CN106794259A - 采用包含含有peg部分的离去基团的试剂缀合肽或蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的缀合试剂，其包含至少一个离去基团，所述离去基团在与所述亲核基团反应时失去，其中所述离去基团包含‑(CH2CH2O)n‑部分，其中n是6或更大的数值；以及使用这样的试剂来制备包含肽或蛋白质的缀合物的新方法。

Description

采用包含含有PEG部分的离去基团的试剂缀合肽或蛋白质的 方法
技术领域
本发明涉及蛋白质和肽的新的缀合方法，以及涉及新的缀合试剂。
背景技术
近年来，大量的研究一直致力于多种有效载荷(payload)(例如诊断、治疗和标记试剂)与肽和蛋白质的缀合，以用于多种应用。所述蛋白质和肽本身具有治疗特性，和/或其可为结合蛋白。
肽和蛋白质具有作为治疗试剂的潜在用途，缀合是提高其性能的一种方法。例如，水溶性的合成聚合物，特别是聚亚烷基二醇，被广泛用于缀合治疗性活性肽或蛋白质。已表明这些治疗性缀合物通过延长循环时间和降低清除率、降低全身毒性以及在一些情况中显示出提高的临床功效而有利地改变药代动力学。将聚乙二醇PEG共价缀合到蛋白质上的方法通常被称为“PEG化”。
结合蛋白，特别是抗体或抗体片段，通常是缀合的。结合蛋白对靶细胞表面上的特定标记物的特异性以及对分子的特异性使它们自身被广泛用作诊断或治疗试剂或被用作有效载荷的载体，所述有效载荷可包括诊断和治疗试剂。这些与标记和报道基团(例如荧光团、放射性同位素和酶)缀合的蛋白质用于标记和成像应用，而缀合至细胞毒性试剂和化疗药物以产生抗体-药物缀合物(ADC)使得将这类试剂被靶向递送到特定的组织或结构(例如特定的细胞类型)，将对正常的、健康组织的影响最小化并且显著减少与化疗治疗相关的副作用。这样的缀合物在许多疾病领域，特别是癌症领域中具有广泛的潜在的治疗应用。
文献中已报道了许多蛋白质和肽的缀合方法。例如，WO 95/13312记载了经由砜部分的缀合。可能最常使用的方法包括使用基于马来酰亚胺的缀合试剂。这样的试剂记载于许多出版物中，例如WO 2004/060965。产生更均一产物的替代性方法记载于Liberatore etal，Bioconj.Chem 1990，1，36-50和del Rosario et al，Bioconj.Chem.1990，1，51-59中，其记载了可用于通过蛋白质(包括抗体)中的二硫键交联的试剂的用途。WO 2005/007197记载了使用新的缀合试剂以使聚合物与蛋白缀合的方法，所述新的缀合试剂能够与源自蛋白质中的二硫键的两个硫原子缀合以产生新的硫醚缀合物，而WO 2009/047500记载了使用相同的缀合试剂以结合至蛋白所连接的多聚组氨酸标记。WO 2010/010324记载了能够结合至蛋白中的单一亲核基团的单一功能试剂的用途。WO 2013/190292、WO 2014/064424、WO2014/184564和WO 2014/064423均记载了使用多种缀合试剂的缀合方法。
大多数缀合方法的共同特征是，缀合反应包括失去缀合试剂中存在的离去基团，以及所产生的部分与蛋白质中存在的亲核基团的反应。已报道的离去基团包括以下类型的基团：-SR、-OR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2和-N+H2R，其中R是烷基或芳基和卤素。
Marculescu et al，Chem.Commun.2014，50，7139-7142公开了含有多种离去基团的芳氧基马来酰亚胺缀合试剂。在其他离去基团中，公开了包含MeO-(CH2CH2O)2-CH2CH2-的基团。相同的结构公开于Christina Marculescu的博士论文，“Development of NovelMaleimide Reagents for Protein Modification”，University College London，August2014中。
出乎意料的是，现已发现通过采用新的离去基团替换已知缀合试剂中的已知离去基团可获得改善的结果，所述新的离去基团包含确定数目的源自乙二醇的重复单元。
发明内容
本发明提供了肽或蛋白质的缀合方法，所述方法包括使所述肽或蛋白质与缀合试剂反应，所述缀合试剂能够与所述肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应，所述试剂包含至少一个离去基团，所述离去基团在与所述亲核基团反应时失去；其特征在于，所述离去基团包含-(CH2CH2O)n-部分，其中n是6或更大的数值。
能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的缀合试剂是新的，所述缀合试剂包含至少一个离去基团，所述离去基团在与所述亲核基团反应时失去，其特征在于，所述离去基团包括-(CH2CH2O)n-部分，其中n为6或更大数值，因此本发明提供了这样的缀合试剂本身。
在另一个实施方案中，本发明提供了肽或蛋白质的缀合方法，所述方法包括使所述肽或蛋白质与缀合试剂反应，所述缀合试剂能够与所述肽或蛋白质中的两个亲核基团反应，所述试剂包含离去基团，所述离去基团在与所述亲核基团反应时失去，其在所述缀合试剂内部具有两个连接点，并且其包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大数值。能够与肽或蛋白质中存在的两个亲核基团反应的缀合试剂是新的，所述缀合试剂包含在与所述亲核基团反应时失去的离去基团，其中所述离去基团在所述缀合试剂内部具有两个连接点，并且其包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大数值，因此本发明提供了这样的缀合试剂本身。
在本说明书全文中，为了方便，将肽和蛋白质共同称为“蛋白质”，除非上下文另有要求，提及“蛋白质”应当理解为包括提及蛋白质和肽两者。
具体实施方式
离去基团
本发明基于以下出乎意料的发现：当包含至少一个离去基团的缀合试剂与蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应时，与已知的离去基团相比，包含重复单元-(CH2CH2O)n-—－其中n至少为6或n1至少为2——的基团是改进的离去基团；并且在n至少为6的情况下，与具有更少的-(CH2CH2O)-重复单元的类似离去基团相比，包含重复单元-(CH2CH2O)n-——其中n至少为6或n1至少为2——的基团是改进的离去基团。新的离去基团可例如包括-(CH2CH2O)n-R1，其中R1是封端基团。可使用众多种类的封端基团。例如R1可以是氢原子；烷基，特别是C1-4烷基，特别是甲基；或任选取代的芳基，例如任选取代的苯基，例如甲苯基。或者，所述封端基团可包括官能团例如羧基或胺基。这类封端基团可例如具有式-CH2CH2CO2H或-CH2CH2NH2，并且可通过使-(CH2CH2O)n-链的末端单元官能化来制备。或者，-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-基团不被封端基团封端，而是在所述缀合试剂内部可具有两个连接点，从而在化学上相当于存在两个能够与两个亲核基团反应的离去基团。
所述离去基团的-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-部分基于PEG聚乙二醇。PEG可以是直链或支链的，并且可以是以任何方式衍生的或官能化的。n是6或更大数值，例如6、7、8、9或10或更多。例如，n可以为6至9。n1是2或更大数值，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多。例如，n1可至少为4；或n1可至少为5，例如5至9；或n1可至少为6，例如6至9。n或n1没有特定的上限。n或n1可为例如150或更低，例如120或更低，例如100或更低。例如n可以为6或7至150，例如6或7至120，而n1可以为2、3、4、5、6或7至150，例如4、5、6或7至150，例如4、5、6或7至120。离去基团的PEG部分-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-可例如具有1至5kDa的分子量；所述分子量可例如为1kDa、2kDa、3kDa、4kDa或5kDa。如果需要，离去基团可包含两个或更多个被一个或更多个间隔基分隔开的-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-部分。
本发明的缀合试剂中的离去基团合适地具有式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P或-N+PR2R3，其中P是包含-(CH2CH2O)n-部分的基团，并且R2和R3各自独立地代表氢原子、C1-4烷基或基团P。离去基团-N+PR2R3可通过基团-NPR2的质子化作用或季铵化作用来制备。优选地，R2和R3各自代表C1-4烷基，特别是甲基，或特别地代表氢原子。或者，所述缀合试剂可包括式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-和-N+R2R3-P-N+R2R3-的基团，其中P是包含-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-部分的基团。如上所述，离去基团-N+R2R3-P-N+R2R3-可通过基团-NPR2-P-NR2的质子化作用或季铵化作用来制备。这种类型的具体基团包括-S-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-S-、-O-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-O-、-SO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-OSO2-或-N+R2R3-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N+R2R3-，或包含n1而非n的对应基团。它们也可包括以下类型的基团：
或包含n1而非n的对应基团，其中-(CH2CH2O)n-或-(CH2CH2O)n1-由任何适合的连接基团(例如亚烷基)携带。这些二价基团在化学上等价于能够与两个亲核基团反应的两个离去基团。
如果存在两个或更多个P基团，则每个P可以是相同或不同的。优选地，所述离去基团为式-OSO2-P-OSO2-，例如-SO2-(CH2.CH2O)n1-CH2-CH2-SO2-，或者特别是-SO2P。
P可例如包括式-T-(CH2.CH2O)n-的基团，其中T为接头。P可例如具有式-T-(CH2.CH2O)n-OR1。T可例如为直接的键，烷基——例如C1-4烷基，或任选取代的芳基，特别是任选取代的苯基。为C1-4烷基的接头T的存在通常是便利的，因为缀合试剂的制备通常涉及使用市售的PEG，并且这些PEG通常由产生基团T的基团来封端。
缀合试剂
许多可用于将有效载荷缀合至蛋白质的缀合试剂是已知的，本发明的新的缀合试剂于这些已知试剂的区别在于它们所包含的离去基团的性质。本发明的缀合试剂必须包含至少一个本发明的新的离去基团。其可包含两个或更多个离去基团。如果存在两个或更多个新的离去基团，这些离去基团可以是相同或不同的。例如，一个离去基团可以是本发明的新的离去基团，而另一个离去基团可以是常规离去基团。如果存在两个或更多个本发明的新的离去基团，它们可以是相同或不同的，例如它们可包含其中每个n均不同的部分。或者，如上所述，缀合试剂可包含单个基团，所述基团在化学上等价于两个离去基团并且能够与两个亲核基团反应。
在本发明的一个优选实施方案中，所述缀合试剂包含本发明的两种离去基团，或包含在化学上等价于两个离去基团并且能够与两个亲核基团反应的单个基团，所述试剂能够与蛋白质或肽中的二硫键还原而形成的两个巯基反应。使用这样的试剂，通过有效地桥连蛋白质或肽中的二硫键而产生缀合物。
所述试剂的一个基团基于双卤代或双硫代马来酰亚胺或其衍生物，如Smith etal，J.Am.Chem.Soc.2010，132，1960-1965和Schumaker et al，Bioconj.Chem.，2011，22，132-136中所描述的。这些试剂包含以下官能团：
其中至少一个、优选每一个L是本发明的离去基团。马来酰亚胺环的氮原子可携带有效载荷，例如诊断、治疗或标记试剂，或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂，例如下文提及的式D-Q-之一。这些试剂能够桥连蛋白质或肽中的二硫键。
类似地，可使用含有单个离去基团L的马来酰亚胺：
同样，马来酰亚胺环的氮原子可携带有效载荷，例如下文提及的式D-Q-之一。
在本发明的一个优选实施方案中，所述缀合试剂包含以下官能团：
其中W代表吸电子基团，例如酮基、酯基-O-CO-、砜基-SO2-或氰基；A代表C1-5亚烷基链或亚烯基链；B代表键或C1-4亚烷基链或亚烯基链；以及每个L独立地代表离去基团，其中至少一个、优选两个必须是本发明的新的离去基团，或者两个L共同代表本发明的离去基团。使用常规离去基团的这种类型的试剂记载于Bioconj.Chem 1990(1)，36-50，Bioconj.Chem 1990(1)，51-59和J.Am.Chem.Soc.110，5211-5212中。当包含这类基团的试剂与蛋白质反应时，其失去第一离去基团L以原位形成包含下式的官能团的缀合试剂：
其中m是0至4，所述缀合试剂与第一亲核基团反应。然后失去第二离去基团L，并且发生与第二亲核基团的反应。作为将包含官能团I的试剂用作起始物质的替代，可将包含官能团I’的试剂用作起始物质。
优选地，W代表酮基。优选地，A代表-CH2-且B代表键。
式I和I’的特别优选的官能团具有下式：
例如，所述基团可以具有下式：
缀合试剂的另一种基团包含以下官能团：
～W-CR4R4′-CR4.L.L′ (II)
其中W具有上文给出含义和优选含义，以及或者
各R4代表氢原子或C1-4烷基，R4′代表氢原子，以及各L独立地代表离去基团，其中至少一个、优选两个必须为本发明的新的离去基团，或者两个L共同代表本发明的离去基团；或
各R4代表氢原子或C1-4烷基，L代表本发明的离去基团，并且R4′和L′共同代表键。
包含官能团I、I′或II的试剂能够桥连蛋白质或肽中的二硫键。
缀合试剂的另一种基团包含以下官能团：
～W-(CH＝CH)p-(CH2)2-L (III)
其中W具有上文给出含义和优选含义，并且p代表0或1至4的整数，优选0。这种类型的特别优选的试剂包含以下官能团：
～NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIa)
其中Ar代表任选取代的芳基，特别是苯基。
本发明的缀合试剂可包含多于一种官能团以与蛋白质反应。例如，试剂可在分子的一端包含式I或I′的官能团，或在分子的其他位置包含含有至少一个本发明的离去基团的任何其他官能团，以及一个或更多个额外的官能团，所述额外的官能团含有本发明的一个新的离去基团或为能够与蛋白质或任何其他分子缀合的常规官能团。这样的结构记载于例如Belcheva et al，J.Biomater.Sci Polymer Edn.9(3)，207-226，并且适用于包含多个蛋白质的缀合物的合成。
可通过与已知方法类似的方法来制备本发明的新的缀合试剂。例如，可以通过与引入常规离去基团相同的方式，将基于PEG且携带合适的官能团的分子引入缀合试剂中。例如，使用Mannich反应，可将氨基或巯基封端的PEG引入含有羰基的化合物中。具体反应将在以下实施例中进行说明。
有效载荷
缀合试剂可携带有效载荷，例如诊断、治疗或标记试剂，或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。在本申请中，包含式I/I′的单元的试剂可具有式(Ic)或(Ic′)，或其中W代表氰基、(Id)或(Id′)：
其中Q代表连接基团且D代表有效载荷，优选诊断、治疗或标记试剂，或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。优选D-Q-包括药物或聚合物或药物和聚合物两者。如果存在药物，则所述药物可例如为细胞毒性药物；如果存在聚合物，则所述聚合物优选为聚乙二醇。
如果D代表用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂，则优选的结构当然将取决于最终所需产品中的诊断、治疗或标记试剂的结构。例如，可存在能够与诊断、治疗或标记试剂反应的任何官能团。例如，可存在官能团，例如-CO2H或其反应性衍生物、-NH2或-OH。羧酸基团的活化衍生物是本领域公知的。例如，可通过使用活化的酯(例如H-羟基琥珀酰亚胺酯)或酸性卤化物来活化羧酸。在一个优选实施方案中，Q是任选取代的苯基，D是用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂，例如-CO2H、-NH2或-OH基团。
可使用任何适合的连接基团Q。在一个实施方案中，Q可例如为直接的键、亚烷基(优选C1-10亚烷基)，或任选取代的芳基或杂芳基，其中任何基团都可被一个或更多个以下原子或基团封端或(在亚烷基的情况下)中断：氧原子、硫原子、-NR基团(其中R代表氢原子或烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基-芳基(优选C1-6烷基苯基))、酮基、-O-CO-基团、-CO-O-基团、-O-CO-O-、-O-CO-NR-、-NR-CO-O-、-CO-NR-和/或-NR.CO-基团。这类芳基和杂芳基Q形成本发明的一个优选实施方案。适合的芳基包括苯基和萘基，而适合的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤。特别适合的连接基团Q是杂芳基或特别是芳基，特别是苯基。当D是结合基团时，这些可例如包含如上所述的-CO2H、-NH2或-OH。当D是诊断、治疗或标记试剂时，这些可具有与基团D连接的连接基团，例如-NR.CO-或-CO.NR-基团或包含-NR.CO-或-CO.NR-基团的基团，例如-NH.CO-或-CO.NH-基团。
其中D包含结合基团的具体的基团D-Q-，包括以下基团：
其中D代表结合基团，例如-CO2H、-NH2或-OH，m和q各自代表从1至6的整数，例如2或3，其中苯环可以是未取代的或被例如下文提及的任何取代基取代。
可存在于任选取代的芳基，特别是苯基，或杂芳基上的取代基包括例如一种或更多种相同或不同的选自以下基团的取代基：烷基(优选C1-4烷基，特别是甲基，任选地被OH或CO2H取代)、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素例如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR2和-C＝CHR，其中每个R独立地代表氢原子或烷基(优选C1-6烷基)、芳基(优选苯基)或烷基芳基(优选C1-6烷基苯基)。特别优选存在吸电子取代基。优选的取代基包括例如CN、NO2、-OR、-OCOR、-SR、-NHCOR、-NR.COR、-NHOH和-NR.COR。
在另一个实施方案中，接头Q可包含可降解基团，即它可包含在生理条件下断裂的基团，使D与其最终将连接的蛋白质分离。或者，Q可以是在生理条件下不可裂解的接头。当接头在生理条件下断裂时，它优选可在细胞内条件下裂解。当靶标是细胞内时，优选所述接头基本上对细胞外条件不敏感(即因此将充足剂量的治疗试剂向胞内靶标的递送不受到抑制)。
当Q包含可降解基团时，该基团通常对水解条件敏感，例如它可以是在某一pH值下(例如酸性条件)降解的基团。水解/酸性条件可例如在核内体或溶酶体中。在酸性条件下易于水解的基团的实例包括腙类、缩氨基脲类、硫代缩氨基脲类、顺式乌头酰胺类(cis-acotinic amides)、原酸酯类和缩酮类。易受水解条件影响的基团的实例包括：
在优选的实施方案中，所述接头是或包括：
例如，它可以是或包括：
所述接头Q也可以在还原条件下易于降解。例如，它可以包含二硫键，其在暴露于生物还原剂如硫醇之后可裂解。二硫基团的实例包括：
其中R、R’、R”和R”’分别独立地为氢或C1-4烷基。在优选的实施方案中，所述接头是或包括：
例如，它可以是或包括：
所述接头Q也可包含易于酶解的基团，例如它可易于被蛋白酶(例如溶酶体或核内体蛋白酶)或肽酶裂解。例如，它可包含含有至少一个，例如至少两个或至少三个氨基酸残基(例如Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Ala、Val-Cit、Phe-Lys)的肽基。例如，它可以是或包含具有1至5个(例如2至4个)氨基酸的氨基酸链。易于酶解的基团的另一个实例是：
其中AA代表蛋白酶特异性氨基酸序列，例如Val-Cit。
在优选的实施方案中，接头Q是或包括：
例如，它可以是或包括
所述接头Q可携带单个基团D，或多于一个基团D。可通过使用分支接头Q来并入多个基团D，所述分支接头Q可例如并入天冬氨酸或谷氨酸或类似的残基。这引入下式的分支元件：
其中b是1、2或3，b＝1为天冬氨酸，b＝2为谷氨酸，b＝3代表一个优选的实施方案。上式中每个酰基部分可与基团D偶联。因此，以上分支基团可以并入-CO.CH2-基团中：
如果需要，所述天冬氨酸或谷氨酸或类似的残基可与其他天冬氨酸和/或谷氨酸和/或类似的残基偶联，例如：
等等。
所有上述接头可与聚合物连接，例如通过酰胺键连接。聚合物在下文进行讨论。
包含式I/I’的单元的优选试剂包括：
其中Q和D具有上文给出的含义。
这类特别优选的试剂具有下式：
其中Ar代表任选地取代的芳基，特别是苯基，例如上文列出的那些之一。例如，所述试剂或所述试剂的前体可具有下式：
其中D是-CO2H、-NH2或-OH基团，特别是-CO2H基团，并且每个m和q为1至6的整数，例如2或3。优选m和q其中之一为2，另一个为3。
上述试剂可被官能化以携带任何需要的有效载荷。例如，在式(Ig)/(Ig′)中所示的NH2基团、式(Ih)/(Ih′)中的羧酸基团、或式(Ii)/(Ii′)中的羟基、或式(Ij)中的对应基团D可用于与任何适合的基团反应以连接有效载荷，产生其中NH2基团或羧酸基团成为另一基团D-Q-的一部分的化合物；或上式(If)、(If′)、(Ig)、(Ig′)、(Ih)、(Ih′)、(Ii)、(Ii′)或(Ij)中的芳基/苯基可携带额外的适合的反应性基团，其可用于连接有效载荷。
携带有效载荷的其他优选的缀合试剂具有下式：
D-Q-W-CR2R2′-CR2.L.L′ (IIa)
或
D-Q-(CH＝CH)p-(CH2)2-L (IIIa)
例如
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIb)
其中各取代基具有上文给出的含义和优选含义。
当D或Q并入聚合物时，所述缀合试剂可以是具有WO 99/45964、WO 2005/007197或WO 2010/100430中所述的基本结构的试剂之一，所述文献的内容以引用的方式纳入本文。优选地，含有聚合物的试剂包含上述式I的官能团并且是下式Ii：
其中X和X′之一代表聚合物，另一个代表氢原子；
Q代表连接基团；
W代表吸电子基团，例如酮基、酯基-O-CO-或砜基-SO2-；或者，如果X’代表聚合物，X-Q-W可共同代表吸电子基团，例如氰基；
A代表C1-5亚烷基链或亚烯基链；
B代表键或C1-4亚烷基链或亚烯基链；以及
每个L独立地代表本发明的离去基团，或两个L共同代表本发明的离去基团。
相关的缀合试剂具有通式(Ii′)或(IIa)：
其中X、X′、Q、W、A和L具有通式Ii中给出的含义，m代表0至4；或
X-Q-W-CR4R4′-CR4.L.L′ (IIa)
其中X、Q和W具有通式Ii中给出的含义；以及
每个R4代表氢原子或C1-4烷基，R4′代表氢原子；以及每个L独立地代表离去基团，其中至少一个、优选两个必须是本发明的新的离去基团，或者两个L共同代表本发明的离去基团；或
每个R4代表氢原子或C1-4烷基，L代表本发明的离去基团，并且R4′和L′共同代表键。
式Ii、Ii′和IIa中的各取代基的优选含义如上文所给出。在式Ii和Ii′中，优选X代表聚合物，X′-Q-代表氢原子。与聚合物X的连接可借助于水解不稳定的键或借助于非不稳定的键。
特别优选的聚合缀合试剂具有下式：
用于本发明的方法的另一组优选试剂是基于WO 2010/010324中描述的那些。这些试剂具有以下通式：
X-[Q-W-(CH＝CH)p-(CH2)2-L]q (IIIc)
其中X、Q、W和L具有上文给出的含义和优选含义；p代表0或1至4的整数，优选0；q代表1至8的整数，优选1。式IIIc的特别优选的试剂具有下式：
X-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIId)
在以上通式的优选实施方案中，接头Q或聚合物X可并入有效载荷，例如诊断、治疗或标记试剂。特别有价值的是以上通式的试剂，其中接头Q或聚合物X并入药物分子：这些试剂可例如用于合成抗体-药物缀合物。
本发明的缀合试剂可包含任何需要的有效载荷，例如诊断、治疗或标记试剂，或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。优选包含一种或多种药物分子，例如细胞毒性试剂或毒素。奥瑞斯他汀类(Auristatins)和美登木素类(maytansinoids)是典型的细胞毒性药物。通常优选药物缀合物(特别是抗体药物缀合物)应当包含多拷贝的药物。标记试剂(其应当被理解为包含显像剂)可例如包括放射性核素、荧光剂(例如胺衍生的荧光探针，例如5-二甲基氨基萘-1-(N-(2-氨基乙基))磺胺-丹磺酰乙二胺、Oregon488尸胺(目录编号O-10465，分子探针)、丹磺酰尸胺、N-(2-氨基乙基)-4-氨基-3，6-二硫代-1，8-萘酰亚胺、二钾盐(荧光黄乙二胺)，或罗丹明B乙二胺(目录编号L-2424，分子探针)；或硫醇衍生的荧光探针，例如FL L-胱氨酸(目录编号B-20340，分子探针)。结合剂可例如为螯合剂，例如去铁胺或生物素，其可用于结合任何其他需要的部分，例如上文提及的那些之一，或者结合剂可以是上文所述的反应性基团。
我们共同未决的申请GB 1418984提供了缀合物，其包括通过接头与含有美坦辛(maytansine)的有效载荷连接的蛋白质、肽和/或聚合物，用于形成这样的缀合物的缀合试剂，以及用作有效载荷的含有美坦辛的化合物。含有美坦辛的有效载荷和化合物由至少两个美坦辛部分组成，这两个部分通过不可降解的桥连基彼此连接。这些美坦辛可用作本发明的有效载荷，并且所述试剂构成本发明的一方面。我们共同未决的申请公开了以下内容：
“本发明在第一方面提供了含有美坦辛的化合物，其中至少两个美坦辛部分(D)通过桥连基(Bd)彼此连接。所述桥连基(Bd)在生理条件下是不可降解的。有利地，所述桥连基(Bd)具有至少3个链碳原子并且除3个链碳原子以外任选地包含聚乙二醇间隔基。有利地，在桥连基中没有两个杂原子彼此相邻。有利地，所述桥连基不包含-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分，其中b是1、2或3，R1选自氢原子和C1至C6烷基，X是任意基团。第一方面的含有美坦辛的化合物——其中存在两个美坦辛部分——可由以下式(I)表示：
D-Bd-D (I)
在第二方面，本发明提供了缀合试剂，其包含能够与肽或蛋白质反应的官能团和/或能够与聚合物反应的官能团，有效载荷经由一个或更多个接头与所述官能团连接，其特征在于，所述缀合试剂包括含有美坦辛的有效载荷，该有效载荷由至少两个通过不可降解的桥连基彼此连接的美坦辛部分组成，条件是当缀合试剂包含能够与肽或蛋白质反应的官能团时，将有效载荷连接至能够与肽或蛋白质反应的官能团的接头是可降解的。当缀合试剂包含能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的官能团时，所述官能团包含至少一个在与亲核基团反应时失去的离去基团，含有美坦辛的有效载荷(其由至少两个经由不可降解的桥连基彼此连接的美坦辛部分组成)有利地经由可降解接头连接至能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的官能团。所述缀合试剂任选地包含能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的官能团，所述官能团有利地包含至少一个在与亲核基团反应时失去的离去基团，其特征在于所述缀合试剂包含含有美坦辛的有效载荷，所述有效载荷由至少两个——特别是两个——通过不可降解的桥连基彼此连接的美坦辛部分组成，以及特征在于所述有效载荷通过接头——特别是可降解接头——连接至能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的官能团。所述接头适于将桥连基团连接至能够与伴侣或靶标结合的蛋白质或肽。优选地，含有美坦辛的有效载荷(D2Bd)的桥连基(Bd)连接至可降解接头(Lkd)，该接头包含在生理条件下断裂的可降解基团。所述可降解基团可例如对水解条件，特别是酸性条件敏感；在还原条件下易于降解；或易于被酶解。
第二方面的含有美坦辛的缀合试剂——其中存在两个美坦辛部分——可由下式(II)表示：
D2Bd-Lk-F (II)
其中D2Bd代表含有美坦辛的有效载荷，其由两个通过不可降解的桥连基连接的美坦辛部分组成，Lk是接头，特别是可降解接头(Lkd)，F代表能够与肽或蛋白质反应的官能团和/或能够与聚合物反应的官能团。
本发明还提供了肽、蛋白质和/或聚合物的缀合方法，所述方法包括使所述肽、蛋白质和/或聚合物与本发明第二方面的缀合试剂反应。当缀合试剂与肽或聚合物反应时，所述缀合试剂有利地能够与所述肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应，所述试剂有利地包含至少一个离去基团，其在与所述亲核基团反应时失去。
本发明在第三方面还提供了缀合物，其包含通过接头与含有美坦辛的有效载荷连接的蛋白质、肽和/或聚合物，其特征在于，含有美坦辛的有效载荷由至少两个通过不可降解的桥连基彼此连接的美坦辛部分组成。当缀合物包含蛋白质或肽时，将有效载荷连接至蛋白质或肽的接头有利地是可降解的。本发明的第三方面的缀合物可例如包含含有美坦辛的药物部分(D2Bd)，其通过接头(Lk)(特别是可降解接头(Lkd))连接至能够结合伴侣或靶标的蛋白质或肽(Ab)，其中含有美坦辛的药物部分(D2Bd)包含至少两个通过不可降解的桥连基(Bd)彼此连接的美坦辛部分(D)。本发明第三部分的含有美坦辛的缀合物——其中存在两个美坦辛部分(D)——可由下式(III)表示：
D2Bd-Lk-Ab (III)
所述接头(Lk)有利地为可降解接头(Lkd)，其包含在生理条件下裂解的可降解基团，所述裂解将含有美坦辛的药物部分(D2Bd)——其包含至少两个通过桥连基(Bd)彼此连接的美坦辛部分(D)——与能够结合伴侣或靶标的蛋白质或肽(Ab)分开。所述可降解基团可例如对水解条件，特别是酸性条件敏感；在还原条件下易于降解；或易于被酶解。所述不可降解的桥连基(Bd)不含有下述基团：其在与可降解接头中的可降解基团裂解的相同的条件下易于裂解。
本发明第一方面的含有美坦辛的化合物可例如包含至少两个通过桥连基(Bd)彼此连接的美坦辛部分(特别是两个美坦辛部分)或由至少两个通过桥连基(Bd)彼此连接的美坦辛部分(特别是两个美坦辛部分)组成，所述桥连基具有至少3个链碳原子，特别是至少7个链碳原子，并且除链碳原子以外具有任选的聚乙二醇单元，条件是在所述桥连基中没有两个杂原子彼此相邻，并且条件是所述桥连基不包含-C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-部分，其中b是1、2或3，R1选自氢和C1-C6烷基，X是任意基团。任选地，所述桥连基团并入0至8个羰基，特别是2至8个羰基。所述桥连基团任选地在链中并入0至4个不饱和碳-碳双键；和/或0至4个C3-C10芳基或杂芳基。任选地，所述链中散布有0至11(特别是2至11)个选自N、O和S的链杂原子，条件是两个杂原子彼此不相邻。有利地，所述桥连基中的链碳原子被选自胺、羧基、炔、叠氮化物、羟基或巯基的垂悬(pendant)连接基团取代。有利地，所述桥连基在链中包含至少一个酰胺键。”
使用本发明使得能够有效地缀合范围非常大的有效载荷。对于一些有效载荷而言，使用已知技术所得的产率较低。例如，将蛋白质与不包含PEG的有效载荷缀合是低产的，使用本发明可获得更高的产率。此外，与使用已知技术相比，缀合可明显更快地发生，因此更加高效。
缀合试剂中存在的聚合物
如上文所提及的，所述缀合试剂可用于将低聚物或聚合物(为了方便，本文中共同称为“聚合物”)，特别是水溶性合成聚合物(特别是聚亚烷基二醇)与蛋白质缀合。换言之，所述有效载荷(例如上述通式中的D或X)可以是或可包含聚合物。聚合物可例如为聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯，例如聚丙烯酰吗啉、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺，例如聚羧甲基丙烯酰胺，或HPMA共聚物。此外，所述聚合物可以是易于被酶解或水解的聚合物。这样的聚合物例如包括聚酯、聚缩醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亚氨基碳酸酯和聚酰胺，例如聚氨基酸。聚合物可以是同聚物、无规共聚物或结构确定的共聚物如嵌段共聚物，例如它可以是源自两种或更多种环氧烷的嵌段共聚物，或源自聚环氧烷和聚酯、聚缩醛、聚原酸酯或聚氨基酸的嵌段共聚物。可使用的多官能聚合物包括二乙烯醚-马来酸酐和苯乙烯-马来酸酐的共聚物。
也可使用天然存在的共聚物，例如多糖类，例如壳多糖、葡聚糖、糊精、壳聚糖、淀粉、纤维素、糖原、聚唾液酸、透明质酸，及其衍生物。可将蛋白质用作共聚物。这允许第一蛋白质(例如抗体或抗体片段)与第二蛋白质(例如酶或其他活性蛋白质)或支架蛋白质(例如可结合至生物素化的分子的抗生物素蛋白(avidin))缀合。此外，如果使用包含催化序列的肽，例如针对糖基转移酶的O-聚糖受体位点，这允许并入随后的酶反应的底物或靶标。也可使用聚合物如聚谷氨酸，同样可使用源自天然单体(例如糖类或氨基酸)和合成单体(例如环氧乙烷和甲基丙烯酸)的杂合聚合物。
如果所述聚合物是聚亚烷基二醇，其优选包含C2和/或C3单位，特别是聚乙二醇。聚合物，特别是聚亚烷基二醇，可包含单条线性链，或可具有由许多短链或长链组成的分支结构。所谓的普朗尼克类(Pluronics)是PEG嵌段共聚物的重要一类。这些源自环氧乙烷和环氧丙烷嵌段。可使用取代的或封端的聚亚烷基二醇，例如甲氧基聚乙二醇。
所述聚合物可例如为通过WO 2004/113394中所述的方法产生的梳形聚合物，所述文献的内容以引用的方式纳入本文。例如，所述聚合物可以是具有以下通式的梳形聚合物：
(E)e-(F)f-(G)g
其中
在存在的情况下，E可通过一种或更多种并非如F中定义的烯属不饱和单体的另外的聚合作用而获得；
F可通过多个单体的另外的聚合作用获得，所述单体为线性、分支或星形、取代或未取代的，并且具有烯属不饱和部分；
在存在的情况下，G可通过一种或更多种并非如F中定义的烯属不饱和单体的另外的聚合作用而获得；
e和g是0至500之间的整数；
f是0至1000的整数；
其中存在D、E和F中的至少一个。
可通过任何需要的方式使与蛋白质缀合的聚合物任选地衍生化或官能化。在一个优选的实施方案中，所述聚合物携带例如诊断试剂、治疗试剂或标记试剂，例如上文提及的那些中的一种，或能够结合诊断试剂、治疗试剂或标记试剂的结合剂。反应性基团可连接在所述聚合物的末端或末端基团，或通过垂悬接头沿着聚合物连接；在这种情况下，所述聚合物是例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或马来酸酐共聚物。包含多于一种生物分子的多聚缀合物可产生协同和加成益处。如果需要，可使用常规方法将所述聚合物偶联至固体载体。
所述聚合物的最佳分子量当然取决于预期应用。可使用长链聚合物，例如平均分子量可最高达约75,000，例如最高达50,000、40,000或30,000g/摩尔。例如，平均分子量的范围可为500g/摩尔至约75,000g/摩尔。然而，由离散的PEG链——例如少至2个重复单元、例如2至50个重复单元——组成的非常小的低聚物适用于一些应用，并且存在于本发明的一个优选实施方案中。例如，可使用包含2至48，例如2至36，例如2至24个单元的聚合物。例如可使用具有12、20、24、36、40或48个重复单元的支链或支链PEG。当待缀合的蛋白质预期将离开循环并渗透到组织中时，例如用于治疗由恶性病、感染或自身免疫性疾病或由外伤引起的炎症时，使用最高达30,000g/摩尔的较低分子量的聚合物可能是有利的。对于聚合物-蛋白质缀合物预期将留在循环中的应用，使用更高分子量的聚合物可能是有利的，所述聚合物的分子量范围例如为20,000-75,000g/摩尔。
应当选择所使用的聚合物，以使缀合物可溶于溶剂介质中而发挥其预期用途。对于生物应用而言，特别是对于对哺乳动物进行临床治疗性给药的诊断应用和治疗应用而言，所述缀合物可溶于水性介质中。
优选所述聚合物是合成聚合物，并且优选它是水溶性聚合物。对于许多应用，特别优选使用水溶性聚乙二醇。
我们共同未决的申请GB 1418986涉及特定结构的包含PEG的接头的用途，这些接头可用于本发明。该申请公开了以下内容：
“本发明提供了蛋白质或肽与治疗、诊断或标记试剂的缀合物，所述缀合物包含蛋白质或肽连接部分以及聚乙二醇部分；其中所述蛋白质或肽连接部分具有以下通式：
其中Pr代表所述蛋白质或肽，每个Nu代表所述蛋白质或肽中存在的或与所述蛋白质或肽连接的亲核基团，A和B各自独立地代表C1-4亚烷基或亚烯基链，W′代表吸电子基团或通过吸电子基团的还原而获得的基团；其中所述聚乙二醇部分是或包含垂悬的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链具有式-CH2CH2OR的末端基团，其中R代表氢原子烷基(例如C1-4烷基，特别是甲基)、或任选取代的芳基，特别是苯基，特别是未取代的苯基。
本发明还提供了能够与蛋白质或肽反应并且包含治疗、诊断或标记试剂和聚乙二醇部分的缀合试剂；所述缀合试剂包含下式的基团：
其中W代表吸电子基团，A和B具有以上所述的含义，m是0至4，每个L独立地代表离去基团；并且其中所述聚乙二醇部分是或包含垂悬的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链具有式-CH2CH2OR的末端基团，其中R代表氢原子、烷基(例如C1-4烷基，特别是甲基)、或任选取代的芳基，特别是苯基，特别是未取代的苯基。
本发明还提供了用于制备本发明的缀合物的方法，所述方法包括使蛋白质或肽与本发明的缀合试剂反应。
本发明的缀合物可由下式示意性地表示：
其中D代表治疗、诊断或标记试剂，F′代表式I的基团，PEG代表垂悬的聚乙二醇链，其具有式-CH2CH2OR的末端基团。
本发明的试剂可由下式示意性地表示：
其中D代表治疗、诊断或标记时间，F代表式II或II′的基团，PEG代表垂悬的聚乙二醇链，其具有式-CH2CH2OR的末端基团。官能团F能够与蛋白质或肽中存在的两个亲核基团反应，如下文所解释的。
本发明的缀合物和试剂的聚乙二醇(PEG)部分是或包含垂悬的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链具有式-CH2CH2OR的末端基团，其中R代表氢原子、烷基(例如C1-4烷基，特别是甲基)、或任选取代的芳基，特别是苯基，特别是未取代的苯基。优选地，R是甲基或氢原子。
PEG部分的总体大小当然取决于预期的应用。对于一些应用，可使用高分子量PEG，例如平均分子量可最高达约75,000，例如最高达50,000、40,000或30,000g/摩尔。例如，平均分子量可在500g/摩尔至约75,000的范围。然而，对于一些应用，可优选较小的PEG部分。
在一个优选的实施方案中，PEG部分中的全部PEG存在于垂悬的PEG链中。在另一个实施方案中，PEG也可存在于分子的骨架中，这将在下文中详细讨论。
对于PEG部分，垂悬的PEG链的大小将取决于预期应用。对于一些应用，可使用高分子量的垂悬PEG链，例如平均分子量可最高达约75,000，例如最高达50,000、40,000或30,000g/摩尔。例如，平均分子量可在500g/摩尔至约75,000的范围。然而，对于一些应用，可使用较小的垂悬PEG链。例如，所述PEG链可具有最高达3,000g/摩尔的分子量。然而，由离散的PEG链——例如少至2个重复单元、例如2至50个重复单元——组成的非常小的低聚物适用于一些应用，并且作为所述PEG链存在于本发明的一个优选实施方案中。所述垂悬的PEG链可以是直链的或支链的。例如可使用PEG链，例如具有12、20、24、36、40或48个重复单元的直链或支链PEG链。”
缀合方法
包含本发明的离去基团的缀合试剂可与蛋白质或肽反应以形成缀合物，这样的反应构成本发明的另一方面。在本发明该方面的优选实施方案中，具有上述结构I、I′、II或III(包括全部优选的亚结构)之一的缀合试剂与蛋白质或肽反应以形成缀合物。使用这些缀合试剂之一的缀合方法的直接产物是包含吸电子基团W的缀合物。然而，所述缀合物方法在适当的条件下是可逆的。这对于一些应用——例如需要快速释放蛋白质的情况——可能是期望的，但是对于其他应用，可能不期望快速释放蛋白质。因此，可能需要通过吸电子基团W的还原以产生阻止蛋白质释放的基团而稳定缀合物。因此，上述方法可包括另外的任选步骤：还原缀合物中的吸电子基团W。特别优选将硼氢化物，例如硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾或三乙酰氧基硼氢化钠用作还原剂。其他可使用的还原剂包括例如氯化锡(II)，醇盐例如烷醇铝(aluminium alkoxide)，以及氢化铝锂。
因此，例如，含有酮基的基团W可被还原为含有CH(OH)的基团；醚基CH.OR可通过羟基与醚化剂的反应而获得；酯基CH.O.C(O)R可通过羟基与酰化剂的反应而获得；胺基CH.NH2、CH.NHR或CH.NR2可通过还原性胺化作用由酮制得；或酰胺CH.NHC(O)R或CH.N(C(O)R)2可通过胺的酰化作用而形成。砜可被还原为亚砜、硫化物或硫醚。氰基可被还原为胺基。
使用上述式I或II的缀合试剂的关键特征在于，α-亚甲基离去基团和双键与吸电子官能团交叉缀合，所述吸电子官能团充当Michael活化部分。如果所述离去基团在交叉官能性试剂中易于被消除而非直接置换，并且所述吸电子基团是Michael反应的适合的活化部分，则通过连续Michael反应和逆Michael反应可相继发生分子内双烷基化。所述离去基团用于遮蔽潜在的缀合双键，该缀合双键直到第一烷基化作用发生之后才暴露以产生式I′的试剂，并且双烷基化产生自相继且相互影响的Michael反应和逆Michael反应。交叉官能性烷化剂可包含缀合至双键或位于离去基团和吸电子基团之间的多重键。
当与蛋白质的结合是经由来自蛋白质中二硫键的两个硫原子而进行时，所述方法可通过原位还原二硫键，之后还原后的产物与具有结构I或II之一的试剂反应来进行。优选地，在引入缀合试剂之前，将二硫键还原并例如通过缓冲液交换来除去任何过量的还原剂。可使用常规方法，例如采用二硫苏糖醇、巯基乙醇或三羧乙基膦来还原二硫键。
可在与已知缀合方法的条件(包括以上提及的现有技术中公开的条件)类似的条件下进行缀合反应。例如，当使用结构I、I′或II之一的缀合试剂时，本发明的缀合反应可在与WO 2005/007197，WO 2009/047500、WO 2014/064423和WO 2014/064424中所述的那些条件类似的反应条件下进行。所述方法例如可在溶剂或溶剂混合物中进行，其中所有反应物都可溶于所述溶剂或溶剂混合物。例如，可在水性反应介质中使蛋白质与聚合物缀合试剂直接反应。根据亲核基团的pH要求，该反应介质也可以是缓冲的。反应的最佳pH通常为至少4.5，通常为约5.0至约8.5，优选约6.0至7.5。最佳反应条件当然取决于所使用的具体反应物。
当使用水性反应介质时，3-40℃的反应温度通常是适合的。在有机介质(例如THF、乙酸乙酯、丙酮)中进行的反应通常在最高达室温的温度下进行。在一个优选的实施方案中，反应在水性缓冲液中进行，所述水性缓冲页可包含部分有机溶剂，例如最高达20体积％的有机溶剂，通常为5-20体积％的有机溶剂。
使用化学计量相当或稍微过量的缀合试剂可有效地缀合蛋白质。然而，也可使用过量的缀合试剂来进行缀合反应，这对于一些蛋白质而言可能是期望的。在随后的缀合物纯化过程中，过量的试剂可通过常规方法例如离子交换或HPLC色谱法轻易地除去。
当然，当蛋白质包含足够多适合的连接点时，多于一种缀合试剂与蛋白质缀合是可能的。例如，在包含两个不同的二硫键的蛋白质中，或在包含一个二硫键并且还携带多聚组氨酸标记的蛋白质中，每分子的蛋白质可缀合两分子的所述试剂。
蛋白质
使用本发明的方法可缀合包含亲核基团的任何期望的肽或蛋白质。适合的蛋白质包括例如肽、多肽、抗体、抗体片段、酶、细胞因子、趋化因子、受体、血液因子、肽激素、毒素、转录蛋白或多亚基蛋白。
以下给出了可使用本发明来缀合的一些具体蛋白质。酶包括碳水化合物特异性酶、蛋白水解酶等，例如US 4,179,337公开的氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。所关注的特异性酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺苷脱氨酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡糖醛酸糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖苷酸酶和谷氨酰胺酶。
血液蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、因子VII、因子VIII或因子IX、von Willebrand因子、胰岛素、ACTH、胰高血糖素、生长激素抑制素、生长激素、胸腺素、甲状旁腺素、色素激素、生长调节素、红细胞生成素、黄体化激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、白细胞介素、干扰素(例如IFN-α或IFN-β)、集落刺激因子、血红蛋白、细胞因子、抗体、抗体片段、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素和组织纤维蛋白溶酶原激活剂。
其他所关注的蛋白质是Dreborg et al Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Syst.(1990)6315-365中公开的变应原蛋白，其在与聚合物如聚环氧烷缀合时具有降低的变应原性，因此适合用作耐受诱导剂。所公开的变应原为豚草抗原E、蜜蜂毒液、螨变应原等。
糖多肽如免疫球蛋白、卵白蛋白、脂肪酶、葡糖脑苷脂酶、凝集素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂和糖基化的白细胞介素、干扰素和集落刺激因子是所关注的蛋白，免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段同样是所关注的蛋白。
特别关注的蛋白质是在临床医学中用于诊断和治疗目的的受体和配体结合蛋白，以及抗体和抗体片段。所述结合蛋白/抗体可与诊断、治疗或标记试剂(例如放射性同位素或细胞毒性/抗感染药物)缀合。特别优选的是本发明用于制备抗体-药物缀合物的用途，其中所述药物是细胞毒性药物，例如奥瑞斯他汀或美登木素。
如果需要，所述蛋白质可以是衍生的或官能化的。特别地，在缀合之前，所述蛋白质(例如天然蛋白质)可与多种保护基团反应以保护其上的敏感基团；或可使用本发明的方法或使用替代方法使所述蛋白质先与一种或更多种聚合物或其他分子缀合。在本发明的一个实施方案中，所述蛋白质包含多聚组氨酸标记，本发明的缀合试剂可靶向该标记。
在本发明的一方面——其中缀合试剂能够与肽或蛋白质中存在的两个亲核基团反应，所述试剂可如以下条款中定义。
1.一种能够与肽或蛋白质中存在的两个亲核基团反应的缀合试剂，其包含在与所述亲核基团反应时失去的离去基团，其中所述离去基团在所述缀合试剂内具有两个连接位点，并且包含-(CH2CH2O)n1部分，其中n1是2或更大的数值。
2.如条款1中所定义的缀合试剂，其中n1为2至5，或5至9。
3.如条款1或条款2中所定义的缀合试剂，其中-(CH2CH2O)n1-部分的分子量为最高达5kDa。
4.如前述条款中任一项所定义的试剂，其中所述离去基团具有式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-或-N+R2R3-P-N+R2R3-，其中P是包含-(CH2CH2O)n1-部分的基团，并且R2和R3各自独立地代表氢原子或C1-4烷基或基团P。
5.如条款1至4中任一项所定义的试剂，其中所述离去基团是-S-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-S-、-O-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-O-、-SO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-OSO2-、-N+R2R3-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-N+R2R3-，或下式的基团之一：
其中R1是封端基团，并且R2和R3各自独立地代表氢原子或C1-4烷基。
6.如条款5中所定义的试剂，其中所述离去基团是-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-。
7.如条款5中所定义的试剂，其中R1代表氢原子、C1-4烷基、任选取代的芳基，或式-CH2CH2CO2H或-CH2CH2NH2的基团。
8.如前述条款中任一项所定义的试剂，其携带有效载荷，所述有效载荷是诊断、治疗或标记试剂或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。
9.如条款1至8中任一项所定义的试剂，其包含官能团I、I′、II或III：
其中W代表吸电子基团；A代表C1-5亚烷基链或亚烯基链；B代表键或C1-4亚烷基链或亚烯基链；两个L共同代表离去基团，所述离去基团包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大的数值；或
～W-CR4R4′-CR4.L.L′ (II)
其中W具有通式I中给出的含义，并且(i)每个R4代表氢原子或C1-4烷基，R4′代表氢原子，L和L′共同代表离去基团，所述离去基团包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大的数值。
10.如条款9中所定义的试剂，其具有以下通式：
或
D-Q-W-CR2R2′-CR2.L.L′ (IIa)
其中Q代表连接基团，D代表有效载荷，其为诊断、治疗或标记试剂或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。
11.如条款10中所定义的试剂，其包含以下官能团：
12.如条款11中所定义的试剂，其具有以下通式：
其中Q代表连接基团，D代表有效载荷，其为诊断、治疗或标记试剂或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。
13.如条款10或条款12中所定义的试剂，其中D-Q包含药物或聚合物，或包含药物和聚合物两者。
14.如条款13中所定义的试剂，其中如果存在药物，则其为细胞毒性药物，并且如果存在聚合物，则其为聚乙二醇。
附图说明
图1示出了实施例17的结果。
图2示出了实施例18的结果。
图3示出了实施例19的结果。
图4示出了实施例20的结果。
图5、6和7示出了实施例21的结果。
图8示出了实施例22的结果。
图9示出了实施例25的结果。
图10示出了在2小时反应时间之后获得的实施例49的结果。
图11示出了在4小时反应时间之后获得的实施例49的结果。
以下实施例说明本发明。
实施例1：包含7个重复单元乙二醇离去基团的缀合试剂2的合成
步骤1：化合物1的合成
向4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸(1.50g，Nature Protocols，2006，1(54)，2241-2252)于二甲基甲酰胺(DMF，70mL)中的搅拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)(3.20g，Iris Biotech)和三乙胺(2.50mL)。在室温下，在惰性氮气气氛下搅拌所得的反应混合物。19h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(2.4mL)中并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清无色油状的4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-硫-七(乙二醇)]乙酰基]-苯甲酸化合物1(1.77g，66％)m/z[M+H+]901。
步骤2：试剂2的合成
在室温下向1(1.32g)于甲醇∶水(18mL，9∶1v/v)的搅拌溶液中添加(2.70g)。2.5h之后，真空除去挥发物并用乙腈(2×15mL)共沸除去水。将所得的残余物溶于二氯甲烷(3×10mL)中，过滤通过硫酸镁柱并用二氯甲烷冲洗(2×7mL)。将洗脱液和冲洗液合并，并真空除去挥发物以生成稠的澄清浅黄色油(1.29g，92％)。将一部分残余物(700mg)溶于水∶乙腈(1.50mL，3∶1v/v)中，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清无色油状的4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸试剂2(524mg，68％)m/z[M+H+]965。
实施例2：包含7个重复单元乙二醇离去基团和10kDa PEG的PEG化试剂3的合成
在氩气下，将试剂2(14mg)于DMF(600μL)中的搅拌溶液冷却至0℃，并加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)(5.5mg)和N-甲基吗啉(NMM)(1.5μL)。当加入10kDa H2N-PEG-OMe(132mg)于二氯甲烷(600μL)中的溶液时，在0℃搅拌溶液0.5h。在0℃搅拌所得溶液5min后加入另外的HATU(5.5mg)和NMM(1.5μL)。在0℃下搅拌反应溶液2h后，将溶液升温至室温。22h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，2.0mL)，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色粉末状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(10kDa)OMe试剂3(72mg，53％)。1H NMR(600MHz，)3.35(6H)，3.36(3H)，3.40(4H)，3.46-3.59(10H)，3.56-3.70(1065H，m，PEG)，3.71-3.77(7H)，3.85-3.91(4H)，4.76(1H)，8.00(2H)，8.18(2H)。
实施例3：包含7个重复单元乙二醇离去基团和罗丹明B染料的荧光缀合试剂4的合成
将试剂2(38mg)和丽丝胺罗丹明B乙二胺(20mg，Invitrogen)溶于1.5mL无水DMF，并冷却至0℃。加入HATU(15mg)并搅拌溶液2min，然后加入NMM(8.7μL)。在0℃下搅拌反应混合物2h。在高真空下将粗反应产物部分浓缩3h，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成紫色固体状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-罗丹明B试剂4(43mg，69％)。m/z[M+H]+(1549，80％)，[M+2H]2+(783，100％).1H NMR(600MHz；)1.45(9H，s)，2.40-2.45(8H，m)，3.40-3.46(2H，m)，3.52-3.66(m，PEG和CH2-Ts)，4.27(1H，q)，8.01(2H，d)，8.08(1H，dd)，8.15(2H，d)，8.66(1H，d)。
实施例4：包含7个重复单元乙二醇离去基团和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂5的合成
向具有以下结构的val-cit-PAB-MMAE的TFA盐(25.0mg)中加入试剂2(15.6mg)于DMF(1.5mL)中的溶液，并在室温下在惰性氮气气氛下搅拌5min。
将混合物冷却到0℃，并每20min添加HATU(6.1mg)和NMM(1.8μL)的等分部分，共添加5次。1.5h之后，使反应混合物升温至室温。2h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，0.6mL)中，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色粉末状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE试剂5(22.4mg，68％)m/z[M+2H2+]1035。
实施例5：包含7个重复单元乙二醇离去基团和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂6的合成
步骤1：化合物7的合成
制备HATU(394mg)于DMF(4ml)中的储备溶液和NMM(114μL)于DMF(4mL)中的储备溶液。向试剂2(250mg)的DMF(10mL)溶液中添加H2N-dPEG-(24u)-(CO2 tBu)(405mg)。将混合物用DMF(5mL)稀释并在室温下在惰性氮气气氛下搅拌5min。将混合物冷却至0℃，并每10min添加HATU(1ml)和NMM(1ml)的等分部分，共添加4次。40min之后，使反应混合物升温至室温。2.5h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(2mL)中，并通过反相C18柱色谱法分离产物，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清的淡黄色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯化合物7(422mg，76％)m/z[M-(tBu)+3H3+]698.46Da。
步骤2：化合物8的合成
将试剂7(382mg)溶于甲酸(5mL)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌反应混合物1h。通过冷冻干燥法除去甲酸。将所得固体溶于水(1mL)，并通过反相C18柱色谱法分离产物，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)酸化合物8(194mg，53％)m/z[M+3H3+]698.33Da。
步骤3：试剂6的合成
将试剂8(15mg)溶于DMF(0.2mL)并添加于DMF(0.2mL)中的val-cit-PAB-MMAE.TFA盐(11mg)。将混合物冷却至0℃并在惰性气氛下搅拌。依次添加HATU(2.7mg)和NMM(0.7mg)，在0℃搅拌反应混合物。每20min添加额外量的HATU(2.7mg)和NMM(0.4mg)，共添加5次，在0℃下搅拌反应混合物。1h 40min之后，将反应混合物冷却至-20℃，保持16h。将反应溶液用水(0.4mL)淬灭并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE试剂6(7.9mg，34％)m/z[M+2H]2+1599.98。
实施例6：包含7个重复单元乙二醇离去基团和美登木素细胞毒性有效载荷的缀合试剂9的合成
向具有以下结构的val-ala-PAB-AHX-DM1(5.2mg)于无水DMF(400μL)的搅拌溶液中添加试剂2(6mg)并在0℃下搅拌5min。
依次添加HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃搅拌反应混合物。20min之后，添加额外量的HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃下搅拌反应混合物。2.5h之后，将反应混合物冷却至-20℃，保持16h。将反应溶液真空浓缩，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-val-ala-PAB-AHX-DM1试剂9(6.5mg，74％)m/z[M+H+]2030。
实施例7：包含7个重复单元乙二醇离去基团和美登木素细胞毒性有效载荷的缀合试剂10的合成
向val-ala-PAB-AHX-DM1(5.0mg)于无水DMF(400μL)的搅拌溶液中添加试剂8(13mg)，并在0℃下搅拌5min。依次添加HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃搅拌反应混合物。20min之后，添加额外量的HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，在0℃下搅拌反应混合物。2.5h之后，将反应混合物冷却至-20℃，保持16h。将反应溶液真空浓缩，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的黄色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1试剂10(5.6mg，41％)m/z[M-OH+H]2+1571.5。
实施例8：分别包含2个重复单元、12个重复单元、1kDa，2kDa或5kDa多聚乙二醇离去基团和美登木素细胞毒性有效载荷的缀合试剂12、13、14和15的合成
以与实施例7中所描述的试剂10的合成方法类似的方法，分别使用硫醇2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇、α-甲氧基-ω-巯基十二(乙二醇)、α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇1kDa)、α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇2kDa)和α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇5kDa)替代实施例1中用于合成化合物1的α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)来合成美登木素试剂双-mPEG(12u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 12、双-mPEG(1kDa)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 13、双-mPEG(2kDa)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 14和双-mPEG(5kDa)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1 15。
实施例9：分别包含2个重复单元、12个重复单元、1kDa，2kDa或5kDa多聚乙二醇离去基团和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂17、18、19和20的合成
以与实施例5中所描述的试剂6的合成方法类似的方法，分别使用硫醇2-(2-甲氧基乙氧基)乙硫醇、α-甲氧基-ω-巯基十二(乙二醇)、α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇1kDa)、α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇2kDa)和α-甲氧基-ω-巯基聚(乙二醇5kDa)替代实施例1中用于合成化合物1的α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)来合成奥瑞斯他汀试剂双-mPEG(12u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 17、双-mPEG(1kDa)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 18、双-mPEG(2kDa)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE 19和双-mPEG(5kDa）砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE20。
实施例10：包含美登木素细胞毒性有效载荷的缀合试剂21的合成
步骤1：化合物22的合成
在氩气气氛下将Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)于DMF(2mL)中的溶液冷却至0℃，并加入(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)(41mg)，随后加入NH2-PEG(24u)-OMe(100mg)和N，N-二异丙基乙胺(19μL)。使溶液升温至室温，22h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶解于二氯甲烷(1mL)并通过正相柱色谱法纯化，所述柱用二氯甲烷∶甲醇(100∶0v/v至80∶20v/v)洗脱。真空除去有机溶剂以生成无色油状的FmocL-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](84mg，67％)。在氩气气氛下将哌啶(49μL)加入化合物Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](74mg)于DMF(2mL)中的溶液中，并在室温下搅拌所得溶液22h，然后真空除去挥发物。将所得残余物用己烷(3×0.7mL)研磨。每次将有机溶剂倒出并真空干燥所得残余物以生成白色固体状的L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe]化合物22(61mg，97％)。m/z[M+H]+(1097，10％)，[M+2H]2+(1035，100％)。
步骤2：化合物23的合成
在氩气气氛下将化合物22(26.6mg)于DMF(550μL)中的溶液冷却至0℃，向其中加入HATU(10.5mg)并在0℃下搅拌溶液0.5h。向该溶液中加入试剂2(32mg)于DMF(550μL)中的溶液。在0℃下搅拌所得溶液5min，然后加入NMM(2.9μL)和HATU(10.5mg)。在0℃下搅拌反应溶液2h，然后使其升温至室温并再搅拌3.5h。然后真空除去挥发物。将所得残余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，1.2ml)，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30.5mg，55％)。1H NMR(400MHz，)8.19(2H，d)，8.04(2H，d)，4.83-4.71(1H，m)，4.58(1H，dd，)，3.92-3.83(6H，m)，3.78-3.56(140H，m)，3.57-3.51(6H，m)，3.40(4H，dd)，3.36(3H，s)，3.35(6H，s)，2.41(2H，t)，2.24-2.13(1H，m)，2.10-1.98(1H，m)，1.45(9H，s)；m/z[M+Na]+(2243，50％)，[M+H]+(2221，40％)，[M+Na+2H]3+(747，100％)。在氩气气氛下将双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe](30mg)于二氯甲烷(2mL)中的溶液冷却至0℃，然后向其中加入三氟乙酸(500μL)并搅拌所得溶液1.5h。使反应混合物升温至室温并再搅拌1h。然后真空除去挥发物。将所得残余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，0.6mL)，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]化合物23(20mg，68％)。1H NMR(400MHz，)8.19(2H，d)，8.04(2H，d)，4.81-4.72(1H，m)，4.59(1H，dd)，3.92-3.84(6H，m)，3.67-3.50(146H，m)，3.40(4H，dd)，3.36(3H，s)，3.35(6H，s)，2.48(2H，t)，2.26-2.15(1H，m)，2.15-2.03(1H，m)；m/z[M+H]+(2165，55％)，[M+2H]2+(1083，60％)，[M+2H+Na]3+(729，100％)。
步骤3：试剂21的合成
在氩气气氛下将化合物23(15.0mg)于DMF(600μL)中的溶液冷却至0℃。加入HATU(2.9mg)并在0℃下搅拌溶液0.5h。向该溶液中加入已经在室温下搅拌了0.5h的val-ala-PAB-AHX-DM1(9.2mg)和NMM(0.8μL)于DMF(600μL)中的溶液。5min之后，加入额外量的HATU(2.9mg)和NMM(0.8μL)，并在0℃下搅拌反应混合物。3h之后，添加额外量的HATU(0.7mg)并在0℃下搅拌反应混合物。再过2h之后，将反应混合物贮存于-20℃下16h。将反应溶液真空浓缩并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[val-ala-PAB-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]化合物21(14.3mg，64％)。1H NMR(600MHz，)(选择的特征信号)5.69(1H，dd，)，6.59(1H，dd)，6.68(1H，s)，6.69(1H，d)，7.10(1H，s)，7.28(2H，d)，7.57(2H，d)，8.01(2H，d)，8.16(2H，d)；m/z[M-AHX-DM1]+(2422，40％)。
实施例11A：包含7个重复单元多聚离去基团和美登木素细胞毒性有效载荷的缀合试剂24的合成
在氩气气氛下将化合物23(12.4mg)于DMF(500μL)中的溶液冷却到0℃。加入HATU(2.4mg)并在0℃下搅拌溶液0.5h。向该溶液加入已经在室温下搅拌了0.5小时的val-cit-AHX-DM1(以与化合物50的制备方法类似的方法，使用AHX-DM1代替化合物47，6.4mg而制备)和NMM(0.7μL)于DMF(500μL)中的溶液。5min之后，加入额外量的HATU(1.2mg)和NMM(0.4μL)并在室温下搅拌反应混合物。2h之后，加入额外量的HATU(1.2mg)和NMM(0.4μL)并在室温下搅拌反应混合物。再过1h之后，将反应混合物真空浓缩并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[val-cit-AHX-DM1]-[PEG(24u)-OMe]24(9.6mg，53％)。m/z[M-H2O]+(3148，8％)，[M-H2O]2+(1575，40％)，[M-H2O]3+(1050，100％)，1036[M-NHCO-H2O]3+。
实施例11B：包含奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂25的合成
以与实施例11A中试剂24的制备方法类似的方法，由化合物23和val-cit-PAB-MMAE TFA盐来合成试剂25。双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(24u)-OMe]25是作为无色油状物而分离的。m/z[M+H]+(3270，12％)，[M+2H]2+(1636，50％)，[M+3H]3+(1091，100％)。
实施例12：包含7个重复单元聚乙二醇离去基团和去铁胺的用于成像和螯合应用的缀合试剂27的合成
步骤1：化合物28的合成
在室温下在氩气气氛中向21-(Boc-氨基)-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酸(50mg，Sigma-Aldrich)于DMF(2mL)中的溶液中加入(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)(73mg)，并搅拌溶液0.5h。向该溶液中加入已经在室温下搅拌了0.5h的去铁胺甲磺酸盐(87mg，Sigma-Aldrich)和N，N-二异丙基乙胺(29μL)于DMF(2mL)中的溶液。24h之后，将反应溶液真空浓缩，然后通过反相C18柱色谱法直接纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)－－水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)－－乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至50∶50v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的BocNH-PEG(6u)-去铁胺化合物28(50mg，46％)m/z[M+Na]+(1019，50％)，[M+H]+(997，95％)，[M+2H]2+(499，100％)；1H NMR(600MHz；MeOH-δ4)1.28-1.38(7H，m)，1.43(9H，s)，1.49-1.55(6H，m)，1.60-1.67(5H，m)，2.09(3H，s)，2.41-2.47(6H，m)，2.76(4H，t)，3.14-3.19(6H，m)，3.21(2H，t)，3.50(2H，t)，3.57-3.65(27H，m)，3.70-3.73(2H，t)。
步骤2：化合物29的合成
在氩气气氛下将化合物28(49mg)于二氯甲烷(DCM)(3mL)中的溶液冷却至0℃并加入三氟乙酸(TFA)(750μL)。使溶液升温至室温。1h之后，将甲苯(2mL)加到反应混合物中，并真空除去挥发物。将所得残余物溶于缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸(2mL)，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以除去任何残留的TFA并生成白色固体状的NH2-PEG(6u)-去铁胺化合物29(44mg，定量收率)，其用于下一步而无需任何进一步的纯化：m/z[M+H]+(897，100％)，[M+2H]2+(449，100％)。
步骤3：试剂27的合成
在氩气气氛下将试剂2(17mg)于DMF(750μL)中的溶液冷却至0℃，然后加入HATU(8.0mg)，并在0℃下搅拌溶液0.5h。向该溶液中加入化合物29(23mg)和NMM(2.1μL)于DMF(750μL)中的溶液并在0℃下搅拌反应混合物。历时4h加入额外量的试剂2、HATU和NMM。再过15h之后，将反应溶液真空浓缩，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至50∶50v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(6u)-去铁胺试剂27(20.6mg，49％)m/z[M+H]+(1844，95％)，[M+2H]2+(922，100％)，[M+3H]3+(615，100％)。
实施例13(比较)：包含甲苯磺酰基离去基团和去铁胺的用于成像和螯合应用的缀合试剂30的合成
向化合物29(43mg)于DMF(2.5mL)中的溶液中加入NMM(6μL)并在室温下搅拌0.5h。向该溶液中加入已知的4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸(29mg，NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)于DMF(700μL)中的溶液。1h、2h、19h、23h和25h之后向反应混合物中加入额外的NMM(共15.6μL)。26h之后，将反应溶液真空浓缩，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-甲苯砜-丙酰基-苯甲酰胺PEG(6u)-去铁胺试剂30(19mg，29％)m/z[M+H]+(1379，98％)，[M+2H]2+(690，100％)；1H NMR(600MHz；MeOH-δ4)1.28-1.36(7H，m)，1.48-1.55(6H，m)，1.59-1.65(5H，m)，2.09(3H，s)，2.40-2.46(6H，m)，2.50(6H，s)，2.74-2.78(4H，m)，3.14-3.17(5H，m)，3.55-3.61(23H，m)，3.62-3.70(12H，m)，3.75-3.80(2H，m)，4.09-4.14(1H，m)，7.44(4H，d)，7.55(2H，d)，7.62(4H，d)，7.82(2H，d)。
实施例14：包含六PEG-二砜离去基团和美登木素细胞毒性有效载荷的缀合试剂31的合成
步骤1：化合物32的合成
向4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸(542mg，Nature Protocols，2006，1(54)，2241-2252)于DMF(40mL)中的搅拌溶液中加入六(乙二醇)二硫醇(400μL)和Cs2CO3(2.4g)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得的反应混合物。40h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(4mL)中，并且通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的六PEG-二硫醚丙酰基-苯甲酸化合物32(180mg，33.1％)m/z[M+Na+]525.1HNMR(600MHz，CDCl3)2.72-2.78(4H，m，CH2-S)，2.95-3.04(4H，m)，3.65-3.72(18H，m，PEG)，4.76(1H，m)，8.11(2H，d)，8.21(2H，d)。
步骤2：化合物33的合成
以与实施例1中所描述的试剂2的制备方法类似的方法，使用化合物32替代化合物1来合成六PEG-二砜丙酰基苯甲酸化合物33。
步骤3：化合物34的合成
以与实施例5中所描述的化合物7的制备方法类似的方法，使用化合物33替代化合物2来合成六PEG-二砜丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯化合物34。
步骤4：化合物35的合成
以与实施例5中所描述的化合物8的制备方法类似的方法，使用化合物34替代化合物7来合成六PEG-二砜丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-酸化合物35。
步骤5：试剂31的合成
以与实施例7中所描述的试剂10的制备方法类似的方法，使用化合物35替代化合物8来合成美登木素试剂六PEG-二砜丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM131。
实施例15(比较)：包含甲苯磺酰基离去基团和罗丹明B染料的缀合试剂36的合成
步骤1：化合物37的合成
以与实施例5中所描述的试剂8的制备方法类似的方法，使用已知的4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸(Nature Protocols，2006，1(54)，2241-2252)替代试剂2来合成4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(12u)-酸化合物37。
步骤2：试剂36的合成
以与实施例3中所描述的试剂4的制备方法类似的方法，使用化合物37替代试剂2来合成4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(12u)-罗丹明B试剂36。
实施例16：包含7个重复单元多聚离去基团、芳基离去基团和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂38的合成
步骤1：化合物39的合成
向已知的4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酸(200mg，NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)于二甲基甲酰胺(DMF，8mL)中的搅拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)(142mg)和NMM(264μL)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。19h之后，真空除去挥发物，并将所得残余物溶于乙腈(800μL)，并且通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清的无色油状的单-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-单-(甲苯磺酰基甲基)丙酰基)苯甲酸化合物39(132mg，47％)m/z[M+H+]701.1。
步骤2：试剂40的合成
在室温下向化合物39(116mg)于甲醇∶水(5mL，9∶1v/v)中的搅拌溶液中加入(305mg)。75min之后，真空除去挥发物并用乙腈(3×15mL)共沸除去水。将所得残余物溶于二氯甲烷(3×10mL)，过滤通过硫酸镁柱并用二氯甲烷(2×7mL)冲洗。将洗脱液和冲洗液合并，真空除去挥发物以生成稠的澄清浅黄色油。将残余物溶于水∶乙腈(800μL，1∶4v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的澄清的无色油状的4-(3-((2-七(乙二醇)甲氧基乙基)磺酰基)-2-(甲苯磺酰基甲基)丙酰基)苯甲酸化合物40(103mg，78％)m/z[M+H+]733.2。
步骤3：试剂38的合成
向val-cit-PAB-MMAE.TFA盐(25.0mg)中加入试剂40(11.8mg)于DMF(1.5mL)中的溶液，并在室温下在惰性气氛下搅拌5min。将混合物冷却至0℃，并在5h的时间内加入HATU(6.1mg)和NMM(1.8μL)的等分部分，共添加5次。1.5h之后，使反应混合物升温至室温。6h之后，真空除去挥发物，并将所得残余物溶于水和乙腈(v/v；1/4，0.6mL)，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)－－水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成亮白粉末状的单-mPEG(7u)砜-单-(甲苯磺酰基甲基丙酰基-苯甲酰胺-)-val-cit-PAB-MMAE试剂38(13.0mg，44％)m/z[M+2H2+]919.3。
实施例17：使用试剂3，在经还原的Fab二硫键处的PEG化，以及与已知PEG化试剂4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(10kDa)-OMe 41(NatureProtocols，2006，1(54)，2241-2252)的比较
通过添加50μL 0.5M二硫苏糖醇(DTT)水溶液并在22℃孵育1h来还原Fab(5.71mg，于PBS中2.33mg/mL，通过曲妥珠单抗的木瓜蛋白酶消化而产生)的链间二硫键。然后使用PD10柱除去还原剂，所述PD10柱用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、20mM EDTA平衡，并且用相同的缓冲液将经还原的Fab进一步稀释至1.24mg/mL。将试剂3和41以10mg/mL的浓度单独地溶于超纯水，并将它们加入经还原的Fab的单独的溶液中，PEG试剂相当于Fab1.5倍的摩尔当量。在22℃进行PEG化反应，2h和4h之后取样进行SDS-PAGE分析。
使用ImageQuantTM系统(GE Healthcare)，根据SDS-PAGE条带密度来评估转化为PEG化的Fab的％转化率。结果如图1所示，其比较了PEG化试剂3(黑色柱)相对于试剂41(白色柱)与Fab的缀合程度。在2h和4h，与试剂3的反应分别产生63％和83％转化为PEG化的Fab的转化率。对于试剂41，在2h和4h的转化率分别为35％和51％。这些数据表明，试剂3反应更快，其相对于试剂41在更短的时间范围内产生更大量的PEG化的Fab。
实施例18：使用试剂3，在干扰素α二硫键处的PEG化，以及与已知PEG化试剂41的比较
使用ZebaTM spin 5mL柱，将干扰素α-2a(IFN)(4mL，0.93mg/mL，于20mM Tris pH8.0、约100mM NaCl、蛋白酶抑制剂、1mM EDTA、10％甘油中)缓冲交换到磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.4)中。在22℃下通过用DTT(25mM)处理30min来还原IFN。使用以PBS(pH 7.4)平衡的PD10脱盐柱来除去还原剂。在4℃下，使试剂3和41(1.5当量相对于每当量IFN硫化物)与IFN(0.7mg/mL)缀合。1h、2h和4h孵育之后，通过SDS-PAGE分析反应混合物的样品。使用ImageQuantTM系统(GE Healthcare)，根据SDS-PAGE条带密度来评估转化为PEG化的IFN的％转化率。结果如图2所示，其比较了具有聚合乙二醇离去基团的荧光试剂4和缺少聚合的离去基团的类似试剂41的缀合率。与试剂41在相同的时间点相比，试剂3反应更快并且产生更大量的IFN-PEG(10kDa)-OMe(对应于约35kDa的条带)。
实施例19：具有聚合乙二醇离去基团的荧光试剂4和缺少聚合的离去基团的试剂36的缀合效率的比较
使用与实施例17中所描述的方法类似的缀合方法，在缀合前将试剂4和36分别以1.53mg/mL和1.67mg/mL的浓度单独地溶于100％MeCN中。向Fab溶液(在PBS中1.24mg/mL，0.475mL)中添加相当于1.5当量的试剂4或试剂36(18μL)。使反应在22℃进行22h，并在反应过程中取样用于SDS-PAGE分析。使用ImageQuantTM系统(GE Healthcare)，根据SDS-PAGE条带密度来评估转化为罗丹明缀合的Fab的％转化率。结果如图3所示，其比较了在1.5当量的试剂下，使用试剂4(黑色柱)和试剂36(白色柱)，转化为罗丹明缀合的Fab的转化率。在各时间点，试剂4转化为缀合Fab的转化率更高。
实施例20：具有聚合乙二醇离去基团的细胞毒性试剂5与缺少聚合离去基团的类似试剂42(4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE)的抗体缀合的比较
试剂42如WO2014064423中所述合成。
使用与WO2014064423的实施例中所描述的方法类似的方法，将试剂5和42两者缀合至抗体曲妥珠单抗。简言之，在40℃下用三(2-羧乙基)膦(TCEP)来还原曲妥珠单抗(5.2mg/mL)1h。然后通过将试剂5和试剂42两者溶于DMF至最终浓度为1.6mM，使抗体与相对于每个链间二硫键1.5摩尔当量的试剂5或42缀合。用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mMNaCl、20mM EDTA将抗体溶液稀释到4.21mg/mL。将试剂5和42加到单独的抗体等分部分中。用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、20mM EDTA将反应中的最终抗体浓度调节至4mg/mL。轻轻混合各溶液并在22℃下孵育22h。在16h和22h取等分部分，在22℃下用N-乙酰基-L-半胱氨酸(相对于试剂20当量)处理1h，然后通过HIC分析。根据HIC色谱图中在280nm处测量的吸收峰面积％确定药物/抗体比例(DAR)为4时的产物转化率％，结果如图4所示，其示出了试剂5(黑色柱)和试剂42(白色柱)与抗体缀合的比较。图4的结果表明，22h之后，使用试剂42产生了6％的DAR 4缀合物，而在22h之后试剂5产生了78％的DAR 4缀合物。
实施例21：全部具有聚合乙二醇离去基团的细胞毒性试剂5、6和10与缺少聚合离去基团的类似试剂42、43和44的抗体缀合的比较
如WO2014064423中所描述的，合成试剂43，并如WO2014064424所描述的，合成试剂44。
(a)细胞毒性试剂43(4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)和试剂5的抗体缀合的比较
用于将细胞毒性试剂43与抗体(5mg规模)缀合的反应条件与以上实施例20中所述的反应条件相同，但二者具有以下差异：
将试剂43和5制备成3.2mM MeCN溶液。在0.5、1、2、4和22h之后取反应溶液的等分部分，并通过用N-乙酰基-L-半胱氨酸处理(22℃下1h)而淬灭，并通过HIC分析。这些缀合反应的结果如图5所示，其为比较试剂5和试剂43在22h内的缀合速率(平均DAR)的时程分析。在图5中，可以看出试剂5的产物形成速率比试剂43快得多。使用HIC从各反应混合物中纯化出DAR4种类，并通过SDS-PAGE进行分析。根据SDS-PAGE分析，通过染色凝胶的ImageQuantTM分析来确定各样品中存在的半抗体种类的百分数(％)，结果示于表1，其中由试剂43制备的缀合物所具有的半抗体种类的量几乎是由试剂5制备的缀合物的2倍。这表明由试剂5产生的缀合物具有显著更多的重链至重链链间共价键，并且更类似于未缀合抗体的结构。
表1
(b)细胞毒性试剂44(4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1)和试剂10的抗体缀合的比较
用于将细胞毒性试剂44与抗体(3.8mg规模)缀合的反应条件与以上实施例20中所述的反应条件相同。在16h和22h之后取反应溶液的等分部分，并通过用N-乙酰基-L-半胱氨酸处理而淬灭。通过HIC分析各等分部分并确定生成DAR 4产物的转化率％。结果示于图6，其为试剂10(黑色柱)和44(白色柱)与抗体缀合的比较。可见在16h和22h之后试剂10均产生更多的DAR 4产物。
(c)细胞毒性试剂43(4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE)和试剂6的抗体缀合的比较
用于将细胞毒性试剂6与抗体(1mg规模)缀合的反应条件与以上实施例20中所述的反应条件类似，但二者具有以下差异：将试剂6制备为3.2mM MeCN溶液并且反应中的MeCN浓度为5％。4h之后取反应溶液的等分部分，通过用N-乙酰基-L-半胱氨酸处理而淬灭并通过分析性HIC进行分析，并确定存在的DAR 4产物的百分数(％)。结果示于图7，其为试剂6(黑色柱)和43(白色柱)与抗体缀合的比较。可见，4h之后试剂6(黑色柱)比试剂43(白色柱)产生显著更多的DAR 4产物。
实施例22：具有聚合乙二醇离去基团的细胞毒性试剂12与不具有聚合离去基团的类似试剂44的抗体缀合的比较
用于将细胞毒性试剂12与抗体(1mg规模)缀合的反应条件与以上实施例20中所述的反应条件相同。4h之后取反应溶液的等分部分，通过用N-乙酰基-L-半胱氨酸处理而淬灭并通过HIC进行分析。结果示于图8，其为试剂44(白色柱)和12(黑色柱)与抗体缀合的比较。在图8中，可以看出，与试剂44相比，试剂12在4h之后产生显著更高收率的DAR 4产物。
实施例23：具有聚合乙二醇离去基团的细胞毒性试剂14、15和31与不具有聚合离去基团的类似试剂44的抗体缀合的比较
用于将细胞毒性试剂14、15和31与抗体(1mg规模)缀合的反应条件与以上实施例20中所述的反应条件相同。4h之后取反应溶液的等分部分，并通过用N-乙酰基-L-半胱氨酸处理而淬灭。通过HIC分析各等分部分，并确定存在的DAR 4产物的百分数(％)。与试剂14、15、31和44的缀合结果示于表2，从中可见与试剂44相比，4h之后试剂14、15和31产生超过两倍量的DAR 4产物。
表2：4h反应之后试剂14、15、31和44与抗体缀合的比较
用于与抗体缀合的试剂 4h之后DAR 4产物％
44 9
14 24
15 23
31 28
实施例24：抗体药物缀合物的制备
通过与WO2014064423和WO2014064424中所述的方法类似的方法，由试剂21、24和25制备抗体药物缀合物。简言之，在40℃下使用三(2-羧乙基)膦还原抗体(曲妥珠单抗或brentuximab)1h。然后，通过将试剂溶解在乙腈或DMF中至最终浓度为1.6mM而进行抗体与试剂的缀合，每个链间二硫键使用1.5摩尔当量的试剂。使用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、20mM EDTA将抗体溶液稀释至4.21mg/mL。将试剂加到抗体中，并用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、20mM EDTA将反应中的最终抗体浓度调节至4mg/mL。轻轻混合各溶液并在22℃下孵育。通过适用于各缀合物的疏水作用色谱法纯化抗体药物缀合物产物。
实施例25：在pH 6.6和7.9下，使用试剂3的组氨酸标记的干扰素α的PEG化
在pH 6.6或pH 7.9(通过分别混合乙酸钠pH 5.3或磷酸钠pH 8.0与磷酸钠pH 7.4而实现)下，在2.5mg/mL下进行干扰素α-2a(IFN)(具有8-组氨酸标记)和试剂3的缀合。使用每当量IFN 1当量、1.5当量和2当量的试剂3。在22℃下将所得反应混合物孵育22h，在4h时进行间断分析。通过SDS-PAGE分析反应混合物，结果示于图9中。在图9中，泳道M表示Novex蛋白标准物；泳道1表示pH 5.4下的IFN；泳道2表示pH 8.0下的IFN；泳道3-5表示pH 6.6下，4h时分别来自1、1.5和2当量的试剂3的缀合产物；泳道7-9表示pH 6.6下，22h时分别来自1、1.5和2当量的试剂3的缀合产物；泳道10表示pH 7.9下，22h时来自1.5当量的试剂3的缀合产物。
实施例26：二硫桥连试剂45的合成
步骤1：化合物46的合成
向下式的氨基己酸美坦辛(AHX-DM1).TFA盐(29.4mg)于二甲基甲酰胺(DMF)(400μL)中的搅拌溶液中加入4-(N-Boc-氨基)-1，6-庚二酸双-五氟苯基酯(10.2mg)于DMF(200μL)中的溶液。
将所述溶液冷却至0℃，然后添加N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(13.5μL)。使溶液升温至室温并搅拌18.5h。通过反相C18柱色谱法纯化反应溶液，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。通过冷冻干燥法除去溶剂以产生白色固体状的4-(N-boc-氨基)-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1化合物46(假定的定量收率，29.7mg)m/z[M+2H-2(H2O)-NHCO]2+844(100％)，[M+H]+1767。
步骤2：细胞毒性有效载荷47的合成
将化合物46(假定的定量收率，29.7mg)溶解于甲酸(700μL)中，在室温下搅拌溶液1.5h。真空除去挥发物，并通过溶于缓冲液A∶缓冲液B 50∶50v/v％混合物(1.5mL，缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸)将残余物转化为三氟乙酸盐。在室温下搅拌溶液5min，然后通过冷冻干燥法除去溶剂。重复该过程以生成米黄色固体状的4-(氨基)-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1化合物47(18.0mg，在2步后60％)m/z[M+2H-2(H2O)-NHCO)]2+794(100％)，[M+H]+1667。
步骤3：化合物48的合成
按照专利(EP 0 624 377 A2)中所述的步骤来合成化合物48以生成白色固体，其具有与之前报道的数据一致的光谱数据。
步骤4：化合物49的合成
制备化合物48于DMF(500μL)中的储备溶液，以及HATU(40.0mg)于DMF(400μL)中的储备溶液。向化合物47(14.0mg)于DMF(700μL)中的搅拌溶液中加入化合物48储备溶液(126.9μL)和HATU储备溶液(77.8μL)的等分部分。将反应溶液冷却至0℃，然后加入DIPEA(4.11μL)。在0℃下搅拌溶液50min，然后再加入化合物48储备溶液的等分部分(126.9μL)、HATU储备溶液的等分部分(77.8μL)和DIPEA的等分部分(4.11μL)。在0℃下搅拌溶液40min。通过反相C18柱色谱法纯化反应溶液，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。通过冷冻干燥法除去溶剂以生成米黄色固体状的4-(Fmoc-val-cit-氨基)-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1化合物49(假定的定量收率，16.9mg)m/z[M+2H-2(H2O)]2+1055(100％)。
步骤5：化合物50的合成
向化合物49(假定的定量收率，16.9mg)于DMF(500μL)中的搅拌溶液中加入哌啶(3.04μL)。在室温下搅拌反应溶液1.5h，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。通过冷冻干燥法除去溶剂以生成米黄色固体状的4-(val-cit-氨基)-1，6-庚烷二酰胺二-AHX-DM1化合物50(8.8mg，在2步后55％)m/z[M+2H]2+962(100％)。
步骤6：包含细胞毒性有效载荷47的二硫桥连试剂45的合成
制备化合物8(13.5mg)于DMF(100μL)中的储备溶液、HATU(10.0mg)于DMF(200μL)中的储备溶液和NMM(5.83μL)于DMF(94.2μL)中的储备溶液。向50(1.8mg)于DMF(80μL)中的搅拌溶液中加入化合物23储备溶液的等分部分(16.5μL)和HATU储备溶液的等分部分(20.2μL)。将反应溶液冷却至0℃，然后加入NMM储备溶液的等分部分(5μL)。在0℃下搅拌溶液1h，然后升温至室温。3.5h之后，通过反相C18柱色谱法纯化反应溶液，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。通过冷冻干燥法除去溶剂以生成固体状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-val-cit-氨基)-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1试剂45(1.5mg，42％)m/z[M+4H-2(H2O)]4+992(100％)，[M+3H-2(H2O)]3+1321，[M+2H-2(H2O)]2+1982。
实施例27：包含细胞毒性有效载荷47的二硫桥连试剂51的合成
步骤1：试剂51的合成
制备HATU(10mg)于DMF(200μL)中的储备溶液和NMM(5.83μL)于DMF(94.2μL)中的储备溶液。在搅拌下将化合物23(5.4mg)溶于化合物50(3.6mg)于DMF(254μL)中的溶液中。向所述搅拌溶液中加入HATU储备溶液的等分部分(40μL)。将溶液冷却至0℃，然后加入NMM储备溶液的等分部分(10μL)。50min之后，加入HATU储备溶液的等分部分(6.67μL)和NMM储备溶液的等分部分(1.67μL)。在0℃下再搅拌反应溶液20分钟，并通过反相C18柱色谱法直接纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。通过冷冻干燥法除去溶剂以生成米黄色固体状的试剂51(3.8mg，53％)m/z[M+4H-(H2O)-NHCO]4+1003(100％)，[M+3H-2(H2O)-NHCO]3+1331，[M+2H-2(H2O)]2+2017。
实施例28：包含细胞毒性有效载荷47的二硫桥连试剂56的合成
步骤1：化合物57的合成
制备羟基苯并三唑(HOBt，6.6mg)于DMF(200μL)中的储备溶液。向细胞毒性有效载荷47(10mg)于DMF(500μL)中的搅拌溶液中加入Fmoc-val-ala-PAB-PNP(3.7mg)以及HOBt储备溶液的等分部分(2μL)。将反应溶液冷却至0℃，然后加入DIPEA(2.14μL)。然后将反应溶液在室温下搅拌18h，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。通过冷冻干燥法除去溶剂以生成Fmoc-val-ala-PAB-氨基-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1试剂57。
步骤2：化合物58的合成
以与所述的化合物50的合成方法类似的方法，使用化合物57替代化合物49，合成双-美登木素化合物胺-val-ala-PAB-氨基-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1化合物58。
步骤3：试剂56的合成
以与所述的试剂51的合成方法类似的方法，使用化合物58替代化合物50，合成双-美登木素试剂双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-Glu-[NH-PEG(24u)-OMe]-[val-ala-PAB-氨基-1，6-庚烷二酰胺双-AHX-DM1]56。
实施例29：包含细胞毒性有效载荷AHX-DM1的二硫桥连试剂59的合成
向val-cit-AHX-DM1(5.0mg)于无水DMF(400μL)中的搅拌溶液中加入试剂8(13mg)，并在0℃下搅拌5min。依次加入HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)，并在0℃下搅拌反应混合物。20min之后，加入额外量的HATU(2.62mg)和NMM(0.44mg)并在0℃下搅拌反应混合物。2.5h之后，将反应冷却至-20℃并保持16h。真空浓缩反应溶液，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成稠的黄色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-val-cit-AHX-DM1试剂59(5.6mg，41％)m/z[M-OH+H]2+1571.5。
实施例30：使用二硫桥连试剂45产生抗体药物缀合物60；使用二硫桥连试剂51产生抗体药物缀合物61；以及使用二硫桥连试剂56产生抗体药物缀合物62
通过与WO2014064423和WO2014064424中所述的方法类似的方法，制备抗体药物缀合物。简言之，在40℃下使用三(2-羧乙基)膦还原抗体(曲妥珠单抗或brentuximab)1h。然后，通过将试剂在乙腈或DMF中至最终浓度为1.6mM而进行抗体与试剂(即45、51或56)的缀合，每个链间二硫键使用1.5摩尔当量的试剂。使用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mMNaCl、20mM EDTA将抗体溶液稀释至4.21mg/mL。将试剂加到抗体中，并用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、20mM EDTA将反应中的最终抗体浓度调节至4mg/mL。轻轻混合各溶液并在22℃下孵育。通过适用于各缀合物的疏水作用色谱法纯化抗体药物缀合物产物以生成具有确定的药物/抗体比例(DAR)的产物。对于试剂45、51和56，通过HIC测定的转化为DAR4产物的转化率％分别为30％、65％和40％。
实施例31：包含7个重复单元乙二醇离去基团和氟化芳基接头的PEG缀合试剂63的合成
步骤1：化合物64的合成
将甲醛(37％溶液)(144μL)、哌啶(14.4μL)和哌啶盐酸盐(134mg)添加到4-乙酰基-2-氟苯甲酸(200mg)和4-甲苯硫醇(272mg)于无水乙醇(1.5mL)中的混合物中。将反应混合物在回流下加热2.5h，在此期间再加入(1.5h之后)一部分甲醛(37％溶液)(144μL)。然后将反应混合物冷却至室温并搅拌过夜。加入额外量的甲醛(37％溶液)(288μL)和哌啶(14.4μL)，并将反应混合物在回流下再加热8h。然后将反应混合物冷却至室温并搅拌过夜。真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(800μL，1∶3v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成淡橙色晶体状的双-(甲苯硫醚丙酰基)-2-氟-苯甲酸化合物64(196.0mg，39％)m/z[M+H]+454.20Da；1H NMR(400MHz，CDCl3)2.35(6H，s，OMe)，3.20-3.30(4H，m，CH2)，3.70-3.80(1H，m，CH)，7.10(4H，d，Ar-H)，7.15(4H，d，Ar-H)，7.20(1H，s，Ar-H)，7.35(1H，d，Ar-H)，7.90(1H，t，Ar-H)。
步骤2：化合物65的合成
在室温下向化合物64(75mg)于甲醇∶水(2.0mL，9∶1v/v)中的搅拌溶液中加入(304mg，Sigma-Aldrich)。2h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于二氯甲烷(3×5.0mL)，过滤通过硫酸镁柱并用二氯甲烷冲洗(2×5.0mL)。合并洗脱液和冲洗液并真空除去挥发物以生成白色粉末状的双-(甲苯磺酰基丙酰基)-2-氟-苯甲酸化合物65(84.0mg，98％)m/z[M+H]+519.15Da。
步骤3：化合物66的合成
向化合物65(75mg)于DMF(2.0mL)中的溶液中加入Et3N(240μL，Acros Organics)和MeO-PEG-(7u)-SH(154mg，Iris Biotech)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌反应溶液。6h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(2.0mL，1∶1v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成无色油状的双-mPEG(7u)-硫醚-丙酰基-2-氟-苯甲酸化合物67(101mg，78％)m/z[M+H]+919.45Da。
步骤4：化合物67的合成
在室温下向化合物66(80mg)于甲醇∶水(2.0mL，9∶1v/v)的搅拌溶液中加入(160mg，Sigma-Aldrich)。3h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于二氯甲烷(3×4mL)，过滤通过硫酸镁柱并用二氯甲烷冲洗(2×5mL)。合并洗脱液和冲洗液并真空除去挥发物。将所得油溶于水并进行冷冻干燥以产生澄清的无色油状的双-mPEG(7u)-砜-丙酰基-2-氟-苯甲酸化合物67(82mg，95％)m/z[M+H]+983.26Da。
步骤5：化合物63的合成
制备HATU(40.0mg，Novabiochem)于DMF(200μL)中的储备溶液和NMM(11.8μL，Acros Organics)于DMF(200μL)中的储备溶液。向化合物67(25.0mg)的DMF(800μL)溶液中加入H2N-PEG(24u)-OMe(23.4mg，Iris Biotech)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。每10min添加HATU(40.0μL)和NMM(40.0μL)的等分部分，共添加3次，在30min时加入HATU(80.0μL)和NMM(80.0μL)剩余的等分部分。60min之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(1.0mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)—－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)-砜-丙酰基-2-氟-苯甲酰胺-PEG(24u)试剂63(17.5mg，40％)m/z[M+3H]3+684.94Da。
实施例32：包含7个重复单位乙二醇氨基离去基团的PEG缀合试剂68的合成
步骤1：化合物69的合成
制备HATU(632mg，Novabiochem)于DMF(1.6mL)中的储备溶液和NMM(183μL，AcrosOrganics)于DMF(1.6mL)中的储备溶液。向4-(3-甲苯磺酰基-2-(甲苯磺酰基甲基)丙酰基)苯甲酸(199mg，BioVectra)的DMF(4.0mL)溶液中加入H2N-PEG(24u)-CO2 tBu(400.0mg，IrisBiotech)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。每10min添加HATU(320μL)和NMM(320μL)的等分部分，共添加5次。120min之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(2.0mL，1∶3v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)—－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的橙色油状的双-(甲苯磺酰基丙酰基)-苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯化合物69(184mg，33％)m/z[M+Na+H]2+853.43Da，[M-(tBu)+2H]2+814.83Da。
步骤2：化合物68的合成
向69(32mg)于DMF(500μL)中的溶液中加入无水碳酸钠(24.1mg，FisherScientific)和MeO-PEG-(7u)-NH2(19mg，Iris Biotech)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌反应混合物。18h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(1.0mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)－－水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)-氨基-丙酰基-苯甲酰胺-PEG(24u)-t丁酯试剂68(15.0mg，38％)m/z[M+2H]2+1026.09Da，[M+3H]3+665.45Da。
实施例33：包含马来酰亚胺单元、7个重复单元乙二醇离去基团的缀合试剂70的合成
步骤1：化合物71的合成
将3，4-二溴呋喃-2，5-二酮(300mg，Sigma Aldrich)溶解于乙酸(4.0mL，FisherScientific)并向其中添加CO2 tBu-PEG-(24u)-NH2(705mg，Iris Biotech)。在75℃下在惰性氮气气氛下搅拌反应混合物。3h之后，在室温下搅拌反应混合物，21h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水和乙腈(v/v；1/1，4.0mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成米黄色不透明固体状的二溴-马来酰亚胺-PEG(24u)-t丁酯化合物71(427mg，51％)m/z[MH-(tBu)]2+692.68Da。
步骤2：化合物70的合成
向71(250mg)于DMF(1.5mL)中的溶液中加入α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)(186mg，Iris Biotech)和三乙胺(145μL)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。将快速沉淀的三乙胺氢溴酸盐与DMF(1.0mL)重新溶解于反应混合物，30min之后真空除去挥发物。将所得残余物溶于甲酸(3mL，Sigma Aldrich)，并在室温下在惰性氮气气氛下搅拌反应混合物。30min之后加入三氟乙酸(50μL，Acros Organics)，60min之后加入更多的三氟乙酸(300μL)。100min之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(1.5mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成蜡状黄色固体状的双-mPEG(7u)-马来酰亚胺-PEG(24u)-酸试剂70(146mg，43％)m/z[MH3]3+646.28Da。
实施例34：包含7个重复单元乙二醇离去基团和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂72的合成
步骤1：化合物73的合成
向4-(3-甲苯磺酰基丙酰基)苯甲酸(99mg，Bioconjugate Chem.2014，(25)460-469)于二甲基甲酰胺(DMF，5.0mL)中的搅拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)(170mg，Iris Biotech)和三乙胺(250μL)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。4h之后将另外一部分三乙胺(120μL)加到反应混合物中。95.0h之后真空除去挥发物并将所得残余物溶于水/乙腈(2mL，1∶1v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的mPEG(7u)-硫醚-丙酰基-苯甲酸化合物73(200mg，126％，含有残留溶剂)m/z[M+H]+(533)。
步骤2：化合物74的合成
在室温下向73(200mg)于甲醇∶水(5.5mL，9∶1v/v)的搅拌溶液中加入(320mg)。4.5h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于二氯甲烷(4×3mL)，过滤通过硫酸镁柱并用二氯甲烷冲洗(2×3mL)。合并洗脱液和冲洗液，并真空除去挥发物以生成稠的澄清油。将残余物溶于水∶乙腈(1.0mL，4∶1v/v)，并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的mPEG(7u)-砜-丙酰基-苯甲酸试剂74(90mg，60％)m/z[M+H]+(565)。
步骤3：化合物72的合成
在0℃下向val-cit-PAB-MMAE(30mg)于无水DMF(500μL)中的搅拌溶液中加入化合物73(11mg)并搅拌5min。依次加入HATU(9.95mg)和NMM(4.26μL)并在0℃下搅拌反应混合物。0.5h和2h之后加入额外量的HATU和NMM，再过2.0h之后，真空浓缩反应溶液，然后通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成米黄色固体状的mPEG(7u)-砜-丙酰基-苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE试剂72(15.0mg，46％)m/z[M+H]+(1671)。
实施例35：包含7个重复单元乙二醇离去基团和呋喃接头的缀合试剂75的合成
步骤1：试剂76的合成
向N，N--二甲基亚甲基碘化铵(407mg)于DMF(3.0mL)中的悬浮液中加入5-乙酰基呋喃-2-甲酸(169mg)。将反应混合物加热到125℃并在惰性气氛下搅拌90min。向一部分反应混合物(1.0mL)中加入mPEG-(7u)-SH(325mg)和Et3N(363μL)。在室温下在惰性气氛下搅拌反应混合物90min。真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(1.0mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成浅黄色油状的双-mPEG(7u)-硫醚-丙酰基-呋喃-2-甲酸试剂76(119mg，36％)。收率计算是基于所使用的起始反应混合物的1/3部分。1H NMR(400MHz，DMSO)2.60-2.70(4H，m，CH2)，2.80-2.90(4H，m，CH2)，3.24(6H，s，OMe)，3.40-3.60(m，PEG)，3.90-3.95(1H，m，CH)，7.36(1H，d，Ar-H)，7.69(1H，d，Ar-H)。
步骤2：试剂77的合成
向76(30.0mg)于甲醇∶水(1.0mL，9∶1v/v)中的溶液中加入(62.1mg，Sigma-Aldrich)。在室温下在惰性气氛下搅拌反应混合物120min。真空浓缩粗反应混合物。将所得残余物溶于二氯甲烷(3×5.0mL)，过滤通过硫酸镁柱并用二氯甲烷冲洗(2×5.0mL)。合并洗脱液和冲洗液并真空除去挥发物以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)-砜-丙酰基-呋喃-2-甲酸试剂77(31.0mg，97％)。m/z[M+H]+955.28Da。
步骤3：试剂75的合成
制备HATU(51.5mg)于DMF(200μL)中的储备溶液和NMM(15.0μL)于DMF(200μL)中的储备溶液。将双-mPEG(7u)-砜-丙酰基-呋喃-2-甲酸77(31.0mg)的DMF(500μL)溶液加到H2N-PEG(24u)-OMe(29.5mg，Iris Biotech)的DMF(500μL)溶液中。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。在0min、10min、30min的时间点时加入HATU的等分部分(40μL)和NMM的等分部分(40μL)，并在90min时加入HATU的等分部分(80μL)和NMM的等分部分(80μL)。120min之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(1.0mL，1∶1v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)-砜-丙酰基-呋喃-2酰胺-PEG(24u)-OMe试剂75(9.6mg，18％)。m/z[M+2H]2+1012.76Da。
实施例36：包含7个重复单元乙二醇硫化物离去基团的缀合试剂78的合成
向1-(4-羟苯基)-3-甲苯磺酰基-2-(甲苯磺酰基甲基)丙-1-酮(400mg)于DMF(8.0mL)中的溶液中加入Et3N(708μL，Acros Organics)和MeO-PEG-(7u)-SH(905mg，IrisBiotech)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌反应混合物。48h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(2.0mL，1∶1v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物79(322mg，43％)m/z[M+H]+873.49Da。
实施例37：包含7个重复单元乙二醇砜离去基团的缀合试剂79的合成
在室温下向化合物78(20.0mg)于甲醇∶水(500μL，9∶1v/v)的搅拌溶液中加入(42.2mg，Sigma-Aldrich)。3h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(800μL，1∶1v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物79(19.5mg，91％)m/z[M+H]+936.86Da。
实施例38：包含7个重复单元乙二醇砜离去基团和苯酚酯接头的缀合试剂80的合成
步骤1：化合物81的合成
向mPEG(24u)-COOH(38.4mg，Iris Biotech)于DMF(400μL)中的溶液中加入HATU(26.1mg)和DIPEA(12.0μL)。在惰性氮气气氛下在室温下搅拌反应混合物5.0min。向该混合物加入溶于DMF(100μL)的化合物79(20.0mg)。在室温下在惰性氮气气氛下再搅拌反应混合物42h。42h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(800μL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物81(15.4mg，34％)m/z[M+2H-mPEG(7u)碎片]2+824.34Da。
步骤2：化合物80的合成
在室温下向化合物81(14.0mg)于甲醇∶水(500μL，9∶1v/v)的搅拌溶液中加入(13.1mg，Sigma-Aldrich)。230min之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(1.0mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物80(12.7mg，88％)m/z[M+3H]3+679.16Da。
实施例39：包含7个重复单元乙二醇砜离去基团、非芳族接头和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂82的合成
步骤1：化合物83的合成
在室温下向3-溴-2-(溴甲基)丙酸(1.32g，Alfa Aesar)于甲醇(50.0mL)中的搅拌溶液中加入压碎的氢氧化钠颗粒(428mg，Fisher Scientific)。加热混合物直至固体溶解。加入苯亚磺酸(1.76g，Sigma Aldrich)的钠盐并在惰性氮气气氛下使反应混合物回流。4.0h之后，将反应混合物冷却至室温并在惰性氮气气氛下搅拌过夜。20h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于0.5M氢氧化钠(30mL)并用二乙醚(3×10.0mL)冲洗。用37％盐酸使水相部分呈酸性并产生白色沉淀。通过Buchner过滤器收集沉淀物，用蒸馏水(3×20.0mL)冲洗渗余物，并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色粉末状的化合物83(632mg，32％)m/z[M+H]+369.08Da；[M+Na]+391.04Da。
步骤2：化合物84的合成
在室温下向化合物83(111mg)于二甲基甲酰胺(2.0mL)中的搅拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)(428mg，Iris Biotech)和三乙胺(251μL)。在室温下在惰性气氛下搅拌所得反应混合物。20h之后，将粗反应混合物用水(1.0mL)稀释并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物84(154mg，64％)m/z[M-PEG-(7u)]+473.05Da。
步骤3：化合物85的合成
在室温下向双-mPEG(7u)-硫醚-丙酸(65.0mg)于甲醇∶水(1.5mL，9∶1v/v)中的搅拌溶液中加入(151mg，Sigma-Aldrich)。3.0h之后真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(800μL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物85(41.7mg，59％)m/z[M+H]+860.91Da。
步骤4：化合物82的合成
制备HATU(26.4mg)于DMF(200μL)中的储备溶液和NMM(7.6μL)于DMF(200μL)中的储备溶液。将化合物83(12.0mg)的DMF(200μL)溶液加入NH2-Val-Cit-PAB-MMAE(21.5mg，Concortis)的DMF(400μL)溶液中。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。在0min和40min时加入HATU的等分部分(80μL)和NMM的等分部分(80μL)，共加入2次。180min之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水∶乙腈(1.0mL，1∶1v/v)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色粉末状的试剂82(13.6mg，50％)。m/z[M+2H]2+983.45Da。
实施例40：含有7个重复单元乙二醇砜离去基团和非芳族接头的缀合试剂86的合成
步骤1：化合物87的合成
在室温下向化合物84(15.0mg)于甲苯(250μL)中的搅拌溶液中加入mPEG-(23u)-OH(19.7mg，Iris Biotech)、三苯基膦(5.43mg，Sigma Aldrich)和偶氮二甲酸二异丙酯(4.1μL，Sigma Aldrich)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。30min之后，加入额外的三苯基膦(5.43mg，Sigma Aldrich)和偶氮二甲酸二异丙酯(4.10μL，SigmaAldrich)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌反应混合物。1.0h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(700μL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色蜡状的化合物87(18.5mg，54％)m/z[M-PEG-(7u)]+750.19Da。
步骤2：化合物86的合成
在室温下向化合物87(14.5mg)于甲醇∶水(1.0mL，9∶1v/v)中的搅拌溶液中加入(14.7mg，Sigma-Aldrich)。3.0h之后，通过脱脂棉(1.5cm塞(plug))过滤反应混合物。将粗产物通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色蜡状的化合物86(7.1mg，47％)m/z[M+3H]3+629.91Da。
实施例41：包含7个重复单元乙二醇砜离去基团和聚乙二醇间隔基的双官能缀合试剂88的合成
制备HATU(448mg)于DMF(2.0mL)中的储备溶液和NMM(129μL)于DMF(2.0mL)中的储备溶液。将氨基-PEG-(11u)-胺(64.1mg，Iris Biotech)的DMF(500μL)溶液加到4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸(250mg)的DMF(2.0mL)溶液中。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。在0min时加入HATU的等分部分(800μL)和NMM的等分部分(800μL)，并在50min时加入HATU的等分部分(200μL)和NMM的等分部分(200μL)，共加入2次。2.0h之后，真空除去挥发物。将所得残余物溶于水(1.0mL)并通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的试剂88(200mg，69％)。m/z[M+H]2+1219.5Da[M+2H]3+813.35Da，[M+3H]4+610.28Da。
实施例42：包含7个重复单元乙二醇砜离去基团和磺酸侧链的缀合试剂89的合成
在室温下向3-(N-(3-磺丙基)-4-(3-甲苯磺酰基-2-(甲苯磺酰基甲基)丙酰基)苯甲酰氨基)丙酸(Click Chemistry Tools LLC，20.0mg)于二甲基甲酰胺(500μL)中的搅拌溶液中加入α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)(30.2mg，Iris Biotech)和三乙胺(23.6μL)。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。3.5h之后，将粗中间产物通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)－－水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂。将所得澄清的无色残余物溶于甲醇∶水(750μL，9∶1v/v)中并将该溶液加到(52.1mg，Sigma-Aldrich)中。在室温下在惰性氮气气氛下搅拌所得反应混合物。4.5h之后将粗产物通过反相C18柱色谱法纯化，所述C18柱用缓冲液A(v/v)－－水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)－－乙腈∶0.05％三氟乙酸(98∶2v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的化合物89(4.71mg，14％)m/z[M+H]2+579.67Da，[M+H2O]2+588.17Da。
实施例43：使用缀合试剂63、68和70，在还原的Fab二硫键处的PEG化
向通过木瓜蛋白酶消化而产生的曲妥珠单抗的Fab中加入1M DTT储备溶液(25μL，最终浓度10mM)，使用涡旋短暂地混合还原混合物，并在22℃下孵育1h。然后使用PD10柱(GEHealthcare)除去还原剂，所述PD10柱用pH为7.5的20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、20mMEDTA平衡。用相同的缓冲液将经还原的Fab进一步稀释至1.2mg/mL。在0.719mM下将试剂63、68和70各自溶于乙腈，并加入单独的经还原的Fab的溶液中(每Fab 1.5当量试剂)。使PEG化反应在22℃下进行，22h之后从其中取出样品进行HIC HPLC分析。各反应混合物的HIC HPLC分析表明，对于试剂63、68和70而言，转化为PEG化的Fab的转化率％分别为95％、90％和90％。
实施例44：试剂72与部分还原的曲妥珠单抗的缀合
使于pH为7.5的20mM磷酸钠(20mM EDTA；150mM NaCl)中的曲妥珠单抗(3.5mg，5.2mg/mL)升温至40℃并保持15min。向该曲妥珠单抗中加入2.08mM TCEP(28μL)并将所得混合物在40℃下孵育1h。1h之后，将经TCEP处理的曲妥珠单抗冷却至22℃。用pH为7.5的20mM磷酸钠(20mM EDTA；150mM NaCl)(0.12mL)稀释一部分曲妥珠单抗溶液(3.2mg，0.64mL，5.0mg/mL)。向3个小瓶中装入稀释的mAb溶液(1mg，238μL)。制备试剂72于DMF中的溶液(3.2mM)。将该试剂溶液(12.5μL，每mAb 6.0当量)加到单独的小瓶中，将反应物混合，然后在22℃下孵育。22h时用N-乙酰基-L-半胱氨酸(相对于试剂20当量)淬灭反应样品，然后进行HIC分析。HIC HPLC分析表明与试剂72缀合的曲妥珠单抗的平均DAR为4.5。
实施例45：试剂82和86与曲妥珠单抗的缀合
使用相同的方案使试剂82和86与抗体曲妥珠单抗缀合。简言之，在40℃下将于缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，20mM EDTA，pH 8.4)中的曲妥珠单抗(5.2mg/mL)用TCEP(6当量)还原1h。然后在40℃下进行抗体与每个链间二硫键1.5摩尔当量的试剂82或86的缀合。这通过在乙腈(每个反应中5％v/v乙腈)中加入试剂82或试剂86来实现。用pH为8.4的20mM磷酸钠缓冲液，150mM NaCl，20mM EDTA将抗体溶液稀释至4.0mg/mL。轻轻混合各溶液并在40℃下孵育22h。22h时，在22℃用N-乙酰基-L-半胱氨酸(相对试剂20当量)处理反应1h。随后通过分析性HIC来分析反应物。基于HIC色谱图中在280nm处测量的吸收峰的面积％来确定使用试剂82和86时转化为产品的转化率％。对于试剂82和86而言，转化为产品的转化率数值％分别为100％和50％。
实施例46：使用缀合试剂75、79和80以及试剂89，在经还原的Fab二硫键处的PEG化
通过与实施例43中对于缀合试剂63、68和70所述的方法类似的方法，使试剂75、79、80和89与Fabtrast缀合。22h缀合反应之后，在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析样品。使用ImageQuantTMLAS 4010系统(GE Healthcare)，使用以InstantBlueTM染色的凝胶，从条带密度测量值来评估使用各试剂时PEG化的Fabtrast的转化率％。对于试剂75、79、80和89，转化率％数值分别为90％、20％、75％和40％。
实施例47：分别包含3或5个重复单元聚合乙二醇离去基团和奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂90(对比)和91(对比)的合成
以与实施例4中所述的试剂5的合成方法类似的方法，分别使用硫醇2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙硫醇和2，5，8，11，14-五氧十六烷-16-硫醇代替实施例1中用于合成化合物1的α-甲氧基-ω-巯基七(乙二醇)来合成奥瑞斯他汀试剂双-mPEG(3u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE 90和双-mPEG(5u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-val-cit-PAB-MMAE91。
实施例48：包含单一7个重复单元的乙二醇离去基团和24个单元PEG的PEG化试剂92的合成
根据Nature Protocols(2006，1，2241-2252)，使用实施例10中的化合物23来合成单-mPEG(7u)砜-(甲基-丙烯酰基)-苯甲酰胺-L-Glu-[OH]-[PEG(24u)-OMe]试剂92。
实施例49：具有聚合乙二醇离去基团的细胞毒性试剂90(对比)、91(对比)和5的抗体缀合的比较
用于将细胞毒性试剂90、91和5与曲妥珠单抗(1mg规模)缀合的反应条件与上述实施例20中的那些条件相同，在缀合反应中使用1.25％v/v MeCN作为溶剂代替DMF。2h和4h之后取反应溶液的等分部分并各自通过用N-乙酰基-L-半胱氨酸处理而淬灭。通过HIC分析各等分部分并确定％DAR产物特征。试剂90、91和5的缀合结果示于表3和图10(2小时)和11(4小时)。可见，与使用对比试剂所得结果相比，使用本发明的试剂所得的结果得到显著改善——产物的同质性高得多，产物主要是期望的DAR4缀合物。
表3：2h和4h反应之后，试剂90、91和5与抗体缀合的比较
实施例50：使用试剂92，在经还原的Fab二硫键处的PEG化
使用与实施例17中所述的条件相同的条件，使试剂92与经还原的Fab缀合。随后通过SDS-PAGE分析反应物，在相对于分子量蛋白标准品的49kDa处观察到主要产物——PEG化的Fab。
实施例51：包含奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂93的合成
步骤1：化合物94的合成
在0℃下在氮气气氛下将Boc-L-Glu(135mg)和(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)(724mg)溶于无水DMF(4mL)中并搅拌1.25h。然后将该溶液加到H2N-PEG(12u)-Me(685mg)和NMM(180μL)于DMF(3mL)中的溶液中。然后在N2下搅拌溶液4h。然后在0-4℃下在氮气气氛下搅拌溶液4.5h。加入另外的BOP(241mg)和NMM(60μL)，使反应混合物在4℃下静置24h。真空除去挥发物并将所得残余物通过反相C18快速色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至65∶35v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂。通过正相快速色谱法重新纯化材料，所述色谱法用乙酸乙酯∶甲醇(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成无色油状的Boc-Glu-[PEG(12u)-Me]2化合物94(450mg)。m/z[M+H]+(1331，100％)，[M+2H]2+(665，100％)。
步骤2：化合物95的合成
将化合物94(450mg)溶于DCM(25mL)中，向其中加入TFA(2.5mL)。在室温下搅拌溶液5h。然后真空除去挥发物。将所得残余物通过反相C18快速色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至60∶40v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色胶状的Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2TFA化合物95(320mg)m/z[M+Na]1+(1253.0，10％)[M+H]2+(616.8，100％)。
步骤3：化合物96的合成
向Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(36mg)于无水DMF(2mL)中的搅拌溶液中加入HATU(37mg)。在0℃下在氮气气氛下搅拌反应混合物1h，然后加入化合物95(103.5mg)和NMM(19μL)于DMF(1mL)中的溶液。加入额外的DMF(1mL)。使搅拌的反应物升温至室温并保持5h以上。真空除去挥发物。将所得浅黄色油通过反相C18快速色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至50∶50v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色糊状的Fmoc-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物96(173mg)。m/z[M+1]+(1638，100％)&[M+Na]+(1660，57％)。
步骤4：化合物97的合成
向化合物96(173mg)于无水DMF(3.2mL)中的搅拌溶液中加入哌啶(104μL)。在室温下在氩气下搅拌溶液1.5h。真空除去挥发物并用己烷重复研磨残余物。真空干燥产物以生成澄清的无色油状的L-Glu-(OtBu)-L-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物97(152mg)。m/z[M+H]1+(1416.7，85％)，[M+2H]2+(708.5，100％)，[M+Na]1+(1438.7，30％)。
步骤5：化合物98的合成
向4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸(114mg)于无水DMF(3mL)中的搅拌溶液中加入HATU(51mg)。在0℃下搅拌反应混合物0.5h，然后将其加到L-Glu(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2(152mg)于DMF(2mL)中的溶液中，并用另外的DMF(1mL)冲洗，然后用NMM(15μL)冲洗。在0-15℃下搅拌反应混合物3.5h，然后真空除去挥发物。将所得残余物通过反相C18快速色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至55∶45v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-(OtBu)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2化合物98(161mg)。m/z[M+H]1+(2366.7，100％)，[M+2H]2+(1184.0，80％)[M+H2O]3+(795.5，100％)。
步骤6：化合物99的合成
向化合物98(58mg)于无水DCM(6mL)中的搅拌溶液中加入TFA(6mL)。在室温下搅拌反应混合物2h，然后真空除去挥发物，将所得残余物溶于水(25mL)并冷冻干燥以生成澄清的无色油状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-(OH)-Glu-[HN-PEG(12u)-OMe]2化合物99(160.6mg)。m/z[M+H]1+(2306.8，90％)，[M+2H]2+(1153.0，100％)。
步骤7：试剂93的合成
以与实施例11A中试剂24的合成方法类似的方法，从化合物99和val-cit-PAB-MMAE TFA盐合成试剂93。双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-(val-cit-PAB-MMAE)-Glu-[HN-PEG(12u)-Me]2 93是作为无色油而分离的(69％)。m/z[M+H]1+(3410.4，90％)，[M+2H]2+(1706.2，60％)，[M+3H]3+(1137.2，85％)，[M+4H]4+(852.8，70％)。
如实施例21所述，使Brentuximab与缀合试剂93的缀合反应进行16h。分析性HIC的结果表明，转化为DAR4产物的转化率为67％。
实施例52：包含奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂100的合成
以与实施例11A中试剂24的合成方法类似的方法，使用化合物20B替代化合物23，以及val-cit-PAB-MMAE TFA盐替代val-cit-AHX-DM1，合成试剂100。
以与实施例10中化合物23的合成方法类似的方法，使用H2N-PEG(12u)-三(m-dPEG(24u)替代H2N-PEG(24u)，制备化合物20B。双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-L-Glu-[val-cit-PAB-MMAE]-[PEG(12u)-三(m-dPEG(24u))]100是作为无色油而分离的。m/z[M+2H]2+(3166，20％)，[M+3H]3+(2111，50％)，[M+4H]4+(1583，100％)。
如实施例21所述，使Brentuximab与缀合试剂100的缀合反应进行16h。分析性HIC的结果表明，转化为DAR4产物的转化率为65％。
实施例53：包含两个奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂101的合成
步骤1：化合物102的合成
向Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH(2g)于无水DMF(18mL)中的搅拌溶液中加入HOBt(666mg)和DIC(768μL)。在0℃下搅拌反应混合物10min，然后在室温下搅拌2.5h。在室温下加入H-L-Glu-(OtBu)-OH(1.19g)和DIPEA(2.46mL)并搅拌反应混合物18h。将反应混合物用水(100mL)稀释，并通过加入稀HCl将反应混合物酸化至pH 2.0。用EtOAc(3×100mL)萃取水层，合并有机相并用水(2×50mL)和饱和盐水溶液(1×50mL)冲洗。将EtOAc层通过Na2SO4干燥2h，然后在旋转蒸发器上浓缩。将产物通过反相C18快速色谱法分离，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至80∶20v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的化合物Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH 102(875mg)。m/z[M+H]1+(610.8，85％)，[M+Na]1+(633.1，55％)，[2M+Na]+(1243.2，55％)。
步骤2：化合物103的合成
向Fmoc-L-Glu-(OtBu)-L-Glu-(OtBu)-OH(510mg)和NH2-PEG(24u)-OMe(1g)于无水DMF(5mL)中的搅拌溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(44μL)和HATU(48mg)。在0℃下搅拌反应混合物10min，然后在室温下搅拌16h。将溶液真空浓缩至2ml，并将残余物通过反相C18快速色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％甲酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％甲酸(100∶0v/v至83∶17v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色糊状的Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物103644mg)。m/z[M+H]1+(1681.0，40％)，[M+Na]1+(1704.0，30％)和[M+2H]2+(841.4，55％)。
步骤3：化合物104的合成
向Fmoc-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe(193mg)于无水DMF(900μL)中的搅拌溶液中加入哌啶(34μL)，并在室温下搅拌反应混合物1h。将溶液真空浓缩至干燥，并用Et2O(2×2.5mL)研磨残余物。真空干燥产物以生成米黄色固体状的H-L-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe化合物104(166mg)。
步骤4：化合物105的合成
以与实施例10中化合物23的合成方法类似的方法，从化合物104和4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸来合成试剂105。双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-PEG(24u)-OMe 105是作为无色油而分离的。m/z[M+H]1+(2407.2，25％)，[M+Na]1+(2429.4，70％)。
步骤5：化合物106的合成
以与实施例10中试剂23的合成方法类似的方法，从化合物105合成试剂106。双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-Glu-(OH)-Glu-(OH)-PEG(24u)-OMe 106是作为无色油而分离的。m/z[M+H]1+(2294.2，20％)，[M+Na]1+(2317.4，10％)和[M+2Na]2+(1217.4，100％)。
步骤6：试剂101的合成
向化合物106(28mg)、val-cit-PAB-MMAE TFA盐(31mg)和HATU(14mg)于无水DMF(1.5mL)中的搅拌溶液中加入N-甲基吗啉(7μL)，并在0℃下搅拌反应混合物5h。将溶液用水(1mL)稀释并通过反相C18快速色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶5％乙腈∶0.1％TFA和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.1％TFA(100∶0v/v至60∶40v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的双-mPEG(7u)砜-丙酰基-苯甲酰胺-双-[Glu-(val-cit-PAB-MMAE)]-PEG(24u)-OMe化合物101(36mg)。m/z[M+2H]2+(2252.7，20％)，[M+3H]3+(1501.6.7，40％)和[M+4H]4+(1126.6，100％)。
如实施例21所述，使Brentuximab与缀合试剂101的缀合反应进行16h。分析性HIC的结果表明，转化为DAR4产物的转化率为56％。
实施例54：包含两个奥瑞斯他汀细胞毒性有效载荷的缀合试剂107的合成
步骤1：化合物108的合成
向Boc-L-Glu(OH)-OH(51.6mg)于无水DMF(6mL)中的搅拌溶液中加入BOP(277mg)。在0℃下搅拌溶液20min，然后加入MeO-PEG(24)-NH2(500mg)，之后加入NMM(69μL)。4h之后，加入额外量的BOP(92mg)和NMM(23μL)。再过2.5h之后，将反应混合物贮存在-20℃下18h，然后真空浓缩并通过反相柱C18柱色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体(373mg)。将甲酸(6mL)加到所述固体中，并在惰性气氛下搅拌所得混合物60min，然后真空浓缩。将残余物溶于95％水∶5％乙腈∶0.05％三氟乙酸(约6mL)并冷冻干燥过夜以生成米黄色固体状的TFA·H2N-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe，化合物108(330mg)。m/z[M+2H]2+(1144，5％)，[M+3H]3+(763，35％)，[M+4H]+(573，100％)。
步骤2：化合物109的合成
在0℃下向Fmoc-Glu(OtBu)-OH(2g)于无水DMF(18mL)中的搅拌溶液中加入HOBt(666mg)和DIC(768μL)。使反应混合物升温至室温，2h之后加入Glu(OtBu)-OH(1.19g)和DIPEA(2.46mL)。搅拌20h之后，将反应混合物真空浓缩并通过反相柱C18柱色谱法纯化，所述色谱法用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-OH，化合物109，其为白色固体(1.03g)。m/z[2M+H]+(1221，15％)，[M+H]+(611，60％)，[M-tBu+H]+(554，65％)，[M-2tBu+H]+(499，100％)。
步骤4：化合物110的合成
向化合物108(330mg)于无水DMF(10mL)中的搅拌溶液中加入化合物109(100mg)。然后在0℃下加入HATU(156mg)和NMM(45μL)并搅拌所得溶液5min，然后再加入NMM(3μL)和HATU(11mg)。将反应溶液再搅拌20min，然后升温至室温，再继续搅拌4h。然后加入额外量的HATU(51mg)和NMM(15μL)。再过1.5h之后，将混合物在-20℃下贮存18h，然后通过反相C18柱色谱法纯化，用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的Fmoc-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe，化合物110(193mg)。m/z[M+3H]3+(961，20％)，[M-tBu+4H]4+(707，100％)，[M-2tBu+4H]4+(693，85％)，[M+5H]5+(577，75％)。
步骤5：化合物111的合成
向111(193mg)于无水DMF(1.5mL)中的搅拌溶液中加入哌啶(20μL)。90min之后，加入额外量的哌啶(13μL)，将反应溶液再搅拌90min，然后在-20℃下贮存18h。在高真空下除去溶剂并在己烷中研磨所得残余物。将残余物在高真空下进一步干燥30min，然后将其溶于缓冲液A∶缓冲液B的50∶50混合物(2mL，缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸)中，并冷冻干燥过夜以生成淡蓝色固体状的TFA·H2N-(L-Glu(OtBu))2-L-Glu(PEG(24)-OMe)-PEG(24)-OMe，化合物111(186mg)。m/z[M+3H]3+(887，20％)，[M+4H]4+(666，100％)，[M+5H]5+(533，30％)。
步骤6：化合物112的合成
向4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸(71mg)于无水DMF(1.5mL)中的搅拌溶液中加入HATU(28mg)。将混合物冷却至0℃并在惰性气氛下搅拌30min。加入111(186mg)于无水DMF(2.5mL)中的溶液，然后加入HATU(22.9mg)和NMM(14.7μL)，并使混合物升温至室温。
3h之后，加入额外量的4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸(18mg)、HATU(50.8mg)和NMM(15μL)。再过1.5h之后，加入额外量的4-[2，2-双[α-甲氧基-ω-磺酰基七(乙二醇)]乙酰基]苯甲酸(9mg)、HATU(51mg)和NMM(15μL)。将反应混合物再搅拌8h，并通过反相C18柱色谱法纯化两次，用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成浅黄色油状的112(假定的定量)。m/z[M+4H]4+(902，60％)，[M-tBu+4H]4+(888，60％)，[M-2tBu+4H]4+(874，45％)，[M-tBu+5H]5+(711，100％)。
步骤7：化合物113的合成
在惰性气氛下将甲酸(2mL)加到112中。搅拌反应混合物60min，然后真空浓缩。将所述材料通过反相C18柱色谱法纯化，用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成无色油状的113(28.1mg)。m/z[M+3H]3+(1165，5％)，[M+4H]4+(874，65％)，[M+5H]5+(699，100％)。
步骤7：试剂107的合成
向113(15mg)于无水DMF(270μL)中的搅拌溶液中加入HATU(4mg)。将混合物冷却至0℃并在惰性气氛下搅拌20min。加入val-Cit-PAB-MMAE(12mg)于无水DMF(300μL)中的溶液，然后加入HATU(2.5mg)和NMM(2μL)，并使混合物升温至室温。4h 20min之后，加入额外量的HATU(3.3mg)和NMM(0.9μL)。将反应混合物再搅拌2h，然后在-20℃下贮存18h。升温至室温之后，向搅拌的溶液中加入HATU(3.3mg)和NMM(0.9μL)。4.5h之后，加入额外量的HATU(1.6mg)和NMM(0.5μL)并将反应混合物再搅拌2.5h，然后在-20℃下贮存18h。将材料通过反相C18柱色谱法纯化，用缓冲液A(v/v)——水∶0.05％三氟乙酸和缓冲液B(v/v)——乙腈∶0.05％三氟乙酸(100∶0v/v至0∶100v/v)洗脱。真空除去有机溶剂并通过冷冻干燥法除去水性溶剂以生成白色固体状的107(13.8mg)。m/z[M+4H]4+(1426，5％)，[M+5H]5+(1141，70％)，[M+6H]6+(951，100％)，[M+7H]7+(815，20％)。
如实施例21所述，使Brentuximab与缀合试剂107的缀合反应进行17h。分析性HIC的结果表明，转化为DAR4产物的转化率为61％。

Claims (22)

1.一种能够与肽或蛋白质中存在的至少一个亲核基团反应的缀合试剂，其包含至少一个离去基团，所述离去基团在与所述亲核基团反应时失去，其特征在于所述离去基团包含-(CH2CH2O)n-部分，其中n是6或更大的数值。
2.权利要求1的缀合试剂，其中n为6至9。
3.权利要求1或权利要求2的缀合试剂，其中-(CH2CH2O)n-部分的分子量最高达5kDa。
4.前述权利要求中任一项的试剂，其中所述离去基团是式-SP、-OP、-SO2P、-OSO2P、-N+PR2R3的基团，或式-S-P-S-、-O-P-O-、-SO2-P-SO2-、-OSO2-P-OSO2-或-N+R2R3-P-N+R2R3-的基团，其中P是包含-(CH2CH2O)n-部分的基团，并且R2和R3各自独立地代表氢原子或C1-4烷基或基团P。
5.权利要求4的试剂，其中所述离去基团是式-SO2P的基团。
6.前述权利要求中任一项的试剂，其中所述离去基团包括-(CH2CH2O)n-R1，其中R1是封端基团；或其中所述-(CH2CH2O)n-基团在所述试剂内具有两个连接点。
7.权利要求1至4中任一项的试剂，其中所述离去基团是-S-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-S-、-O-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-O-、-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-、-OSO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-OSO2-、-N+R2R3-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-N+R2R3-或下式基团之一：
其中R1是封端基团，R2和R3各自独立地代表氢原子或C1-4烷基。
8.权利要求7的试剂，其中所述离去基团是-SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-。
9.权利要求6或权利要求7的试剂，其中R1代表氢原子、C1-4烷基、任选取代的芳基或式-CH2CH2CO2H或-CH2CH2NH2的基团。
10.前述权利要求中任一项的试剂，其携带有效载荷，所述有效载荷为诊断、治疗或标记试剂或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。
11.前述权利要求中任一项的试剂，其包含以下官能团：
其中一个L是离去基团，其包含-(CH2CH2O)n-部分，其中n是6或更大的数值，并且另一个L是离去基团，其包含-(CH2CH2O)n-部分，其中n是6或更大的数值，或是另一种结构的离去基团；或所述试剂包含以下官能团：
其中一个L是离去基团，其包含-(CH2CH2O)n-部分，其中n是6或更大的数值。
12.权利要求1至10中任一项的试剂，其包含官能团I、I′、II或III：
其中W代表吸电子基团；A代表C1-5亚烷基链或亚烯基链；B代表键或C1-4亚烷基链或亚烯基链；或者一个L是包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值，并且另一个L是包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值，或是另一种结构的离去基团，或者两个L共同代表包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值；
其中W和A具有通式I中给出的含义，m是0至4，L是包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值；
～W-CR4R4′-CR4.L.L′ (II)
其中W具有通式I中给出的含义，并且(i)每个R4代表氢原子或C1-4烷基，R4′代表氢原子，L是包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值，并且L′是包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值，或是另一种结构的离去基团，或L和L′共同代表包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值；或(ii)每个R4代表氢原子或C1-4烷基，L代表包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值，并且R4′和L′共同代表键；
～W-(CH＝CH)p-(CH2)2-L (III)
其中W具有通式I中给出的含义，p代表0或1至4的整数，L代表包含-(CH2CH2O)n-部分的离去基团，其中n是6或更大的数值。
13.权利要求12的试剂，其具有以下通式：
或
D-Q-W-CR2R2′-CR2.L.L′ (IIa)
或
D-Q-(CH＝CH)p-(CH2)2-L (IIIa)
其中Q代表连接基团并且D代表有效载荷，所述有效载荷为诊断、治疗或标记试剂或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。
14.权利要求12的试剂，其包含官能团：
或
～NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIa)
其中Ar代表苯基。
15.权利要求14的试剂，其具有通式：
或
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIb)
其中Q代表连接基团并且D代表有效载荷，所述有效载荷为诊断、治疗或标记试剂或用于诊断、治疗或标记试剂的结合剂。
16.权利要求13或权利要求15的试剂，其中D-Q包含药物或聚合物或包含药物和聚合物两者。
17.权利要求16的试剂，其中如果存在药物，则所述药物为细胞毒性药物，并且如果存在聚合物，则所述聚合物为聚乙二醇。
18.一种能够与肽或蛋白质中存在的两个亲核基团反应的缀合试剂，其包含离去基团，所述离去基团在与所述亲核基团反应时失去，其特征在于所述离去基团在所述缀合试剂内具有两个连接点，并且包含-(CH2CH2O)n1-部分，其中n1是2或更大的数值。
19.权利要求18的缀合试剂，其中n1为5至9。
20.一种肽或蛋白质的缀合方法，其包括使所述肽或蛋白质与权利要求1至19中任一项的缀合试剂反应。
21.权利要求20的方法，其中所述蛋白质是受体或配体结合蛋白或抗体或抗体片段。
22.通过权利要求20或权利要求21的方法制备的蛋白质或肽缀合物。
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