CN104147613B - 一种高分子抗肿瘤前药及其制备方法 - Google Patents
一种高分子抗肿瘤前药及其制备方法 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本申请提供了一种高分子抗肿瘤前药，具有式(I)、式(II)或式(III)所示结构。本申请提供的高分子抗肿瘤前药包括PEG衍生物和阿霉素，PEG衍生物和阿霉素通过间隔基丙氨酸‑丙氨酸‑天冬酰胺‑亮氨酸(Ala‑Ala‑Asn‑Leu)相连，所述Ala‑Ala‑Asn‑Leu为对肿瘤内蛋白酶敏感的多肽。本申请提供的高分子抗肿瘤药物在延长药物半衰期和降低药物毒副的同时保证了药物在病灶部位的快速释放，而从提高了药物治疗效果。实验结果表明，在本申请提供的高分子抗肿瘤前药为10μg/mL时，正常细胞的存活率高于65％，癌细胞的存活率低于25％。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，尤其涉及一种高分子抗肿瘤前药及其制备方法。
背景技术
癌症的治疗中，药物治疗是一个很重要的环节，有效的抗癌药物的使用，可以帮助患者获得更长的生存时间。目前，常见的抗癌药物有化疗药物、中药、生物制药、靶向药物等。
阿霉素(DOX)作为一种化疗药物，自上世纪60年代以来，就被广泛用于临床化疗，其作用机制主要是阿霉素分子能作用于细胞DNA或RNA，抑制其合成，进而有效杀死肿瘤细胞。阿霉素的抗瘤谱较广，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，适用于急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。目前，阿霉素的给药方式多为静脉滴注，静注后药物迅速分布全身，毒副作用大，主要表现为：白细胞和血小板减少、脱发、心脏毒性、药物溢出导致组织溃疡及坏死。同时，药物在血液中的半衰期短，到达病灶部位的比例很低。
为提高阿霉素到达病灶部位的比例，降低毒副作用，需要使用药物载体将其传送到病灶部位。其中，使用较多的药物载体是纳米级和微米级尺度的高分子载体，高分子载体可有效改善阿霉素的药代动力学，延长其在体内的循环时间，减少毒副作用。目前，应用较为广泛的高分子载体是聚乙二醇(PEG)及其衍生物，PEG及其衍生物作为药物载体可以和阿霉素形成稳定的高分子结构，从而延长药物在体内的半衰期，降低药物在血液循环过程中非特异性释药的发生概率，降低药物的毒副作用。但是，PEG及其衍生物和阿霉素形成的稳定的高分子结构会阻碍病灶部位细胞对阿霉素的摄取，降低药物治疗效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高分子抗肿瘤前药及其制备方法，本发明提供的高分子抗肿瘤前药能够在病灶部位快速释放阿霉素，具有良好的癌细胞杀灭效果。
本发明提供了一种高分子抗肿瘤前药，具有式(I)、式(II)或式(III)所示结构:
式(I)中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
式(II)中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10；A1和A2分别独立地选自羟基或且A1和A2中至少有一个为m为聚合度，10≤m≤500；
式(III)中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选自1≤n≤10；A1、A2、A3和A4分别独立地选自羟基或且A1、A2、A3和A4中至少有一个为
m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
优选的，所述R0为C1～C5的烷基。
优选的，式(I)中，所述R2为2≤n≤4；式(II)中，所述R2和R4分别独立地选自2≤n≤4；式(III)中，所述R2、R4、R6和R8分别独立地选自2≤n≤4。
优选的，式(I)中，45≤m≤500；式(II)中，45≤m≤500；式(III)中，45≤m1≤500，45≤m2≤500，45≤m3≤500，45≤m4≤500。
本发明提供了一种高分子抗肿瘤前药的制备方法，包括以下步骤：
a)、端羧基的聚乙二醇衍生物、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸和盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药；
所述端羧基的聚乙二醇衍生物为式(IV)、式(V)或式(VI)所示结构的聚合物；
式(IV)中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
式(V)中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
(VI)式中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选1≤n≤10；m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
优选的，所述步骤a)具体为：
a1)、端羧基的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应，得到中间产物；
a2)、所述中间产物与盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药。
优选的，在步骤a1)中，所述反应在羧基活化剂存在下进行。
优选的，所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺或二环己基碳二亚胺。
优选的，在步骤a2)中，所述反应在偶联剂存在下进行。
优选的，所述偶联剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯或N,N'-羰基二咪唑。
与现有技术相比，本发明提供了一种高分子抗肿瘤前药，具有式(I)、式(II)或式(III)所示结构。本发明提供的高分子抗肿瘤前药包括PEG衍生物和阿霉素，PEG衍生物和阿霉素通过间隔基丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸(Ala-Ala-Asn-Leu)相连，所述Ala-Ala-Asn-Leu为对肿瘤内蛋白酶敏感的多肽。通过引入PEG衍生物，使本发明提供的高分子抗肿瘤前药在正常组织细胞中的稳定性提高，延长了药物在血液中的循环时间，减少了药物对正常组织细胞的毒副作用，而Ala-Ala-Asn-Leu的存在使本发明提供的高分子肿瘤前药在进入肿瘤组织后能够发生水解，水解后阿霉素从高分子抗肿瘤前药中释放出来，进入肿瘤细胞，解决了传统的PEG化抗肿瘤药物存在的PEG阻碍抗肿瘤药物的细胞摄取以及药物释放过慢的问题。本发明提供的高分子抗肿瘤药物在延长药物半衰期和降低药物毒副的同时保证了药物在病灶部位的快速释放，而从提高了药物治疗效果。实验结果表明，在本发明提供的高分子抗肿瘤前药为10μg/mL时，正常细胞的存活率高于65％，癌细胞的存活率低于25％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例5制备的中间产物(PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu)以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药、阿霉素纯药和聚乙二醇键合阿霉素的浓度与MDA-MB-435细胞存活率的关系图；
图4为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药、阿霉素纯药和聚乙二醇键合阿霉素的浓度与MCF-7细胞存活率的关系图；
图5为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药、阿霉素纯药和聚乙二醇键合阿霉素的浓度与CT26细胞存活率的关系图；
图6为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药和阿霉素纯药的细胞内吞激光共聚焦图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种高分子抗肿瘤前药，具有式(I)、式(II)或式(III)所示结构:
式(I)中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
式(II)中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10；A1和A2分别独立地选自羟基或且A1和A2中至少有一个为m为聚合度，10≤m≤500；
式(III)中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选自1≤n≤10；A1、A2、A3和A4分别独立地选自羟基或且A1、A2、A3和A4中至少有一个为
m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
本发明提供了一种具有式(I)、式(II)或式(III)所示结构的高分子抗肿瘤前药。其中，式(I)所示结构中，R0为烷基或取代烷基，优选为C1～C5的烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10，优选为2≤n≤4；m为聚合度，10≤m≤500，优选为45≤m≤500，更优选为90≤m≤450。
式(II)所示结构中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10，优选为2≤n≤4；A1和A2分别独立地选自羟基或且A1和A2中至少有一个为m为聚合度，10≤m≤500，优选为45≤m≤500，更优选为90≤m≤450。
式(III)所示结构中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选自1≤n≤10，优选为2≤n≤4；A1、A2、A3和A4分别独立地选自羟基或且A1、A2、A3和A4中至少有一个为m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，优选为45≤m1≤500，更优选为90≤m≤450；10≤m2≤500，优选为45≤m2≤500，更优选为90≤m≤450；10≤m3≤500，优选为45≤m3≤500，更优选为90≤m≤450；10≤m4≤500，优选为45≤m4≤500，更优选为90≤m≤450。
本发明提供的高分子抗肿瘤前药具有PEG衍生物结构和Ala-Ala-Asn-Leu结构。PEG衍生物结构的存在可以提高药物在正常组织细胞中的稳定性，延长药物在血液中的循环时间，减少药物对正常组织细胞的毒副作用。而Ala-Ala-Asn-Leu结构的存在使本发明提供的高分子肿瘤前药在进入肿瘤组织后发生水解，水解后，阿霉素从高分子抗肿瘤前药中释放出来，进入肿瘤细胞，解决了传统的PEG化抗肿瘤药物存在的PEG阻碍抗肿瘤药物的细胞摄取以及药物释放过慢的问题。此外，本发明提供的高分子抗肿瘤前药能够在水中自组装成型纳米粒子，具有显著的“增强渗透保留效应(EPR效应)”，通过利用EPR效应可以实现药物的靶向运输，改善药物在体内的浓度分布，提高药物的利用率。实验结果表明，在本发明提供的高分子抗肿瘤前药为10μg/mL时，正常细胞的存活率高于65％，癌细胞的存活率低于25％。
本发明提供了一种高分子抗肿瘤前药的制备方法，包括以下步骤：
a)、端羧基的聚乙二醇衍生物、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸和盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药；
所述端羧基的聚乙二醇衍生物为式(IV)、式(V)或式(VI)所示结构的聚合物；
式(IV)中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
式(V)中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
(VI)式中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选1≤n≤10；m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
本发明中，端羧基的聚乙二醇衍生物、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸和盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药。
其中，所述丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸是一种多肽，化学简称为Ala-Ala-Asn-Leu。Ala-Ala-Asn-Leu在正常组织细胞中保持稳定，而在肿瘤细胞中，会与肿瘤细胞中的天冬酰胺内肽酶发生酶解反应。所述丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸与端羧基的聚乙二醇衍生物所含羧基的摩尔比优选为0.5～3:1，更优选为1～2:1。
所述盐酸阿霉素为抗肿瘤抗生素，盐酸阿霉素通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成，对多种肿瘤细胞均有杀灭作用。所述盐酸阿霉素与端羧基的聚乙二醇衍生物所含羧基的摩尔比优选为0.5～3:1，更优选为1～2:1。
所述端羧基的聚乙二醇衍生物为式(IV)、式(V)或式(VI)所示结构的聚合物。其中，所述式(IV)所示结构的聚合物中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。本发明将R1为-O-的式(IV)所示结构的聚合物记为(IV-a)；将R1为-NH-的式(IV)所示结构的聚合物记为(IV-b)。
式(IV-a)中，R0为烷基或取代烷基；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。
式(IV-b)中，R0为烷基或取代烷基；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。
本发明对所述式(IV-a)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，可以是市售的，也可以按照以下步骤制备得到：
式(VII-a)所示结构的聚合物和环状酸酐在缚酸剂中进行反应，得到式(IV-a)所示结构的聚合物，
式(VII-a)中，R0为烷基或取代烷基；m为聚合度，10≤m≤500。所述式(VII-a)所示结构的聚合物为聚乙二醇衍生物。本发明对所述式(VII-a)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，以本领域技术人员熟知的(VII-a)所示结构的聚合物来源或市售的(VII-a)所示结构的聚合物即可。
所述环状酸酐的通式为(CH2)n(CO)2O，其中1≤n≤10。所述式(VII-a)所示结构的聚合物与环状酸酐的摩尔比优选为2:5～20，更优选为2:8～15。所述缚酸剂优选为吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉。所述缚酸剂与(VII-a)所示结构的聚合物的质量比优选为20:30～100，更优选为20:40～60。本发明中，所述式(VII-a)所示结构的聚合物和环状酸酐在缚酸剂中进行反应，得到式(IV-a)所示结构的聚合物的过程具体为：
首先，式(VII-a)所示结构的聚合物、环状酸酐和缚酸剂混合，进行反应。所述反应的时间优选为24～72h。所述反应的温度优选为室温。
反应结束后，得到反应产物溶液。将所述反应产物溶液与有机溶剂混合。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与所述缚酸剂的体积比优选为2～8:1，更优选为4～6:1。然后，向得到的混合液中加入酸液，调节pH值至7以下，优选为1～3。调节pH后的溶液依次经过洗涤、干燥和沉降，得到式(IV-a)所示结构的聚合物。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
本发明对所述式(IV-b)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，可以是市售的，也可以按照以下步骤制备得到：
式(VII-b)所示结构的聚合物和环状酸酐进行反应，得到式(IV-b)所示结构的聚合物，
式(VII-b)中，R0为烷基或取代烷基；m为聚合度，10≤m≤500。所述式(VII-b)所示结构的聚合物为端氨基的聚乙二醇衍生物。本发明对所述式(VII-b)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，以本领域技术人员熟知的(VII-b)所示结构的聚合物来源或市售的(VII-b)所示结构的聚合物即可。
所述环状酸酐的通式为(CH2)n(CO)2O，其中1≤n≤10。所述式(VII-b)所示结构的聚合物与环状酸酐的摩尔比优选为2:5～20，更优选为2:8～15。本发明中，所述式(VII-b)所示结构的聚合物和环状酸酐进行反应，得到式(IV-b)所示结构的聚合物的过程具体为：
首先，式(VII-b)所示结构的聚合物和环状酸酐混合，进行反应。所述反应的时间优选为12～48h。所述反应的温度优选为室温。所述反应优选在有机溶剂中进行。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与环状酸酐的质量比优选为100～300:1，更优选为150～250:1。
反应结束后，得到反应产物溶液。所述反应产物溶液经过洗涤、干燥和沉降后，得到式(IV-b)所示结构的聚合物。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
所述式(V)所示结构的聚合物中，R1和R3别独立的选自-NH-或-O-；R2和R4别独立的选自1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。本发明将R1和R3同时为-O-的式(V)所示结构的聚合物记为(V-a)；将R1和R3同时为-NH-的式(V)所示结构的聚合物记为(V-b)。
式(V-a)中，R2和R4别独立的选自1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。
式(V-a)中，R2和R4别独立的选自1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。
本发明对所述式(V-a)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，可以是市售的，也可以按照以下步骤制备得到：
式(VIII-a)所示结构的聚合物和环状酸酐在缚酸剂中进行反应，得到式(V-a)所示结构的聚合物，
式(VIII-a)中，m为聚合度，10≤m≤500。所述式(VIII-a)所示结构的聚合物为聚乙二醇。本发明对所述式(VIII-a)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，以本领域技术人员熟知的(VIII-a)所示结构的聚合物来源或市售的(VIII-a)所示结构的聚合物即可。
所述环状酸酐的通式为(CH2)n(CO)2O，其中1≤n≤10。所述式(VIII-a)所示结构的聚合物与环状酸酐的摩尔比优选为2:10～40，更优选为2:15～25。所述缚酸剂优选为吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉。所述缚酸剂与(VIII-a)所示结构的聚合物的质量比优选为20:30～100，更优选为20：40～60。本发明中，所述式(VIII-a)所示结构的聚合物和环状酸酐在缚酸剂中进行反应，得到式(V-a)所示结构的聚合物的过程具体为：
首先，式(VIII-a)所示结构的聚合物、环状酸酐和缚酸剂混合，进行反应。所述反应的时间优选为24～72h。所述反应的温度优选为室温。
反应结束后，得到反应产物溶液。将所述反应产物溶液与有机溶剂混合。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与所述缚酸剂的体积比优选为2～8:1，更优选为4～6:1。然后，向得到的混合液中加入酸液，调节pH值至7以下，优选为1～3。调节pH后的溶液依次经过洗涤、干燥和沉降，得到式(V-a)所示结构的聚合物。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
本发明对所述式(V-b)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，可以是市售的，也可以按照以下步骤制备得到：
式(VIII-b)所示结构的聚合物和环状酸酐进行反应，得到式(V-b)所示结构的聚合物，
式(VIII-b)中，m为聚合度，10≤m≤500。所述式(VIII-b)所示结构的聚合物为双端氨基聚乙二醇。本发明对所述式(VIII-b)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，以本领域技术人员熟知的(VIII-b)所示结构的聚合物来源或市售的(VIII-b)所示结构的聚合物即可。
所述环状酸酐的通式为(CH2)n(CO)2O，其中1≤n≤10。所述式(VIII-b)所示结构的聚合物与环状酸酐的摩尔比优选为2:10～40，更优选为2:15～25。本发明中，所述式(VIII-b)所示结构的聚合物和环状酸酐在有机溶剂中进行反应，得到式(V-b)所示结构的聚合物的过程具体为：
首先，式(VIII-b)所示结构的聚合物和环状酸酐混合，进行反应。所述反应的时间优选为12～48h。所述反应的温度优选为室温。所述反应优选在有机溶剂中进行。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与环状酸酐的质量比优选为100～300:1，更优选为150～250:1。
反应结束后，得到反应产物溶液。所述反应产物溶液经过洗涤、干燥和沉降后，得到式(V-b)所示结构的聚合物。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
所述式(VI)所示结构的聚合物中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选1≤n≤10；m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。本发明将R1、R3、R5和R7同时为-O-的式(VI)所示结构的聚合物记为(VI-a)；将R1、R3、R5和R7同时为-NH-的式(VI)所示结构的聚合物记为(VI-b)。
式(VI-a)中，R2、R4、R6和R8分别独立地选1≤n≤10；m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
式(VI-b)中，R2、R4、R6和R8分别独立地选1≤n≤10；m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
本发明对所述式(VI-a)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，可以是市售的，也可以按照以下步骤制备得到：
式(IX-a)所示结构的聚合物和环状酸酐在缚酸剂中进行反应，得到式(VI-a)所示结构的聚合物，
式(IX-a)中，m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。所述式(IX-a)所示结构的聚合物为聚乙二醇衍生物。本发明对所述式(IX-a)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，以本领域技术人员熟知的(IX-a)所示结构的聚合物来源或市售的(IX-a)所示结构的聚合物即可。
所述环状酸酐的通式为(CH2)n(CO)2O，其中1≤n≤10。所述式(IX-a)所示结构的聚合物与环状酸酐的摩尔比优选为2:20～80，更优选为2:30～50。所述缚酸剂优选为吡啶、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉。所述缚酸剂与(IX-a)所示结构的聚合物的质量比优选为20:30～100，更优选为20：40～60。本发明中，所述式(IX-a)所示结构的聚合物和环状酸酐在缚酸剂中进行反应，得到式(VI-a)所示结构的聚合物的过程具体为：
首先，式(IX-a)所示结构的聚合物、环状酸酐和缚酸剂混合，进行反应。所述反应的时间优选为24～72h。所述反应的温度优选为室温。
反应结束后，得到反应产物溶液。将所述反应产物溶液与有机溶剂混合。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与所述缚酸剂的体积比优选为2～8:1，更优选为4～6:1。然后，向得到的混合液中加入酸液，调节pH值至7以下，优选为1～3。调节pH后的溶液依次经过洗涤、干燥和沉降，得到式(VI-a)所示结构的聚合物。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
本发明对所述式(VI-b)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，可以是市售的，也可以按照以下步骤制备得到：
式(IX-b)所示结构的聚合物和环状酸酐进行反应，得到式(VI-b)所示结构的聚合物，
式(IX-b)中，m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。所述式(IX-b)所示结构的聚合物为端氨基的聚乙二醇衍生物。本发明对所述式(IX-b)所示结构的聚合物的来源没有特别限定，以本领域技术人员熟知的(IX-b)所示结构的聚合物来源或市售的(IX-b)所示结构的聚合物即可。
所述环状酸酐的通式为(CH2)n(CO)2O，其中1≤n≤10。所述式(IX-b)所示结构的聚合物与环状酸酐的摩尔比优选为2:20～80，更优选为2:30～50。本发明中，所述式(IX-b)所示结构的聚合物和环状酸酐进行反应，得到式(VI-b)所示结构的聚合物的过程具体为：
首先，式(IX-b)所示结构的聚合物和环状酸酐混合，进行反应。所述反应的时间优选为12～48h。所述反应的温度优选为室温。所述反应优选在有机溶剂中进行。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与环状酸酐的质量比优选为100～300:1，更优选为150～250:1。
反应结束后，得到反应产物溶液。所述反应产物溶液经过洗涤、干燥和沉降后，得到得到式(VI-b)所示结构的聚合物。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
本发明中，所述端羧基的聚乙二醇衍生物、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸和盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药的过程具体为：
a1)、端羧基的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应，得到中间产物；
a2)、所述中间产物与盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药。
其中，在步骤a1)中，所述反应优选在羧基活化剂存在下进行。所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺或二环己基碳二亚胺中的一种或多种。所述端羧基的聚乙二醇衍生物所含羧基与羧基活化剂的摩尔比优选为15:2～15，更优选15:5～12。
本发明中，所述步骤a1)优选分为两步进行：
a11)、端羧基的聚乙二醇衍生物与羧基活化剂反应，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物；
a12)、上述羧基活化的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应，得到中间产物。
首先，端羧基的聚乙二醇衍生物与羧基活化剂反应。所述反应的时间优选为12～48h。所述反应的温度优选为室温。所述反应优选在有机溶剂中进行。所述有机溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述有机溶剂与端羧基的聚乙二醇衍生物的质量比优选为5～20：3，更优选为10～15:3。反应结束后，得到反应产物溶液。所述反应产物溶液经过溶解、洗涤、干燥和沉降后，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。所述溶解的溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。所述洗涤的洗涤液优选为饱和食盐水，所述洗涤的次数优选为2～5次；所述干燥的干燥剂优选为无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述沉降的溶剂优选为乙醚。
制得羧基活化的聚乙二醇衍生物后，将其与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸混合，进行反应。所述反应的时间优选为24～72h。所述反应的温度低于30℃。所述反应优选在有机溶剂中进行。所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。所述有机溶剂与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸的质量比优选为20:0.05～1，更优选为20：0.1～0.15。所述反应优选在催化剂存在下进行。所述催化剂优选为三乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉。所述催化剂与与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸的摩尔比优选为2:0.5～5，更优选为2：0.5～2。所述反应优选在保护气体中进行，所述保护气体为氮气或氩气。反应结束后，得到反应产物溶液。所述反应产物溶液经过透析和干燥后，得到中间产物。所述透析的透析液优选为纯水，所述透析的时间优选为48～96h，所述透析过程中透析液的更换次数优选为5～20次；所述干燥的方式优选为冷冻干燥。
本发明中，式(IV)所示结构的端羧基的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应得到的中间产物具有式(X)所示结构；式(V)所示结构的端羧基的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应得到的中间产物具有式(XI)所示结构；式(VI)所示结构的端羧基的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应得到的中间产物具有式(XII)所示结构。
式(X)中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。
式(XI)中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500。
式(XII)中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选自1≤n≤10；m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500。
得到所述中间产物后，进行步骤a2)，所述步骤a2)具体为：
中间产物与盐酸阿霉素混合，进行反应。所述反应的时间优选为48～96h。所述反应的温度优选为室温。所述反应优选在有机溶剂中进行。所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。所述有机溶剂与盐酸阿霉素的质量比优选为5:10～30，更优选为5:15～20。所述反应优选在催化剂存在下进行。所述催化剂优选为三乙胺、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉。所述催化剂与盐酸阿霉素的摩尔比优选为1：0.5～5，更优选为1:0.5～2。所述反应优选在偶联剂存在下进行。所述偶联剂优选为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯或N,N'-羰基二咪唑。所述偶联剂与盐酸阿霉素的质量比优选为1：0.5～5，更优选为1:0.5～2。反应结束后，得到反应产物溶液。所述反应产物溶液经过透析和干燥后，得到高分子抗肿瘤前药。所述透析的透析液pH优选为酸性，更优选为5～6.5；所述干燥的方式优选为冷冻干燥。
本发明提供的高分子抗肿瘤前药制备方法以端羧基聚乙二醇、Ala-Ala-Asn-Leu、盐酸阿霉素为原料，通过缩合反应得到高分子抗肿瘤前药，该方法操作简单，易于实现。
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
将20g数均分子量为10000的聚乙二醇单甲醚加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入1g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将15g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、0.86g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.518g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将2g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.117g Ala-Ala-Asn-Leu、0.006g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(X)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-O-；R2为n＝2；m＝227。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu200mg、盐酸阿霉素17.397mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入3.033mg三乙胺和15.618mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(I)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-O-；R2为n＝2；m＝227。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例2
将20g数均分子量为10000的具有式(VII-b)结构的聚合物(其中，R0为甲基，m＝227)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入1g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将15g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、0.86g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.518g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将2g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.117g Ala-Ala-Asn-Leu、0.006g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(X)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-NH-；R2为n＝2；m＝227。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu200mg、盐酸阿霉素17.397mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入3.033mg三乙胺和15.618mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(I)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-NH-；R2为n＝2；m＝227。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例3
将20g数均分子量为10000的聚乙二醇加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入2g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将15g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、1.72g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.036g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将2g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.234g Ala-Ala-Asn-Leu、0.012g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XI)所示结构，其中，R1和R3为-O-；R2和R4为n＝2；m＝227。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu200mg、盐酸阿霉素34.794mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入6.066mg三乙胺和31.236mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(II)所示结构，其中，R1和R3为-O-；R2和R4为n＝2；A1和A2为m＝227。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例4
将20g数均分子量为10000的双端氨基聚乙二醇加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入2g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将15g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、1.72g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.036g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将2g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.234gAla-Ala-Asn-Leu、0.012g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XI)所示结构，其中，R1和R3为-NH-；R2和R4为n＝2；m＝227。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu200mg、盐酸阿霉素34.794mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入6.066mg三乙胺和31.236mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(II)所示结构，其中，R1和R3为-NH-；R2和R4为n＝2；A1和A2为m＝227。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例5
将20g数均分子量为10000的具有式(IX-a)结构的聚合物(其中，m1＝57，m2＝57，m3＝57，m4＝57)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入4g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将15g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、3.44g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.072g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将2g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.486g Ala-Ala-Asn-Leu、0.024g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，其中，核磁共振图谱参见图1。结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XII)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-O-；R2、R4、R6和R8为n＝2；m1＝57，m2＝57，m3＝57，m4＝57。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu200mg、盐酸阿霉素69.588mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入12.123mg三乙胺和62.472mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，其中，核磁共振图谱参见图2。结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(III)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-O-；R2、R4、R6和R8为n＝2；A1、A2、A3和A4为m1＝57，m2＝57，m3＝57，m4＝57。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例6
将20g数均分子量为10000的具有式(IX-b)结构的聚合物(其中，m1＝57，m2＝57，m3＝57，m4＝57)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入4g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将15g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、3.44g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.072g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将2g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.486g Ala-Ala-Asn-Leu、0.024g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XII)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-NH-；R2、R4、R6和R8为n＝2；m1＝57，m2＝57，m3＝57，m4＝57。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu 200mg、盐酸阿霉素69.588mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入12.123mg三乙胺和62.472mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(III)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-NH-；R2、R4、R6和R8为n＝2；A1、A2、A3和A4为m1＝57，m2＝57，m3＝57，m4＝57。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例7
将10g数均分子量为5000的聚乙二醇单甲醚加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入1g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将7.5g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、0.86g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.518g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将1g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.117g Ala-Ala-Asn-Leu、0.006g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(X)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-O-；R2为n＝2；m＝113。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu100mg、盐酸阿霉素17.397mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入3.033mg三乙胺和15.618mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(I)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-O-；R2为n＝2；m＝113；该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例8
将10g数均分子量为5000的具有式(VII-b)结构的聚合物(其中，R0为甲基，m＝113)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入1g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将7.5g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、0.86g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.518g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将1g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.117g Ala-Ala-Asn-Leu、0.006g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(X)所示结构，其中，R0为甲基，R1为-NH-；R2为n＝2；m＝113。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu100mg、盐酸阿霉素17.397mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入3.033mg三乙胺和15.618mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(I)所示结构，其中，R0为甲基；R1为-NH-；R2为n＝2；m＝113。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例9
将10g数均分子量为5000的聚乙二醇加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入2g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将7.5g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、1.72g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.036g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将1g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.234g Ala-Ala-Asn-Leu、0.012g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XI)所示结构，其中，R1和R3为-O-；R2和R4为n＝2；m＝113。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu100mg、盐酸阿霉素34.794mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入6.066mg三乙胺和31.236mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(II)所示结构，其中，R1和R3为-O-；R2和R4为n＝2；A1和A2为m＝113。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例10
将10g数均分子量为5000的双端氨基聚乙二醇加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入2g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将7.5g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、1.72g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.036g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将1g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.234g Ala-Ala-Asn-Leu、0.012g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XI)所示结构，其中，R1和R3为-NH-；R2和R4为n＝2；m＝113。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu100mg、盐酸阿霉素34.794mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入6.066mg三乙胺和31.236mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(II)所示结构，其中，R1和R3为-NH-；R2和R4为n＝2；A1和A2为m＝113。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例11
将10g数均分子量为5000的具有式(IX-a)结构的聚合物(其中，m1＝28，m2＝28，m3＝28，m4＝28)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入4g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将7.5g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、3.44g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.072g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将1g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.486g Ala-Ala-Asn-Leu、0.024g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XII)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-O-；R2、R4、R6和R8为n＝2；m1＝28，m2＝28，m3＝28，m4＝28。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu100mg、盐酸阿霉素69.588mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入12.123mg三乙胺和62.472mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(III)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-O-；R2、R4、R6和R8为n＝2；A1、A2、A3和A4为m1＝28，m2＝28，m3＝28，m4＝28。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例12
将10g数均分子量为5000的具有式(IX-b)结构的聚合物(其中，m1＝28，m2＝28，m3＝28，m4＝28)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入4g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将7.5g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、3.44g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.072g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将1g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.486g Ala-Ala-Asn-Leu、0.024g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XII)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-NH-；R2、R4、R6和R8为n＝2；m1＝28，m2＝28，m3＝28，m4＝28。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu100mg、盐酸阿霉素69.588mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入12.123mg三乙胺和62.472mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(III)所示结构，其中，其中，R1、R3、R5和R7为-NH-；R2、R4、R6和R8为n＝2；A1、A2、A3和A4为m1＝28，m2＝28，m3＝28，m4＝28。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例13
将40g数均分子量为20000的具有式(IX-a)结构的聚合物(其中，m1＝113，m2＝113，m3＝113，m4＝113)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入4g丁二酸酐和50mL吡啶，室温下反应48h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，用盐酸将反应瓶中溶液的pH调至2，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将30g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、3.44g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.072g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将4g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.486g Ala-Ala-Asn-Leu、0.024g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XII)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-O-；R2、R4、R6和R8为n＝2；m1＝113，m2＝113，m3＝113，m4＝113。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu400mg、盐酸阿霉素69.588mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入12.123mg三乙胺和62.472mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(III)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-O-；R2、R4、R6和R8为n＝2；A1、A2、A3和A4为m1＝113，m2＝113，m3＝113，m4＝113。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例14
将40g数均分子量为20000的具有式(IX-b)结构的聚合物(其中，m1＝113，m2＝113，m3＝113，m4＝113)加入到干燥的反应瓶中，然后向反应瓶中加入4g丁二酸酐和150mL无水二氯甲烷，室温下反应24h。反应结束后，用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到端羧基聚乙二醇衍生物。
将30g上述制得的端羧基聚乙二醇衍生物、3.44g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.072g N-羟基琥珀酰亚胺和500mL干燥的二氯甲烷加入反应瓶中，常温下反应24h。反应结束后，向反应瓶中加入250mL二氯甲烷，然后用饱和食盐水洗三次。洗涤结束后，干燥，乙醚沉降，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物。
将4g上述制得的羧基活化的聚乙二醇衍生物、0.486g Ala-Ala-Asn-Leu、0.024g三乙胺和20mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，在30℃下、氮气氛围中反应48h。反应结束后，得到的反应产物溶液在纯水中透析72h，透析过程中换水10次。透析结束后，产物冷冻干燥，得到PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu。
对上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu进行核磁共振和质谱分析，结果表明，上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu具有式(XII)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-NH-；R2、R4、R6和R8为n＝2；m1＝113，m2＝113，m3＝113，m4＝113。
将上述制得的PEG衍生物-AlaAlaAsnLeu400mg、盐酸阿霉素69.588mg和5mL无水二甲基甲酰胺加入反应瓶，搅拌均匀，向反应瓶中加入12.123mg三乙胺和62.472mg六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基，反应72h。反应结束后，得到的反应产物溶液用pH＝6的水透析，然后冷冻干燥，得到高分子抗肿瘤前药。
对上述制得的高分子抗肿瘤前药进行分析，结果表明，上述制得的高分子抗肿瘤前药具有式(III)所示结构，其中，R1、R3、R5和R7为-NH-；R2、R4、R6和R8为n＝2；A1、A2、A3和A4为m1＝113，m2＝113，m3＝113，m4＝113。该高分子抗肿瘤前药的产率为89％。
实施例15
体外抑瘤实验
收集对数期MDA-MB-435细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～10000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
24h后弃去培养液，用培养基将阿霉素纯药、聚乙二醇键合阿霉素、实施例5制备的高分子抗肿瘤前药稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL6个浓度(所述浓度为药物中阿霉素的浓度)的样品，将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h。
48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素纯药、聚乙二醇键合阿霉素、实施例5制备的高分子抗肿瘤前药的细胞存活率，实验结果参见图3。图3中，DOX为阿霉素纯药，PEG-DOX为聚乙二醇键合阿霉素，PEG-AlaAlaAlaAsn-DOX为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药。
由图3可知，实施例5制备的高分子抗肿瘤前药的对MDA-MB-435细胞的杀灭效果明显优于传统PEG化抗肿瘤药物，其药效接近纯药。
实施例16
体外抑瘤实验
收集对数期MCF-7细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～10000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
24h后弃去培养液，用培养基将阿霉素纯药、聚乙二醇键合阿霉素、实施例5制备的高分子抗肿瘤前药稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL6个浓度(所述浓度为药物中阿霉素的浓度)的样品，将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h。
48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素纯药、聚乙二醇键合阿霉素、实施例5制备的高分子抗肿瘤前药的细胞存活率，实验结果参见图4。图4中，DOX为阿霉素纯药，PEG-DOX为聚乙二醇键合阿霉素，PEG-AlaAlaAlaAsn-DOX为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药。
由图4可知，实施例5制备的高分子抗肿瘤前药对MCF-7细胞的杀灭效果明显优于传统PEG化抗肿瘤药物，其药效接近纯药。
实施例17
正常细胞毒性实验
收集对数期CT-26细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～10000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
24h后弃去培养液，用培养基将阿霉素纯药、聚乙二醇键合阿霉素、实施例5制备的高分子抗肿瘤前药稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL6个浓度(所述浓度为药物中阿霉素的浓度)的样品，将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h。
48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素纯药、聚乙二醇键合阿霉素、实施例5制备的高分子抗肿瘤前药的细胞存活率，实验结果参见图5。图5中，DOX为阿霉素纯药，PEG-DOX为聚乙二醇键合阿霉素，PEG-AlaAlaAlaAsn-DOX为本发明实施例5制备的高分子抗肿瘤前药。
由图5可知，CT-26细胞在实施例5制备的高分子抗肿瘤前药中的存活率明显高于纯药，说明天冬酰胺内肽酶在CT-26细胞中基本不表达，实施例5制备的高分子抗肿瘤前药对正常组织细胞的毒副作用小。
实施例18
细胞内吞实验
收集对数期MDA-MB-435细胞，调整细胞浓度，接种入6孔板内(每孔2×5万个，1.8mL)，37℃培养24h。用培养基稀释实施例5制备的高分子抗肿瘤前药以及纯药阿霉素(DOX)，以DOX终浓度1μg/mL为基准，加入200μL溶液。37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24小时。24小时后，弃培养液液，PBS清洗细胞3～5次。弃PBS，每孔加入1mL4％多聚甲醛，固定10分钟。弃甲醛，PBS洗3～5次后，每孔加入1～2μL的DAPI，于1mL PBS中避光标记10分钟，弃标记液，PBS洗5次。加2μl甘油封片，激光共聚焦显微镜观察，结果如图6所示。图6中，(A)为阿霉素纯药的激光共聚焦显微镜结果，(B)为实施例5制备的高分子抗肿瘤前药的激光共聚焦显微镜结果。其中DAPI为细胞核染色图，DOX为阿霉素荧光图，Merged为叠加效果图。
由图6可知，阿霉素纯药中的阿霉素作为一个小分子能够通过扩散作用快速进入细胞并作用于细胞核；高分子抗肿瘤前药在相同时间相同浓度下与纯药相比进入细胞的能力稍弱，可能是由于高分子键合药在酶作用下脱除PEG需要一段时间，这与实施例15、16中的体外抑瘤实验结果相符。通过图6可以看出，实施例5制备的高分子抗肿瘤前药中的阿霉素可被MDA-MB-435细胞快速摄取。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种高分子抗肿瘤前药，具有式(I)、式(II)或式(III)所示结构:
式(I)中，R0为烷基或取代烷基；R1为-NH-或-O-；R2为1≤n≤10；m为聚合度，10≤m≤500；
式(II)中，R1和R3分别独立地选自-NH-或-O-；R2和R4分别独立地选自1≤n≤10；A1和A2分别独立地选自羟基或且A1和A2中至少有一个为m为聚合度，10≤m≤500；
式(III)中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自-NH-或-O-；R2、R4、R6和R8分别独立地选自1≤n≤10；A1、A2、A3和A4分别独立地选自羟基或且A1、A2、A3和A4中至少有一个为m1、m2、m3和m4为聚合度，10≤m1≤500，10≤m2≤500，10≤m3≤500，10≤m4≤500；
所述高分子抗肿瘤前药的制备的方法包括以下步骤：
a11)、端羧基的聚乙二醇衍生物与羧基活化剂反应，得到羧基活化的聚乙二醇衍生物；
a12)、上述羧基活化的聚乙二醇衍生物与丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-亮氨酸反应，得到中间产物；
a2)、所述中间产物与盐酸阿霉素反应，得到高分子抗肿瘤前药。
2.根据权利要求1所述的前药，其特征在于，所述R0为C1～C5的烷基。
3.根据权利要求1所述的前药，其特征在于，式(I)中，所述R2为2≤n≤4；式(II)中，所述R2和R4分别独立地选自2≤n≤4；式(III)中，所述R2、R4、R6和R8分别独立地选自2≤n≤4。
4.根据权利要求1所述的前药，其特征在于，式(I)中，45≤m≤500；式(II)中，45≤m≤500；式(III)中，45≤m1≤500，45≤m2≤500，45≤m3≤500，45≤m4≤500。
5.根据权利要求1所述的高分子抗肿瘤前药，其特征在于，所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺或二环己基碳二亚胺。
6.根据权利要求1所述的高分子抗肿瘤前药，其特征在于，在步骤a2)中，所述反应在偶联剂存在下进行。
7.根据权利要求6所述的高分子抗肿瘤前药，其特征在于，所述偶联剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯或N,N'-羰基二咪唑。
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