CN106456734A - Ox40l融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露提供包括人IgG4 Fc结构域、三聚结构域、和Ox40配体的受体结合域的OX40L huIgG4融合多肽亚基，其中该融合多肽亚基可自组装成六聚体蛋白。还提供制造融合多肽亚基和六聚体蛋白的方法，以及例如，用于治疗癌症的方法。

Description

OX40L融合蛋白及其用途
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文结合在此。所述ASCII副本创建于2015年5月21日，名称为OX40F-101W01_SL.txt并且大小为31,496字节。
背景
OX40(CD134；TNFRSF4)是主要存在于活化的CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)和自然杀伤(NK)细胞上的肿瘤坏死因子受体(克罗夫特(Croft)等人，2009，免疫学评论(Immunol Rev)，229：173-91)。OX40具有一个已知的内源性配体，OX40配体(OX40L；CD152；TNFSF4)，该OX40配体以三聚体的形式存在，并且可以使OX40聚集，在T细胞内导致有效的细胞信号传导事件(克罗夫特(Croft)等人，2009，免疫学评论(ImmunolRev)，229：173-91)。在活化的CD4+和CD8+T细胞上通过OX40发信号导致细胞因子产生的增强、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆T细胞池的扩增(延森(Jensen)等人，2010，肿瘤学研讨会(SeminOncol)，37：524-32)。另外，OX40在Treg细胞上发信号抑制Treg的扩增，关闭Treg的诱导和阻断Treg抑制性功能(Voo等人，2013，免疫学杂志(J Immunol)，191：3641-50；Vu等人，2007，血液(Blood)，110：2501-10)。
免疫组织化学研究和早期流式细胞术分析表明，OX40在浸润宽范围的人类癌症的T细胞上表达(巴鲁阿(Baruah)等人，2011，免疫生物学(Immunobiology)，217：668-675；柯蒂(Curti)等人，2013，癌症研究(Cancer Res)，73：7189-98；兰丹尼(Ladanyi)等人，2004，临床癌症研究(Clin Cancer Res)，10：521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美国外科杂志(AmJ Surg)，183：512-8；Ramstad等人，2000，美国外科杂志(Am J Surg)，179：400-6；Sarff等人，2008，美国外科杂志(Am J Surg)，195：621-5，讨论625；韦托(Vetto)等人，1997，美国外科杂志(Am J Surg)，174：258-65)。在肿瘤浸润淋巴细胞上的OX40表达与若干种人类癌症中的较长生存期相关，表明OX40信号可在建立抗肿瘤免疫应答中发挥关键的作用(兰丹尼(Ladanyi)等人，2004，临床癌症研究(Clin Cancer Res)，10：521-30；佩蒂(Petty)等人，2002，美国外科杂志(Am J Surg)，183：512-8)。
在各种非临床小鼠肿瘤模型中，OX40的激动剂，包括抗体和OX40配体融合蛋白，已被成功地应用并具有有希望的结果(Kjaergaard等人，2000，癌症研究(Cancer Res)，60：5514-21；恩德洛武(Ndhlovu)等人，2001，免疫学杂志(J Immunol)，167：2991-9；温伯格(Weinberg)等人，2000，免疫学杂志(J Immunol)，164：2160-9)。共刺激T细胞通过OX40促进抗肿瘤活性在一些情况下是持久的，针对随后的肿瘤挑战提供持久的保护(温伯格(Weinberg)等人，2000，免疫学杂志(JImmunol)，164：2160-9)。Treg细胞抑制和效应T细胞的共刺激被证明对于OX40激动剂的肿瘤生长抑制是必要的(Piconese等人，2008，实验医学杂志(J Exp Med)，205：825-39)。通过与疫苗、化疗、放疗、和免疫疗法组合，已探索许多策略和技术以提高OX40激动剂治疗的抗肿瘤效果(延森(Jensen)等人，2010，肿瘤学研讨会(Semin Oncol)，37：524-32；梅莱罗(Melero)等人，2013，临床癌症研究(Clin CancerRes)19：997-1008)。
概述
本披露涉及多肽亚基，每一个作为融合多肽都包括OX40配体(OX40L)的受体结合域、三聚结构域和人IgG4Fc结构域，这些多肽亚基能够形成稳定的多聚体(例如，六聚体蛋白)。提供的组合物和方法对于癌症免疫治疗是有用的。
本披露提供一种单链多肽亚基，该单链多肽亚基包括：人IgG4Fc结构域；功能性三聚结构域；和OX40L的受体结合域。在某些方面中，所提供的多肽亚基可以自组装成三聚体或六聚体蛋白。在某些方面中，该多肽亚基包括(从氨基末端到羧基末端)人IgG4Fc结构域，随后是三聚结构域，随后是OX40L受体结合域。人IgG4Fc结构域的羧基末端可以直接融合到三聚结构域的氨基末端，且三聚结构域的羧基末端可以直接融合到OX40L受体结合域的氨基末端。
在本披露提供的多肽亚基的进一步方面中，IgG4Fc结构域包括IgG4铰链区，其可以包括赋予完整的重链间二硫键形成的突变，例如，根据欧盟编号在位置228处丝氨酸至脯氨酸的突变(S228P)。在某些方面中，该铰链区包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至12。人IgG4Fc结构域还可以包括CH2区，和/或CH3区。在某些方面中，人IgG4Fc结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至229。
由本披露提供的三聚结构域可包括α-螺旋卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域、或它们的组合。例如，三聚结构域可起源于TRAF2；血小板反应蛋白1；母系蛋白(Matrilin)-4；CMP(母系蛋白-1)；HSF1；和吞饮受体(Cubilin)。在某些方面中，该三聚结构域包括人TRAF2三聚结构域。在某些方面中，TRAF2三聚结构域包括人TRAF2(SEQ ID NO:2)的氨基酸310至349。
在本披露提供的多肽亚基的另外方面中，OX40L受体结合域可以包括人OX40L(SEQID NO:1)的氨基酸51至183。在某些方面中，由本披露提供的多肽亚基可以自组装成可以特异性结合于人OX40的六聚体融合蛋白。在某些方面中，该多肽亚基包括氨基酸序列SEQ IDNO:4。
如在此提供的多肽亚基可进一步包括相关的异源剂。在此提供的异源剂可以是通过肽键融合到该多肽亚基的异源多肽。异源多肽可融合(例如)至IgG4-Fc结构域的N-末端、至OX40L的受体结合域的C末端、在该IgG4-Fc结构域的C-末端和三聚结构域的N-末端之间，或在三聚结构域的C-末端和OX40L的受体结合域的N-末端之间。在某些方面中，异源剂可以化学地轭合于多肽亚基，并且可以是，例如细胞毒性分子、稳定剂、免疫应答调节剂、或可检测的药剂。
在某些方面中，本披露提供了可被用作对照的多肽亚基。例如，本披露提供了多肽亚基，其中OX40L受体结合域包括人OX40L(SEQ ID NO:1)的氨基酸51至183，除了在位置180处苯丙氨酸至丙氨酸的取代(F180A)之外。从这个多肽亚基自组装的六聚体融合蛋白不能够结合至人OX40。在某些方面中，这个对照多肽亚基包括氨基酸序列SEQ ID NO:6。
在某些方面中，本披露提供了包括三个如在此提供的多肽亚基的三聚体蛋白。
本披露提供包括六个如上所述的多肽亚基的六聚体蛋白。在某些方面中，该六个多肽亚基每一个包括氨基酸序列SEQ ID NO:4。典型的六聚体融合蛋白是OX40L IgG4P融合蛋白。
在某些方面中，如由本披露提供的六聚体蛋白可以特异性结合至OX40，该OX40在来自人、食蟹猴和/或恒河猴的活化的CD4+或CD8+T细胞中表达。例如，该六聚体蛋白可以特异性结合至OX40，该OX40在来自人、食蟹猴和/或恒河猴的活化的CD4+T细胞中表达。在某些方面中，对在初级活化的人CD4+T细胞中表达的人OX40的结合亲和力是约1.0pM至约8.0pM，例如，约3.6pM，如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，该六聚体蛋白在约0.5至约3.0pM(例如，约1.8pM)处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上20％受体占有率(EC20)，在约3.0至约10pM处(例如，约6.6pM)可实现在初级活化的人CD4+T细胞上50％受体占有率(EC50)，并且在约35至约70pM处(例如，约53pM)可实现在初级活化的人CD4+T细胞上90％受体占有率(EC90)，所有均如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，如由本披露提供的六聚体蛋白具有针对在OX40过量表达的尤尔卡特(Jurkat)细胞上表达的人OX40的、为约1.0pM至约24pM(例如，约12pM)的结合亲和力，如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，六聚体蛋白质在OX40过量表达的尤尔卡特细胞上在约1.0至15pM(例如，约7.2pM)处可实现EC20，在OX40过量表达的尤尔卡特细胞上在约1.0至40pM(例如，约16pM)处可实现EC50，并且在OX40过量表达的尤尔卡特细胞上在约10至100pM(例如，约57pM)处可实现EC90，所有均如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，如由本披露提供的六聚体蛋白具有针对在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40的、为约1.0pM至约50pM(例如，约24pM)的结合亲和力，如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，如本披露所提供的六聚体蛋白具有针对在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40的、为约1.0pM至约50pM(例如，约21pM)的结合亲和力，如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，在基于平板的测定法中，如本披露所提供的六聚体蛋白可诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖和来自活化的CD4+T细胞的剂量依赖性细胞因子释放。在某些方面中，在初级活化的人CD4+T细胞中在约1.0pM至约15pM(例如，8.0pM)的六聚体蛋白浓度处可实现20％最大增殖应答(EC20)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约5.0pM至约25pM(例如，14pM)的六聚体蛋白浓度处可实现50％最大增殖应答(EC50)，并且在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约65pM(例如，57pM)的六聚体蛋白浓度处可实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，六聚体蛋白可诱导IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70和/或IL-1β的剂量依赖性释放。在某些方面中，释放的细胞因子包括IFNγ、TNFα、IL-5、和/或IL-10。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和在初级活化的恒河猴CD4+T细胞中可实现CD4+T细胞增殖和细胞因子释放。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白在FcγR表达细胞的存在下可激活在表达OX40的T细胞中的NFκB途径。例如，表达OX40的T细胞可以是表达OX40的尤尔卡特NFκB萤光素酶报告细胞，该尤尔卡特NFκB萤光素酶报告细胞在响应于NFκB信号传导途径的刺激中产生荧光素酶。由这些细胞表达的OX40可以是，例如，人OX40，食蟹猴OX40或恒河猴OX40。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白，当作为有效剂量被给予至需要癌症治疗的受试者时，可在受试者中抑制肿瘤生长，例如，在T细胞的存在下。在某些方面中，与给予同种型匹配的对照相比，肿瘤生长可被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白可通过结合至OX40来诱导活化的、表达OX40的CD4+T细胞的增殖，但基本上不触发针对活化的CD4+T细胞的补体依赖性或抗体依赖性细胞毒性。例如，在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白不结合C1q或不触发活化的CD4+T细胞的NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白，一旦与疫苗抗原一起给予至受试者，可以增加CD4+中央记忆(cM)T细胞增殖、效应记忆(eM)CD8+T细胞增殖、NK细胞增殖、和/或B细胞增殖。在某些方面中，CD4+cM T细胞增殖、CD8+eM T细胞增殖、NK细胞增殖、B细胞增殖、或它们的任意组合是在外周血单核细胞中作为胞内Ki67表达进行测定的。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白，一旦与疫苗抗原一起给予至受试者，可增加可被测量(例如，作为增加的干扰素γ(IFN-γ)表达)的抗原特异性T细胞应答，该疫苗抗原包括但不限于来自呼吸道合胞病毒(RSV)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、流感病毒、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、难辨梭菌(Clostridium difficile)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白，一旦与疫苗抗原一起给予至受试者，可增加抗原特异性IgG滴度。在某些方面中，该抗原可以是呼吸道合胞病毒的可溶性F糖蛋白(RSV sF)，并且向受试者共同给予六聚体蛋白和RSV抗原可以增加RSV-中和抗体的滴度。
在某些方面中，六聚体蛋白和疫苗抗原共同给予的受试者是非人类灵长类动物。
在某些方面中，如本披露提供的六聚体蛋白可抑制调节性T细胞(Treg)介导的效应T细胞增殖的抑制，例如，在基于平板的测定法中。在某些方面中，效应T细胞是效应CD4+T细胞。在某些方面中，效应细胞对Treg细胞的比率可以是约1:0.5至约1:3，例如，约1:1或约1:2。
本披露还提供了包括在此提供的六聚体蛋白和载体的组合物。
在某些方面中，本披露提供了一种多核苷酸，该多核苷酸包括编码在此提供的多肽亚基的核酸，或在此提供的六聚体蛋白。在某些方面中，该多核苷酸可包括核酸序列SEQID NO:3。
本披露还提供了包含所提供的多核苷酸的载体以及包含所提供的多核苷酸或所提供的载体的宿主细胞。在相关的方面中，本披露提供了生产如在此提供的多肽亚基或在此提供的六聚体蛋白的方法，其中该方法包括在表达由该多核苷酸编码的多肽亚基或六聚体蛋白的条件下培养所提供的宿主细胞，并包括回收该多肽亚基或六聚体蛋白。
在进一步的方面中，本披露提供促进活化的T细胞存活或增殖的方法，其中该方法包括使活化的T细胞接触如在此提供的六聚体蛋白，使得六聚体蛋白可以在T细胞的表面上特异性结合OX40。本披露进一步提供了诱导从活化的T细胞释放细胞因子的方法，其中该方法包括使活化的T细胞接触如在此提供的六聚体蛋白，使得六聚体蛋白可以在T细胞的表面上特异性结合OX40。在某些方面中，该细胞因子可以是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70和/或IL-1β，例如，IFNγ、TNFα、IL-5和/或IL-10。在某些方面中，活化的T细胞是活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞。例如，活化的CD4+T细胞可以是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、和/或恒河猴CD4+T细胞。
在进一步的方面中，本披露提供减少调节性T细胞(Treg)介导的活化的T细胞增殖的抑制的方法，其中该方法包括使活化的T细胞和Treg细胞的混合物接触如权利要求26至70中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可以在T细胞的表面上特异性结合OX40。
在又另一个方面中，本披露提供促进T细胞活化的方法，其中该方法包括使T细胞接触如在此提供的六聚体蛋白，使得六聚体蛋白可以在T细胞的表面上特异性结合OX40。在某些方面中，这个方法还包括通过IgG4-Fc结构域与表达FcγR的细胞相互作用使六聚体蛋白交联。表达FcγR的细胞可以是，例如，B细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或浆细胞树突状细胞、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞、NK细胞、活化的T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、来自原发人肿瘤或肿瘤引流或非引流淋巴结的CD45+细胞、和/或来自其他第二或第三级淋巴结构的CD45+细胞。在某些方面中，T细胞的活化可以通过NFκB信号传导途径的刺激进行测量，并且在某些方面中，活化的T细胞是活化的CD4+T细胞和/或活化的CD8+T细胞，例如，人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、和/或恒河猴CD4+T细胞。
在某些方面中，以上提供的方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的如本披露所提供的六聚体蛋白或组合物。在相关的方面中，本披露提供在受试者中治疗癌症的方法，其中该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的在此提供的六聚体蛋白。在某些方面中，该癌症是实体瘤。在某些方面中，该六聚体蛋白或组合物的给予可以抑制肿瘤生长、可以促进肿瘤缩小、或两者。在某些方面中，在T细胞的存在下实现肿瘤生长抑制。
在又另一个方面中，本披露提供在受试者中增强免疫应答的方法，其中该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本披露所提供的六聚体蛋白、或本披露所提供的组合物。对于在本披露中所提供的任何治疗方法，该受试者可以是人类受试者。
在另外的方面中，本披露提供了在T细胞上诱导ICOS表达的方法，该方法包含使T细胞接触如本披露所提供的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可以在T细胞的表面上特异性结合OX40。
在另一个方面中，本披露提供了在T细胞上诱导PD-1表达的方法，该方法包括使T细胞接触如本披露所提供的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可以在T细胞的表面上特异性结合OX40。
附图/图简要说明
图1.示意性示出了示例性多聚体蛋白质，即OX40L融合蛋白。
图2.OX40L IgG4P融合蛋白的氨基酸序列(N至C末端，SEQ ID NO:4)。氨基酸序列huIgG4PFcTF20X40L F180A被披露为SEQ ID NO:12。
图3A.在初级活化的人CD4+T细胞的表面上表达的、结合OX40的OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白。数据被用于确定表观亲和力(Kd)和表观浓度以实现20％、50％和90％的受体占有率(EC20、EC50和EC90值)。
图3B.结合在尤尔卡特T细胞上表达的人OX40的、OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白。数据被用于确定表观亲和力(Kd)和表观浓度以实现20％、50％和90％的受体占有率(EC20、EC50和EC90值)。
图4A.OX40L IgG4P融合蛋白缺乏对在初级活化的小鼠CD4+T细胞上表达的OX40的结合。MFI＝平均荧光强度。nM＝纳摩尔。误差条＝SEM。
图4B.OX40L IgG4P融合蛋白缺乏对在初级活化的大鼠CD4+T细胞上表达的OX40的结合。MFI＝平均荧光强度。nM＝纳摩尔。误差条＝SEM。
图4C.OX40L IgG4P融合蛋白与在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的OX40的结合。从两个独立的测定平均的单孔数据被用于确定表观亲和力(Kd)值。MFI＝平均荧光强度。nM＝纳摩尔。
图4D.OX40L IgG4P融合蛋白与在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的OX40的结合。从两个独立的测定平均的数据被用于确定表观亲和力(Kd)值。MFI＝平均荧光强度。nM＝纳摩尔。误差条＝SEM。
图5A-C.OX40L IgG4P融合蛋白与表达TNFRSF的HEK293和表达OX40的尤尔卡特的结合。(A-B)在HEK293细胞中TNFRSF成员的瞬时表达，如直方图的左侧所指示，以及与TNFRSF-特异性mAb或与OX40L IgG4P融合蛋白结合，如直方图上方所指示。灰色直方图，荧光染料轭合的同种型对照抗体对TNFRSF-特异性mAb的结合或山羊抗人647二级抗体对OX40L IgG4P融合蛋白的结合对照；敞开直方图，TNFRSF-特异性mAb或OX40LIgG4P融合蛋白结合。(C)OX40L IgG4P融合蛋白与作为阳性对照的、表达OX40的尤尔卡特的结合。灰色直方图，山羊抗人647二级抗体结合对照；敞开直方图，OX40L IgG4P融合蛋白结合。
图6.OX40L IgG4P融合蛋白平板结合生物活性测定的示意图。OX40L IgG4P融合蛋白。抗-CD3克隆OKT3。
图7A-E.OX40L IgG4P融合蛋白共刺激原代CD4 T细胞增殖并在基于平板的生物活性测定法中释放细胞因子。对于(A)CD4 T细胞增殖和(B)IFNγ、(C)TNFα、(D)IL-10、(E)IL-13的释放呈现供体4的代表数据；对于供体1、2、和3发现了类似的结果。符号、平均值；误差条、平均值的标准偏差。
图8.用于测量OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性的细胞系统。通过FcγR表达细胞交联的OX40L IgG4P融合蛋白介导OX40在表达OX40的尤尔卡特NFκB萤光素酶克隆64报告细胞系上的聚集，导致萤光素酶的NFκB依赖性产物，该萤光素酶的NFκB依赖性产物可作为NFκB活性和T细胞活化的替代品来测量。
图9A-C.当通过或不通过FcγR交联时OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性。(A)OX40L IgG4P融合蛋白与表达CD32A的HEK293交联后的报告活性。(B)在没有FcγR表达的HEK293亲代细胞的存在下的报告活性。(C)使用药物和不使用HEK293细胞的报告活性。RLU，相对光单位。
图10.OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性的实例，对于FcγR介导的药物的交联，使用拉吉(Raji)细胞、表达CD32B的HEK293细胞、表达CD32A的HEK293细胞、或从原发人类肿瘤中分离的CD45+细胞，并且对于生物活性的读出，使用表达OX40的尤尔卡特NFkB萤光素酶克隆64报告细胞。(A)由拉吉B细胞聚集的OX40L IgG4P融合蛋白活性；(B)表达CD32B的HEK293；(C)表达CD32A的HEK293；(D)从原发人肿瘤分离的CD45+细胞。RLU＝相对光单位。M＝摩尔浓度。
图11.在食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB荧光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B细胞生物活性测定中OX40L IgG4P融合蛋白是有活性的。OX40L IgG4P融合蛋白通过在尤尔卡特NFκB萤光素酶报告细胞系的细胞表面上表达的食蟹猴/恒河猴OX40诱导发信号的、以RLU计的浓度依赖性活性。每个数据点4个重复。误差条＝SEM。RLU，相对光单位；n＝2个测定；nM＝纳摩尔
图12.在食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB荧光素酶和表达Fcγ受体的恒河猴免疫细胞生物活性测定中OX40L IgG4P融合蛋白是有活性的。OX40L IgG4P融合蛋白通过在尤尔卡特NFκB萤光素酶报告细胞系的细胞表面上表达的食蟹猴/恒河猴OX40诱导发信号的、以RLU计的浓度依赖性活性。每个数据点2个重复。误差条＝SEM。RLU，相对光单位；nM＝纳摩尔。
图13.OX40L IgG4P融合蛋白引起初级活化的恒河猴CD4+T细胞的增殖。OX40LIgG4P融合蛋白诱导初级活化的恒河猴CD4+T细胞进入细胞周期和分裂的浓度依赖性活性。OX40L IgG4P融合蛋白的特异性活性是通过仅从百分比CD4除值减去用抗CD3抗体刺激的细胞的平均值来进行计算。对于2个独立的试验显示的数据，这2个独立的试验具有一式三份的孔。nM＝纳摩尔。误差条＝SEM。
图14A-D.对OX40L IgG4P融合蛋白、OX40L IgG1融合蛋白和抗CD20抗体的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的评估，实验1#。通过由OX40L融合蛋白IgG1介导，但不由OX40L IgG4P融合蛋白也不由F180A OX40L融合蛋白IgG1和IgG4P对照介导的初级活化NK细胞的表达OX40的CD4+T细胞特异性杀伤：(A)用活化的CD4+T细胞孵育的供体1NK细胞；(B)用托莱多(Toledo)B细胞孵育的供体1NK细胞；(C)用活化的CD4+T细胞孵育的供体2NK细胞。在ADCC测定中使用的初级活化NK细胞能够介导结合到利妥昔单抗的托莱多B细胞的有效裂解：(D)与托莱多B细胞组合的供体2NK细胞。实验重复进行三次。误差条代表平均值的标准偏差。
图15.对OX40L IgG4P融合蛋白和OX40配体融合蛋白IgG1的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞毒性的评估，实验2#。通过由OX40L融合蛋白IgG1介导，但不由OX40L IgG4P融合蛋白也不由F180A OX40L融合蛋白IgG1和IgG4P对照介导的初级活化NK细胞的、表达OX40的CD4+T细胞的特异性杀伤。实验重复进行三次。误差条代表平均值的标准偏差。
图16A-B.对结合于纯化的C1q蛋白的OX40L IgG4P融合蛋白的评估。(A)将指定浓度的纯化的人C1q蛋白注射到生物传感器芯片上。空白代表注射单独的PBS/0.005％吐温20运载体。(B)在相同的实验中，结合纯化的人C1q的对照人IgG1。
图17.OX40L IgG4P融合蛋白对A375细胞在小鼠异种移植模型中生长的影响。每个组中六只NOD/SCID小鼠在第1天经皮下(SC)植入A375细胞，该A375细胞以1:6的E:T比值与同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系混合。试验样品(同种型对照或OX40L IgG4P融合蛋白)在第4天、第7天、第9天和第12天经腹膜内(IP)给予。示出肿瘤体积的平均值。对OX40LIgG4P融合蛋白处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.05。NOD/SCID＝非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷；SC＝皮下；E:T＝效应物:靶标比值；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制
图18.OX40L IgG4P融合蛋白对A375细胞在小鼠异种移植模型中生长的影响。每个组中六只NOD/SCID小鼠在第1天经皮下(SC)植入单独的A375细胞(无T细胞)，或混合有同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系(比值为2:1)的处于1:6的E:T比值的试验样品(同种型对照或OX40L IgG4P融合蛋白)在第3天、第6天、第8天和第10天经IP给予。示出肿瘤体积的平均值。对OX40L IgG4P融合蛋白处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过曼-惠特尼秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.05。NOD/SCID＝非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷；SC＝皮下；E:T＝效应物:靶标比值；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制。
图19.小鼠OX40配体融合蛋白对在小鼠同源模型中Renca细胞系的生长的影响。每个组10只BALB/c小鼠在第1天经SC接种Renca细胞。分别在第4天和第7天经IP给予对照样品(同种型对照)和测试样品(mOX40L FP)。示出平均(小图A)和单个(小图B)的肿瘤体积的值。对mOX40L Fp处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过在第6.8章节中描述的方法使用图板棱柱(GraphPad Prism)6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：在第26天与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.0001。SC＝皮下；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制。
图20.小鼠OX40配体融合蛋白对在小鼠同源模型中CT26细胞系的生长的影响。每个组10只BALB/c小鼠在第1天经SC接种CT26细胞。分别在第4天和第6天经IP给予对照样品(同种型对照)和测试样品(mOX40L FP)。示出平均(小图A)和单个(小图B)肿瘤体积的值。对mOX40L Fp处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过在第6.8章节中描述的方法使用图板棱柱6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：在研究第22天与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.0001。SC＝皮下；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制。
图21.小鼠OX40配体融合蛋白对在小鼠同源模型中4T1细胞系的生长的影响。每个组12只BALB/c小鼠在第1天经SC接种4T1细胞。分别在第4天和第7天经IP给予对照样品(同种型对照)和测试样品(mOX40L FP)。示出平均(小图A)和单个(小图B)肿瘤体积的值。对mOX40L Fp处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过在第6.8章节中描述的方法使用图板棱柱6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：在研究第25天与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.0006。SC＝皮下；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制。
图22.小鼠OX40配体融合蛋白对在小鼠同源模型中MCA205细胞系的生长的影响。每个组14只C57BL/6小鼠在第1天经SC接种MCA205细胞。分别在第11天和第14天经IP给予对照样品(同种型对照)和测试样品(OX40L FP)。示出平均(小图A)和单个(小图B)肿瘤体积的值。对mOX40L Fp处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过在第6.8章节中描述的方法使用图板棱柱6.0软件针对统计显著性分析了组间差异。误差条代表平均值的标准误差。*：在研究第22天与同种型对照组相比，TGI>50％，P≤0.028。SC＝皮下；IP＝腹膜内；TGI＝肿瘤生长抑制。
图23.OX40L IgG4P融合蛋白克服了效应CD4+T细胞的调节性T细胞抑制。效应CD4+T细胞使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)来标记，并且在抗CD3、抗CD28和试验或对照样品的存在下使用和不使用指定比例的调节性T细胞(Treg)来培养4天。在测定结束时分裂的效应CD4+T细胞的百分比通过流式细胞术来评估。误差条表示来自一式两份测定孔的平均值的标准误差。显著性是使用学生T检验(Student’s T test)来计算，其中*p＝0.0042；**p＝0.0002，***p<0.0001。
图24.OX40L IgG4P融合蛋白对效应CD4+T细胞的调节性T细胞抑制的影响是浓度依赖性的。效应CD4+T细胞使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)来标记，并且在抗CD3、抗CD28和试验或对照样品的存在下使用和不使用处于1:1比例的调节性T细胞(Treg)来培养4天。在测定结束时分裂的效应CD4+T细胞的百分比通过流式细胞术来评估。误差条表示来自一式两份测定孔的平均值的标准误差。显著性是使用学生T检验来计算，其中*p<0.05；**p<0.01。
图25.用于监控通过静脉途径向恒河猴给予的OX40L融合蛋白IgG4-FP的药效学作用的研究设计。
图26A-D.总的CD4记忆T细胞(A)、初始的CD4 T细胞(B)、总的记忆CD8 T细胞(C)、和初始的CD8 T细胞(D)的药效学(如通过Ki-67表达测量的)。
图27A-D.总的CD4记忆T细胞(A)、初始的CD4 T细胞(B)、总的记忆CD8 T细胞(C)、和初始的CD8 T细胞(D)的药效学(如通过ICOS表达测量的)。
图28A-D.总的CD4记忆T细胞(A)、初始的CD4 T细胞(B)、总的记忆CD8 T细胞(C)、和初始的CD8 T细胞(D)的药效学(如通过PD-1表达测量的)。
图29.Lin-CD20+B细胞的增殖的药效学(如通过Ki-67表达测量的)。
详细说明
在由抗原致敏(priming)的过程中或之后不久，OX40受体接合在T细胞(例如，CD4+T细胞)上导致T细胞(例如，CD4+T细胞)对抗原的应答增加。在本披露的上下文中，术语“接合”是指结合并刺激由OX40受体介导的至少一种活性。例如，OX40受体在抗原特异性T细胞(例如，CD4+T细胞)上的接合导致与响应于单独的抗原相比增加的T细胞增殖，以及增加的细胞因子的产生。对抗原的增加的应答可以比在没有OX40受体接合下维持实质上更长的一段时间。因此，经由OX40受体的刺激通过提高抗原(例如，肿瘤抗原)的T细胞识别来增强抗原特异性免疫应答。
当在由抗原致敏T细胞的过程中或之后不久向受试者给予时，OX40激动剂可在受试者(如人类受试者)中增强抗原特异性免疫应答。OX40激动剂包括OX40配体(“OX40L”)，如可溶性OX40L融合蛋白和抗OX40抗体或其片段。具体的实例是融合多肽亚基，包含OX40L的受体结合域、三聚结构域(例如，来自TRAF-2的异亮氨酸拉链结构域)、和人IgG4Fc结构域，其中该多肽亚基自组装成多聚体(例如，三聚体或六聚体)的融合蛋白。还描述了包括编码此类融合多肽的多核苷酸序列的核酸。本披露还提供了用于在受试者中使用多聚OX40L融合多肽来增强抗原特异性免疫应答的方法。在此所披露的关于OX40L融合蛋白的组合物和方法可更普遍地用于多聚体(例如，三聚体和六聚体)的受体结合的融合蛋白的生产和使用中。
定义
术语“一个/种(a或an)”实体是指一个/种或多个/种该实体；例如，“多肽亚基”应理解为代表一种或多种多肽亚基。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个(一种或多种)”、以及“至少一个(至少一种)”在此可以互换地使用。
除非另外定义，否则在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。例如，《简明生物医学和分子生物学词典》，佐裴秀(Juo,Pei-Show)，第2版，2002年，CRC出版社；《细胞与分子生物学词典》，第3版，1999年，学术出版社；以及《牛津生物化学与分子生物学词典》，修订版，2000年，牛津大学出版社，为技术人员提供了许多在本披露中使用的术语的综合词典。
单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受的形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是本披露的不同方面或方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
如在此使用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”和复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非标准的氨基酸来进行的修饰。多肽可来自天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
如在此使用的，“蛋白质”可指单个多肽，即，如上所定义的单个氨基酸链，而且还可以指相关联的两个或更多个多肽，例如，通过二硫键、氢键、或疏水相互作用来产生多聚体蛋白质。如在此使用的，术语“多肽亚基”是指氨基酸的多肽链，该多肽链可以与其他多肽亚基(无论是相同或不同的)相互作用以形成多聚体蛋白，例如，如在此所描述的六聚体蛋白。
如在此披露的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有一种限定的三维结构，但是它们不是必然具有这种结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有限定的三维结构而可采用很多不同构象的多肽被称为未折叠的。
一种“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不存在于其天然环境中的一种多肽。不要求特定水平的纯化。例如，一种分离的多肽可以从其天然或自然环境中去除。如同已经通过任何合适的技术来分离、份化或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽一样，如在此披露的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。
在此披露的其他多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及其任何组合。当提及如在此披露的多肽亚基或多聚体蛋白时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”可包括保留完整多肽或蛋白质的至少一些活性的任何多肽或蛋白质，但其在结构上不同。多肽的片段包括，例如，蛋白水解片段、以及缺失片段。变体包括如上所述的片段，而且还有由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可自发产生或有意构造。有意构造的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包括保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已被改变使得展现出在天然多肽上找不到的附加特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在此还可以称为“多肽类似物”。如在此所使用的，“衍生物”是指具有通过官能侧基的反应来化学衍生的一个或多个氨基酸的主题多肽。含有二十种标准氨基酸的一种或多种标准或合成的氨基酸衍生物的那些肽也作为“衍生物”包括在内。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
“保守的氨基酸取代”是一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸替代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸对于酪氨酸的取代是保守取代。鉴定不消除蛋白质活性的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域公知的(参见，例如，布鲁梅尔(Brummell)等人，生物化学(Biochem.)，32：1180-1187(1993)；小林(Kobayashi)等人，蛋白质工程(Protein Eng.)12(10):879-884(1999)；以及伯克斯(Burks)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：412-417(1997))。
如在此使用的术语“抗体”(或其片段、变体、或衍生物)是指能够结合至抗原的抗体的至少最小部分，例如，在由B细胞产生的典型抗体的情况下，至少重链(VH)的可变结构域和轻链(VL)的可变结构域。脊椎动物系统中的基础抗体结构相对较好理解。参见，例如，哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5,892,019之中。本披露涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或子类。
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸连同复数核酸，并且是指一种分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中所发现)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸节段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其天然环境中去除的核酸分子DNA或RNA。例如，在一个载体中所包含的编码多肽亚基的重组多核苷酸被视为是分离的，如在此披露。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分地或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物。分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如在此使用，“编码区”是包含翻译成氨基酸的密码子的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，它可被认为是编码区的一部分，但是任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、以及类似序列)并非编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单一载体可以单独地编码一个免疫球蛋白重链可变区和一个免疫球蛋白轻链可变区。另外，载体、多核苷酸、或核酸可以编码异源编码区，无论是稠合或非稠合至编码如在此提供的多肽亚单位或融合蛋白的核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相关联的其他转录或翻译控制元件。可操作地关联或连接是针对基因产物(例如多肽)的编码区按以下这种方式与一个或多个调控序列相关联，该方式使得该基因产物的表达处于这种或这些调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所希望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰有待转录的DNA模板的能力，那么两个DNA片段(如多肽编码区和与其关联的启动子)“可操作地关联”或“可操作地连接”。因此，启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联，只要启动子能够实现所述核酸的转录。启动子可以是只在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号可以可操作地与多核苷酸相关联以便引导细胞特异性转录。在此披露了合适的启动子和其他转录控制区。
多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，它与内含子A相结合)、猿病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其他转录控制区包括得自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔β-球蛋白的那些转录控制区域，连同能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。另外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，连同淋巴因子可诱导的启动子(例如可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及得自小核糖核酸病毒的元件(特别是内核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。
在其他实施例中，多核苷酸可以是例如处于信使RNA(mRNA)形式的RNA。
多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区相关联，这些另外的编码区引导由如在此披露的多核苷酸(例如编码在此提供的多肽亚基的多核苷酸)所编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经开始将生长的蛋白质链输出横穿粗面内质网，该信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白质上裂解。本领域普通技术人员意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽的N末端的信号肽，这种信号肽从完整或“全长”多肽上裂解以便产生分泌或“成熟”形式的多肽。在一些实施例中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保持引导与其可操作关联的多肽的分泌的能力的所述序列的功能衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列来取代。
“载体”是导入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体也可以包括一种或多种可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件。
“转化的”细胞或“宿主”细胞是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。如在此使用的，术语转化涵盖可将核酸分子引入这样的细胞的所有技术，这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。转化的细胞或宿主细胞可以是细菌细胞或真核细胞。
“特异性结合”一般是指分子(例如，OX40L或其受体结合片段)经由其受体结合域来结合至另一个分子(例如，OX40)，并且这种结合需要抗原结合域与表位之间有某种互补性。根据此定义，当与配体将结合至随机、不相关的分子相比，该配体更容易经由其受体结合域来结合至那个受体时，该配体被认为是“特异性地结合”至该受体。术语“特异性”在此用于对某种配体结合至某种受体的相对亲和力进行定性。例如，与配体“B”相比，配体“A”可被视为针对给定的受体具有较高特异性，或与配体“A”针对相关受体“D”所具有的特异性相比，配体“A”可被认为以较高特异性结合至受体“C”。
“受体-结合域”意指包括在配体(例如，如在此所披露的OX40L)中的结合域。
配体，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亚基或多聚体融合蛋白可以结合到受体，该受体例如是具有解离速率(k(解离))小于或等于5x 10-2sec-1、10-2sec-1、5x 10- 3sec-1或10-3sec-1的OX40。配体，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亚基或多聚体融合蛋白可以结合到受体，该受体例如是具有解离速率(k(解离))小于或等于5x 10-4sec-1、10-4sec-1、5x 10-5sec-1或10-5sec-15x 10-6sec-1、10-6sec-1、5x 10-7sec-1或10-7sec-1的OX40。
术语“抑制(inhibit)”、“阻断(block)”和“压制(suppress)”在此可互换地使用，并且是指任何统计学显著的生物活性的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的降低。
如在此使用，术语“亲和力”是指配体与其同源受体的结合强度的度量。如在此使用的，术语“亲合力”是指配体和受体的群体之间复合体的总体稳定性，即，配体和受体的组合的功能性结合强度，例如，六聚体OX40L-IgG4融合蛋白与细胞表面OX40的相互作用。亲合力与群体中的单独受体结合域与特定受体的亲和力相关，并且还与配体和受体的效价相关。
配体，例如，在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亚基或多聚体融合蛋白，也可以就其对配体的结合亲和力方面来描述或指定。例如，配体可以按不大于5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x 10-11M、10-11M、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x 10-15M或10-15M的解离常数或KD来结合至受体。
配体，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亚基或多聚体融合蛋白可以结合到受体，该受体例如是具有结合速率(k(结合))大于或等于103M-1sec-1、5X 103M-1sec-1、104M-1sec-1或5X 104M-1sec-1的OX40。配体，例如，如在此所披露的OX40L-IgG4-Fc多肽亚基或多聚体融合蛋白可以结合到受体，该受体例如是具有结合速率(k(结合))大于或等于105M-1sec-1、5X 105M-1sec-1、106M-1sec-1、或5X 106M-1sec-1、或107M-1sec-1的OX40。
OX40，或“OX40受体”是在活化的T细胞(例如CD4+和CD8+T-细胞)的表面上以及在Foxp3+CD4+调节性T细胞(Treg)上表达的一种蛋白(也不同地称为CD134、肿瘤坏死因子受体超家族成员4、和ACT-35)。初始的CD4+和CD8+T-细胞不表达OX40(克罗夫特·M.(Croft,M.)，(2010)免疫学年鉴(Ann RevImmunol)28：57-78)。
“OX40配体”(“OX40L”)(也不同地称为肿瘤坏死因子配体超家族成员4、gp34、TAX转录活化糖蛋白1、和CD252)在很大程度上被发现于抗原呈递细胞(APC)，并且可以在活化的B细胞、树突细胞(DC)、朗格汉斯细胞、浆细胞DC、和巨噬细胞上被诱导(克罗夫特·M.(Croft,M.)，(2010)免疫学年鉴(Ann Rev Immunol)28：57-78)。其他细胞，包括活化的T细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞和平滑肌细胞可以在响应于炎性细胞因子(Id.)中表达OX40L。OX40L特异性结合OX40受体。人类蛋白质被描述于PCT公开号WO 95/21915中。小鼠OX40L被描述于美国专利号5,457,035中。OX40L表达于细胞的表面上，并包括细胞内、跨膜和细胞外受体结合域。OX40L的功能性活性可溶形式可以通过删除细胞内和跨膜结构域来产生，如描述于，例如，美国专利号5,457,035和6,312,700以及WO 95/21915，出于所有目的将其披露内容结合在此。OX40L的功能性活性形式是保留特异性结合OX40的能力的形式，即具有OX40“受体结合域”的形式。一个实例是SEQ ID NO:1的氨基酸51至183，人OX40L。确定OX40L分子或衍生物特异性结合OX40的能力的方法在下面讨论。制造和使用OX40L及其衍生物(例如，包括OX40结合域的衍生物)的方法描述于WO 95/21915，其还描述了包含连接到其他肽的OX40L的可溶形式的蛋白，例如，人免疫球蛋白(“Ig”)Fc区，该蛋白可以被产生来促进OX40配体从培养的细胞中纯化，或被产生来提高该分子在体内给予至哺乳动物后的稳定性(也参见，美国专利号5,457,035和PCT公开号WP 2006/121810，这两个专利都通过引用以其全文结合在此)。
如在此使用，术语“OX40L”包括整个OX40配体、可溶性OX40配体、和OX40配体的功能性活性部分。在OX40L的定义内还包括的是OX40配体变体，其氨基酸序列与天然存在的OX40配体分子不同，但其保留特异性结合到OX40受体的能力。此类变体被描述于美国专利号5,457,035和WO 95/21915中。在相关的实施例中，本披露提供已经丧失特异性结合OX40的能力的OX40L的突变体，例如SEQ ID NO:1的氨基酸51至183，其中人OX40L的受体结合域的位置180处的苯丙氨酸已被替换为丙氨酸(F180A)。
“三聚结构域”是在多肽内促进该多肽装配成三聚体的氨基酸序列。例如，三聚可经由与其他三聚结构域(具有相同或不同的氨基酸序列的另外的多肽的三聚结构域)关联来促进装配成三聚体。该术语也被用于指编码这样的肽或多肽的多核苷酸。
术语“Fc”域是指抗体恒定区的一部分。传统上，术语Fc结构域是指涵盖抗体的配对CH2、CH3和铰链区的蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶)裂解产物。在本披露的上下文中，术语Fc结构域或Fc是指不管生产手段的任何多肽(或编码这样的多肽的核酸)，其包括免疫球蛋白多肽的CH2、CH3和铰链区的全部或一部分，例如，人IgG4Fc。
如在此使用，术语“CH2域”包括重链分子的Fc结构域的部分，使用常规的编号方案该部分例如从抗体的约氨基酸244延伸至氨基酸360(氨基酸244至360，卡巴特编号系统；以及氨基酸231-340，EU编号系统)。还被文献充分证明的是CH3域从CH2域延伸至IgG分子的C末端并且包括近似108个氨基酸。
如在此使用，术语“铰链区”包括重链分子的Fc结构域的将CH1域接合至CH2域的那部分。这个铰链区包括近似25个氨基酸并且是柔性的，由此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分成三个相异的域：上、中、以及下铰链域(鲁(Roux)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)161：4083(1998))。
如在此使用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在在此提供的某些方面中，人IgG4Fc结构域可以在铰链区进行突变以确保两个铰链区之间二硫键形成，具体地，在位置228处丝氨酸至脯氨酸(根据EU编号)的突变。包含S228P突变的人IgG4Fc结构域在此被称为“IgG4P Fc结构域”。
如在此使用，术语“连接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”可互换地使用。这些术语是指通过包括化学轭合或重组手段的任何手段将两个更多个元件或组分连接在一起。“框内融合”是指连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框架(ORF)以便以维持原始ORF的正确翻译阅读框架的方式来形成连续更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个节段的单一蛋白质(这些节段天然地通常并不这样连接)，例如，如在此提供的OX40L IgG4P融合蛋白。虽然阅读框架由此在整个融合节段上被致使连续，但是这些节段可以被例如框内接头序列在物理上或空间上分离。
在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是多肽中的在氨基至羧基末端方向上的氨基酸顺序，其中在多肽的一级活化的结构中，在序列上彼此邻接的氨基酸是连续的。
如在此使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除和瞬态表达与稳定表达两者。它包括而不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，和将这种mRNA翻译成多肽。如果最终所希望的产物是生物化学物质，那么表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如在此使用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录来产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。在此描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白裂解等)的多肽。
如在此使用的术语“治疗(treat、treatment、或treatment of)”(例如，在短语“治疗癌症患者”中)是指减少疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如在一定程度上受试者具有更长的存活期或减少的不适。例如，治疗可以是指当向受试者给予疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜、体育动物、和动物园动物，包括例如人、非人类灵长类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
术语“药用组合物”是指一种呈关于允许活性成分的生物活性有效的这种形式的制剂，以及不包含对于该组合物将给予的受试者而言具有不可接受毒性的额外组分的制剂。这种组合物可以是无菌的。
如在此披露的，抗体的“有效量”是足以实施具体阐述目的的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。
OX40L IgG4融合多肽亚基
本披露涉及可以装配成六聚体蛋白并具有增强的刺激人T细胞的能力的OX40L融合多肽亚基。在此提供的多肽亚基包含人IgG4Fc结构域，例如人IgG4P Fc结构域、三聚结构域(例如，TRAF-2异亮氨酸拉链三聚结构域)、和人OX40L的受体结合域。示例性实施例示意性地在图1示出。典型地，IgG4Fc结构域、三聚结构域和OX40L受体结合域以N-末端至C-末端方向排列。示例性OX40L融合多肽亚基由SEQ ID NO:4所代表。
在示例性实施例中，OX40L受体结合域是人OX40L的胞外结构域。一个这样的结构域的序列是由SEQ ID NO:1的氨基酸51至183所代表。>sp|P23510|TNFL4_人肿瘤坏死因子配体超家族成员4OS＝智人GN＝TNFSF4PE＝1SV＝1
MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEK GFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVY LNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
保留结合于OX40受体所希望的性质的任何OX40L多肽序列适用于在此所述的融合多肽和方法。
毗连OX40L受体结合域的是三聚结构域。术语“毗连”包括，例如，经由接头或异源剂邻接或关联。三聚结构域的作用是促进单个OX40L融合多肽分子自组装成三聚体蛋白。因此，具有三聚结构域的OX40L融合多肽自组装成三聚体OX40L融合蛋白。在一个实施例中，该三聚结构域是亮氨酸拉链结构域。示例性亮氨酸拉链结构域是工程化的酵母GCN4亮氨酸变体，被描述于Harbury等人(1993)科学(Science)262：1401-1407，将其披露内容结合在此用于所有目的。示例性三聚结构域包括：TNF受体相关因子2(TRAF2)(登录号Q12933[gi:23503103]；氨基酸310-349)；血小板反应蛋白1(登录号PO7996[gi:135717]；氨基酸291-314)；母系蛋白-4(登录号O95460[gi:14548117]；氨基酸594-618；软骨基质蛋白(母系蛋白-1)(登录号NP002370[gi:4505111]；氨基酸463-496；热休克转录因子(HSF)(登录号AAX42211[gi:61362386]；氨基酸165-191；和吞饮受体(登录号NP001072[gi:4557503]；氨基酸104-138。在某些方面中，三聚结构域包括人TRAF2(SEQ ID NO:2)的氨基酸310至349。
>sp|Q12933|TRAF2_人肿TNF受体相关因子2OS＝智人GN＝TRAF2PE＝1SV＝2
MAAASVTPPGSLELLQPGFSKTLLGTKLEAKYLCSACRNVLRRPFQAQCGHRYCSFCLASILSSGPQNCAACVHEGIYEEGISILESSSAFPDNAARREVESLPAVCPSDGCTWKGTLKEYESCHEGRCPLMLTECPACKGLVRLGEKERHLEHECPERSLSCRHCRAPCCGADVKAHHEVCPKFPLTCDGCGKKKIPREKFQDHVKTCGKCRVPCRFHAIGCLETVEGEKQQEHEVQWLREHLAMLLSSVLEAKPLLGDQSHAGSELLQRCESLEKKTATFENIVCVLNREVERVAMTAEACSRQHRLDQDKIEALSSKVQQLERSIGLKDLAMADLEQKVLEMEASTYDGVFIWKISDFARKRQEAVAGRIPAIFSPAFYTSRYGYKMCLRIYLNGDGTGRGTHLSLFFVVMKGPNDALLRWPFNQKVTLMLLDQNNREHVIDAFRPDVTSSSFQRPVNDMNIASGCPLFCPVSKMEAKNSYVRDDAIFIKAIVDLTGL
除了OX40L受体结合域和三聚结构域之外，融合多肽包括免疫球蛋白结构域，例如恒定区或“Fc”结构域。本披露提供了包括至少铰链区的人IgG4Fc结构域。在某些方面中，人IgG4Fc结构域进一步包括CH2域。在某些方面中，人IgG4Fc结构域进一步包括CH3域。在某些方面中，该铰链区包括在位置228(根据EU编号)处的丝氨酸至脯氨酸的突变，该突变赋予完整的重链间二硫键形成。在某些方面中，该铰链区包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至12。在某些方面中，人IgG4Fc结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至229。
与将三个OX40L受体结合域带到一起的三聚结构域结合，在两个IgG4Fc结构域之间的二硫键形成导致六聚体蛋白的形成(图1)。因此，免疫球蛋白结构域用作二聚结构域促进两个三聚体融合多肽之间经由不配对的免疫球蛋白结构域之间的相互作用组装成稳定的六聚体(即包含六个OX40L融合多肽亚基的多聚体)。在某些方面中，人IgG4Fc结构域为六聚体蛋白提供稳定性而不促进效应功能例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性。
在某些方面中，本披露提供自组装以形成能够特异性结合OX40的六聚体蛋白的单链多肽亚基。示例性单链多肽亚基包括：人IgG4Fc结构域、功能性三聚结构域、和OX40L的受体结合域。在某些方面中，该多肽亚基可以自组装成三聚体或六聚体蛋白。在某些方面中，该多肽亚基(从氨基末端到羧基末端)被安排如下：人IgG4Fc结构域，随后是三聚结构域，随后是OX40L受体结合域。三个结构域可以是直接毗连的。例如，在某些方面中，人IgG4Fc结构域的羧基末端直接融合到三聚结构域的氨基末端，且三聚结构域的羧基末端直接融合到OX40L受体结合域的氨基末端。可替代地，该三个结构域可以被一个或多个接头、间隔子或其他异源多肽分离。
在某些方面中，如在此提供的OX40L融合多肽亚基可以特异性结合至人OX40。在某些方面中，如在此提供的OX40L融合多肽亚基可以特异性结合至非人类灵长类OX40，例如，食蟹猴OX40或恒河猴OX40。在某些方面中，如在此提供的OX40L融合多肽亚基不结合小鼠OX40或大鼠OX40。
如在此提供的OX40L亚基多肽可以包含一个或多个保守氨基酸改变，例如，多达十个保守性变化(例如，两个取代的氨基酸、三个取代的氨基酸、四个取代的氨基酸、或五个取代的氨基酸等)，只要可以在该多肽中进行该变化而不改变OX40L融合多肽亚基或六聚体蛋白的生化功能。
例如，可以在OX40L受体结合域中进行一个或多个保守性改变，而不改变其结合OX40能力。同样地，可以在三聚结构域中进行一个或多个保守性变化，而不改变其进行三聚的能力。
另外，多肽结构域的一部分可以被缺失而不损害或消除它的全部功能。同样地，如下所述，可以在多肽链中进行插入或添加，例如，添加表位标签，而不损害或消除其功能。可以进行的、不实质性损害多肽的一个或多个功能的其他修饰包括，例如，在体内或体外结合了不常见氨基酸的化学和生化修饰。这样的修饰包括，例如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、标记(例如，使用放射性核素)、以及各种酶修饰，如本领域的普通技术人员将很容易理解的。各种用于标记多肽的方法和对于这样的目的有用的标记在本领域中是公知的，并且包括放射性同位素如32P、荧光团、化学发光剂、酶和抗配体。
融合多肽亚基可进一步包括异源剂，例如，稳定剂、免疫应答调节剂、或可检测的药剂。在某些方面中，异源剂包括经由肽键融合到多肽亚基的一个或多个另外的多肽序列，例如信号序列(例如，分泌信号序列)、接头序列、氨基酸标签或标记、或有助于纯化的肽或多肽序列。在某些方面中，异源多肽可融合到IgG4-Fc结构域的N-末端，异源多肽可融合至OX40L的受体结合域的C-末端，异源多肽可融合至IgG4-Fc结构域的C-末端和三聚结构域的N-末端，或异源多肽可融合至三聚结构域的C-末端和OX40L的受体结合域的N-末端。可替代地，异源多肽可以在任何IgG4Fc结构域、三聚结构域、或OX40L受体结合域内发生内部融合，只要保持该结构域的功能特性。
在某些方面中，可以将异源剂化学轭合至多肽亚基。可以化学轭合至多肽亚基的示例性异源剂包括但不限于，接头、药物、毒素、显像剂、放射性化合物、有机和无机聚合物、以及能够提供不为多肽亚基本身所提供的希望的活性的任何其他组合物。具体的试剂包括但不限于聚乙二醇(PEG)、细胞毒性剂、放射性核素、显像剂、生物素。
在某些方面中，本披露提供了某些OX40L相关的多肽亚基，被用作对照或研究工具。例如，本披露提供如上所述的OX40L相关亚基多肽，其中OX40L受体结合域包括人OX40L的氨基酸51到183(SEQ ID NO:1)，除了在位置180处的单个苯丙氨酸至丙氨酸的取代(F180A)。这个包含SEQ ID NO:6的OX40L相关的多肽亚基不能结合人OX40。在另一个实例中，本披露提供可形成如上所述的六聚体蛋白的OX40L多肽亚基，但是其中OX40L受体结合域是小鼠或大鼠OX40L受体结合域，并且Fc结构域是鼠类IgG1Fc结构域，并且三聚结构域是小鼠TRAF2三聚结构域。这个小鼠源性构建体可被用于在啮齿类动物中进行体内实验。
多聚体OX40L IgG4P融合蛋白
如上所述的OX40L融合多肽亚基可自组装成三聚体或六聚体OX40L融合蛋白。因此，本披露提供包括六个如上所述的多肽亚基的六聚体蛋白。在实例中所描述的示例性多肽亚基自组装成在此指定为“OX40L IgG4P融合蛋白”的六聚体蛋白。除非特别注明，在此所用的术语“OX40L IgG4P融合蛋白”是指人OX40L IgG4P融合蛋白。自组装成六聚体蛋白OX40IgG4P融合蛋白的多肽亚基的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:4中。尽管如此，本领域的普通技术人员将认识到，许多其他序列也满足在此阐述的关于六聚体OX40L融合蛋白的标准。
在某些方面中，OX40L融合多肽亚基也可以自组装成包括三个多肽亚基的三聚体蛋白。例如，在Fc结构域不展现完整的二聚化的情况下，这可能会发生。
当OX40在初级活化的T细胞(例如，来自人、食蟹猴、恒河猴或其任意组合的初级活化的CD4+T细胞)上表达时，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以特异性结合该OX40。在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约0.01pM至约1nM，例如，约0.1pM至约100pM，例如，约1pM至约10pM，例如，约1.0pM至约8.0pM，所有均如通过流式细胞术测量的。例如，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约0.1pM、约0.5pM、约1pM、约2pM、约3pM、约4pM、约5pM、约6pM、约7pM、约8pM、约9pM、约10pM、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约80pM、约90pM、约100pM、约500pM、或约1nM，所有均如通过流式细胞术测量的。在某些方面，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约3.6pM。结合亲和力可通过许多不同的方法和/或仪器进行测量，相对结合亲和力可以依赖于方法或仪器而变化，如本领域的技术人员或普通技术人员将很好地理解的。
如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)鉴于其多价的特性可以占据和交联在细胞(例如，初级活化的人CD4+T细胞)表面上的一些或全部OX40分子。在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并能实现在初级活化的人CD4+T细胞上的20％受体占有率(EC20)，该六聚体蛋白的浓度为约0.01pM至约1nM，例如，约0.1pM至约100pM，例如，约0.5pM至约10pM，例如，或约0.5至约3.0pM，例如，约0.5pM、约0.6pM、约0.7pM、约0.8pM、约0.9pM、约1pM、约2pM、或约3pM，如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并能实现在初级活化的人CD4+T细胞上的50％受体占有率(EC50)，该六聚体蛋白的浓度为约0.01pM至约1nM，例如，约0.1pM至约100pM，例如，约0.5pM至约10pM，例如，或约3.0pM至约10pM，例如，约2pM、约3pM、约4pM、约5pM、约6pM、约7pM、约8pM、约9pM、或约10pM，如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并能实现在初级活化的人CD4+T细胞上的90％受体占有率(EC90)，该六聚体蛋白的浓度为约0.1pM至约10nM，例如，约1pM至约1nM，例如，约10pM至约100pM，例如，或约35至约70pM，例如，约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、或约70pM，如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40，并可在约1.8pM的浓度下实现EC20，在约6.6pM的浓度下实现EC50，以及在约53pM的浓度下实现EC90，全部如通过流式细胞术测量的。
例如，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在OX40过量表达尤尔卡特细胞上表达的人OX40，结合亲和力为约1.0pM至约24pM，例如，约12pM，如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在OX40过量表达尤尔卡特细胞上表达的人OX40，并可在约1.0pM至约15pM的浓度下实现EC20，在约1.0pM至约40pM的浓度下实现EC50，以及在约10pM至约100pM的浓度下实现EC90，如通过流式细胞术测量的。在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在OX40过量表达尤尔卡特细胞上表达的人OX40，并可在约7.2pM的浓度下实现EC20，在约16pM的浓度下实现EC50，以及在约57pM的浓度下实现EC90，如通过流式细胞术测量的。
在另一个实例中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40，结合亲和力为约1.0pM至约50pM，例如，约24pM，如通过流式细胞术测量的。在另一个实例中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以结合至在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40，结合亲和力为约1.0pM至约50pM，例如，约21pM，如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)在基于平板的测定法中可诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖。例如，在体外测定中使用在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约1.0pM至约15pM(例如，8.0pM)的六聚体蛋白浓度处可实现20％最大增殖应答(EC20)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约5.0pM至约25pM(例如，14pM)的六聚体蛋白浓度处可实现50％最大增殖应答(EC50)，并且在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约65pM(例如，57pM)的六聚体蛋白浓度处可实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术测量的。
在某些方面中，在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可诱导从活化的CD4+T细胞(例如，人初级活化的CD4+T细胞)的剂量依赖性细胞因子释放。在某些方面中，释放的细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它们的任意组合。在某些方面中，该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它们的任意组合。同样地，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和在初级活化的恒河猴CD4+T细胞中实现CD4+T细胞增殖和细胞因子释放。
在另外的方面中，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可在表达OX40的T细胞中在FcγR表达细胞的存在下激活NFκB途径。例如，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可在表达OX40的尤尔卡特NFκB荧光素酶报告细胞中激活NFκB途径，该尤尔卡特NFκB荧光素酶报告细胞在响应于NFκB信号传导途径的刺激中产生荧光素酶。可替代地，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可在表达人OX40、食蟹猴OX40或恒河猴OX40的细胞中激活NFκB途径。
在又另一个方面中，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，当作为有效剂量向需要癌症治疗的受试者给予时，可以促进癌症治疗，例如通过减缓肿瘤生长、停止肿瘤生长、或减小现有肿瘤的尺寸。在某些方面中，可以在T细胞的存在下实现癌症治疗的促进。在某些方面中，当作为有效剂量向需要治疗的受试者给予时，与给予同种型匹配的对照分子相比，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以使肿瘤生长减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。
在又进一步方面中，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，可通过结合至OX40来诱导活化的表达OX40的CD4+T细胞的增殖，但基本上不触发针对活化的CD4+T细胞的补体依赖性或抗体依赖性细胞毒性。此外，在某些方面中，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可通过结合至OX40来诱导活化的、表达OX40的CD4+T细胞的增殖，但不结合C1q或不触发NK细胞介导的活化的CD4+T细胞的抗体依赖性细胞毒性。
编码OX40L融合蛋白的多核苷酸
本披露进一步提供了包含编码OX40L融合多肽亚基、或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸。编码OX40L IgG4P融合蛋白的多肽亚基的示例性多核苷酸序列由SEQ ID NO:3所代表。在某些方面中，编码IgG4Fc结构域、三聚结构域和OX40L受体结合域的核酸序列以5'至3'方向连接，例如，以5'至3’方向连续地连接起来。在其他方面中，所提供的多核苷酸可进一步包括信号序列，该信号序列编码，例如，分泌信号肽或膜定位序列。本披露提供了编码任何和所有OX40L融合多肽亚基体或多聚体(例如，包含该亚基的六聚体蛋白)的多核苷酸。
在某些方面中，本披露提供了包含编码OX40L IgG4P融合蛋白的核酸的多核苷酸。在某些方面中，核酸序列包含SEQ ID NO:3。在此提供的编码对照蛋白的多核苷酸，例如，本披露提供了包含编码HuIgG-4FcPTF2OX40L F180A的核酸的多核苷酸。在某些方面中，该核酸包含SEQ ID NO:5。
编码OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如OX40L IgG4P融合蛋白)的多核苷酸包括脱氧核糖核苷酸(DNA，cDNA)或核糖核苷酸(RNA)序列、或任一核苷酸的修饰形式，其编码在此描述的融合多肽。该术语包括单链和双链形式的DNA和/或RNA。
还提供的是包含含有一个或少数个缺失、添加和/或取代的核酸序列的多核苷酸。这样的改变可以是连续的，或者可以分布在该核酸的不同位置。基本上相同的核酸序列可以，例如，具有1个、或2个、或3个、或4个、或甚至更多的核苷酸缺失、添加和/或取代。在某些方面中，一个或更多个缺失、添加和/或取代不改变由多核苷酸序列编码的阅读框，使得修饰的(“突变体”)但基本上相同的多肽经核酸的表达而产生。
氨基酸(和/或核酸)的序列之间的相似性按照序列之间的相似性来表达，否则被称为序列一致性。序列一致性经常按照一致性(或相似性)百分比来测量；百分比越高，两个序列的初级活化结构越相似。“一致性百分比(％)”在此被定义为在比对序列并且(必要时)在候选和/或选择的序列中引入空位以便获得最大的序列一致性百分比之后，并且不考虑将任何保守氨基酸取代作为序列一致性的一部分，在候选序列中与所选择的序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。
因此，包括含有编码OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸可以是至少约95％、或至少96％、经常至少97％、98％、或99％相同于SEQ ID NO:4或相同于其中的至少一个子序列。出于确定百分比同源性(即，序列相似性)或一致性百分比的目的的比对可以用在本领域的技术范围内的各种方式(例如，使用公众或专有算法)来实现。例如，可使用成对比对方法来确定序列相似性，这些成对比对方法例如是BLAST、BLAST-2、ALIGN、或ALIGN-2、或多重序列比对方法，如Megalign(DNASTAR)、ClustalW或T-咖啡(T-Coffee)软件。本领域的技术人员可确定适当的计分函数，例如，缺口罚分或得分矩阵用于测量比对，包括在被比较序列的全长上实现最佳比对质量所需的任何算法。此外，可以用结构比对方法(例如，使用二级或三级结构信息来对齐两个或更多个序列的方法)，或组合序列、结构和系统发育信息来鉴定和最佳对齐候选蛋白质序列的混合法来实现序列比对。
NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(阿尔丘尔(Altschul)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1990)215:403)可从若干来源获得，这些来源包括国家生物技术信息中心(NCBI，贝塞斯达，马里兰州)和在互联网上，用于与序列分析程序BLASTP、BLASTN、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX连接使用。如何使用这个程序确定序列一致性的描述在互联网的NCBI网站上可获得。
因此，基本上相同或基本上相似于SEQ ID NO:4的核酸序列被涵盖在本披露之内。如果序列是以逐个核苷酸为基础与参比序列(例如，SEQ ID NO:4)的至少一个子序列相同，则序列基本上与SEQ ID NO:4相同。这样的核酸可以包括，例如，相对于SEQ ID NO:4的插入、缺失和取代。例如，这些核酸可以与参比核酸至少约70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或甚至99％相同，或可以编码与参考多肽序列(例如，SEQ ID NO:4)至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或甚至99％相同的多肽。
另外，包括编码OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸也可以包括多核苷酸序列，例如，促进核酸的表达或复制的表达调控序列和/或载体序列。同样地，包括编码OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸可以包括对所编码的多肽赋予功能属性的另外的编码序列。这样的序列包括分泌信号序列和膜定位信号。
包括编码OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的核酸的多核苷酸可以通过常规技术被引入载体，例如真核表达载体。因此，本披露提供了包含在此提供的多核苷酸的载体。将表达载体设计来通过提供启动和增强cDNA的转录和保证其正确的剪接和聚腺苷酸化的调控序列允许编码OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的多核苷酸序列在细胞中的转录。许多表达载体是对本领域的普通技术人员而言已知的，并且是商业上可获得的，或可以根据传统的分子生物学程序从个别组件组装的。
表达调控序列和表达载体的选择将依赖于宿主细胞的选择。可以采用多种多样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9以及其衍生物，更广泛的宿主范围质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。
对于表达OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的合适的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述哺乳动物起源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。关于蛋白质产生(包括抗体产生)方法的其他信息可以在例如美国专利公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501、以及国际专利公开号WO 2004/009823中找到，这些专利各自通过引用以其全文结合在此。
还提供的是包括如在此提供的多核苷酸或载体的宿主细胞。还可以有利地采用不同的哺乳动物或昆虫细胞培养系统，以表达在此提供的多肽亚基或六聚体蛋白。可以在哺乳动物细胞中进行重组蛋白质的表达，因为此类蛋白质总体上被正确地折叠，适当地修饰并且完全起作用。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由格卢兹曼(Gluzman)(细胞23:175，1981)描述的猴肾细胞的COS-7系、以及包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞系的其他细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制原点、连接有待表达的基因的适合的启动子和增强子、以及其他5'或3'侧接非转录序列、以及5'或3'非翻译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点)，以及转录终止序列。用于产生昆虫细胞中的异源蛋白质的杆状病毒系统通过卢科和萨莫斯(Luckow和Summers)，生物技术(BioTechnology)6:47(1988)评价。
蛋白质例如OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的表达和纯化可以使用标准的实验室技术进行。在此讨论或参考了这样的方法的实例。表达后，纯化的蛋白质有许多用途，包括例如功能分析、抗体产生和诊断，以及如下所述的预防和治疗用途。例如，在此提供的多肽亚基或六聚体蛋白可被用于生产药物组合物，包括适合用于预防和/或治疗给药的疫苗组合物。
通过转化的宿主产生的OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以按照任何合适的方法来纯化。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签诸如六组氨酸(SEQ ID NO:11)、麦芽糖结合域、流感外壳序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质，以便允许蛋白质通过合适的亲和柱后较容易地得到纯化。还可以使用诸如蛋白质水解、核磁共振和x射线结晶的此类技术来物理性表征分离的蛋白质。
例如，可以首先使用商业上可获得的蛋白浓缩过滤器例如艾美康恩(Amicon)或密理博皮里康恩(Millipore Pellicon)超滤单元浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。浓缩步骤之后，浓缩物可以施加到适合的纯化基质。可替代地，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧接的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。可替代地，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不可溶基质。最后，可以使用采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧接甲基或其他脂族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以便进一步纯化流感B/山形病毒结合分子。还可以采用不同组合的一些或所有上述纯化步骤以便提供均质的重组蛋白。
在细菌培养物中产生的OX40L融合多肽亚基或如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以例如通过以下方法分离：最初从细胞沉淀提取，然后进行一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。可以采用高效液相层析(HPLC)进行最终纯化步骤。用于重组蛋白表达的微生物细胞可以通过任何常规方法来破坏，这些方法包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。
药物组合物和给药方法
制备和给予如在此提供的六聚体蛋白(例如，如在此提供的OX40L IgG4P融合蛋白)至对其有需要的受试者，例如，以便增强在癌症患者中的免疫应答的方法，例如，以便抑制或减少肿瘤生长的方法，是本领域的技术人员公知的或可以容易地确定的。如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)的给药途径可以是，例如，口服、肠胃外、通过吸入或局部。如在此所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。虽然所有这些给药形式可清楚地考虑为适合的形式，但对于给予形式的另一个实例是用于注射、特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，合适的药物组合物可以包括但不限于缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(如聚山梨酯)、稳定剂试剂(例如人类白蛋白)等。在与在此的传授内容相容的其他方法中，如在此提供的六聚体蛋白(例如，在此提供的OX40L IgG4P融合蛋白)可直接递送到有害细胞群的位点，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。
如在此提供的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型(包括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液)来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入来给予。使用苄醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、和/或其他常规增溶剂或分散剂，这样的组合物可以作为盐水中的溶液来制备。
可与载体材料相组合以便产生单一剂型的如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)的量将取决于所治疗的受试者和具体给予模式而变化。该组合物可以作为单次剂量，多次剂量或在一个既定时间段中的输注给药。也可以调整剂量方案以便提供最佳期望应答(例如治疗性或预防性应答)。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40LIgG4P融合蛋白)当被给予时引起对患有待治疗疾病或病症的治疗的积极治疗应答的量。
试剂盒
本披露进一步提供包含如在此提供的六聚体蛋白(例如，在此描述的OX40L IgG4P融合蛋白)和可用于执行在此描述的方法的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含至少一种纯化的如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)。本领域的技术人员将容易地认识到所披露的、如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以容易地与在本领域中熟知的已建立的试剂盒形式之一结合。
免疫测定
如在此提供的六聚体蛋白，例如，OX40L IgG4P融合蛋白可以通过本领域中已知的任何方法测定特异性和/或选择性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统，例如：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、荧光集落测定(FFA)、微量中和测定、血凝抑制测定(HAI)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、仅举几个例子。此类测定是常规的并且在本领域是熟知的(参见，例如奥苏贝尔等人编著，1994，《分子生物学现代方法》(约翰威利父子公司，纽约)第1卷，其通过引用以其全文结合在此)。FFA，微量中和测定，和HAI将在以下实例中进行详细讨论。
适合于确定在此提供的六聚体蛋白的结合特性的方法和试剂是在本领域中已知的和/或可商购的。设计用于此类动力学分析的设备和软件是可商购的(例如，软件，GE医疗集团；软件，Sapidyne仪器)。
免疫增强和治疗的方法
在抗原激活过程中或之后通过在活化的T细胞(例如活化的CD4+T细胞)上接合OX40在受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类受试者)内增强抗原特异性免疫应答可以利用各种各样的方法来实现。选择的方法将主要取决于期望增强免疫应答的抗原的类型，并且可用的各种方法将在下面讨论。无论哪种方法被选中，可向受试者(例如人类受试者)给予如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)使得在T细胞被抗原致敏过程中或之后不久它呈现于受试者的T细胞。在受试者(例如人类受试者)内使用如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)激活免疫应答的示例性方法被呈现于PCT公开号WO2006/121810中，其通过引用以其全文结合在此。
在某些方面中，本披露提供了促进活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)存活或增殖的方法，该方法包括在该六聚体蛋白可特异性结合在T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)表面上的OX40的条件下使活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)接触如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)。在某些方面中，该接触是体外的。在某些方面中，该接触是体内的，例如，经由向需要治疗的受试者给予有效剂量的六聚体蛋白。在某些方面中，该接触与T细胞激活(例如，抗原激活)同时发生，在某些方面中，该接触在T细胞激活后发生。
在进一步方面中，本披露提供诱导从活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)的细胞因子释放的方法，该方法包括使活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)接触如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，其中该六聚体蛋白可特异性结合在活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)表面上。在某些方面中，该接触是体外的。在某些方面中，该接触是体内的，例如，经由向需要治疗的受试者给予有效剂量的六聚体蛋白。在某些方面中，该接触与T细胞激活(例如，抗原激活)同时发生，在某些方面中，该接触在T细胞激活后发生。在某些方面中，该细胞因子可以是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它们的任意组合。在某些方面中，该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它们的任意组合。
在某些方面中，活化的T细胞(例如，活化的CD4+T细胞)是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或它们的组合。
本披露进一步提供促进T细胞活化的方法，该方法包括使T细胞接触如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，其中该六聚体蛋白可以特异性结合T细胞表面上的OX40。在某些方面中，在抗原，例如，肿瘤抗原的存在下接触发生。在某些方面中，该方法进一步包括通过IgG4-Fc结构域与表达FcγR的细胞的相互作用使六聚体蛋白交联，这些表达FcγR的细胞例如是：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或浆细胞树突状细胞、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞、NK细胞、活化的T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、来自原发人肿瘤或肿瘤引流或非引流淋巴结的CD45+细胞、来自其他二级或三级淋巴结构的CD45+细胞，或它们的组合。在某些方面中，T细胞活化可以通过NFκB信号传导途径的刺激进行测量。在某些方面中，该接触是体外的。在某些方面中，该接触是体内的，例如，经由向需要治疗的受试者给予有效剂量的六聚体蛋白。
本披露进一步提供诱导ICOS或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)在T-细胞上的表达的方法，该方法包括使T细胞接触如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，其中该六聚体蛋白可以特异性结合T细胞表面上的OX40。
本披露进一步提供在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的在此提供的六聚体蛋白，例如，OX40L IgG4P融合蛋白或包含六聚体蛋白的组合物或配制品。在某些方面中，该癌症是实体瘤。根据这个方法，该六聚体蛋白或组合物的给予可以抑制肿瘤生长；可以促进肿瘤缩小、或两者。在某些方面中，在T细胞的存在下实现肿瘤生长抑制。
术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性的”以及“恶性的”是指或描述典型地特征为细胞生长失控的哺乳动物的生理病状。癌症的实例包括但不限于恶性肿瘤，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(诸如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介导的乳腺癌，参见例如，英尼斯(Innes)等人(2006)英国癌症杂志(Br.J.Cancer)94:1057-1065)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、各种类型的头颈癌(包括但不限于鳞状细胞癌)、以及粘液性起源的癌症(诸如粘液性卵巢癌)、胆管癌(肝)以及肾乳头状癌。
一些实施例针对在对其有需要的受试者中预防或治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予有效量的如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)、包含六聚体蛋白的组合物或配制品、或如在此所述的多核苷酸、载体、或宿主细胞。
用于治疗癌症的组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括给予方式、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所给予的其他药剂，以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定，以最优化安全性和功效。
本披露的组合物可以通过任何合适方法来给予，例如肠胃外、心室内、口服、通过吸入喷雾剂、局部、直肠、经鼻、口腔、经阴道或经由植入的储槽。如在此使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内以及颅内注射或输注技术。
本披露进一步提供在受试者中增强免疫应答的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)或包含六聚体蛋白的组合物或配制品。
待治疗的受试者可以是需要治疗的任何动物，例如，哺乳动物，在某些方面中，受试者是人类受试者。
在其最简单的形式中，将向受试者给予的制剂是以常规的剂量形式给予的如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)，并且在一些方面中，与如本文别处描述的药用赋形剂、载体或稀释剂组合。
如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可以通过如本文中别处所述的任何合适的方法给予，例如，通过静脉内输注给予。在某些方面中，如在此提供的六聚体蛋白(例如，OX40L IgG4P融合蛋白)可被引入到肿瘤中或引入到肿瘤细胞附近。
所有类型的肿瘤都潜在适合于通过这个方法来治疗，这些肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌和膀胱癌、以及黑色素瘤、肉瘤和淋巴瘤。
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除非另外指示，否则本披露采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。此类技术在文献中得到充分解释。参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，编著(1989)，《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；萨姆布鲁克等人，编著(1992)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室，纽约)；D.N.格洛弗(D.N.Glover)编著，(1985)《DNA克隆》(DNA Cloning)，第I卷和第II卷；盖特(Gait)，编著，(1984)《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)；穆利斯(Mullis)等人，美国专利号4,683,195；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)，编著，(1984)《核酸杂交》(NucleicAcid Hybridization)；黑姆斯和希金斯，编著，(1984)《转录和翻译》(Transcription AndTranslation)；Freshney(1987年)《动物细胞培养》(Culture Of Animal Cells)(阿伦利斯公司(Alan R.Liss,Inc.))；《固定化细胞与酶》(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社)(1986)；派尔巴尔(Perbal)(1984)《分子克隆实用指南》(A Practical Guide ToMolecular Cloning)；专注，《酶学方法》(Methods In Enzymology)(学术出版社公司(Academic Press,Inc.)，纽约)；米勒(Miller)和卡洛斯(Calos)编著(1987)《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells)，(冷泉港实验室)；吴(Wu)等人，编著，《酶学方法》(Methods In Enzymology)，第154和155卷；迈耶(Mayer)和沃克(Walker)，编著，(1987)《在细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology)(学术出版社，伦敦)；韦尔(Weir)和布莱克威尔(Blackwell)，编著，(1986)《实验免疫学手册》(Handbook OfExperimental Immunology)，卷I-IV；《操纵小鼠胚胎》(Manipulating the MouseEmbryo)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，(1986)；和奥苏贝尔(Ausubel)等人(1989)《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)，巴尔的摩，马里兰州)。
在博雷贝克(Borrebaeck)，编著(1995)《抗体工程》(Antibody Engineering)(第2版；牛津大学出版社)中，提出了抗体工程化的普遍原理。在雷克伍德(Rickwood)等人，编著(1995)《蛋白质工程实用方法》(Protein Engineering,A Practical Approach)(在牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英格兰)中提出了蛋白质工程化的普遍原理。在Nisonoff(1984)《分子免疫学》(Molecular Immunology)(第2版；Sinauer协会，桑德兰，马萨诸塞州)；以及斯图尔德(Steward)(1984)《抗体，它们的结构和功能》(Antibodies,TheirStructure and Function)(查普曼(Chapman)和霍尔(Hall)，纽约，纽约州)中提出了抗体和抗体半抗原结合的普遍原理。另外，本领域中已知的免疫学标准方法，不再做具体的描述，大体上遵循以下：《免疫学现代方法》，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约；斯蒂茨(Stites)等人，编著(1994)《基础和临床免疫学》(第8版；阿普尔顿和兰格公司(Appleton&Lange)，诺瓦克，康涅狄格州)；以及米歇尔(Mishell)和椎木(Shiigi)编著(1980)《在细胞免疫学中的选择方法》(Selected Methods in Cellular Immunology)(W.H.弗里曼与公司(W.H.Freeman and Co.)，纽约州)。
提出免疫学的普遍原理的标准参考著作包括《免疫学现代方法》(CurrentProtocols in Immunology)，约翰·威利与父子公司(John Wiley&Sons)，纽约；克莱因(Klein J.)(1982)，《免疫学：自身-非自身辨别科学》(Immunology:The Science of Self-NonselfDiscrimination)(约翰·威利与父子，纽约)；肯尼特(Kennett)等人，编著(1980)《单克隆抗体、杂交瘤：生物分析中的新维度》(Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A NewDimension in Biological Analyses)(Plenum出版社，纽约州)；坎贝尔(Campbell)(1984)《生物化学与分子生物学的实验室技术的“单克隆抗体技术”》("Monoclonal AntibodyTechnology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)，编著，伯登(Burden)等人，(爱思唯尔公司(Elsevier)，阿姆斯特丹)；格士柏(Goldsby)等人，编著(2000)《库比免疫学》(Kuby Immunology)(第4版；H.Freemand与公司)；罗义特(Roitt)等人，(2001)《免疫学》(Immunology)(第6版；伦敦：莫斯比)；阿巴斯(Abbas)等人，(2005)，《细胞和分子免疫学》(Cellular and Molecular Immunology)(第5版；爱思唯尔公司健康科学部(Elsevier Health Sciences Division))；Kontermann和迪贝尔(Dubel)(2001)《抗体工程》(Antibody Engineering)(施普林格出版社(Springer Verlag))；萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russell)(2001)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(冷泉港出版社)；勒温(Lewin)(2003)《基因VIII》(Genes VIII)(普伦蒂斯·霍尔出版(Prentice Hall)2003)；哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)(1988)《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港出版社)；迪芬巴赫(Dieffenbach)和Dveksler(2003)PCR引物(PCR Primer)(冷泉港出版社)。
以上引用的所有参考文献，连同在此引用的所有参考文献，是通过引用以其全文结合在此。
通过说明而不是通过限制的方式，提供以下实例。
实例
表1-1：缩略词列表与术语定义
缩略词或术语 定义
1A7 小鼠IgG1κ同种型对照抗体
A 丙氨酸
A375 人黑色素瘤细胞系
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
BSA 牛血清白蛋白
℃ 摄氏度
CI 置信区间
CDC 补体依赖性细胞毒性
CR 完全应答
Cyno 食蟹猴
DM-L 密度介质-淋巴细胞
EC 有效浓度
ECf 导致最大效应的f％的有效浓度
EC20 导致最大效应的20％的有效浓度
EC50 半最大有效浓度
EC90 导致最大效应的90％的有效浓度
表1-1：缩略词列表与术语定义
表1-1：缩略词列表与术语定义
缩略词或术语 定义
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PHA-L 植物血凝素-白细胞凝集素
PI 碘化丙啶
pM 皮摩尔
RBC 红血球
RBD 受体结合域
Rh 重组人
ROA 给药途径
rpm 每分钟转动次数
RT 室温
SC 皮下
SD 标准偏差
TCR T细胞受体
TGI 肿瘤生长抑制
TNFR 肿瘤坏死因子受体
TRAF2 肿瘤坏死相关因子2
Treg T调节性
V 体积
实例1：OX40L IgG4P Fc融合蛋白的工程化
OX40L IgG4P融合蛋白是遗传工程化的人OX40配体(OX40L)六聚体融合蛋白，该六聚体融合蛋白由三个不同的结构域组成(图1)：人IgG4P Fc、TRAF2的异亮氨酸拉链、和人OX40L的受体结合域。N末端Fc由铰链区(HC)和人类免疫球蛋白G4(IgG4)的γ重链恒定结构域2和3(CH2，CH3)组成。核心铰链区包括在位置228(根据EU编号)处的丝氨酸至脯氨酸的突变，该突变赋予完整的重链间二硫键形成。IgG4P Fc结构域直接融合到人肿瘤坏死因子2(TRAF2)的氨基酸残基310-349衍生的异亮氨酸拉链三聚结构域。融合到TRAF2域的C-末端的是人OX40L(基因名称TNFSF4)的胞外受体结合域(RBD)的氨基酸残基51-183。该TRAF2域稳定OX40L RBD的同源三聚体结构以便使OX40能够结合和活化，而IgG4P Fc结构域赋予血清稳定性、OX40L三聚体的二聚化，并促进六聚体融合蛋白的Fcγ受体聚集。
遗传工程化OX40L IgG4P融合蛋白是通过将两个单独的DNA片段融合在一起，且然后将融合的DNA克隆入质粒载体，从而产生编码完整融合蛋白的单个基因(称为huIgG4PFcTF2OX40L)。含有预先通过位点定向诱变引入到IgG4DNA序列中的S228P IgG4P突变的内部质粒在聚合酶链反应(PCR)中作为模板以产生IgG4P Fc DNA片段。含有编码TRAF2和OX40L RBD的融合物的DNA序列的独立的内部质粒被用作PCR的模板以产生第二DNA片段。后一片段通过重叠延伸PCR与IgG4P Fc片段重新组合，产生编码全长融合蛋白的单个DNA片段。在PCR中使用的寡核苷酸引物被设计来引入5′BssHII限制位点和3′NheI限制位点来在内部pOE质粒表达载体上消化、连接并克隆全长片段。插入物的核苷酸序列包含下列核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，并且来自这个构建体的表达产物(在此也被称为huIgGFcPTF2OX40L)包括下列氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：
SEQ ID NO：3：huIgG4FcPTF2OX40L的DNA序列(5’至3’开放阅读框)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTG
SEQ ID NO：4：huIgG4FcPTF2OX40L的氨基酸序列(N至C末端)
IgG4P-Fc结构域以常规字体显示，其中S228P突变带有下划线，TRAF2三聚结构域带有下划线，并且OX40L的RBD以粗体表示。
除了这个构建体，也产生了变体(F180A)，其编码对应于OX40L中的位置180处的氨基酸的苯丙氨酸(F)至丙氨酸(A)的突变。这种突变消除了OX40L蛋白的OX40受体结合活性，因此所得的分子可以作为实验对照以验证融合蛋白的特异性活性。这个变体是使用编码位置180处的丙氨酸的引物和编码融合蛋白的质粒作为模板通过位点定向诱变产生的。插入物的核苷酸序列包含下列核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，并且来自这个构建体的表达产物(在此也被称为huIgGFcPTF2OX40L F180A)包括下列氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：
huIgG4FcPTF2OX40L F180A的DNA序列(5’至3’开放阅读框)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCATAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCACCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTCTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGGCCTGCGTGCTG
huIgG4PFcTF2OX40L F180A的氨基酸序列(N至C末端)
IgG4P-Fc结构域以常规字体显示，S228P突变带有下划线，TRAF2三聚结构域带有下划 线，OX40L的RBD以粗体表示，并且F180A突变带有双下划线。
huIgG4PFcTF2OX40L和huIgG4PFcTF2OX40L F180A构建体用图示于图2中。
还构建了第三种变体，huIgGlFcTF2OX40L，其用人IgG1 Fc结构域替换了IgG4P Fc结构域。电脑设计这个构建体并通过基因合成(基因技术生命技术公司(Life Technologies))来制备，而不是采用重叠延伸PCR。如先前所描述的，合成的基因片段被用作PCR模板，以引入BssHII和NheI限制位点，用于消化和连接到pOE质粒表达载体。插入物的核苷酸序列包含下列核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，并且来自这个构建体的表达产物(在此也被称为huIgGFcPTF2OX40L F180A)包括下列氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：
SEQ ID NO：7：huIgG1TF2OX40L的DNA序列(5’至3’开放阅读框)
GATAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCTAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAGGACCAGGATAAGATCGAGGCTCTGTCCTCCAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCCATCGGCCTGAAGGACCTGGCCATGGCTGACCTGGAACAGAAAGTGCTGGAAATGGAAGCCTCCACACAGGTGTCACACAGATACCCCCGGATCCAGTCCATTAAGGTGCAGTTCACCGAGTACAAGAAAGAGAAGGGCTTTATCCTGACCTCCCAGAAAGAGGACGAGATCATGAAGGTGCAGAACAACTCCGTGATCATCAACTGCGACGGGTTCTACCTGATCTCCCTGAAGGGCTACTTCAGCCAGGAAGTGAACATCTCCCTGCACTACCAGAAGGACGAGGAACCCCTGTTCCAGCTGAAGAAAGTGCGGAGCGTGAACTCCCTGATGGTGGCCTCTCTGACCTACAAGGACAAGGTGTACCTGAACGTGACCACCGACAACACCTCCCTGGACGACTTCCACGTGAACGGCGGCGAGCTGATCCTGATCCACCAGAACCCTGGCGAGTTCTGCGTGCTG
SEQ ID NO：8：huIgG1FcTF2OX40L的氨基酸序列(N至C末端)
IgG1-Fc结构域以常规字体显示，TRAF2三聚结构域带有下划线，并且OX40L的RBD以粗体表示。
所产生的、编码用于融合蛋白的pOE质粒被转染到HEK293细胞中用于瞬时表达，然后通过蛋白A层析和凝胶过滤将可溶性融合蛋白从培养介质中纯化。使用均相时间分辨荧光(HTRF)表位竞争测定法(Cisbio，目录#62C16PAE)来对纯化的融合蛋白进行生化表征。进行HTRF竞争试验以评估huIgG4PFcTF2OX40L对CD16a(FcγRIIIa)的V158高亲和力变体的结合活性，该CD16A(FcγRIIIa)的V158高亲和力变体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在这个测定中，FcγRIIIa和γ链在HEK293细胞中共表达，并使用SNAP-铽供体染料标记。在0.1-1μM之间浓度的huIgG4PFcTF2OX40L蛋白的制剂被添加到标记的细胞中，随后加入受体染料标记的人IgG抗体(IgG-d2)。IgG-d2结合标记的FcγRIIIa，并引发了可测量的FRET信号。通过huIgG4PFcTF2OX40L竞争IgG-d2结合抑制了FRET，并且这个负信号与融合蛋白对于FcγRIIIa的结合亲和力成反比。HuIgG4PFcTF2OX40L结合FcγRIIIa，半最大应答(EC50)为500nM。相比之下，人IgG1单克隆抗体结合的EC50为220nM，表明相对于典型的IgG1抗体，该融合蛋白对于FcγRIIIa的亲和力减少约2.3倍。huIgG1FcTF2OX40L变体也在HTRF测定中进行了测试，并且它结合FcγRIIIa的EC50为4nM，或者相对于IgG1抗体亲和力增加了约55倍。
实例2：OX40L IgG4P融合蛋白对在活化的人、非人灵长类动物、大鼠和小
鼠T细胞表面上表达的天然OX40的结合亲和力和受体占有率
在这个实例中，进行了基于细胞的平衡结合测定来测量OX40L IgG4P融合蛋白对人、非人类灵长类动物、大鼠和小鼠T细胞的细胞表面上表达的OX40的结合的表观亲和力。另外，进行该平衡结合测定以确定OX40L IgG4P融合蛋白在什么浓度下实现了20％、50％、或90％的人OX40受体占有率(EC20、EC50、和EC90)。
OX40L IgG4P融合蛋白对初级活化的人CD4+T细胞和表达OX40的尤尔卡特T细胞的结合
OX40L IgG4P融合蛋白结合至人OX40的平衡结合常数(Kd)和在平衡时结合20％、50％、或90％的人OX40受体(EC20、EC50和EC90)的浓度是从OX40L IgG4P融合蛋白对表达OX40的初级活化的人CD4+T细胞或表达OX40的人尤尔卡特T细胞的结合曲线计算的。
对于结合于活化的初级活化的人CD4+T细胞，CD4+细胞首先从肝素钠抗凝全血中分离，该肝素钠抗凝全血是通过米迪缪尼供血者程序(MedImmune Blood Donor Program)从健康的供体中获得的，根据以下方案进行：
1.将1mL干细胞技术RosetteSep CD4+T细胞分离试剂盒抗体混合物添加至每20mL的全血，混合，并在室温(RT)下孵育20分钟(min)。
2.将血液用无菌的室温FACS缓冲液(PBS中的2％热灭活的新生小牛血清，pH 7.2)以1:1稀释，并且在DM-L介质上铺一薄层，接着在台式离心机中以380g(1200rpm)离心，持续20分钟停止。
3.离心后，用10mL移液管将含有人CD4+T细胞的血沉棕黄层移除，并且将细胞用RTFACS缓冲液洗涤一次并用RT完全RPMI培养基洗涤一次。
4.细胞在Vi细胞计数器上计数以确定细胞数量和活力，并且将CD4+T细胞以1.0×106/ml的浓度悬浮于完全RPMI培养基中。
在2μg/mL PHA-L和20IU/mL rhIL-2存在下，初级活化的人CD4+T细胞(1.0×106/ml在完全RPMI培养基中)在湿润的组织培养保温箱中在37℃和5％CO2下培养48小时以激活T细胞并上调OX40。随后，将这些细胞用于OX40L IgG4P融合蛋白结合实验中。在下面的表格和图表中的所有供体代表独立的个体；即，CD4+T细胞不从同一供体中分离用于重复结合实验。
在结合实验之前，表达OX40的人尤尔卡特NFκB-荧光素酶克隆64细胞在完全RPMI中进行培养，但没有激活。
用于结合实验的细胞随后通过离心(380g在RT下持续5分钟)收集，悬浮于FACS缓冲液并在贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)Vi细胞计数器上计数以确定细胞活力。随后，将确定为>95％存活的细胞在FACS缓冲液中稀释至1.0×106细胞/mL后用于结合试验。然后，将100μL的活菌(100,000)添加到非TC处理的96孔圆底板的每个孔中用于结合试验。
为了将OX40L IgG4P融合蛋白与细胞结合，将药物在4℃FACS缓冲液中稀释至1μg/mL，并且在15点稀释系列上稀释3倍。稀释后，加入到96孔板的细胞在380g下离心以沉淀细胞，并且将FACS缓冲液除去。然后，将含有OX40L IgG4P融合蛋白的100μL FACS缓冲液加入细胞，并于4℃孵育1小时。OX40L IgG4P融合蛋白孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液洗涤三次，每次洗涤使用200μL。然后，在黑暗中在4℃下将细胞与100μL FACS缓冲液一起孵育30分钟，该FACS缓冲液含有25μg/mL 647标记的山羊抗-人二级抗体和1μg/mL碘化丙啶(PI)。在二级抗体孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液(每次洗涤200μL)洗涤两次，然后悬浮于100μL的FACS缓冲液中用于在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。为了补偿，将含有结合到10μg/mL抗体(无PI)的表达OX40的细胞、仅结合于二级647标记的Ab试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用1μg/mL PI处理的细胞的孔制备用于单染色补偿对照。为了背景减除，如上所述，还制备了不存在第一抗体而含有二级抗体的细胞。F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P对照在与早期实验中的OX40L IgG4P融合蛋白相同的浓度下被用于证明OX40L IgG4P融合蛋白由结合活化的T细胞上的OX40的OX40L特异性介导。这种突变的对照蛋白代表在位置180处具有单一氨基酸突变(F至A的氨基酸改变)的OX40L IgG4P融合蛋白，该OX40L IgG4P融合蛋白防止OX40L结合OX40但不影响OX40L IgG4P融合蛋白的整体结构；它不结合天然的OX40，从而证明在活化的T细胞的受体占有率是通过OX40L：OX40相互作用特异性介导的。
对于OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白结合细胞的分析，使用了树星公司(TreeStar)的流式乔细胞术分析软件(Flow Jo cytometry analysis software)。使用补偿对照来定义补偿矩阵的荧光补偿之后，对活的(PI阴性)细胞进行门控并确定二级抗体的平均荧光强度(MFI)。将OX40L IgG4P融合蛋白结合的MFI对蛋白质浓度(M)进行作图以确定结合曲线，表观平衡解离结合常数(Kd)和表示20％、50％和90％的受体占有率(分别为EC20、EC50、和EC90)的浓度分别在图板棱柱(GraphPad prism)中用单位点(双曲线)非线性回归方程和在ECf计算中使用S形剂量-响应曲线(可变斜率)来确定。相较于使用原发人CD4 T细胞起源的和使用表达OX40的尤尔卡特细胞起源的表观Kd和EC20、EC50、和EC90值的2尾学生T检验确定的p值(如果有的话)呈现在总结表中。
OX40L IgG4P融合蛋白结合到活化的人CD4+T细胞，平均Kd为3.6±4.3pM，并且EC20、EC50、和EC90受体占有值分别为1.8±1.1pM、6.6±2.8pM、和53±17pM(表2-1和图3A)。
OX40L IgG4P融合蛋白结合到表达OX40的尤尔卡特T细胞，平均Kd为12±12pM，并且EC20、EC50、和EC90受体占有值分别为7.2±8.8pM、16±16pM、和57±46pM(表2-2和图3B)。在表达OX40的激活初级活化的人CD4+T细胞和表达OX40的尤尔卡特细胞之间计算的结合亲和力或受体占有值无统计学差异，如表2-3中所示。
表2-1对于OX40L IgG4P融合蛋白结合到表达OX40的激活的初级活化人CD4+T细胞的表观亲和力(Kd)和受体占有值(EC20、EC50、EC90)
表2-2：对于OX40L IgG4P融合蛋白结合到表达OX40的人尤尔卡特NFkB-荧光素酶克隆64细胞的表观亲和力(Kd)和受体占有值(EC20、EC50、EC90)
表2-3：初级活化的人CD4+T细胞和表达OX40的人尤尔卡特之间的表观亲和力和受体占有值之间的统计学比较
OX40L IgG4P融合蛋白结合至小鼠CD4+T细胞
使用表达OX40的、激活的初级活化小鼠CD4+T细胞对结合小鼠OX40的OX40L IgG4P融合蛋白进行了研究。根据以下方案，从收获的正常Balb/C小鼠脾脏中分离小鼠CD4+T细胞：
1.抵靠70μM尼龙过滤器将脾脏捣碎，该尼龙过滤器后面是无菌的3mL注射器柱塞以释放脾细胞，并且用1mL完全培养基(RPMI 1640，具有10％胎牛血清(FBS)、1％抗生素/抗真菌溶液、和55μMβ巯基乙醇(BME))冲洗过滤器。
2.脾细胞在台式离心机在室温下以330×g(1200rpm)离心10分钟以沉淀细胞。
3.弃去上清液，且沉淀用5mL的1X红血细胞(RBC)裂解缓冲液处理，并在室温下孵育5分钟以裂解RBC。将45mL完全培养基加入到该混合物，以在孵育时间结束时恢复同渗容摩。
4.细胞在离心机中在330×g下沉淀10分钟，并在美天旎(Miltenyi)MACS缓冲液(PBSpH 7.2+0.5％牛血清白蛋白(BSA)+2mM乙二胺四乙酸(EDTA))中洗涤两次。
5.弃去上清液，且将细胞沉淀物悬浮在冷的MACS缓冲液中，并用Vi细胞细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
6.根据制造商的说明，使用美天旎加工试剂盒(Miltenyi process kit)进行小鼠CD4+T细胞分离。然后，将CD4+阳性T细胞以1.5×106/mL在完全培养基中悬浮。
小鼠CD4+T细胞(150,000每孔在100μL完全培养基中)在涂有2μg/mL仓鼠抗小鼠CD3和仓鼠抗小鼠CD28抗体的96孔平板中培养以激活T细胞和诱导OX40表达，并在37℃和5％CO2下在湿润的组织培养保温箱中孵育过夜。活化的CD4+T细胞从孵育平板中除去，并且将100,000个细胞转移到非组织培养处理的96孔圆底板的各孔用于结合试验，并且细胞用FACS缓冲液(PBS pH 7.2，具有2％FBS)洗涤一次。用1μg/mL OX40L IgG4P融合蛋白和大鼠抗小鼠克隆OX86(阳性对照)抗体进行结合，该OX40L IgG4P融合蛋白和该大鼠抗小鼠克隆OX86抗体于FACS缓冲液中连续稀释3倍用于10点数据曲线，并且1μg/mL F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P(阴性对照)在深孔聚丙烯板中稀释6倍用于3点数据曲线。将50μL含OX40LIgG4P融合蛋白或抗体的FACS缓冲液加入一式两份的细胞，并在4℃下孵育45分钟。初级活化孵育后，将细胞洗涤两次，每次洗涤用200μL冷(4℃)的FACS缓冲液。然后，在4℃下在黑暗中将细胞与50μL FACS缓冲液一起孵育30分钟，该FACS缓冲液含有10μg/mL 488标记的山羊抗人二级或488标记的山羊抗大鼠二级抗体和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二级抗体孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液(每次洗涤200μL)洗涤两次，并且悬浮于100μL的FACS缓冲液中用于在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。制备含有表达OX40的细胞(无PI)、仅结合于二级488标记的抗体试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mL PI处理的细胞的孔，用于单染色补偿对照。
流式乔细胞术分析软件(树星(TreeStar)，阿什兰，俄勒冈州)被用来确定与细胞结合的OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白质。使用补偿对照来定义补偿矩阵，对活的(PI阴性)细胞进行门控并确定二级抗体的平均荧光强度(MFI)。将OX40L IgG4P融合蛋白结合的MFI对蛋白质浓度(M)进行作图以确定结合曲线，并且表观平衡解离结合常数(Kd)使用图板棱柱(GraphPad prism)(拉霍亚，加利福利亚州)中和用单位点(双曲线)非线性回归方程来确定。
对于活化的小鼠CD4+T细胞的结合测定结果示于图4A中。OX40L IgG4P融合蛋白不结合活化的小鼠CD4+T细胞。
OX40L IgG4P融合蛋白结合至大鼠CD4+T细胞。
使用表达OX40的、激活的初级活化大鼠CD4+T细胞对结合大鼠OX40的OX40L IgG4P融合蛋白进行了研究。根据以下方案，将大鼠CD4+细胞从新鲜收获的正常斯普瑞格-道利(Sprague Dawley)大鼠脾脏中分离：
1.抵靠70μM尼龙过滤器将脾脏捣碎，该尼龙过滤器后面是无菌的3mL注射器柱塞以释放脾细胞，并且用完全培养基(RPMI 1640，具有10％FBS、1％抗生素/抗真菌溶液、和55μMBME)冲洗过滤器。
2.脾细胞在台式离心机在室温下以330×g(1200rpm)离心10分钟以沉淀细胞。
3.弃去上清液，且沉淀用5mL的1X RBC裂解缓冲液处理，并在室温下孵育5分钟。将45mL完全培养基加入到该沉淀以在孵育时间结束时停止裂解。
4.细胞在离心机中在330×g下沉淀10分钟，并在美天旎MACS缓冲液(PBS pH 7.2+0.5％BSA+2mM EDTA)中洗涤两次。
5.弃去上清液，且将细胞沉淀物悬浮在冷的MACS缓冲液中，并用Vi细胞细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
6.根据制造商的说明，使用R&D系统Magcellect试剂盒进行大鼠CD4+T细胞分离。然后，将CD4+阳性T细胞以1.5×106/mL在完全培养基中悬浮。
大鼠CD4+T细胞(1x 106/mL完全培养基)在具有1μg/mL伴刀豆球蛋白A(Con A)和500IU/mL IL-2的T75细胞培养烧瓶中培养以激活T细胞和诱导OX40表达，并在37℃和5％CO2下在湿润的组织培养保温箱中孵育过夜。活化的CD4+T细胞从烧瓶中除去，并且将100,000个细胞转移到非组织培养处理的96孔圆底板的各孔用于结合试验，并且细胞用FACS缓冲液洗涤一次。用10μg/mL OX40L IgG4P融合蛋白和小鼠抗大鼠克隆OX40(阳性对照)抗体和10μg/mL F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P(阴性对照)进行结合，该OX40L IgG4P融合蛋白和该小鼠抗大鼠克隆OX40抗体于FACS缓冲液中连续稀释3倍用于10点数据曲线，该F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P在深孔聚丙烯板中连续稀释6倍用于3点数据曲线。将100μLOX40L IgG4P融合蛋白、对照蛋白或抗体加入一式两份的细胞，并在4℃下孵育1小时。初级活化孵育后，将细胞洗涤两次，每次洗涤用200μL冷(4℃)的FACS缓冲液。然后，在4℃下在黑暗中将细胞与100μL FACS缓冲液一起孵育30分钟，该FACS缓冲液含有10μg/mL488标记的山羊抗人或488标记的山羊抗小鼠二级抗体和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二级抗体孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液(每次洗涤200μL)洗涤两次，并且重悬浮于100μL的FACS缓冲液中用于在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。制备含有表达OX40的细胞(无PI)、仅结合于二级488标记的抗体试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mL PI处理的细胞的孔，用于单染色补偿对照。
流式乔细胞术分析软件(树星(TreeStar)，阿什兰，俄勒冈州)被用来确定与细胞结合的OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白质。使用补偿对照来定义补偿矩阵，对活的(PI阴性)细胞进行门控并确定二级抗体的平均荧光强度(MFI)。将OX40L IgG4P融合蛋白结合的MFI对蛋白质浓度(M)进行作图以确定结合曲线，并且表观平衡解离结合常数(Kd)使用图板棱柱(GraphPad prism)(圣地亚哥，加利福尼亚州)中和用单位点(双曲线)非线性回归方程来确定。
对于活化的大鼠CD4+T细胞的结合测定结果示于图4B中。OX40L IgG4P融合蛋白不结合活化的大鼠CD4+T细胞。
OX40L IgG4P融合蛋白结合至食蟹猴CD4+T细胞。
对于结合食蟹猴(cyno)OX40的OX40L IgG4P融合蛋白的平衡结合常数(Kd)，使用表达OX40的、激活的初级活化食蟹猴CD4+T细胞来确定。根据以下方案，将食蟹猴CD4+T细胞从来自万维网灵长类(World Wide Primates)(迈阿密，佛罗里达州)的健康食蟹猴供体(N＝2)获得的肝素钠抗凝全血中分离：
1.(试验1)通过组合52.8mL珀可(Percoll)附加液、1.2mL的1M HEPES、6mL的10X PBSpH 7.2和40mL的1×PBS pH 7.2来制备60％珀可，然后将10mL全血在50mL锥形离心管中在30mL的60％珀可上铺一薄层。(试验2)在室温下，通过将15mL的PBS加入85mL的淋巴细胞分离介质(LSM)中将LSM稀释至85％，然后将20mL全血在15mL的85％LSM上铺一薄层。
2.(试验1)在没有制动的台式离心机中，在室温下将血液于400×g下离心30分钟。(试验2)在没有制动的台式离心机中，在室温下将血液于1100×g下离心20分钟。
3.外周血单核细胞(PBMC)在界面收集并用冷的(4℃)美天旎MACS缓冲液洗涤两次，在1200转进行10分钟。
4.弃去上清液，且沉淀用5mL的1X RBC裂解缓冲液处理，并在室温下孵育5分钟。将45mL完全培养基(RPMI，具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌剂)加入沉淀以在孵育时间结束时停止裂解过程。
5.然后，将细胞在330×g下离心10分钟沉淀，并用20mL冷(4℃)的美天旎MACS缓冲液洗涤两次。
6.弃去上清液，且将细胞沉淀物悬浮在冷(4℃)的MACS缓冲液中，并用Vi细胞细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
7.根据制造商的说明，用美天旎非人灵长类试剂盒进行食蟹猴CD4+T细胞分离，然后如上所述CD4+T细胞在在Vi细胞计数器上计数并以1x 106/mL悬浮在完全培养基中。
食蟹猴CD4+T细胞(1x 106/mL完全培养基)在具有2μg/mL PHA-L和20IU/mL IL-2的T75细胞培养烧瓶中培养以激活T细胞和诱导OX40表达，并在37℃和5％CO2下在湿润的组织培养保温箱中孵育48小时。活化的CD4+T细胞从烧瓶中除去，并且将100,000个细胞转移到非组织培养处理的96孔圆底板的各孔用于结合试验，并且细胞用200μL FACS缓冲液洗涤一次。用1μg/mL OX40L IgG4P融合蛋白和1μg/mL F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P(阴性对照)进行结合，该OX40L IgG4P融合蛋白于FACS缓冲液中连续稀释3倍用于10点数据曲线，该F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P在深孔聚丙烯板中稀释8倍用于3点数据曲线。将100μL含OX40L IgG4P融合蛋白或对照蛋白的FACS缓冲液加入一式两份的细胞，并在4℃下孵育1小时。初级活化孵育后，将细胞每次洗涤用200μL冷(4℃)的FACS缓冲液洗涤两次。然后，在4℃下在黑暗中将细胞与100μL FACS缓冲液一起孵育30分钟，该FACS缓冲液含有10μg/mL488标记的山羊抗人二级抗体和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二级抗体孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液(每次洗涤200μL)洗涤两次，并且悬浮于100μL的FACS缓冲液中用于在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。制备含有表达OX40的细胞(无PI)、仅结合于二级488标记的抗体试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mL PI处理的细胞的孔，用于单染色补偿对照。
流式乔细胞术分析软件(树星(TreeStar)，阿什兰，俄勒冈州)被用来确定与细胞结合的OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白质。使用补偿对照来定义补偿矩阵，对活的(PI阴性)细胞进行门控并确定二级抗体的平均荧光强度(MFI)。将OX40L IgG4P融合蛋白结合的MFI对蛋白质浓度(nM)进行作图以确定结合曲线，并且表观平衡解离结合常数(Kd)使用图板棱柱(GraphPad prism)(圣地亚哥，加利福尼亚州)中和用单位点(双曲线)非线性回归方程来确定。
对于使用表达OX40的、激活的初级活化食蟹猴CD4+T细胞(N＝2)的结合试验的结果示于表2-4和图4C中。平衡解离常数(Kd)的计算表明，OX40L IgG4P融合蛋白对活化的食蟹猴CD4+T细胞结合的平均Kd为24.2±31.4pM。食蟹猴Kd和人Kd测量值之间的比率是七倍。
表2-4：对于OX40L IgG4P融合蛋白对食蟹猴的表达OX40的、激活的初级活化CD4+T细胞的结合的表观亲和力(Kd)
结合蛋白 N次实验 Kd±SD(pM)
OX40LIgG4P融合蛋白 2 24.2±31.4
F180AOX40L融合蛋白人IgG4P 2 无结合
OX40L IgG4P融合蛋白结合至恒河猴CD4+T细胞
对于结合恒河猴OX40的OX40L IgG4P融合蛋白的平衡结合常数(Kd)使用表达OX40的、激活的初级活化恒河猴CD4+T细胞来确定。根据以下方案，将恒河猴CD4+T细胞从来自全球灵长类(World Wide Primates)(迈阿密，佛罗里达州)的健康恒河猴供体(N＝2)获得的肝素钠抗凝全血中分离：
1.在室温下，将淋巴细胞分离介质(LSM)通过将5ml的PBS加入95mL的LSM稀释至95％。
2.在室温下使用PBS将肝素化恒河猴血以1:1稀释，并且20mL稀释的全血在50mL锥形离心管中在15mL的95％LSM上铺一薄层。
3.在没有制动的台式离心机中，在室温下将血液于400×g下离心30分钟。4.外周血单核细胞(PBMC)在界面收集并用冷的美天旎MACS缓冲液洗涤两次，在1200转进行10分钟。
5.弃去上清液，且沉淀用5mL的1X RBC裂解缓冲液处理，并在室温下孵育5分钟。将45mL完全培养基(RPMI，具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌剂)加入沉淀以在孵育时间结束时停止裂解过程。
6.然后，将细胞在330×g下离心10分钟沉淀，并用20mL冷的美天旎MACS缓冲液洗涤两次。
7.弃去上清液，且将细胞沉淀物悬浮在冷的MACS缓冲液中，并用Vi细胞细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
8.根据制造商的说明，用美天旎非人灵长类试剂盒进行恒河猴CD4+T细胞分离，然后如上所述CD4+T细胞在在Vi细胞计数器上计数并以1x 106/mL重悬浮于完全培养基中。
恒河猴CD4+T细胞(1x 106/mL完全培养基)在具有2μg/mL PHA-L和20IU/mL IL-2的T75细胞培养烧瓶中培养以激活T细胞和诱导OX40表达，并在37℃和5％CO2下在湿润的组织培养保温箱中孵育48小时。活化的CD4+T细胞从烧瓶中除去，并且将100,000个细胞转移到非组织培养处理的96孔圆底板的各孔用于结合试验，并且细胞用200μL FACS缓冲液洗涤一次。用1μg/mL OX40L IgG4P融合蛋白和1μg/mL F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P(阴性对照)进行结合，该OX40L IgG4P融合蛋白在深孔聚丙烯板中于FACS缓冲液中连续稀释3倍用于10点(试验1)或12点(试验2)数据曲线，该F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P稀释6倍用于2点数据曲线。将100μL含OX40L IgG4P融合蛋白或对照蛋白的FACS缓冲液加入一式两份孔中的细胞，并在4℃下孵育1小时。初级活化孵育后，将细胞洗涤两次，每次洗涤用200μL冷(4℃)的FACS缓冲液。然后，在4℃下在黑暗中将细胞与100μL FACS缓冲液一起孵育30分钟，该FACS缓冲液含有10μg/mL 488标记的山羊抗人或488标记的山羊抗小鼠二级抗体和5μg/mL碘化丙啶(PI)。在二级抗体孵育后，将细胞用4℃FACS缓冲液(每次洗涤200μL)洗涤两次，并且悬浮于100μL的FACS缓冲液中用于在BD LSRII流式细胞仪上进行流式细胞术分析。将含有表达OX40的细胞(无PI)、仅结合于二级488标记的Ab试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mL PI处理的细胞的孔制备用于单染色补偿对照。
流式乔细胞术分析软件(树星(TreeStar)，阿什兰，俄勒冈州)被用来确定与细胞结合的OX40L IgG4P融合蛋白和对照蛋白质。使用补偿对照来定义补偿矩阵，对活的(PI阴性)细胞进行门控并确定二级抗体的平均荧光强度(MFI)。将OX40L IgG4P融合蛋白结合的MFI对蛋白质浓度(nM)进行作图以确定结合曲线，并且表观平衡解离结合常数(Kd)使用图板棱柱(GraphPad prism)(圣地亚哥，加利福尼亚州)中和用单位点(双曲线)非线性回归方程来确定。
对于使用表达OX40的、激活的初级活化恒河猴CD4+T细胞(N＝2)的结合试验的结果示于表2-5和图4D。平衡解离常数(Kd)的计算表明，OX40L IgG4P融合蛋白对活化的恒河猴CD4+T细胞结合的平均Kd为20.65±22.56pM。恒河猴Kd和人Kd测量值之间的比率是六倍。
表2-5：对于OX40L IgG4P融合蛋白对恒河猴OX40表达活化的初级CD4+T细胞的结合的表观亲和力(Kd)
结合蛋白 N次实验 Kd±SD(pM)
OX40LIgG4P融合蛋白 2 20.65±22.56
F180AOX40L融合蛋白人IgG4P 2 无结合
SD＝标准偏差
统计方法
为了确定OX40L IgG4P融合蛋白与人、小鼠、大鼠、食蟹猴、恒河猴OX40结合的表观解离平衡结合常数(Kd)，使用用于Windows的图板棱柱(GraphPad Prism)版本5.01(图板软件公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国，www.graphpad.com)，对于一个位点结合(双曲线)采用了非线性回归(曲线拟合)方程。
为了确定20％、50％、和90％的OX40受体被抗体占有的浓度，首先利用方程X＝log[X]转化浓度值(M)，随后使用图板棱柱(GraphPad Prism)软件从S形剂量应答(可变斜率浓度-MFI)结合曲线对f＝20、f＝50、和f＝90确定EC任何值(ECf)。Ecf是激动剂给出底端和顶端之间通路的f％应答的浓度，并且在这种情况下当设置为20、50、或90时分别代表20％、50％、和90％的受体占有率，并且其中所计算曲线的顶端代表100％受体占有率。
为了确定从初级活化的人T细胞或OX40表达的尤尔卡特的结合试验中确定的表观Kd值或表观EC20、EC50或EC90值之间的统计显著性，在图板棱柱软件中利用具有95％置信水平的两侧不配对学生t检验和韦尔奇校正以解释具有不同标准偏差的数据集。
从数据获得的显著的p值(如果有的话)呈现于邻近描述性统计(即平均值和标准偏差)的总结表和图表中。
在这项研究中使用的材料在表2-6中列出。
表2-6：材料
结论
OX40L IgG4P融合蛋白与在初级活化的CD4+T细胞的细胞表面上表达的OX40结合，表观Kd对于人类OX40为3.6pM、对于食蟹猴OX40为24pM并且对于恒河猴OX40为21pM。OX40LIgG4P融合蛋白结合到在食蟹猴的细胞表面上的OX40的平均Kd值相比于结合到人初级活化的T细胞表面上表达的OX40的平均Kd值的所得比率被计算为7，OX40L IgG4P融合蛋白结合到在恒河猴的细胞表面上表达的OX40的平均Kd值相比于结合到人初级活化的T细胞表面上表达的OX40的平均Kd值的所得比率被计算为6。OX40L IgG4P融合蛋白不结合在大鼠或小鼠T细胞的细胞表面上表达的OX40。另外，在平衡时实现20％、50％、或90％人OX40受体占有率(EC20、EC50和EC90)的OX40L IgG4P融合蛋白的浓度分别被计算为1.8pM、6.6pM和53pM。
实例3：OX40L IgG4P融合蛋白对在细胞表面上表达的OX40相比于对在细胞
表面上表达的相关人肿瘤坏死因子受体超家族成员的结合特异性的确定
在这个实例中，使用人胚肾(HEK293)细胞在基于流式细胞术的细胞结合测定中确定了OX40L IgG4P融合蛋白的特异性，该人胚肾(HEK293)细胞使用cDNA构建体来进行瞬时转染，该cDNA构建体指导与OX40具有高度序列一致性的TNFR超家族(TNFRSF)成员的表达。
方法
搜索与人OX40具有亲近序列同源性的蛋白
为了鉴定与人OX40具有亲近氨基酸序列一致性的人类蛋白质，用OX40的蛋白序列进行了序列同源性搜索。利用UniProt网站(http://www.uniprot.org)用于搜索和确定人OX40和所鉴定的人类蛋白质之间的氨基酸一致性的百分比(表3-1)。
表3-1：与人OX40具有最高同源性的12个TNFRSF成员的氨基酸序列一致性。
NA＝不适用
OX40LIgG4P融合蛋白的结合特异性
在转染到哺乳动物细胞中时能够指导个体TNFRSF成员的表达的cDNA构建体从傲锐基因技术公司(Origene Technologies)获得。这些cDNA构建体由在米迪缪尼公司(MedImmune)(盖瑟斯堡，马里兰州)的蛋白质科学组扩增并纯化用于在瞬时转染中使用。对于每个TNFRSF成员的表达，使用脂质体2000与2.5μg DNA的编码TNFRSF成员之一的表达载体组合单独地转染HEK293细胞；遵循制造商对于脂质体2000建议的方案。转染后48小时，将细胞通过胰蛋白酶化和胰蛋白酶从组织培养平板中除去，该胰蛋白酶通过加入含有血清的完全培养基中和，接着是细胞沉淀和在完全培养基中洗涤。然后，将细胞悬浮在冷的FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中，并且涂板于96孔非TC处理的平板用于使用TNFRSF-特异性mAb和OX40L IgG4P融合蛋白的结合研究。
对于结合抗体，将细胞沉淀，移除FACS缓冲液，并且将细胞悬浮于FACS缓冲液中，该FACS缓冲液含有1μg/mL碘化丙啶(PI)以及由生产商推荐体积的特异于转染的TNFRSF成员的荧光染料标记的mAb或具有以1μg/ml浓度的OX40L IgG4P融合蛋白。对于结合对照，将细胞单独与荧光染料标记的同种型对照抗体一起孵育。在黑暗中4℃下将细胞与抗体孵育1小时。此后，与荧光染料标记的单克隆抗体一起孵育的细胞在冷的FACS缓冲液中洗涤2次，然后使用LSRII流式细胞仪通过流式细胞术分析事件。与OX40L IgG4P融合蛋白一起孵育的细胞在冰冷的FACS缓冲液中洗涤3次，然后在25μg/mL的647山羊抗人IgG(H+L)二级抗体中悬浮并在黑暗中4℃下孵育另外的30分钟。对于结合对照，一些细胞在OX40LIgG4P融合蛋白不存在但单独的荧光染料标记的二级抗体的存在下孵育。此后，将细胞用冷的FACS缓冲液额外洗涤两次并悬浮在冷的FACS缓冲液中用于在LSRII流式细胞仪上分析。
对于流式细胞术分析，流式细胞术标准(FCS)数据使用的流式乔(FlowJo)软件检查。为了分析mAb结合，将细胞第一次门控为活的(PI阴性)细胞，然后将MFI对事件数目作图以产生结合直方图。另外，对于每个结合确定了活的细胞的几何平均荧光强度，使得对于背景(同种型对照或单独的二级抗体)的MFI倍数可以被确定。
在这项研究中使用的材料在表3-2中列出。
表3-2：材料
在OX40上的序列同源性BLAST搜索发现12个人TNFRSF蛋白与OX40共享10％或更多的氨基酸序列一致性。蛋白质和序列一致性的比例在表3-1中列出。
为了确认OX40L IgG4P融合蛋白对人OX40结合的特异性，OX40L IgG4P融合蛋白对工程化以表达人OX40的尤尔卡特细胞系或对表达人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137或HVEM的瞬时转染的HEK293细胞的结合通过流式细胞术来评估。如由MFI确定的OX40L IgG4P融合蛋白对表达OX40的尤尔卡特细胞系的结合比单独的二级抗体的MFI大17倍(图5A-B)。使用商购的对每个人TNFRSF蛋白特异的抗体来确认人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137和HVEM的细胞表面表达；相比于对每个TNFRSF蛋白的同种型对照抗体的在MFI的倍数增加在表12-2中示出。OX40L IgG4P融合蛋白对表达人NGFR、LTβR、TNFR2、GITR、CD137和HVEM的HEK293细胞的结合不是如以上所看见的单独的二级抗体对这些相同的细胞的结合(表3-3，图5C)。
表3-3.荧光染料标记的TNFRSF特异的mAb和OX40L IgG4P融合蛋白对表达TNFRSF的HEK293细胞的结合倍数或OX40L IgG4P融合蛋白对表达OX40的尤尔卡特细胞的结合倍数。
MFI＝平均荧光强度；ND＝未确定。
结论
OX40L IgG4P融合蛋白对人OX40的结合是特异的。OX40L IgG4P融合蛋白与TNFRSF的高度相关抗原没有交叉反应。
实例4：OX40L IgG4P融合蛋白的体外生物活性：采用初级活化的人CD4+T细胞的基于平板的生物测定法
在这个实例中，在基于平板的测定法中使用初级活化的人CD4+T细胞啦确定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。将激活的初级活化的人CD4+细胞涂抹到平板捕获的次优抗CD3(OKT3)单克隆抗体用于TCR刺激和OX40L IgG4P融合蛋白的剂量滴定，用于OX40受体介导的共刺激。对CD4+T细胞增殖以及细胞因子释放进行确定以测量OX40生物活性。
为了确定OX40L IgG4P融合蛋白增加T细胞活化同时增加通过TCR(共刺激)的活化的能力，进行了基于平板的生物活性测定并评估了T细胞活化。T细胞共刺激的测量包括CD4+T细胞增殖和细胞因子释放的确定。含有不能结合OX40的OX40L ECD的OX40L IgG4P融合蛋白的突变版本(F180A OX40L融合蛋白IgG4P)被用于替代OX40L IgG4P融合蛋白来证明共刺激需要OX40接合。
在基于平板的药物捕获试验中，利用激活的初级活化的人CD4+T细胞以CD4+T细胞的增殖以及细胞因子释放作为活性读数来确定OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性(图6)。
为了测量OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性，使用以下方案：
第0天：
·以白朴(leuko pak)形式的人免疫细胞从全细胞(AllCells)中获得。随后，根据制造商的方案，使用EasySep CD4+T细胞富集试剂盒纯化CD4+T细胞。
·在完全RPMI培养基中悬浮CD4+T细胞，并调整细胞浓度为1.0x106/ml。添加含有PHA-L和重组人IL-2分别至终浓度2μg/mL和20IU/mL，并且在湿润的组织培养保温箱中在37℃和5％CO2下培养细胞2天以活化T细胞。
第1天：
·在非TC处理的圆底96孔分析平板上涂抹100μL的、在PBS中的2μg/mL的Fcγ特异性的山羊抗小鼠IgG和2μg/mL的Fcγ特异性的山羊抗人IgG。
·在4℃下孵育过夜
第2天：
·用200μL PBS洗涤平板
·在37℃下用在PBS中的1％BSA(1％BSA/PBS)阻断平板90分钟
·用PBS洗涤平板3次
·在37℃下加入在1％BSA/PBS中重构的2ng/ml的抗CD3克隆OKT3持续90分钟
·用PBS洗涤平板3次
·添加OX40L IgG4P融合蛋白或对照F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P，这两种蛋白从1μg/mL开始在1％BSA/PBS中稀释(100μL每孔；3nM)且持续进行3倍稀释系列。在37℃下孵育90分钟
·在此期间，收集激活的初级活化的人CD4+T细胞，并调整在室温(RT)完全RPMI中的浓度至1×106活细胞/毫升。
·除了用1.25μM CFSE代替推荐的5μM在37℃下孵育10分钟之外，根据制造商的指示使用CFSE标记细胞，在完全RPMI中悬浮细胞，并调整浓度至0.5×106/ml
·用PBS洗涤平板3次
·每孔添加200μL的细胞(100,000)。在台式离心机上以100xg通过离心温和地沉淀细胞。在37℃和5％CO2下在湿润的组织培养保温箱中放置3天
第3天
·第二天(24小时孵育时间)，移除40μL细胞培养上清液用于细胞因子释放测量
第5天
·72小时孵育时间后，移除40μL细胞培养上清液用于细胞因子释放测量
·在380g下沉淀CD4+T细胞，且使用含有2％FBS的4℃PBS(FACS缓冲液)洗涤一次
·在含有抗体和碘化丙啶的结合混合物中悬浮细胞，该抗体用于标记CD4+T细胞，该碘化丙啶用于辨别活的/无活力的细胞。孵育30分钟，接着在4℃FACS缓冲液中洗涤2次。重新悬浮于4℃FACS缓冲液中，并采用LSRII流式细胞仪通过流式细胞术和用于分析FCS流式细胞术数据的流式乔(FlowJo)软件来分析事件。
对于细胞因子释放的分析，使用来自MSD的10-丛Th1/Th2类细胞因子分析试剂盒，根据制造商的方案分析培养72小时后获得的细胞培养上清液的细胞因子含量。这个试剂盒采用电化学检测方法来定量测量以下细胞因子：IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、和IL-1β。在以前的实验中，72小时时间点已被证明能定性地反映在较早的时间点的细胞因子释放，因此，在这些条件下不支持或反对某些Th1/Th2细胞因子的检测。
对于细胞增殖的分析，使用流式乔(FlowJo)软件对活的(PI阴性)事件进行门控，并且显示CFSE稀释的CD4+T细胞的百分比被确定为经历增殖的细胞的百分比的测量。在增殖或细胞因子释放方面产生半最大应答(EC50)的OX40L IgG4P融合蛋白的浓度，并且对于20％和90％的最大应答(EC20和EC90)的药物浓度是利用在图版棱柱(GraphPad Prism)版本5.01中的非线性回归分析来确定。
在这项研究中使用的材料在表4-1中列出。
表4-1：材料
对于IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10，关于诱导增殖和细胞因子释放，富集的CD4+T细胞显示了对OX40L IgG4P融合蛋白的剂量依赖性应答，对于IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、和IL-1β，形成的曲线不佳。对于四个供体之一给出剂量应答的结果的实例显示于图7A-E。对于这些供体的总结数据概述于表4-2中。因为对于IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、和IL-1β细胞因子释放观察到形成不佳的剂量应答曲线，对于这些测量没有获得有效价值。
对于四个供体关于CD4+T细胞增殖的平均EC20、EC50、和EC90值为8.0±7.6、14±11、和57±5.8pM。对于细胞因子释放的平均EC20、EC50、和EC90值为如下：INFγ，45±39、65±41、和140±45pM；TNFα，22±17、48±26、和230±132pM；IL-10，32±20、53±34、和137±70pM；IL-5，43±28、59±40、和134±57pM。因此，CD4+T细胞的增殖是OX40L IgG4P融合蛋白效价以这种形式的最敏感的测量。
表4-2：在基于平板的生物活性测定中OX40L IgG4P融合蛋白的增殖和细胞因子释放活性。
实例5：OX40L IgG4P融合蛋白的体外活性：使用尤尔卡特NFkB-荧光素酶报告T细胞的基于2-细胞的生物活性测定
在这个实例中，在基于2-细胞的生物活性测定中使用表达OX40的尤尔卡特NFkB-荧光素酶报告细胞系来确定OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性。具体来说，OX40尤尔卡特NFkB荧光素酶报告细胞与表达FcγR的HEK293细胞、肿瘤细胞系、或与从原发人肿瘤中分离的CD45+细胞、连同用于OX40受体介导的NFkB信号的激活的OX40L IgG4P融合蛋白的剂量滴定一起涂抹。NFkB信号传导是OX40信号传导中公知的下游事件，并且与T细胞激活的其他测量例如增殖和细胞因子释放定性地良好相关。
为了确定OX40L IgG4P融合蛋白增加T细胞的活化的能力，进行了一组2-细胞报告生物活性测定并评估了T细胞活化。通过采用在响应NFkB信号途径的刺激中产生荧光素酶的表达OX40的尤尔卡特NFkB-荧光素酶T细胞报告系实现了T细胞活化的测量(图8)，初级活化的人T细胞活化的典型结果。可通过向细胞裂解液添加荧光素酶底物和用光度计通过反应产物测量所发出的光来测量荧光素酶的量，从而激活T细胞。使用表达FcγR的不同补体的细胞，对于可溶性OX40L IgG4P融合蛋白以及FcγR交联的OX40L IgG4P融合蛋白测量了T细胞活化。同样地，含有使得ECD不能结合OX40的在OX40L ECD中F至A氨基酸取代的OX40LIgG4P融合蛋白的突变版本(F180A OX40L FP IgG4P)被用于替代OX40L IgG4P融合蛋白来证明对于OX40接合的效果的特异性。
试验1
使用2-细胞生物活性测定对OX40L IgG4P融合蛋白进行了测试，该2-细胞生物活性测定使用表达OX40的人尤尔卡特NFkB-荧光素酶报告克隆64(OX40尤尔卡特报告)用于读出OX40激动(NFkB活性)和介导OX40L IgG4P融合蛋白交联的第二FcγR-表达细胞系，该OX40L IgG4P融合蛋白交联在表达OX40的尤尔卡特报告细胞上的簇OX40(图8)。用于药物交联的FcγR-表达细胞系包括拉吉(Raji)B细胞肿瘤系、表达CD32B的HEK293、表达CD32A的HEK293、或从原发人肿瘤或正常邻近组织分离的CD45+免疫细胞。为了确定OX40L IgG4P融合蛋白的可溶性活性，使用亲本HEK293细胞(无FcγR)代替表达FcγR的细胞系或在没有第二交联细胞系一起存在下进行生物活性测定。为了证明在报告细胞上的OX40接合要求，对于OX40结合减少的突变的OX40L融合蛋白IgG4P或突变的OX40L融合蛋白IgG1被用来替代OX40L IgG4P融合蛋白。
在使用前，在湿润的组织培养保温箱中在37℃和5％CO2下以0.5-1.5e6/ml的密度在完全RPMI中培养OX40尤尔卡特报告细胞，在生物试验之前的那天对细胞进行传代至1e6/ml的浓度。
OX40L IgG4P融合蛋白的生物试验使用下面的方案建立：
第0天
·在50mL离心管中收集OX40尤尔卡特报告细胞和FcγR-表达细胞系、或HEK亲本细胞，并以380g(1200rpm)沉淀细胞。对于从初级活化的人肿瘤和正常邻近的组织中分离的CD45+细胞，将组织解离，且将CD45+细胞分离并重悬浮在完全RPMI培养基中用于在生物活性测定中使用，如下所述。
·将每种类型的细胞重新悬浮在完全RPMI中并在稀释抗体时挑出。
·进行OX40L IgG4P融合蛋白的连续稀释，在μg/mL范围开始并在完全RPMI培养基中稀释3倍至亚-ng/mL的浓度。在完全RPMI培养基中稀释F180A OX40L融合蛋白作为对照。
·将OX40报告细胞加上FcγR表达的细胞系或HEK亲本细胞(各以每孔100,000个细胞)置于96孔平板中。
·将OX40L IgG4P融合蛋白添加到在完全RPMI培养基中的细胞至终浓度，该终浓度从1μg/mL开始稀释下降3倍，如上所述。F180A OX40L融合蛋白稀释至1μg/mL的终浓度作为对照。
第1天
·第二天(16-24小时孵育时间)，加入100μL的室温重构的来自普洛麦格公司(Promega)的稳定辉光(SteadyGlo)荧光素酶测定溶液至每孔并混匀孔以裂解细胞。
·在室温下孵育5分钟以平衡荧光素酶信号，并利用反向移液技术(避免产生气泡)从每个孔转移150μL稳定辉光/样品裂解物到96孔白壁测定板用于检测和使用珀金埃尔默预想(Perkin Elmer Envision)发光读数器来读出发光信号。
·通过将对OX40L IgG4P融合蛋白的浓度(x轴以摩尔浓度的log10计)
对发光的RLU(y轴)作图来分析数据。通过使用图板棱柱(GraphPad Prism)版本5.01软件经由非线性回归分析来确定EC20、EC50、和EC90值。
以下方案被用于分离来自人肿瘤和正常邻近组织的原生人CD45+细胞：
·从传输介质中除去肿瘤或正常邻近组织样本并放置于无菌培养皿中。添加汉克氏缓冲盐溶液并解剖可见坏死组织或来自肿瘤样本的任何正常组织。
·使用镊子和剪刀，将组织切成小块(约1mm)并放置于50ml的锥形管中，并添加10-20mL胶原酶III酶混合物(250IU/ml胶原酶III、3mM CaCl2、315μg/mL DNA酶I)。混匀，并在30℃保温箱中孵育约半小时。
·通过70微米的过滤器过滤被消化的样品。依靠后端有1mL注射器活塞的过滤器轻压材料，并频繁地用冷的MACS缓冲经常清洗过滤网以帮助洗涤细胞穿过。
·在4℃下以900rpm(190g RCF)沉淀解离的细胞15分钟。
·使用Vi细胞计数器确定细胞数量和活力。
·对于每1000万个细胞，悬浮于80μL MACS缓冲液(PBS pH 7.2加上0.5％BSA和2mMEDTA)中，并添加20μL的CD45微珠。
·在4℃下，于冰上孵育15分钟。
·洗涤细胞，每1000万个细胞用2mL冷的MACS缓冲液洗涤。
·再悬浮于500μL冷的MACS缓冲液中
·对于每个选择肿瘤和正常组织样品用3mL冷的MACS缓冲液预湿一个LS柱
·将500μL结合微珠的细胞悬浮液应用于柱子，并加入3X 3mL的冷的MACS缓冲液(总共9mL)以洗涤未结合的细胞穿过柱子。
·通过从磁铁移除柱子和加入5mL的MACS缓冲液来洗脱微珠结合的CD45+细胞。使用活塞轻轻推送MACS缓冲液与细胞一起穿过柱子。将CD45+细胞沉淀并重新悬浮于完全RPMI培养基中，并在如上所述的生物活性测定中使用。
在这项研究中使用的材料在表5-1中列出
表5-1：材料
2-细胞生物活性测定结果
在第二细胞类型不存在下或在缺乏外源表达的FcγR的HEK293细胞的存在下，使用表达OX40的尤尔卡特NFkB-荧光素酶报告细胞加上OX40L IgG4P融合蛋白作为可溶性蛋白来测试OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性。在这些条件下，OX40L IgG4P融合蛋白表现出少许报告活性。然而，在表达FcR的细胞系如表达CD32A的HEK293的存在下，OX40L IgG4P融合蛋白展示出有效的T细胞刺激活性，如通过NFkB途径刺激测得的(图9)。
如在表达CD32A的HEK存在下，在使用拉吉(Raji)B细胞、表达CD32B的HEK293细胞、表达CD32A的HEK293、或从原发人肿瘤分离的用于药物交联的CD45+细胞的2-细胞试验中，OX40L IgG4P融合蛋白展示了有效的生物活性(图10)。
对于2-细胞生物试验的效价值(EC20、EC50、和EC90)总结于表5-2。对于试验的平均值±标准偏差EC20、EC50、EC90值分别为35±29pM、59±47pM、和141±114pM。
表5-2：OX40L IgG4P融合蛋白的2-细胞生物活性。如所指示的，试验使用了拉吉(Raji)细胞、表达CD32B的HEK293细胞、表达CD32A的HEK293细胞、或从具有表达OX40的尤尔卡特NFkB萤光素酶克隆64报告细胞的原发人肿瘤中分离的CD45+细胞。
如通过在表达OX40的尤尔卡特NFkB-萤光素酶报告系中的NFkB途径的激活所测量的，OX40L IgG4P融合蛋白介导人T细胞的活化。在表达能够经由OX40L IgG4P融合蛋白的Fc结构域交联药物的FcR的细胞不存在下，这个生物活性很低。在2-细胞系统中使用表达FcR的细胞(拉吉(Raji)细胞、表达CD32A或CD32B的HEK293)(用于药物交联)和尤尔卡特NFkB-萤光素酶报告系(用于T细胞活化的读出)，MEDI介导有效的T细胞活化，平均EC50值为60±52pM。
实例6：使用OX40L IgG4P融合蛋白以及食蟹猴和恒河猴T细胞的体外可比性研究
食蟹猴(cyno)和恒河猴已被用于对于OX40L IgG4P融合蛋白和共享相同OX40序列的物种的安全性和药物代谢动力学/药效学(PK/PD)建模。在这个实例中，在基于2-细胞的生物活性测定中使用表达食蟹猴/恒河猴OX40的尤尔卡特NFκB-荧光素酶报告细胞系来确定OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性。食蟹猴/恒河猴OX40尤尔卡特NFκB-荧光素酶报告细胞与Fcγ受体表达的恒河猴B细胞系或分离的含有抗原呈递细胞的恒河猴细胞一起涂板，然后用OX40L IgG4P融合蛋白剂量滴定处理用于OX40受体介导的NFκB信号传导的激活。NFκB信号传导是在OX40信号传导中的公知的下游事件，并且可以与T细胞活化的其他措施如增殖和细胞因子释放相关。
另外，在基于平板的增殖试验中使用初级活化的恒河猴CD4+T细胞确定OX40LIgG4P融合蛋白的生物活性。将初级活化的恒河猴CD4+T细胞涂板到平板捕获的次优抗CD3单克隆抗体用于TCR刺激连同OX40L IgG4P融合蛋白的剂量滴定用于OX40受体介导的共刺激。对CD4+T细胞增殖进行测量以确定OX40生物活性。
食蟹猴/恒河猴2-细胞生物活性试验
使用具有Fcγ受体表达的细胞的2-细胞试验来测试OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性，该Fcγ受体表达的细胞被用于介导OX40L IgG4P融合蛋白交联，因此，介导在尤尔卡特报告细胞上聚集的OX40。因为食蟹猴和恒河猴共享相同的OX40序列，第一细胞类型是用于读出OX40激动(NFκB活性)的食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB-萤光素酶报告细胞系(克隆B2)。第二细胞类型是Fcγ受体表达细胞系、恒河猴B细胞系LCL8664、或来自正常恒河猴的全血的Fcγ受体表达的免疫细胞。为了确定可溶性OX40L IgG4P融合蛋白的活性，在第二交联的细胞系(“仅靶标”)不存在下进行对照试验。不加OX40L IgG4P融合蛋白(“靶标+效应物”)下对背景生物活性进行了评估。为了证明在报告细胞上要求OX40接合，具有降低的OX40结合的突变的F180A OX40L融合蛋白IgG4P被用来替代OX40L IgG4P融合蛋白。按照以下方案进行了使用LCL8664的OX40L IgG4P融合蛋白2-细胞生物活性试验：
试验前一天：
1.将完全培养基(具有10％FBS的RPMI)加入食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB-荧光素酶报告克隆B2和恒河猴B细胞系以分别实现大约500,000和400,000个细胞/毫升的细胞浓度以促进在试验中好的细胞活力。
第0天：
1.食蟹猴/恒河猴的表达OX40的尤尔卡特NFκB-荧光素酶报告克隆B2和恒河猴B细胞系LCL8664被收集在单独的50mL锥形离心管中，在330×g下沉淀并弃去上清液。然后，将细胞悬浮于10mL完全培养基中，使用Vi细胞计数器计数细胞悬浮液，且如先前描述将两种细胞系的细胞浓度在完全培养基中调节至2.5×106。
2.在深孔聚丙烯板中在完全培养基中将10μg/mL OX40L IgG4P融合蛋白连续稀释3倍增量用于11点数据曲线。将10μg/mL F180A突变的OX40L融合蛋白和IgG4P抗体(阴性同种型对照)类似地稀释6倍增量用于5点数据曲线。
3.食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB-荧光素酶报告克隆B2和恒河猴B细胞系LCL8664以等体积混合至每种细胞1.25×106/mL的终浓度，然后将80mL的混合细胞悬浮液分配到96孔底部无组织培养物处理的平板的每个孔。
4.然后将20μL的OX40L IgG4P融合蛋白或F180A突变的OX40L融合蛋白IgG4P加入到各孔，并将平板转移到具有湿润的5％CO2气体的37℃培养箱。
第1天：
1.孵育16小时后，使平板适应室温30分钟；然后将100μL的重构的室温才稳定辉光(SteadyGlo)萤光素酶测定溶液(普洛麦格公司(Promega))加入每个孔以裂解细胞。
2.平板在旋转振荡器上于室温下孵育5分钟以平衡荧光素酶信号。从每个孔转移150μL稳定辉光/样品裂解物到96孔白壁测定板并使用珀金埃尔默预想(Perkin ElmerEnvision)发光读数器来读出发光信号。
以下方案用于从来自健康印度起源的恒河猴供体(全球灵长类(World WidePrimates)，迈阿密，佛罗里达州)获得的肝素钠抗凝全血中分离表达Fcγ受体的免疫细胞：
1.将5mL的新鲜全血加入50mL锥形管中，并添加45mL的氯化铵溶液。将细胞混合物在冰上孵育10分钟。
2.将细胞混合物在300×g离心10分钟；然后弃去上清液。
3.如前所述细胞沉淀用40mL完全细胞培养基洗涤两次，然后细胞准备在2-细胞生物活性试验中使用。
如先前所述使用LCL8664恒河猴B细胞系进行使用恒河猴全溶解的血液的2-细胞生物活性试验，除了NIP228IgG4P在仅10μg/mL浓度下被用作阴性对照抗体。
恒河猴CD4+T细胞增殖试验
在基于平板的药物捕获试验中，利用激活的初级活化的恒河猴CD4+T细胞来确定OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性，并且测量了CD4+T细胞的增殖。根据以下方案，使用恒河猴CD4+T细胞来评估OX40L IgG4P融合蛋白的生物活性，该恒河猴CD4+T细胞是从来自全球灵长类(World Wide Primates)(迈阿密，佛罗里达州)的健康恒河猴供体(N＝2)获得的肝素钠抗凝全血中分离的：
第1天：
1.在室温下，将淋巴细胞分离介质(LSM)通过将5ml的PBS加入95mL的LSM稀释至95％。
2.在室温下使用PBS将新鲜的肝素化恒河猴血以1:1稀释，并且然后20mL稀释的全血在50mL锥形离心管中在15mL的95％LSM上铺一薄层。
3.在没有制动的台式离心机中，在室温下将血液于400×g下离心30分钟。
4.外周血单核细胞(PBMC)在界面收集并用冷的美天旎MACS缓冲液洗涤两次，在1200转进行10分钟。
5.弃去上清液，且细胞沉淀用5mL的室温1X RBC裂解缓冲液处理，并在室温下孵育5分钟。将45mL完全培养基(具有10％FBS和1％抗生素/抗真菌剂的高级RPMI)加入沉淀以在孵育时间结束时停止裂解过程。
6.然后，将PBMC细胞在330×g下离心10分钟沉淀，并用20mL冷的美天旎MACS缓冲液洗涤两次。
7.弃去上清液，且将细胞沉淀物悬浮在冷的MACS缓冲液中，并用Vi细胞细胞计数器计数以确定细胞数量和活力。
8.根据制造商的说明，用美天旎非人灵长类试剂盒进行恒河猴CD4+T细胞分离，然后如先前所述CD4+T细胞在Vi细胞计数器上计数并以1x106/mL悬浮于完全细胞培养培养基中。
9.恒河猴CD4+T细胞(1×106/ml在完全RPMI培养基中)在湿润的组织培养保温箱中在37℃和5％CO5下在具有5μg/mL伴刀豆球蛋白A和1000IU/mL Il-2的细胞培养烧瓶中培养48小时以激活T细胞和诱导OX40表达。
第2天：
1.在非组织培养处理的圆底96孔分析平板上涂覆100μL的、在PBS中的2μg/mL的山羊抗小鼠IgG(Fcγ特异的)和2μg/mL的山羊抗人IgG(Fcγ特异的)，然后在4℃下孵育过夜。
第3天：
1.抗体覆盖的平板用200μL PBS洗涤一次，然后在37℃下平板用PBS中的1％BSA(1％BSA/PBS)阻断90分钟。
2.平板用200μL PBS洗涤两次；然后将在1％BSA/PBS中100μL的2ng/mL抗CD3克隆SP34-2添加到每孔，并在37℃下孵育90分钟。
3.平板用200μL PBS洗涤两次；然后用100μL的0.5μg/mL(试验1)或1μg/mL(试验2)OX40L IgG4P融合蛋白在1％BSA/PBS中连续稀释3倍用于10点数据曲线或将对照NIP228IgG4P同种型以1μg/mL添加到每个孔。在37℃下将平板孵育90分钟。
4.如先前所述，在室温完全培养基中将活化的恒河猴CD4+T细胞调节至1×106活细胞/毫升。
5.除了用1.25μM羧基二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(CFSE)代替推荐的5μM和在37℃下孵育10分钟之外，根据制造商的指示对恒河猴CD4+T细胞用CFSE进行标记。细胞标记后，如先前所述将细胞悬浮于完全RPMI中，并将浓度调整至1.5×106/ml。
6.将100μL活化的恒河猴CD4+T细胞(150,000)添加到每个孔中，并且将平板放置于在37℃和5％CO2的湿润的组织培养保温箱中三天。
第5天：
1.在380xg下离心来沉淀CD4+T细胞，使用200μL的含有2％FBS的4℃PBS(FACS缓冲液)洗涤一次。
2.在含有2.5μL CD4-V450抗体和碘化丙啶的4℃结合混合物中悬浮细胞，该抗体用于标记恒河猴CD4+T细胞，该碘化丙啶用于辨别活的/非活的细胞。
3.细胞平板在4℃下孵育30分钟，然后每孔用200μL的4℃FACS缓冲液洗涤两次。将细胞悬浮于每孔100μL的4℃FACS缓冲液中，并采用LSRII流式细胞仪通过流式细胞术和用于分析FCS流式细胞术数据的流式乔(FlowJo)软件来分析细胞。
如表6-3所示，使用初级活化的恒河猴CD4+T细胞在两个独立的试验中重复该试验。
对于细胞增殖的分析，使用流式乔(FlowJo)软件对活的(PI阴性)事件进行门控，并且显示CFSE稀释的CD4+门控细胞的百分比被确定为经历增殖的细胞的百分比的测量。
在图板棱柱(GraphPad Prism)版本5.01(圣地亚哥，加利福尼亚州)中使用非线性回归分析(剂量应答对数、4参数拟合曲线)产生在生物活性和增殖方面的半最大(EC50)应答的OX40L IgG4P融合蛋白的浓度。标准偏差作为个体实验和供体之间偏差的度量被确定。
在这项研究中使用的材料在表6-1中列出。
表6-1：材料
结果
食蟹猴/恒河猴2-细胞生物活性试验的结果
对于食蟹猴/恒河猴2-细胞生物活性试验的结果显示于表6-2和6-3以及图11和12中。在恒河猴B细胞系LCL8664存在下OX40L IgG4P融合蛋白显示出在尤尔卡特T细胞中激活OX40信号传导途径的能力，平均EC50为49.9±4.60pM(N＝2个试验)。如在表6-5中所示，相比在人类2-细胞试验中，在食蟹猴/恒河猴2-细胞试验中使用拉吉(Raji)B细胞系对于OX40LIgG4P融合蛋白活性的EC50值为高于3.6倍。另外，在表达Fcγ受体的总体恒河猴免疫细胞存在下OX40L IgG4P融合蛋白在尤尔卡特细胞中激活了OX40信号传导途径，平均EC50为50.8(95％CI 45.7，56.4)pM(N＝1个试验)。
表6-2：在食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB-荧光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B细胞生物活性试验中的OX40L IgG4P融合蛋白的平均EC50值
SD＝标准偏差
表6-3：在食蟹猴/恒河猴表达OX40的尤尔卡特NFκB荧光素酶克隆B2和表达Fcγ受体的恒河猴免疫细胞生物活性试验中OX40L IgG4P融合蛋白的EC50值
结合蛋白 实验的数目 EC50(95％CI)
OX40LIgG4P融合蛋白 1 50.8(45.7，56.4)
NIP228IgG4P同种型 1 无活性
CI＝置信区间
恒河猴初级活化的T细胞增殖试验的结果
对于恒河猴初级活化的T细胞增殖试验(N＝2)的结果示于表6-4和图13中。OX40LIgG4P融合蛋白诱导初级活化的恒河猴CD4+T细胞的增殖，平均EC50为134±144pM(N＝2个试验)。如在表6-6中所示，相比在人类CD4+T细胞增殖试验中，在恒河猴CD4+T细胞增殖试验中对于OX40L IgG4P融合蛋白活性的EC50值为高于9.6倍。
表6-4：在初级活化的恒河猴CD4+T细胞增殖试验中对于OX40L IgG4P融合蛋白的平均EC50
结合蛋白 实验的数目 平均EC50±SD(pM)
OX40LIgG4P融合蛋白 2 134±144
NIP228IgG4P同种型 2 无活性
SD＝标准偏差
表6-5：相比表达OX40的人尤尔卡特NFκB-荧光素酶克隆64和拉吉(Raji)人B细胞生物活性试验，在表达OX40的食蟹猴/恒河猴尤尔卡特NFκB-荧光素酶克隆B2和LCL8664恒河猴B细胞生物活性试验中对于OX40L IgG4P融合蛋白的平均EC50值
SD＝标准偏差
表6-6：相比人CD4+T细胞增殖试验，在恒河猴中对于OX40L IgG4P融合蛋白的平均EC50值
SD＝标准偏差
在恒河猴B细胞或来自全裂解血液的表达Fcγ受体的恒河猴免疫细胞的存在下，在食蟹猴/恒河猴表达OX40的T细胞中，OX40L IgG4P融合蛋白激活了OX40信号传导途径。另外，OX40L IgG4P融合蛋白诱导了初级活化的恒河猴CD4+T细胞的增殖。
实例7：确定OX40L IgG4P融合蛋白引发效应功能的能力
这个实例评估OX40L IgG4P融合蛋白结合C1q并引发针对表达高水平的OX40的初级活化的人CD4+T细胞的自然杀伤(NK)细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。具有人IgG1Fc结构域的OX40L IgG4P融合蛋白的版本(OX40L FP IgG1)被产生以评估已知的且能引发ADCC或结合C1q的Fc域的贡献。在OX40L受体结合域中具有点突变(F180A)的OX40LIgG4P融合蛋白和OX40L FP IgG1的版本对于OX40具有降低的结合能力，并被产生以评估OX40结合域引发对表达OX40细胞的ADCC的贡献。抗CD20抗体利妥昔单抗结合至表达CD20的B细胞，并被用作用于ADCC实验的阳性对照。因为初级活化的人CD4+T细胞不表达CD20，使用不表达CD20的托莱多(Toledo)B细胞系进行了单独的试验以确认该ADCC试验系统是有效的。人IgG1对照抗体被用作用于C1q结合试验的阳性对照。
抗体依赖性细胞毒性
相对于OX40L融合蛋白IgG1和利妥昔单抗的ADCC活性，使用富集的初级活化的人NK细胞作为效应物和表达OX40的初级活化的人CD4+T细胞作为靶标测试了OX40L IgG4P融合蛋白的ADCC活性。对于初级活化的人CD4+T细胞的分离，肝素抗凝全血通过米迪缪尼供血者程序(MedImmune Blood Donor Program)从健康的供体中获得并根据以下方案进行处理：
1.将1mL干细胞技术RosetteSep CD4+T细胞分离试剂盒抗体混合物添加至每20mL的全血，混合，并在室温(RT)下孵育20分钟(min)。
2.将血液用无菌的室温FACS缓冲液(PBS中的2％热灭活的新生小牛血清，pH 7.2)以1:1稀释，并且在DM-L介质上铺一薄层，接着在台式离心机中以380g(1200rpm)离心，持续20分钟停止。
3.离心后，用10mL移液管将含有人CD4+T细胞的血沉棕黄层移除，并且将细胞用RTFACS缓冲液洗涤一次并用RT完全RPMI培养基洗涤一次。
4.细胞在Vi细胞计数器上计数以确定细胞数量和活力，并且CD4+T细胞以1.0×106/ml的浓度悬浮于完全RPMI培养基中。
在2μg/mL PHA-L和20IU/mL rhIL-2存在下，初级活化的人CD4+T细胞(1.0×106/ml在完全RPMI培养基中)在湿润的组织培养保温箱中在37℃和5％CO2下培养48小时以激活T细胞并上调OX40，并且随后用于OX40L IgG4P融合蛋白ADCC试验中。在下面的表格和图表中的所有供体代表单独的个体；即，CD4+T细胞不从相同的供体中分离用于重复ADCC实验。
初级活化的人CD4+T细胞活化后，效应NK细胞从来自米迪缪尼供血者程序的肝素钠抗凝血液中分离，使用与如上的针对CD4+T细胞相同的方案，除了使用了1mL的RosetteSep Nk细胞分离试剂盒抗体混合物代替1mL的RosetteSep CD4+T细胞分离试剂盒抗体混合物之外。分离的初级活化的人NK细胞用温的完全RPMI培养基(RPMI-1640加10％FBS)洗涤两次，然后以2.67×106/mL的浓度悬浮于完全RPMI中。同样地，激活的初级活化的人CD4+T细胞也在温的完全RPMI中洗涤两次，并以2.67×105/mL的浓度悬浮。此后，将75μL初级活化的人NK细胞(200,000)和75μL激活的初级活化的人CD4+T细胞(20,000)加入到无菌的无TC处理的圆底96孔板的孔中，效应物:靶标比例为10:1。向平板中的细胞里加入50μL的含有OX40L IgG4P融合蛋白或OX40L融合蛋白IgG1的稀释系列的完全RPMI。10μg/mL利妥昔单抗对照抗体在孔中作为阳性对照，该孔含有表达CD20的拉吉(Raji)B细胞代替激活的初级活化人CD4+T细胞。在ADCC试验中的细胞通过离心(在室温下以100g持续2分钟)轻轻地沉淀，且随后在在湿润的组织培养保温箱中在37℃和5％CO2下培养24小时。
在孵育期结束时，细胞通过在380g离心沉淀，然后悬浮于含有10μg/mL碘化丙啶的100μL FACS缓冲液中，该碘化丙啶用于在BD LSRII流式细胞仪上通过流式细胞术分析来辨别非活的细胞。为了补偿，将含有结合到10μg/mL抗体(Ab)(无PI)的表达OX40的细胞、仅结合于二级647标记的抗体试剂的细胞、或用0.1％皂苷透化并用10μg/mL PI处理的细胞的孔制备用于单染色补偿对照。为了背景减除，如上所述，还制备了不存在初级活化的抗体而含有二级抗体的细胞。
OX40L IgG4P融合蛋白结合至C1q
ProteOn XPR36仪器被用来确定从人血清池纯化的人补体蛋白C1q对OX40L IgG4P融合蛋白的结合参数。标准胺偶联被用于使OX40L IgG4P融合蛋白固定在GLC生物传感器芯片的表面上。将在从26nM至1.6nM范围内的5个浓度的人C1q悬浮在PBS/0.005％吐温20，pH7.4中。将样品以30μL/min注射200秒，并且接下来是解离相持续600秒。使用ProteOnManager2.1软件(伯乐公司(Bio-Rad))使用1:1拟合来对传感图数据进行处理。
在这项研究中使用的材料在表7-1中列出。
表7-1：材料
治疗性抗体基于它们引发效应器功能的潜能总体上可分为三类(蒋(Jiang)等人，2011)。I类和II类抗体与细胞结合的抗原结合，且III类抗体结合和中和可溶性抗原。通常，I类抗体的作用机制涉及Fc效应功能，例如CDC和ADCC。与此相反，Fc效应功能预计不是II类和III类抗体的作用机制的一部分。OX40L IgG4P融合蛋白是特异性结合OX40(细胞表面相关蛋白)的人OX40配体IgG4P融合蛋白。包含IgG4P的分子展示与Fcγ受体相对较低的亲和力相互作用且缺乏效应子功能(蒋(Jiang)等，2011)。因此，OX40L IgG4P融合蛋白被分类为II类抗体，并且预期不会引发可测量的效应子功能。作为这项研究的一部分，在ADCC试验和补体C1q结合试验中确认了OX40L IgG4P融合蛋白的效应子功能的缺乏。
使用富集的初级活化的人NK细胞作为效应细胞和表达高水平OX40的活化的人类CD4+细胞作为靶标细胞来评估OX40L IgG4P融合蛋白介导的ADCC的潜能。对OX40L IgG4P融合蛋白和OX40L融合蛋白IgG1的ADCC活性进行了评估；抗CD20抗体(利妥昔单抗)被用作阳性对照抗体。OX40L融合蛋白IgG1展示出浓度依赖性ADCC活性(图14A和C；图15)。与此相反，且如基于IgG4P Fc结构域所预期的那样，OX40L IgG4P融合蛋白没有任何可检测的ADCC(图14A和C；图15)。另外，每个OX40L融合蛋白IgG1和IgG4P的F180A突变的版本没有任何可检测的ADCC活性(图14A和C；图15)，确认了ADCC活性依赖于融合蛋白接合在靶标细胞上的OX40。针对人CD20的阳性对照抗体也展示出ADCC(图14B和D)；这支持了试验的有效性。总的来说，这些实验的结果证实OX40L IgG4P融合蛋白不会引发针对表达高水平OX40的靶标细胞的ADCC。
使用表面等离子体共振试验评价了OX40L IgG4P融合蛋白结合到人补体成分C1q的潜能。在这个试验中，结合C1q被用作为补体依赖性细胞毒性测定的替代品(达尔阿夸·W.F.(Dall'Acqua，W.F.)，K.E.库克(K.E.Cook)，M.M.·达姆施罗德(M.M.Damschroder)，R.M·伍兹(R.M.Woods)和H·吴(H Wu)2006.免疫学杂志(J.Immunol.)177:1129-1138)。
人IgG1抗体被用作阳性对照抗体。如预期的，对照人类IgG1展示出浓度依赖性的结合至纯化的人C1q蛋白的能力(图16)。OX40L IgG4P融合蛋白没有任何可检测的与C1q蛋白质的结合(图16)。
结论
OX40L IgG4P融合蛋白不结合C1q或针对表达高水平OX40的活化的CD4+T细胞引发ADCC。
实例8：在人类癌症的小鼠模型中OX40L IgG4P融合蛋白的活性
这个实例测试OX40L IgG4P融合蛋白是否可有效地作为用于癌症治疗的单一试剂治疗以及T细胞是否有助于OX40L IgG4P融合蛋白的体内抗癌活性。这项研究是在免疫功能低下的NOD/SCID(非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷，表8-1)小鼠中的人类癌症的异种移植模型中进行的。
测试动物
表8-1：测试动物
安置
按照米迪缪尼公司的实验动物资源设施的机构动物护理和使用委员会(实验动物护理的动物认证和美国农业部特许机构)批准的协议，这些动物被人道待遇和安置。将动物保持在无菌微型隔离单元中，提供有无菌草垫和食物、以及自由采食的酸化饮用水。环境条件是标准化的(室温：20℃±1℃；相对湿度：50％±10％；12小时明暗循环)。动物每天监测不良的临床症状和每周检测体重。对于有和没有T细胞的存在的测试OX40L IgG4P融合蛋白的活性的实验，没有每周收集体重。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、
20％体重损失、或肿瘤体积大于2000mm3，立即通过用CO2窒息人道地将动物处死。
异种移植物的建立
用于研究中的人细胞系
表8-2：细胞系的说明：A375
细胞系 A375
组织起源 人黑色素瘤细胞系
来源 ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州
生长培养基 DMEM，10％FCS
生长条件 37℃，5％CO2，湿润的培养箱
DMEM＝杜尔贝科(Dulbecco’s)改良的伊格尔(Eagle)培养基；FCS＝小牛胎血清
移植细胞的制备
人癌性A375细胞从细胞培养物收获，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次并重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。随后，A375细胞在移植到动物中之前与A375肿瘤细胞系同种异体反应性的CD4+和CD8+T细胞系混合。
为了产生CD4+和CD8+T细胞系，来自健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)通过向每20mL全血加入1mL RosetteSep T细胞富集产品来富集CD4+或CD8+T细胞。接下来是20分钟孵育和随后使用RosetteSep DM-L致密培养基通过密度梯度离心来分离。离心后，将细胞用补充有2％胎牛血清(FBS)的PBS洗涤3次，并再悬浮于补充有10％FBS的RPMI1640培养基中。将富集的CD4+和CD8+T细胞在补充有重组人白介素-2(rhIL-2)的培养基中单独培养7至10天，且各自与丝裂霉素C处理的A375细胞相组合。将T细胞收集并也在补充有rhIL-2的培养基中单独培养7至10天，且与丝裂霉素C处理的A375细胞相组合。将CD4+和CD8+T细胞收集并以2:1的比例组合。
用来富集CD4+和CD8+T细胞的A375细胞和PBMC在移植前即刻以6A375细胞比1T细胞的比例混合。
异种移植物的移植
通过皮下(SC)注射3.5×106个细胞(A375细胞与人T细胞以1:6的效应物:靶标[E:T]，并悬浮于200μL PBS中)进入动物的右侧翼来建立异种移植物。
随机化、组名称和剂量水平
在SC注射细胞前，六只动物被随机分配给每个实验组。目前还没有动物替换。对于每个实验的组名称和剂量水平在表8-3和表8-4中列出。测试和对照样品以200μL的总体积经腹膜内(IP)给予。测试和对照样品的第一剂量在癌性/效应T细胞移植后第3天或第4天被给予。在某些天收到多达3个额外剂量的测试和对照样品的动物在图例图17和18中列出。在每只动物中观察肿瘤的形成，每周1或2次。在这项研究中的主要活化终点是2000mm3的肿瘤体积或总的肿瘤坏死中的任一个。
肿瘤测量
肿瘤通过卡尺测量且肿瘤体积(V)使用下面的公式计算：肿瘤体积＝[长(mm)×宽(mm)2]/2
对于每个组，结果以算术平均值报告。
抗癌作用被表示为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，其计算如下：％TGI＝(1-[治疗组的平均肿瘤V]÷[对照组的平均肿瘤V])×100。
统计方法
对OX40L IgG4P融合蛋白处理的和同种型对照处理的动物之间进行了比较，并且通过曼-惠特尼秩和检验针对统计显著性分析了组间差异。
从曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验获得的显著的p值呈现于邻近的算术平均值和该平均值的标准偏差的总结表和图表中。
在这项研究中使用的材料和它们的来源在表8-5中列出。
表8-5材料
在这项研究中，研究了OX40L IgG4P融合蛋白对在人类癌症的小鼠模型中肿瘤的生长的活性。免疫缺陷的NOD/SCID雌性动物用混合有同种异体反应性人CD4+和CD8+T细胞系的人类癌性细胞系来移植。CD4+和CD8+T细胞起源于从健康人供体中分离的PBMC。动物在异种移植物移植后3或4天接受测试和对照样品的首次剂量，并如所指示的被给予测试和对照样品的额外剂量。
如与同种型对照组相比，OX40L IgG4P融合蛋白显著地抑制A375细胞生长多达74％(表8-3、表8-4、图17和图18)。OX40L IgG4P融合蛋白的抗肿瘤活性依赖于同种异体反应性人类T细胞的添加(表8-4和图18)。OX40L IgG4P融合蛋白在人T细胞的存在下抑制A375细胞的生长，而在T细胞不存在时不抑制。
表8-3：治疗组与在第28天在A375异种移植模型中的TGI百分比
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹腔内；V＝体积
a每组动物的数目：6。
b所有动物在第4、7、9和12天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(治疗组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
表8-4：治疗组与在第30天在A375异种移植模型中的TGI百分比
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹腔内；V＝体积
a每组动物的数目：6。
b所有动物在第3、6、8、10天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(治疗组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
OX40L IgG4P融合蛋白证明在人类癌症的小鼠模型中具有有效的抗癌活性。这些结果提供证据表明：1)OX40L IgG4P融合蛋白可有效地作为单一试剂治疗用于癌症患者的治疗，2)T细胞从而有助于OX40L IgG4P融合蛋白在体内的抗癌活性。
实例9：鼠类OX40配体融合蛋白抑制同源模型中的小鼠癌细胞系的生长
OX40L IgG4P融合蛋白不与小鼠(m)OX40发生交叉反应(参见实例2)；因此，不可能在免疫活性小鼠模型中测试其活性。为了更充分地研究OX40激动的作用，产生了小鼠OX40配体小鼠IgG1融合蛋白(mOX40L Fp)，该mOX40L Fp特异性结合小鼠OX40受体并引发通过小鼠OX40受体进行的信号传导。DNA和氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
mOX40L FP被选定为对于OX40L IgG4P融合蛋白的替代的小鼠OX40L FP。进行这项非GLP研究以评估在4个癌症小鼠模型中mOX40L FP的单一药剂活性。
SEQ ID NO：9：小鼠构建体mIgG1mTF2mOX40L的DNA序列(5’至3’开放阅读框)
GTGCCTAGAGATTGCGGCTGCAAGCCCTGCATCTGCACCGTGCCCGAGGTGTCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTGACCATCACCCTGACCCCCAAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACATCAGCAAGGACGACCCCGAGGTGCAGTTCAGTTGGTTCGTGGACGACGTGGAAGTGCACACCGCCCAGACCCAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCAGAAGCGTGTCCGAGCTGCCCATCATGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATTCAAGTGCAGAGTGAACAGCGCCGCCTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCAGACCCAAGGCCCCCCAGGTGTACACCATCCCCCCACCCAAAGAACAGATGGCCAAGGACAAGGTGTCCCTGACCTGCATGATCACCGATTTCTTCCCAGAGGACATCACCGTGGAATGGCAGTGGAACGGCCAGCCCGCCGAGAACTACAAGAACACCCAGCCCATCATGGACACCGACGGCAGCTACTTCGTGTACAGCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAACACCTTCACCTGTAGCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAACCACCACACCGAGAAGTCCCTGAGCCACAGCCCCGGCAAGCGGCTGGACCAGGACAAGATCGAGGCCCTGAGCAACAAGGTGCAGCAGCTGGAACGGTCTATCGGCCTGAAGGACCTGGCTATGGCCGACCTGGAACAGAAAGTGTCTGAGCTGGAAGTGTCCACCAGCAGCCCCGCCAAGGACCCTCCCATCCAGAGACTGAGAGGCGCCGTGACCAGATGCGAGGACGGCCAGCTGTTCATCAGCAGCTACAAGAACGAGTACCAGACCATGGAAGTGCAGAACAACAGCGTGGTCATCAAGTGCGACGGCCTGTACATCATCTACCTCAAGGGCAGCTTCTTCCAGGAAGTGAAGATCGACCTGCACTTCAGAGAGGACCACAACCCCATCAGCATCCCCATGCTGAACGACGGCAGACGGATCGTGTTCACCGTGGTGGCTAGCCTGGCCTTCAAGGACAAAGTGTATCTGACCGTGAACGCCCCCGACACCCTGTGCGAGCATCTGCAGATCAACGACGGCGAGCTGATCGTGGTGCAGCTGACCCCCGGCTACTGTGCCCCTGAGGGCAGCTACCACAGCACCGTGAACCAGGTGCCCCTG
SEQ ID NO：10：小鼠构建体mIgG1FcmTF2mOX40L的氨基酸序列(N至C末端)
小鼠IgG1Fc结构域小鼠TRAF2结构域(粗体)
试验动物描述于表9-1和9-2中。
表9-1：试验动物：BALB/c小鼠
表9-2：试验动物：C57BL/6小鼠
壳体
按照米迪缪尼公司的实验动物资源设施的机构动物护理和使用委员会(实验动物护理的动物认证和美国农业部特许机构)批准的协议，这些动物被人道待遇和安置。将动物保持在无菌微型隔离单元中，提供有无菌草垫和食物、以及自由采食的酸化饮用水。环境条件是标准化的(室温：20℃±1℃；相对湿度：50％±10％；12小时明暗循环)。动物每天监测不良的临床症状和每周检测体重。如果注意到后肢麻痹、呼吸窘迫、20％体重损失、或肿瘤体积大于2000mm3，立即通过用CO2窒息人道地将动物处死。
同源肿瘤的建立
在同源肿瘤模型中使用的细胞系描述在表9-3至9-6中。
表9-3：细胞系的说明：Renca
细胞系 Renca
组织起源 肾脏，小鼠
来源 ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州
生长培养基 补充有10％FBS的RPMI1640
生长条件 在湿润的组织培养箱中，37℃，5％CO2
表9-4：细胞系的说明：CT26
细胞系 CT26
组织起源 结肠，小鼠
来源 ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州
生长培养基 补充有10％FBS的RPMI 1640
生长条件 在湿润的组织培养箱中，37℃，5％CO2
表9-5：细胞系的说明：4T1
细胞系 4T1
组织起源 乳腺，小鼠
来源 ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州
生长培养基 补充有10％FBS的RPMI 1640
生长条件 在湿润的组织培养箱中，37℃，5％CO2
表9-6：细胞系的说明：MCA205
RPMI 1640＝洛斯维公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基；FBS＝牛胎儿血清
同源肿瘤的移植
通过将悬浮于0.1mL PBS的5.0×105Renca细胞、5.0×105CT26细胞或1.0×1054T1细胞皮下(SC)注射到被随机分配到研究组的7至9周大的BALB/c小鼠的右侧翼来建立同种异体移植物；而将悬浮于0.1mL PBS的2.5×106MCA205细胞注射到7至9周大的C57BL/6小鼠的右侧翼。
随机化、组名称和剂量水平
BALB/c(总共150只)和C57BL/6(总共70只)雌性小鼠被用于这项研究中。在注射Renca和CT26肿瘤细胞系之前，将BALB/c小鼠随机分配到治疗组中。在移植后3天，使用4T1肿瘤细胞移植的Balb/c小鼠通过体重随机化。移植后11天，在肿瘤长到每个组平均体积为95mm3之后随机分配C57BL/6小鼠。组名称、动物数目、剂量水平和剂量时间表呈现于表9-7、
表9-8、表9-9和表9-10中。
如在表9-7、表9-8、表9-9和表9-10中所呈现，所有治疗在适合的研究天数经腹膜内(IP)给予。目前还没有动物替换。
当肿瘤体积达到大约2000mm3时，来自每个组的动物被处死。
表9-7：在OX40-013-029(Renca癌细胞系)研究中的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；NA＝因为没有处理动物而不适用；IP＝腹膜内；ROA＝给予的途径；mOX40L FP＝鼠类OX40配体鼠类IgG1融合蛋白
a剂量体积：0.2ml
表9-8：在OX40-013-039(CT26癌细胞系)研究中的组名称和剂量水平
表9-7：在OX40-013-029(Renca癌细胞系)研究中的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；NA＝因为没有处理动物而不适用；IP＝腹膜内；ROA＝给予的途径；mOX40L FP＝鼠类OX40配体鼠类IgG1融合蛋白；mOX40L FP(Y182A)＝使得融合蛋白不能结合鼠类OX40的在OC40L中的点突变
a剂量体积：0.2ml
表9-9：在IMT-14-003(4T1癌细胞系)研究中的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；NA＝因为没有处理动物而不适用；IP＝腹膜内；ROA＝给予的途径；mOX40L FP＝鼠类OX40配体鼠类IgG1融合蛋白
a剂量体积：0.2ml
表9-10：在OX40-013-065(MCA205癌细胞系)研究中的组名称和剂量水平
F＝雌性；M＝雄性；IP＝腹膜内；ROA＝给予的途径；mOX40L FP＝鼠类OX40配体鼠类IgG1融合蛋白；mOX40L FP(Y182A)＝使得融合蛋白不能结合鼠类OX40的在OC40L中的点突变
a剂量体积：0.2ml
肿瘤测量
肿瘤通过卡尺测量且肿瘤体积使用以下公式计算：肿瘤体积＝[长(mm)×宽(mm)2]/2
其中，长被定义为较大边且宽被定义为垂直于长的较小边。
每个组的抗肿瘤作用被表示为肿瘤生长抑制(TGI)，其计算如下：
TGI百分比＝(1-T/C)×100
其中，T＝末次剂量后来自治疗组的最终肿瘤体积，且C＝末次剂量后来自对照组的最终肿瘤体积。
如果没有可测量的肿瘤，则肿瘤生长应答被归类为完全应答(CR)。
统计方法
单因子方差分析(One-way ANOVA)被用于确定平均肿瘤体积差异。在显著的F测试的情况下，使用邓尼特的(Dunnett’s)或Sidak’s多重比较试验(适用时)。适用时，对肿瘤体积应用log10转化来解释异方差性。p值<0.05被认为是显著的。
在这项研究中使用的材料和它们的来源在表9-11中列出。
表9-11：材料
相比使用同种型对照，使用鼠类OX40配体融合蛋白IgG1(mOX40L Fp)治疗小鼠导致Renca、CT26、4T1、和MCA205肿瘤细胞的显著减小的生长(表9-7、表9-8、表9-9、和表9-10、图19、图20、图21和图22)。
在同源模型中通常显示混合的应答。使用mOX40L FP治疗的应答从个体动物肿瘤生长图中更清楚(图19、图20、图12-3和图21的小图B)。由于大肿瘤尺寸在第25天(图19、图21)、第42天(图22)或第43天(图20)对未处理的和同种型对照处理的动物实施安乐死。基于肿瘤生长抑制(表9-12、图19)或具有完全应答动物的数目(表9-13、表9-14和表9-15)，在使用mOX40L FP治疗的小鼠中观察到剂量应答。
表9-12：治疗组和在第26天的TGI百分比以及在Renca同源模型中完全应答的数目
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹腔内；V＝体积
a每组动物的数目：10。
b所有动物在第4和7天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(治疗组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
表9-13：治疗组和在第22天的TGI百分比以及在CT26同源模型中完全应答的数目
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹腔内；V＝体积
a每组动物的数目：10。
b所有动物在第4和7天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(治疗组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
表9-14：治疗组和在第25天的TGI百分比以及在4T1同源模型中完全应答的数目
表9-14：治疗组和在第25天的TGI百分比以及在4T1同源模型中完全应答的数目
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹腔内；V＝体积
a每组动物的数目：12。
b所有动物在第4和7天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(治疗组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
表9-15：治疗组、在第22天在MCA205同源模型中的TGI百分比和完全应答的数目
TGI＝肿瘤生长抑制；NA＝不适用；IP＝腹腔内；V＝体积
a每组动物的数目：14。
b所有动物在第4和7天接受200μL测试样品(IP)。
c％TGI＝[1-(治疗组的平均肿瘤V)÷(对照组的平均肿瘤V)]×100
d在研究结束时具有肿瘤体积测量被记录为0的组的动物的数目。
结论
相比未处理的和同种型对照处理的组，荷瘤小鼠使用mOX40L FP的单一药剂治疗导致四个不同肿瘤生长显著减少的剂量依赖性抗肿瘤活性。
实例10：在非人灵长类疫苗接种模型中对OX40L IgG4P融合蛋白的应答
在这个实例中，在非人灵长类(NHP)疫苗接种模型中评估了OX40激动剂的体内活性。用于这项研究的抗原是呼吸道合胞体病毒可溶性F糖蛋白(RSV sF)抗原，其能够诱导T细胞应答和在食蟹猴中的抗体应答(数据未显示)。
已显示被称为克隆L106的抗人OX40单克隆抗体增强类人猿免疫缺陷病毒糖蛋白130(SIV gp1340)疫苗接种的非人灵长类(NHP)模型中的T和B细胞应答(温伯格·AD(Weinberg，AD)等人，免疫治疗杂志(J Immunother)29:575-585(2006))。在1期人临床试验中，在癌症患者中，MEDI6469(小鼠抗人OX40单克隆抗体，也被称为克隆9B12)被显示刺激针对共同给予抗原的T细胞增殖应答(对破伤风类毒素的回忆应答和针对钥孔虫戚血蓝蛋白的从头应答两者)，在一些患者中发生肿瘤消退(柯蒂·BD(Curti BD)等人，癌症研究(Cancer Res)73:7189-98(2013))。
材料与方法
表10-1描述了组名称和给药方案。在这项研究中使用了两只雌性和两只雄性实验初始的中国食蟹猴。将动物随机化并分配给各组。在给药的时候，动物大约2.3至5.5岁，体重范围为从2.5至3.5千克。在研究过程中动物被社会化。
表10-1：治疗组和给药方案
从全血中分离食蟹猴外周血单核细胞
外周血单核细胞(PBMC)在可珀(Percoll)梯度上分离。简言之，将全血(约15mL)在50mL锥形管中的30mL的60％可珀(Percoll)工作溶液上铺一薄层，并在1100×g下在室温(RT)下离心20分钟。PBMC从可珀(Percoll)界面收获，转移到新的锥形管，并用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，沉淀，并在RT下再悬浮于2mL氯化铵钾裂解缓冲液以裂解红血细胞。将PBMC用1×PBS洗涤，然后沉淀并再悬浮于25mL的1×PBS中，用于在番石榴(Guava)easyCyte-HT仪器(密理博公司(Millipore)；比勒利卡，马萨诸塞州)上计数。使用在ViaCount试剂中的1:20稀释获得总活PBMC计数。离心前，来自每只动物的PBMC样品分成两个管：一个用于酶联免疫斑点(ELISpot)测定和一个用于Ki67测定，因为每个测定类型需要不同的细胞浓度。离心后，将酶联免疫斑点PBMC以2×106PBMC/mL再悬浮于CTL测试培养基(具有谷氨酰胺)且Ki67PBMC以5×106PBMC/mL再悬浮于培养基中。
细胞内Ki67染色试验
Ki67是用于增殖的细胞内(核)标记，允许在全血或纯化的PBMC中的多个免疫亚群中同时评估细胞增殖。Ki67增殖是在CD4+和CD8+记忆T细胞中测量OX40激动剂的体内活性的既定药效标志物(柯蒂·BD(Curti BD)等人，癌症研究(CancerRes)73:7189-98(2013))。
在第7、42、和56天使用纯化的PBMC和在第28、35、和38天使用全血，在中央记忆(cM)CD4+T细胞、效应记忆(eM)CD8+T细胞、NK细胞、和B细胞中评估了所有猴子的Ki67水平。将100微升的全血或PBMC的100μL的等分(106细胞/孔)移液到96孔V形底板的多个孔中，每个免疫表现型面板一个孔(即，一个用于记忆T细胞，一个用于NK细胞，以及一个用于B细胞)。CD4+cM亚群(CD95+、CCR5-)代表大多数的CD4+记忆T细胞，而CD8+eM(CD95+、CCR5+)亚群代表了大多数的CD8+记忆T细胞。集中这些亚群增加了测定的分辨率。
使用表10-2中列出的抗体制备了用于NHP记忆T细胞和NK细胞的免疫表现型抗体混合物。免疫表现型抗体混合物与100μL的全血或PBMC在室温下孵育20分钟。孔用荧光激活细胞分选(FACS)染色缓冲液(FSB)洗涤两次，随后用FACSTM裂解液在室温下重悬浮细胞沉淀10分钟。然后，细胞沉淀用FSB洗涤并在室温下用FACS彼尔姆(Perm)透化10分钟(两次)。将细胞沉淀用FSB洗涤另一次后，在黑暗中室温下向每个孔添加10μL的Ki67异硫氰酸荧光素抗体，持续45分钟。细胞沉淀用200μL FSB洗涤两次并再悬浮于200μL FSB中。在流式细胞仪上获得每个样品100,000个事件，且使用FACS迪瓦(Diva)和流式乔(FlowJo)10.6软件(树星(Tree Star)，阿什兰，俄勒冈州)分析数据。
NHP IFN-γ酶联免疫斑点测定
IFNγ酶联免疫斑点测定是用于通过捕获和定量对应于分泌IFNγ细胞因子的各个细胞的个别膜斑点来检测抗原特异性T细胞的频率的96孔测定。这项测定是该领域中用于检测抗原特异性T细胞的最灵敏的测定。
抗猴IFNγ试剂盒包括抗体预涂板，且检测抗体从Mabtech公司(马里蒙特，俄亥俄州)购得并根据制造商的说明使用。平板用CTL-测试培养基阻断。每孔200,000个PBMC的样品用模拟液(mock)(CTL-测试培养基+二甲基亚砜)或RSV F肽池(2μg/mL)刺激三次，而每孔20,000个PBMC用葡萄球菌肠毒素B(1μg/mL)刺激三次作为阳性对照。将平板在37℃孵育22±2小时，然后用PBS洗涤10次。IFNγ斑点检测通过用检测抗体(7-B6-1-生物素，1:1000)在室温孵育2小时来实现，接着是另一次洗涤和与二级检测抗体(链霉亲和素-ALP，1:1000)在室温孵育1小时。然后添加BCIP/NBT附加底物来可视化斑点4分钟，平板用水洗涤来停止斑点显影，在黑暗中室温下干燥过夜。第二天，每个孔中的斑点使用CTL免疫斑点板读数器和免疫斑点5.1软件(CTL公司；克利夫兰，俄亥俄州)进行计数。在减去二甲基亚砜孔(背景)之后，结果使用图板棱柱(GraphPad Prism)6(图板软件公司，拉霍亚，加利福尼亚州)作为F-特异性斑点形成计数(SFC)/106PBMC绘图。
RSV-F特异性血清IgG检测试验
对于RSV-F IgG酶联免疫吸附测定(ELISA)，高结合的96孔平底板在4℃用0.1μg/mL RSV sF蛋白涂覆过夜。血清样品在稀释缓冲液(补充有10％超级块的PBS吐温20[PBST])中手动稀释1:100，然后在96孔样品稀释块(0.5mL)中使用布拉沃(Bravo)液体处理器SRT以1:3连续稀释7倍。每个样品稀释块还包括人类血清作为阳性对照和无抗血清的阴性对照用于测量试验背景。测定板用PBST洗涤3次和在室温下使用超级块阻断1小时后，与封闭1小时在室温下，将在96孔样品稀释块中的血清稀释物转移至96孔测定板，并在室温持续振荡下进一步孵育1小时。在孵育结束后，将测定板用PBST洗涤3次，并在室温持续振荡下与辣根过氧化物酶轭合的抗猴IgG(1:80000)一起孵育1小时。测定板用PBST洗涤3次，然后在3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)中显影8-15分钟。彩色显影用1N HCl终止，且这些孔在平板读数器上在光密度(OD)450被读出。血清滴度以给出每个检测板的平均背景4倍以上OD450值的倒数倍血清稀释来定量。RSV-F抗原特异性IgG ELISA滴度是log2转化并作图的。对于这个试验的检测极限(LOD)被确定为对血清样品进行第一次血清稀释的倒数，即1:100稀释意味着LOD为100或log26.6且对于<100的样品的估算LOD值是LOD的一半，其在这个实例的情况下为50或log25.6。
RSVA2微量中和试验
血清RSV中和滴度通过RSV A2绿色荧光蛋白(GFP)微量中和试验来确定。在56℃下将对照和测试样品血清热灭活一小时以灭活补体。使用布拉沃(Bravo)SRT液体处理器(安捷伦公司(Agilent)；圣克拉拉，加利福尼亚州)，将热灭活血清对照和测试样品连续稀释3倍，从1:5或1:10开始进行8次稀释。将工程化以表达GFP的RSV A2(RSV-GFP)添加到每个血清稀释且病毒地将孔控制在实现每孔大约500荧光聚焦单位的稀释。同时，制备了韦罗(Vero)细胞，该韦罗细胞被铺板在96孔板中以达到95％-100％融合性单层。血清-病毒混合物在室温孵育1小时用于中和，然后加至重复，使用布拉沃(Bravo)SRT液体处理器洗涤韦罗(Vero)细胞板两次。受感染的细胞板在37℃，5％CO2培养箱中孵育22-24小时。通过ImageXpress微XL自动成像平台(分子装置公司(Molecular Devices)，桑尼维尔，加利福尼亚州)获得平板数据后，枚举出由非中和RSV GFP产生的荧光聚焦。在每个板上，使用从归一化至病毒对照的数据的2-点插值，将聚焦计数登录到自动数据分析工作表以确定log250％抑制浓度滴度。2-点插值从病毒的50％中和周围的2点线性回归计算。对于这个试验，LOD被确定为对样品进行第一次稀释的倒数，即1:10稀释意味着LOD为10或log23.3且对于<10的样品的估算LOD值是LOD的一半，其在这个实例的情况下为5或log22.3。
统计方法
使用混合效应模型得到显著的p值(布朗H(Brown H)和普雷斯科特R(PrescottR)，《在医中应用混合模型》，纽约，纽约州：约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，1999年)。显着性设定为p<0.05。出于分析和评估的目的，还报道和鉴定了在0.05和0.1之间的、已接近显著的值，p值。在特定的时间点在特定的组内，使用来自4个个体动物试验值的计算的几何平均值(GeoMean)执行了统计显著性的分析以进行跨组和跨天的比较。
在这项研究中使用的材料在表10-2中列出。
表10-2：材料
结果
细胞内Ki67水平
在CD4+cM T细胞中的Ki67
表10-3总结了CD4+cM T细胞增殖结果(Ki67诱导百分比)。评估CD4+cM T细胞增殖的最佳时间点(基于最高Ki67水平)通常是在第35至42天。
在第29、31、和33天被给予3次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白的猴子(第10组)在第42天具有CD4+cM T细胞增殖的最强增加，显著高于任何其他组。与第28天(p＝0.0003)基线相比，Ki67刺激百分比的增加高度显著，并引起在第35和42天的CD4+cM T细胞增殖超过70％。第56天，由OX40L IgG4P融合蛋白引起的CD4+cM T细胞增殖几乎恢复到基线。然而，第4组动物被给予3次剂量的5mg/kg的OX40L IgG4P融合蛋白，第5组动物被给予单一的1mg/kg剂量的OX40L IgG4P融合蛋白。由一次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白引发的应答比得上由3次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白治疗方案引起的应答，并且显著强于PBS或mIgG1同种型对照组的那些，
表明在单一剂量后在食蟹猴中OX40L IgG4P融合蛋白可实现显著的OX40激动。
相比于PBS对照组，MEDI6469在CD4+cM T细胞增殖试验中未显示显著的活性(见表10-3)。
表10-3：CD4+cM T细胞增殖结果的总结
使用第42天时间点确定了相对于基线的组变化和组与组比较的统计显著性。
ap<0.05，与第28天(基线)相比。
bp<0.05，测试组与第1组相比。
在CD8+eM T细胞中的Ki67
表10-4总结了CD8+eM T细胞增殖结果(Ki67诱导百分比)。CD8+eM T细胞增殖是在第42天最佳。OX40L IgG4P融合蛋白在第42天显示出与基线相比最强的CD8+eM T细胞增殖应答(p＝0.0095)。MEDI6469也在第42天诱导了与基线(p＝0.007)和同种型对照mIgG1(p＝0.015)相比强的CD8+eM T细胞增殖。对于OX40L IgG4P融合蛋白(3次剂量)观察到的CD8+eMT细胞增殖应答的峰值幅度在50％以上(在CD8+eM T细胞中的％Ki67+细胞)。OX40L IgG4P融合蛋白和MEDI6469是唯一的OX40激动剂，它们的活性与PBS和mIgG1同种型对照组相比在CD8+eM T细胞增殖中达到显著水平。
表10-4：CD8+eM T细胞增殖结果的总结
使用第42天时间点确定了相对于基线的组变化和组与组比较的统计显著性。
ap<0.05，与第28天(基线)相比。
bp<0.05，测试组与第1组相比。
cp<0.1，与第28天(基线)相比。
dp<0.1，测试组与第1组相比。
在NK细胞中的Ki67
表10-5总结了NK细胞增殖结果(Ki67+NK细胞百分比)。据报道OX40在NK细胞上以低水平表达(克罗夫特·M(Croft M)等人，免疫学评论(Immunol Rev)229:173-91(2009))，因此，NK细胞可以是OX40激动作用的直接靶标，或者可以通过与T细胞相互作用而受影响。OX40L IgG4P融合蛋白在所测试的所有组的第42天引起最高的NK细胞增殖应答；应答与PBS对照(p＝0.020)和mIgG1同种型对照(p＝0.032)相比是显著的并且类似于MEDI6469(p＝0.74)。单一的1mg/kg剂量的OX40L IgG4P融合蛋白与3次剂量(5mg/kg)方案(p＝0.48)是相似的。在第42天MEDI6469增强NK细胞增殖，其比PBS对照(p＝0.0083)和mIgG1同种型对照(p＝0.042)组显著更高。
表10-5：NK细胞增殖结果的总结
使用第42天时间点确定了相对于基线的组变化和组与组比较的统计显著性。
ap<0.05，与第28天(基线)相比。
bp<0.05，测试组与第1组相比。
cp<0.1，与第28天(基线)相比。
dp<0.1，测试组与第1组相比。
在B细胞中的Ki67
表10-6总结了B细胞增殖结果(Ki67+B细胞百分比)。已知B细胞不表达OX40，但它们可通过与活化的T细胞相互作用而受影响。使用3次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白方案和1次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白方案，在第42天观察到相比基线的显著的B细胞增殖(p<0.05)。在3次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白方案中，观察到与基线的差异，但是这可能是由于2只动物基线值的缺失和小的样本大小，结果在统计学上不显著。PBS对照组也显示出与基线不同的B细胞增殖的增加(p＝0.0007)。因为如此，具有比PBS对照组显著更高的B细胞增殖的唯一组为1次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白组(p＝0.0316)。显示比mIgG1同种型对照组的B细胞增殖显著增加的唯一组是1次剂量OX40L IgG4P融合蛋白的方案。该1次剂量OX40L IgG4P融合蛋白方案类似于3次剂量OX40L IgG4P融合蛋白的方案。
表10-6：B细胞增殖结果的总结
使用第42天时间点确定了相对于基线的组变化和组与组比较的统计显著性。
ap<0.05，与第28天(基线)相比。
bp<0.05，测试组与第1组相比。
cp<0.1，与第28天(基线)相比。
dp<0.1，测试组与第1组相比。
NHP IFN-γ酶联免疫斑点
表10-7总结了如通过酶联免疫斑点测定的RSV-F特异性IFNγ的T细胞应答。对RSVsF初次-加强疫苗接种方案的最佳T细胞应答可在给予加强抗原后14-28天(其对应于这项研究的第42-56天)观察到。如果动物具有它基线水平(免疫接种前)4倍的应答水平和≥50斑点/百万PBMC，则该动物被认为是一个应答者。
3次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白方案展现出RSV-F特异的T细胞应答的最强诱导，其是在第42和56天检测到的，4只猴子全部在每个时间点都具有积极的应答。应答与基线相比在第42天(p＝0.012)和第56天(p＝0.010)是显著的，并且与PBS对照(p＝0.0023)和mIgG1同种型对照(p＝0.0024)组显著不同。在第42天(p＝0.47)和第56天(p＝0.38)，在给予1次剂量OX40L IgG4P融合蛋白的动物中的应答相似于给予3次剂量OX40L IgG4P融合蛋白的动物中的应答。
表10-7：RSV F-特异的IFN-γT细胞酶联免疫斑点结果的总结
使用第42天时间点确定了相对于基线的组变化和组与组比较的统计显著性。
ap<0.1，测试组与第1组相比。
bp<0.05，测试组与第1组相比。
cp<0.1，第28天(基线)。
dp<0.05，与第28天(基线)相比。
在第42天，MEDI6469引起了25％的应答率，其没有与PBS对照组(p＝0.093)或mIgG1同种型对照组(p＝0.066)显著不同。在第56天，MEDI6469具有50％的应答率，与mIgG1同种型对照组(p＝0.039)显著不同。鉴于抗原加强后没有延迟，这种应答没有与MEDI6469显著不同。
抗RSV-FIgG滴度
表10-8总结了抗RSV-F IgG滴度。B细胞可以通过与活化的T细胞相互作用来为共享的抗原靶标制造更多或更高亲和力的抗体而受影响。如在表10-6中所示的Ki67数据，通过若干个OX40激动剂方案诱导B细胞增殖。对抗原特异性抗体滴度进行评估以确定这种增殖是否转化为功能性效果。在第0天第一次免疫接种之前，RSV-F-特异性IgG水平在大多数(或全部)动物中低于试验检测极限。在第14天，在所有RSV sF免疫组但不在PBS对照组中检测到低水平的抗RSV-F IgG抗体。在第42天(OX40激动剂给药后14天)观察到最高的抗体应答。mIgG1同种型对照组初次免疫后(第14和28天)展示出在RSV-F IgG滴度的增加(从基线至大约1:256滴度或8log2)，其在单独的RSV-F抗原加强后第42和56天进一步增加了约8倍(大约1:2048滴度或11log2)。相比mIgG1同种型对照组(p＝0.050)，使用MEDI6469的OX40激动作用在第42天显著增强了抗RSV-F IgG抗体(大约1:16,400滴度或14log2)，具有从基线的300倍的增加。3次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白组在第42天显示出抗RSV-F IgG抗体的强的诱导，其类似于MEDI6469(分别为p＝0.33和p＝0.44)。对于这两个组在大小和显著性上第56天的应答等同于第42天的应答。另外，在诱发抗RSV-F IgG抗体方面，1次剂量OX40LIgG4P融合蛋白组等同于3次剂量OX40L IgG4P融合蛋白组(p＝0.23)。
表10-8：RSV F特异性IgG滴度的总结
RSV中和的抗体滴度
表10-9总结了在动物的血清中观察到的平均(每个组)RSV中和滴度。这个试验比RSV-F IgG试验的敏感性少，因为它仅评估可中和RSV病毒的抗体。正的中和应答被定义为在基线以上的中和抗体滴度的4倍升高。最大的RSV中和抗体在第42和56天观察到。观察到在这个试验中最大的应答为产生100％应答率(4/4动物)的3次剂量OX40L IgG4P融合蛋白组。1次剂量OX40L IgG4P融合蛋白组在第56天达到了75％的应答率，应答大小显著高于它的基线，并且在第42天(p＝0.21)和第56天(p＝0.45)类似于3次剂量OX40L IgG4P融合蛋白组。1次剂量和3次剂量OX40L IgG4P融合蛋白组是在第56天(对于两个组p＝0.029)显示与PBS对照组统计学显著的仅有的组。
表10-9：RSV A2中和抗体滴度的总结
使用第42天时间点确定了相对于基线的组变化和组与组比较的统计显著性。
ap<0.05，与第28天(基线)相比。
结论
OX40L IgG4P融合蛋白在Ki67增殖水平和在RSV-F抗原特异性应答两者方面引起强的应答。MEDI6469诱发CD8+eM T细胞增殖的活性类似于OX40L IgG4P融合蛋白的活性，且诱发RSV F特异性T细胞和B细胞应答比OX40L IgG4P融合蛋白更弱。总体而言，一次剂量的OX40L IgG4P融合蛋白(以1mg/kg)在评估的大多数试验中诱导与3次剂量(5mg/kg)类似的应答，尽管3次剂量方案在Ki67增殖和诱发RSV中和抗体方面优越。OX40L IgG4P融合蛋白与RSV sF一起给予导致与基线相比显著的F-特异性IFNγ应答。这项NHP研究的结果提供了证据表明向NHP给予OX40激动剂可以驱动定义的抗原特异性免疫应答。
实例11：人OX40L IgG4P融合蛋白对Treg介导的人CD4+效应T细胞的抑制的影响
在这个实例中，研究了OX40L IgG4P融合蛋白对人调节性T细胞的抑制效果的影响。
材料与方法
效应细胞和调节性T细胞的分离
匿名人类白细胞锥是由在英国的国家卫生服务输血服务(NHSBT)中心提供。人外周血单核细胞(PBMC)通过在菲科帕克+(Ficoll-Paque Plus)上分层血液和按照制造商的说明(GE医疗集团，查尔方特圣吉尔斯，英国)离心从白细胞锥中分离。人CD4+效应和调节性T细胞使用人T调节性细胞分离试剂盒按照制造商的说明(生命技术公司(LifeTechnologies)，佩斯利，英国)从PBMC中分离。简言之，这个过程涉及通过非CD4+细胞的抗体标记的总CD4+细胞的阴性选择，和通过使用基于磁珠的消耗除去它们。然后，将调节性T细胞通过标记抗CD25从效应CD4+细胞中分离，接着是使用磁珠的阳性选择，这些磁珠随后从分离的细胞中除去。
圆底96孔组织培养板在两个连续的步骤中涂覆上抗CD3抗体和测试样品。首先，将100μL的0.5μg/mL抗CD3抗体加入各孔，且平板在4℃孵育过夜。然后，平板用PBS洗涤，100μL测试或对照样品差以适宜的浓度加入到相关孔且平板在4℃孵育过夜。孵育之后，在随后的抑制试验中使用前，将平板再次用PBS洗涤。
使用细胞踪迹(CellTrace)TMCFSE细胞增殖试剂盒(生命技术公司，佩斯利，英国)根据制造商的说明，将效应CD4+T细胞使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。
效应CD4+T细胞和调节性T细胞在抗CD3涂覆的平板中以1:1或1:2比率共培养。培养基是含有1％v/v青霉素和链霉素、5％v/v人AB血清和1μg/mL抗CD28抗体的RPMI-1640Glutamax-I。培养条件为37℃的温度和5％CO2的空气。
培养细胞从培养板中除去4天后，在PBS中洗涤两次，并根据制造商的说明(eBiosciences公司，哈特菲尔德，英国)用可固定活性染料780染色。染色之后，细胞在FACS缓冲液(eBioscience公司)中洗涤和通过重悬浮于100μL的细胞固定(CellFix)TM(贝克顿·迪金森公司(Becton Dickinson)，牛津，英国)中来固定，接着是在室温下孵育15分钟。
将固定的细胞悬浮于FACS缓冲液中，并使用贝克顿·迪金森公司(BectonDickinson)的FACSCanto II流式细胞仪进行分析。荧光补偿后，分裂效应T细胞(CFSE低)的百分比使用流式乔(FlowJo)软件(版本vX.0.7)来评估。将非存活的(eFluor阳性)细胞和调节性T细胞(CFSE阴性)区分，并且从分析中排除。
数据的图解表示(包括平均值和该平均值的标准误差的确定)使用用于Windows的图板棱柱(GraphPad Prism)版本6.0来产生。
在这个实例中使用的材料在表11-1中列出。
表11-1：材料
结果
人OX40L IgG4P融合蛋白克服了调节性T细胞介导的人效应CD4+T细胞增殖的抑制。
人效应CD4+T细胞在刺激不存在下不分裂。抗CD3和抗CD28的添加导致分裂细胞的百分比增加至33％。40nM或10nM的浓度的OX40LIgG1融合蛋白的添加分别使分裂细胞的百分比显著地增加至41％和61％(图23)。40nM或10nM的浓度的对照构建体(F180A OX40L FPIgG1；这个苯丙氨酸(F)至丙氨酸(A)突变消除OX40L蛋白的OX40受体结合活性，参见实例1)的添加相对于单独的抗CD3+抗CD28没有显著地增加分裂细胞的％(图23“同种型对照”(F180A OX40L FP IgG1))。
调节性T细胞(Treg)以1:1的效应物:Treg比例的添加减少分裂的细胞的百分比至15％。调节性T细胞(Treg)以1:2的效应物:Treg比例的添加减少分裂细胞的百分比进一步至12％。40nM或10nM的对照构建体(F180A OX40L FP IgG1)的添加未显著影响当以1:1或1:2的效应物:Treg比例存在时通过Treg的效应T细胞分裂的抑制。与此相反，40nM或10nM的OX40L IgG1融合蛋白添加分别显著地增加当在调节性T细胞的存在下以1:1的效应物:Treg比例培养时分裂的效应CD4+T细胞的百分比至52％和67％。40nM和10nM的OX40L IgG1融合蛋白添加显著地增加当在调节性T细胞的存在下以1:2的效应物:Treg比例培养时分裂的效应CD4+T细胞的百分比至53％和66％(图23)。
OX40L IgG4P融合蛋白对调节性T细胞介导的效应CD4+T细胞增殖的抑制的影响是浓度依赖性的。
在随后的试验中，对如上所述的OX40L IgG4P融合蛋白介导的影响的浓度依赖性进行了评估。在这个试验中，抗CD3和抗CD28的添加导致3.4％分裂的CD4+效应细胞。这通过OX40L IgG4P融合蛋白的加入增加了，但这些增加没有达到统计显著性，除了在2.5nM处OX40L IgG4P融合蛋白增加了分裂的效应细胞的百分比至17％(图24)之外。
Treg以1:1的比例的添加减少了分裂的效应T细胞的百分比至2.5％。40nM和2.5nM(而不是10nM和0.62nM)的OX40L融合蛋白IgG4-FPat的添加，分别显著地增加分裂的效应CD4+T细胞的百分比至6.7％和24％(图24)。
40nM的浓度的对照样品(NIP228IgG4P(见表1-1))的添加没有显著增加当单独培养或在Treg的存在下培养时分裂的CD4+效应细胞的％(图24)。
结论
OX40L融合蛋白可克服Treg细胞对CD4+效应T细胞的增殖的抑制影响。OX40L融合蛋白对Treg细胞介导的抑制的影响是浓度依赖性的，且需要至少2.5nM的OX40L融合蛋白。
实例12：OX40激动剂在恒河猴中的药效学
Ox40激动剂的药效学在静脉内注射恒河猴后进行了确定。在给予MEDI6469(9B12抗体)或OX40L融合蛋白IgG4-FP后，值是基于外周血T、B、和NK细胞(如细胞表面免疫调节蛋白和免疫细胞上的细胞内Ki-67的变化)。作为细胞增殖的标志物，以及免疫调节蛋白例如PD-1和ICOS，在这些细胞群体上对Ki-67的表达进行了检查。另外的组接受生理盐水作为对照。
研究设计如下(也参见，图25)：
表12-1：研究设计和组
存活的单细胞通过流式细胞术分析以确定药效学标志物的变化。总的记忆CD4和CD8 T细胞分别被定义为CD3+CD4+CD95+CD20-和CD3+CD8+CD95+CD20-。中央记忆CD4和CD8 T细胞分别被定义为CD3+CD4+CD28+CD95+CCR5-CCR7+CD20-和CD3+CD8+CD28+CD95+CCR5-CCR7+CD20-。效应记忆CD4和CD8 T细胞分别被定义为CD3+CD4+CD28-CD95+CCR7-CD20-和CD3+CD8+CD28-CD95+CCR7-CD20-。B细胞被定义为CD3-CD20+细胞(见下面表12-2)。
表12-2：免疫分型板
与PBS对照组相比，MEDI6469和OX40L融合蛋白IgG4-FP的结果在最高生物效应方面在数量上和性质上都不同。相对于PBS处理组，MEDI6469在总的记忆CD4 T细胞增殖方面显示了3.5倍平均增加(30％相比7.6％)。这反映在中央记忆CD4的3.0倍增加(23％相比7.7％)和效应记忆CD4 T细胞的3.2倍增加(22％相比6.8％)。OX40L融合蛋白IgG4-FP诱导了总记忆CD4+T细胞增殖的7倍增加(52％相比7.6％)。OX40L融合蛋白IgG4-FP诱导的效应记忆CD4+T细胞增殖(第14天)的最大增加相对于总的和中央记忆CD4 T细胞增殖(第10天)观察到的最大增加被延迟。响应于OX40L融合蛋白IgG4-FP的CD8+总记忆T细胞增殖的增加(19％相比7.6％；2.5倍)类似于对于MEDI6469所观察的(17％相比9.2％；1.8倍)。对于OX40L融合蛋白IgG4-FP，总记忆CD8 T细胞的增加反映在中央记忆CD8 T细胞的3.3倍变化(29％相比8.9％)，以及效应记忆CD8 T细胞的1.9倍变化(21％相比11％)。与对于CD4 T细胞所观察的类似，在OX40L融合蛋白IgG4-FP治疗后的效应记忆CD8 T细胞增殖的最高值(第14天)相对于总的和中央记忆CD8 T细胞增殖的最高值(第10天)被延迟了。对于OX40L融合蛋白IgG4-FP和MEDI6469，观察到初始的CD4或CD8 T细胞增殖没有实质性变化(图26)。
在总的记忆CD4 T细胞中ICOS+细胞的增加在性质上与对于OX40L融合蛋白IgG4-FP的OX40介导的总记忆CD4 T细胞的增殖相符，显示平均％阳性细胞的6.4倍增加(15％与对于PBS的2.3％相比)，虽然代表在细胞上更低的总体诱导总百分比。还观察到ICOS+记忆CD8 T细胞的6.0倍增加(3.8％相比0.64％)，高于CD8记忆T细胞增殖(Ki67；2.5倍)的相对增加，但低于总体诱导总％。与OX40L融合蛋白IgG4-FP相反，MEDI6469诱导了对于ICOS诱导的较低2.4倍的增加，类似与在总记忆CD4T细胞上的增殖(Ki67)的3.5倍诱导。在MEDI6469治疗总记忆CD8 T细胞之后没有观察到ICOS诱导，其因而与OX40L融合蛋白IgG4-FP的结果不同。对于OX40L融合蛋白IgG4-FP或MEDI6469，没有观察到在初始的CD4或CD8 T细胞上ICOS表达的变化(图27)。
OX40L融合蛋白IgG4-FP给予后，总记忆CD4 T细胞上的PD-1表达增加了3.1倍(3.3％相比1.1％PBS组)，而对于MEDI6469给予那个增加是大约5.1倍(1.1％至5.4％)，虽然在总百分比基础上的诱导是低的(分别为2.0％和4.0％)。对于总记忆CD8 T细胞，OX40L融合蛋白IgG4-FP和MEDI6469分别在PD-1表达的细胞中诱导了2.7倍(2.5％相比0.92％)和5.0倍(2.6％相比0.54％)的最大增加，虽然对于每一个来说在总百分比基础上的增加是相当低的(分别为1.6％和2.1％)。由MEDI6469在总记忆CD4和CD8 T细胞上的PD-1的更大的诱导与对于ICOS所观察的定性地不同，其中OX40L融合蛋白IgG4-FP诱导的变化更大。对于OX40L融合蛋白IgG4-FP或MEDI6469，没有观察到在初始的CD4或CD8 T细胞上PD-1表达的变化(图28)。
OX40L融合蛋白IgG4-FP和MEDI6469诱导了CD20+B细胞的增殖。在最大值处，OX40L融合蛋白IgG4-FP使在B细胞中Ki67表达增加了2.8倍(24％相比8.5％)，并且MEI6469使在B细胞中Ki67表达增加了2.5倍(17％相比6.7％)(图29)。
结论
OX40L融合蛋白IgG4-FP诱导总的、中央、和效应记忆CD4和CD8 T细胞的增殖。CD4比CD8 T细胞群体影响的大小更大。效应记忆CD4和CD8 T细胞增殖的诱导相对于总的和中央记忆T细胞被延迟，表明对效应T细胞群体间接的或延迟的生物效应。OX40L融合蛋白IgG4-FP比MEDI6469诱导更高水平的总记忆CD4 T细胞的增殖，虽然诱导总的记忆CD8 T细胞增殖在这些剂量和药物时间表是相似的。
OX40L融合蛋白IgG4-FP诱导了在总记忆CD4和CD8 T细胞上的ICOS和PD-1表达，对于每一个在总记忆CD4 T细胞上观察到相比总记忆CD8 T细胞更高的总百分比诱导。相比MEDI6469，对OX40L融合蛋白IgG4-FP观察到在总记忆CD4和CD8 T细胞上更多的ICOS诱导。然而，在总记忆CD4 T细胞上，相比对OX40L融合蛋白IgG4-FP所观察的，有通过MEDI6469的对PD-1的更大诱导，表明OX40L融合蛋白IgG4-FP诱导PD-1T细胞抑制性蛋白的能力相对于在这些细胞上的激动剂mAb MEDI6469的可能的生物学差异。
***
本披露的宽度和范围应当不限于以上描述的示例性实施例中的任一个，而应当仅根据以下权利要求书和它们的等效物来限定。

Claims (90)

1.一种单链多肽亚基，包括：人IgG4Fc结构域；功能性三聚结构域；和OX40L的受体结合域，其中该多肽亚基可自组装成三聚体或六聚体蛋白。
2.如权利要求1所述的多肽亚基，该多肽亚基从氨基末端到羧基末端包括人IgG4Fc结构域，随后是三聚结构域，随后是OX40L受体结合域。
3.如权利要求2所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域的羧基末端是直接融合到该三聚结构域的氨基末端，且该三聚结构域的羧基末端是直接融合到该OX40L受体结合域的氨基末端。
4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽亚基，其中该IgG4Fc结构域包括IgG4铰链区。
5.如权利要求4所述的多肽亚基，其中该铰链区包括赋予完整的重链间二硫键形成的突变。
6.如权利要求5所述的多肽亚基，其中该突变包括根据EU编号的在位置228处的丝氨酸至脯氨酸突变(S228P)。
7.如权利要求5或权利要求6所述的多肽亚基，其中该铰链区包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至12。
8.如权利要求1至7中任一项所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域进一步包括CH2区。
9.如权利要求1至8中任一项所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域进一步包括CH3区。
10.如权利要求9所述的多肽亚基，其中该人IgG4Fc结构域包括SEQ ID NO:4的氨基酸1至229。
11.如权利要求1至10中任一项所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括α-螺旋卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域、或它们的组合。
12.如权利要求11所述的多肽亚基，其中该三聚结构域起源于TRAF2；血小板反应蛋白1；母系蛋白(Matrilin)-4；CMP(母系蛋白-1)；HSF1；或吞饮受体(Cubilin)。
13.如权利要求12所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括人TRAF2(SEQ ID NO:2)的氨基酸310至349。
14.如权利要求1至13中任一项所述的多肽亚基，其中该OX40L受体结合域包括人OX40L(SEQ ID NO:1)的氨基酸51至183。
15.如权利要求14所述的多肽亚基，其中从六个该多肽亚基组装的六聚体蛋白可特异性地结合至人OX40。
16.如权利要求1至15中任一项所述的多肽亚基，包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
17.如权利要求1至16中任一项所述的多肽亚基，进一步包括相关联的异源剂。
18.如权利要求17所述的多肽亚基，其中该异源剂是异源多肽并经由肽键融合到该多肽亚基。
19.如权利要求18所述的多肽亚基，其中该异源多肽融合至该IgG4-Fc结构域的N-末端、融合至OX40L的受体结合域的C末端、融合至该IgG4-Fc结构域的C-末端和该三聚结构域的N-末端，或融合至该三聚结构域的C-末端和OX40L的受体结合域的N-末端。
20.如权利要求17所述的多肽亚基，其中该异源剂以化学方式轭合至该多肽亚基。
21.如权利要求17至20中任一项所述的多肽亚基，其中该异源剂包括细胞毒性分子、稳定剂、免疫应答调节剂、或可检测的药剂。
22.一种三聚体蛋白，包括如权利要求1至21中任一项所述的三个多肽亚基。
23.一种六聚体蛋白，包括如权利要求1至21中任一项所述的六个多肽亚基。
24.如权利要求23所述的六聚体蛋白，其中该六个多肽亚基各自包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的六聚体蛋白，包括OX40L IgG4P融合蛋白。
26.如权利要求23至25中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白特异性结合在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任意组合的活化的CD4+或CD8+T细胞上表达的OX40。
27.如权利要求26所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白可特异性结合在来自人、食蟹猴、恒河猴或其任意组合的初级活化的CD4+T细胞上表达的OX40。
28.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，其中对于在初级活化的人CD4+T细胞上表达的人OX40的结合亲和力是约1.0pM至约8.0pM，如通过流式细胞术测量的。
29.如权利要求28所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约3.6pM。
30.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在约0.5至约3.0pM处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上20％受体占有率(EC20)，在约3.0至约10pM处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上50％受体占有率(EC50)，并且在约35至约70pM处可实现在初级活化的人CD4+T细胞上90％受体占有率(EC90)，如通过流式细胞术测量的。
31.如权利要求30所述的六聚体蛋白，其中EC20为约1.8pM，EC50为约6.6pM，并且EC90为约53pM。
32.如权利要求26所述的六聚体蛋白，其中对于在过量表达OX40的尤尔卡特(Jurkat)细胞上表达的人OX40的结合亲和力是约1.0pM至约24pM，如通过流式细胞术测量的。
33.如权利要求32所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约12pM。
34.如权利要求26所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白质在过量表达OX40的尤尔卡特细胞上在约1.0至15pM处可实现EC20，在过量表达OX40的尤尔卡特细胞上在约1.0至40pM处可实现EC50，并且在过量表达OX40的尤尔卡特细胞上在约10至100pM处可实现EC90，如通过流式细胞术测量的。
35.如权利要求34所述的六聚体蛋白，其中EC20为约7.2pM，EC50为约16pM，并且EC90为约57pM。
36.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，其中对于在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞上表达的食蟹猴OX40的结合亲和力是约1.0pM至约50pM，如通过流式细胞术测量的。
37.如权利要求36所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约24pM。
38.如权利要求26或权利要求27所述的六聚体蛋白，其中对于在初级活化的恒河猴CD4+T细胞上表达的恒河猴OX40的结合亲和力是约1.0pM至约50pM，如通过流式细胞术测量的。
39.如权利要求38所述的六聚体蛋白，其中该结合亲和力是约21pM。
40.如权利要求23至39中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在基于平板的试验中诱导活化的CD4+T细胞的剂量依赖性增殖并且诱导从活化的CD4+T细胞释放剂量依赖性细胞因子。
41.如权利要求40所述的六聚体蛋白，其中在初级活化的人CD4+T细胞中在约1.0pM至约15pM的六聚体蛋白浓度处可实现20％最大增殖应答(EC20)，在初级活化的人CD4+T细胞中在约5.0pM至约25pM的六聚体蛋白浓度处可实现50％最大增殖应答(EC50)，并且在初级活化的人CD4+T细胞中在约50pM至约65pM的六聚体蛋白浓度处可实现90％最大增殖应答(EC90)，所有如通过流式细胞术测量的。
42.如权利要求41所述的六聚体蛋白，其中EC20为约8.0pM，EC50为约14pM，并且EC90为约57pM。
43.如权利要求40所述的六聚体蛋白，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它们的任意组合。
44.如权利要求43所述的六聚体蛋白，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它们的任意组合。
45.如权利要求23至39中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在初级活化的食蟹猴CD4+T细胞中和在初级活化的恒河猴CD4+T细胞中可实现CD4+T细胞增殖和细胞因子释放。
46.如权利要求23至39中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白在FcγR表达细胞的存在下可激活在表达OX40的T细胞中的NFκB途径。
47.如权利要求46所述的六聚体蛋白，其中该表达OX40的T细胞是表达OX40的尤尔卡特NFκB-萤光素酶报告细胞，该尤尔卡特NFκB-萤光素酶报告细胞响应于NFκB信号传导途径的刺激产生荧光素酶。
48.如权利要求46或权利要求47所述的六聚体蛋白，其中该细胞表达人OX40、食蟹猴OX40或恒河猴OX40。
49.如权利要求23至48中任一项所述的六聚体蛋白，其中向需要癌症治疗的受试者给予有效剂量可抑制该受试者中的肿瘤生长。
50.如权利要求49所述的六聚体蛋白，其中该肿瘤生长抑制是在T细胞的存在下实现的。
51.如权利要求48或权利要求49所述的六聚体蛋白，其中与给予同种型匹配的对照相比，肿瘤生长被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％。
52.如权利要求23至51中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白通过结合至OX40可诱导活化的、表达OX40的CD4+T细胞的增殖，但基本上不引发针对活化的CD4+T细胞的补体依赖性或抗体依赖性细胞毒性。
53.如权利要求23至52中任一项所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白不结合C1q或不引发活化的CD4+T细胞的NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性。
54.如权利要求23至53中任一项所述的六聚体蛋白，其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和疫苗抗原可增加CD4+中央记忆(cM)T细胞增殖。
55.如权利要求23至53中任一项所述的六聚体蛋白，其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和疫苗抗原可增加效应记忆(eM)CD8+T细胞增殖。
56.如权利要求23至53中任一项所述的六聚体蛋白，其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和疫苗抗原可增加NK细胞增殖。
57.如权利要求23至53中任一项所述的六聚体蛋白，其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和疫苗抗原可增加B细胞增殖。
58.如权利要求54到57中任一项所述的六聚体蛋白，其中CD4+cM T细胞增殖、CD8+eM T细胞增殖、NK细胞增殖、B细胞增殖、或它们的任意组合是在外周血单核细胞中作为细胞内Ki67表达进行测量的。
59.如权利要求23至58中任一项所述的六聚体蛋白，其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和疫苗抗原可增加抗原特异性T细胞应答。
60.如权利要求59所述的六聚体蛋白，其中该抗原特异性T细胞应答是作为增加的干扰素γ(IFNγ)表达来测量的。
61.如权利要求23至60中任一项所述的六聚体蛋白，其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和疫苗抗原可增加抗原特异性IgG滴度。
62.如权利要求61所述的六聚体蛋白，其中该抗原是呼吸道合胞病毒的可溶性F糖蛋白(RSV sF)，并且其中向受试者共同给予该六聚体蛋白和该RSV抗原可以增加RSV-中和抗体的滴度。
63.一种组合物，包含如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，以及载体。
64.一种多核苷酸，包括编码如权利要求1至21中任一项所述的多肽亚基或如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白的核酸。
65.如权利要求64所述的多核苷酸，包括SEQ ID NO:3。
66.一种载体，包含如权利要求64或权利要求65所述的多核苷酸。
67.一种宿主细胞，包含如权利要求64或权利要求65所述的多核苷酸或如权利要求66所述的载体。
68.一种生产如权利要求1至21中任一项所述的多肽亚基或如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白的方法，该方法包括在表达由该多核苷酸编码的多肽亚基或六聚体蛋白的条件下培养如权利要求67所述的宿主细胞，并且回收该多肽亚基或六聚体蛋白。
69.一种促进活化的T细胞存活或增殖的方法，该方法包括使活化的T细胞接触如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可特异性结合T细胞表面上的OX40。
70.一种减少调节性T细胞(Treg)介导的、活化的T细胞增殖的抑制的方法，该方法包括使活化的T细胞和Treg细胞的混合物接触如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可特异性结合T细胞表面上的OX40。
71.一种诱导从活化的T细胞释放细胞因子的方法，该方法包括使活化的T细胞接触如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可特异性结合T细胞表面上的OX40。
72.如权利要求71所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或它们的任意组合。
73.如权利要求72所述的方法，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、或它们的任意组合。
74.如权利要求69至73中任一项所述的方法，其中活化的T细胞是活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、或它们的组合。
75.如权利要求74所述的方法，其中活化的CD4+T细胞是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或它们的组合。
76.一种促进T细胞活化的方法，该方法包括使T细胞接触如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可特异性结合T细胞表面上的OX40。
77.如权利要求76所述的方法，进一步包括通过该IgG4-Fc结构域与表达FcγR的细胞的相互作用使该六聚体蛋白交联。
78.如权利要求77所述的方法，其中表达FcγR的细胞是B细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或浆细胞树突状细胞、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞、NK细胞、活化的T细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、来自原发人肿瘤或肿瘤引流或非引流淋巴结的CD45+细胞、来自其他第二或第三级淋巴结构的CD45+细胞、或它们的组合。
79.如权利要求76至78中任一项所述的方法，其中T细胞活化可以通过NFκB信号传导途径的刺激来测量。
80.如权利要求76至79中任一项所述的方法，其中活化的T细胞是活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、或它们的组合。
81.如权利要求80所述的方法，其中活化的CD4+T细胞是人CD4+T细胞、食蟹猴CD4+T细胞、恒河猴CD4+T细胞、或它们的组合。
82.如权利要求69至81中任一项所述的方法，其中该接触包括向受试者给予有效量的该六聚体蛋白。
83.一种在受试者内治疗癌症的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白、或如权利要求63所述的组合物。
84.如权利要求83所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
85.如权利要求83或权利要求84所述的方法，其中该六聚体蛋白或组合物的给予可抑制肿瘤生长，可促进肿瘤减小，或两者。
86.如权利要求83至85中任一项所述的方法，其中肿瘤生长抑制是在T细胞的存在下实现的。
87.一种在受试者内增强免疫应答的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白、或如权利要求63所述的组合物。
88.如权利要求83至87中任一项所述的方法，其中该受试者是人类受试者。
89.一种诱导ICOS在T细胞上表达的方法，该方法包括使T细胞接触如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可特异性结合T细胞表面上的OX40。
90.一种诱导PD-1在T细胞上表达的方法，该方法包括使T细胞接触如权利要求23至62中任一项所述的六聚体蛋白，其中该六聚体蛋白可特异性结合T细胞表面上的OX40。
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