대조군 섬유아세포와 비교 분석하였다. 흥미롭게도, 표 IV에 표시된 조절된 유전자는 경피증 시료에서 조절되는 것으로 밝혀졌다. 경피증 섬유아세포에서 상향 조절되는 것으로 밝혀진 유전자는 상기 모델에서 SARP-1 발현이후 하향-조절되었고, 하향-조절되는 것으로 밝혀진 유전자는 상기 모델에서 SARP-1 발현이후 상향-조절되었는데, 이는 SARP-1이 경피증의 치료에 유익한 효과를 나타낸다는 것을 암시한다.

비율^*	처리된 TGFβ	TGFβ+ 처리된 SARP-1	유전자
-1.6	1346	830	FGF-5
-2.7	788	297	엔도글린
3.3	157	515	TNFRI
3.3	128	428	푸린
-4.6	275	60	TGFα
-4.7	164	34	TARC

^* 비율 SARP-1/의사(mock)는 TGFα+ 처리된 SARP-1/TGFα단독의 비율을 나타낸다. 도시된 결과는 2번의 독립된 실험에 기초한다.

실시예 9: 뮤린 질환 모델에서 시험관내 SARP-1 효과의 평가

블레오마이신-유도된 폐 손상은 경피증의 용인된 모델이다. 상기 질환은 블레오마이신의 기관내 투여에 의해 유도된다(Hattori et al., 2000). 처리된 생쥐는 폐에 염증 반응(7일쯤 최대 반응)이 발생하고, 뒤이어 유도이후 14일쯤에 피크에 도달하는 섬유증이 발생한다. 이런 모델은 폐 섬유증의 발병에 대한 시험관내 SARP-1 투여의 효과를 평가하는데 이용된다.

세포-전달 시스템(전장 SARP-1 cDNA로 트랜스펙션된 NIH3T3 세포)은 생체내에서 SARP-1을 발생시키는데 사용된다.

방법

동물 처리

폐 섬유증은 1일에 식염수에 녹인 블레오마이신의 기관내 투여로 생쥐(20-25 g)에 유도한다. 생쥐는 10마리씩 구성되는 4개의 군으로 구분한다. 첫 번째 군은 SARP-1/pcDNA3.1로 트랜스펙션된 10⁶ NIH3T3 세포의 i.p. 주사를 투여한다. 두 번째 군은 10⁶ 의사 트랜스펙션된(pcDNA3.1 벡터) NIH3T3 세포를 투여한다. 세 번째 군은 250 ㎍ 항-TGFβ항체(Anti Pan TGFβ: Sigma cat. no. T9429)를 투여하고, 네 번째 군은 식염수를 투여한다. 모든 생쥐는 14일에 죽이고, 폐는 포르말린 고정시키고 조직 연구를 위해 파라핀 포매한다. 폐 절편은 콜라겐에 대하여 삼-크롬 또는 피크로 시리우스 레드(picro sirius red)로 염색하고(Bancroft J.D. and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques), 섬유증/폐의 정도를 기록한다.

NIH3T3 세포의 트랜스펙션

NIH3T3 세포는 전술한 바와 같이 Geneporter 2 시약을 이용하여 SARP-1/pcDNA3.1 또는 pcDNA3.1로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 24시간후, 배양 배지는 제거하고, 세포는 37℃에서 5분동안 1 mM EDTA를 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리한다. 세포는 세포 스크레이퍼(Costar)로 부드럽게 떼어내고 4℃에서 5분동안 원심분리하여 세포를 펠렛하며 10⁷ 세포/㎖의 농도로 주사등급 식염수에 재현탁시킨다.

결과

SARP-1은 블레오마이신 유도된 폐 섬유증을 예방한다.

블레오마이신 단독, 또는 의사 트랜스펙션된 NIH3T3 세포로 처리된 동물은 현저한 폐 섬유증이 발생하였다. TGFβ1은 섬유증에 이르는 병리학적 변화를 주관하는 핵심 작용제중의 하나인 것으로 생각된다. 예방적으로 투여된 항-TGFβ1 다클론 항체는 폐 섬유증의 발병을 예방하고(Yamamoto et al., 1999) 경피증의 GvHD 모델에서 피부 섬유증을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(McCormick et al., 1999). 따라서, 상기 항체는 이들 실험에서 파지티브 대조군으로 사용되었다. 항-TGFβ 처리된 생쥐는 폐의 광범위한 섬유증이 발생하지 않았다. 하지만, SARP-1 트랜스펙션 세포로 처리된 생쥐는 블레오마이신 단독 또는 의사 트랜스펙션된 세포로 처리된 생쥐와 비교하여 폐에서 현저하게 감소된 섬유성 병변을 보였다. 이런 효과는 항-TGFβ처리에서 관찰되는 효과 이상이다.

폐의 조직학적 분석에서는 SARP-1 처리된 동물이 염증성 침윤이 없고 정상적인 폐포 구조를 갖는 거의 정상 형태의 폐를 보유한다는 것을 보여준다. 이런 형태는 항-TGFβ-처리된 동물의 형태와는 유사한 반면, 의사와 처리되지 않은 동물의 폐에서 관찰되는 비정상적 형태와는 상당히 대조적이다. 의사와 처리되지 않은 동물 군에서, 폐포 공간은 섬유성 침윤과 콜라겐 침착으로 채워진다.

개별 실험 군의 폐에서 섬유성 병변의 함량은 도 10에 도시한다. SARP-1 처리된 생쥐는 식염수 또는 항-TGFβ처리된 생쥐와 비교하여 현저하게 적은 섬유성 병변을 보였다.

블레오마이신의 투여는 사망률 증가를 초래할 수 있다. SARP-1 투여의 섬유증에 대한 보호 효과이외에, 식염수 처리된 생쥐군(6/10), TGFβ처리된 생쥐군(4/10), 의사 처리된 생쥐군(3/10)에서보다 이런 처리를 받은 생쥐군(8/10 생쥐)에서 더 많은 개체가 생존하였다. 따라서, SARP 처리는 폐 섬유증 모델에서 죽음을 예방하는데, 이는 SARP-1 치료가 본 실험 환경에서 항 TGFβ처리보다 우월하다는 것을 암시한다.

요약하면, 경피증의 이런 확립된 생체내 모델에서 SARP-1의 유익한 효과가 입증되었다.

SARP-1 투여의 효과를 검사하기 위하여 다른 생체내 모델, 예를 들면 경피증에 대한 뮤린 경피증 이식편-대-숙주 질환(Scl GVHD) 모델이 이용될 수 있다. 상기 모델은 피부 비후(thickening), 폐 섬유증 및 단핵구 침윤과 피하 TGF-β1 mRNA의 상향 조절을 후행하는 피부 콜라겐 mRNA의 상향-조절을 비롯한 경피증의 주요 특징을 재현한다.

실시예 10: 발현 플라스미드 DNA의 근육내 주사에 의한 SARP-1의 전신 전달

경피증에서 보호 인자로서 SARP-1의 역할을 입증하기 위하여, 생쥐는 뮤린 SARP-1 cDNA를 인코드하는 플라스미드로 생체내 트랜스펙션시키고 대조군인 빈 플라스미드로 트랜스펙션된 생쥐와 비교한다.

플라스미드는 이전에 보고된 바와 같이 마취된 생쥐의 종아리 근육에 주사한다(Dimmeler et al., 1997; Mir et al., 1999). 간단히 말하면, 경피 전기 펄스[200 v/㎝의 8 구형파(square wave) 전기 펄스, 2Hz에서 20 msec]는 다리의 각 면에 4.2 내지 5.3mm 떨어져 위치하는 2개의 스테인레스 스틸 플레이트 전극을 이용한 PS-15 전기펄스기로 전달한다.

이후, 블레오마이신-유도된 폐 섬유증은 상기 실시예에서 밝힌 바와 동일한 고, 발병은 SARP-1 트랜스펙션된 동물과 의사 트랜스펙션 동물에서 관찰한다.

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SEQUENCE LISTING <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V. <120> Use of SARP-1 in the treatment and/or prevention of scleroderma <130> EP 469 Y <160> 5 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 912 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccaagcttc ccacgatgct gcagggccct ggctcgctgc tgctgctctt cctcgcctcg 60 cactgctgcc tgggctcggc gcgcgggctc ttcctctttg gccagcccga cttctcctac 120 aagcgcagca attgcaagcc catcccggcc aacctgcagc tgtgccacgg catcgaatac 180 cagaacatgc ggctgcccaa cctgctgggc cacgagacca tgaaggaggt gctggagcag 240 gccggcgctt ggatcccgct ggtcatgaag cagtgccacc cggacaccaa gaagttcctg 300 tgctcgctct tcgcccccgt ctgcctcgat gacctagacg agaccatcca gccatgccac 360 tcgctctgcg tgcaggtgaa ggaccgctgc gccccggtca tgtccgcctt cggcttcccc 420 tggcccgaca tgcttgagtg cgaccgtttc ccccaggaca acgacctttg catccccctc 480 gctagcagcg accacctcct gccagccacc gaggaagctc caaaggtatg tgaagcctgc 540 aaaaataaaa atgatgatga caacgacata atggaaacgc tttgtaaaaa tgattttgca 600 ctgaaaataa aagtgaagga gataacctac atcaaccgag ataccaaaat catcctggag 660 accaagagca agaccattta caagctgaac ggtgtgtccg aaagggacct gaagaaatcg 720 gtgctgtggc tcaaagacag cttgcagtgc acctgtgagg agatgaacga catcaacgcg 780 ccctatctgg tcatgggaca gaaacagggt ggggagctgg tgatcacctc ggtgaagcgg 840 tggcagaagg ggcagagaga gttcaagcgc atctcccgca gcatccgcaa gctgcagtgc 900 tagctcgagc gc 912 <210> 2 <211> 295 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Gln Gly Pro Gly Ser Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ser His 1 5 10 15 Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Pro Asp 20 25 30 Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro Ala Asn Leu Gln 35 40 45 Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu 50 55 60 Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ala Trp Ile 65 70 75 80 Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Gln 100 105 110 Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gln Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val 115 120 125 Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg 130 135 140 Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys Glu Ala Cys Lys 165 170 175 Asn Lys Asn Asp Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr Leu Cys Lys Asn 180 185 190 Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr Tyr Ile Asn Arg 195 200 205 Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr Ile Tyr Lys Leu 210 215 220 Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val Leu Trp Leu Lys 225 230 235 240 Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp Ile Asn Ala Pro 245 250 255 Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu Val Ile Thr Ser 260 265 270 Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys Arg Ile Ser Arg 275 280 285 Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys 290 295 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 gccaagcttc ccacgatgct gcagggccct 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 gcgctcgagc tagcactgca gcttgcggat 30 <210> 5 <211> 295 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Pro Arg Gly Pro Ala Ser Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Ser His 1 5 10 15 Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Pro Asp 20 25 30 Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro Ala Asn Leu Gln 35 40 45 Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu 50 55 60 Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ala Trp Ile 65 70 75 80 Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Gln 100 105 110 Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gln Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val 115 120 125 Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg 130 135 140 Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys Glu Ala Cys Lys 165 170 175 Thr Lys Asn Glu Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr Leu Cys Lys Asn 180 185 190 Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr Tyr Ile Asn Arg 195 200 205 Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr Ile Tyr Lys Leu 210 215 220 Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val Leu Trp Leu Lys 225 230 235 240 Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp Ile Asn Ala Pro 245 250 255 Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu Val Ile Thr Ser 260 265 270 Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys Arg Ile Ser Arg 275 280 285 Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys 290 295

Claims

경피증, 간경화, 간질 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 수장근막 구축(Dupuytren's contracture) 및 켈로이드성 반응 이상을 치료 또는 예방용 제약학적 조성물에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 활성 성분으로, 아래에서 선택되는 폴리펩티드 및 선택적으로, 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:

(a) SARP(Secreted Apoptosis Related Protein)-1;

(b) 이의 시스테인 풍부한 곱슬모양 도메인으로 구성되는 SARP-1 단편

(c) SEQ ID NO:2로 구성되는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 21 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 24 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 26 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:2의 아미노산 27 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 28 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(j) SEQ ID NO:2의 아미노산 37 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(k) 면역글로브린(Ig)에 (a) 내지 (j)중 하나의 폴리펩티드가 융합된 것으로 구성된 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 폴리펩티드는 당화(glycosylation)된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 폴리펩티드는 페길화(PEGylated)된 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
경피증, 간경화, 간질 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 수장근막 구축(Dupuytren's contracture) 및 켈로이드성 반응 이상을 치료 또는 예방용 제약학적 조성물에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 활성 성분으로, 아래에서 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 선택적으로, 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:

(a) SARP(Secreted Apoptosis Related Protein)-1;

(b) 이의 시스테인 풍부한 곱슬모양 도메인으로 구성되는 SARP-1 단편

(c) SEQ ID NO:2로 구성되는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 21 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 24 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 26 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:2의 아미노산 27 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 28 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(j) SEQ ID NO:2의 아미노산 37 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(k) 면역글로브린(Ig)에 (a) 내지 (j)중 하나의 폴리펩티드가 융합된 것으로 구성된 융합 단백질.
경피증, 간경화, 간질 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 수장근막 구축(Dupuytren's contracture) 및 켈로이드성 반응 이상을 치료 또는 예방용 제약학적 조성물에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 활성 성분으로, 아래에서 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 선택적으로, 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:

(a) SARP(Secreted Apoptosis Related Protein)-1;

(b) 이의 시스테인 풍부한 곱슬모양 도메인으로 구성되는 SARP-1 단편

(c) SEQ ID NO:2로 구성되는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 21 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 24 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 26 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:2의 아미노산 27 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 28 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(j) SEQ ID NO:2의 아미노산 37 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(k) 면역글로브린(Ig)에 (a) 내지 (j)중 하나의 폴리펩티드가 융합된 것으로 구성된 융합 단백질.
제 6항에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 벡터는 유전자 치료 벡터인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 벡터는 폴리펩티드의 내생적 생산을 유도 또는 강화시키는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
경피증, 간경화, 간질 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 수장근막 구축(Dupuytren's contracture) 및 켈로이드성 반응 이상을 치료 또는 예방하는 약물의 제조에 사용되는 제약학적 조성물에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 활성 성분으로, 아래에서 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 보유하는 세포 및 선택적으로, 제약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:

(a) SARP(Secreted Apoptosis Related Protein)-1;

(b) 이의 시스테인 풍부한 곱슬모양 도메인으로 구성되는 SARP-1 단편

(c) SEQ ID NO:2로 구성되는 폴리펩티드;

(d) SEQ ID NO:2의 아미노산 21 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(e) SEQ ID NO:2의 아미노산 24 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(f) SEQ ID NO:2의 아미노산 25 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(g) SEQ ID NO:2의 아미노산 26 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(h) SEQ ID NO:2의 아미노산 27 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 28 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(j) SEQ ID NO:2의 아미노산 37 내지 295로 구성되는 폴리펩티드;

(k) 면역글로브린(Ig)에 (a) 내지 (j)중 하나의 폴리펩티드가 융합된 것으로 구성된 융합 단백질.
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제 1항에 있어서, 보조 성분으로 인터페론을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 보조 성분으로 종양 괴사 인자(TNF) 길항물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 16 항에 있어서, TNF 길항물질은 TBP-I 또는 TBP-II인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 보조 성분으로 항-경피증 작용제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제 18항에 있어서, 항-경피증 작용제는 ACE 저해물질, 칼슘 채널 차단제, 양성자 펌프 저해물질, NSAID, COX-저해물질, 코르티코스테로이드, 테트라사이클린, 펜톡시필린, 부실라민, 게라닐게라닐 트랜스퍼라제 저해물질, 로테를린, 프롤릴-4-하이드록실라제 저해물질, c-프로테이나제 저해물질, 리실-옥시다제 저해물질, 렐락신, 할로푸기논, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 엔도텔린-1, 산화질소, 안지오텐신 II 저해물질, 항-산화제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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