CN109839509A - 利用ox40/ox40l的htrf结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法，属于潜在激动剂的筛选领域。OX40/OX40L的HTRF结合分析实验筛选潜在激动剂的方法，包括如下步骤：1)配制已构建好的带有不同标签的OX40或OX40L蛋白，待筛选样品用；2)在微孔板中依次加入待筛选样品、OX40及OX40L蛋白，上述两种对应的带标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；3)室温孵育一段时间，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值即为原始数据。本发明提供了新的方法，实现了生化水平上筛选OX40/OX40L潜在激动剂，无需构建细胞，更加直接快捷。

Description

利用OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的 方法

技术领域

本发明属于潜在激动剂的筛选领域，具体涉及一种利用 OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法。

背景技术

OX40(CD134)和它的结合配体OX40L(CD252)是TNFR/TNF超家族成员之一，表达于活化的CD4/CD8T细胞表面。OX40/OX40L是机体免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子。OX40与OX40L结合后，可激活T细胞免疫应答，促进T细胞增殖，调节相关细胞因子的产生。同时， OX40会抑制Treg细胞的增殖和分化，以增强T细胞的活化。因此， OX40/OX40L的相互作用在多种炎症和机体自身免疫疾病中发挥重要作用，是目前药物研发领域治疗癌症和传染性疾病十分热门的靶点之一。

OX40/OX40L的HTRF结合分析实验是用于检测OX40和OX40L蛋白之间的相互结合作用情况。HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，是基于时间分辨荧光(TRF)和荧光共振能量转移(FRET)两大技术的一个改良升级。利用HTRF技术，可实现高通量水平化合物或抗体对OX40/OX40L结合的影响，从而筛选潜在激动剂。此实验方法为针对 OX40/OX40L靶点的药物研发，提供了一种高效便捷的实用技术。

目前，常用的检测方法是FACS和ELISA。FACS为流式细胞荧光分选技术，将构建了表达OX40或OX40L蛋白的细胞系经特殊荧光燃料染色或与带有荧光标记的抗体结合，OX40/OX40L实验中一般采用后者。将细胞和待测样品(化合物或抗体)混合后加入带荧光标记的抗体，混合物中放入样品管，气体压力将样品打入含鞘液的流动室，在鞘液的压力下，细胞以单列的形式通过检测通道，被检测通道中的激发光激发，其发射光可被检测器检出，如果样品能结合到OX40或OX40L上，则为阳性信号，不结合为阴性信号。

ELISA，酶联免疫吸附实验，将重组纯化的OX40或OX40L蛋白包被在高吸附的96孔检测板中，孵育过夜后洗掉多余蛋白，加入待测样品，孵育后再次洗掉多余未结合样品，然后加入另一个蛋白，第三次孵育并洗涤，然后加入标记有HRP(辣根过氧化物酶)的二抗，第四次孵育洗涤，最后加入HRP的显色试剂，反应半小时后在酶标仪下读数。根据信号判断样品的阳性/阴性。

FACS需要特殊的流式细胞检测仪，价格昂贵，且单个细胞过柱，通量很低，只适合做抗体药筛选，不适合小分子。

ELISA作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤繁多，耗费时间长,需经过多次洗板、加样、显色等，至少需要一天时间；2)无法实现高通量，难以解决药物待选样品多的难题；3) 包被的蛋白有可能会屏蔽一些蛋白位点，致使漏掉阳性信号，即得到假阴性结果；4)由于步骤较多容易引起实验误差，导致结果重复性差、不稳定。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种HTRF结合分析实验技术，用于筛选潜在激动剂。通过本发明，可实现短时间内高通量筛选，提供更为经济可靠的筛选结果，为快速高效的筛选OX40/OX40L潜在激动剂提供一种便捷高效的方法。

OX40/OX40L的HTRF结合分析实验筛选潜在激动剂的方法，包括如下步骤：

1)配制已构建好的带有不同标签的OX40或OX40L蛋白，待筛选样品用；

2)在微孔板中依次加入待筛选样品、OX40及OX40L蛋白，上述两种对应的带标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；

3)室温孵育一段时间，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm 的比值即为原始数据。

其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白OX40和OX40L，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor 和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使 Acceptor产生荧光；若样品能与OX40蛋白，则随着样品浓度的增加， 665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化样品的效价；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当 665nm/620nm的比值越低，样品的效应越高。上述OX40和OX40L为重组蛋白，带有不同标签。上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板该筛选方法的反应体系为8-20ul。可用于筛选的潜在激动剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。

HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。HTRF基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移 (FRET)两大技术。TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。FRET利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。较传统TR-FRET的能量供体包裹在螯合物中，HTRF的荧光能量的两种Donor——铕 (Eu3+cryptate)和铽(Lumi4^TMTb)，它们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。Acceptor也有两种，一种是APC铰链复合体，商业名称为XL665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kD。XL665和d2 的激发光与Donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。HTRF的反应体系为液体均相，通过优化Diluent(蛋白互作反应缓冲液)成分可使重组蛋白尽可能保持自然构象和生物活性，更真实地暴露出结合位点或活性位点，避免假阳性/假阴性概率，从而提高后期成药概率。

HTRF技术特点如下：

1)操作简单：只需加样和检测试剂，孵育后即检测，无需洗涤， 1小时内完成实验；

2)通量高，易小型化：384或1536孔板操作，反应体系最小可达8uL；

3)信号稳定：可连续多次检测，重复性好；

4)假阳性、假阴性率低：均相检测，不破坏蛋白构象；可排除天然产物自发荧光的背景。

本发明的优点在于：

1)提供新的方法：实现了生化水平上筛选OX40/OX40L潜在激动剂，无需构建细胞，更加直接快捷；

2)适用于所有激动剂筛选，无论是抗体、蛋白、多肽还是小分子化合物；

3)大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2小时；

4)极大提高了实验的通量：由原来ELISA的96孔或FACS单个细胞过柱，提高到384孔甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；

5)结果更可靠：均相检测，抗原蛋白在液相体系里呈现自然构象，有效避免产生假阳性和假阴性；

6)信号更稳定：荧光持续时间久，可以过夜后再进行检测，不影响检测结果，而ELISA的检测结果受到时间限制，时间过长或者过短都会影响检测结果。

附图说明

图1是OX40/OX40L的HTRF结合分析实验的基本原理示意图。

图2是OX40/OX40L的HTRF结合分析实验测定蛋白Kd的结果图。

图3是OX40/OX40L的HTRF结合分析实验检测阳性抗体的数据。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明中的利用HTRF一步法筛选OX40/OX40L阻断剂的方法，包括如下步骤：

步骤一，配置已构建好的带有不同标签的OX40及OX40L蛋白，待筛选样品；

步骤二，在微孔板中依次加入待筛选样品OX40及OX40L蛋白，上述两种对应的抗标签抗体，分别偶联Eu和XL665；

步骤三，室温孵育，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值为原始数据。

其中上述偶联Eu(Donor)和XL665(Acceptor)的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白OX40和OX40L，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到 Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能抑制二者结合，则随着阻断剂浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化阻断剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm 和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，阻断剂的效应越高。

作为优选而非限定，上述OX40和OX40L为重组蛋白，带有不同标签,上述微孔板包括96孔板、384孔板和1536孔板，该筛选方法的反应体系为8-20ul，可用于筛选的阻断剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。

图1是OX40/OX40L的HTRF结合分析实验的基本原理示意图。FRET 利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体 (Donor)和能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。

实施例1

1)配制蛋白，OX40从200nM开始进行系列梯度稀释，得到 200nM到0nM的不同浓度；OX40L从10nM开始进行系列梯度稀释，得到从10nM到0nM的不同浓度；

2)将配制好的蛋白各5ul加入384孔检测板中，室温孵育15 分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的标签抗体(或等量混匀后加 10ul)，孵育2小时读数；

3)根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断蛋白的结合，信号越高，结合越多，结果见图2，图2 左边的图为OX40/OX40L结合实验在10nM OX40L时测定的OX40的Kd 值，其中，特异性结合，Kd：29.98nM；图2右边的图为OX40/OX40L 结合实验在200nM OX40时测定的OX40L的Kd值,其中，特异性结合， Kd：2.22nM。

实施例2

1)配置阳性抗体，将anti-human OX40 blocking antibody进行梯度稀释，从20μg/mL开始进行3倍稀释，共12个浓度；

2)配制蛋白，根据实施例1合适的蛋白浓度做后续阻断剂的筛选，OX40为50nM，OX40L为4nM；

3)配制好的阳性抗体和蛋白依次加入384孔检测板中，室温孵育15分钟后，加入偶联Donor和Acceptor的标签抗体(或等量混匀后加10ul),孵育2小时读数；

4)根据HTRF方法原理，检测665nm/620nm的荧光比值，根据该比值，判断蛋白的结合，信号越高，结合越多，结果见图3,从图3 中能够看出阻断抗体的抑制效应。

由图1、图2和图3可知，本发明适用于多种OX40或OX40L潜在激动剂的筛选，且蛋白用量较少，方法灵敏度高。实验证明采用本发明的方法进行OX40/OX40L潜在激动剂筛选简单可行。

综上所述，目前的主要筛选OX40/OX40L的方法以传统的ELISA、 FACS为主，且多为细胞实验，需要复杂的细胞系构建。而本发明首次将应用HTRF在生化水平筛选，解决了传统方法操作繁琐、时间长、通量低的问题，实现了低成本、高通量、高灵敏度和稳定性、操作简单的筛选方法，为加快药物发现进展提供了更加稳定实用的方案。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种利用OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

S110,配制已构建好的带有不同标签的OX40或OX40L蛋白，待筛选样品用；

S120,在微孔板中依次加入待筛选样品、OX40及OX40L蛋白，上述两种对应的带标签抗体，分别偶联Donor和Acceptor；

S130,室温孵育一段时间，用酶标仪读数检测荧光，665nm/620nm的比值即为原始数据；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光，当665nm/620nm的比值越低，样品的效应越高；

其中上述偶联Donor和Acceptor的两种标签抗体分别检测相互作用的蛋白OX40和OX40L，从而形成四个物质聚合的复合物，拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若样品能与OX40蛋白，则随着样品浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待稳定后测定荧光值的变化便可量化样品的效价，上述OX40和OX40L为重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的利用OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法，其特征在于：上述微孔板包括96孔板，384孔板和1536孔板。

3.根据权利要求1所述的利用OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法，其特征在于：该筛选方法的反应体系为8-20ul。

4.根据权利要求1所述的利用OX40/OX40L的HTRF结合分析实验技术筛选潜在激动剂的方法，其特征在于：可用于筛选的潜在激动剂包括小分子化合物和各种来源的抗体。