KR20060106810A - 염증 및/또는 자가면역 질환에서 가용성 ｃｄ164의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히, 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 인간 CD164의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 단백질의 신규한 치료 용도에 관계한다.

인간 CD164

Description

염증 및/또는 자가면역 질환에서 가용성 ＣＤ164의 용도{USE OF SOLUBLE CD164 IN INFLAMMATORY AND/OR AUTOIMMUNE DISORDERS}

본 발명은 염증과 자가면역 질환 분야, 특히, 염증 및/또는 자가면역 질환을 예방하거나 치료하는데 유효한 신규 단백질의 발견에 관계한다.

아래의 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 선행 기술로서 의도되지 않는다.

CD164는 당단백질의 뮤신-유사 수용체 또는 시알로뮤신 대과의 구성원이다. 시알로뮤신은 cDNA와 아미노산 수준에서 제한된 유사성을 보이는 50-3000 kD 범위의 막통과 당단백질이다. 뮤신-유사 발현된 단백질은 세린과 트레오닌 잔기에 연결된 다수의 O-당화를 보유하는 공통 특성을 공유하는데, 이는 다양한 종류의 세포-세포 또는 세포-세포외 매트릭스 상호작용을 공여한다. O-연결된 측쇄의 밀집된 어레이는 다수의 뮤신-유사 분자가 세포를 둘러싸는 폴리사카라이드 글리코칼릭스(glycocalyx)를 뛰어 넘어 돌출되게 하는 연장된 구조 및 말단 당의 최적 노출과 높은 다양성으로 특성화된다. 구조적 형태와 음성 전하로 인하여, 뮤신-유사 당단백질은 세포가 뮤신에 특이적인 수용체(부착)를 보유하지 않는다면, 배척 장벽으로 기능한다. 뮤신 수용체의 기능은 코어 뮤신 펩티드 및 글리코실 트랜스퍼라아제의 세포-특이적 발현과 관련된 세포 유형과 활성화 상태에 좌우되고, 상기 글리코실 트랜스퍼라아제는 O-연결된 올리고사카라이드 측쇄의 구조와 외형, 막 고정, 신호 도입 능력 및/또는 정확한 세포 도메인으로 뮤신의 트래픽킹(trafficking)을 조절한다.

인간 CD164는 포유동물 세포의 리소좀과 엔도솜 구획에서 발견되는 막 단백질인 뮤린 MGC-24v(M. musculus)와 쥐 엔돌린(endolyn)(R.norvegicus)의 오르토로그이다. CD164/엔돌린의 기능적으로 중요한 도메인과 세포이하 분포와 함께, 상이한 동등형 간의 상관관계가 보고되었다(Chan YH et al., J Biol. Chem, 276:.2139-2152, 2001).

자연 상태에서, 인간 CD164는 2개의 80-85kDa 아단위의 이황화결합 동종이량체이다. CD164는 고도로 당화되고, O-와 N-연결된 글리칸을 모두 보유한다. 세포외 영역은 성장 인자와 사이토킨 수용체에서 기존에 발견된 공통 패턴과 유사한 시스테인-풍부 모티프뿐만 아니라 이황화물내 가교를 보유하는 비-뮤신 도메인으로 연결된 2개의 뮤신 도메인(I과 II)으로 구성된다. CD164는 또한, 단백질을 엔도솜과 리소좀으로 표적시킬 수 있는 C-말단 모티프(즉, YHTL)를 포함하는 단일-통과 막통과 도메인과 13개 아미노산 세포내 영역을 보유한다.

4가지 인간 CD164 mRNA 종류는 인간 크로모좀 6q21에 위치한 단일 게놈 전사 단위로부터 6개의 진정한(bona fide) 엑손의 절단접합으로 발생하는 것으로 보고되었다(Zannettino A, J Biol Regul Homeost Agents, 15: 394-396, 2001; Watt and Chan, Leuk Lymph, 37(: 1-25. 2000)). 아마도, 4개의 택일적 프로모터, 2개의 비- 중복 택일적 최후 엑손, 절단에 의해 항상 제거되지는 않는 1개의 내부 인트론이 존재한다. 우세한 CD164(E1-6) 동등형은 178개 아미노산 I형 막통과 당단백질이다. 다른 보고된 동등형은 178개의 아미노산을 보유하는 시알로뮤신 CD164 또는 CD164 동등형이다; 184개 잔기 CD164 동등형 델타 4; 막통과 고정 모티프가 부재하고 189개의 잔기를 보유하는 200 kD 가용성 동등형(24 kD의 Multi-Glycosylated Core 단백질, MGC-24). 모든 동등형은 O-와 N-연결된 당화 부위를 보유하는 고도로 당화된 단백질이다(도 1).

CD164 기능에는 조혈 선포 세포 부착의 조절; 이들의 성장 및/또는 분화의 음성 조절이 포함된다. CD164는 일반적으로, CD34+와 CD34lo/- 조혈 줄기 세포 및 연관된 미소환경 세포에 의해 발현된다(Watt et al., Blood, 92: 849-866, 1998). 또한, CD164는 골수 간질과 내피 세포에서, 림프구에서 약하게, 중간엽 줄기 세포에서 수임된 골수와 적혈구 콜로니 형성 세포에 의해 발현된다. CD164는 인간 CD34+ 세포의 골수 간질로의 부착을 조장하고 CD34+ CD38lo/- 조혈 선조 세포 증식을 억제함으로써 강력한 신호전달 분자로서 기능한다(Zannettino et al. Blood, 92: 2613-2628, 1998).

이들 효과는 단클론 항체(mAb) 105A5와 103B2/9E10에 의해 인식되는 CD164 클래스 I 및/또는 II 에피토프를 수반한다. 이들 에피토프는 탄수화물-의존성이고, N-말단 뮤신 도메인 I에 위치한다(Watt et al., Blood, 95, 3113-3124, 2000; Doyonnas et al., J Immunol, 165: 840-851, 2000). 인접 미소환경에서 조혈 세포와 간질/내피 세포의 상호작용은 조혈 줄기 자가-재생, 무활동, 수임(commitment), 이동의 조절에서 극히 중요한 것으로 생각된다. 이들 상호작용은 부착 수용체, 이들의 동족 리간드, 사이토킨 사이의 공조를 수반한다. Ig, 인테그린, 캐더린(cadherin), 셀렉틴, 뮤신-유사 단백질 계통을 비롯한 일련의 세포 부착 분자(CAMS)가 이들 과정에 참여한다.

시험관내에서, CD164는 근원 분화(myogenic differentiation)에서 일정한 역할을 수행한다(Lee et al., Mol Cell Biol, 21: 7696-7706, 2001). 근원 세포주에서 CD164의 과다발현은 분화의 생화학적 마커의 발현을 가속화시키고 다핵 근관세포(multinucleate myotube)의 형성을 강화시킨 반면, 안티센스 CD164 또는 CD164의 가용성 세포외 영역은 근발생(myogenesis)을 저해하였다.

가용성 MGC-24의 땅콩 아글루티닌(PNA)-결합 부위는 다수의 암종에서 발현되는 종양 연관된 탄수화물 마커를 대표한다. 전체 MGC-24 mRNA는 정상 인접 점막 조직에 비하여 인간 결장직장 암종에서 낮은 것으로 밝혀졌다(Matsui et al., J Biochem, 127: 1103-1107, 2000). 암종에 의한 림프관(lymphatic vessel) 침윤은 결장 암종에서 낮은 수준의 MGC-24 mRNA와 상관하는 반면, 높은 수준은 감소든 정맥 침윤과 감소된 원격전이(remote metastasis)와 상관하였다. CD164에 특이적인 단클론 항체는 암 진단과 치료 및 조혈 저해에 유효한 것으로 입증되었다(EP889054, EP761814).

다른 CD164-유사 단백질이 공개되긴 했지만(NOV25, WO 02/098917; SEQ ID NO: 7852, EP1033401; fig. 1), 이들의 생물학적 특성은 분석되지 않았다.

본 발명의 요약

놀랍게도, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태를 포함하는 가용성 단백질은 콘카발린 A와 같은 약물로 자극되는 경우에 사이토킨을 정상적으로 생산하는 세포에서 사이토킨(즉, 인터페론-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α)의 발현에 대한 저해 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다. 게다가, CD164의 이런 가용성 단편은 염증 및/또는 자가면역 질환의 동물 모델에서 유관한 생리 반응(가령, 림프구 또는 대식세포 이동)을 저해한다.

이런 이유로, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질은 염증이나 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에 이용될 수 있다. 이들 가용성 단백질을 함유하는 제약학적 조성물은 염정 또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 적합하고, 일반적으로, 사이토킨의 발현을 저해하는 목적으로 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 특징과 이점은 아래의 상세한 설명으로부터 명백하다.

도 1: (A) 전장, 인간 CD164(hCD164; NCBI Acc. No. NP_006007; SEQ ID NO: 3), 인간 CD164-델타4(hCD164-DELTA4; NCBI Acc. No. AAG53908; SEQ ID NO: 4), CD164-델타5(hCD164-델타5; NCBI Acc. No. AAG53907; SEQ ID NO: 5), MGC-24(hMGC-24; NCBI Acc. No. Q04900;SEQ ID NO: 6)의 아미노산 정렬. 신호 서열은 박스로 표시한다. 세포외 영역은 화살표로 표시한다. 당화 부위는 별표로 표시한다. (B) CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 3의 아미노산 24-163과 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-140에 상응하는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-140), MGC- 24(SEQ ID NO: 6의 아미노산 24-163), CD164-델타4(SEQ ID NO: 4의 아미노산 24-150), CD164-델타5(SEQ ID NO: 5의 아미노산 24-145), SEQ ID NO: 7852(EP1033401; SEQ ID NO: 7의 아미노산 24-163), NOV25(WO 02/098917; SEQ ID NO: 8의 아미노산 24-161)의 아미노산 정렬. NOV25에서 SEQ ID NO: 1과 상이한 지역은 밑줄로 표시한다.

도 2: IL-2(A)와 TNF-α(B)의 발현에 대한 ConA-자극된 인간 PBMC 세포-혼합물에 sf-CD164 투여의 효과. X-축은 sf-CD164 농도(㎍/㎖)를 나타낸다. Y-축은 분비에 의해 방출된 사이토킨의 비율을 나타낸다.

도 3: IL-2(A)와 TNF-α(B)의 발현에 대한 ConA-자극된 인간 CD4 T 세포에 sf-CD164 투여의 효과. X-축은 sf-CD164 농도(㎍/㎖)를 나타낸다. Y-축은 분비에 의해 방출된 사이토킨의 비율을 나타낸다.

도 4: LPS-유도된 TNF-α 방출의 동물 모델에서 TNF-α 방출에 대한 sf-CD164 투여의 효과. 별표는 통계학적 유의성을 표시한다.

도 5: 복막에서 티오글리콜레이트(thioglycolate)-(A) 또는 LPS-유도된(B) 세포 동원의 동물 모델에서 세포 이동에 대한 sf-CD164 투여의 효과. Y-축은 ㎕당 세포 농도를 나타낸다(A에서 대식세포, B에서 활성화된 림프구). 별표는 통계학적 유의성을 표시한다.

도 6: 자가항원성 MBP 특이적 T 세포의 증식에 대한 sf-CD164 투여의 효과. Y-축은 분열 세포에 의한 방사성표지된 뉴클레오티드(³H 티미딘)의 함입과 관련된 방사능(CPM, counts per minute)을 나타낸다. 별표는 통계학적 유의성을 표시한다.

도 7: 트랜스아미나아제 수준(ALAT; A), IL-6 방출(B), IFN-γ(C) 방출에 대한 ConA-유도된 간염 동물 모델에 sf-CD164 투여의 효과. 별표는 통계학적 유의성을 표시한다.

본 발명에서, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)는 콘카나발린 A(ConA)와 같은 약물로 이들 세포의 자극이후 다양한 사이토킨(즉, 인터페론-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α)의 세포 발현에 저해 효과를 보이는 것으로 밝혀졌다. 상기 단백질 서열의 치료 유용성은 동물 질병 모델에 의해 더욱 뒷받침되는데, 여기서 상기 가용성 단백질은 림프구 이동의 감소 또는 MBP(미엘린 기초 단백질) 특이적 T 세포 증식의 저해와 같은 생체내에서 유용한 생물학적 특성을 보였다.

가용성 단백질로서 분자의 나머지 부분으로부터 분리된 인간 CD164의 세포외 도메인이 사이토킨의 발현, 또는 자가면역 및/또는 염증 질환에 관련된 임의의 다른 현상에 영향을 준다는 것은 당분야에서 제안된 적이 없다.

본 발명의 주목적은 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질의 활용이다.

본 발명에 이용될 수 있는 가용성 단백질에서, 가장 바람직한 가용성 단백질은 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1), 또는 인간 CD164의 신호 서열에 융합된 후자 서열이다.

본 발명에 이용될 수 있는 다른 바람직한 가용성 단백질은 활성 뮤테인 형태로 SEQ ID NO: 1의 변이체, 또는 SEQ ID NO: 1의 동등형이다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 인간 CD164의 동등형은 기존 문헌에 공지되어 있다(Chan YH et al., J Biol Chem, 276: 2139-2152, 2001; 도 1). MGC-24(SEQ ID NO: 6)라고 하는 이들 중에서 한 동등형은 기능성 막통과 도메인의 부재로 인하여 가용성인 반면, CD164-델타 4(SEQ ID NO: 4)와 CD164-델타 5(SEQ ID NO: 5)라고 하는 다른 두 동등형은 막통과 도메인을 여전히 보존한다. 이런 이유로, 이들 후자 막-결합된 동등형의 세포외 도메인의 성숙 형태는 본 발명에 유용한 것으로 간주될 수 있다.

본 명세서에서 “가용성 단백질”은 세포막에서 통합을 유발하는 임의의 서열, 예를 들면, 인간 전장 CD164에서 막통과 도메인을 보유하지 않는 단백질 서열을 의미한다. 이들 가용성 단백질은 세포에서 발현되면, 세포내에 국지적으로 위치하거나, 또는 신호 서열에 융합되는 경우에 세포외 공간으로 분비될 것으로 예상된다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질은 기존 문헌에서 공지되긴 했지만(Lee YN et al., Mol Cell Biol, 21: 7696-7706, 2001), 염증이나 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 유용성이 제안된 적이 없다.

또한, 본 발명에서 염증이나 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 가용성 단백질은 유사한 특성을 보유하거나, 또는 보유하는 것으로 추정되는 임의의 다른 인간 서열과 분명하게 구별된다.

WO 02/098917에서는 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 80% 상동한 서열을 포함하는 단백질 NOV25(SEQ ID NO: 8; 도 1B)를 공개하고, 상기 단백질이 자가면역 질환을 비롯한 다양한 질환에서 유효할 수 있다고 제안한다. 하지만, 이런 활용은 단순한 추정에 기초하며, 상기 문헌은 세포막에 위치할 것으로 예측되는 상기 단백질의 잠재적 세포외 도메인으로부터 분리될 수 있는 가용성 단편의 치료 유용성을 인식하지 못하였다.

EP1033401에서는 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태에 동일한 서열(SEQ ID NO: 7; 도 1B)을 포함하는 단백질(SEQ ID NO: 7582)을 공개한다. 상기 문헌에서는 임의 종류의 질환용 약물에서 상기 단백질의 가설적 치료 용도를 제안하고 있긴 하지만, 상기 단백질의 잠재적 세포외 도메인으로부터 분리될 수 있는 가용성 단편의 치료 유용성을 인지하지는 못하였다.

본 발명에서 “활성”은 실시예에 제시된 임의의 검사법에 따라, SEQ ID NO: 1과 비교하여 필적하거나 또는 증가된 활성을 보유하고 청구된 용도와 방법에 적합한 상기 서열과 적어도 85%의 상동성을 보유하는 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)의 임의의 변이체를 정의한다.

“필적하는” 활성은 전술한 임의의 검사법에서 가용성 단백질의 변이체에 대하여 측정된 활성이 동일한 크기 자리수(order of magnitude)를 보유하고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1로 정의된 가용성 단백질을 이용하여 측정된 활성의 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101% 이하, 102% 이하, 103% 이하, 104% 이하, 105% 이하, 110% 이하, 115% 이하, 120% 이하 또는 125% 이하임을 의미한다.

“증가된” 활성은 전술한 임의의 검사법에서 가용성 단백질의 변이체에 대하여 측정된 활성이 SEQ ID NO: 1로 정의된 가용성 단백질을 이용하여 측정된 활성의 적어도 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450%, 또는 500%임을 의미한다.

본 명세서에서 “뮤테인”은 SEQ ID NO: 1에서 하나이상의 아미노산 잔기를 삽입, 결실 및/또는 치환함으로써 생산될 수 있는 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 임의의 서열을 의미한다. 유사한 활성 뮤테인은 오르토로거스(orthologous) 단백질에 상응하는(즉, CD164에 대한 공통 조상으로부터 진화된 비-인간 유전자에 의해 인코딩된) 또는 인간 게놈에서 다형성으로부터 유래된 것들과 같이 자연적일 수 있다. 뉴클레오티드 치환이 하나이상의 아미노산 변화를 유발하는 경우에, 바람직한 가용성 단백질에는 하나이상의 항-염증- 및/또는 항-자가면역-관련된 활성을 유지하는 것들이 포함된다.

대안으로, 이들 서열은 합성이나 인공이며, 공지된 합성법, 재조합 DNA 기술, 특정부위 돌연변이유발 기술, 또는 본 발명의 실시예에서 제시되거나 당분야에 공지된 교시를 이용하여 당업자가 용이하게 수득하고 검사할 수 있는 유한의 실질적으로 상응하는 돌연변이되거나 또는 단축된 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공하는데 적합한 임의의 다른 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.

이들 활성 뮤테인에서 바람직한 변화는 “보존성” 또는 “안전한” 치환으로 알려져 있다. 보존성 아미노산 치환은 분자의 구조와 생물학적 기능을 보존하기 위하여, 충분히 유사한 화학적 특성을 보유하는 아미노산을 이용한 치환이다. 아미노산의 삽입과 결실은 기능의 변화없이 상기 정의된 서열에서 수행될 수 있는데, 특히, 소수, 예를 들면, 10개 이하, 바람하게는 3개 이하의 아미노산이 삽입 또는 결실되고 단백질 또는 펩티드의 기능적 구조에 중요한 아미노산이 제거 또는 치환되지 않는 경우에 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다.

기존 문헌에서는 자연 단백질의 서열 및/또는 구조에서 통계학적, 물리-화학적 연구에 기초하여 보존성 아미노산 치환의 선별을 수행할 수 있는 다수의 모델을 제공한다(Rogov SI and Nekrasov AN, Protein Eng, 14: 459-463, 2001). 단백질 설계 실험은 특정한 아미노산 부분집합의 활용이 접힘가능한 활성 단백질을 생산하여, 단백질 구조에 더욱 용이하게 수용될 수 있는 아미노산 “동의성” 치환의 분류를 보조할 수 있음을 보여준다(Murphy LR et al., Protein Eng, 13:149-52, 2000). 동의성 아미노산 군 및 더욱 바람직한 동의성 아미노산은 표 1에서 정의한다.

대안으로, 기능에 필수적인 본 발명의 가용성 단백질에서 아미노산은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 부위 직접 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발로 확인할 수도 있다(참조: Cunningham, et al., Science, 244:1081-5, 1989). 특히, 매우 바람직한 개선된 특성, 예를 들면, 줄어든 응집을 보이는 단백질을 생산하는 하전된 아미노산의 다른 하전된 또는 중성 아미노산으로의 치환이 주목을 받고 있다. 응집은 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 제약학적 또는 생리학적으로 수용가능한 조성물을 제조하는 데에도 문제가 되는데, 그 이유는 응집물이 면역원으로 기능할 수 있기 때문이다(Cleland et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 10: 307-77, 1993).

본 발명에 유용한 가용성 단백질의 뮤테인을 획득하는데 이용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환의 다른 실례에는 임의의 공지된 방법 단계가 포함된다(US patent No. 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462, 5,116,943, 4,965,195, 4,879,111, 5,017,691, 4,904,584).

대안으로, 활성 뮤테인은 포유동물에 투여될 때 가용성 단백질의 면역성을 감소시키는 서열 변형으로 유래될 수도 있다. 기존 문헌에서는 특히, 비-인간, 비-포유동물, 또는 비-자연 단백질인 치료 단백질의 안전하고 효과적인 투여를 가능하게 하는 상기한 목적 또는 다른 기능적 최적화를 위하여 설계되고 도입될 수 있는 이들 서열 변형에 관한 다수의 실례를 제시한다(Vasserot AP et al., Drug Disc Today, 8: 118-126, 2003; Marshall SA et al., Drug Disc Today, 8: 212-221, 2003; Schellekens H, Nat Rev Drug Disc, 1: 457-462, 2002; Gendel SM, Ann NY Acad SCI, 964: 87-98, 2002; Graddis TJ et al., Curr Pharm Biotechnol, 3: 285-97, 2002; WO 03/104263; WO 03/006047; WO 02/98454; WO 02/96454; WO 02/79415; WO 02/79232; WO 02/66514; WO 01/40281; WO 98/52976; WO 96/40792; WO 94/11028).

상기 정의된 서열에서 기능의 변화없이 아미노산의 삽입과 결실이 수행될 수도 있는데, 특히, 소수, 예를 들면, 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 삽입 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산, 예를 들면, 시스테인 또는 프롤린이 제거 또는 치환되지 않는 경우에 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이들 변형은 아미노 또는 카르복시 말단에서, 또는 이들 말단 지역 사이에서 서열상의 잔기 사이에 또는 서열내 하나이상의 연속 군에서 개별적으로 산재되어 진행된다.

실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)에 어느 정도의 비율로 상동한 지는 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 간편하게 결정할 수 있다. 이런 알고리즘과 프로그램에는 TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, CLUSTALW 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다(Pearson and Lipman,(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-8; Altschul et al.,(1990) J Mol Biol 215(3):403-410; Thompson et al.,(1994) Nucleic Acids Res 22(2):4673-4680; Higgins et al.,(1996) Meth Enzymol 266:383-402; Altschul et al.,(1997) Nuc Acids Res 25:3389-3402; Altschul et al.,(1993) Nature Genetics 3:266-272). 특히 바람직한 구체예에서, 단백질과 핵산 서열 상동성은 당분야에 공지된 Basic Local Alignmenr Search Tool("BLAST")를 이용하여 평가한다(참조: Karlin and Altschul(1990) Proc Natl Acad Sci USA 87(6):2264-8; Altschul et al., 1990, 1993, 1997, all supra).

BLAST 프로그램은 쿼리 아미노 또는 핵산 서열 및 가급적 단백질 또는 핵산 서열 데이터베이스로부터 획득된 검사 서열 사이의 “고득점 분절 쌍(high-scoring segment pairs)”이라고 하는 유사 분절을 확인함으로써 상동성 서열을 확인한다. 고득점 분절 쌍은 가급적, 당분야에 공지된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)에 의해 확인(즉, 정렬)된다. 적절하게는, 이용된 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스이다(참조: Gonnet et al.,(1992) Science 256(5062):1443-5; Henikoff and Henikoff(1993) Proteins 17(1):49-61). PAM 또는 PAM250 매트릭스 역시 이용될 수 있다(참조: Schwartz and Dayhoff, eds,(1978) Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). BLAST 프로그램은 확인된 모든 고득점 분절 쌍의 통계학적 유의성을 평가하고, 사용자-특정된 통계 역치, 예를 들면, 사용자-특정된 상동성 비율을 충족하는 분절을 선별한다. 적절하게는, 고득점 분절 쌍의 통계학적 유의성은 Karlin의 통계학적 유의성 공식을 이용하여 평가한다(참조: Karlin and Altschul,(1990) Proc Natl Acad Sci USA 87(6):2264-8). BLAST 프로그램은 디폴트 파라미터 또는 사용자에 의해 제공된 변형된 파라미터로 이용될 수 있다. 적절하게는, 파라미터는 디폴트 파라미터이다.

전역 서열 정렬(global sequence alignment)이라고 하는 쿼리 서열(본 발명의 서열)과 대상 서열 사이에서 최적의 전체 정합(match)을 결정하는데 선호되는 방법은 Brutlag 알고리즘(Brutlag et al.(1990) Comp. App. Biosci. 6:237245)에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 쿼리와 대상 서열은 둘 모두 아미노산 서열이다. 전역 서열 정렬의 결과는 동일성 비율로 표시된다. FASTDB 아미노산 정렬에 이용되는 바람직한 파라미터는 매트릭스(Matrix)=PAM 0, k개 요소의 집합(k-tuple)=2, 부정합 페널티(Mismatch Penalty)=1, 합류 페널티(Joining Penalty)=20, 무작위 그룹(Randomization Group)=25, 길이(Length)=0, 컷오프 스코어(Cutoff Score)=1, 윈도우 크기(Window Size)=서열 길이, 갭 페널티(Gap Penalty)=5, 캡 크기 페널티(Gap Size Penalty)=0.05, 윈도우 크기(Window Size)=247 또는 대상 아미노산 서열의 길이(이들중 짧은 것)이다.

대상 서열이 내부 결실이 아닌 N-또는 C-말단 결실로 인하여 쿼리 서열보다 짧은 경우에, 결과(동일성 비율)는 인위적으로 수정해야 하는데, 그 이유는 FASTDB 프로그램이 전역 비율 상동성을 계산하는 경우에 대상 서열의 N-과 C-말단 절두를 고려하지 않기 때문이다. N-과 C-말단에서 절두된 대상 서열의 경우에, 쿼리 서열에 상대적인 동일성 비율은 상응하는 대상 잔기와 정합/정렬되지 않는 대상 서열의 N-과 C-말단에서 쿼리 서열의 잔기 총수를 쿼리 서열의 전체 염기 비율로서 계산함으로써 수정한다. 잔기가 정합/정렬되는 지는 FASTDB 서열 정렬의 결과로서 결정된다. 이후, 상기 비율은 특정된 파라미터를 이용한 상기 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성 비율로부터 감하여 최종 동일성 비율 스코어를 얻는다. 상기 최종 동일성 비율 스코어는 본 발명의 목적에 이용된다. 쿼리 서열과 정합/정렬되지 않는 대상 서열의 N-과 C-말단 잔기, 다시 말하면, 대상 서열의 N-과 C-최말단 잔기 외부의 쿼리 아미노산 잔기만 동일성 비율 스코어를 인위적으로 조정하는데 고려된다.

가령, 90개 아미노산 잔기 대상 서열을 100개-잔기 쿼리 서열로 정렬하여 동일성 비율을 결정한다. 결실은 대상 서열의 N-말단에서 진행되고, 이런 이유로, FASTDB 정렬은 N-말단에서 첫 번째 잔기로 정합/정렬되지 않는다. 10개의 홀 잔기가 서열의 10%(N-과 C-말단에서 정합되지 않는 잔기의 총수//쿼리 서열에서 잔기의 총수)이기 때문에, FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성 비율 스코어로부터 10%를 감한다. 나머지 90% 잔기가 완전하게 정합된다면, 최종 동일성 비율은 90%가 된다.

바람직한 구체예에서, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질의 번역후 변형된 형태가 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 이용될 수 있다. 특히, 이들 단백질은 아세틸화(acetylation), 아미드화(amidation), 당화(glycosylation), 인산화(phosphorylation) 및/또는 미리스톨화(myristoylation)될 수 있다.

인간 CD164는 이들 군으로 변형되는 것으로 알려져 있으며, 일련의 특정 위치는 SEQ ID NO: 1에서 지시할 수 있다:

a) 잠재적 N-당화 위치는 잔기 3, 9, 18, 49, 54, 71, 81, 98, 123에 위치한다;

b) 잠재적 O-당화 위치는 잔기 11, 12, 17, 20, 21, 25, 26, 31, 32, 89, 90, 92, 96, 99, 100, 104, 108, 110, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 125, 127, 129, 130, 136에 위치한다.

c) 잠재적 cAMP-와 cGMP-의존성 단백질 키나아제 인산화 위치는 잔기 134 내지 137에 위치한다;

d) 잠재적 단백질 키나아제 C 인산화 위치는 잔기 100 내지 102 및 112 내지 114에 위치한다;

e) 잠재적 카세인 키나아제 II 인산화 위치는 잔기 73 내지 76 및 136 내지 139에 위치한다;

f) sf-CD164에서 잠재적 N-미리스톨화 위치는 잔기 119에 위치한다.

분명하게, 이런 변형은 서열 정렬에 의해 확인된 상기한 상동성 가용성 단백질의 상응하는 위치에서도 존재할 수 있다(도 1).

더욱 바람직한 구체예에서, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질은 가용성 융합 단백질이다.

이들 가용성 융합 단백질은 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이종성 단백질 서열에 대한 코딩 서열 프레임에 클로닝하여 획득할 수 있다.

본 명세서에서 “이종성”은 인간 CD164 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드를 지정한다.

N- 또는 C-말단에서 가용성 융합 단백질에 포함될 수 있는 이종성 서열의 실례는 막-결합된 단백질의 세포외 도메인, 면역글로불린 불변 영역(Fc 영역), 다량체화(multimerization) 도메인, 세포외 단백질의 도메인, 신호 서열, 이출 서열, 또는 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 가능하게 하는 서열이다.

이들 이종성 서열의 대부분은 발현 플라스미드에서 상업적으로 이용가능한데, 그 이유는 이들 서열이 일반적으로, 이들에 융합된 단백질의 특이적인 생물 활성을 현저하게 손상시키지 않으면서 부가적인 특성을 제공하기 위하여 융합 단백질에 포함되기 때문이다(Terpe K, Appl MicrobiolBiotechnol, 60: 523-33, 2003). 이런 부가적인 특성의 실례는 체액에서 길어진 반감기, 세포외 국지화, 또는 소위 “히스티딘 태그”를 형성하는 히스티딘 가닥(Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 821-4, 1989) 또는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프인 “HA” 태그(Wilson et al., Cell, 37: 767-78, 1994)에 의한 더욱 용이한 정제 절차이다. 필요한 경우에, 이종성 서열은 단백분해 절단, 예를 들면, 가용성 단백질과 이종성 서열 사이에 단백분해 절단 부위를 삽입하고, 정제된 가용성 융합 단백질을 적절한 프로테아제에 노출시킴으로써 제거할 수 있다. 이들 특징은 가용성 융합 단백질에서 특히 중요한데, 그 이유는 이들 특징이 이들의 생산 및 제약학적 조성물의 제조에서 활용을 용이하게 하기 때문이다. 가령, 실시예에 이용된 가용성 단백질(sf-CD164; SEQ ID NO: 2)은 가용성 CD164의 C-말단에 융합된 헥사-히스티딘 펩티드로 정제하였다. 가용성 융합 단백질이 면역글로불린 영역을 포함하는 경우에, 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 또는 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 짧은 링커 펩티드를 통하여 달성될 수 있다. 상기 링커는 예로써 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 또는 본 발명의 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생산된 융합 단백질은 체액에서 연장된 체류 시간(반감기), 증가된 특이적 활성, 증가된 발현 수준, 또는 융합 단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.

바람직한 구체예에서, 가용성 단백질은 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써 인간 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. Ig 분자의 다른 동등형 역시 본 발명에 따른 융합 단백질, 예를 들면, 동등형 IgG₂ 혹은 IgG₄, 또는 다른 Ig 종류(가령, IgM 또는 IgA)의 산출에 적합하다. 융합 단백질은 단일체 또는 다합체이고, 이종- 또는 동종다합체이다.

더욱 바람직한 구체예에서, 기능성 유도체는 아미노산 잔기에서 하나이상의 측쇄로서 발생하는 하나이상의 기능기에 부착된 적어도 하나의 일부분을 포함한다. 적절하게는, 일부분은 폴리에틸렌(PEG) 부분이다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 99/55377에서 기술된 공지된 방법으로 수행할 수 있다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질과 가용성 융합 단백질은 체액, 세포, 또는 이들을 자연적으로 발현하는 인간이나 포유동물의 조직으로부터 추출되고 분리될 수 있다. 특히, 직접적으로 분리되거나 배양된 세포는 이들 가용성 단백질(자연적으로, 또는 유도물질에 노출이후)을 발현하고 분비할 수 있다. 단백질을 정제하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 입자를 파괴하는 세정제 또는 무질서유발제(chaotropic agent)의 이용, 후속으로 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 밀도에 따른 침강, 겔 전기영동에 의한 폴리펩티드의 구별 추출(differential extraction)과 분리를 수반한다.

일반적으로, 가용성 단백질과 가용성 융합 단백질은 재조합 DNA-관련된 기술과 화학적 합성 기술을 비롯한 당분야에 공지된 임의의 절차로 제조될 수 있다.

재조합 DNA-관련된 기술은 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 먼저 발생시킴으로써, 가용성 단백질과 가용성 융합 단백질을 생산할 수 있다. 이들 핵산은 게놈 DNA, 또는 더욱 효율적으로, 인간 CD164(SEQ ID NO: 3)의 전체 서열 또는 임의의 다른 유관한 상동성 서열로부터 PCR로 수득할 수 있다. 원하는 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 가용성 단백질을 인코딩하는 서열이 발현 플라스미드에서 폴리A 신호 및 나머지 다른 서열에 대하여 적절하게 위치하도록 추가적인 클로닝을 위한 특이적인 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 가능하게 하는 제한 엔도뉴클레아제 서열을 보유한다.

형질전환-, 감염-, 침전-, 또는 트랜스펙션-기초한 기술뿐만 아니라 공통 유전자 조작 기술을 이용하여, 이들 폴리뉴클레오티드는 에피솜 또는 비-/동종성 벡터로 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 형질전환하는데 이용되는 바이러스 또는 플라스미드 기원의 복제가능 발현 벡터에 클론될 수 있다. 이들 벡터는 세포에서 본질적으로 활성이거나 유도성인 자체 전사 개시/종결 조절 서열의 조절하에 진핵 또는 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 이후, 이런 세포가 실질적으로 풍부한 세포주를 분리하여 목적 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 제공한다.

많은 문헌, 예를 들면, Oxford University Press에서 출판한 연속 출판물 "A Practical Approach"("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001)에서 벡터 및 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용하여 재조합 단백질을 클론하고 생산하는 방법에 관한 교시를 제공한다.

전형적인 발현 벡터는 아래와 같이 구성된다:

a) 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질 또는 가용성 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열;

b) 발현 카세트;

여기서, 상기 서열(a)은 서열(b)에 포함된 조직-특이적 또는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

발현 벡터는 당분야에 공지된 임의의 포유동물, 효모, 곤충 또는 박테리아 발현 시스템이다. 상업적으로 입수가능한 벡터와 발현 시스템은 Genetics Institute(Cambridge, MA), Stratagene(La Jolla, California), Promega(Madison, Wisconsin), Invitrogen(San Diego, California)을 비롯한 여러 공급업체로부터 구입가능하다. 원하는 경우, 발현을 강화하고 적절한 단백질 접힘을 조장하기 위하여, 서열의 코돈 문맥(codon context)과 코돈 쌍은 발현 벡터가 도입되는 특정 발현 생물체에 대하여 최적화될 수 있다(US Patent No. 5,082,767; Gustafsson C et al., Trends Biotechnol, 22: 346-53, 2004).

특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 있어 중요한 인자에는 벡터를 보유하지 않는 수용자 세포로부터 벡터를 보유하는 수용자 세포의 인식과 선별의 용이성; 특정 숙주에서 요구되는 벡터의 사본 수; 상이한 종의 숙주 세포간 벡터 “수송”의 바람직성 여부 등이 포함된다. 본 발명에 따른 재조합 벡터에는 YAC(Yeast Artificial Chromosome), BAC(Bacterial Artificial Chromosome), 파지, 파제미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 플라스미드, 또는 크로모좀, 비-크로모좀, 반-합성 또는 합성 DNA로 구성되는 선형 DNA 분자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점, 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별가능 마커, 하류 구조 서열의 전사를 유도하는 고도 발현된 유전자로부터 유래된 프로모터를 보유한다. 이종성 구조 서열은 적절한 단계에서 번역 개시와 종결 서열, 바람직하게는 번역된 단백질의 주변세포질 공간 또는 세포외 매체로의 분비를 유도할 수 있는 리더 서열에 조합된다. 벡터가 포유동물 숙주 세포에서 원하는 서열을 트랜스펙션시키고 발현시키도록 적합된 특정 구체예에서, 바람직한 벡터는 원하는 숙주에서 복제 기점, 적절한 프로모터, 인헨서를 포함하고, 또한 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 절단접합 공여체와 수용체 부위, 전사 종결 서열, 5'-측면 비-전사된 서열을 포함한다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들면, SV40 기점, 초기 프로모터, 인헨서, 절단접합과 폴리아데닐화 부위를 이용하여, 요구되는 비-전사된 유전자 요소를 제공할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터에 이용되는 적절한 프로모터 영역은 이종성 유전자가 발현된 숙주 세포를 고려하여 선택한다. 목적 핵산 서열의 발현을 조절하는데 이용되는 특정 프로모터는 중요하게 간주되지 않는데, 그 이유는 프로모터가 표적 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수 있기만 하면 되기 때문이다. 따라서, 인간 세포가 표적되는 경우에, 인간 세포에서 발현될 수 있는 프로모터, 예를 들면, 인간이나 바이러스 프로모터의 조절하에 상기 프로모터에 인접하여 핵산 코딩 영역을 위치시키는 것이 바람직하다.

적절한 프로모터는 발현이 조절되는 핵산에 대하여 이종성이거나, 또는 발현되는 코딩 서열을 보유하는 자연 폴리뉴클레오티드에 내인성일 수 있다. 부가적으로, 프로모터는 일반적으로, 구조체 프로모터/코딩 서열이 삽입된 재조합 벡터 서열에 대하여 이종성이다.

프로모터 영역은 예로써 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라아제) 벡터, 바람직하게는 pKK232-8과 pCM7 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택할 수 있다. 바람직한 박테리아 프로모터는 LacI, LacZ, T3 또는 T7 박테리오파지 RNA 중합효소 프로모터, gpt, 람다 PR, PL, trp 프로모터(EP 0036776), 폴리헤드린 프로모터, 또는 바쿨로바이러스로부터 유래된 p10 단백질 프로모터(Kit Novagen)(Smith et al.,(1983) Mol Cell Biol 3(12):2156-65; O'Reilly et al., 1992), 람다 PR 프로모터 또는 trc 프로모터이다. 진핵 프로모터에는 CMV 즉시 초기, HSV 티미딘 키나아제, 초기와 후기 SV40, 레트로바이러스로부터 LTR, 생쥐 메탈로티오네인-L이 포함된다. 이에 더하여, 특정 세포형에 특이적인 프로모터, 예를 들면, 지방 조직, 근육 조직, 또는 간에서 발현을 조정하는 프로모터를 선택할 수도 있다. 편의한 벡터와 프로모터의 선택은 당업자의 통상적인 능력 범위에 속한다.

cDNA 삽입체가 이용되는 경우에, 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하는 폴리아데닐화 신호가 전형적으로 포함된다. 폴리아데닐화 신호의 특성은 본 발명의 성공적인 수행에 중요하게 간주되지 않으며, 임의의 이런 서열, 예를 들면, 인간 성장 호르몬과 SV40 폴리아데닐화 신호가 이용될 수 있다. 발현 카세트의 요소에는 종결인자가 또한 포함된다. 이들 요소는 메시지 수준을 강화시키고 카세트로부터 다른 서열로의 연속 판독을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.

벡터는 예로써 비-코딩 5'와 3' 서열, 벡터 서열, 정제, 탐침 또는 시발(priming)에 이용되는 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 추가의 비-코딩 서열을 보유할 수도 있다. 가령, 이종성 서열은 전사 및 mRNA 가공, 예를 들면, mRNA의 리보솜 결합과 안정성에서 중요한 역할을 수행하는 전사된 비-번역 서열을 보유한다.

선별가능 마커는 세포에 확인가능 변화를 공여하여, 발현 구조체를 보유하는 세포의 확인을 용이하게 한다. 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 선별가능 마커 유전자는 가급적, 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 저항성, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 경우 TRP1, 대장균(E. coli)에서 테트라사이클린, 리팜피신 또는 암피실린 저항성, 또는 마이코박테리아의 경우 레반 사카라아제(levan saccharase)이다.

대표적인 무-제한적 실례로서, 박테리아에 유용한 발현 벡터는 선별가능 마커 및 pBR322의 유전자 요소를 포함하는 상업적으로 이용가능한 플라스미드(ATCC 37017)로부터 유래된 박테리아 복제 기점을 포함할 수 있다. 이런 상업적 벡터에는 pKK223-3(Pharmacia, Uppsala, Sweden)과 pGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

다수의 다른 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 예로써 아래의 박테리아 벡터: pTrc-His, pET30-His, pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia); pQE-30(QIAexpress)이 상업적으로 구입가능하다.

폴리펩티드의 발현에 적합한 벡터는 곤충 세포와 곤충 세포주에서 증폭될 수 있는 바쿨로바이러스 벡터이다. 특히 적합한 숙주 벡터는 나비목해충(Spodoptera frugiperda)으로부터 유래된 SF9 세포주(ATCC N°CRL 1711)를 트랜스펙션시키는데 이용되는 pVL1392/1393 바쿨로바이러스 전달 벡터(Pharmingen)이다. 다른 적합한 바쿨로바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, FastBacHT이다. 바쿨로바이러스 발현 시스템에서 APM1 구형 헤드 폴리펩티드의 발현을 위한 다른 적합한 벡터는 Chai et al., 1993; Biotechnol Appl Biochem. Dec;18(Pt 3):259-73; Vlasak et al., 1983; Eur J Biochem Sep 1;135(1):123-6; Lenhard et al., 1996; Gene Mar 9;169(2):187-90에 기술한다.

폴리펩티드의 발현을 위한 다른 적합한 벡터는 포유동물 벡터이다. 다수의 적합한 벡터 시스템이 공지되어 있으며, 예를 들면, pcDNA4HisMax, pcDNA3.1Hygro-His, pcDNA3.1Hygro이다.

폴리펩티드의 발현을 위한 다른 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스로부터 유래된 벡터이다. 본 발명에 따른 바람직한 아데노바이러스 벡터는 Feldman and Steg, 1996; Semin Interv Cardiol 1(3):203-8 또는 Ohno et al., 1994; Science 265(5173):781-4에서 기술한다.

레트로바이러스 벡터와 아데노-연관된 바이러스 벡터는 일반적으로, 생체내, 특히, 인간을 비롯한 포유동물로 외인성 폴리뉴클레오티드의 전달에 선택되는 재조합 유전자 전달 시스템으로 간주된다. 이들 벡터는 유전자의 세포로의 효율적인 전달을 제공하고, 전달된 핵산은 숙주의 크로모좀 DNA에 안정적으로 통합된다.

폴리펩티드를 발현하는 다른 가능성은 상동성 재조합으로 게놈의 정확한 좌위로 조절 서열을 도입함으로써, 유전자를 내적으로 활성화시켜, 발현의 유도가 요구되는 유전자와 조절 서열을 작동가능하게 연결시킨다(WO 91/09955; WO 02/10372).

숙주 세포는 원핵 또는 진핵이다. 진핵 숙주, 특히, 포유동물 세포, 예를 들면, 인간, 원숭이, 생쥐, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 선호되는데, 그 이유는 이들이 정확한 위치에서 정확한 접힘 또는 당화를 비롯한 단백질 분자에 번역후 변형을 제공하기 때문이다. 또한, 효모 세포는 당화를 비롯한 번역후 펩티드 변형을 수행할 수 있다. 효모에서 원하는 단백질의 생산에 이용될 수 있는 강한 프로모터 서열과 많은 사본 수의 플라스미드를 이용하는 다수의 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모는 클론된 포유동물 유전자 산물에서 리더 서열을 인식하고 리더 서열을 보유하는 펩티드(즉, 프리-펩티드)를 분비한다.

가용성 단백질을 발현하기 위한 수용자로서 이용하기 적합한 숙주 세포는 아래와 같다:

a) 원핵 숙주 세포: 대장균(Escherichia coli) 균주(I.E. DH5-α 균주), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스(Staphylococcus)와 같은 종의 균주;

b) 진핵 숙주 세포: HeLa 세포(ATCC N°CCL2; N°CCL2.1; N°CCL2.2), Cv 1 세포(ATCC N°CCL70), COS 세포(ATCC N°CRL1650; N°CRL1651), Sf-9 세포(ATCC N°CRL1711), C127 세포(ATCC N°CRL-1804), 3T3(ATCC N° CRL-6361), CHO(ATCC N° CCL-61), 인간 신장 293(ATCC N° 45504; N° CRL-1573), BHK(ECACC N° 84100501; N° 84111301), PLC 세포, HepG2, Hep3B.

진핵 숙주(가령, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포)의 경우, 숙주의 특성에 따라 상이한 전사와 번역 조절 서열을 이용할 수 있다. 이들은 바이러스 출처, 예를 들면, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 유인원 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는데, 여기서 조절 신호는 높은 발현 수준을 보유하는 특정 유전자에 연결된다. 실례는 포진 바이러스 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등이다. 유전자의 발현이 조절될 수 있도록 억제와 활성화가 가능한 전사 개시 조절 신호가 선택된다. 도입된 DNA에 의해 안정적으로 형질전환된 세포는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 하나이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 마커는 또한, 영양요구성 숙주에 굴광성(phototrophy), 살생제 저항성(가령, 항생성), 또는 구리와 같은 중금속을 제공한다. 선별가능 마커 유전자는 발현되는 DNA 유전자 서열에 직접 연결되거나, 또는 동시-트랜스펙션에 의해 동일 세포로 도입될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질의 최적 합성을 위하여 추가의 요소 역시 필요할 수 있다.

가용성 단백질을 인코딩하는 핵산에서 개시 부위로서 기능하는 메티오닌이 부재하면, 통상적인 기술을 이용하여 핵산의 첫 번째 코돈에 인접하여 개시 메티오닌을 도입할 수 있다. 유사하게, 가용성 CD164 폴리펩티드 cDNA로부터 삽입체에서 폴리 A 신호가 부재하면, 상기 서열은 예로써 BglI과 SalI 제한 엔도뉴클레아제 효소를 이용하여 pSG5(Stratagene)로부터 Poly A 신호를 절단하고, 이를 포유동물 발현 벡터 pXT1(Stratagene)에 통합함으로써 구조체에 부가될 수 있다. pXT1은 LTR 및 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스로부터 gag 유전자의 일부를 보유한다. 구조체에서 LTR의 위치는 효율적이고 안정적인 트랜스펙션을 가능하게 한다. 상기 벡터는 단순 포진 티미딘 키나아제 프로모터 및 선별가능 네오마이신 유전자를 보유한다.

재조합 생산 절차에 이용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화되거나 비-당화된다. 이에 더하여, 가용성 단백질은 일부 경우에, 숙주-매개된 과정의 결과로서 초기 변형된 메티오닌 잔기를 보유할 수도 있다. 따라서, 번역 개시 코돈에 의해 인코딩된 N-말단 메티오닌이 일반적으로, 모든 진핵 세포에서 번역이후 단백질로부터 높은 효율로 제거된다는 것은 당분야에 널리 알려져 있다. 대부분의 단백질에서 N-말단 메티오닌은 대부분의 원핵생물에서 효율적으로 제거되지만, 일부 단백질의 경우에는 이런 원핵 제거 과정이 비효율적이고 N-말단 메티오닌이 공유 결합된 아미노산의 특성에 좌우된다.

가용성 단백질은 한정된 길이로 인하여, 화학적 합성 기술, 예를 들면, 고체상 합성과 액체상 합성으로 생산될 수도 있다. 고체상 합성의 경우에, 예로서 합성되는 펩티드의 C-말단에 상응하는 아미노산은 유기 용제에서 불용성인 서포트; 반응의 교체 반복으로, 아미노기와 측쇄 기능기가 적절한 보호기로 보호된 아미노산이 C-말단에서부터 N-말단의 순서로 하나씩 응축된 서포트; 수지 또는 펩티드의 아미노기의 보호기에 결합된 아미노산이 방출되는 서포트에 결합되고, 펩티드 사슬은 이런 방식으로 신장된다.

고체상 합성 방법은 이용된 보호기의 유형에 따라, tBoc 방법과 Fmoc 방법으로 분류된다. 전형적으로 이용된 보호기는 아미노기의 경우, tBoc(t-부톡시카르보닐), Cl-Z(2-클로로벤질옥시카르보닐), Br-Z(2-브로모벤질옥시카르보닐), Bzl(벤질), Fmoc(9-플루오르에닐메톡시카르보닐), Mbh(4,4'-디메톡시디벤즈하이드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카르보닐), Cl2-Bzl(2,6-디클로로벤질); 구아니디노기의 경우, NO2(니트로)와 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 하이드록실기의 경우 tBu(t-부틸)이다. 원하는 펩티드의 합성이후, 이는 탈-보호 반응에 적용되고 고체 서포트로부터 절단된다. 이런 펩티드 절단 반응은 Boc 방법의 경우 플루오르화 수소 또는 트리플루오르메탄 설폰산 및 Fmoc 방법의 경우 TFA로 수행된다. 본 발명의 단백질에 필적하는 길이의 완전 합성 단백질은 기존 문헌(Brown A et al., J Pept Sci 2 :40-46, 1996; Muir TW, Annu Rev Biochem, 72: 249-89, 2003; Casi G and Hilvert D, Curr Opin Struct Biol, 13: 589-94, 2003)에서 공개한다.

가용성 단백질의 화학적 합성은 비-자연 아미노산을 이용함으로써 단백질 구조와 기능의 자연 레퍼토리를 확대할 수 있다(Anthony-Cahill SJ and Magliery TJ, Curr Pharm Biotechnol, 3: 285-97, 2002). 이들 분자는 아미노산 측쇄, 아미노산 키랄성 및/또는 펩티드 골격의 수준에서 화학적으로 변형될 수 있는 잔기를 선별하고, 이후 관련된 특성, 예를 들면, 효능, 정제의 용이성, 반감기를 개선하기 위하여 가용성 단백질의 서열 및/또는 구조에 맞게 설계될 수 있다. 포함되는 아미노산에 대한 바람직한 택일적 “동의성” 군은 표 II에서 정의한다. 이들 화합물의 합성과 개발을 위한 기술은 당분야에 널리 알려져 있다(Hruby VJ and Balse PM, Curr Med Chem, 7:945-70, 2000; Golebiowski A et al., Curr Opin Drug Discov Devel, 4: 428-34, 2001; Villain M et al., Chem Biol, 8: 673-9, 2001¸WO 02/10195;). 단백질 구조와 기능을 탐침하거나 개선하기 위하여 시험관내와 생체내 번역 시스템을 모두 이용하여 인공 아미노산을 단백질에 통합하는 다양한 방법 역시 기존 문헌(Dougherty DA, Curr Opin Chem Bio, 4: 645-52, 2000)에서 공개한다.

본 발명에 사용될 수 있는 합성 또는 재조합 가용성 단백질의 정제는 이런 목적으로 공지된 방법, 다시 말하면, 침전, 크로마토그래피(음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파티트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피), 전기영동, 구별 추출, 염 분류, 원심분리 등을 비롯한 통상적인 절차로 수행할 수 있다(가령, Methods in Enzymology for a variety of methods for purifying proteins).

우선적으로 이용되는 정제 절차는 단클론 항체, 또는 충분한 친화성과 특이성으로 표적 단백질(직접적으로 가용성 CD164, 또는 가용성 융합 단백질인 경우에 히스티딘 태그와 같은 이종성 서열)에 결합하는 임의의 다른 화학 작용기를 이용한 친화성 크로마토그래피이다. 결합기는 칼럼 내에 포함된 겔 매트릭스에 고정된다. 이들 단백질을 보유하는 불순 제조물은 칼럼에 통과시킨다. 가용성 단백질은 친화성에 의해 칼럼에 결합되는 반면, 불순물은 통과하게 된다. 나머지 불순물을 세척한 이후, 가용성 단백질은 pH 또는 이온 강도에서 변화로 겔로부터 용출할 수 있다. 대안으로, HPLC(고속 액체 크로마토그래피)를 이용할 수 있다. 용출은 단백질 정제에 통상적으로 이용되는 물-아세토니트릴-기초한 용제를 이용하여 수행할 수 있다.

대안으로, 가용성 단백질은 기존 문헌(Protein Purification Applications, A Practical Approach(New Edition), Edited by Simon Roe, AEA Technology Products and Systems, Biosciences, Harwell; Clark(1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; U.S. Patent Nos. 6,140,552)에 공개된 다양한 방법을 적용하여, 가용성 단백질을 발현하는 유전자도입 동물의 모유로부터 분리할 수 있다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질은 활성 유도체, 단백분해-저항성 변형 형태, 공액체, 복합체, 분획물, 전구체 및/또는 염으로서 생산하거나, 조제하거나, 투여하거나, 또는 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 일반적으로 이용할 수 있다.

본 명세서에서 “유도체”는 당분야에 공지된 방법으로, 아미노산 부분의 측쇄에 또는 N- 혹은 C-말단기에 존재하는 작용기로부터 제조될 수 있는 유도체를 의미한다. 이런 유도체는 예로써 카르복실기의 에스테르 또는 지방족 아마이드; 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 유리 하이드록실기의 O-아실 유도체이고, 예로써 알카노일- 또는 아로일-기와 같은 아실-기로 형성된다.

본 명세서에서 “분획물”은 단독으로, 또는 관련된 분자 또는 여기에 결합된 잔기(가령, 당이나 인산염 잔기, 또는 최초 폴리펩티드 또는 펩티드의 응집체)와의 조합으로, 화합물 자체의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편을 의미한다. 이런 분자는 통상적으로, 일차 서열을 변화시키지 않는 다른 변형, 예를 들면, 펩티드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화(아세틸화 또는 카르복실화), 인산화의 패턴을 변화시킴으로써 달성된 변형(포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌 잔기의 도입), 또는 합성과 가공동안 또는 추가의 가공 단계에서 펩티드의 당화(당화에 영향을 주는 효소, 예를 들면, 포유동물 당화 또는 탈당화 효소에 펩티드를 노출시킴으로써)로부터 생산될 수도 있다.

“전구체”는 세포 또는 체내에 투여하기에 앞서 또는 투여한 이후에 대사와 효소 가공에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있는 화합물이다.

본 명세서에서 “염”은 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 또는 이의 유사체의 카르복실기의 염과 아미노기의 산 첨가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생산될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염과 같은 무기 염 및 예로써 아민, 예를 들면, 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산 첨가염에는 예로써 무기산, 예를 들면, 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면, 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 본 발명의 펩티드와 폴리펩티드 또는 이들의 동족체에 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.

공액체 또는 복합체는 방사성 표지, 비오틴, 형광 표지, 세포독성제, 약물 전달제에서 선택되는 분자로 형성될 수 있다. 이들 공액체 또는 복합체는 폴리에틸렌글리콜 및 다른 자연이나 합성 중합체와 같은 중합체를 이용하여, 예로써 다른 단백질과의 상호작용의 검출을 가능하게 하거나(방사성 또는 형광 표지, 비오틴), 치료 효능을 개선하거나(세포독성제), 또는 약물 전달 효능을 개선하기 위하여 당분야에 공지된 분자와 방법을 이용하여 생산할 수 있다(Pillai O and Panchagnula R, Curr Opin Chem Biol, 5: 447-451, 2001).

중합체는 임의의 분자량을 보유하고, 분지형 또는 선형이다. 폴리에틸렌글리콜의 경우에 선호되는 분자량은 용이한 취급과 제조를 위하여 대략 1 kD 내지 대략 100 kDa이다(“대략”은 폴리에틸렌글리콜 제조물에서, 일부 분자가 명시된 분자량보다 많거나 적은 분자량을 보유한다는 것을 지시한다). 원하는 치료 프로필(가령, 원하는 서방의 지속 기간, 임의의 생물 활성에 대한 효과, 취급의 용이성, 항원성의 정도 또는 부재, 치료 단백질 또는 동족체에 대한 폴리에틸렌글리콜의 다른 공지된 효과)에 따라, 다른 크기를 이용할 수도 있다.

폴리에틸렌글리콜 분자(또는 다른 화학적 부분)은 폴리펩티드의 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려하여 폴리펩티드에 부착해야 한다. 당업자에게 다수의 부착 방법이 가용하다(참조: EP 0 401 384(G-CSF에 PEG 결합); Malik et al.(1992) Exp Hematol 20(8):1028-35(트레실 클로라이드를 이용한 GM-CSF 페길화). 가령, 폴리에틸렌글리콜은 반응기, 예를 들면, 유리 아미노 또는 카르복실기를 통하여 아미노산 잔기에 공유 결합된다. 반응기에는 활성화된 폴리에틸렌글리콜 분자가 결합된다. 유리 아미노기를 보유하는 아미노 잔기에는 리신 잔기와 N-말단 아미노산 잔기가 포함된다; 유리 카르복실기를 보유하는 잔기에는 아스파라긴산 잔기, 글루탐산 잔기, C-말단 아미노산 잔기가 포함된다. 설피드릴기 역시 폴리에틸렌글리콜 분자를 부착하는 반응기로서 이용될 수 있다. 치료 목적에는 아미노기에서 부착, 예를 들면, N-말단 또는 리신기에서 부착이 바람직하다.

단백분해에 저항하는 폴리펩티드는 -CONH- 펩티드 결합을 (CH2NH) 환원된 결합; (NHCO) 레트로 인벌소(retro inverso) 결합; (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합; (CH2-S) 티오메틸렌 결합; (CH2CH2) 카바(carba) 결합; (CO-CH2) 세토메틸렌 결합; (CHOH-CH2) 하이드록시에틸렌 결합; (N-N) 결합; E-알센(alcene) 결합; 또는 -CH=CH- 결합으로 치환하여 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 펩티드 결합이 상기한 바와 같이 변형된 가용성 CD164 또는 이의 변이체를 포괄한다. 이에 더하여, 아미노산은 L 또는 D의 입체 내에 키랄성을 보유한다. 일부 구체예에서는 체내에서 반감기를 연장하기 위하여 아미노산의 키랄성을 변화시키는 것이 바람직하다. 따라서, 일부 구체예에서, 하나이상의 아미노산이 가급적, L 배열로 존재한다. 다른 구체예에서, 하나이상의 아미노산이 가급적, D 배열로 존재한다.

본 발명의 폴리펩티드와 관련된 반응물의 치료 적용은 세포 동원의 저해와 같은 생체내 또는 시험관내 검사뿐만 아니라, 사이토킨 방출 및/또는 발현의 저해를 검출할 수 있는 동물 세포, 조직, 모델을 이용한 생체내 또는 시험관내 검사의 수단으로 평가할 수 있다(안정성, 약동학, 효능의 관점에서). 본 발명에 기술된 생물학적 치료 활성의 추가적인 특성화는 다양한 분자생물학 기술, 예를 들면, 2차원 겔 전기영동 또는 RNA 간섭을 적용함으로써 달성할 수 있다.

생체내에서 척추동물의 세포 내부에 가용성 단백질을 전달하는 방법의 한가지 특정 구체예는 생리학적으로 수용가능한 담체 및 목적 폴리펩티드를 작동가능하게 코딩하는 나신 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제조물을 세포를 포함하는 조직의 간질 공간에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 나신 폴리뉴클레오티드는 세포의 내부로 흡입되고 생리학적 효과를 나타낸다. 이는 시험관내 전달에 특히 적합하지만 생체내에도 적용될 수 있다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 이용될 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 재조합 CD164 폴리펩티드를 발현하는 비-인간 동물과 식물의 산출에도 이용될 수 있다. 동물 또는 식물은 외래유전자가 도입될 수 있다, 다시 말하면, 이들 각 세포가 CD164 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 보유하거나, 또는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 동물 또는 식물의 체세포, 예를 들면, 포유동물의 유선 분비 상피 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비-인간 동물은 소, 양, 염소, 돼지 또는 토끼와 같은 포유동물이다. 포유동물과 같은 유전자도입 동물을 산출하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 임의의 방법이 본 발명에 이용될 수 있다. 더 나아가, 모유에 재조합 가용성 단백질 폴리펩티드를 분비하는 유전자도입 포유동물을 산출할 수 있다. 전형적으로, 인코딩된 폴리펩티드는 단백질의 모유로의 분비를 담보하는 신호 서열을 보유한다.

“나신” 폴리뉴클레오티드를 함유하고 시험관내와 생체내에 이용되는 조성물은 선행 기술(WO 90/11092; WO 95/11307; Tascon et al., Nature Medicine 2: 888-892, 1996)에서 기술한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 나신 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달은 입자 폭발(particle bombardment)로 수행되는데, 상기 입자는 세포막을 관통하여 세포를 사멸시키지 않으면서 진입할 수 있도록 고속으로 가속되는 DNA-코팅된 유전자 총(microprojectile)이다(Klein et al.((1990) Curr Genet Feb;17(2):97-103). 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 리포좀에 피포된다(Ghosh and Bacchawat,(1991) Targeted Diagn Ther 4:87-103; Wong et al.,(1980) Gene 10:87-94; Nicolau et al.,(1987) Methods Enzymol 149:157-76). 게다가, 이들 리포좀은 렙틴, 트리글리세리드, ACRP30, 또는 다른 공지된 LSR 리간드를 리포좀 막으로 통합함으로써 LSR을 발현하는 세포로 표적될 수 있다. 원하는 숙주 생명체에 주입되는 벡터의 양은 주입 부위에 따라 달라진다. 지정된 분량으로, 벡터는 동물 신체, 바람직하게는, 포유동물 신체, 예를 들면, 생쥐 신체에 0.1 내지 100 ㎍ 주입된다. 본 발명에 따른 벡터의 다른 구체예에서, 이는 숙주 세포, 바람직하게는 치료되는 동물로부터 미리 수집된 숙주 세포, 더욱 바람직하게는 근육 세포와 같은 체세포에 시험관내 도입된다. 후속 단계에서, 원하는 CD164 폴리펩티드 또는 원하는 이의 단편을 코딩하는 벡터로 형질전환된 세포는 체내에서 국지적으로 또는 전신적으로 재조합 단백질을 전달하기 위하여 동물 신체로 재도입된다.

생체내 투여의 경우, 폴리뉴클레오티드는 임의의 농도 범위(가령, 1-500 ㎍/㎖, 바람직하게는 50-100 ㎍/㎖), 임의의 용적(가령, 1-100 ㎖, 바람직하게는 1 내지 20 ㎖)에서 임의의 적합한 조성물로 투여될 수 있고, 임의의 횟수(가령, 1회, 2회, 3회, 5회, 또는 10회), 임의의 빈도(가령, 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 또는 임의의 기간 간격)로 투여될 수 있다. 적절한 농도, 빈도, 투여 양식 등은 특정 폴리뉴클레오티드, 벡터, 동물 등에 좌우되고, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질은 친염증성-및/또는 면역-관련된 사이토킨 발현을 저해할 수 있기 때문에, 염증 및/또는 자가면역 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 생각된다.

면역계의 일차적인 기능은 외래 침입자, 예를 들면, 미생물에 의한 감염으로부터 개체를 보호하는 것이지만, 면역계가 개체의 자가 조직을 공격하여 자가면역 질환이라고 하는 병리 상태를 초래할 수도 있는데, 자가면역 질환은 염증 과정과 빈번하게 연관한다.

특히, CD4+T 세포는 분명하게 구별되는 사이토킨 발현 패턴에 기초하여, T 보조 I형 세포(Th1)와 T 보조 2형 세포(Th2)라고 하는 2가지 상이한 부분집합으로 구분될 수 있다. Th1은 IL-2, 인터페론-γ, IL-12, TNF-α의 분비로 특성화되고, Th2는 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13의 분비로 특성화된다. 그럼에도 불구하고, 이들은 완전한 부분집합은 아닌데, 그 이유는 IFN-γ와 IL-10이 Th1과 Th2 반응과 연관된 효과를 모두 억제할 수 있고, IL-4와 IL-13이 IL-12의 생산을 촉진함으로써 Th1을 자극하고 Th2 반응을 잠재적으로 저해할 수 있기 때문이다. Th1 T 세포는 대식세포 활성화 및 지연형 과민증(DTH)을 매개하여 친-염증성 또는 세포-매개된 면역 반응을 유도할 수 있는 반면, Th2 T 세포는 즉시형 과민 반응(체액 면역; 항체-매개된 반응을 자극하고, 비만 세포를 활성화시키며, 조직 호산성(tissue eosinophilia)을 유도한다)을 유발하는 IgG1과 IgE 분비를 촉진한다. Th1은 류머티스 관절염, 유사 육종증, 결핵과 같은 질환의 병인에서 핵심 특징이며, Th2는 알레르기, 항기생충 반응(antiparasite response), 천식성 기도(가령, 섬유증에서 역할)에 관여한다.

인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유하는 약물 또는 제약학적 조성물이 이용될 수 있는 질환의 무제한적 목록에는 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 류머티스 관절염, 연소성 특발성 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 척추관절병소, 염증성 장 질환, 내독혈증, 크론병, 스틸병, 포도막염, 웨게너 육아종증, 베쳇병, 경피증, 쇼그렌 증후군, 유사 육종증, 괴저성 농피증, 다발성 근염, 피부근염, 심근염, 건선, 전신 경화증, C형 간염, 알레르기, 알레르기성 염증, 알레르기성 기도 염증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 장간막 경색, 발작, 궤양성 대장염, 알레르기성 천식, 기관지 천식, 섬유증, 근육, 신장, 심장에서 허혈후 염증, 피부 염증, 사구체신염, 소아 발병 I형 당뇨병, 과민성 질환, 바이러스성 또는 급성 간 질환, 알코올성 간 부전, 결핵, 패혈성 쇼크, HIV 감염, 이식편-대-숙주 질환(GVHD), 죽상경화증이 포함된다.

류머티스 관절염은 관절 염증의 징후와 증상으로 확인되는 질환이다. 전신성 홍반성 낭창(SLE)은 피부에서 적색의 딱지 파편 및 진행된 단계에서 신장의 기능장애로 특성화되고, 특히 신장에서 혈관 내에 면역 복합체의 침착으로 인한 염증 반응과 연관한다. 다발성 경화증은 약화, 신체 떨림 및 심한 경우에 마비를 유발할 수 있는 재발성 염증 상태로 특성화되는 인간 질환으로, 말초 신경 게포를 둘러싸는 보호성 미엘린 수초의 면역계 공격과 연관한다. 알레르기성 염증은 아토피 질환의 Th2-세포-기초한 병인과 일치한다. 가령, IL-4의 부재하에 Th2 세포의 결함성 시발은 후속의 기도 공격이후 알레르기성 염증 반응의 발생 실패를 유도한다. IL-5와 IL-13은 특징적인 호산구 침윤물 및 점액 분비증가(mucus hypersecretion)를 더욱 직접적으로 주도하는 것으로 밝혀졌다.

다발성 경화증에서, Th1 매개된 면역 반응은 상기 질환을 촉진하는 반면, Th2 매개된 면역 반응은 상기 질환의 진행에 완화 효과를 나타내는 것으로 생각된다. IL-10을 발현하는 T 세포는 다발성 경화증의 쥐 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 억제하는 것으로 밝혀졌다. TNF-α는 EAE의 유도를 주도하는 것으로 가정된다(TNF-α는 Th1과 Th2 배양액 모두에서 분비될 수 있다).

인간 전신성 홍반성 낭창(SLE)은 Th2 반응에 의해 유도되는 것으로 간주된다. 하지만, IFN-γ은 생쥐 모델에서 질병 진행에 중요한 효과를 나타내는 것으로 밝혀진 반면, IL-4는 질병 유지(disease maintenance)를 매개하는 것으로 생각된다.

심근염은 심장 근육의 염증으로 정의되고, 급성 상부 호흡기 감염이후 심장-특이적 항원에 대한 자가면역 반응에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 쥐 모델에서 실험적 자가면역 심근염(EAM)의 심각도는 항-IL-4의 투여에 의해 감소되는데, 이는 질병 진행에서 IL-4의 역할을 암시한다.

본 발명의 다른 구체예는 개체에서 하나이상 사이토킨의 발현을 저해하는 방법인데, 상기 방법은 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 사이토킨은 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, 또는 IL-10일 수 있다. 이들 방법은 아래에 기술된 약리학적 또는 생리학적으로 수용가능한 조성물을 병든 개체에 제공하거나 투여하는 단계를 포함하고, 염증이나 자가면역 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법으로 간주될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제의 존재하에, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유하는 염증이나 자가면역 질환의 치료용 제약학적 조성물로 대표된다. 이들 조성물은 다른 면역억제제 또는 항-염증성 물질을 추가로 함유할 수 있다. 대안으로, 가용성 단백질을 함유하는 제약학적 조성물은 다양한 치료 섭생(regime)에 이용되는 “칵테일”로 조합될 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 또한, 임의의 적합한 제약학적으로 수용가능한 담체, 생물 적합성 운반제, 동물 투여에 적합한 첨가제(가령, 생리 염수)를 함유하고, 궁극적으로 활성 화합물의 제약학적으로 이용될 수 있는 제조물로의 가공을 용이하게 하는 보조제(가령, 부형제, 안정제 또는 희석제)를 함유할 수 있다. 제약학적 조성물은 투여 양식의 요구를 충족하는 임의의 허용되는 방법으로 조제된다. 가령, 특정 투여 양식을 실증하는 상이한 기술과 방법뿐만 아니라 약물 전달을 위한 생체적합물질과 다른 중합체의 이용은 기존 문헌(Cleland JL et al., Curr Opin Biotechnol,12: 212-9, 2001; Luo B and Prestwich GD, Exp Opin Ther Patents, 11: 1395-1410, 2001)에서 공개한다.

“제약학적으로 수용가능한”은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 나타내지 않는 임의의 담체를 포괄한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형(unit dosage form)으로 조제될 수 있다.

활성 성분의 원하는 혈액 수준을 확립하기 위하여 당분야에 공지된 임의의 인정된 투여 양식이 이용될 수 있다. 가령, 투여는 피하, 정맥내, 경막외(epidural), 국소, 피내, 척수강내, 직접 심실내, 복강내, 경피(가령, 서방 조성물에서), 근육내, 비내, 폐내(흡입), 안구내, 경구 또는 협측 경로에 의해 달성될 수 있다. 장관외 투여는 거환 주사, 또는 시간에 따른 점진적인 관류에 의해 달성될 수 있다. 다른 특히 바람직한 투여 경로는 에어로졸과 장기보존(depot) 주사이다. 본 발명에 따른 약물의 서방 주입, 특히, 장기보존 주사가 특히 선호된다.

장관외 투여용 제조물은 당분야에 공지된 보조제 또는 부형제를 보유하는 무균 수성이나 비-수성 용액, 현탁액, 에멀젼을 함유하고, 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 이에 더하여, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적절한 친지성 용제 또는 운반제에는 지방산, 예를 들면, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드를 함유한다. 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유하는 수성 주사 현탁액은 예로써, 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 함유한다. 선택적으로, 현탁액은 안정제를 함유할 수도 있다. 제약학적 조성물은 주사에 의한 투여에 적합한 용액을 함유하고, 부형제와 함께 대략 0.01 내지 99%, 바람직하게는 대략 20 내지 75%의 활성 화합물을 함유한다. 직장 투여될 수 있는 조성물에는 좌약이 포함된다.

장관외(가령, 정맥내, 피하, 근육내) 투여의 경우, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(가령, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(가령, 만니톨) 또는 화학적 안정성(가령, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 냉동 건조된 분말로 조제될 수 있다. 상기 조성물은 통상의 기술로 멸균된다. 점막내 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적합한 침투제가 조성물에 이용된다. 이런 침투제는 당분야에 널리 공지되어 있다.

경구 섭취될 수 있는 제약학적 또는 생리학적으로 수용가능한 제조물에는 젤라틴과 가소제, 예를 들면, 글리콜 또는 솔비톨로 구성되는 연성 밀봉된 캡슐뿐만 아니라 젤라틴으로 구성되는 푸시-핏(push-fit) 캡슐이 포함된다. 푸시-핏 캡슐은 락토오스와 같은 충전제, 전분과 같은 접착제 및/또는 활석이나 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 선택적으로 안정제와 함께 활성 성분을 함유할 수 있다. 연성 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 예를 들면, 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌글리콜에 분해 또는 부유된다. 이에 더하여, 안정제가 첨가될 수 있다. 모든 경구 투여 조성물은 이런 투여에 적합한 형태로 조제되어야 한다.

협측 투여의 경우, 조성물은 통상적 방식으로 조제된 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태를 취한다. 흡입 투여의 경우, 본 발명에 이용되는 화합물은 적절한 가스 추진제, 예를 들면, 이산화탄소의 이용으로, 가압된 포장 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 형태로 편의하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에, 조제 단위(dosage unit)는 정량을 제공하는 밸브를 제공함으로써 결정된다. 흡입기 또는 취입기에 이용되는 예로서 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 본 발명의 화합물 및 적절한 분말 기부, 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 조제된다.

화합물은 주사, 예를 들면, 거환 주사, 또는 연속 주입에 의한 장관외 투여용으로 조제될 수 있다. 주사용 조성물은 보존제가 첨가된 단위 약형, 예를 들면, 앰플 또는 다중-분량 용기에 존재한다. 조성물은 수성 운반제에 담긴 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취하고, 부형제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 조제 보조제를 함유할 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 이용에 앞서, 적절한 운반제. 예를 들면, 무균 무-발열원 물로 조직되는 분말 또는 냉동 건조된 형태를 취할 수도 있다.

상기한 조성물 이외에, 화합물은 장기보존 제조물로 조제될 수도 있다. 이런 장기 작용 조성물은 이식(가령, 피하 또는 근육내), 또는 근육내 주사로 투여된다. 따라서, 이들 화합물은 적절한 중합성이나 소수성 재료(가령, 수용가능 오일에 녹인 에멀젼) 또는 철 교환 수지에 의해 조제되거나, 또는 거의 불용성 유도체, 예를 들면, 거의 불용성 염으로 조제된다. 부가적으로, 이들 화합물은 서방 시스템, 예를 들면, 치료제를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 전달될 수 있다. 확립된 다양한 서방 재료가 당분업자에게 널리 공지되어 있다. 서방 캡슐은 화학적 특성에 따라, 수주 내지 최대 100일간 화합물을 방출할 수 있다.

투여량은 수용자의 연령, 성별, 건강, 체중, 병행 치료법의 종류, 치료 빈도, 요구되는 치료 효과에 좌우된다. 용량은 개별 개체에 맞춤되며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 각 치료에 요구되는 전체량은 복수 분량 또는 단일 분량으로 투여된다. 본 발명의 제약학적 조성물은 단독으로, 또는 다른 질병 치료제 또는 질병의 다른 증상의 치료제와 공동으로 투여된다. 일반적으로, 활성 성분의 일일량은 체중 ㎏당 0.01 내지 100 ㎎ 또는 그 이상으로 구성된다. 통상적으로, 분할 분량 또는 서방 형태로 제공되는 일일 1 내지 40 ㎎/㎏이 원하는 결과를 달성하는데 유효하다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 최초 또는 이전 투여와 동일하거나, 이보다 적거나, 또는 이보다 많은 용량으로 수행될 수 있다.

“효과량”은 질병의 과정과 심각도에 영향을 줄 만큼 충분하고 이런 병리의 감소 또는 소실을 유도하는 활성 성분의 양을 의미한다. 효과량은 투여 경로 및 환자의 상태에 좌우된다.

투약 간격(dosage interval)은 최소 효과 농도에 대한 수치를 이용하여 결정할 수 있다. 화합물은 혈장 수준을 10-90%, 바람직하게는 30-90%, 가장 바람직하게는 50-90% 시간동안 최소 효과 농도 이상으로 유지시키는 섭생을 이용하여 투여해야 한다. 국소 투여 또는 선택적 흡입의 경우에, 약물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 무관하다.

투여되는 조성물의 양은 치료 개체, 개체의 체중, 고통의 심각도, 투여 방식, 처방 의사의 판단에 당연히 좌우된다. 단일 또는 복수 분량으로 개체에 투여되는 용량은 약동학적 특성, 투여 루트, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다.

본 발명의 물질은 매일, 격일, 또는 이보다 적은 횟수로 투여된다. 적절하게는, 본 발명의 물질은 주 1회, 2회 또는 3회 투여된다. 일일량은 일반적으로, 원하는 결과를 달성하는데 효과적인 분할 분량 또는 서방 형태로 제공된다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 최초 또는 이전 투여와 동일하거나, 이보다 적거나, 또는 이보다 많은 용량으로 수행될 수 있다. 2차 또는 후속 투여는 발병 동안 또는 발병에 앞서 투여될 수 있다.

본 발명의 물질은 치료 효과량으로, 다른 치료 섭생 또는 치료제(가령, 복수 약물 섭생)에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 개체에 예방 또는 치료 목적으로 투여될 수 있다. 다른 치료제와 동시에 투여되는 치료제는 동일한 또는 상이한 조성물에 담겨 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 이용되는 임의의 화합물에서, 치료 효과량은 처음에 세포 배양 검사로부터 산정될 수 있다. 가령, 용량은 생체내와 시험관내 시스템에서 사이토킨 발현을 감소시키는 것으로 확인된 농도 지점 또는 범위를 포괄하는 순환 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 결정될 수 있다. 이런 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 치료 효과량은 환자에서 증상의 완화를 결과하는 화합물의 양을 의미한다. 이런 화합물의 독성과 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차, 예를 들면, LD50(검사 집단의 50%를 치사시키는 용량)과 ED50(집단의 50%에서 치료 효과적 용량)을 결정함으로써 확인할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, LD50과 ED50간의 비율로 표시할 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 선호된다. 이들 세포 배양 검사와 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 유용한 용량 범위를 결정하는데 이용될 수 있다. 이런 화합물의 용량은 가급적, 독성 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 위치한다. 용량은 상기 범위 내에서, 이용된 조제 형태와 이용된 투여 경로에 따라 달라진다. 정확한 조제, 투여 경로, 용량은 환자의 상태를 고려하여, 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(참조: Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1).

본 발명은 또한, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유하는 새로운 스크리닝 분석물과 키트를 제시하는데, 이들은 사이토킨 분비와 발현의 저해물질로서 화합물의 특성을 확인하고 비교하는데 이용될 수 있다. 상기 키트와 분석물은 표지되거나 또는 고체 서포트에 고정된 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유한다.

아래의 정의는 본 발명을 설명하는데 이용되는 용어의 의미와 범위를 예시하고 규정한다.

본 명세서에서 혼용되는 “올리고뉴클레오티드”, “폴리뉴클레오티드”, 핵산은 단일 사슬 또는 이중나선 형태로 RNA, DNA, 또는 하나이상 뉴클레오티드의 RNA/DNA 하이브리드 서열을 포함한다. 상기 용어는 (a) 택일적 연결기, (b) 퓨린의 유사 형태, (c) 피리미딘의 유사 형태, 또는 (d) 유사 당을 비롯한 적어도 한가지 변형을 포함하는 “변형된 뉴클레오티드”를 포괄한다. 유사한 연결기, 퓨린, 피리미딘, 당의 실례는 선행 기술(WO 95/04064)에 공지되어 있다. 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 정제 방법뿐만 아니라 합성, 재조합, 탈체 생성, 이들의 조합을 비롯한 임의의 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 구조체, 재조합 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리펩티드는 당분야의 통상적인 의미와 일치한다. “상류”와 “하류” 역시 당분야의 통상적인 의미와 일치한다. “염기 쌍”과 “왓슨 & 크릭(Watson & Crick) 염기 쌍”은 혼용되며, 당분야의 통상적인 의미와 일치한다. 유사하게, 본 명세서에서 “상보적인”, “이의 보체”, “보체”, “상보성 폴리뉴클레오티드”, “상보성 핵산”, “상보성 뉴클레오티드 서열”은 혼용되며, 당분야의 통상적인 의미와 일치한다.

유사하게, 본 명세서에서 “정제된”은 핵산, 지질, 탄수화물, 다른 단백질을 비롯한 다른 화합물로부터 분리된 가용성 단백질을 기술한다. 일부 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 샘플의 폴리펩티드 분자의 적어도 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%가 단일 아미노산 서열을 보유하는 경우에 실질적으로 순수하다. 일부 바람직한 구체예에서, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 전형적으로, 단백질 샘플 중량당 대략 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 중량을 포함한다. 폴리펩티드 순도 또는 균질성(homogeneity)은 당분야에 널리 공지된 다수의 방법, 예를 들면, 샘플의 아가로즈 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 이후 겔을 염색한 직후에 단일 폴리펩티드 밴드의 시각화로 표시한다. 특정 목적을 위하여, HPLC 또는 당분야에 널리 공지된 다른 방법을 이용하여 더욱 높은 분석력을 달성할 수 있다.

더 나아가, 본 명세서에서 “정제된”은 절대 순도를 요하지 않는다; 오히려, 이는 상대적인 정의로서 간주된다. 출발 재료 또는 자연 재료의 적어도 1 크기 자리수, 바람직하게는 2 또는 3 크기 자리수, 더욱 바람직하게는 4 또는 5 크기 자리수로의 정제가 특히 선호된다. 대안으로, 정제는 이종성 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA 또는 둘 모두) 또는 폴리펩티드에 비하여 “최소한” 순도 비율로 표시될 수도 있다. 바람직한 구체예로서, CD164 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 비하여 최소한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 순수하다. 더욱 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 비하여 90% 내지 100% 사이의 임의의 숫자에서부터 천분의 1 단위까지(가령, 최소한 99.995% 순수) “최소한” 순도를 보유한다. 부가적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 순도는 담체 용액을 제외한 모든 재료와 화합물에 상대적인 비율로서 표시된다. 천분의 1 단위까지 각 숫자는 개별 순도 형식으로서 청구된다.

“분리된”은 재료가 최초 환경(가령, 자연적으로 발생하는 경우 자연 환경)으로부터 분리된다는 것을 의미한다. 가령, 생존 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리되지 않지만, 자연 시스템에서 공존하는 일부 또는 전체 재료로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 또는 폴리펩티드는 분리된다. 이런 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부가 되거나, 또는 이런 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부가 될 수 있는데, 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 분리될 수 있다.

“프라이머”는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적이고 표적 뉴클레오티드 서열과의 혼성화에 이용되는 특정 올리고뉴클레오티드 서열을 표시한다. 프라이머는 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 또는 역전사효소에 의해 촉매되는 뉴클레오티드 중합화의 개시 지점(initiation point)으로 기능한다.

“단백질” 또는 “폴리펩티드”는 중합체의 길이에 상관없이 아미노산의 중합체를 의미한다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 상기 용어는 폴리펩티드의 발현후 변형을 지정하거나 배제하지 않는다. 가령, 글리코실 기, 아세틸 기, 인산염 기, 지질 기, 미리스톨화된 기 등의 공유 부착을 보유하는 폴리펩티드가 특히 선호된다. 또한, 상기 정의에는 인산화되거나 탈인산화된 폴리펩티드 역시 포함된다. 상기 정의에는 아미노산의 하나이상 동족체를 보유하는 폴리펩티드(예로써, 비-자연 발생 아미노산, 무관한 생물 시스템에서만 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유동물 시스템으로부터 변형된 아미노산 등 포함), 치환된 연쇄를 보유하는 폴리펩티드, 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 당분야에 공지된 다른 변형 역시 포함된다.

“포함하는”, “구성되는”, “본질적으로 구성되는”은 당분야의 표준 의미에 따라 정의된다. M.P.E.P.에 규정된 정의는 당분야에서 규정된 정의를 지배하고, 항소법원 판례에 규정된 정의는 M.P.E.P.에 규정된 정의를 지배한다. 이런 점에서, 용어는 각 용어와 연관된 특정 의미를 구속하기 위하여 본원 전체에서 서로 대체될 수 있다.

본 명세서에서 “치료”는 임상적 증상의 개시이후 화합물의 투여를 의미한다.

본 명세서에서 “예방”은 임상적 증상의 개시이전 화합물의 투여를 의미한다.

본 명세서에서 “예방”은 질병, 또는 질병의 한가지이상 증상의 완전한 예방뿐만 아니라, 발병 이전이나 발병 초기에 병적 효과의 부분적인 또는 실질적인 예방, 약화, 완화, 감소 또는 소멸을 의미한다.

본 명세서에서 “치료”는 발병 이후 병리학적 발생의 약화, 완화, 감소 또는 소멸을 비롯한 질병의 진행에 대한 임의의 유익한 효과를 의미한다.

논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 참고문헌은 여기에 순전히 참고로 한다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체내용은 순전히 참고로 한다.

공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본원 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 설시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다.

본 발명은 아래의 실시예로써 기술하지만, 상기 실시예는 본원 발명을 한정하지 않는다. 실시예에서는 상술된 도면을 인용한다.

특정 구체예의 전술한 설명에서는 본원 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식(참고문헌의 내용 포함)을 활용하고, 본 발명의 전반적인 개념을 벗어나지 않으면서 과도한 실험없이 이들 특정 구체예를 다양한 용도로 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 공개된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에 이용된 용어는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이를 한정하지 않으며, 본원에 공개된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.

실시예 1: His-표식된 sf-CD164의 포유동물 세포에서 클로닝, 고속 발현, 정제

인간 CD164(NCBI Acc. No. NP_006007의 잔기 1-163; SEQ ID NO: 3)의 전체 세포외 영역을 인코딩하는 cDNA 서열은 GatewayTM 클로닝 기술(Invitrogen)로 서브클론하여 발현 플라스미드를 발생시켰다. 상기 발현 플라스미드는 헥사-히스티딘 태그 융합된 C-말단(146개 아미노산; sf-CD164; SEQ ID NO: 2)을 보유하는 가용성 융합 단백질로서 인간 CD164(140개 아미노산)의 세포외 영역의 성숙 형태의 발현과 분비가 가능하고, 이후 친화성 정제에 이용된다. 분비는 자연 CD164 신호 서열(NCBI Acc. No. NP_006007; SEQ ID NO: 3의 잔기 1-23)에 의해 유도된다.

고속 발현을 위하여 선택된 포유동물 세포는 엡스테인-바르 바이러스 핵 항원(HEK293-EBNA, Invitrogen)을 발현하는 인간 태아 신장 293 세포이다.

이들 세포는 Ex-cell VPRO 혈청-없는 배지(종균, 유지 배지, JRH Biosciences)에서 현탁 상태로 유지시켰다. 트랜스펙션 16 내지 20시간 전에(트랜스펙션 -1일), 세포는 2x T225 플라스크에 접종(2x10⁵ 세포/㎖의 밀도)하는데, 각 플라스크는 2% FBS(소 태아 혈청) 접종 배지(JRH Biosciences)를 보유하는 50 ㎖ DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F12(1:1)을 포함한다. 다음날(트랜스펙션 0일), 트랜스펙션은 JetPEI^TM시제(2 ㎕/㎍ 플라스미드; PolyPlus-트랜스펙션)를 이용하여 수행하였다. 각 플라스크에, 113 ㎍의 sf-CD164 발현 플라스미드는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 2.3 ㎍의 플라스미드로 동시-트랜스펙션시켰다. 이후, 트랜스펙션 혼합물은 2xT225 플라스크에 첨가하고 37℃(5% CO₂)에서 6일동안 배양하였다. 양성 트랜스펙션의 확증은 GFP에 기인한 형광을 정량적으로 평가하는 현미경(Axiovert 10 Zeiss)으로 1일과 6일에 수행하였다. 6일(수집일)에, 2개의 플라스크로부터 상층액(100 ㎖)은 모으고 원심분리(4℃, 400g)하며 고유 식별자가 포함된 병에 집어넣었다.

정제 과정은 C-말단 His-표식된 재조합 단백질을 발현하는 세포로부터 얻은 100 내지 500 ㎖ 배양 배지 샘플을 출발 물질로 하여 수행하였다. 이들 샘플은 각각, 1 용적의 차가운 완충액 A(50 mM NaH₂PO₄; 600 mM NaCl; 8.7 %(w/v) 글리세롤, pH 7.5) 내지 200과 1000 ㎖의 최종 용적으로 희석하였다. 샘플은 0.22 m 무균 필터(Millipore, 500 ㎖ 필터 단위)를 통하여 여과하고 무균 사각 배양 용기(Nalgene)에서 4℃에 유지시켰다.

정제는 자동 샘플 적하기(Labomatic)에 연결된 VISION 워크스테이션(Applied Biosystems)에서 4℃에서 수행하였다. 정제 절차는 2가지 연속 단계, Ni 이온(4.6 x 50 mm, 0.83 ㎖)으로 충전된 Poros 20 MC(Applied Biosystems) 칼럼에서 금속 친화성 크로마토그래피, 이후 Sephadex G-25 배지(Amersham Pharmacia) 칼럼(1.0 x 10 cm)에서 겔 여과로 구성되었다.

첫 번째 크로마토그래피 단계에서, 금속 친화성 칼럼(Ni-칼럼)은 30 칼럼 용적의 EDTA 용액(100 mM EDTA; 1 M NaCl; pH 8.0)으로 재생시키고, 5 칼럼 용적의 100 mM NiSO₄ 용액으로 세척함으로써 Ni 이온으로 재충전시키며, 10 칼럼 용적의 완충액 A와 7 칼럼 용적의 완충액 B(50 mM NaH₂PO₄; 600 mM NaCl; 8.7 %(w/v) 글리세롤, 400 mM; imidazole, pH 7.5)로 순차적으로 세척하고, 최종적으로 15 mM 이미다졸을 함유하는 15 칼럼 용적의 완충액 A로 평형화시켰다. 샘플은 Labomatic 샘플 적하기로 200 ㎖ 샘플 루프에 이전하고, 이후 10 ㎖/min의 유속으로 Ni 금속 친화성 칼럼에 충전시켰다. 1000 ㎖ 샘플의 경우에, 충전 절차는 5회 반복하였다. Ni-칼럼은 12 칼럼 용적의 완충액 A 및 20 mM 이마다졸을 함유하는 28 칼럼 용적의 완충액 A로 순차적으로 세척하였다. 세척동안, 약하게 부착된 오염 단백질은 칼럼으로부터 용출되었다. 재조합 His-표식된 단백질은 2 ㎖/min의 유속으로 10 칼럼 용적의 완충액 B로 Ni-칼럼으로부터 최종적으로 용출하고, 용출된 단백질은 1.6 ㎖ 분획물에 집합시켰다.

2차 크로마토그래피 단계에서, Sephadex G-25 겔-여과 칼럼은 2 ㎖의 완충액 D(1.137 M NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH₂PO₄; 8 mM Na₂HPO₄; pH 7.2)로 재생시키고, 이후 4 칼럼 용적의 완충액 C(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH₂PO₄; 8 mM Na₂HPO₄; 20 %(w/v) 글리세롤; pH 7.4)로 평형화시켰다. Ni-칼럼으로부터 용출된 피크 분획물은 VISION에서 통합 샘플 적하기를 통하여, Sephadex G-25 칼럼으로 자동 적하하고, 단백질은 2 ㎖/min의 유속으로 완충액 C로 용출하였다. 탈염된 샘플은 2.2 ㎖ 분획물에 집합시켰다. 분획물은 0.22 ㎛ 무균 원심분리 필터(Millipore)를 통하여 여과하고 분량하며 동결하고 80℃에서 보관하였다. 샘플 분량은 쿠마시에 염색(Coomassie staining) 및 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 SDS-PAGE(4-12% NuPAGE 겔; Novex)에서 분석하였다.

쿠마시에 염색은 실온에서 1시간동안, 0.1% 쿠마시에 블루 R250 염색 용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에 NuPAGE 겔을 배양함으로써 수행하였다. 이후, 겔은 배경이 투명해지고 단백질 띠가 분명하게 나타날 때까지, 20% 메탄올, 7.5% 아세트산에서 탈염색하였다.

웨스턴 블랏에서, 단백질은 4℃에서 1시간동안, 290 mA에서 NuPAGE 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 전기이전하였다. 막은 완충액 E(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH₂PO₄; 8 mM Na₂HPO₄; 0.1% Tween 20, pH 7.4)에 담긴 5% 우유 분말로 실온에서 1시간동안 차단하고, 이후 완충액 E에 담긴 2.5% 우유 분말에서 2가지 다클론 항-His 항체(G-18과 H-15, 각각 0.2 ㎍/㎖; Santa Cruz)의 혼합물과 함께 배양하였다. 실온에서 1시간동안 추가로 배양한 이후, 막은 완충액 E(3 x 10 min)로 세척하고, 2.5% 우유 분말을 함유하는 완충액 E에서 1/3000 희석된 2차 HRP-공액된 항-토끼 항체(DAKO, HRP 0399)와 함께 배양하였다. 완충액 E(3 x 10 min)로 세척한 이후, 막은 1시간동안 ECL 키트(Amersham Pharmacia)로 진전시켰다. 막은 Hyperfilm(Amersham Pharmacia)에 노출시키고, 필름은 현상하고, 웨스턴 블랏 이미지는 시각적으로 분석하였다.

샘플에서 단백질 농도는 소 혈청 알부민으로 표준으로 하는 BCA 단백질 검사 키트(Pierce)를 이용하여 결정하였다.

실시예 2: 세포-기초한 검사법으로 측정된 사이토킨 방출에 대한 sf-CD164의 효과

아래의 시험관내 세포-기초한 검사법은 IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-4, IL-10에 대한 사이토킨 비드 어레이(CBA) 검사에 의해 측정된 콘카나발린 A(Con A)에 의해 유도된 사이토킨 분비에 대한 sf-CD164의 효과를 측정한다.

아래의 장치와 소프트웨어가 이용되었다:

- 96 웰 마이크로역가 평판 광도계 EX(Labsystem).

- Graph Pad Software(Prism)

- Excel 소프트웨어(Microsoft)

- 유세포분석기(Becton-Dickinson)

- CBA 분석 소프트웨어

- 세포 배양용 후드

- 세포 배양용 배양기

- 원심분리기

- 피펫

아래의 재료와 시제가 이용되었다:

- 연막층(buffy coat)

- DMEM(GIBCO)

- 인간 혈청형 AB(SIGMA)

- L-글루타민(GIBCO)

- 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO)

- Ficoll(PHARMACIA)

- 세포 배양용 96 웰 마이크로역가 평판(COSTAR)

- 콘카나발린 A(SIGMA)

- 인간 Th1/Th2 사이토킨 CBA 키트(Becton-Dickinson)

- PBS(GIBCO)

- Falcon 50 ㎖ 무균 튜브(Becton-Dickinson)

- 소 혈청 알부민(BSA; SIGMA)

- 글리세롤(MERCK)

- 디메틸 설폭사이드(DMSO; SIGMA)

- 96 웰 마이크로역가 원뿔형 바닥(NUNC)

- autoMACS^TM 분리기와 MACS 세포 분리 키트(Miltenyl Biotec)

세포는 아래와 같은 세포-기초한 검사를 위하여 분리하였다.

인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 DMEM으로 희석된 연막층으로부터 분리하였다. 이후, 25 ㎖의 희석된 혈액은 50 ㎖ Falcon 튜브에서 15 ㎖의 Ficoll 층에 첨가하고, 튜브는 원심분리하였다(2000 rpm, 20 min, 실온에서 중단없이). 그 다음, 간기(고리)는 수집하고, 세포는 25 ㎖의 DMEM으로 세척하고 원심분리 단계(1200 rpm, 5 min)를 수행하였다. 이런 절차는 3회 반복하였다. 연막층은 대략 600 x 10⁶ 개의 전체 세포를 제공하였다.

백혈구(T 세포, B 세포, 단핵구)의 아집단은 분리 키트 제조업체(MACS; Miltenyl Biotec)의 지시에 따라, PBMC로부터 준비하였다. PBMC는 상기한 바와 같이 연막층으로부터 분리하였다. 단일-세포 현탁액이 되도록 주의하였다. CD4+ T 세포를 준비하기 위하여, CD4+ T 세포 분리 키트 II(제품 번호 130-091-155, Miltenyl Biotec)를 이용하였다. PBMC는 산정하고 10분간 원심분리하며 차가운 PBS 완충액(0.5% BSA와 2mM EDTA로 보충된 인산염 완충액, pH 7.2)에서 ㎖당 2.5 x 10⁸개의 세포(10⁷개의 세포당 40 ㎕의 완충액)로 재-부유시켰다. 10⁷개의 전체 세포당 10 ㎕의 비오틴-항체 칵테일(키트와 함께 제공된)을 첨가하였다. 현탁액은 충분히 혼합하고, 4-8℃에서 10분간 배양하였다. 10⁷개의 세포당 30 ㎕의 완충액 및 10⁷개의 전체 세포당 20 ㎕의 항-비오틴 마이크로비드를 순차적으로 첨가하였다. 현탁액은 충분히 혼합하고, 4-8℃에서 추가로 15분동안 배양하였다. 세포는 10-20x 표시 용적(labeling volume)을 첨가함으로써 완충액으로 세척하고 300xg에서 10분간 원심분리하였다. 상층액은 완전히 제거하고, 세포는 500 ㎕의 완충액에서 최대 10⁸개의 세포까지 재-부유시켰다. autoMACS^TM 분리기로 자성 분리를 수행하였다. autoMACS^TM 분리기는 제조업체의 지시에 따라 준비하고 시발하였다. 자성 표지된 세포를 보유하는 튜브는 autoMACS^TM 분리기에 위치시키고, 프로그램 “고갈”을 선택 하였다. 음성 분획물은 수집하였다(출구 포트 "neg1"). 상기 분획물은 농축된 CD4+ T 세포를 나타낸다. 필요한 경우에, 양성 분획물을 차후에 수집하였다(출구 포트 "pos1"). 상기 분획물은 자성 표지된 비-CD4+ T 세포를 나타낸다.

세포-기초한 검사법에 적용된 조건은 아래와 같다:

- 96-웰 평판에서 100 ㎕ 최종 2% 글리세롤에 담긴 100,000개 세포/웰.

- 5 ng/㎖의 미토겐 콘카나발린 A(ConA).

- 각 검사에서 48 시간.

세포는 혼합으로 각 웰에서 준비하였다.

- 80 ㎕의 1.25 x 10⁶개 세포/㎖를 DMEM + 2.5% 인간 혈청 + 1% L-글루타민 + 1% 페니실린-스트렙토마이신에 희석하였다.

- PBS + 20% 글리세롤에 희석된 sf-CD164를 함유하는 10 ㎕의 용액(단백질의 최종 희석도는 1/10이다);

- 10 ㎕ ConA.

48시간후, 세포 상층액은 수집하고, 인간 사이토킨은 인간 Th1/Th2 사이토킨 CBA 키트(Becton-Dickinson)로 측정하였다.

혼합된 인간 Th1/Th2 포획 비드 현탁액은 마이크로웰 평판으로부터 얻은 샘플과의 혼합에 앞서, 수초동안 활발하게 교반하여 준비하였다. 각 분석물에 대하여, 각 포획 비드의 10 ㎕ 분량을 “혼합 포획 비드”라고 하는 단일 튜브에 첨가하였다. 비드 혼합물은 완전하게 교반하였다. 상층액은 검사 희석액(20 ㎕의 상층 액 + 60 ㎕의 검사 희석액)을 이용하여 희석하였다(1:4). 이후, 샘플 희석액은 샘플을 96 웰 마이크로역가 평판 원뿔형 바닥(Nunc)으로 이전하기에 앞서, 혼합하였다.

인간 Th1/Th2 사이토킨 CBA 검사는 50 ㎕의 희석된 상층액을 96 웰 마이크로역가 평판 원뿔형 바닥(Nunc)에 첨가함으로써 수행하였다. 50 ㎕의 혼합 포획 비드 및 50 ㎕의 인간 Th1/Th2 PE 검출 시제를 순차적으로 첨가하였다. 이후, 평판은 실온에서 3시간동안 배양하고 광에 대한 직접 노출로부터 보호하며 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 조심스럽게 버렸다. 후속 단계에서, 200 ㎕의 세척 완충액을 각 웰에 2회 첨가하고 1500rpm에서 5분간 원심분리하며 상층액을 조심스럽게 버렸다. 이후, 130 ㎕의 세척 완충액을 각 웰에 첨가하여 비드 펠렛을 재부유시켰다. 샘플은 유세포분석기에서 최종적으로 분석하였다. 데이터는 CBA 응용 소프트웨어, Activity Base, Microsoft Excel 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

인간 PBMC 세포(혼합물)와 분리된 T 세포로부터 사이토킨 방출에 대한 sf-CD164의 효과는 6가지 사이토킨: TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10에 대하여 측정하였다. 이들 사이토킨의 방출은 양 세포-기초한 검사에서 sf-CD164에 의해 용량-의존성 방식으로 유의하게 감소하였다(IC50은 표 III에 요약한다). 인간 PBMC와 분리된 CD4+ T 세포 모두에서 IL-2와 TNF-α에 대한 2가지 전형적인 용량-의존성 곡선은 각각, 도 2와 3에 도시한다.

실시예 3: LPS 유도된 TNF-α 방출 동물 모델에서 측정된 사이토킨 방출에 대한 sf-CD164 투여의 효과

생쥐에서 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 TNF-α 방출의 모델은 특허 WO98/38179에 따라 설정하였다. LPS(O111:B4; SIGMA)를 C3H/HeN 생쥐(Charles River, France)에 주입하였다(0.3 ㎎/㎏, i.p.). 90분후, 혈액 샘플을 채취하고 ELISA 키트(R&D)를 이용하여 혈장 TNF-α를 측정하였다. Sf-CD164와 덱사메타손은 PBS에서 희석하고 LPS 투여 15분전에 주입하였다(Sf-CD164, 0.03, 0.1, 0.3 ㎎/㎏, iv; 또는 덱사메타손, 0.1 ㎎/kg, sc).

양성 대조로 이용되는 소염 화합물 덱사메타손은 LPS-유도된 TNF-α 방출을 72%로 유의하게 저해하였다(p < 0.001). 0.3 ㎎/kg에서 Sf-CD164는 LPS-유도된 TNF-α방출을 38%로 유의하게 저해하였다(p < 0.01)(도 4). 적은 용량, 0.03과 0.1 ㎎/kg은 통계학적으로 덜 유의한 방식으로 TNF-α를 저해할 수 있었다.

실시예 4: 2가지 동물 모델에서 측정된 면역 세포 동원에 대한 sf-CD164 투여의 효과

면역 세포 동원에 대한 sf-D164 투여의 효과는 먼저, 티오글리콜레이트(thyoglicollate)-유도된 백혈구 복막 동원 검사를 이용하여 검사하였다(도 5).

생쥐(계통 C3H, 8주령, n=6; Elevage Janvier, France)에 0.02% BSA를 함유하는 PBS에 희석된 sf-CD164(0.03, 0.1, 0.3 ㎎/kg, iv) 또는 덱사메타손(1 ㎎/kg, sc)을 주입하였다. 검사 물질의 투여 15분후에 티오글리콜레이트(1.5%, 40 ㎖/㎏, ip SIGMA)를 주입하였다. 검사 물질의 2차 투여는 24시간후에 수행하였다. 티오글리콜레이트로 공격이후 48시 시점에, 이들 동물은 희생시키고 2 x 5 ㎖ PBS-1mM EDTA(+4℃)를 이용하여 복막강의 세척을 수행하였다. 원심분리(3000 rpm에서 10분)이후, 펠렛은 1 ㎖ PBS에 재부유시켰다. 복막 세포는 Beckman/Coulter 계수기를 이용하여 계산하였다.

덱사메타손은 대식세포의 동원을 69%로 유의하게 저해하였다(p <0.001). 상기 효과는 용량-의존성이었다. Sf-CD164(0.03, 0.1, 0.3 ㎎/kg)는 림프구(각각, 14%, 18%, 34%)와 호중구 복막 동원(각각, 3%, 9%, 23%) 뿐만 아니라, 대식세포의 티오글리콜레이트-유도된 복막 동원을 각각, 5%, 26%(p < 0.05), 43%(p < 0.001)로 유의하게 저해하였다.

호중구와 림프구의 LPS-유도된 복막 동원에서 동일한 결과가 달성되었다(도 5).

LPS(O111:B4, Sigma; 0.9 ㎎/kg, 40 ㎖/㎏,ip)에 상기한 바와 동일한 투여 프로토콜을 이용하였다. Sf-CD164(0.03, 0.1, 0.3 ㎎/kg)는 호중구의 LPS-유도된 복막 동원을 각각, 9%, 35%(p < 0.001), 43%(p < 0.001)로 유의하게 저해하였다. 동일한 용량에서, 이는 활성화된 림프구의 동원 역시 각각, 8%, 26%(p < 0.05), 47%(p < 0.001)로 유의하게 저해하였다. 덱사메타손(0.1 ㎎/kg)은 활성화된 림프구의 동원을 유의하게 저해하였다(p <0.001).

실시예 5: MBP-특이적 항원 가공과 제시에 대한 세포-기초한 검사에서 sf-CD164의 효과.

미엘린 염기성 단백질 펩티드 Ac1-11(MBP(Ac1-11)에 의해 유도된 미엘린 염기성 단백질(MBP)-특이적 T 세포의 증식에 대한 Sf-CD164의 효과를 검사하는 검사 법을 개발하였다. 미엘린 염기성 단백질의 면역우성 펩티드, Ac1-11로 피내단자(epicutaneous) 면역(ECi)은 실험적 알레르기 뇌척수염(EAE)의 유도된 형태와 자발적 형태 모두에 대한 Ac1-11-특이적 T 세포 수용체가 유전자도입된 생쥐를 보호하는 것으로 밝혀졌다.

B10.PL과 MBP 유전자도입 생쥐로부터 비장은 수집하고 균질화시켜 단일 세포 현탁액을 얻었다. Gay 용액으로 적혈구 용해이후, 비장세포는 PBS에 재부유시키고 세척하며 계산하였다. 분리 절차이후, 세포 생존능(cellular viability)은 트리판 블루 염색법(trypan blue dye exclusion)으로 90% 이상이었다. 이후, B10.PL 항원 제시 세포(APC)는 25 Gy의 g-방사선(자극물질)으로 조사하고 세척하며 완전 배지에서 1.9*10⁶개 세포/㎖로 재부유시켰다. 반응 세포 집단은 완전 배지에서 3.8*10⁶개 세포/㎖로 조정하였다. 웰당 80 ㎕의 각 세포 현탁액은 96 웰 평판에서 혼합하였다. 이후, 항원을 20 ㎕의 용적으로 첨가하였다: 웰당 10 ㎍/㎖의 MBP 뮤린 또는 1 ㎍/㎖의 Ac 1-11 MBP 펩티드(적절한 음성 대조는 각각, BSA, MSA, 무관계한 MBP-유래된 펩티드이다). 단백질 또는 소형 분자를 20 ㎕의 용적으로 첨가하고 5% CO₂의 가습된 대기하에 37℃에서 배양하였다. 3일동안 배양한 이후, 상층액을 수집하고 사이토킨 생산의 검사 때까지 -80℃에서 동결시키거나, 또는 1μCi의 ³H 티미딘을 첨가하고 14-16 시간의 추가 배양이후 방사능 함입을 계산하였다.

Sf-CD164(50 ㎍/㎖)는 Ac1-11(1 ㎍/㎖)에 의해 유도된 MBP 특이적 T 세포의 증식을 유의하게 저해하였다(도 6). 따라서, sf-CD164 또는 가용성 CD164는 다발성 경화증의 치료에 유효할 수 있다.

실시예 6: 전격성 간 간염의 동물 모델에서 sf-CD164 투여

Sf-CD164 단백질은 시험관내에서, ConA-자극된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 의한 특정 사이토킨의 분비를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 사이토킨이 T 세포 유도된 ConA 유도된 간 간염에서 결정적인 역할을 하기 때문에(Seino et al. 2001, Annals of surgery 234, 681; Kusters S, Gastroenterology 111(2):462-71, 1996; Toyonaga et al. 1994, PNAS 91, 614-618), 상기 모델에서 sf-CD164를 검사하였다.

암컷 C57/BL6 생쥐(8주령; IFFA CREDO)를 이용하였다. 일반적으로, 실험 군당 7마리의 동물을 이용한다. 생쥐는 12시간 명암 주기하에 표준 조건에 유지하고, 조사(irradiation)된 사료와 물을 무제한으로 공급하였다.

콘카나발린 A(ConA; Sigma ref.C7275)를 18㎎/kg iv로 주입하고, 주입후 1.30시와 8시 시점에 채취하였다. Sf-CD164는 ConA 주입 30분전에 주입하였다. 양성 대조는 덱사메타손(0.1 ㎎/kg)을 주입하고, 음성 대조는 PBS-BSA 1.8% 글리세롤을 주입하였다. 희생 시점에, 심장으로부터 혈액을 채취하였다. IL-6과 IFN-감마 사이토킨 수준은 ConA 주입이후 1.5시 시점에 TH1/TH2 CBA 검사를 이용하여 측정하였다. 트랜스아미나아제 혈액 파라미터는 COBAS 장치(Hitachi)를 이용하여 결정하였다.

상기 실험은 sf-CD164(1 ㎎/kg)가 sf-CD164의 피하 전달이후 전격성 간염을 모방하는 생쥐 모델에서 간 손상으로부터 보호를 제공한다는 것을 입증하는데, 그 이유는 sf-CD164가 트랜스아미나아제 수준(ALAT), IFN-γ, IL-6 사이토킨 수준과 같은 유관한 파라미터를 감소시키기 때문이다(도 7). ALAT 수준에서 감소는 감소된 IFN-γ와 IL-6 수준 모두에 기인하는 것으로 보인다. ConA 주입이후 간 손상에 서로 다른 사이토킨이 관여한다. 가령, 항-TNF-알파 항체는 질병으로부터 보호를 공여하고(Seino et al. 2001, Annals of surgery 234, 681), NKT 세포에 의한 IL-4 생산의 저해는 생쥐의 T-세포 매개된 간염에서 간-보호성인 것으로 밝혀졌다(Ajuebor et al. 2003 J. Immunology 170, 5252-9).

SEQUENCE LISTING <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V. <120> USE OF SOLUBLE CD164 IN INFLAMMATION AND/OR AUTOIMMUNE DISORDERS <130> PCT883 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PUTATIVE-MUCIN-CORE-PROTEIN-24 <222> (1)..(140) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (3)..(3) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (9)..(9) <220> <221> O-LINKED <222> (11)..(11) <220> <221> O-LINKED <222> (12)..(12) <220> <221> O-LINKED <222> (17)..(17) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (18)..(18) <220> <221> O-LINKED <222> (20)..(20) <220> <221> O-LINKED <222> (21)..(21) <220> <221> O-LINKED <222> (25)..(25) <220> <221> O-LINKED <222> (26)..(26) <220> <221> O-LINKED <222> (31)..(31) <220> <221> O-LINKED <222> (32)..(32) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (49)..(49) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (54)..(54) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (71)..(71) <220> <221> CK2-PHOSPHO-SITE <222> (73)..(76) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (81)..(81) <220> <221> O-LINKED <222> (89)..(89) <220> <221> O-LINKED <222> (90)..(90) <220> <221> O-LINKED <222> (92)..(92) <220> <221> O-LINKED <222> (96)..(96) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (98)..(98) <220> <221> O-LINKED <222> (99)..(99) <220> <221> O-LINKED <222> (100)..(100) <220> <221> PKC-PHOSPHO-SITE <222> (100)..(102) <220> <221> O-LINKED <222> (104)..(104) <220> <221> O-LINKED <222> (108)..(108) <220> <221> O-LINKED <222> (110)..(110) <220> <221> O-LINKED <222> (111)..(111) <220> <221> O-LINKED <222> (112)..(112) <220> <221> PKC-PHOSPHO-SITE <222> (112)..(114) <220> <221> O-LINKED <222> (113)..(113) <220> <221> O-LINKED <222> (115)..(115) <220> <221> O-LINKED <222> (117)..(117) <220> <221> O-LINKED <222> (118)..(118) <220> <221> O-LINKED-GLYCOSAMINOGLYCAN <222> (119)..(119) <220> <221> MYRISTYL <222> (120)..(125) <220> <221> O-LINKED <222> (121)..(121) <220> <221> O-LINKED <222> (122)..(122) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (123)..(123) <220> <221> O-LINKED <222> (125)..(125) <220> <221> O-LINKED <222> (127)..(127) <220> <221> O-LINKED <222> (129)..(129) <220> <221> O-LINKED <222> (130)..(130) <220> <221> CAMP-PHOSPHO-SITE <222> (134)..(137) <220> <221> O-LINKED <222> (136)..(136) <220> <221> CK2-PHOSPHO-SITE <222> (136)..(139) <400> 1 Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Ser Ala Pro Val Thr Ser Leu Pro Leu Val Thr Thr 20 25 30 Pro Ala Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg Asn Ser Cys Val Ser Cys Phe 35 40 45 Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys Phe Trp Ile Glu Cys Lys Asp 50 55 60 Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr Val Ser Asp Cys Gln Val Gly 65 70 75 80 Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Val Ser Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr 85 90 95 Ala Asn Ser Thr Ala Lys Pro Thr Val Gln Pro Ser Pro Ser Thr Thr 100 105 110 Ser Lys Thr Val Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Asn Thr Val Thr Pro 115 120 125 Thr Ser Gln Pro Val Arg Lys Ser Thr Phe Asp Ala 130 135 140 <210> 2 <211> 146 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Ser Ala Pro Val Thr Ser Leu Pro Leu Val Thr Thr 20 25 30 Pro Ala Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg Asn Ser Cys Val Ser Cys Phe 35 40 45 Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys Phe Trp Ile Glu Cys Lys Asp 50 55 60 Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr Val Ser Asp Cys Gln Val Gly 65 70 75 80 Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Val Ser Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr 85 90 95 Ala Asn Ser Thr Ala Lys Pro Thr Val Gln Pro Ser Pro Ser Thr Thr 100 105 110 Ser Lys Thr Val Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Asn Thr Val Thr Pro 115 120 125 Thr Ser Gln Pro Val Arg Lys Ser Thr Phe Asp Ala His His His His 130 135 140 His His 145 <210> 3 <211> 197 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Met Ser Arg Leu Ser Arg Ser Leu Leu Trp Ala Ala Thr Cys Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Cys Val Leu Ser Ala Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn 20 25 30 Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile Ser Asn Val Thr Ser Ala Pro Val Thr 35 40 45 Ser Leu Pro Leu Val Thr Thr Pro Ala Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg 50 55 60 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Cys Phe Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys 65 70 75 80 Phe Trp Ile Glu Cys Lys Asp Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr 85 90 95 Val Ser Asp Cys Gln Val Gly Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Ala Lys 100 105 110 Pro Thr Val Gln Pro Ser Pro Ser Thr Thr Ser Lys Thr Val Thr Thr 115 120 125 Ser Gly Thr Thr Asn Asn Thr Val Thr Pro Thr Ser Gln Pro Val Arg 130 135 140 Lys Ser Thr Phe Asp Ala Ala Ser Phe Ile Gly Gly Ile Val Leu Val 145 150 155 160 Leu Gly Val Gln Ala Val Ile Phe Phe Leu Tyr Lys Phe Cys Lys Ser 165 170 175 Lys Glu Arg Asn Tyr His Thr Leu 180 <210> 5 <211> 178 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 5 Met Ser Arg Leu Ser Arg Ser Leu Leu Trp Ala Ala Thr Cys Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Cys Val Leu Ser Ala Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn 20 25 30 Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile Ser Asn Val Thr Ser Ala Pro Val Thr 35 40 45 Ser Leu Pro Leu Val Thr Thr Pro Ala Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg 50 55 60 Asn Ser Cys Val Ser Cys Phe Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys 65 70 75 80 Phe Trp Ile Glu Cys Lys Asp Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr 85 90 95 Val Ser Asp Cys Gln Val Gly Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Val Ser 100 105 110 Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr Ala Asn Ser Thr Gly Thr Thr Asn Asn 115 120 125 Thr Val Thr Pro Thr Ser Gln Pro Val Arg Lys Ser Thr Phe Asp Ala 130 135 140 Ala Ser Phe Ile Gly Gly Ile Val Leu Val Leu Gly Val Gln Ala Val 145 150 155 160 Ile Phe Phe Leu Tyr Lys Phe Cys Lys Ser Lys Glu Arg Asn Tyr His 165 170 175 Thr Leu <210> 6 <211> 189 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <220> <221> PUTATIVE-MUCIN-CORE-PROTEIN-24 <222> (24)..(189) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (26)..(26) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (32)..(32) <220> <221> O-LINKED <222> (34)..(34) <220> <221> O-LINKED <222> (35)..(35) <220> <221> O-LINKED <222> (40)..(40) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (41)..(41) <220> <221> O-LINKED <222> (43)..(43) <220> <221> O-LINKED <222> (44)..(44) <220> <221> O-LINKED <222> (48)..(48) <220> <221> O-LINKED <222> (49)..(49) <220> <221> O-LINKED <222> (54)..(54) <220> <221> O-LINKED <222> (55)..(55) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (72)..(72) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (77)..(77) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (94)..(94) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (104)..(104) <220> <221> O-LINKED <222> (112)..(112) <220> <221> O-LINKED <222> (113)..(113) <220> <221> O-LINKED <222> (115)..(115) <220> <221> O-LINKED <222> (119)..(119) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (121)..(121) <220> <221> O-LINKED <222> (122)..(122) <220> <221> O-LINKED <222> (123)..(123) <220> <221> O-LINKED <222> (127)..(127) <220> <221> O-LINKED <222> (131)..(131) <220> <221> O-LINKED <222> (133)..(133) <220> <221> O-LINKED <222> (134)..(134) <220> <221> O-LINKED <222> (135)..(135) <220> <221> O-LINKED <222> (136)..(136) <220> <221> O-LINKED <222> (138)..(138) <220> <221> O-LINKED <222> (140)..(140) <220> <221> O-LINKED <222> (141)..(141) <220> <221> O-LINKED-GLYCOSAMINOGLYCAN <222> (142)..(142) <220> <221> O-LINKED <222> (144)..(144) <220> <221> O-LINKED <222> (145)..(145) <220> <221> N-LINKED-GLCNAC <222> (146)..(146) <220> <221> O-LINKED <222> (148)..(148) <220> <221> O-LINKED <222> (150)..(150) <220> <221> O-LINKED <222> (152)..(152) <220> <221> O-LINKED <222> (153)..(153) <220> <221> O-LINKED <222> (159)..(159) <400> 6 Met Ser Arg Leu Ser Arg Ser Leu Leu Trp Ala Ala Thr Cys Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Cys Val Leu Ser Ala Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn 20 25 30 Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile Ser Asn Val Thr Ser Ala Pro Val Thr 35 40 45 Ser Leu Pro Leu Val Thr Thr Pro Ala Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg 50 55 60 Asn Ser Cys Val Ser Cys Phe Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys 65 70 75 80 Phe Trp Ile Glu Cys Lys Asp Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr 85 90 95 Val Ser Asp Cys Gln Val Gly Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Val Ser 100 105 110 Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr Ala Asn Ser Thr Ala Lys Pro Thr Val 115 120 125 Gln Pro Ser Pro Ser Thr Thr Ser Lys Thr Val Thr Thr Ser Gly Thr 130 135 140 Thr Asn Asn Thr Val Thr Pro Thr Ser Gln Pro Val Arg Lys Ser Thr 145 150 155 160 Phe Asp Ala Ala Ser Phe Ile Gly Gly Ile Val Leu Val Leu Glu Ile 165 170 175 Arg Cys His Thr Arg Asn Tyr Ile Pro Asp Leu Lys Lys 180 185 <210> 7 <211> 197 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (186)..(186) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 7 Met Ser Arg Leu Ser Arg Ser Leu Leu Trp Ala Ala Thr Cys Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Cys Val Leu Ser Ala Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn 20 25 30 Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile Ser Asn Val Thr Ser Ala Pro Val Thr 35 40 45 Ser Leu Pro Leu Val Thr Thr Pro Ala Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg 50 55 60 Asn Ser Cys Val Ser Cys Phe Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys 65 70 75 80 Phe Trp Ile Glu Cys Lys Asp Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr 85 90 95 Val Ser Asp Cys Gln Val Gly Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Val Ser 100 105 110 Thr Ala Thr Pro Val Pro Thr Ala Asn Ser Thr Ala Lys Pro Thr Val 115 120 125 Gln Pro Ser Pro Ser Thr Thr Ser Lys Thr Val Thr Thr Ser Gly Thr 130 135 140 Thr Asn Asn Thr Val Thr Pro Thr Ser Gln Pro Val Arg Lys Ser Thr 145 150 155 160 Phe Asp Ala Ala Ser Phe Ile Gly Gly Ile Val Leu Val Xaa Gly Val 165 170 175 Xaa Ala Val Ile Phe Phe Leu Tyr Lys Xaa Cys Lys Xaa Lys Glu Arg 180 185 190 Asn Tyr His Thr Leu 195 <210> 8 <211> 195 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Met Ser Arg Leu Ser Arg Ser Leu Leu Trp Ala Ala Thr Cys Leu Gly 1 5 10 15 Val Leu Cys Val Leu Ser Ala Asp Lys Asn Thr Thr Gln His Pro Asn 20 25 30 Val Thr Thr Leu Ala Pro Ile Ser Asn Val Lys Ser Leu Ile Ser Cys 35 40 45 Ile Ser Pro Pro Asn Ser Pro Glu Thr Cys Glu Gly Arg Asn Ser Cys 50 55 60 Val Ser Cys Phe Asn Val Ser Val Val Asn Thr Thr Cys Phe Trp Ile 65 70 75 80 Glu Cys Pro Pro Thr Asp Glu Ser Tyr Cys Ser His Asn Ser Thr Val 85 90 95 Ser Asp Cys Gln Val Gly Asn Thr Thr Asp Phe Cys Ser Gly Lys Tyr 100 105 110 Ser Tyr Trp Leu Leu Gly Ser Ile Pro Ala Lys Pro Thr Val Gln Pro 115 120 125 Ser Pro Ser Thr Thr Ser Lys Thr Val Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn 130 135 140 Asn Thr Val Thr Pro Thr Ser Gln Pro Val Arg Lys Ser Thr Phe Asp 145 150 155 160 Ala Ala Ser Phe Ile Gly Gly Ile Val Leu Val Leu Gly Val Gln Ala 165 170 175 Val Ile Phe Phe Leu Tyr Lys Phe Cys Lys Ser Lys Glu Arg Asn Tyr 180 185 190 His Thr Leu 195

Claims (23)

1. 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질의 용도.
2. 제 1 항에 있어서, 가용성 단백질은

   a) SEQ ID NO: 1; 또는

   b) 인간 CD 164의 신호 서열에 융합된 SEQ ID NO: 1에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
3. 제 1 항에 있어서, 가용성 단백질은 SEQ ID NO: 1의 활성 뮤테인 또는 동등형인 것을 특징으로 하는 용도.
4. 제 3 항에 있어서, 가용성 단백질은

   a) MGC-24(SEQ ID NO: 6); 또는

   b) 아래의 인간 CD164 동등형: CD164-델타 4(SEQ ID NO: 4), CD164-델타 5(SEQ ID NO: 5)의 세포외 도메인의 성숙 형태에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질은 당화되는 것을 특징으로 하는 용도.
6. 제 5 항에 있어서, 가용성 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기술된 임의의 위치에서 당화되는 것을 특징으로 하는 용도.
7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질은 인산화되는 것을 특징으로 하는 용도.
8. 제 7 항에 있어서, 가용성 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기술된 임의의 위치에서 인산화되는 것을 특징으로 하는 용도.
9. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질은 미리스틸화(myristoylation)화되는 것을 특징으로 하는 용도.
10. 제 9 항에 있어서, 가용성 단백질은 SEQ ID NO: 1에 기술된 임의의 위치에서 미리스틸화(myristoylation)화되는 것을 특징으로 하는 용도.
11. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질은 가용성 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 용도.
12. 제 11 항에 있어서, 가용성 융합 단백질은 신호 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
13. 제 11 항 또는 12 항에 있어서, 가용성 융합 단백질은 히스티딘 태그를 보유하는 것을 특징으로 하는 용도.
14. 제 13 항에 있어서, 가용성 융합 단백질은 SEQ ID NO: 2인 것을 특징으로 하는 용도.
15. 제 11 항 또는 12 항에 있어서, 가용성 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
16. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 가용성 단백질은 활성 유도체, 단백분해-저항성 변형 형태, 공액체, 복합체, 분획물, 전구체, 또는 염인 것을 특징으로 하는 용도.
17. 염증이나 자가면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 용도.
18. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 염증이나 자가면역 질환은 다발성 경화증, 전신성 홍반성 낭창, 류머티스 관절염, 연소성 특발성 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 척추관절병소, 염증성 장 질환, 내독혈증, 크론병, 스틸병, 포도막염, 웨게너 육아종증, 베쳇병, 경피증, 쇼그렌 증후군, 유사 육종증, 괴저성 농피증, 다발성 근염, 피부근염, 심근염, 건선, 전신 경화증, C형 간염, 알레르기, 알레르기성 염증, 알레르기성 기도 염증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 장간막 경색, 발작, 궤양성 대장염, 알레르기성 천식, 기관지 천식, 섬유증, 근육, 신장, 심장에서 허혈후 염증, 피부 염증, 사구체신염, 소아 발병 I형 당뇨병, 과민성 질환, 바이러스성 또는 급성 간 질환, 알코올성 간 부전, 결핵, 패혈성 쇼크, HIV 감염, 이식편-대-숙주 질환(GVHD), 죽상경화증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
19. 개체에서 한가지이상 사이토킨의 발현을 저해하는 방법에 있어서, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 사이토킨은 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, 또는 IL-10인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제의 존재하에, 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 함유하고, 염증이나 자가면역 질환의 치료를 위한 제약학적 조성물.
22. 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 보유하고, 사이토킨 분비와 발현의 저해물질로서 기능하는 화합물을 확인하고 이들의 특성을 비교하기 위한 스크리닝 분석물.
23. 인간 CD164의 세포외 도메인의 성숙 형태(SEQ ID NO: 1)와 적어도 85%의 상동성을 보유하는 서열을 포함하는 가용성 단백질을 포함하고, 사이토킨 분비와 발현의 저해물질로서 기능하는 화합물을 확인하고 이들의 특성을 비교하기 위한 장치.

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