CN107281498A - 一种聚乙二醇修饰的铁离子螯合剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的铁离子螯合剂及其制备方法。该铁离子螯合剂由生物相容性好的聚乙二醇的衍生物与去铁胺组成。其制备方法是：通过羧基化聚乙二醇单甲醚或者醛基化聚乙二醇单甲醚与去铁胺进行共价结合，得到聚乙二醇修饰的去铁胺。本发明公开的铁离子螯合剂与去铁胺相比具有长效低毒的优点，将在铁离子过载相关疾病的治疗中具有潜在应用价值。

Description

一种聚乙二醇修饰的铁离子螯合剂

技术领域

本发明属于化学改性的缩聚物领域，具体涉及一种去铁胺接枝聚乙二醇，还涉及其作为铁离子螯合剂的应用。

背景技术

铁离子过载与许多临床疾病有关，比如地中海贫血，中风，阿茨海默、帕金森病等神经退变性疾病。

去铁胺是临床上通用的一种铁离子螯合剂，对铁离子过载相关的疾病具有治疗作用。但是其具有明显的缺陷：1、血液中的去铁胺会被体内的酶快速降解，其体内半衰期不足30分钟，导致药效不佳，需要加大用药剂量或者延长用药时间；2、具有毒性，会引起许多不良反应，如，低血压和心动过速(参见俞天骥，去铁胺——老药新毒性，国外医学：药学分册，1991.P249,)，特别是在高剂量的时候，其不良反应特别明显。为了兼顾药效和安全，目前通常的治疗方式低剂量长时间的静脉注射，以维持体内浓度以达到一定效果，但是该种治疗方法十分不便，患者依从性差。

因此，急需对去铁铵进行改进，提高其半衰期，降低其毒性。

发明内容

本专利的目的在于提供一种具有长效低毒的聚乙二醇衍生物修饰的去铁胺螯合剂。

本发明公开了一种铁离子螯合剂，它是由聚乙二醇衍生物和去铁胺通过酰胺键共价连接得到。

进一步地，本发明的铁离子螯合剂具有下述式(Ⅰ)所示的结构：

R_n-DFO

(I)

其中，R_n表示聚乙二醇衍生物主链，DFO表示去铁胺基，DFO结构如下：

进一步地，所述聚乙二醇衍生物为羧基化的聚乙二醇单甲醚或醛基化的聚乙二醇单甲醚。

进一步地，所述聚乙二醇衍生物主链的分子量为2kDa～20kD。

本发明化合物制备方法为如下两种制备方法之一：

(1)将羧基化的聚乙二醇单甲醚溶于溶剂中，按比例加入去铁胺、二环己基碳二亚胺(DCC)/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，调节pH值，反应结束后分离纯化即得；

(2)将醛基化的聚乙二醇单甲醚溶于溶剂中，按比例加入去铁胺和硼氢化试剂，调节pH值，反应结束后分离纯化即得。

进一步地，反应条件为避光反应24～48h，反应温度为0～25℃，反应的pH值为6.8～8.2。

进一步地，反应的pH值通过4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液或者通过加入三乙胺进行调节。

进一步地，所述聚乙二醇单甲醚与去铁胺的摩尔配比范围为：1:1.2～1:2。

进一步地，所述溶剂选自水、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺，优选为甲醇或者水。

进一步地，制备方法(1)所述聚乙二醇单甲醚：去铁胺：EDC/DCC：NHS的摩尔比为1:1.2:1.2:1.2～1:2:2:2。

进一步地，制备方法(2)所述硼氢化试剂为氰基硼氢化钠或硼氢化纳。

进一步地，制备方法(2)所述聚乙二醇单甲醚：去铁胺：硼氢化试剂的摩尔比为1:1.2:2-1:2:20。

进一步地，所述提纯方法为经硅胶柱和/或阳离子交换柱提纯。

本发明提供了所述化合物作为铁离子螯合剂的应用。

与去铁铵相比，本发明铁离子螯合剂的半衰期显著延长、毒性大大降低，而且其螯合铁离子的能力没有变化，因此，将其注入体内，药效会明显提高，同时毒性大大减小，安全性明显提升，临床应用前景优良。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.铁离子螯合剂合成示意图。

图2.实施例1产物的红外谱图。

图3.实施例3产物的核磁谱图。

图4.去铁胺和实施例1和2的螯合铁离子紫外吸收光谱。

图5.去铁胺和实施例1、3、5和6化合物的半衰期。

图6.不同浓度去铁胺和实施例1、3、5和6化合物的细胞毒性测试结果

具体实施方式

本发明所用原料和试剂均来自于市售的商品。

羧基化聚乙二醇单甲醚、醛基化聚乙二醇单甲醚购自厦门赛诺邦格生物科技有限公司；去铁胺、EDC、NHS购自sigma，DCC、硼氢化钠和氰基硼氢化钠购自阿拉丁。

EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺

DCC：二环己基碳二亚胺

本发明所使用的仪器型号为：红外(Nicolet 6700，核磁(Bruker AV II-400MHz)，紫外-可见光谱仪(Bioteck Eon)。

本发明铁离子螯合剂的合成步骤如图1所示。

实施例1

1克羧基化聚乙二醇单甲醚(分子量2kDa)溶于10毫升HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液中，按照1:2:2:2(羧基化聚乙二醇单甲醚中的羧基摩尔比为1)的摩尔比例加入去铁胺、EDC和NHS，避光搅拌24小时后，反应溶液经过硅胶柱和阳离子交换柱提纯，得到产物聚乙二醇单甲醚修饰的去铁胺铁离子螯合剂MPEG_2k-DFO。

红外光谱测试：KBr压片法，测试结果如图2所示。特征峰归属为：3445cm^-1(聚乙二醇单甲醚分子中的O-H伸缩振动)；3300cm^-1(去铁胺分子中的N-H伸缩振动)；2878cm^-1(聚乙二醇单甲醚和去铁胺分子中的CH2对称伸缩振动)；1650cm^-1(酰胺Ⅰ带，C＝O伸缩振动)；1551cm^-1(去铁胺分子中的N-H弯曲振动)；1467cm^-1(聚乙二醇单甲醚和去铁胺分子中的CH₂弯曲振动)；1100cm^-1(聚乙二醇单甲醚分子中的C-O-C伸缩振动)。

以上红外检测结果表明：聚乙二醇单甲醚成功对去铁胺进行了化学修饰。

实施例2

1克羧基化聚乙二醇单甲醚(分子量2kDa)溶于10毫升甲醇溶液中，置于冰浴中，按照1:1.2:1.2:1.2(羧基化聚乙二醇单甲醚中的羧基摩尔比为1)的摩尔比例分别加入去铁胺、DCC和NHS，最后滴加三乙胺调节pH至7～8，避光搅拌24小时后，反应溶液先经乙醚沉淀后旋转蒸发得到粗产物，然后经过硅胶柱和阳离子交换柱提纯，得到产物聚乙二醇单甲醚修饰的去铁胺铁离子螯合剂MPEG_2k-DFO-2。

实施例3

1克醛基化聚乙二醇单甲醚(分子量5kDa)溶于10毫升超纯水中，按照1:2:2(醛基化聚乙二醇单甲醚中的醛基摩尔比为1)的摩尔比例分别加入去铁胺和氰基硼氢化钠，在10℃避光搅拌48小时后，反应溶液经过硅胶柱提纯，得到产物聚乙二醇单甲醚修饰的去铁胺铁离子螯合剂MPEG_5k-DFO。

核磁氢谱测试：将40mg样品溶于1ml D₂O中，25℃检测，结果如图3所示。

特征峰归属为：3.6和3.3ppm分别对应聚乙二醇单甲醚中甲氧基和亚甲基中的氢；3.4ppm对应去铁胺分子中的H-5,H-12和H-19；3.1ppm对应去铁胺分子中的H-1,H-8和H-15；2.8ppm对应去铁胺分子中的H-6和H-13；2.3和2.4ppm对应去铁胺分子中的H-14和H-7；2.0ppm对应–CH₃；1.5ppm对应去铁胺分子中的H-2,H-4，H-11和H-18；1.4ppm对应去铁胺分子中的H-9和H-16；1.2ppm对应去铁胺分子中的H-3,H-10和H-17。

以上核磁氢谱结果表明聚乙二醇单甲醚对去铁胺成功进行了化学修饰。

实施例4

1克醛基化聚乙二醇单甲醚(分子量5kDa)溶于10毫升甲醇溶液中，按照1:2:2(醛基化聚乙二醇单甲醚中的醛基摩尔比为1)的摩尔比例加入去铁胺和氰基硼氢化钠，在室温25℃避光搅拌24小时后，反应溶液先经乙醚沉淀后旋转蒸发得到粗产物，然后经过硅胶柱提纯，得到产物聚乙二醇单甲醚修饰的去铁胺铁离子螯合剂MPEG_5k-DFO-2。

实施例5

1克羧基化聚乙二醇单甲醚(分子量10kDa)溶于20毫升HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液中，按照1:2:2:2(羧基化聚乙二醇单甲醚中的羧基摩尔比为1)的摩尔比例加入去铁胺、EDC和NHS，在室温25℃避光搅拌24小时后，反应溶液经过硅胶柱和阳离子交换柱提纯，得到产物聚乙二醇单甲醚修饰的去铁胺铁离子螯合剂MPEG_10k-DFO。

实施例6

1克醛基化聚乙二醇单甲醚(分子量20kDa)溶于20毫升二氯甲烷溶液中，按照1:2:20(醛基化聚乙二醇单甲醚中的醛基摩尔比为1)的摩尔比例加入去铁胺和硼氢化钠，在室温25℃避光搅拌48小时后，反应溶液先经乙醚沉淀后旋转蒸发得到粗产物，然后经过硅胶柱提纯，得到产物聚乙二醇单甲醚修饰的去铁胺铁离子螯合剂MPEG_20k-DFO。

本发明通过以下试验说明本发明的有益效果。

试验例1铁离子螯合能力检测

铁离子螯合能力采用紫外吸收光谱法检测(Tian,et al.,RSC Advances,2016,6,32471–32479)。如图4所示，去铁胺螯合铁离子的特征吸收峰在429nm。实施例1和例2的产品螯合铁离子后的吸收峰也在429nm，并根据去铁胺浓度-吸光度标准曲线计算实施例1和例2产品中的去铁胺含量，结果表明与其分子结构式中的理论含量是一致的。上述结果表明，实施例1和实施例2制备的螯合剂与相同摩尔浓度的去铁胺螯合铁离子的能力相同，去铁胺接枝上聚乙二醇并不影响其对铁离子的螯合能力。

试验例2半衰期检测

半衰期采用代谢实验检测(Meyer-brunot&Keberle，Biochem.Pharmaco.l,1967,16,527-535)。步骤为：样品采用实施例1、3、5和6中得到的产品，分别为MPEG_2k-DFO，MPEG_5k-DFO，MPEG_10k-DFO和MPEG_20k-DFO。样品和去铁胺对照(DFO)分别溶于10毫升KRB(Krebs-Ringer bicarbonate,克-林二氏重碳酸盐)缓冲液后加入2毫升新鲜血浆，然后在37℃，95％氧气和5％二氧化碳气氛中震荡，每隔一定时间吸出1毫升反应液，经处理后采用紫外-可见光谱在429nm检测吸光度。对应标准曲线计算出孵化不同时候后孵化液中的有效去铁胺浓度。然后将时间和对应浓度作图，曲线经拟合后计算半衰期。

根据图5所示，去铁胺的半衰期仅为0.8小时，而螯合剂的半衰期分别为18.2、27.8、36.9和42.2小时。本发明制备的乙二醇修饰的铁离子螯合剂大幅度延长了去铁胺的半衰期。

试验例3细胞毒性

采用MTT法检测细胞毒性。样品采用实施例1、3、5和6中得到的产品，分别为MPEG_2k-DFO、MPEG_5k-DFO、MPEG_10k-DFO和MPEG_20k-DFO。各样品分别溶于磷酸缓冲液PBS中配制成含10mM等效DFO浓度的溶液，用于细胞试验时，再用培养基稀释成含0.5、0.2、0.1、0.05、0.01和0.005mM等效DFO浓度的溶液。对照组采用等体积的PBS加入培养基。人脐静脉内皮细胞按3×10³的密度种于96孔板，24小时后吸弃培养基，加入上述含不同浓度的螯合剂培养基，继续培养48小时，然后采用MTT法检测人脐静脉内皮细胞毒性(Tian,et al.,CarbohydratePolymers,2010,79,137-144)。

细胞存活率MTT测试结果依次如图6所示。

去铁胺具有剂量依赖性的细胞毒性，从图中看出当DFO的浓度高于0.05mM时培养48小时后细胞活率低于60％。相对比，各产品组的等效DFO浓度在0.5mM下均表现出大于80％的细胞活率。

以上结果表明：螯合剂的细胞毒性明显小于对照组去铁胺的细胞毒性。

本发明公开的聚乙二醇衍生物键接去铁胺制备的铁离子螯合剂具有长效低毒的作用。具体地，本发明通过将去铁胺与乙二醇链链接，克服了去铁胺在体内半衰期短的问题，同时，等效去铁胺浓度的铁离子螯合剂细胞毒性比去铁胺的细胞毒性小，降低了去铁胺的毒副作用，明显优于单独的去铁胺。

Claims (10)

1.一种铁离子螯合剂，其特征在于：它是由聚乙二醇衍生物和去铁胺通过共价键连接得到。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：它具有式(Ⅰ)所示的结构：

R_n-DFO

(I)

其中，R_n表示聚乙二醇衍生物主链，DFO表示去铁胺基，DFO结构如下：

3.根据权利要求1所述化合物，其特征在于：所述聚乙二醇衍生物为羧基化的聚乙二醇单甲醚或醛基化的聚乙二醇单甲醚，聚乙二醇衍生物主链的分子量为2kDa～20kDa。

4.一种权利要求1～3任一项所述化合物的制备方法，其特征在于：其制备方法为如下两种制备方法之一：

(1)将羧基化的聚乙二醇单甲醚溶于溶剂中，按比例加入去铁胺、二环己基碳二亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH值，反应结束后分离纯化即得；

(2)将醛基化的聚乙二醇单甲醚溶于溶剂中，按比例加入去铁胺和硼氢化试剂，调节pH值，反应结束后分离纯化即得。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述溶剂选自水、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺；反应条件为避光反应24～48h，反应温度为0～25℃，反应的pH值为6.8～8.2。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：所述溶剂为甲醇或者水；所述反应的pH值通过4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液或者通过加入三乙胺进行调节。

7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：方法(1)所述聚乙二醇单甲醚：去铁胺：二环己基碳二亚胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2:2:2～1:1.2:1.2:1.2；方法(2)聚乙二醇单甲醚：去铁胺：硼氢化试剂的摩尔比为1:1.2:2～1:2:20。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于：所述硼氢化试剂为硼氢化钠或氰基硼氢化钠。

9.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述提纯方法为经硅胶柱和/或阳离子交换柱提纯。

10.权利要求1～3任一项所述化合物作为铁离子螯合剂的应用。