CN114891107A - 一种抗猪cd164l2单克隆抗体制备与应用 - Google Patents

一种抗猪cd164l2单克隆抗体制备与应用 Download PDF

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聂晓华
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Abstract

本发明公开了一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备，包括以下制备步骤：从NCBI基因库中获取查找猪源CD164L2的基因序列，合成pIRES2‑CD164L2‑EGFP质粒；进行质粒的扩增；以表示CD164L2蛋白的表达情况；在质粒转染48小时后，CD164L2的L929细胞与CpG1826佐剂混合后，通过背部皮下多点注射免疫途径免疫8周龄Balb/c小鼠，经过3次加强免疫后，收集血清获得多克隆抗体，将多抗血清与表达CD164L2蛋白的人293T细胞做流式结合检测；选择结合程度最好的小鼠进行杂交瘤融合，4次流式检测筛选，获得单克隆抗体，不仅为深入研究CD164L2蛋白的分子机制奠定基础，而且为研究猪DC5的亚群鉴定、发育和功能研究提供有效的抗体材料，及为抗体介导的靶向免疫细胞的疫苗研制提供新的设计思路，具有比较重要的科学价值。

Description

一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用
技术领域
本发明涉及与猪CD164L2结合的抗体技术领域，具体是指一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用。
背景技术
树突状细胞是专职的抗原提呈细胞，是连接先天免疫和适应性免疫反应的桥梁，其具有异质性，不同的树突状细胞亚群具有不同的功能特性，在机体的免疫过程中发挥不同的功能，比如Ⅰ型树突状细胞诱导CD8+T细胞的增殖和活化，发挥细胞毒性的作用；Ⅱ型树突状细胞诱导CD4+T细胞的增殖和分化；浆细胞样树突状细胞则在抗病毒的过程中产生大量的干扰素，从而抑制病毒的增殖。因此，对树突状细胞亚群的鉴定及功能的研究，首先是要对其进行分群鉴定，而可用的商品化猪抗体较少，因此我们前期的工作就是根据不同树突状细胞亚群的特征性表面分子的基因表达差异，制备大量的猪抗体，包括CD164L2。为后期不同树突状细胞亚群的鉴定，以及为后续靶向特定树突状细胞亚群，增强抗原提呈能力，进而机体的免疫力等功能研究提供抗体支持。本发明的抗猪CD164L2抗体主要是用于除此之外，在临床医学的研究中，可用于血液蛋白、血压、脉冲压力的检测，可以用于单细胞计数，单细胞计数是高血压、重度抑郁症、炎症、心血管疾病临床研究的潜在标志物。
本发明是基于猪外周血树突状细胞的单细胞数据的结果分析，发现CD164L2在某个树突状细胞亚群上特异性高表达，而在其它树突状细胞亚群上低表达或不表达，因此我们实验室对CD164L2的抗体进行了制备。CD164L2是CD164的主要类似物，属于Ⅰ型跨膜蛋白。已经在mRNA水平上检测了CD164L2在各种猪组织中的表达，报道了CD164L2在皮下脂肪组织(subcutaneous adipose)、卵巢、肺脏中高表达，在脾脏中低表达，在心脏、肾脏、肝脏等组织中几乎不表达(Li,Chen etal.2017)。
在人的树突状细胞研究中，发现这群细胞在受到CpGA刺激时，分泌干扰素的水平介于经典树突状细胞和浆细胞样树突状细胞；在CpGB的刺激下，DC5产生炎性细胞因子的水平更高；以及活化
Figure BDA0003639981050000011
T最强，且能诱导Th22细胞反应(Yu,Zhang et al.2015)。我们目前认为在猪外周血中新发现的这群细胞是人和小鼠DC5树突状细胞的同源物。CD164L2主要在新发现的这群猪树突状细胞亚群中高表达。已经有研究证明，疫苗靶向表达XCR1分子和MHCⅡ分子的树突状细胞(Fredriksen,Sandlie et al.2006,Bernelin-Cottet,Urien etal.2019)，能够显著提高疫苗效应，增强动物机体的免疫力。此CD164L2单抗的制备可以为之后的靶向疫苗的研究提供前期的支持。
目前关于树突状细胞的研究主要集中在人和小鼠的研究，对于动物，比如猪、牛、羊、禽类等，研究都比较少，还处于起步阶段，其根本原因在于抗体的研发较少，几乎没有，因此制备可使用的抗体成了未来研究的重中之重。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用，提供一个可结合猪CD164L2的单克隆抗体，不仅为深入研究CD164L2蛋白的分子机制奠定基础，而且为研究猪DC5的亚群鉴定、发育和功能研究提供有效的抗体材料，及为抗体介导的靶向免疫细胞的疫苗研制提供新的设计思路，具有比较重要的科学价值。
近年来，通过将单克隆抗体作为治疗靶点，直接靶向免疫细胞，诱导机体自身的免疫反应，提高疫苗的安全性和有效性，日益成为动物疫苗研制的热点。猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)[101]、非洲猪瘟亚单位疫苗的研制[102]就是针对靶向免疫细胞进行的。此外，猪和人在解剖学和生理上极为相似，既是异种器官移植的潜在供体动物，也是研究人免疫学和病原微生物与宿主关系研究的理想生物模型。因此，对于猪免疫细胞及免疫细胞上表面分子的研究具有重要意义。
CD164L2是CD164蛋白家族的成员之一[103]，是表达在造血祖细胞和骨髓基质细胞中的一种唾液粘蛋白[104,105]，参与造血干细胞和基质细胞之间的相互作用，调节细胞在不同微环境中的增殖、分化、黏附以及驻留和迁移等，因此也是造血干细胞和骨髓干细胞的重要生物标记物[103,106]。前期的转录组测序结果显示，相比传统的DCs亚群，CD164L2蛋白高表达在DC5细胞膜上。目前国内外极少有CD164L2单克隆抗体的相关报道[103]，更没有商品化的抗猪CD164L2蛋白的抗体。M.G.Pallavicini等人基于荧光抗体标记培养板孔内的活细胞来选择对某一表面抗原特异的抗体，即流式细胞术筛选单抗[107]。含有绿色荧光的靶细胞先与待测抗体(杂交瘤细胞上清液)染色，再用红色荧光标记的第二抗体进行孵育，分析红、绿荧光标记的细胞群体的双变量分布，来快速对待测抗体进行定性和定量。故本研究通过流式细胞术筛选和制备抗猪CD164L2蛋白的小鼠单克隆抗体，为后期DC5细胞和其它细胞的研究提供前期的抗体材料[106]。
为了制备能够与猪源的CD164L2蛋白反应的单克隆抗体，本研究首先对猪CD164L2蛋白与哺乳类CD164L2蛋白的氨基酸进行同源序列比对，进而对猪CD164L2蛋白的抗原性和膜表达情况进行分析，CD164L2是Ⅰ型跨膜蛋白，为了不影响CD164L2蛋白在细胞膜外的正确折叠，将Flag标签蛋白设计在CD164L2蛋白的C端。人工合成CD164L2全基因序列，设计引物，成功构建pIRES2-CD164L2-flag-EGFP重组质粒，CD164L2-Flag序列长度约为552bp，与GenBank序列一致；将测序正确的重组质粒转染293T细胞后获得了膜表达的猪CD164L2融合蛋白，流式细胞术检测到细胞膜内Flag和GFP标签蛋白的表达，细胞膜外并没有检测到Flag标签蛋白的表达，与预期结果相一致。将蛋白表达验证成功的CD164L2-Flag重组质粒转染小鼠L929细胞进行蛋白的真核表达，4次转染效率均达到20％以上。将成功表达CD164L2-Flag蛋白的小鼠L929细胞分别免疫4只BALB/c小鼠，加强免疫4次后，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞系SP2/0融合，经过4次培养基和流式筛选及亚克隆，成功制备了能够与过表达CD164L2蛋白的细胞特异性结合的小鼠抗猪CD164L2单抗。综上，本研究制备的猪CD164L2单克隆抗体，不仅为深入研究CD164L2蛋白的分子机制奠定基础，而且为研究猪DC5的亚群鉴定、发育和功能研究提供有效的抗体材料，及为抗体介导的靶向免疫细胞的疫苗研制提供新的设计思路[108]，具有比较重要的科学价值。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备，包括以下制备步骤：
步骤一：从NCBI基因库中获取查找猪源CD164L2的基因序列，合成pIRES2-CD164L2-EGFP质粒；
步骤二：在CD164L2蛋白C端加入了flag蛋白序列，以表征CD164L2蛋白的表达，构建了既可以检测GFP也检测flag的pIRES2-CD164L2-flag-EGFP质粒，将构建的重组质粒转化到TOP10感受态中，进行质粒的扩增；
步骤三：将质粒通过lipo2000转染到小鼠的L929细胞中，在真核细胞中进行蛋白的表达，通过检测GFP的指标，以表示CD164L2蛋白的表达情况；
步骤四：在质粒转染48小时后，将表达CD164L2的L929细胞与CpG1826佐剂混合后，通过背部皮下多点注射免疫途径免疫8周龄Balb/c小鼠，经过3次加强免疫后，收集血清获得多克隆抗体，将多抗血清与表达CD164L2蛋白的人293T细胞做流式结合检测；
步骤五：选择结合程度最好的小鼠进行杂交瘤融合，通过4次流式检测筛选，获得单克隆抗体。
一种如权利要求1所述抗猪CD164L2单克隆抗体的应用。
本发明制备的猪CD164L2单克隆抗体，不仅为深入研究CD164L2蛋白的分子机制奠定基础，而且为研究猪DC5的亚群鉴定、发育和功能研究提供有效的抗体材料，及为抗体介导的靶向免疫细胞的疫苗研制提供新的设计思路，具有比较重要的科学价值。
附图说明
图1是本发明一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用的PCR扩增CD164L2-Flag基因与质粒双酶切鉴定图。
图2是本发明一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用的猪CD164L2融合蛋白在293T细胞中的诱导表达及鉴定图。
图3是本发明一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用的猪CD164L2融合蛋白在L929细胞中的诱导表达及鉴定图。
图4是本发明一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用的猪CD164L2多抗血清的鉴定图。
图5是本发明一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用的CD164L2阳性杂交瘤细胞株的筛选图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备，包括以下制备步骤：
步骤一：从NCBI基因库中获取查找猪源CD164L2的基因序列，合成pIRES2-CD164L2-EGFP质粒；
步骤二：在CD164L2蛋白C端加入了flag蛋白序列，以表征CD164L2蛋白的表达，构建了既可以检测GFP也检测flag的pIRES2-CD164L2-flag-EGFP质粒，将构建的重组质粒转化到TOP10感受态中，进行质粒的扩增；
步骤三：将质粒通过lipo2000转染到小鼠的L929细胞中，在真核细胞中进行蛋白的表达，通过检测GFP的指标，以表示CD164L2蛋白的表达情况；
步骤四：在质粒转染48小时后，将表达CD164L2的L929细胞与CpG1826佐剂混合后，通过背部皮下多点注射免疫途径免疫8周龄Balb/c小鼠，经过3次加强免疫后，收集血清获得多克隆抗体，将多抗血清与表达CD164L2蛋白的人293T细胞做流式结合检测；
步骤五：选择结合程度最好的小鼠进行杂交瘤融合，通过4次流式检测筛选，获得单克隆抗体。
一种如权利要求1所述抗猪CD164L2单克隆抗体的应用。
在具体实施时，一、材料使用如下：
1、主要表达载体、感受态和细胞系
pIRES2-EGFP表达载体为本实验室保存，大肠杆菌感受态细胞TOP10购自全式金生物有限公司，HEK293T细胞最初来源于美国模式培养物保藏中心(ATCC)，小鼠L929细胞和SP2/0细胞为本实验室保存。
2、分子试剂
Figure BDA0003639981050000041
Figure BDA0003639981050000051
3、试验动物
Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。NCG免疫缺陷小鼠饲养于中科院生物物理研究所免疫缺陷动物实验室。动物实验符合中国科学院生物物理所实验动物的管理办法要求。
4、细胞培养用液
PBS(10mol/L,pH 7.4)：分别称取NaCl 4.0g，KCl 0.1g，KH2PO40.12 g，Na2HPO40.72g溶于500mL超纯中，121℃高压灭菌20min。
0.25％胰酶：北京索莱宝科技有限公司产品。每1000mL D-Hank’s溶液中加入1.0g葡萄糖和2.5g胰酶，0.22μm滤膜过滤除菌后分装并于-20℃保存。
DMEM培养液：Gibco公司产品，货号：4℃保存。
RPMI培养液：Hyclone公司产品，4℃保存。
特级胎牛血清(FBS)：GIBCO公司产品，分装后于-20℃冻存备用。
双抗(青霉素/链霉素)购自InvitroGen公司；丙酮酸购自InvitroGen公司；L-谷氨酰胺购自InvitroGen
DMEM/RPMI完全培养液：无菌环境下，每41.5mL DMEM/RPMI培养液中加入5mL FBS，0.5mL双抗，0.5mL丙酮酸和0.5mL L-谷氨酰胺；于4℃保存备用。
Binding buffer：20mM sodium phosphate,pH 7.0
ELution buffer：0.1M gLycine,pH 2.5-3.0，pH 2.76
NeutraLization buffer：1M Tris-CL,pH9.0,60-200μL/1mL eLute(具体用pH定量)
5、主要仪器设备
流式细胞检测仪器购自Thermo Fisher Scientific。
6、CD164L2基因序列
7、CD164L2基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司，如下所示
ATGGCCGCGCCTGGACCCCGCTCCTTACGGGCTGCACTCTGTGGCGGCTGCTGTTACCTCCTCCTGTGTGCCCAGCTCGCTGTGGCGGGTAAAGGAGCTCGAGGTTTTGGGCGGGGAGCCCTGCTCCGCATGAACATCTGGCCAGCTGTCCGAGGGACCTGCAAACAGCTGAAGCTCTGTGAGCATTGTGTGGAGGGCAACAGAGCACACAACCTCTCTGGCTGCGTGTGGGAGCAGTGTCGGCTGGAGGAGCCAGGACGCTGTGTGGCCCAAGCTGAGGTGGTCAAGGAAGGTTGCTCGGTCTACAACCGCTCGGAATCTTGTCCAGCTGTGCACCACCACCCCACCAATGAACCGAAGACAGTCACAACAGAGAGCCCCCCGGGCCCCGAGGACCACAGCCCTGGCTTTGATGGGGCCAGCTTCATTGGTGGCGTTGTGCTGGTGTTGAGCCTGCAGACGGTGGCCTTCTTTGCCTTGCGCTTCCTCAAGGCCAAGGACAGCACCTATCAGACACTGTGA
8、CD164L2引物序列
CD164L2基因片段由北京擎科生物科技有限公司设计并合成，引物片段见下表
Table 4-1 primersequences
Figure BDA0003639981050000061
9、流式细胞术检测试剂
70μm一次性无菌细胞滤网，购自Falcon公司，货号：352350。
PE Goat Anti-Mouse IgG：购自百赛生物公司。货号：P6121S。
PE anti-DYKDDDDK Tag，克隆号：15，同型对照：Rat IgG2a，λ；浓度：0.2mg/mL；公司：Biolegend。
二、方法
1、CD164L2基因重组质粒的构建和鉴定
根据NCBI基因库公布的CD164L2(XM_013988797.2)全基因序列，人工合成CD164L2基因，设计引物。由于CD164L2是Ⅰ型跨膜蛋白，N端在细胞膜外，C端在细胞膜内，为了使标签蛋白的表达不影响细胞膜外蛋白的正确折叠，但又能通过标签蛋白的表达验证CD164L2蛋白的表达，故在CD164L2基因的C端加入Flag标签蛋白，以及SalⅠ和SacⅡ的酶切位点和保护碱基，构建重组质粒CD164L2-Flag。CD164L2上游引物为5’-ACGCGTCGACGCCACCATGGCCGCGCCTGGACCCCGC-3’，下游引物为5’-TCCCCGCGGTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTAGTGTCTGATAGGTGCTG-3’。将PCR扩增产物与pIRES2-EGFP空载体双酶切后的回收产物用DNA T4连接酶25℃连接1小时，连接产物转化、挑取单克隆菌落、提取质粒，送北京擎科生物科技有限公司测序，获得带有Flag标签和GFP标签的重组质粒pIRES2-CD164L2-flag-EGFP。
2、CD164L2重组蛋白的表达
将测序正确的重组质粒，通过Lipofectamine 2000脂质体转染到293T细胞中，置于37℃培养24h。收集活细胞，以备流式细胞术检测。
3、CD164L2重组蛋白的细胞膜外鉴定
将收集的活细胞悬液，经两次离心，重悬细胞加入PE anti-DYKDDDDK Tag抗体，4℃孵育、清洗，加入2％多聚甲醛重悬细胞，流式检测Flag和GFP的表达情况。
4、CD164L2重组蛋白的细胞膜内鉴定
将收集的活细胞悬液，经两次离心，重悬细胞，用2％多聚甲醛固定细胞30min，破膜缓冲液清洗，用破膜缓冲液稀释的PE anti-DYKDDDDK Tag抗体，4℃孵育30min，破膜缓冲液清洗细胞；加入2％PFA重悬细胞，流式细胞术检测Flag和GFP的表达情况。
5、小鼠的免疫
取2.5×106表达CD164L2蛋白的L929细胞与等体积的CpG1826混合，2.5×106细胞/500uL/只，皮下多点注射4只8周龄雌性BALB/c小鼠，分别编号5#、6#、7#、8#。每隔一月以等量同样的方式免疫1次。3次免疫后，眼眶采血，测定多抗血清与外源性转染细胞表达的CD164L2蛋白的特异性结合程度。待特异性结合达到要求后，加强免疫1次，3天后，取小鼠脾脏融合。
6、细胞的融合
分离7#小鼠脾细胞，将SP2/0细胞与脾细胞以1：2的比例混合，37℃水浴锅中逐滴加入预热的50％PEG，30秒后加入预热的RPMI培养基，离心，HAT培养基重悬沉淀细胞，加入预先铺有滋养细胞的96孔板中，7至9天后，取细胞培养上清以筛选阳性杂交瘤细胞。
7、CD164L2阳性杂交瘤细胞的鉴定
将不同孔源的杂交瘤细胞上清作为一抗，加入PE Goat Anti-Mouse IgG抗体(1：500)，初筛阳性杂交瘤细胞株；未免疫的小鼠血清作为阴性对照；免疫成功的小鼠多抗血清作为阳性对照。通过有限稀释法进行细胞克隆，扩大培养能稳定分泌抗CD164L2的单克隆抗体细胞株。
8、数据分析
采用FlowJO流式分析软件进行数据分析。
三、结果
1、猪CD164L2基因重组质粒的构建与鉴定
将人工合成的CD164L2基因经PCR扩增，成功扩增出CD164L2-Flag基因，为552bp，与预期大小相符合如说明书附图1中左侧图所示。对pIRES2-CD164L2-flag-EGFP重组质粒进行SalⅠ和SacⅡ双酶切，琼脂糖凝胶电泳显示5300bp和550bp左右的两条带如说明书附图1中右侧图所示。经测序鉴定，与已知序列完全匹配，表明成功构建了真核表达质粒pIRES2-CD164L2-flag-EGFP。
说明书附图1中：左侧图为PCR鉴定扩增的CD164L2-Flag基因；右侧图为重组质粒进行SalⅠ和SacⅡ双酶切鉴定。
M：DNA marker；1：阴性对照；2：CD164L2-Flag；3：pIRES2-CD164L2-flag-EGFP双酶切鉴定。
2、猪CD164L2融合蛋白的诱导表达及鉴定
约60％的293T细胞经脂质体转染进行蛋白的瞬时表达，收集活细胞悬液，经PEanti-DYKDDDDK Tag抗体进行细胞膜内和膜外的染色以检测Flag和GFP标签蛋白的表达，结果与预期一致，PE-Flag标签蛋白仅能在细胞膜内检测到如说明书附图2所示。
3、猪CD164L2多抗血清的鉴定
经转染L929细胞，以1×105细胞进行流式检测GFP的表达，转染效率达到20％以上，如说明书附图3所示，免疫小鼠。在3次免疫后的第15天，流式细胞术检测结果显示，4只小鼠的多抗血清均可以识别外源性转染表达CD164L2的293T细胞，如说明书附图4所示。
4、CD164L2阳性杂交瘤细胞株的鉴定
选择7#小鼠脾脏进行细胞融合。经培养基筛选、流式细胞术检测和3次克隆化后，最终获得1株能够稳定分泌小鼠抗猪CD164L2的阳性单克隆细胞株，能够识别外源性转染表达CD164L2的293T细胞，如说明书附图5所示。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京农学院
<120> 一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备与应用
<130> 2022.5.12
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccgcgc ctggaccccg ctccttacgg gctgcactct gtggcggctg ctgttacctc 60
ctcctgtgtg cccagctcgc tgtggcgggt aaaggagctc gaggttttgg gcggggagcc 120
ctgctccgca tgaacatctg gccagctgtc cgagggacct gcaaacagct gaagctctgt 180
gagcattgtg tggagggcaa cagagcacac aacctctctg gctgcgtgtg ggagcagtgt 240
cggctggagg agccaggacg ctgtgtggcc caagctgagg tggtcaagga aggttgctcg 300
gtctacaacc gctcggaatc ttgtccagct gtgcaccacc accccaccaa tgaaccgaag 360
acagtcacaa cagagagccc cccgggcccc gaggaccaca gccctggctt tgatggggcc 420
agcttcattg gtggcgttgt gctggtgttg agcctgcaga cggtggcctt ctttgccttg 480
cgcttcctca aggccaagga cagcacctat cagacactgt ga 522
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcgtcgac gccaccatgg ccgcgcctgg accccgc 37
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccccgcggt tacttgtcat cgtcgtcctt gtaatctagt gtctgatagg tgctg 55

Claims (2)

1.一种抗猪CD164L2单克隆抗体制备，其特征在于：包括以下制备步骤：
步骤一：从NCBI基因库中获取查找猪源CD164L2的基因序列，合成pIRES2-CD164L2-EGFP质粒；
步骤二：在CD164L2蛋白C端加入了flag蛋白序列，以表征CD164L2蛋白的表达，构建了既可以检测GFP也检测flag的pIRES2-CD164L2-flag-EGFP质粒，将构建的重组质粒转化到TOP10感受态中，进行质粒的扩增；
步骤三：将质粒通过lipo2000转染到小鼠的L929细胞中，在真核细胞中进行蛋白的表达，通过检测GFP的指标，以表示CD164L2蛋白的表达情况；
步骤四：在质粒转染48小时后，将表达CD164L2的L929细胞与CpG1826佐剂混合后，通过背部皮下多点注射免疫途径免疫8周龄Balb/c小鼠，经过3次加强免疫后，收集血清获得多克隆抗体，将多抗血清与表达CD164L2蛋白的人293T细胞做流式结合检测；
步骤五：选择结合程度最好的小鼠进行杂交瘤融合，通过4次流式检测筛选，获得单克隆抗体。
2.一种如权利要求1所述抗猪CD164L2单克隆抗体的应用。
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