BG107941A - Използване на sarp-1 за лечение и/или предпазване от склеродерма - Google Patents

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение е в областта на склеродерма. По-специално, изобретението се отнася до използването на SARP1 за лечението и/или предпазване от склеродерма, още поспециално от склероза на целия организъм.

ПРЕДШЕСТВАЩО НИВО НА ТЕХНИКАТА

Склеродермата е заболяване на съединителната тъкан, характеризиращо се с фиброза на кожата и вътрешните органи, което води до дисфункция на органите и смърт (Black et al., 1998; Clements and Furst, 1996). Склеродермата има спектър от прояви и разнообразни терапевтични последствия. Той включва локализирана склеродерма, склероза на целия организъм, склеродерма-подобни нарушения и склеродерма на Sine (Smith, 2000). Докато локализираната склеродерма е рядко дерматологично заболяване, свързано с фиброза и прояви ограничени до кожата, склерозата на целия организъм е многосистемно заболяване с вариращ риск за вътрешните органи и вариации в степента на кожните заболявания. Склерозата на целия организъм може да бъде дифузна или ограничена. Ограничената склероза на целия организъм, наричана още CREST (калциноза, .2..

езофагиална дисфункция на Raynaud, склеродаитили, телангиектазия). Счита се че, нарушенията наподобяващи склеродермата се отнасят до въздействие на индустриалното обкръжение. При болестта на Sine се засягат вътрешните органи, без кожни промени.

Главните прояви на склеродерма и по-специално на склерозата на целия организъм представляват неправилна усилена синтеза и отлагане на колаген, ендотелиална дисфункция, спазъм, колапс и фиброзни сраствания.

Склеродермата е рядко заболяване със стабилно А ^w разпространение приблизително 19 случая на един милион човека. Причината за склеродермата е неизвестна. Важно е, обаче, генетичното предразположение. Аномалиите включват автоимунитет и промени на ендотелните клетки и фибробластната функция. В действителност, склерозата на целия организъм е вероятно най-острото от автоимунните заболявания с 50 % смъртен изход в периода от 5 години от поставянето на диагнозата (Silman, 1991).

От гледна точка на диагностицирането, важен клиничен параметър е кожното уплътняване проксимално на сухожилията свързващи китката с фалангите. Феномена на Raynaud е често срещан, почти универсален компонент на склеродермата. Той се диагностицира чрез промени в цвета на кожата след излагане на студ. Исхемията и кожното уплътняване са симптоми на болестта на Raynaud.

Няколко определени биологични процеса участват в инициирането, степента и развитието на заболяването и включват васкуларна дисфункция, активиране на ендотелните клетки и • · • · увреждане, акумулиране на левкоцити, продукция на автоантитела и критичен, не-контролиран фиброзен отговор, който може да доведе до смърт (Clements and Furst, 1996). Фибробластите играят важна роля в патогенезата на това заболяване. Първични фибробласти получени от пациенти със склеродерма показват много от характеристиките на заболяването, които се наблюдават in vivo, забележимо увеличена синтеза и отлагане на екстрацелуларен матрикс, особено на колаген и фибронектин и променена продукция на растежни фактори и цитокини, като TGFp и CTGF (Strehlow and Korn, 1998 and LeRoy, 1974).

Няма средство за лечение на склеродерма. Нова, но много рискована терапия се предлага от автоложната трансплантация на стволови клетки (Martini et al., 1999). По-специално, понастоящем няма лечения ра склеродерма, насочени към фиброзния процес (Wigley and Boling, 2000).

Идентифицирането на гени, свързани е риска от заболяване и развитието на склеродермата може да доведе до развитие на ефективни стратегии за лекарска намеса на различни етапи от заболяването.

SARP-1 (секреторният, свързан с апоптозата белтък 1) е член на семейството на секреторните белтъци, известни като белтъци, отнасящи се до секреторни нагънати (фризирани) белтъци, на базата на тяхната хомология на цистеин богатия домен (CRD домен) открит в това семейство от 7 трансмембранни рецептора (Rattner et al., 1997). Гените за тези нагънати белтъци са идентифицирани първоначално в дрозофила и контролират тъканата полярност (Adler et al., 1987). Нагънатите белтъците са рецепторите за високо консервативното Wnt семейство от наймалко 16 секреторни сигнални молекули, които регулират взаимодействията клетка-клетка по време на ембриогенезата (Smalley and Dale, 1999). Вникването в механизмите на действието на Wnt е на база на няколко системи: генетични в дрозофила и С. elegans; биохимични в клетъчна култура; и ектопична генна експресия в ембриони от Ксенопус. Много Wnt гени в мишката са мутирали, което води до разнообразни специфични дефекти в развитието. Сигналният път на Wnt, който започва от взаимодействието на Wnt с нагънатите белтъците се медиира чрез няколко цитоплазмени каскадни компонента и функционира така че да подтиска активността на много-белтъчния комплекс отговарящ за обмяната на β-катенин, като по този начин позволява изграждането на цитозолния β-катенин, който след това постъпва в ядрото и образува комплекс с TCF за да активира транскрипцията на Wnt прицелните гени (Miller et al., 1999; Kuhl et al., 2000).

Взаимодействията на Wnt е нагънатите белтъци могат да се модулират чрез ограничената експресия на различни Wnt свързващи белтъци, като белтъци, отнасящи се към секретираните нагънатите белтъци (sFRP). SFRPs са способни да се свързват с Wnt, чрез N-крайния CRD домен. Ето защо, те могат да отделят Wnt от неговите рецептори и така да антагонизират неговите ефекти (Bafico et al., 1999).

SARP-1 е известен с няколко алтенативни имена, такива като SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2. Описана е част от или пълната дължина на секвенциите на белтъка и/или на нуклеиновата киселина на миши или човешки SARP-1 в няколко • · • · · · • * • ·

патентни заявки, например W0 98/35043, WO 98/13493, ЕР 0 879 887, WO 99/46281.

По отношение на функцията, секреторните белтъци, сходни с нагънатите (SFRPs) изглежда че действат като разтворими модулатори на Wnt сигнализацията, чрез конкуриране с мембранно свързаните нагънати рецептори, за свързване със секретираните Wnt лиганди. До сега е известно, че освен SARP-1, човешките белтъци от това семейство включват SARP-2 (SFRP-1) и SARP-3 (SFRP-5). Описано е, че мишия SARP-1 и човешки SARP -2 и -3 имат способността да повишават чувствителността на клетките към апоптоза или да подтискат апоптозния отговор (Melkonyan et al., 1997). Когато се експресира в клетъчна линия от гръдна аденокарцинома, мишия SARP-1 и човешкия SARP-2 показват противоположни ефекти върху клетъчната чувствителност към про-апоптозни стимули. Докато клетките със SARP-1 имат по-висока резистентност, клетките експресиращи SARP-2 са с повишена чувствителност към апоптоза, индуцирана от туморния некрозис фактор и церамид. Експресията на SARP-1 или SARP-2 модифицира вътреклетъчните нива на β-катенин, индикатор за Wnt медиираната сигнална трансдукция, което предполага че SARP и повлиява сигналния път между Wnt и нагънатите белтъци (Melkonyan et al., 1997).

Northern блот анализа разкрива, че гените за SARP имат различни модели на експресия (Leimeister et al., 1998). SARP-1 е представен като 2.2- и 1.3-kb транскрипти в няколко човешки тъкани, като най-високи са нивата в дебелото и тънкото черво. Chang et al., 1999, съобщават, че SARP-1 или SFRP-2, се експресира във висока степен и предмно в говежда ретина изцяло • · · · през вътрешния ядрен слой. В ретината, SARP-З, или SFRP-5 се експресира специфично в ретиналният пигментиран епител.

Чрез анализ на соматични клетъчни хибриди, Melkonyan et al. (1997) картират гена за SARP-1 в човешката хромозома 4. Chang et al. (1999) преоткриват позицията в хромозомната карта 4q31.3, чрез използване на радиационен хибриден анализ.

Също така, има все повече доказателства, че променената експресия на SARP-1 се отнася до рак (WO 98/13493).

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се основава на откритието на благоприятния ефект на SARP-1 в установен животински модел на склеродерма.

Ето защо първата цел на изобретението е използване на SARP-1 за приговяне на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма и частично на склероза на целия организъм. Втора цел на изобретението е използването на клетка, експресираща SARP-1 или на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на SARP-1 за приготвяне на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма, поспециално на склероза на целия организъм. В обхвата на настоящето изобретение са също така фармацевтични състави включващи SARP-1 и методи за лечение, включващи прилагане на SARP-1 към човешко тяло.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ • · • ·

Фигура 1 показва експресията на SARP-1 иРНК в нормални и засегнати фибробласти от 7 пациента със склеродерма, както е определено от gene filter анализите. Средното ниво на експресия за всеки клас от проби (нормални или анормални) е дадено в (А) и медианата е дадена в (В).

Фигура 2 показва съотношението на експресията на SARP-1 иРНК в засегнати/нормални фибробласти (малък брой пасажи, < 5 пасажа) от 8 пациента със склеродерма, определено чрез real time PCR.

Фигура 3 показва real time PCR анализите на SARP-1 иРНК експресията в нормални човешки кожни фибробласти (NHDF) спрямо GAPDH иРНК експресията.

Фигура 4 показва real time PCR анализите на SARP-1 иРНК експресията в клинично нормални човешки кожни биопсии (п=6) в сравнение с анормални кожни биопсии от пациенти със склеродерма (п=2) спрямо GAPDH.

Фигура 5 А и В са сходни и показват нуклеотидната секвенция и аминокиселинната секвенция на SARP-1 кДНК, получени по дедуктивен път. Предсказаните места на късане за сигналния пептид са показани със стрелки.

Фигура 6 показва съпоставянето на аминокиселинните секвенции на човешки и миши SARP-1. Не-идентичните остатъци между двете секвенции са маркирани (сиво).

Фигура 7 показва нивото на апоптоза в SARP-1 трансфектирани и mock-трансфектирани клетки в сравнение с контролните. *** е статистически значима редукция.

Фигура 8 показва ефекта на третирането със SARP-1 върху общата активност на ММР-1 в кондиционална среда взета от • · • · • · · · * · · .

• *·· · * ··· · · * • ····*···· .

·..··..· ·..·*..· човешки кожни фибробластни култури. Фибробластите са получени от тъкани на болни (A, D, F) или здрави индивиди (В, С) или от не-засегнати области на пациенти със склеродерма (Е).

Фигура 9 показва ефекта на ко-трансфекция на SARP-1 върху активността на колагеновия промотор в не-стимулирани и TGFp стимулирани NIH3T3 клетки. (А) показва единиците на луминесценция, измерени в репортерния анализ (В) дава процента на луминисценция по отношение на контролата.

Фигура 10 показва броя фибрози на един бял дроб в модел на блеомицин-индуцирана белодробна фиброза. Показан е резултатът от броят на фиброзите, измерен в мишки, получили носител, SARP-1-трансфектирани клетки, mock трансфектирани клетки или анти-TGF терапия. *** е статистически значима редукция.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно настоящето изобретение е намерено, че експресията на секреторен белтък SARP-1 е значително по-ниска във фибробласти от болни, получени от пациенти със склеродерма в сравнение е контролни клетки. Използва се ДНК технологията за gene filter microarray анализ за идентифициране на диференциялно експресираните гени в кожни фибробласти, изолирани от фиброзни лезии, получени от пациенти със склеродерма, в сравнение е фибробласти изолирани от клинично не-засегнати области на кожата от същите пациенти. Експресията на SARP-1 е подтисната във фибробластите, от областите на лезиите в 5 от 7 анализирани пациента. Също така, real time RT-PCR анализите на тотална РНК, изолирана от цялостна биопсия на всички видове анормална кожа от пациенти със склеродерма, показва по-ниски нива на SARP-1 иРНК в сравнение с биопсии от клинично с нормални контроли със съответстваща възраст, пол и анатомично място на биопсията.

В подкрепа на по-горните резултати, статистически метод, сравняващ нивата на експресия на всичките гени, включващи се при gene filter microarray анализа, показва че подтискането на SARP-1 има 95 % вероятност да бъде свързан с фиброзните лезии в пациенти, което предполага връзка с клиничното развитие на заболяването.

Благоприятният ефект на SARP-1 при склеродерма се потвърждава в добре установен миши модел на склеродерма, блеомицин-индуцирания белодробен фиброзен модел. В този модел, въвеждането на SARP-1 експресиращи клетки значително намалява частта на белодробната фиброза.

Следователно, изобретението се отнася до използване на субстанция, която се свързва със и инициира сигналния път на човешкия SARP-1 рецептор или на субстанция, която стимулира освобождаването или стимулира активността на ендогенен SARP1 за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма. Споменатата субдстанция може да бъде самия зрял SARP-1 или всеки фрагмент от SARP-1 свързващ се с и иницииращ сигналния път, чрез SARP-1 рецептора, така както и всеки друг антагонист на SARP-1 рецептора, такива като антитела агонисти насочени срещу SARP-1 рецептора или химични агонисти специфични за него.

• · * ·

Рецептор, който се предполага че е за SARP-1 е wnt белтъка, за който се предполага че се свързва към цистеин-богатия нагънат (frz) домен на SARP-1 (Lin et al., 1997). Ето защо, субстанцията, съгласно изобретението може да бъде също така фрагмент от SARP-1, включващ неговия цистеин богат нагънат домен.

За предпочитане е, субстанцията използвана за лечение и/или предпазване от склеродерма да е избрана от групата, включваща:

(а) Зрял SARP-1;

(б) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

** (в) Полипептид, включващ аминокиселини 21 до 295 от SEQ ID

NO: 2;

(г) Полипептид, включващ аминокиселини 24 до 295 от SEQ ID NO: 2;

(д) Полипептид, включващ аминокиселини 25 до 295 от SEQ ID NO: 2;

(е) Полипептид, включващ аминокиселини 26 до 295 от SEQ ID NO: 2;

(ж) Полипептид, включващ аминокиселини 27 до 295 от SEQ ID NO: 2;

(з) Полипептид, включващ аминокиселини 28 до 295 от SEQ ID NO: 2;

(и) Полипептид, включващ аминокиселини 37 до 295 от SEQ ID NO: 2;

(й) Мутеин на всеки от (а) до (и), където аминокиселинната секвенция има поне 40 % или 50 % или 60 % или 70 % или 80 % или 90 % идентичност поне с една от секвенциите в (а) до (и);

(к) Мутеин на всеки от (а) до (и), който е кодиран от ДНК секвенция, която хибридизира с комплементарна секвенция на нативната ДНК, кодираща всеки от (а) до (и) при средна степен на хибридизация и при висока степен на хибридизация;

(л) Мутеин на всеки от (а) до (и), където всички промени в аминокиселинната секвенция са консервативни аминокиселинни замествания на аминокиселинните секвенции в (а) до (и);

(м) Сол или изоформа, рекомбинантен белтък, функционално производно, активна фракция или циклично пермутирано производно на всеки от (а) до (л).

Клонирана е пълната дължина на кДНК на човешки SARP-1 и е показана на Фигура 5 и също на SEQ ID NO: 1 от приложения списък на секвенциите. Съответната аминокиселинна секвенция е дадена на Фигура 5 и SEQ ID NO: 2 от приложения списък на секвенциите. Както е показано в примерите по-долу, намерено е че, N-края на SARP-1 е силно хетероложен. Предсказано е че сигналния пептид на SARP-1 обхваща или аминокиселините 25 до 295 на SEQ ID NO: 2 или аминокиселините 21 до 295. N-крайните секвенции на пречистен рекомбинантен човешки SARP-1 експресиран в НЕК 293 клетки показва по-нататък N-крайните секвенции, водещи до зрял SARP-1, започващ от аминокиселини 24, 25, 26, 27, 28 или 37 на SEQ ID NO: 2.

Терминът “SARP-1”, както се използва тук, се отнася до която и да или всяка от субстанциите, описани по-горе в (а) до (м).

Териминът “лечение и/или предпазване”, както се използва тук обхваща всяко от намаляване, редуциране или частично, съществено или пълно предпазване или блокиране на началото на заболяването, развитието, напредването формирането, развитието, • · • · · ·

напредването на който и да е или някои от всички симптоми на заболяването.

Терминът “склеродерма”, както се използва тук, включва склеродерма в която и да е класификация и дефиниция, а също така един или повече от симптомите на склеродерма, както са описани подробно във въведението. Терминът “склеродерма” понататък се отнася до заболявания, за които е известно че са свързани със склеродерма, такива като тези например описани в Smith (2000), изцяло въведени тук от цитираната литература.

Терминът “склеродерма” използван тук включва по-нататък ^w фиброзни заболявания, такива като чернодробна цироза, интерстициални белодробни фибрози, контрактура на Dupuytren, келоид и други аномалии които са застрашаващи или се отнасят до заздравяване на рани, следоперативни адхезии и реактивни фибрози, също така и хронична сърдечна недостатъчност, поспециално след инфаркт на миокарда. Изобретението се отнася до използване на SARP-1 за производство на медикамент за лечение и/или предпазване от фиброзни заболявания, като едно от тези изброени по-горе.

Също така, заболяванията или нарушенията, които се лекуват със SAPR-1 включват заболявания свързани със заздравяването на рани, по-специално заздравяването на рани в белия дроб, включващи хронично възпаление на белия дроб и ултимативна фиброза или застрашаване на белодробните повърхности. Нарушения, включващи възпаление на белия вроб, включват например, идиопатична белодробна фиброза, саркоидоза, бронхопулмонарна дисплазия, фибропролиферативен ARDS, а също така и белодробни прояви или заболявания • · 9 9 99 свързани с целия организъм, такива като ревматоидни артрити (Krein et al., 2001).

Терминът “склеродерма” се отнася предимно до локализирана, засягаща целия организъм, оганичена и дифузна склеродерма, а същто така и до припокриващите синдромите.

Локализираната склеродерма предимно засяга кожата, но може също така да засегне и подлежащите мускули и кости. Тя не засяга обаче вътрешните органи. Локализираната склеродерма е относително мека форма и може да се отнася до склеродерма, засягаща целия организъм по отношение на сходните суперфициалните симптоми, такива които се наблюдават под микроскоп при кожната биопсия.

Склеродермата на целия организъм включва няколко типа симптоми от групата на симптомите, такива като CREST, ограничена и дифузна. Скелродермата на целия организъм, също така е известна като склероза на целия организъм. Тя може да бъде отнесена също до прогресивна склероза на целия организъм или семейна прогресивна склероза на целия организъм. Склеродермата на целия организъм може например да засегне кожата, кръвоносните съдове и/или вътрешните органи. Когато засяга кожата, тя може да причини втвърдяване на кожата, най-често на ръцете и/или на лицето. Когато засяга кръвоносните съдове, тя може да причини заболяване на Raynaud. Най-сериозните форми на склероза на целия организъм, засягат вътрешните органи и може да причинят инвалидност или даже смърт. Освен това, склерозата на целия организъм включва: склеродермално белодробно заболяване, склеродермални бъбречни кризи, сърдечни прояви, мускулна слабост, включващи умора или ·· ···» *-··· · · „ I , • * · · ♦ · « * • * · * Ч « «»'··

...............

ограничен CREST, стомашночревно обездвижване и спазъм и аномалии в централната периферната и автономната нервна система. По отношение на аномалиите в нервната система сред най-често срещаните са синдрома на карпалния тунел е последван от тригеминална невралгия.

Ограничената склеродерма може да се ограничи до ръцете, въпреки че може да включи също лицето и врата.

Дифузната склеродерма включва кожно удебеляване и също се появява над китките (или лактите). Има няколко субкатегории на дифузна склероза на целия организъм, като “склеродерма sine склеродерма” където се наблюдават фибрози на вътрешните органи, но не и кожни удебелявания; и семейна прогресивна склероза на целия организъм, рядка форма която се среща в семействата.

Припокриващи се синдроми се отнася до пациент със склеродерма, ако има други автоимунни заболявания (такива като лупус, ревматоидни артрити и т.н.), като например при дифузната склеродерма, която се припокрива с лупус. Симптомите на склеродерма могат също да бъдат част от смесени заболявания на съединителната тъкан (MCTD), или от недиференцирани заболявания на съединителната тъкан (UCTD).

Както се използва тук, терминът “SARP-1” се отнася до белтък, включващ цялата или част от секвенцията от SEQ ID NO: 2 (човешка) или SEQ ID NO: 5 (миша) от приложения списък на секвенциите, независимо от означението на такъв белтък, включващ, но не се ограничаващ по-нататък до известните означения SDF-5, PRO697, ATG-1622, HLHDY31, SFRP-2 или FRP-2, а също така до соли, изоформи, мутеини, активни фракции, • · · · • ·

функционални производни и циклични пермутирани техни производни.

Терминът “SARP-1” предимно се отнася до зрял белтък, в който липсва сигнален пептид. Предсказано е, че сигналният пептид съдържа първите 20 или в първите 23, 24, 25, 26, 27 или 36 аминокислини на SAPP-1 както е дефинирано в SEQ ID NO: 2, което означава, че зрелия белтък ще включва или аминокиселините 21 до 295 или 24, 25, 26, 27, 28 или 37 до 295 от SEQ ID NO: 2.

Както е показано на Фигура 6 по-долу, човешката аминокиселинна секвенция на SARP-1 е с висока хомология със мишата секвенция (SEQ ID NO: 5). Ето защо, мишия SARP-1 може също да бъде използван, съгласно изобретението, а също така и белтъци производни на други видове, докато има значително висока идентичност между белтъците, такава че да позволява на белтъка да покаже неговата биологична активност и без да предизвиква по същество имунен отговор в човешко същество.

Терминът “SARP-1” също така се отнася до всеки фрагмент, част, домен или суб-домен на SEQ ID NO: 2 или 5, показващ желаната активност в склеродерма. Белтъчните фрагменти или един или повече домени от белтъка, могат да се използват съгласно изобретението, докато те показват благоприятен ефект върху склеродерма, за предпочитане ефект, който поне е сравним с този на белтъка с пълна дължина. Благоприятният ефект може да бъде измерен в in vitro или in vivo тестове, описани в примерите по-долу, или чрез всеки друг от адекватните анализи, за да се демонстрира ефектът в склеродерма. Например, SARP-1 включва цистеин богат нагънат домен и нетрин-подобен домен, също • · • · · · • · • « • · · · наречен NTR модул, който е хомоложен на тъканните инхибитори на металопротеиназите (TIMPs) (Banyai and Patthy, 1999). Ето защо съгласно изобретението предпочитани фрагменти са, фрагмента включващ нагънатия домен на SARP-1, или фрагмент, включващ

NTR модул.

Съгласно настоящето изобретение, SARP-1 може да бъде естествено срещащ се, т.е. нативен белтък или рекомбинантен белтък. Получаването по рекомбинантен път може да се проведе в еукариотни клетки, такива като дрождеви клетки или СНО клетки, в човешки фибробластни клетки или клетъчни линии. То може също да бъде проведено в прокариотни клетки, такива като Е. coli.

За предпочитане, SARP-1 е гликозилиран в едно или повече места. Той може също да не бъде гликозилиран, в зависимост нуждите и източника на получаване или изолирането на белтъка.

Терминът соли тук се отнася както до соли на карбоксилните групи, така и до киселинно-присъединителни соли на аминогрупите от SARP-1 молекулата или техни аналози. Соли на карбоксилните групи могат да бъдат получени чрез подходи известни в областта на техниката и включват неорганични соли, например натриеви, калциеви, амониеви, железни или цинкови соли и други подобни, и соли с органични бази, като тези получени например с амини, такива като триетаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и други подобни. Киселинноприсъединителните солите, включват например соли с минерални киселини, такива като например, солна киселина или сярна киселина и соли с органични киселини, такива като, например оцетна киселина или оксалова киселина. Разбира се всички тези соли, трябва да запазят биологичната активност на SARP-1 в съответствие с настоящото изобретение, т.е. да проявяват благоприятен ефект при склеродерма.

Изоформи или сплайс варианти на SARP-1 могат също да бъдат използвани, съгласно изобретението, докато те са способни да подтискат развитието на склеродермалното заболяване и/или симптомите на това заболяване. Двата транскрипта 1.3 kb и 2.2 kb за които е известно че се експресират различно в човешките тъкани, могат например на представляват различни изоформи на SARP-1, които могат да бъдат използвани съгласно изобретението.

Както се използва тук, терминът мутеини се отнася до ^w аналози на SARP-1, в които един или повече от аминокиселинните остатъци на естествения SARP-1 са заместени от различни аминокиселинни остатъци или са отстранени чрез делеция или един или повече аминокиселинни остатъка са добавени към секвенцията на естествения SARP-1, които за предпочитане имат поне същата активност като дивия тип SARP-1 или дори имат много по-висока активност. Тези мутеини се получават чрез известни синтези и/или чрез техники на място-насочен мутагенез, или чрез всяка друга известна техника подходяща за тях.

Всеки такъв мутеин за предпочитане има секвенция от аминокиселини дублираща до голяма степен тази на SARP-1, както е описано в SEQ ID NO: 2, така че да има поне по същество подобна активност на SARP-1. Активността на SARP-1 мутант може да бъде тествата чрез анализи известни в областта на техниката и по-специално, чрез използването на анализите обяснени в примерите по-долу. Например, измерването на количеството на синтезирания колаген (Пример 7) във ··· · · · · ♦ · ···· · *··· · · · • ····«···* · фибробластите е подходящ тест за оценяване на активността на SARP-1 мутеините.

Мутеините, съгласно настоящето изобретение включват белтъци, кодирани от нуклеинова киселина, такава като ДНК или РНК, която хибридизира е ДНК или РНК, която кодира SARP-1 съгласно настоящето изобретение, при условия на висока степен на хибридизация. Терминът условия на висока степен на хибридизация се отнася до хибридизация и последващи условия на промиване, като тези обикновено използвани от специалистите в областта, се използва стандартно тук като висока степен на хибридизация. Виж например Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 и 6.4 (1987, 1992), и Sambrook et al. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Без да се ограничават само до, примерите за условия за висока степен на хибридизация включват условия на промиване при 12-20° С под изчислената Тт на хибрида при изследването, например 2 х SSC и 0.5 % SDS в продължение на 5 минути, 2 х SSC и 0.1 % SDS в продължение на 15 минути; 0.1 х SSC и 0.5 % SDS при 37° С в продължение на 30-60 минути и след това 0.1 х SSC и 0.5 % SDS при 68° С в продължение на 30-60 минути. Тези които са специалисти от областта разбират че условията за висока степен на хибридизация също зависят от дължината на ДНК секвенцията, на олигонуклеотидните сонди (такава като 10-40 бази) или на смесени олигонуклеотидни сонди. Ако се използват смесени сонди, за предпочитане е да се използва ··· ··· ·· · ···· · ···· · · · тераметил амониев хлорид (ТМАС) вместо SSC. Виж Ausubel, погоре.

За предпочитане всеки такъв мутеин ще има секвенция от аминокиселини, по същество дублираща се с тази на SARP-1, така че да притежава фактическа подобна или даже по-добра биологична активност от тази на SARP-1.

Една лесно измерима активност на SARP-1 е неговата способност да редуцира колагеновата синтеза. Анализ за измерване на тази активност е описан подробно в Пример 6 подолу. Докато мутеина има съществена колаген-редуцираща активност, той може да се счита че има по същество подобна активност на SARP-1. Следователно, може да се определи дали всеки даден мутеин има поне по същество същата активност като SARP-1 чрез рутинни средства от експерименти, включващи подлагането на такъв мутеин например на прост анализ, както е описано в Пример 7.

В предпочитан вариант, всеки такъв мутеин има най-малко 40 % идентичност или хомология със секвенцията от SEQ ID NO: 2 от приложения списък на секвенциите. Още по-добре е, той да има поне 50 %, поне 60 %, поне 70 %, поне 80 % или най-добре поне 90 % идентичност или хомоложност с нея.

Идентичността отразява връзката между две или повече полипептидни секвенции или две или повече полинуклеотидни секвенции, определена чрез сравняване на секвенциите. Обикновенно, идентичността се отнася до точно нуклеотид спрямо нуклеотид или аминокиселинно спрямо аминокиселинно съответствие съответно на две полинуклеотидни или две • · • · • · · · ·· ·· • · · · · · полипептидни секвенции, върху дължината на сравняваните секвенции.

Може да се определи ”% идентичност за секвенциите, където няма точно съответствие. Обикновенно двете секвенции, които трябва да се сравнят са подредени така, че да се получи максимална корелация между секвенциите. Това може да включва въвеждане на дупки в една от двете или и в двете секвенции, за да се повиши степента на съпоставяне. Процента на идентичност може да се определи върху цялата дължина на всяка една от секвенциите, които се сравняват (така нареченото глобално ^w съпоставяне), което е особено подходящо за секвенциите с една и съща дължина или с много сходна дължина, или с по-къса дължина (така нареченото локално подреждане), което е поподходящо за секвенции е нееднаква дължина.

Методите за сравняване на идентичност и хомология на две или повече секвенции са добре известни в областта от нивото на техниката. Така например, програмите налични в Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J et al 1984), например програмите BESTFIT и GAP, могат да се използват за да се определи % идентичност между два полинуклеотида и % идентичност и % хомология между две полипептидни секвенции. BESTFIT използва алгоритъма на Smith and Waterman (1981) за локална хомология и открива най-добата единична област на сходство между две секвенции. От нивото на техниката са известни също така и други програми за определяне на идентичност и/или сходство между секвенции, например семейството на BLAST програмите (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, достъпен чрез интернет страницата на ··· · · · · ·· ···· · «··· · ·· • · · · ·· «·· ·· • · 0*1 · · ·♦··· ······· ζι·· · · · ···

NCBI на адрес www.ncbi.nlm.nih.gov) и FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Мутеините на SARP-1, които могат да се използват съгласно настоящето изобретение, или кодиращите ги нуклеинови киселини, включват определен набор от съществено съответстващи си секвенции като заместени пептиди или полинуклеотиди, които могат да бъдат получени рутинно от който и да е от специалистите от областта на техниката, на базата на публикации и ръководствата представени тук, без да се използват несвойствени експерименти.

Предпочитани промени за мутеини, съгласно настоящето изобретение са тези известни като консервативни замествания. Консервативните аминокиселинни замествания на SARP-1 полипептиди или белтъци могат да включват синонимни аминокиселини от група която има достатъчно сходни физикохимични свойства, така че заместването между членовете на групата ще запази биологичната функция на молекулата (Grantham, 1974). Ясно е, че аминокесилинните инсерции и делеции могат също да бъдат направени в по-горе дефинираните секвенции без да се променя тяхната функция, по-специално ако аминокиселинните инсерции и делеции включват само няколко аминокиселини, например под тридесет, за предпочитане под десет и без да се отстраняват или заместват аминокиселините, които са важни за функционалната конформация, например цистеиновите остатъци. Белтъци и мутеини получени чрез такива делеции и/или инсерции са в обхвата на настоящето изобретение.

Предпочитаните синонимни аминокиселинни групи са тези, определени в Таблица I. По-предпочитани синонимни

аминокиселинни групи са тези определени в Таблица II; и найпредпочитаните синонимни аминокиселинни групи са тези, определени в Таблица III.

ТАБЛИЦАI

Предпочитани групи синонимни аминокиселини

Аминокиселина	Синонимна група
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Vai	Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Vai
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
He	Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, He
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Vai, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, lie, Vai, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp

• · • · · · • · • · • ·

Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, lie, Val, Leu, Met
Trp	Trp

ТАБЛИЦА 2

По-предпочитани групи от синонимни аминокиселини

Аминокиселини	Синонимни групи
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, He, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, lie
Gly	Gly
lie	He, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, He, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn

tt 9 ··· 9 99 9

9 9 99 9

9999 99999

• · · · • · * ·

Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, He, Vai, Leu
Trp	Trp

ТАБЛИЦА HI

Най-предпочитани групи от синонимни аминокиселини

Аминокиселини	Синонимни групи
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, He, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Vai	Vai
Gly	Gly
lie	He, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp

• · ·

• 4

4 4 4

4 4 · · 4 4

2t>·*

Glu	Glu
Met	Met, lie, Leu
Trp	Met

Примери за получаване на аминокиселинни замествания в белтъци, които могат да бъдат използвани за получаване на мутеини на SARP-1 полипептиди или белтъци, за използване в настоящето изобретение включват всички известни етапи от методи, такива като представени в US Патенти 4,959,314, 4,588,585 и 4,737,462, на Mark et al; 5,116,943 на Koths et al., ^w 4,965,195 на Namen et al; 4,879,111 на Chong et al; и 5,017,691 на Lee et al; и лизин заместени белтъци, представени в US Патент No. 4,904,584 (Shaw et al).

Терминът рекомбинантен белтък се отнася до полипептид, включващ SARP-1 или до негов мутеин, свързан по рекомбинантен път с друг белтък, например такъв който може да съществува продължително време в телесните течности. Например, съгласно изобретението са предпочитани рекомбинантни белтъци, включващи всички или функционална част от SARP-1 свързана по рекомбинантен път с целия или с функционална част от белтък, способен да подобри биологичните активности на молекулата, като полу-живот в тялото на човек. В предпочитан вариант, рекомбинантния белтък включва имуноглобулинов (Ig) рекомбинант. Силно предпочитани са рекомбинантните белтъци включващи целия или част от SARP-1, свързан с целия или с част от имуноглобулините. Те могат да бъдат мономерни, мултимерни, хетеро- или хомомултимерни. С предимство са рекомбинантните белтъци, включващи • « · ·· · • * • · · ·

Λ?·'· константната област от имуноглобулин, по-специално Fc участъка от имуноглобулина. Други предпочитани варианти съгласно изобретението са тези в които имуноглобулина е IgGl или IgG2 изотип.

Следователно SARP-1 може да бъде свързан по рекомбинантен път към друг белтък, полипептид или други подобни, например имуноглобулин или негов фрагмент. Свързването може да бъде директно или чрез къс линкерен пептид, който може да е с дължина от 1 до 3 аминокиселинни остатъка или по-дълъг, например с дължина 13 аминокиселинни остатъка. Споменатият линкер може да бъде трипептид например със секвенцията E-F-M (Glu-Phe-Met), или 13-аминокиселинен линкер със секвенция, включваща Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-ValLeu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met въведена между SARP-1 секвенцията и имуноглобулиновата секвенция.

Както се използва тук функционални производни обхваща производни на SARP-1 и техни мутеини и рекомбинантни белтъци, които могат да бъдат получени чрез методи известни в областта от нивото на техниката, от функционални групи, които се срещат в страничните вериги на остатъците или N- или С-крайни групи, и които са включени в изобретението, доколкото те са фармацевтично приемливи, т.е. те не нарушават активността на белтъка, която е поне по същество подобна на активността на SARP-1 и не придава токсични свойства на съединенията които я съдържат. Ето защо, в предпочитан вариант, функционалното производно включва поне една група, прикрепена към една или повече функционални групи, които се намират в една или повече странични вериги върху аминокиселинните остатъци.

···· • · • 44· • 4 · ·· • · е · ·· • ···· 4 ·4 • · · · · · 4· .··· ···' 27··* *··* ··**

Съгласно настоящето изобретение, силно предпочитани групи са полиетилен гликоловите (PEG) странични вериги. PEG страничните вериги могат да маскират антигенните места и така да увеличат престоя в телесните течности на субстанцията към която са прикрепени. Други производни включват алифатни естери на карбоксилни групи, амиди на карбоксилни групи, чрез реакция с амоняк или с първични или вторични амини, N-ацил производни на свободни амино групи на аминокиселинни остатъци, образувани с ацилни групи (например, алканоил или карбоциклични ароил групи) или О-ацил производни на свободни хидроксилни групи (например такива на серилови или треонилови остатъци) образувани с ацилни групи.

Активни фракции на SARP-1 и негови мутеини и рекомбинантни белтъци, обхващат всеки фрагмент, или прекурсори на полипептидната верига, само на белтъчната молекула или заедно със свързаните молекули или свързаните с тях остатъци, например захарни или фосфатни остатъци или агрегати от белтъчни молекули или от самите захарни остатъци, при условие че споменатата активна фракция, има по същество поне сходна активност на SARP-1.

Изобретението също така се отнася до използване на молекула нуклеинова киселина за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма, където молекулата нуклеинова киселина включва секвенция на нуклеинова киселина, кодираща полипептид, включващ аминокиселинна секвенция избрана от групата, съставена от:

(а) Зрял SARP-1;

(б) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

··♦· «· ···· • · • ♦·· ·* ·4 • · € • · ···

• · · » ·

28·· · ·

(в) Полипептид, включващ аминокиселини	21	ДО	295	от	SEQ	ID
N0: 2;
(г) Полипептид, включващ аминокиселини	24	ДО	295	от	SEQ	ID
N0: 2;
(д) Полипептид, включващ аминокиселини	25	ДО	295	от	SEQ	ID
N0: 2;
(е) Полипептид, включващ аминокиселини	26	ДО	295	от	SEQ	ID
N0: 2;
(ж) Полипептид, включващ аминокиселини	27	ДО	295	от	SEQ	ID
N0: 2;
(з) Полипептид, включващ аминокиселини	28	ДО	295	от	SEQ	ID
N0: 2;
(и) Полипептид, включващ аминокиселини	37	ДО	295	от	SEQ	ID

'Чииг

NO: 2;

(й) Мутеин на всеки от (а) до (и), където аминокиселинната секвенция има поне 40 % или 50 % или 60 % или 70 % или 80 % или 90 % идентичност най-малко с една от секвенциите в (а) до (и) ;

(к) Мутеин на всеки от (а) до (и), който е кодиран от ДНК секвенция, която хибридизира с комплементарна секвенция на нативната ДНК, кодираща всеки от (а) до (и) при условия за средна степен на хибридизация или при условия за висока степен на хибридизация;

(л) Мутеин на всеки от (а) до (и), където всички промени в аминокиселинната секвенция са консервативни аминокиселинни замествания на аминокиселинните секвенции в (а) до (и);

(м) Сол или изоформа, рекомбинантен белтък, функционално производно, активна фракция или циклично пермутирано производно на всеки от (а) до (л) • · · · • · « ·

за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма. В същата степен изобретението се отнася до използването на споменатите молекули нуклеинови киселини за лечение и/или предпазване от склеродерма.

Съгласно настоящето изобретение, SARP-1 също може да бъде прилаган в човешкото тяло, като вектор включващ спомената молекула нуклеинова киселина. Следователно, изобретението освен това, се отнася до използването на вектор, включващ спомената молекула нуклеинова киселина за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма. За предпочитане, векторът е експресионен вектор, включващ промотор свързан по оперативен път с цялата или с част от кодиращтата секвенция на SARP-1. В друг предпочитан вариант, векторът е вектор за генна терапия. Векторите за генна терапия са известни в областта от нивото на техниката, с това че повечето от тях са вектори с вирусен произход, такива като аденовирусни или лентивирусни вектори.

Съгласно изобретението, SARP-1 също може да се прилага в човешкото тяло под формата на клетка, продуцираща и/или секретираща SARP-1. Ето защо, изобретението също така се отнася до използването на клетка, експресираща SARP-1 за производството на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма, т.е. до клетъчна терапия за лечение и/или предпазване от склеродерма. Клетката може да бъде естествено продуцираща SARP-1 и/или да е трансфектирана клетка, която продуцира рекомбинантен SARP-1. Предпочитани са клетки, експресиращи и секретиращи големи количества от белтъка, такива като свръх-експресиращи клетки, които носят голям брой копия от експресионен вектор, включващ молекула нуклеинова киселина, кодираща SARP-1.

Тъй като фибробластите са в основата на фиброзата, те са най-подходящите клетки за анти-фиброзна и склеродермална терапия. Следователно, SARP-1 експресиращи фибробласти се използват предимно, съгласно настоящето изобретение.

Изобретението след това се отнася до клетка, включваща вектор, включващ молекула нуклеинова киселина, кодираща целия или част от SARP-1 за получаване на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма. Клетка, която е генетично модифицирана да продуцира полипептид съгласно изобретението е също така в обхвата на настоящето изобретение.

Съгласно изобретението се предвижда също така, използването на експресионен вектор за индуциране и/или повишаване на ендогенната продукция на SARP-1 в нормални неекспресиращи клетки или клетки експресиращи инхибиторът в недостатъчни количества. Следователно, изобретението включва използването на технология, известна като ендогенно генно активиране (EGA) за получаването на желания белтък.

Склерозата на целия организъм е едно от най-сериозните заболявания от склеродермата, често водещо до инвалидност и смърт. Ето защо, друг предпочитан вариант на изобретението се отнася до склероза на целия организъм, която е индикация за заболяване от типа на склеродерма и се характеризира главно с това че засяга вътрешните органи, както е описано по-подробно по-горе.

•· ···· · * • · · · · · · · • · · · · · · · · · ·· • · з! · · · · · ·· ······· ·· · · ·· · ·

Съгласно настоящето изобретение се предпочитат няколко комбинации от лечения. Ето защо, предимно медикаментът от изобретението също така включва:

• Интерферон, по-специално интерферон -β • Антагонист на тумор некрозис фактора (TNF), поспециално ΤΒΡΙ и/или ТВР II • Друго анти-склеродермално средство • Анти-склеродермално средство, избрано от групата, включваща АСЕ инхибитори, блокери на калциевите канали, инхибитори на протонните помпи, NSAIDs, COXинхибитори, кортикостероиди, тетрациклин, пентоксифилин, буциламин, геранилгеранил тренсферазни инхибитори, ротерлин, пролил -4хидролазни инхибитори, с-портеиназни инхибитори, лизил-оксидазни инхибитори, релаксин, халофугинон, простагландини, простациклини, ендотелин-1, азотен оксид, инхибитори на ангиотензин II и анти-оксиданти.

При всички лечения се има предвид едновременно, последователно или поотделно използване.

. Въпреки, че понастоящем няма лечение за склеродерма,

Чи»· някои средства или лечения се използват днес за лечение на симптомите на склеродерма. Такива анти-склеродермални средства, които могат да бъдат използвани като комбинирана терапия съгласно изобретенето са обобщени, например в Leighton (2001) или Wigley и Sule (2001), които са напълно включени тук в цитираната литература.

Интерфероните са известни предимно с инхибиторните ефекти върху вирусната репликация и клетъчната пролиферация.

• ··· · ···· · · · • · 3$ · · » · ·· · • · · · · · · · · · · · · · ·

Интерферон-γ, например играе важна роля в повишаването на имунният и възпалителни отговори. За интерферон β (IFN-β, тип I интерферон) се споменава че играе роля като анти-възпалително средство.

В друг следващ вариант от изобретението, SARP-1 се използва в комбинация с антагонист на TNF. TNF антагонистите проявяват активността си по няколко начина. Първо, антагонистите могат да свързват или да изолират самата TNF молекула с достатъчен афинитет и специфичност, така че частично или съществено да неутрализират епитопа за TNF или епитопите отговорни за рецепторното свързване на TNF (тук по-нататък определени като “изолиращи антагонисти”). Изолиращият антагонист може да бъде например антитяло, насочено срещу TNF.

От друга страна, TNF антагонистите могат да инхибират сигналният път на TNF, активирани от клетъчно повърхностен рецептор след свързване с TNF (определени по-нататък тук с термина “сигнални антагонисти”). TNF антагонистите се идентифицират лесно и се оценяват, чрез рутинни скринирания на кандидати за техният ефект върху активността на естествен TNF, върху компетентни клетъчни линии in vitro, например човешки В клетки, в които TNF води до пролиферация и имуноглобулинова секреция. Анализът включва TNF приготвен с различни разреждания от кандидата антагонист, например от 0,1 до 100 пъти от моларното количество на TNF, използвано в анализа и контроли в които няма TNF или има само антагонист (Tucci et al., 1992).

• · · • · · · • · • ·

Изолиращите антагонисти са предимно TNF антагонисти, използвани съгласно настоящето изобретение. Между изолиращите антагонисти се предпочитат тези полипептиди, които свързват TNF с висок афинитет и притежават ниска имуногенност. Специално предпочитани са разтворими TNF рецепторни молекули и неутрализиращи антитела на TNF. Например, разтворимите форми на TNF-RI (р55) и TNF-RII (р75) се използват в настоящето изобретение. Съгласно настоящето изобретение поспециално предпочитани антагонисти са скъсените форми на тези рецептори, включващи извънклетъчни домени на рецепторите или техни функционални части. Например, скъсените разтворими TNF тип-I и тип-П рецептори са описани в ЕР914431.

Скъсените форми на TNF рецепторите са разтворими и се наблюдават в урината и серума като около 30 kDa или 40 kDa TNF инхибиторни свързващи белтъци, които се наричат съответно TBPI и ТВРП (Engelmann et al., 1990). Предпочита се едновременното, последователното или поотделното прилагане на SARP-1 с TNF антагонист и/или интерферон, съгласно настоящето изобретение.

Съгласно изобретението, TBPI и ТВРП са предимно TNF антагонисти, които се използват в комбинация със SARP-1. Производни, фрагменти, области и биологично активни части от рецепторните молекули, които функционално наподобяват рецепторните молекули, могат също да бъдат използвани в настоящето изобретение. Такъв биологично активен еквивалент или производно на рецепторната молекула се отнася до част от полипептида или секвеницята кодираща рецепторната молекула, която е с достатъчен размер и е способна да свързва TNF с такъв афинитет, че взаимодействието с мембранно-свързаният TNF рецептор да се инхибира или блокира.

Съгласно изобретението, в друг предпочитан вариант се използва като TNF антагонист човешки разтворим TNF-RI (TBPI). Естествени и рекомбинантни разтворими TNF рецепторни молекули и методи за тяхното получаване са описани в Европейски Патенти ЕР 308 378, ЕР 398 327 и ЕР 433 900.

Докато в ранните етапи на заболяването може да е блогоприятно блокирането на TNF-oc, дискутира се че в покъсните етапи, самият TNF може да прояви благоприятен ефект при склеродерма (Abraham et al., 2000). Ето защо, изобретението също се отнася до комбинации на SARP-1 и TNF-α за лечение или предпазване от склеродерма, по-специално в напредналите етапи на заболяването.

СОХ инхибиторите са известни в областта. Специфични СОХ-2 инхибитори са описани например в WO 01/00229.

Изобретението се отнася също така до фармацевтичен състав, включващ SARP-1, по избор заедно е един или повече фармацевтивно приемливи носители, разредители или ексципиенти за лечение и/или предпазване от склеродерма, поспециално склероза на целия организъм. Фармацевтичният състав може по-нататък да включи всеки един от горе-идентифицираните допълнителни компоненти и по-специално интерферон, ТВР или СОХ инхибитор.

Фармацевтичният състав, съгласно изобретението може също така да включва вектор, включващ молекула нуклеинова киселина съгласно изобретението или клетка, експресираща

SARP-1.

Активните съставки от фармацевтиката, т.е. полипептиди, нуклеинови киселини или клетки, съгласно изобретението или техни комбинации, така както и комбинации от субстанции споменати по-горе, могат да бъдат прилагани на индивид по различни начини. Пътищата на прилагане включват интрадермален, трансдермален (например в бавно освобождаващи формулиравки), интрамускулен, интраперитонеален, интравенозен, подкожен, орален, епидурален, локален и интраназален път. Всеки друг терапевтично ефективен път на прилагане може да бъде използван, например абсорбиране чрез епителната или ендотелната тъкан или чрез генна терапия, където ДНК молекулата кодираща активното средство се прилага в пациент (например, чрез вектор) което води до експресиране на активното средство и секретиране in vivo. В допълнение белтъкът (белтъците) съгласно изобретението могат да се приложат заедно с други компоненти от биологично активи средства, като фармацевтично приемливи сърфактанти, ексципиенти, носители, разредители и носители.

Определението “фармацевтично приемлив има за цел да обхване всеки носител, който не повлиява ефективността на биологичната активност на акитвната съставка и който е нетоксичен за гостоприемника към който се прилага. Например, за парентерално прилагане, активния белтък (белтъци) може да бъде формулиран, като единична дозирана форма за инжекция в средства, такива като солеви разтвор, декстрозен разтвор, серумен албумин и рингеров разтвор.

За парентерално (например, интравенозно, подкожно, интрамускулно) прилагане, активния белтък (белтъци) може да • · • · · · • · • · · · .:.....· зб..· ·..· ·..· ·..· бъде формулиран като разтвор, суспензия, емулсия или лиофилизиран прах свързан с фармацевтично приемливо парентерално средство (например, вода, солеви разтвор, декстрозен разтвор) и добавъчни средства които поддържат изотоничността (например манитол) или химичната стабилност (например консерванти и буфери). Формулировката се стерилизира по общоприети използвани техники.

Бионаличността на активния белтък (белтъци), съгласно изобретението, може също да бъде подобрена, чрез използване на методи за свързване, които повишават полу-живота на молекулата в човешкото тяло, например свързване на молекулата с полиетиленгликол, както е описано в РСТ Патентна заявка WO 92/13095.

Терапевтичното ефективно количество от активен белтък (белтъци) ще бъде функция от много променливи, включващи типа на рецептора, афинитета на субстанцията съгласно изобретението към нейния рецептор, всяка една остатъчна цитотоксична активност която тя показва, начина на прилагане, клиничното състояние на пациента.

Терапевтично ефективно количество е това, което когато се прилага, субстанцията съгласно изобретението води до активиране на SARP-1 рецептора или инактивиране на лиганд, стимулиращ рецептора in vivo. Дозата, приложена като единична или многократна доза в индивид, ще варира в зависимост от фактори, включващи SARP-1 фармакокинетични свойства, начина на прилагане, състоянието на пациента и характеристики (пол, възраст, телесно тегло, здравословно състояние, размер), степен на симптомите, текущо лечение, честота на лечение и желания ефект.

Установяването и манипулацията на установените дозови обхвати са познати на специалистите в областта от нивото на техниката.

Необходимата дозата на полипетида, съгласно изобретението, ще варира от около 0,0001 до 100 mg/kg или около 0.01 до 10 mg/kg или около 0.1 до 5 mg/kg или около 1 до 3 mg/kg, въпреки че както е отбелязано по-горе тя ще е обект на голям брой терапевтични преценки.

Дневните дози обикновено се дават като отделни дози или под формата на дози със задържащо освобождаване, ефективни за да се получат желаните резултати. Второ или последващо прилагане може да бъде направено под формата на доза, която е същата, по-малка или по-голяма от първоначалната доза или предишната доза, приложена на индивида. Второ или последващо прилагане може да бъде направено по време на или преди проявата на заболяването.

Изобретението се отнася по-нататък до метод за лечение и/или предпазване от склеродерма, по-специално от склероза на целия организъм, включващ прилагане в пациент, който се нуждае от него, на ефективно количество полипептид съгласно изобретението по избор заедно със фармацевтично приемлив носител. Съответно, или в допълнение, може да бъде приложена клетка, продуцираща SARP-1 или молекула нуклеинова киселина от изобретението, по избор включена в експресионен вектор, съгласно изобретението.

Експресионен вектор може да бъде приложен върху целия организъм. Предимно експресионния вектор се прилага чрез интрамускулна инжекция. Друг предпочитан начин на прилагане е • * · · · · • · • · • · · · инхалирането по-специално ако заболяването включва белодробна фиброза.

Изобретението освен това се отнася до метод за получаване на фармацевтичен състав, включващ смесване на ефективно количество SARP-1 с фармацевтично приемлив носител и до метод за лечение и/или предпазване от артрит, включващ прилагане в гостоприемник, който се нуждае от него, на ефективно инхибиращо количество от SARP-1.

Всички справки, цитирани тук, включващи статии от списания или абстракти, публикувани или не-публикувани U.S. или чужди патентни заявки, издадени U.S. или чужди патенти или която и да е друга справка, са включени изцяло тук в цитираната литература, включващи всички данни, таблици, фигури и текст, представени в цитираната литературна справка. В допълнение, цялото съдържание на цитираната литература в цитираната тук справка е изцяло включено тук.

Справката за известните методични етапи, стандартните методични етапи, известните методи или стандартни методи, не дава основание да се допусне че който и да е аспект, описание или вариант от настоящето изобретение е описан, издаден в статия или даден като предположение в съответната област на техниката.

По-горното описание на специфичните варианти ще разкрие толкова пълно общата природа на настоящето изобретение, че другите да могат чрез прилагане на знанията на специалистите от областта на техниката (включително и съдържанието на цитираната тук литература), да могат лесно да модифицират и/или адаптират различните приложения като специфични варианти, без да е необходимо несвойствени експерименти, без да се разграничава от общата концепция на настоящето изобретение. Ето защо, такива адаптации и модификации са имат за цел да са в обхвата от еквиваленти на описаните варианти, въз основа на публикации и ръководства представено тук. Ясно е че фразеологията или терминологията тук е с цел да опише, а не да ограничи, така че тази терминологията или фразеологията от настоящата спецификация, трябва да се интерпретира от специалистите в областта от нивото на техниката в светлината на публикациите и ръководството представено тук, в комбинация със знанията на този, който е специалист в областта от нивото на техниката.

След като е описано изобретението, то лесно ще се разбере чрез справката със следните примери, които са илюстративни и нямат за цел да ограничат настоящето изобретение.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1

SARP-1 се експресира диференциално в кожни фибробласти от пациенти със склеродерма

Методи

Проби от пациент

Два mm3 тъкан за биопсии се взимат, чрез перфорация от кожа с лезии или кожа без лезии (обикновено от кожа на ръката) от девет пациента с определена възраст и пол с дифузна кожна склероза на целия организъм (SSc). Всички пациенти отговарят на • · ···· • · • · критериите на American College of Rheumatology за диагностика на склероза на целия организъм.

Фибробластни култури

Фибробластите са получени от биопсии чрез in vitro култивиране, както е описано преди това (Abraham et al., 1991). Накратко, тъканта, взета чрез биопсия се нарязва на парченца и се поставя в стерилни пластмасови петрита или матраци. След 15 минути сушене на стайна температура, парченцата от биопсиите адхерират върху пластмасата за тъканно култивиране и след това се култивират в среда за фибробластен растеж (FGM) съдържаща, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), съдържаща 10 % фетален телешки серум (FCS), 2 mM L-глутамин, 1 тМ натриев пируват, 100 единици на милилитър пеницилин, 100 pg на милилитър стрептомицин, 50 pg на ml гентамицин и 2.5 pg на ml амфотерицин В. След 2-3 седмици инкубация във влажен въздух и 5 % СО2 във въздуха, фибробластите се отделят чрез кратко трипсинизиране и се култивират отново във FGM без гентамицин и амфотерицин В. В експериментите, фибробластите се използват между 2 и 5 пасаж. Фенотипа на фибробластите се потвърждава от тяхната типична морфология в монослй и три-измерни колагенови гел култури.

Изолиране на РНК

Тотална РНК се изолира от конфлуентни фибробласти от склеродерма в ранни пасажи или от първични култури (пасаж 1-3) на нормални човешки дермални (кожни) фибробласти (закупени от Promocell), като се използва Тризол (Life Technologies), • · • · · · съгласно протокол на производителя. Крайната утайка от РНК се ресуспендира в стерилна вода третирана с DEPC в концентрация от 1 μg/μl и се съхранява при -80° С.

Синтезиране на кДНК сонда pg тотална РНК се смесва с 1.3 μΐ от цитокин специфични праймери (R&D systems cat. no. GAC11) и се инкубира на 70° С в продължение на 2 min в 0.5 ml епендорф епруветка. Епруветките след това се охлаждат до 50° С в продължение на 2 min след което реакционната смес съдържаща 2 μΐ от 5Х реакционен буфер (250 mM Tris-HCl pH 8.3, 375 тМ КС1 и 15 тМ MgC12), се добавят 1 μΐ от 10Х dNTP смес (5 mM dGTP, 5тМ dCTP и 5тМ dTTP), 3.5 μΐ οτ oc32P-dATP (3000Ci/mmol, Amersham cat. no. PB10204), 0.5 μΐ DTT (100 mM) и 1 μΐ от Superscript II (Life Technologies). Реакционната смес се разбърква за кратко време, чрез пипетиране и инкубиране при 50° С в продължение на 25 min. Реакцията се спира чрез добавяне на 1 μΐ от 0.1 М EDTA pH 8.0 съдържащ 1 mg/ml гликоген. Белязаната кДНК след това се пречиства от невключените дезоксинуклеотиди, като се използва Chromaspin-200 ф DEPC-H20 колона (Clontech) съгласно инструкциите на производителя. кДНК, съдържащите фракции се идентифицират, чрез броене на Czerenkov. Пиковата фракция (обикновено фракция 2 от всичките 6 събрани) се третира с 0.1 обема 1 М NaOH, съдържаща 1 mM EDTA в продължение на 20 min при 70° С за да се хидролизира РНК, и след това се неутрализира с равен обем от 1 М NaH2PO4 съдържащ 2.5 pg от човешка Cot-1 DNA (Life Technologies) в продължение на 20 min при 70° С. Нагрятата, • · • · · · • · • » неутрализирана кДНК сонда след това се добавя директно към хибридизационната смес.

Хибридизиране към gene filter microarray

Gene filter microarray (човешка цитокинова експресионна група, R&D systems cat no. GA001) се хибридизира предварително при 68° C в продължение на 2 h в 5 ml от Express Hybridization разтвор (Clontech), съдържащ 0.5 pg/ml ДНК от сперма на пъстърва (Life technologies) в непрекъснато въртящи се бутилки в сушилня за Hybaid хибридизация (MWG Biotech). След като изтече това време, разтворът за предварителна хибридизация се замества с пресен разтвор за хибридизация, съдържащ кДНК сондата със специфична активност между 0.25 до 1 х 10⁶ cpm/ml. хибридизацията се провежда в продължение на 16 - 20 h при 68° С. След хибридизацията, филтрите се промиват 4 пъти с 2Х SSC/1 % SDS при 68° С в продължение на 20 минути за всяко промиване и два пъти с 0.1Х SSC/0.5 % SDS в продължение на 15 min за всяко промиване. Филтрите след това се запечатват в Saran wrapTM и се излагат на действието на К-тип storage phosphor imaging екран (Biorad) за различни периоди от време (от 4 часа до 4 дни) на стайна температура.

Анализ на образа

Скринираните образи се сканират с разделителна способност от 50 pm, като се използва Biorad Personal FX phosphoimager. Получения 16 битов дигитален файл се конвертира в TIF формат и образът се анализира, като се използва Arrayvision софтуер (Imaging Research Inc.). За всяка проба се измерват пикселовия • · · · · ♦4 * • ·· · · ···· · · 4 4 4 ’43 - : ::

··’··· ·♦ »··» ·· интензитет на 384 гении места, дублирано разположени върху филтъра. Фоновия сигнал се изважда и се получава средният пикселов интензитет за всяка двойка от местата, получени в редица (= експресионното ниво).

Потвърждаване на резултатите от microarray на избрани гени, чрез RT-PCR.

pg от тотална РНК от проба на всеки пациент се подлага на обратна транскрипция, като се използва олиго dT праймер (Promega) в 20 μΐ обем на реакционна смес, включваща 5 тМ MgC12, 10 тМ Tris-HCl, 50 тМ КС1, 0.1 % Triton Х-100, 1 тМ от всеки от dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.5 единици рекомбинантен рибонуклеазен инхибитор RNasin (Promega) и 15 единици AMV обратна транскриптаза (Promega). Реакционната смес се инкубира при 42° С в продължение на 60 min, нагрява се при 95° С в продължение на 5 min, след което се разрежда до 200 μΐ със стерилна вода. Разрежданията на реакционната смес за обратна транскрипция след това се подлагат на real time PCR анализ върху Taqman (РЕ Applied Biosystems 7700) като се използват специфични праймерни двойки, създадени за всеки от гените, като се използва Primer Express софтуер (РЕ Applied Biosystems) въз основа на база данни с номер за достъп, даден от производителя на генетичния филтър. Резултатите са нормализирани спрямо експресията на housekeeping гена глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) във всяка проба и са изразени като кратни промени, определени чрез разделяне на стойност на експресия на проба на анормален пациент, спрямо съответна проба, от нормален пациент.

• · · · ·· ·· «· · ··· · · · · · * 6 «·· · *

Статистически метод за предсказване на гени, свързани със склеродерма

Проведен е статистически метод за предсказване на гени, свързани със склеродерма, чрез съседен анализ и клас предсказване, както е описано подробно в Golub et al., 1999, който е напълно включен тук в цитираната литература.

Резултати

Gene filter microarray анализът се провежда върху нормални и анормални фибробластни проби от 7 пациента със склеродерма. Средното ниво на експресия на SARP-1 кДНК за всяка проба от пациент е показано на Фигура 1 А, медианата на експресия е показана на Фигура 1 В. Средната стойност и стойностите на медианата се различават значително между нормални и анормални клетки, нормалното ниво на експресия на SARP-1 е по-високо от анормалното ниво на експресия. Медианите обикновено се използват когато се работи с проби от пациенти, тъй като те минимализират ефекта на многото варианти в една група. Тук, анормалните фибробласти експресират значително по-ниски нива от SARP-1 иРНК в сравнение с нормалните фибробласти в 5 от 7 анализирани пациента.

Резултатите, получени от microarray анализа са след това потвърдени чрез real time PCR анализ на проби от пациенти, като се използват SARP-1 специфични PCR праймери. Резултатите са показани на Фигура 2 и са изразени като кратна промяна в нивото на експресия (анормалните разделени на нормалните). В 6 от 8 ·· ···· анализирани пациента, SARP-1 се понижава най-малко 2 пъти в засегнатите фибробласти, в сравнение с нормалните фибробласти, взети от същия пациент. В останалите 2 пациента, нивото на експресия в нормалните фибробласти е сравнимо с това в анормалните.

Разликите в експресията, наблюдавани между нормалните и анормалните фибробласти от един и същ пациент не се дължат на разлики в условията на култивиране между двете популации, тъй като SARP-1 иРНК експресията в първичните култури от нормални човешки дермални фиблобласти не се променя значително при пасажиране на клетките (Фигура 3). В допълнение, real time RT-PCR анализа на тотална РНК, изолирана от всички видове биопсия на анормална кожа от пациенти със склеродерма, показва понижени нива на SARP-1 иРНК в сравнение с клинично нормални биопсии-контроли от същите анатомични места, на хора със същата възраст и пол (Фигура 4).

В допълнение на това е показано, че понижаването на SARP1 с 95 % вероятност е свързано с развитието на склеродерма, като се използват статистически методи.

Заключение

Резултатите описани по-горе показват, че има липса на SARP-1 в засегнати тъкани получени от пациенти със склеродерма, в сравнение със здрави тъкани, което показва че възстановяването на нормалното ниво на SARP-1 може да помогне при лечение на заболяването. Следователно, SARP-1 може да присъства в новите подходи на медицината за получаване на частично или пълно инхибиране на заболяването или най-малко на ·· «··· ··· a ·

• · · ·

един или повече симптоми на склеродермата, или за инхибиране на развитието на заболяването.

Пример 2

Клониране на пълната кДНК, кодираща секвенцията на човешки SARP-1.

Материали и методи *** Провеждат се последователни BLAST търсения върху човешкия dbEST (обществена EST база данни) като се започва със частичната кодираща секвенция на SARP-1 (EMBL номер за достъп: AF017986) и са получени съответните

ESTs, като се използва ENTREZ от http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Search/index.html. След това се свързват следните ESTs секвениции заедно е AFO17986 за да се получи пълната консенсусна кодираща секвенция на SARP-1 секвенцията: AW580647, AW608301, АА976403 и W92531.

Пълната дължина на кДНК кодиращата секвенция на SARP-1 *··» след това се клонира чрез PCR с обратна транскриптаза, като се използват следните праймери на базата на консенсусната секвенция, получена по-горе: SARP-1F 5’ GCC AAG СТТ ССС ACG ATG CTG CAG GGC ССТ (SEQ ID N0: 3) и SARP-1R 5’ GCG СТС GAG СТА GCA CTG CAG СТТ GCG GAT (SEQ ID N0: 4), 50 pmole от всеки в 50 μΐ реакционна смес, съдържаща 0.3 mM dNTPs, 1 mM MgS04, 5 μΐ от кДНК матрица от нормални човешки дермални (кожни) фибробласти (получена както е описано по• · · · · · • · · · · · • · · · · ···· · горе), 5 μΐ от 10Х Pfx буфер за амплификация (Life Technologies) и 1 μΐ от Platinum Pfx DNA полимераза (Life Technologies). Реакционната смес се нагрява при 94° С в продължение на 2 min и след това се подлага на 35 PCR цикъла както следва: 94° С 15 s, 55° С в продължение на 30 s и 68° С в продължение на 1 min. Продуктите от амплификацията се анализират върху 1 % агарозни гелове в 1 X ТАЕ буфер (Life Technologies) и PCR продуктите, придвижили се до местата на предсказаните молекулни маси (906 Ьр) се пречистват от гела, като се използва Wizard PCR кит за пречистване (Promega).

100 ng от пречистената от гела ДНК се подлага на ензимно разграждане с рестриктазните ензими Hindlll и Xhol (Pharmacia), съгласно условията на производителя, пречиства се отново както е описано по-горе и след това се лигира с Hindlll/Xhol ензимно разграден плазмид pcDNA3.1(+) (Invitrogen), като се използва Т4 DNA лигаза (New England Biolabs), съгласно стандартни техники на молекулярната биология. Продуктите от лигирането се трансформират в E.coli щам ТОР 10 F’ (Invitrogen) чрез електропорация, като се използва Biorad Gene Pulser. Плазмидната ДНК се изолира от 5 ml култури, отглеждани от получените колонии и се подлага на анализ на автоматично секвениране върху Applied Biosystems 3700 секвенатор, като се използват Т7 и pcDNA3.1AS праймери (Invitrogen) за да се потвърди секвенцията на SARP-1.

• ··· · · ·· *· • · · · · · · • ··· · ···· · · .:.. ...· 48..· ·,.^:'·,/

Резултати

За да се характеризира in vitro и in vivo активността на SARP-1 се клонира пълната кодиращата секвенция на човешка кДНК. Част от кДНК секвенцията на човешки SARP-1 (EMBL номер за достъп AF017986) се използва за да се идентифицират ESTs припокриванията в dbEST обществената база данни, като се използва програмата BLAST. Пълната дължина на кДНК кодиращата секвенция се сглобява от следните секвенции с номера за достъп: AF017986 AW580647, AW608301, АА976403, и w W92531. Пълната дължина на ДНК секвенцията и получената по пътя на дедукция аминокиселинна секвенция на SARP-1 са показани на Фигура 5А и В (А и В трябва да бъдат четени по непрекъснат начин). Клонирана е кДНК кодиращата секвенция на SARP-1, чрез PCR с обратна транскриптаза, като се използват праймери, фланкиращи предсказаните старт и стоп кодони. Секвенционният анализ на получените SARP-1 кДНК клонове показва 93 % идентичност на нуклеотидно ниво с публикуваната секвенция на миши SARP-1 (Melkonyan et al., 1997) и 95 % идентичност с мишата секвенция на аминокиселинно ниво. Съпоставянето на аминокиселинните секвенции на човешкия и мишия SARP-1 са показани на Фигура 6. Предсказаната белтъчна секвенция е от 295 аминокиселини заедно с предсказания сигналния пептид от 20 или 24 аминокиселини, като се използвани съответно програмите SIGNALASE (Von Heijne, 1986) или SIGNALP, виж стрелките във Фигура 5 А. Разликите в аминокиселините между човешката и мишата секвенции са маркирани на Фигура 6, както и се намират в N-крайния сигнален

• · ·

пептид (4 аминокиселини) и в секвенцията на зрелия белтък (2 аминокиселини).

SEQ ID NO: 1 от приложения списък на секвенциите, съдържа кодиращата верига на човешката SARP-1 кДНК, a SEQ ID N0: 2 съдържа аминокиселинната секвенция на човешки SARP-

1. Мишата аминокиселинна секвенция е илюстрирана в SEQ ID N0: 5 от приложения списък на секвенциите.

Пример 3

Чет

N-крайна секвенция на човешки SARP-1

Предсказаният SARP-1 сигнален пептид е дълъг 20 или 24 аминокиселини (виж Фигура 5А). За да се потвърди коректният Nкрай на зрелия SARP-1, се експресира рекомбинантен SARP-1 съдържащ шест tag хистидинови остатъка в НЕК-293 клетки и се пречиства върху никел-хелатна колона. Пречистеният белтък, който се придвижва като 32kDa ивица в SDS-PAGE, отговаря на масата, измерена чрез MS, която е 34313 Da.

L N-крайните секвенции на пречистеният рекомбинантен белтък са получени, като се използва Applied Biosystems модел 494 белтъчен секвенатор е пул сова течна фаза, модел 148С on-line фенилтиохидантен аминнокиселинен анализатор, съгласно Maundrell et al. (1997). Накратко, пречистения SARP-1 се подлага на разграждане в продължение на една нощ, чрез инкубация на 37° С в 90 μΐ от 100 mM Tris-HCl pH 8.5, съдържащ 1 М уреа, 20 тМ метиламин, 1 тМ дитиотриетол и 5 pg трипсин (Boehringer Mannheim, със степен на чистота за секвениране). Пептидите се « · • · разделят чрез HPLC с обърната фаза (Hewlett Packard HP 1090) с Brownlee Cl8 колона (220 * 2.1 mm). Пептидите се елюират с ацетонитрилов градиент (в 0.1 % трифлуорооцетна киселина) от Одо 55 % в продължение на 60 min, последвано от 55-70 % в продължение на 5 min. Фракциите от елюирането се събират и радиоактивно белязаните с Р фосфопептиди, идентифицирани чрез сцинтилационна спектрометрия, се секвениранат чрез Edman разграждане, като се използва Applied Biosystems модел 494 белтъчен секвенатор с пулсова течна фаза, модел 148С on-line фенилтиохидантен аминокиселинен анализатор.

Секвенцията GLFLFGQPDFSYK се получава чрез тандемна мас спектрометрия върху ензимно разградените продукти на редуцирания и алкилиран белтък. Анализите се провеждат върху Q-TOF мас спектрометър (Micromass UK Limited, Manchester, UK) оборудван c Nano-Spray йонен източник, както е описано от Cavalli et al., 2001. Накратко, един микрограм от пречистения белтък се разделя чрез 10 % SDS-PAGE. Белтъчните ивици, се изрязва от оцветения със сребро гел и се подлагат на ензимно разграждане в гела, с трипсин (Shevchenko et al., 1996). Екстрахираната пептидна смес се анализира чрез секвениране с тандемна мас спектроментрия (Wilm et al., 1996), като се използва Q-TOF мас спектрометър (Micromass, Manchester, UK) оборудван с нано-електроспрей йонен източник.

Резултати

Теоретичната N-крайна секвенция на не-зрелия SARP-1 е както следва:

• · · · • · • · • · · ·

5t

MLQGPGSLLLLFLASHCCLG SARGLFLFGQPDFSYKRSNC KPIPANLQLC ...

Позицията на 2 рото предсказано сигнално място на късане е между остатъци 24 и 25 (G и L).

При провеждането на експериментите за секвениране е намерена значителна хетерогенност в N-края на SARP-1.

В един експеримент, са намерени две главни секвенции една започваща с FGQPD, т.е. започваща в аминокиселина 28 от SEQ ID NO: 2 и друга, която започва с LFGQPD, т.е. започваща от аминокиселина 27 от SEQ ID NO: 2.

В допълнение в различно пречистените партиди са намерени секвенции:

LFLFGQPDFS FLFGQPDFS LFGQPD. FGQPD (започва от аминокиселина 25) (започва от аминокиселина 26) (започва от аминокиселина 27) (започва от аминокиселина 28)

Съществува и друга секвенция, която започва от аминокиселина 37: RSNCKPIPAN. Тази секвенция се дължи на ензимно късане след лизинов остатък (tryptic подобно късане).

В допълнение, друг експеримент показва секвенция, която започва в позиция 24:

GLFLFGQPDFSYK

Следователно, N-краят изглежда че е много хетерогенен, което може да се дължи на ендопептидазна или протеазна активност присъща в SARP-1. Зрелият SARP-1 може да се среща в няколко различни варианта с различни N-краища.

Пример 4

Трансфекцията на SARP-1 индуцира апоптоза in vitro Методи

Фибробластни клетъчни линии (миши NIH3T3 клетки и човешки AG1518 клетки) и първични фибробластни култури (нормални човешки дермални фибробласти пасаж 1-5) (Promocell) са трансфектирани с плазмид pcDNA3.1, включващ SARP-1 кДНК кодиращата секвенция или само с pcDNA3.1 (празен вектор - mock трансфектирани, като негативна контрола), като се използва както Geneporter 2 (Gene Therapy Systems, San Diego) или Fugene 6 (Life Technologies) реагенти за трансфекция, съгласно препоръките на производителя. Апоптозата се измерва, 24 h след трансфекцията, като се изплозва TiterTacs 96 ямков кит за анализ на апоптоза от R&D systems и клетките се преброяват, като се използва CyQuant оцветител (Molecular Probes), съгласно инструкциите на производителя.

Резултати

За да се оцени ефекта на SARP-1 върху фибробластите, се • · • · · · анализират фибробластна клетъчна линия трансфектирана с SARP-1 кДНК и степента на апоптоза. Резултатите са показани на Фигура 7. Апоптозата в SARP-1 трансфектираните клетки се редуцира значително (Р = 0.0009) в сравнение с mock (pcDNA3.1) трансфектираните клетки, което показва че човешкия SARP-1 има активност, подобна на тази, съобщена за неговия миши хомолог. Базалното ниво на апоптоза се определя в не-трансфектирани клетки. Нуклеазно третирани NIH ЗТЗ клетки служат като положителна контрола. Колоната “небелязани” показва фоновото ниво на оцветяване, а третираните с нуклеаза (“нуклеазно третираните”) служат като позитивна контрола.

Пример 5:

Ефект на SARP-1 върху продукцията на TGFQ1

TGF βΐ е профибротичен цитокин, който се повишава при склеродерма и отдавна се свързва с патогенезата на склеродерма (Kawakami et al., 1998). За да се анализира, дали SARP-1 подтиска или инхибира продукцията или секрецията на TGFpl от фибробластите, SARP-1 може да се добави към фибробластни култури под формата на пречистен белтък. От друга страна, може да се трансфектира експресионен вектор, включващ SARP-1 кДНК в клетъчни линии, за да се получи значително количество SARP-1 в клетъчната култура. Друга възможност е да се добави среда от SARP-1 експресиращи клетки, която може да бъде концентрирана за да се постигнат достатъчни количества от SARP-1 към фибробластните култури. В този експеримент могат да бъдат • · • · • « *··· • · • · · · t

• ·

използвани фибробластните клетъчни линии или първичните фибробласти, получени от здрави или болни индивиди или от нормални или засегнати участъци от кожата на пациенти със склеродерма. Количеството на TGFpi може да се измери, чрез ELISA в кондиционирана среда от култивирани клетки, като се използва Quantikine ELISA system за TGFpl от R&D systems (cat. no. DB100).

Пример 6:

Ефект на in vitro прилагането на SARP-1 върху активността на ММР-1 в човешки фибробласти

Методи

Субклонира се кДНК на човешкия SARP-1, включваща кодиращата последователност за 6XHis tag в 3’ края в бакуловирус вектор за пренос pDEST Fastbac. С-крайният 6XHis tag свързан SARP-1 се получава в Sf5 клетки от насекоми, инфектирани с рекомбинантен бакуловирус и се пречиства чрез Ni-NTA афинитетна хроматография.

Човешки фибробласти с малък брой пасажи (2-5), получени от кожа с лезии или от кожа без лезии от пациенти със склеродерма или от нормални лица, се третират с 0, 100 или 1000 ng/ml рекомбинантен SARP-1 в продължение на 24 h. Кондиционираната среда се събира и клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране при 1200 rpm в продължение на 10 минути на 4° С. ММР-1 активността се измерва в не-разредена • Φ · 4 • · · ·

Φ

Φ · Φ Φ

културална среда, като се използва ММР-1 fluorokine кит (закупен от R&D systems), съгласно протокола на производителя. В същите проби се измерва също така ММР-9 активността.

Резултати

ММР-1 е отговорна за разграждането на тип I колаген, което показва, че намаляването на ММР-1 активността е допринасящ фактор за един от дефектите, които са в основата на склеродерма, който включва отлагане на колаген в излишък.

Дермалните фибробласти от пациенти със склеродерма имат намалено ниво на експресия на ММР-1 и на нивото на иРНК и на ниво белтък в сравнение с нормалните дермални фибробласти от кожа без лезии, изолирани от един и същия пациент. Въпреки че се забелязва, че тоталната активност на ММР-1 варира значително от пациент до пациент, SARP-1 третираните фибробласти, показват повишена активност на ММР-1 от не-третираните фибробласти и при анормални фибробласти от пациенти със склеродерма (Фигура 8 A, D, F), и също така във фибробласти получени от не-засегната здрава кожа на пациенти със склеродерма (Фигура 8 Е) и във фибробласти от клинично нормални контролни индивиди (Фигура 8 В и С). Резултатите са представени като средни стойности от три повторения. За разлика от ММР-1, не се наблюдава ефекта на SARP-1 върху активността на ММР-9 (данните не са показани).

· · · ·· ₉ ♦··· · · · · · · ·φ * ♦♦··«♦·♦·φ .· · RR · · ····· ···· ··· UL* · «· ,· _φφ

Пример 7

Трансфекцията със SARP-1 ДНК намалява активността на колаген тип 1а2 промотора в NIH3T3 фибробласти

Материали и методи

NIH3T3 клетките се поддържат в DMEM, съдържаща 2 тМ глутамин, 100 единици/ml пеницилин-стрептомицин и 10 % FCS и се оставят до 50 % конфлуентност в 96 ямкови съдове за култивиране със бели стени (Wallac). На следващия ден, клетките се ко-трансфектират с pcDNA3.1 SARP-1 и pGL3 вектор (Promega), съдържащ 3.5 kb колагенов промотор и луциферазен репортерен ген (любезно предоставен от Dr. David Abraham, Royal Free Hospital), като се използва Geneporter реагент за трансфекция, съгласно инструкциите на производителя. TGFp (R&D systems, 5ng/ml) се добавя 30 h след трансфекцията. Луциферазната активност се измерва директно във всяка ямка след 24 - 36 h, като се използва Bright-Glo система за анализ, закупен от Promega.

Резултати

За да се оцени, дали има връзка между свръх експресията на SARP-1 и синтезата на колаген, изследва се ефекта на трансфекцията на SARP-1 кДНК върху активността на колагеновия промотор в NIH3T3 фибробласти, ко-трансфектирани с Со11а2 промотор-луциферазен репортерен конструкт.

• · • · ··· ··· · · • · · · · ···· · ·· • · · · · ♦ · · · ·· .L. · R*7 · * · · · ·· ···· ··· υ/«· φ· ₉₉₉₉

Котрансфекцията със SARP-1 кДНК с колагеновия промотор-луциферазен репортерен плазмид показва, че SARP-1 е способен да подтисне не само базалната активност на колагеновия промотор, но също така и на TGFp индуцираното повишаване на активността на колагеновия промотор (Фигура 9). Тези резултати предполагат, че SARP-1 генния продукт може да бъде включен в in vitro регулацията на активността на колагеновия промотор или директно или индиректно, чрез SARP-1 медиирани сигнални събития.

Друг начин за анализиране на ефекта на SARP-1 върху колагеновото отлагане и/или синтеза и/или секреция във фибробласти е добавянето на пречистен SARP-1 към фибробластни култури. От друга страна може да се трансфектира експресионен вектор, включващ SARP-1 кДНК във фибробластите, за да се получи достатъчна концентрация на SARP-1 в клетъчната култура.

Друга възможност е да се добави среда от SARP-1 експресиращи клетки, която може да се концентрира, за да се получат достатъчни концентрации от SARP-1 към фибробластните култури. В този експеримент могат да се използват фибробластни клетъчни линии или първични фибробласти, получени от здрави или болни индивиди или от нормални или засегнати участъци на кожата от пациент със склеродерма

Колагеновата синтеза може да бъде измерена in vitro в култивирани човешки фибробласти, като се използва capture ELISA system (антителата са закупени от Southern Biotechnology Associates Inc) както е описано от Shi-wen et al., 1997.

• · • ·

38.·

Пример 8

Човешките дермални фибробласти сврх-експресиращи SARP1 или третирани с рекомбинантен човешки SARP-1 показват променена иРНК експресия на гени свързани с патологията на склеродерма

Материали и методи

Нормалните човешки дермални (кожни) фибробласти се култивират във културална среда за отглеждане на фибробласти (Promocell). Фибробластите са третирани с рекомбинантен човешки SARP-1 (100 ng/ml) в продължение на 4 или 24 h в присъствие и отсъствие на човешки TGFpi. Клетките се събират след периода на третиране и се изолира тотална РНК, като се използва реагента TrizolTM (Life Technologies) съгласно инструкциите на производителя. Приготвя се маркирана с 32РdATP кДНК сонда от РНК, както е описано по-горе и се хибридизира с R&D sytems човешки цитокинов gene filter array и се обработва, както е описано по-горе.

Резултати

Въпреки, че SARP-1 първоначално е описан като отнасящ се до апоптозата белтък, неговата точно определена функция е неизвества. За да се хвърли светлина върху ролята на SARP-1 при склеродерма, ефекта на третирането със SARP-1 на предварително третирани с TGFP човешки дермални фибробласти, които • ·9

99 • 999

99 имитират фенотипа на склеродерма, се измерва генната експресия на фибробластите.

Таблица IV показва иРНКи, засегнати от третирането на фибробластите с рекомбинантен SARP-1 след предварително стимулиране в продлжение на 4 h с TGFa, които се използват да имитират фенотипа на склеродерма. Клетките се третират със SARP-1 в продължение на 24 h. При тези условия, TGFa и FGF 5 се подтискат. Наблюдават се намалена експресия на ендотелин, TGFpl свързващ белтък и повишена експресия на фурин, протеаза свързана с активирането на матрискните металопротеази. Друга иРНК, която се подтиска е на TARC. Този хемокин е свързан с възстановяването на Т клетките, които се намират в местата на кожно възпаление. Ето защо е възможно, прилагането на SARP-1 да има анти-възпалителни ефекти. Наблюдава се също повишаване на иРНК за субединицата TNFR1. Значението на това наблюдение е неясно, тъй като изглежда че има противоречия в научната литература, по въпроса дали TNF има патогенна или защитна роля в склеродерма.

В друг експеримент (не показан), се анализира регулацията на гените във фибробласти от пациенти със склеродерма, в сравнение със здрави контролни фибробласти. Интересно е, че е намерено че регулираните гените показани на Таблица IV са регулирани в проби от склеродерма. Намерено е, че тези гени, които повишават активността си във фибробласти от склеродерма, понижават активността си след експресията на SARP-1 в горния модел и тези гени, намерени че понижават активността си е намерено че повишават активността си след експресията на SARP-1 в по-горния модел, по-нататък показват че

• ft

SARP-1 може да има благоприятен ефект при лечение на склеродерма.

ТАБЛИЦА IV

Съотношение*	TGFp третиране	TGFP + SARP-1 третиране	Ген
- 1.6	1346	830	FGF-5
-2.7	788	297	Ендоглин
3.3	157	515	TNFRI
3.3	128	428	Фурин
-4.6	275	60	TGF-a
-4.7	164	34	TARC

* Съотношението SARP-1/mock представлява съотношението TGFa+SARP-Ι третирани/третирани само с TGFoc.

Показаните резултати се базират на два независими експермента.

Пример 9

Оценка на in vivo ефектите на SARP-1 в миши модел на заболяването

Блеомицин-индуцираното белодробно увреждане е прието като модел за склеродерма. Заболяването се индуцира чрез интратрахеално прилагане на блеомицин (Hattori et al., 2000). Третираните мишки развиват възпалителен отговор в белите дробове (максимум около ден 7), който се последва от фибрози, ·· ···· • · ·· ···· ··»· ··· 61··* чиито пикове са около ден 14 след индукцията. Този модел е използван за оценка на ефекта на in vivo прилагане на SARP-1 върху развитието на белодробни фибрози. Използва се клетъчна система за доставяне за in vivo получаване на SARP-1 (NIH3T3 клетки, трансфектирани с пълната дължина на SARP-1 кДНК).

Методи

Третиране на животните

Индуцират се белодробни фибрози в мишки (20-25 g), чрез интра-трахеално прилагане на блеомицин (0.075 Ш) във солеви разтвор на ден 1. Мишките се разделят на 4 отделни групи от 10 животни. Едната група получава i.p. инжекция от ΙΟ⁶ NIH3T3 клетки, трансфектирани със SARP-l/pcDNA3.1. Втората група получава 10⁶ mock - трансфектирани (pcDNA3.1 вектор) NIH3T3 клетки. Третата група получава 250 pg от анти-ТСБр антитяло (Anti Pan TGFP: Sigma cat. no. T9429), а мишките в последната група получават солеви разтвор. Всичките мишки се убиват на ден 14 и белите им дробове се фиксират с формалин, включват се във парафин за хистологично изследване. Белодробните срези се оцветяват е три-хром или пикро сириусово червено за колаген (Bancroft J.D. and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques) и се оценява степента на фиброза за един бял дроб.

Трансфектиране на NIH3T3 клетки

NIH ЗТЗ клетките се трансфектират със SARP-l/pcDNA3.1 или pcDNA3.1, като се използва Geneporter 2 реагент, както е описано преди това. Двадесет и четири часа след трансфекцията, ···· културалната среда се отстранява и клетките се третират с фофатно солеви буфер (PBS) съдържащ 1 mM EDTA, в продължение на 5 минути при 37° С. Клетките се откачат внимателно със клетъчен ръбър (Costar), центрофугират се в продължение на 5 min при 4° С за да се утаят клетките и се ресуспендират в солеви разтвор със степен на пречистване за инжекция в концентрация 10 клетки /ml.

Резултати

SARP-1 има защитно действие при блеомицин индуцираната белодробна фиброза.

Животните, третирани само с блеомицин или с mock трансфектирани NIH3T3 клетки развиват значителни белодробни фибрози (не е показано). TGFpi се счита че е едно от ключовите средства, отговорно за патологичните промени водещи до фиброза. Преди това е показано, че анти- TGF31 поликлонално антитяло има защитно действие срещу развитие на белодробни фибрози, когато се прилага профилактично (Yamamoto et al., 1999) и също така намалява кожните фибрози в GvHD модел на склеродерма (McCormick et al., 1999). Ето защо, това антитяло се използва, като положителна контрола в тези експерименти. Третираните с aHTH-TGFp мишки не развиват обширни фибрози на белите дробове. Мишките третирани със SARP-1 трансфектирани клетки имат значително редуциран брой фиброзни лезии в белите дробове, в сравнение с мишките третирани само с блеомицин или с mock трансфектирани клетки. Ефектът е сравним или даже е по• · · · · · «а ·« *· • · · · · · « • · · · · ···· »

.....· 68..· добър от този, който се наблюдава при анти- TGFp третирането (не е показано).

Хистологичният анализ на белите дробове показва, че третираните със SARP-1 животни имат близка до нормалната морфология на белите дробове, с леки възпалителни инфилтрати и предимно нормална архитектура. Тази морфология наподобява морфологията на третирани с анти-ТСБр животни и е в голям контраст с анормалната морфология, наблюдавана в бели дробове от mock третирани и не-третирани животни. В последните 2 групи, алвеоларните пространства са изпълнени с клетъчни инфилтрати и отложен колаген (не е показано).

Количествата на фиброзни лезии в белите дробове от различните експериментални групи са показани на Фигура 10. Третираните със SARP-1 мишки съдържат значително малко фиброзни лезии, в сравнение с тези третирани със солеви разтвор или aHTH-TGFp третираните мишки.

Прилагането на блеомицин може да доведе до повишена смъртност. В допълнение на защитните ефекти на прилагането на SARP-1 срещу фиброза, е показано също така, че по-голям брой от мишките преживяват третирането (8/10 мишки) в сравнение с тези третирани със солеви разтвор (6/10), с тези третирани с анти-TGFp (4/10) и мишките третирани с mock (3/10). Следователно третирането със SARP-1 даже защитава от смърт в модела на белодробни фибрози, което показва че третирането със SARP-1 е значително по-добро от третирането със TGFP при тази експериментална установка.

В заключение, при този установен in vivo модел на склеродерма е показан благоприятният ефект на SARP-1.

• · • · · · ···· ·· ·· ·· • · · ··· · · · • · · · · · · · · · · ·

Други in vivo модели могат да бъдат използвани за да се анализира ефекта на прилагане на SARP-1, като мишия модел за склеродерма заболяването склеродерматоус донор-срещуреципиент (Sci GVHD). Този модел възпроизвежда важни характеристики на склеродермата, включващи кожно удебеляване, белодробни фибрози и повишаване на кожната колагенова иРНК, което се предшества от моноцитни инфилтрати и повишаване на кожната TGF-бета 1 иРНК. Моделът е описан подробно от (McCormick LL et al., 1999).

Пример 10

Доставяне на SARP-1 до целия организъм, чрез интрамускулна инжекция на експресионна плазмидна ДНК

За да се покаже ролята на SARP-1, като защитен фактор при склеродерма, мишките се трансфектират in vivo с плазмид, кодиращ миша SARP-1 кДНК и се сравняват с мишки, трансфектирани с празен плазмид, като контрола.

Q Плазмидите се инжектират и в тибиалните краниални мускули на анестезирана мишка, както е описано преди това (Dimmeler et al., 1997; Mir et al., 1999). Накратко, транскутанеусни електрични импулси (8 квадратни вълнови електрични импулси от 200 V/cm, с продължителност 20 msec при 2 Hz) се доставят чрез PS-15 електропулсатор, като се използват два плоски електрода от неръждаема стомана, които се поставят на разстояние от 4.2 до 5.3 mm от всяка страна на крака.

След това, блеомицин-индуцираната белодробна фиброза се наблюдава, както е обяснено в предишния пример и развитието на болестта се наблюдава и в SARP-1 трансфектирани и в mock трансфектирани животни.

σ*’*-

• « · ·

ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА

1. Abraham D., Lupoli S., McWhirter A., Plater-Zyberk C., Piela T.H., Korn J.H., Olsen I. and Black C. (1991) Expression and function of surface antigens on scleroderma fibroblasts. Arthritis Rheum. 34, 1164-1172.

2. Abraham DJ, Shiwen X, Black CM, Sa S, Xu Y, Leask A.J Biol Chem. 2000 May 19;275(20): 15220-5.

3. Adler P.N., Charlton J and Vinson C. (1987) Dev. Genet. 8, 99-119.

4. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402,1997

5. Bafico B.A., Gazit A., Pramila T., Finch P.w., Yaniv A. and Aaronson S.A. (1999) Interaction of frizzled related protein (FRP) with Wnt ligands and the frizzled receptor suggests alternative mechanisms for FRP inhibition of Wnt signalling. J.Biol. Chem. 274,16180-16187.

6. Bancroft J.D. and Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingstone, England.

7. Banyai L. and Patthy L. (1999) The NTR module: domains of netrins, secreted frizzled related proteins and type I procollagen Cproteinase enhancer protein are homologous with tissue inhibitors of metalloproteases. Protein Sci. 8,1636-1642.

8. Black C.M and Denton C.P. (1998) Systemic sclerosis and related disorders. In “Oxford textbook of Rheumatology” (P.G. Maddison, D.A. Isenberg, P.Woo and D.N. Glass, Eds.) pp 771-789, Oxford Univ. Press, New York.

9. Cavalli V, Vilbois F, Corti M, Marcote MJ, Tamura K, Karin M, Arkinstall S, Gruenberg J. Mol Cell 2001 Feb;7(2):421-32 • · · · · · • ··· · ···· е

10. Chang, J. T.; Esumi, N.; Moore, K.; Li, Y.; Zhang, S.; Chew, C.; Goodman, B.; Rattner, A.; Moody, S.; Stetten, G.; Campochiaro, P. A.; Zack, D. J. : Cloning and characterization of a secreted frizzledrelated protein that is expressed by the retinal pigment epithelium. Hum. Molec. Genet. 8: 575-583, 1999

11. Clements P.J. and Furst D.E. (1996) “Systemic Sclerosis” Williama and Williams, Baltimore.

12. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

7. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized lowdensity lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.

13. Finch P.W., He X., Kelley M.J., Uren A., Schaudies R.P., Popescu N.C., Rudikoff S., Aaronson S.A., Varmus H.E. and Rubin J.S. (1997) Purification and molecular cloning of a screted frizzled related antagonist of Wnt action. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6770-6775.

14. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri., MA, Bloomfield CD, Lander ES (1999) Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286, 531-7.

15. Grantham (1974), Science, 185. 862-864.

16. Hattori N., Degen J.L., Sisson T.H., Liu H., Moore B.B., Pandrangi R.G., Simon R.H. and Drew A.F. (2000) Bleomycin induced pulmonary fibrosis in fibrinogen null mice. J. Clin. Invest. 106,1341-135 • · • « • · · ·

17. Kawakami T., Ihn H., Xu W., Smith E. , LeRoy C. and Trojanowska M (1998) Increased expression of TGF beta receptors by scleroderma fibroblasts: evidence for contribution of autocrine TGF-beta signalling to scleroderma phenotype. J. Invest. Dermatol. 10,47-51.

18. Krein, PM, Huang Y amd Winston BW (2001). Expert Opin. Ther. Patents 11(7): 1065-1079.

19. Leighton, C. Drugs 2001 61(3), 419-427.

20. Leimeister C, Bach A, Gessler M. Meeh Dev 1998 Jul;75(l2):29-42.

21. LeRoy E.C. (1974) Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts in vitro. J. Clin. Invest. 54, 880-889.

22. Lin K, Wang S, Julius MA, Kitajewski J, Moos M Jr, Luyten FP, Proc Natl Acad SciU SA 1997 Oct 14;94(21): 11196-200.

23. Martini, Maccario, Ravelli et al., Arthritis Rheum. 1999, 42, 807811.

24. McCormick LL, Zhang Y, Tootell E, Gilliam AC J. Immunol. 163(10) 5693 (1999).

25. Melkonyan H.S., Chang W.C., Shapiro J.P., Mahadevappa M., Fitzpatrick P.A., Kiefer M.C., Tomei L.D. and Umansky S.R. (1997) SARPs: a family of secreted apoptosis-related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13696-13641.

26. Miller J.R., Hocking A.M., Brown J.D. and Moon R.T. (1999) Mechanism and fuunction of signal transduction by the Wnt/ catenin and Wnt/Ca2+ pathways. Oncogene 18, 7860-7872.

8. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency • · • · · · ♦ · ···· ·« ·· • · · · · · ···· · · »·· gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.

9. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

10. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 24442448,1988

27. Rattner A., Hsieh J-C., Smallwood P.M., Gilbert D.J., Copeland N.G., Jenkins N.A., Nathans J. (1997) A family of secreted proteins contain homology to the cysteine rich ligand binding domain of frizzled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,2859-2863.

28. Shevchenko A., Wilm M., Vorm 0. and Mann M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem., 68:850-858

29. Silman A.J. (1991) Moratlity from scleroderma in England and Wales 1968-1975. Ann. Rheu. Dis. 50, 95-96.

30. Shi-wen X., Denton C.P., McWhirter A., Bou-Gharios G., Abraham D.J., du Bois R.M. and Black C.M. (1997) Scleroderma lung fibroblasts exhibit elevated and dysregulated collagen type I biosynthesis. Arthritis Rheum. 40, 1237-1244.

31. Shi-wen X., Denton C.P., Dashwood M.R., Holmes A., BouGharios G.,Pearson J.D., Black C.M. and Abraham D.J. (2000) Fibroblast matrix gene expression and connective tissue remodelling: role of endothelin-1. J. Invest. Dermatol, (in press).

32. Smalley M.J. and Dale T.C. (1999) Wnt signalling in mammalian development and cancer. Cancer and Metastasis Rev. 18, 215-230.

33. Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2,482-489,1981.

34. Strehlow D. and Korn J (1998) Biology of the scleroderma fibroblast. Curr. Opin. Rheumatol. 10, 572-578.

··· φφφφ · · • · Φ Φ · 4 φφφφ φ · · * 70 · · ·*· ··· ······· ’ Ό φφ ····

35. Smith, Textbook of the Autoimmune Diseases, Edited by Lahita, Chiorazzi and Reeves, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2000.

36. Von Heijne G. (1986) Nucleic Acids Res. 14,4683-4690.

37. Wigley F. M. and Sule S. D. (2001) Expert Opinions on Investigational Drugs 10(1) 31-48.

38. Wigley F.M. and Boling C.L. (2000) The treatment of scleroderma. 2,276-292.

39. Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve T., Breit S., Schweigerer

L., Fotsis T. and Mann M. (1996) Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano- electrospray mass spectrometry. Nature, 379:466-469

40. Yamamoto T.S., Takagawa L., Katayama I. and Nishioka K. (1999) Anti-sclerotic effect of transforming growth factorantibody in a mouse model of bleomycin induced scleroderma. Clin Immunol. 92, 6.

Claims (29)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Използване на субстанция, която се свързва с и инициира предаване на сигнала на човешкия SARP-1 рецептор или субстанция, която стимулира освобождаването или повишава активността на ендогенен SARP-1, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
2. 2. Използване на субстанция, избрана от групата, включваща:

   (а) Зрял SARP-1;

   (б) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

   (в) Полипептид, включващ аминокиселини 21 до 295 от SEQ ID NO: 2;

   (г) Полипептид, включващ аминокиселини 24 до 295 от SEQ ID N0:2;

   (д) Полипептид, включващ аминокиселини 25 до 295 от SEQ ID N0:2;

   (е) Полипептид, включващ аминокиселини 26 до 295 от SEQ ID N0:2;

   (ж) Полипептид, включващ аминокиселини 27 до 295 от SEQ ID N0: 2;

   (з) Полипептид, включващ аминокиселини 28 до 295 от SEQ ID N0: 2;

   (и) Полипептид, включващ аминокиселини 37 до 295 от SEQ ID N0: 2;

   (й) Мутеин на всеки от (а) до (и), където аминокиселинната секвенция има най малко 40 % или 50 % или 60 % или 70 % или 80

   ....... . . ; ·,

   72..··..· ·..··..· % или 90 % идентичност най-малко с една от секвенциите в (а) до (и) ;

   (к) Мутеин на всеки от (а) до (и), който е кодиран от ДНК секвенция, която хибридизира с комплементарна секвенция на нативната ДНК, кодираща всеки от (а) до (и) при условия на средна степен на хибридизация и при условия на висока степен на хибридизация;

   (л) Мутеин на всеки от (а) до (и), където всички промени в аминокиселинната секвенция са консервативни аминокиселинни замествания на аминокиселинните секвенции в (а) до (и);

   (м) Сол или изоформа, рекомбинантен белтък, функционално производно, активна фракция или циклично пермутирано производно на всеки от (а) до (л).

   за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
3. 3. Използване, съгласно Претенции 1 или 2, където субстанцията е гликозилирана на едно или повече места.
4. 4. Използване, съгласно която и да е от предишните Претенции, където, рекомбинантният белтък включва рекомбинантен имуноглобулин (Ig).
5. 5. Използване, съгласно всяка една от Претенции от 2 до 4, където функционалното производно включва поне една група, прикрепена към една или повече функционални групи, които се срещат като една или повече странични вериги в аминокиселинните остатъци.
6. 6. Използване, съгласно Претенция 5, където групата е полиетиленова група.
7. 7. Използване на молекула нуклеинова киселина за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма, където молекулата нуклеинова киселина включва секвенция на нуклеинова киселина, кодираща полипептид, включващ аминокиселинна секвенция избрана от групата съставена от:

   (а) Зрял SARP-1;

   (б) Полипептид, включващ SEQ ID NO: 2;

   (в) Полипептид, включващ аминокиселини 21 ДО 295 от SEQ ID N0: 2; (г) Полипептид, включващ аминокиселини 24 до 295 от SEQ ID N0: 2; (д) Полипептид, включващ аминокиселини 25 до 295 от SEQ ID N0: 2; (е) Полипептид, включващ аминокиселини 26 до 295 от SEQ ID N0: 2; (ж) Полипептид, включващ аминокиселини 27 до 295 от SEQ ID N0: 2; (з) Полипептид, включващ аминокиселини 28 до 295 от SEQ ID N0: 2; (и) Полипептид, включващ аминокиселини 37 до 295 от SEQ ID

   NO: 2;

   (й) Мутеин на всеки от (а) до (и), където аминокиселинната секвенция има най малко 40 % или 50 % или 60 % или 70 % или 80 % или 90 % идентичност най-малко с една от секвенциите в (а) до (и) ;

   (к) Мутеин на всеки от (а) до (и), който е кодиран от ДНК секвенция, която хибридизира с комплементарна секвенция на нативната ДНК, кодираща всеки от (а) до (и) при условия на средна степен на хибридизация или при условия на висока степен на хибридизация;

   (л) Мутеин на всеки от (а) до (и), където всички промени в аминокиселинната секвенция са консервативни аминокиселинни замествания на аминокиселинните секвенция в (а) до (й);

   (м) Изоформа, рекомбинантен белтък или активна фракция на всеки от (а) до (л).
8. 8. Използване на вектор, включващ молекула нуклеинова киселина, съгласно Претенция 7, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
9. 9. Използване, съгласно Претенция 8, където векторът е експресионен вектор.
10. 10. Използване, съгласно Претенции 8 или 9, където векторът е вектор за генна терапия.
11. 11. Използване на вектор, за индуциране и/или увеличаване на ендогенната продукция на полипетид, съгласно всяка една от Претенции 1 или 2 в клетка, за приготвяне на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
12. 12. Използване на клетка, включваща вектор, съгласно всяка от Претенции от 8 до 11 за приготвяне на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
13. 13. Използване на клетка, експресираща субстанция съгласно всяка от Претенции от 1 до 4 за производството на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
14. 14. Използване на клетка, която е генетично модифицирана да продуцира полипетид, съгласно Претенции от 1 до 4, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от склеродерма.
15. 15. Използване, съгласно всяка една от предишните претенции, където склеродермата е склероза на целия организъм.

    « ·
16. 16. Използването, съгласно всяка една от предишните Претенции, където лекарственият препарат по-нататък включва интерферон за едновременно, последователно и поотделно приложение.
17. 17. Използването, съгласно Претенция 16, където интерферонът е интерферон-β.
18. 18. Използването, съгласно всяка една от предишните Претенции, където лекарственият препарат по-нататък включва антагонист на тумор некрозис фактора (TNF) за едновременно, последователно и поотделно приложение.
19. 19. Използването, съгласно Претенция 18, където TNF антагонистът е ΤΒΡΙ и/или ΤΒΡΙΙ.
20. 20. Използването, съгласно всяка една от предишните Претенции, където лекарственият препарат по-нататък включва анти-склеродермално средство за едновременно, последователно и поотделно приложение.
21. 21. Използването, съгласно Претенция 20, където анти- :Ρ· склеродермалното средство е избрано от групата, съставена от АСЕ инхибитори, блокери на калциев канал, инхибитори на протонна помпа, NSAIDs, COX-инхибитори, кортикостероиди, тетрациклин, трансферазни инхибитори, пентоксифилин, буциламин, геранилгеранил инхибитори, ротерлин, пролил-4-хидролазни с-протеиназни инхибитори, лизил-оксидазни инхибитори, релаксин, халофугинон, простагландини, простациклини, ендотелин -1, азотен оксид, ангиотензин II инхибитори и анти-оксиданти.

    включва вектор, включващ молекула нуклеинова киселина,
22. 22. Фармацевтичен състав характеризиращ се с това, че ··· · · · · · « • · · · · ft ft · ft · ft· • ··· ft ft ··· ft· • · 9c · · · · ft ·· ······· /Q· ·· ♦ · _e « съгласно всяка една от Претенции от 7 до 11, по избор заедно с един или повече фармацевтично приемливи носители, разредители или ексципиенти, за лечение и/или предпазване от склеродерма, по-специално от склероза на целия организъм.
23. 23. Фармацевтичен състав характеризиращ се с това, че включва клетка, експресираща полипептид, съгласно всяка една от Претенции от 1 до 4, по избор заедно с един или повече фармацевтично приемливи носители, разредители или ексципиенти за лечение и/или предпазване от склеродерма, поспециално от склероза на целия организъм.
24. 24. Фармацевтичен състав характеризиращ се с това, че включва субстанция, съгласно всяка една от Претенции от 1 до 6 в комбинация с анти-склеродермално средство, избрано от групата, съставена от АСЕ инхибитори, блокери на калциев канал, инхибитори на протонна помпа, NSAIDs, СОХ-инхибитори, кортикостероиди, тетрациклин, пентоксифилин, буциламин, геранилгеранил трансферазни инхибитори, ротерлин, пролил-4хидролазни инхибитори, с-протеиназни инхибитори, лизилоксидазни инхибитори, релаксин, халофугинон, простагландини, простациклини, ендотелин-1, азотен оксид, ангиотензин II инхибитори и анти-оксиданти.
25. 25. Използване на SARP-1 за лечение и/или предпазване от склеродерма, по-специално от склероза на целия организъм, включващо прилагане на пациент, който се нуждае от него на ефективно количество от субстанция, съгласно всяка от Претенции от 1 до 6, по избор заедно с фармацевтично приемлив носител.

    • ♦ • · ♦ · · 7*7 · · · ···· ··♦···· i r«· ·· »· ,«
26. 26. Използване на SARP-1 за лечение и/или предпазване от склеродерма, по-специално от склероза на целия организъм, включващо прилагане на пациент, който се нуждае от него на фармацевтичен състав, съгласно всяка една от Претенции от 22 до 24.
27. 27. Метод, съгласно претенции 25 или 26, характеризиращ се с това, че субстанцията или фармацевтичният състав се прилага на целия организъм.
28. 28. Метод, съгласно всяка една от Претенции 25 или 27, характеризиращ се с това, че субстанцията или фармацевтичният състав се прилага чрез интрамускулна инжекция.
29. 29. Метод, съгласно всяка една от Претенции 25 или 28, характеризиращ се с това, че субстанцията или фармацевтичния състав се прилага чрез инхалиране.