CN103768613B - 基于gflg的peg化肽类树状大分子给药系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为了解决PEG化数树大分子给药系统抗癌特异性的问题，提供了一种基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法。其特征在于：给药系统为PEG化肽类树状大分子、靶向功能性因子GFLG与抗肿瘤治疗因子的偶联物，通过GFLG将治疗因子和PEG化肽类树状大分子相连接后形成功能化树状大分子，在获得良好生物相容性的同时，使同等剂量或低剂量的药物达到明显的抗肿瘤疗效。

Description

基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统及其制备方法

技术领域

本发明属于高分子靶向纳米载体的制备领域，具体涉及一种基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统及其制备方法。

背景技术

由于可精确控制的尺寸，低分散度以及可多功能化改性的表面，使得树状大分子(dendrimer)与传统的胶体或者大分子运载体系相比，有望改善抗癌药物的相关性质，如药物动力学，因此其非常适用于作为载体以传递抗癌药物。由于肽类树状大分子融合了树状大分子以及肽类分子两者的特点，而获得了水溶性，生物可降解性，生物相容性以及免疫相容性等优势，所以在最近一段时间里，肽类树状大分子作为一种药物载体获得了很大的关注。尽管有着极大的优势，但是因为这种类型的药物控释体系很容易在体内循环的时候被快速的代谢掉，其体内应用依然面临着极大的挑战和局限性。虽然这种被快速代谢的情况可以通过提高树状大分子的代数来避免，但是合成上的难度以及相应产生的毒性却是不可避免的。

为了避免上述问题，将聚乙二醇(PEG)链段引入树状大分子的球状表面，从而制备出了基于树状大分子的纳米颗粒体系。这种体系由于其分子量和尺寸相较于单纯的树状大分子有一定程度的增加，从而在降低系统毒性的同时获得更长的血液循环时间和更好的肿瘤组织富集程度。同时，PEG化还可以防止网状内皮组织对于树状大分子的早期清除。因此，PEG化的肽类树状大分子是一种很具有吸引力的药物控释体系，如“Developmentofefficientacidcleavablemultifunctionalprodrugsderivedfromdendriticpolyglycerolwithapoly(ethyleneglycol)shell”(JournalofControlledRelease.2011；151：295-301)，“Dendrimersofcitricacidandpoly(ethyleneglycol)asthenewdrug-deliveryagents”(Biomaterials.2005；26：1175-83)，“PharmacokineticsandtumordispositionofPEGylated，methotrexateconjugatedpoly-L-lysinedendrimers”(MolecularPharmaceutics.2009；6：1190-204)。然而，目前PEG化数树大分子给药系统的环境敏感键为pH响应，即利用肿瘤组织以及肿瘤细胞内部的酸性进行控制释放，由于在肿瘤组织当中的pH值也会对使敏感键断裂，自由药物不可避免的会在肿瘤组织当中扩散，增加其溢出肿瘤组织，重新回到血管当中的机率，从而降低其抗癌特异性。

作为药物载体，用于癌症治疗的基于树状大分子的纳米颗粒必须有选择的将自由药物释放进入到肿瘤组织或者肿瘤细胞当中，这样才能够集大程度地提升抗肿瘤效果以及降低药物的副作用。酶敏感体系是一种高效的，具有选择性的药物传输体系，其通过只能被肿瘤细胞特异性分泌的酶所裂解的连接点与药物相连接。CathepsinB是一种在大多数肿瘤细胞和肿瘤上皮细胞里面过度表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。GFLG(Gly-Phe-Leu-Gly)是一种对应于cathepsinB的基质，其作为一种特异性断裂短肽已经被应用于多种聚合物药物当中。这种四肽序列在血浆和血清当中都有着很好的稳定性，并且可以在内吞作用之后在溶酶体当中释放药物。

发明内容

本发明为了解决PEG化数树大分子给药系统抗癌特异性的问题，提供了一种基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统及其制备方法。通过GFLG将抗癌药物和树状大分子相连接后形成功能化树状大分子经PEG化为纳米颗粒，在获得良好生物相容性的同时，使同等剂量或低剂量的药物达到明显的抗肿瘤疗效。

基于GFLG体系的释药体系是针对肿瘤细胞特有的酶进行断裂，即释药体系必须进入肿瘤细胞之后才发生特异性反应，因此其抗癌特异性得到有效保证。

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统，其特征在于：给药系统为PEG化肽类树状大分子、靶向功能性因子GFLG与抗肿瘤治疗因子的偶联物，结构如下：

A——L——R

其中，A为PEG化3～5代肽类树状大分子，树状大分子的末端氨基与基团L连接；

L为：

R为GFLG与治疗因子的偶联物，GFLG的末端氨基与基团L连接。

树状大分子必须依靠较大的尺寸才能体现出EPR效应(肿瘤细胞的增强渗透滞留效应)以及避免被过早的代谢。尽管高代数的树状大分子拥有较大的尺寸，但随之而来的却是更高的系统毒性。

本发明所述的肽类树状大分子为赖氨酸或者谷氨酸的肽类树状大分子。

本发明所述PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的颗粒粒径为80～130nm。该粒径可有效利用肿瘤组织血管壁疏松的特点，通过EPR效应，达到给药系统在肿瘤组织的高富集；同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

本发明所述的治疗因子为能与GFLG发生偶联的药物。

优选地，所述的治疗因子包括阿霉素、吉西他滨。

本发明给药系统的载体为肽类树状大分子，具有单分散性，外围可修饰官能团较多，类蛋白的结构，其在体内的分解产物为天然氨基酸，生物安全性高；PEG链段的引入可以提高整个体系的水溶性，同时可以帮助较低代数的树状大分子在不提高代数的前提下获得较大的纳米尺寸，提高整个体系的生物安全性，并且由于PEG的外部修饰，使得释药体系不易被网状内皮细胞所捕捉，在此基础上，由于PEG的引入，使体系拥有了亲水区域，可以利用亲疏水作用自组装形成纳米颗粒；GFLG的引入使材料拥有了针对肿瘤细胞的特异性酶敏感特性，使其可以在进入肿瘤细胞之前较为稳定，而在进入细胞之后发生特异性的酶水解反应，起到特异性的抗癌作用。

阿霉素和吉西他滨的分子结构当中均带有胺基，可以和GFLG末端的羧基形成酰胺键，使其在断裂时释放原药。阿霉素抗癌效果十分优良但毒性较强，可以很方便的利用紫外或者荧光分光光度计进行检测浓度，在药物控释领域是一个非常常用的模型药物。而吉西他滨的毒性较小，是目前很多癌症化疗的一线药物，且分子体积较小，体外特异性断裂效率明显提高。

本发明基于GFLG的PEG化多肽类树状大分子给药系统的制备方法，先在治疗因子与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基(MA)，得偶联物A备用；再将作为载体的肽类树状大分子炔基化，在树状大分子上引入三苯甲硫基，得到炔基三苯甲硫基树状大分子，脱去三苯甲基后，与所述的偶联物A发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与治疗因子的偶联物，最后经PEG化得成品。

本发明在治疗因子与GFLG的偶联物上引入MA，并在树状大分子上引入三苯甲硫基，三苯甲基(Trt)作为巯基的保护基，脱去Trt后，MA的双键与巯基发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与治疗因子的偶联物。

同时，采用炔基化树状大分子，通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点，为铜催化的炔-叠氮点击环加成(CuAAC)反应，有效的降低不必要的副反应以及保持树状大分子的低分散度。

本发明的制备方法具体操作步骤如下：

AMA-GFLG-治疗因子偶联物的制备

在治疗因子与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，得偶联物A，备用；

B炔基化树状大分子的合成

以Boc与Cbz基团保护的树状大分子为原料，在氢气氛围下与Pb/C反应，反应结束后，将反应产物溶解在DMF当中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、己炔酸、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基化树状大分子；

这一步通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，脱去Cbz，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点。

C炔基三苯甲硫基树状大分子的合成

炔基化树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应，将反应产物溶解在无水DMF中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、3-三苯甲硫基丙酸、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基三苯甲硫基树状大分子；

引入三苯甲硫基的目的在于在树状大分子外围引入巯基，三苯甲基(Trt)是作为巯基的保护基而存在。引入巯基的目的是可以和治疗因子偶联物上MA(甲基乙烯基)的双键发生巯-烯反应。

D炔基化树状大分子-治疗因子偶联物的合成

炔基三苯甲硫基树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，将反应产物溶解在无水DMF当中，溶液中加入偶联物A、DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化树状大分子-治疗因子偶联物；

用TFA(三氟乙酸)的目的在于去除巯基保护剂：三苯甲基，使巯基暴露出来。在DBU的作用下，MA-GFLG-治疗因子偶联物中MA的双键与巯基发生偶联反应。

加入三乙基硅烷的目的在于捕捉反应过程当中产生的正离子，促进反应的进行，必须等到变成黄绿色之后才能加入，否则不能起到脱除保护剂的作用。

EPEG化树状大分子

在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO₄·5H₂O、N₃-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，产物经提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。

优选地，所述的B和C步骤，体系在氮气保护下反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO₃、HCl、NaHCO₃、NaCl洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏除去溶剂，残留物经重结晶，得到产物。

利用反复洗涤和萃取的方法可以有效去除杂质并且减少纯化步骤，利于合成量的放大。

优选地，所述的D步骤，溶液中加入偶联物A、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯后，在氮气保护及室温下避光反应0.1～90小时。有效提高巯基-乙烯基偶联反应的反应机率。

优选地，所述的D步骤，反应结束后，反应液逐滴加入到乙酸乙酯当中，析出物通过离心、提纯、干燥，得到炔基化树状大分子-治疗因子偶联物。

通过逐滴加入到乙酸乙酯可有效去除未反应的树状大分子和DBU，去除杂质，有效提高产品纯度。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的肽类树状大分子靶向给药系统，PEG链段和GFLG短肽结合在一起，可发挥其各自的优势，同时是首次将GFLG引入肽类树状大分子体系，可以避免以往还原性敏感和pH敏感键不仅仅在肿瘤细胞内发生断裂，同时还会在肿瘤组织内发生断裂释放出药物的问题，从而减低药物溢出肿瘤部位的风险。

2、本发明的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统的颗粒粒径可达到80～130nm。该粒径可有效利用肿瘤组织血管壁疏松的特点，通过EPR效应，达到给药系统在肿瘤组织的高富集；同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

3、本发明采用治疗因子与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，再与树状大分子偶联的方案，反应高效、制备方法温和简单，且可以尽量避免铜离子的引入。

4、本发明的制备方法中采用炔基化树状大分子，通过氨基与羧基的缩合反应形成酰胺键，从而使树状大分子的外围带上炔基，为后面的PEG化提供点击反应的反应位点，为铜催化的炔-叠氮点击环加成(CuAAC)反应，有效的降低不必要的副反应以及保持树状大分子的低分散度。

5、本发明的制备方法引入三苯甲硫基，其目的在于在树状大分子外围引入巯基，三苯甲基是作为巯基的保护基而存在。引入巯基的目的是可以和治疗因子偶联物上MA(甲基乙烯基)的双键发生巯-烯反应。

6、本发明在树状大分子与治疗因子的偶联反应中加入三乙基硅烷，其目的在于捕捉反应过程当中产生的正离子，促进反应的进行，并且必须等到溶液变成黄绿色之后才能加入，否则不能起到脱除三苯甲基保护剂的作用。

7、本发明在炔基化树状大分子和炔基化三苯甲硫基树状大分子的合成反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO₃、HCl、NaHCO₃、NaCl洗涤，利用反复洗涤和萃取的方法可以有效去除杂质并且减少纯化步骤，利于合成量的放大。

8、本发明在树状大分子与治疗因子的偶联反应结束后，通过将反应液逐滴加入到乙酸乙酯可有效去除未反应的树状大分子和DBU，去除杂质，有效提高产品纯度。

附图说明

图1为炔基化树状大分子-阿霉素偶联体(a)与PEG化树状大分子-阿霉素偶联体(b)的MALDI-TOFMS结果。

图2为HPLC测量的树状大分子-吉西他滨偶联体7的吉西他滨含量标准曲线。

图3为DLS(a)、SEM(b)、TEM(c)分别测定PEG化树状大分子-阿霉素偶联物的结果。

图4为树状大分子-阿霉素偶联体对体外肿瘤细胞生长抑制结果及其与阿霉素、生理盐水对体内肿瘤细胞生长抑制的比较。

图5为肿瘤组织的CD31免疫组化染色。

图6为肿瘤组织的Ki-67免疫组化染色。

图7为肿瘤组织的TUNEL免疫组化染色。

图8为PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体的DLS图。

图9为PEG化树状大分子-树状大分子-吉西他滨偶联体的TEM图。

图10为PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体与吉西他滨体外抗肿瘤效果图。

图11为本发明实施例1中的树状大分子偶联物的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

实施例1

负载阿霉素的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统，给药系统为抗肿瘤药物阿霉素、靶向功能性因子GFLG和PEG化肽类树状大分子的偶联物，其结构如图11：

偶联体1：n＝10，m＝1的PEG化3代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物

偶联体2：n＝1，m＝1的PEG化3代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物

偶联体3：n＝1，m＝1的PEG化4代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物

偶联体4：n＝2，m＝1的PEG化5代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物

偶联体5：n＝5，m＝6的PEG化3代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物

偶联体6：a＝10，b＝1的PEG化4代谷氨酸树状大分子-阿霉素偶联物

偶联体7：n＝10，m＝3的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

偶联体8：n＝1，m＝1的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

偶联体9：n＝10，m＝1的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

偶联体10：n＝1，m＝1的PEG化4代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

偶联体11：n＝2，m＝1的PEG化5代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

偶联体12：n＝5，m＝6的PEG化3代赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

偶联体13：a＝10，b＝1的PEG化4代谷氨酸树状大分子-吉西他滨偶联物

实施例2

基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，治疗因子先与靶向功能性因子GFLG偶联，再与甲基乙烯基偶联，得到偶联物A，备用；先将作为载体的肽类树状大分子炔基化，再在树状大分子上引入三苯甲硫基，得到炔基三苯甲硫基树状大分子，脱去三苯甲基后，与所述的偶联物A发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与治疗因子的偶联物，最后经PEG化得成品。

实施例3

本发明的制备方法具体操作步骤如下：

AMA(甲基乙烯基)-GFLG-治疗因子偶联物的制备；

在治疗因子与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，得偶联物A，备用；

B炔基化树状大分子的合成

以Boc与Cbz基团保护的树状大分子为原料，在氢气氛围下与Pb/C反应，反应结束后，将反应产物溶解在DMF当中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、己炔酸、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基化树状大分子；

C炔基三苯甲硫基树状大分子的合成

炔基化树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应，将反应产物溶解在无水DMF中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、3-三苯甲硫基丙酸、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基三苯甲硫基树状大分子；

D炔基化树状大分子-治疗因子偶联物的合成

炔基三苯甲硫基树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，将反应产物溶解在无水DMF当中，溶液中加入偶联物A、DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化树状大分子-治疗因子偶联物；

因为巯基-乙烯基偶联反应本身就是一个类似于点击反应的高效反应，在某些结构中甚至是定量反应。依靠这一反应类型，可以通过简单的反应投料比的改变来改变阿霉素对于炔基化树状大分子的修饰程度，从而改变最终材料的载药量。

EPEG化树状大分子

在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子、CuSO₄·5H₂O、N₃-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，产物经提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。

实施例4

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述的B步骤，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌1h，并在室温下搅拌7天，得炔基化树状大分子。

实施例5

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述的C步骤，在氮气保护下反应，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌1h，并在室温下搅拌7天，得炔基三苯甲硫基树状大分子。

实施例6

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述的B步骤，在氮气保护下反应，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌60h，并在室温下搅拌0.5天，得炔基化树状大分子。

所述的C步骤，在氮气保护下反应，溶液在氮气保护以及冰浴下搅拌60h，并在室温下搅拌0.5天，得炔基三苯甲硫基树状大分子。

所述的B和C步骤，体系在氮气保护下反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO₃、HCl、NaHCO₃、NaCl洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏除去溶剂，残留物经重结晶，得到产物。

实施例7

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述的D步骤，溶液中加入偶联物A、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯后，在氮气保护及室温下避光反应0.1小时。

实施例8

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述的D步骤，溶液中加入偶联物A、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，在氮气保护及室温下避光反应90小时，反应所得产物为炔基化树状大分子-治疗因子偶联物；

实施例9

本实施例与实施例3基本相同，在此基础上：

所述的D步骤，反应结束后，反应液逐滴加入到乙酸乙酯当中，析出物通过离心、提纯、干燥，得到炔基化树状大分子-治疗因子偶联物。

实施例10

偶联体1的制备方法，具体步骤如下：

AMA-GFLG-DOX偶联物(3)的制备；

在氮气保护下，将Boc-GFLG-OMe(1)溶于10mL无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中(1∶1，v/v)并在0℃下搅拌24h。利用旋转蒸发仪除去溶剂后，加入适量无水乙醚洗涤三次，有白色沉淀析出。通过离心收集白色沉淀，并在真空干燥箱当中干燥0.5h。所得样品溶解在20mL水与乙腈(水/乙腈＝4/1，v/v)的混合溶剂当中，并在冰水浴下用1M氢氧化钠水溶液将pH值调节到9，随后再加入13mL1M氢氧化钠水溶液并继续搅拌2h。在冰盐浴下，逐滴加入0.85mL甲基乙烯酰氯，同时利用1M氢氧化钠水溶液使体系pH值保持在10左右。搅拌4h后加入大量乙酸乙酯，并用1M盐酸水溶液将pH调整到2-3。最后用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，收集有机相并用无水硫酸镁干燥。除去溶剂后，在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中重结晶，得到MA-GFLG-OH。在氮气保护下，将MA-GFLG-OH，N，N-二异丙基乙胺，四氢噻唑-2-硫酮溶解在20mL无水二氯甲烷中，在冰盐浴下逐滴加入EDCI的无水二氯甲烷溶液。24h后，向体系中加入500mL乙酸乙酯，并依次用1M碳酸氢钠水溶液，1M盐酸水溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤。除去溶剂，在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中重结晶得到亮黄色固体MA-GFLG-TT(2)。将MA-GFLG-TT，阿霉素盐酸盐，吡啶溶解在30mL无水二甲亚砜中，避光室温搅拌24h。除去大部分溶剂后，在冰冻的乙酸乙酯中沉淀得暗红色固体为MA-GFLG-DOX偶联物(3)。

较低的反应温度可以防止乙烯基发生自聚以及减少EDC活性酯的水解，提高产率。如果温度不够低，EDC活性酯很活泼，最终很可能得不到产品或者副产物很多。

B炔基化树状大分子(5)的合成

Boc与Cbz基团保护的树状大分子(4)(3.0g，0.5mmol)溶解在20mL甲醇中，Pb/C(2.54g，10％)加入溶液当中。反应体系在氢气氛围下搅拌3天。反应结束后，溶剂通过减压蒸馏除去。残留物溶解在50mLDMF当中，DIPEA(16.8mL，96mmol)，己炔酸(18mmol)，HBTU(6.83g，18mmol)，HOBt(2.34g，18mmol)加入体系，溶液在氮气保护下以及冰浴下搅拌1小时，并在室温下搅拌4天。反应结束后，溶液用500mLEtOAc稀释，并依次用NaHCO₃aq.(satd.)，1MHClaq.，NaHCO₃aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤.有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为炔基化树状大分子(5)，产率：53％(1.37g，0.27mmol).¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ＝1.18-1.65(m，CH₂-LysandCHCCH₂CH₂)，2.12-2.16(m，CHCCH₂andNCH₂CH₂)，2.741(s，CHC(R))，2.95(s，CONHCH₂)，4.14(s，COCH(R)NH)，6.70-7.98(m，(R)CONH)；MALDI-TOFMS：m/z5192[(M+Na)⁺，C₂₆₄H₄₃₈N₄₆O₅₇Na].

C炔基三苯甲硫基树状大分子(6)的合成

炔基化树状大分子(5)(1.0g，0.19mmol)溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸(1∶1，6mL)当中，溶液在氮气保护及0℃下搅拌24小时。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在30mL无水DMF当中。DIPEA(12.6mL，72mmol)，3-三苯甲硫基丙酸(12mmol)，HBTU(4.55g，12mmol)，HOBt(1.62g，12mmol)加入体系中，该溶液在氮气保护及冰浴下搅拌1小时并在室温下搅拌48小时。反应结束后，溶液用500mLEtOAc稀释，并依次用NaHCO₃aq.(satd.)，1MHClaq.，NaHCO₃aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤.有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为炔基三苯甲硫基树状大分子(6)，产率：75％(113g，0.14mmol).¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ＝1.234-1.644(m，CH₂-LysandCHCCH₂CH₂)，2.11-2.22(m，TrtSCH₂CH₂CO，CHCCH₂andNCH₂CH₂)，2.74(s，CHC(R))，2.95(s，CONHCH₂)，4.14(s，COCH(R)NH)，7.20-7.29(d，ArH)，7.77-7.95(m，(R)CONH)；MALDI-TOFMS：m/z7949[(M+Na)⁺，C₄₆₈H₅₅₈N₄₆O₄₅S₁₂Na].

D炔基化树状大分子-阿霉素偶联物(7)的合成

炔基三苯甲硫基树状大分子(6)(1.19g，0.15mmol)溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸(1∶1，8mL)当中，该溶液在氮气保护及冰浴下搅拌0.5小时。当溶液转为黄绿色后，三乙基硅烷(145.6mg，1.25mmol)加入体系。反应体系在室温和氮气保护下继续搅拌24小时。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在20mL无水DMF当中。MA-GFLG-DOX(157.8mg，0.16mmol)，DBU(2.74g，18mmol)加入体系中.溶液在氮气保护及室温下避光反应72小时。反应结束后，反应液逐滴加入300mL乙酸乙酯当中，析出红色沉淀析出物通过离心收集并利用柱色谱提纯。所得产物在真空下干燥，最终的到暗红色固体炔基化树状大分子-阿霉素(7)，产率：43％(388.5mg，64.5μmmol).MALDI-TOFMS：m/z6044[(M+K)⁺，C₂₉₀H₄₄₉N₄₆O₄₅S₁₂K].

利用质谱来对最终合成的树状大分子-阿霉素偶联体进行表征。根据炔基化树状大分子-阿霉素偶联体(7)的MALDI-TOFMS结果(6044，[M+K⁺])(图1)，可以确定平均每个树状大分子上连有一个MA-GFLG-DOX分子。

E基于PEG化树状大分子-阿霉素偶联物(8)纳米颗粒的合成

在氮气气氛下，炔基化树状大分子-阿霉素(7)(150mg，24.9μmol)，CuSO₄·5H₂O(90mg，0.36mmol)，N₃-mPEG(1.1g，0.54mmol)以及抗坏血酸钠(142mg，0.72mmol)加入20mLDMF和H₂O(3∶1，V/V)的混合溶剂当中。反应体系避光反应3天。反应结束后，溶液避光透析48小时。通过冻干去除溶剂，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose12HR/16/30columnonanFPLCsystem(GEHealthcare)column)进一步提纯。通过再次透析和冻干获得最终产物PEG化树状大分子-阿霉素偶联物(8)，产率：68％(444.9mg)MALDI-TOFMS：m/z26295[M+K]⁺

通过在EDTA溶液当中透析，可以除去点击反应后所残留于体系当中微量的铜离子，而小分子杂质，过量的PEG链段以及副产物都可以通过FPLC简单除去。

因为PEG链段的分子量虽然是一个正态分布，但最主要的分子量是已知的，因此可以通过质谱所得出分子量的增加来判断PEG链段的个数。

根据PEG化树状大分子-阿霉素偶联物(8)的MALDI-TOF质谱结果(26295，[M+K⁺])(图1)，平均每个树状大分子上连有10个PEG链段。根据紫外分光度计的结果，阿霉素的含量为1.0％。

实施例11

偶联体2的合成方案与实施例10基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-DOX，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-阿霉素偶联物、CuSO4·5H₂O、1.05倍摩尔数的N3-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-阿霉素偶联物。MALDI-TOFMS：m/z8054([M+Na]⁺)

实施例12

偶联体3的合成方案与实施例10基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基4代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-DOX，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化4代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-阿霉素偶联物、CuSO4·5H2O、1.05倍摩尔数的N3-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-阿霉素偶联物。MALDI-TOFMS：m/z13337([M+K]⁺)

实施例13

偶联体4的合成方案与实施例10基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基5代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-DOX，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化5代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-阿霉素偶联物、CuSO4·5H₂O、2.1倍摩尔数的N₃-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H2O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-阿霉素偶联物。MALDI-TOFMS：m/z25851([M+H]⁺)

实施例14

偶联体5的合成方案与实施例10基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入6.1倍的MA-GFLG-DOX，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-阿霉素偶联物、CuSO4·5H₂O、5.03倍摩尔数的N3-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-阿霉素偶联物。MALDI-TOFMS：m/z21097([M+K]⁺)

实施例15

谷氨酸树状大分子-阿霉素偶联的合成方案与赖氨酸树状大分子-阿霉素偶联的合成方案(实施例10-14)基本相同。

实施例16

偶联体7的合成方案与实施例10基本相同，在此基础上：

AMA-GFLG-GEM偶联物(9)的制备

在氮气保护下，将Boc-GFLG-OMe(1)溶于10mL无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中(1∶1，v/v)并在0℃下搅拌24h。利用旋转蒸发仪除去溶剂后，加入适量无水乙醚洗涤三次，有白色沉淀析出。通过离心收集白色沉淀，并在真空干燥箱当中干燥0.5h。所得样品溶解在20mL水与乙腈(水/乙腈＝4/1，v/v)的混合溶剂当中，并在冰水浴下用1M氢氧化钠水溶液将pH值调节到9，随后再加入13mL1M氢氧化钠水溶液并继续搅拌2h。在冰盐浴下，逐滴加入0.85mL甲基乙烯酰氯，同时利用1M氢氧化钠水溶液使体系pH值保持在10左右。搅拌4h后加入大量乙酸乙酯，并用1M盐酸水溶液将pH调整到2-3。最后用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，收集有机相并用无水硫酸镁干燥。除去溶剂后，在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中重结晶，得到MA-GFLG-OH。在氮气保护下，将MA-GFLG-OH，N，N-二异丙基乙胺，四氢噻唑-2-硫酮溶解在20mL无水二氯甲烷中，在冰盐浴下逐滴加入EDCI的无水二氯甲烷溶液。24h后，向体系中加入500mL乙酸乙酯，并依次用1M碳酸氢钠水溶液，1M盐酸水溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤。除去溶剂，在乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂中重结晶得到亮黄色固体MA-GFLG-TT(2)。将MA-GFLG-TT，吉西他滨盐酸盐，吡啶溶解在30mL无水二甲亚砜中，避光室温搅拌24h。除去大部分溶剂后，在冰冻的乙酸乙酯中沉淀得白色固体为MA-GFLG-GEM偶联物(9)ESI-MSm/z744[(M+K)⁺，C₃₂H₄₁F₂N₇O₉]

D炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物(10)的合成

炔基三苯甲硫基树状大分子(6)(1.19g，0.15mmol)溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸(1∶1，8mL)当中，该溶液在氮气保护及冰浴下搅拌0.5小时。当溶液转为黄绿色后，三乙基硅烷(145.6mg，1.25mmol)加入体系。反应体系在室温和氮气保护下继续搅拌24小时。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在20mL无水DMF当中。MA-GFLG-GEM(3，324.43mg，0.46mmol)，DBU(2.74g，18mmol)加入体系中.溶液在氮气保护及室温下避光反应72小时。反应结束后，反应液逐滴加入300mL乙酸乙酯当中，析出红色沉淀析出物通过离心收集并利用柱色谱提纯。所得产物在真空下干燥，最终的到白色固体炔基化树状大分子-吉西他滨(10)，产率：43％().MALDI-TOFMS：m/z7159[(M+Na)⁺，C₃₃₆H₁₅₂₁F₆N₆₇O₇₂S₁₂Na].每个目标分子上平均带有三个GEM

E基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物纳米颗粒(11)的合成

在氮气气氛下，炔基化树状大分子-吉西他滨(10)(150mg，21.0μmol)，CuSO₄·5H₂O(90mg，0.36mmol)，N₃-mPEG(760mg，0.38mmol)以及抗坏血酸钠(142mg，0.72mmol)加入20mLDMF和H₂O(3∶1，V/V)的混合溶剂当中。反应体系避光反应3天。反应结束后，溶液避光透析48小时。通过冻干去除溶剂，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose12HR/16/30columnonanFPLCsystem(GEHealthcare)column)进一步提纯。通过再次透析和冻干获得最终产物PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物(11)，产率：73％(419.6mg)MALDI-TOFMS：m/z27372[(M+Na)⁺]

通过在EDTA溶液当中透析，可以除去点击反应后所残留于体系当中微量的铜离子，而小分子杂质，过量的PEG链段以及副产物都可以通过FPLC简单除去。

根据PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物(11)的MALDI-TOF质谱结果(27372[(M+Na)⁺)，平均每个树状大分子上连有10个PEG链段。

图2为利用HPLC所测定的GEM的标准曲线，从中可以得出PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物当中吉西他滨的载药量为2.5％，即平均每个目标分子带有三个GEM，这与上述炔基化树状大分子-吉西他滨的质谱数据是吻合的。

实施例17

偶联体8的合成方案与实施例16基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4·5H₂O、1.05倍摩尔数的N3-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物。MALDI-TOFMS：m/z7774([M+Na]⁺)

实施例18

偶联体9的合成方案与实施例16基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-吉西他滨偶联物、CuSO4·5H₂O、10.1倍摩尔数的N₃-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOFMS：m/z25999([M+Na]⁺)

实施例19

偶联体10的合成方案与实施例16基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基4代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化4代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4·5H₂O、1.05倍摩尔数的N3-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOFMS：m/z13057([M+K]⁺)

实施例20

偶联体11的合成方案与实施例16基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基5代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入1.05倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化5代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4·5H₂O、2.1倍摩尔数的N₃-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOFMS：m/z25571([M+H]⁺)

实施例21

偶联体12的合成方案与实施例16基本相同，在此基础上：

炔基三苯甲硫基3代赖氨酸树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，除去溶剂，加入无水乙醚，析出物经真空干燥，并溶解在无水DMF当中，溶液中加入6.1倍的MA-GFLG-治疗因子，DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化3代赖氨酸树状大分子-治疗因子偶联物。在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO4·5H₂O、5.03倍摩尔数的N3-mPEG(叠氮甲氧基PEG)、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，溶液经避光透析，通过冻干去除溶剂，并通过提纯、透析、冻干得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。MALDI-TOFMS：m/z19416([M+K]⁺)

实施例22

谷氨酸树状大分子-吉西他滨偶联的合成方案与赖氨酸树状大分子-吉西他滨偶联的合成方案(实施例16-21)基本相同。

实施例23

Boc-GFLG-OMe的合成方法

1.在氮气保护下，Boc-Gly-OH(11，10.5g)，H-Phe-OMe盐酸盐(12，8.6g)，HOBT(10.808g)，HBTU(30g)，DIPEA(48mL)溶解在50mL无水DMF当中，溶液在0℃下搅拌2h，而后在室温下搅拌24h。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO₃aq.(satd.)，1MHClaq.，NaHCO₃aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤.有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体Boc-GF-OMe。ESI-MSm/z359[(M+Na)⁺]产率：85％。

2.在氮气保护下，Boc-Leu-OH(14.0g)，H-Gly-OMe盐酸盐(5.0g)，HOBT(10.8g)，EDC(16.0g)，DIPEA(48.8mL)溶解在50mL无水DMF。溶液在0℃下搅拌2h，而后在室温下搅拌24h。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO₃aq.(satd.)，1MHClaq.，NaHCO₃aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤。有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体Boc-LG-OMe。ESI-MSm/z341[(M+K)⁺]产率：87％.

3.Boc-GF-OMe(9.0g，27.0mmol)首先溶解在适量甲醇中，然后在0℃下加入1MNaOHaq.(80.0mL)溶液在室温下搅拌3h，然后用1MHClaq.将pH调节到2-3。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并用NaClaq.(satd.)洗涤三次。减压蒸馏出去溶剂。所得白色固体为Boc-GF-OH，备用。

4.在氮气保护下，Boc-LG-OMe(8.607g，28.5mmol)首先溶解在20mL无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂当中(1∶1，V/V)，该混合体系在0℃下搅拌24h。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在50mL无水DMF当中。DIPEA(19.5mL)、Boc-GF-OH(6.0g)、HBTU(10.6g)、HOBT(3.8g)依次加入体系并在氮气保护下以及0℃下搅拌1h，而后在室温下搅拌24h。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3aq.(satd.)，1MHClaq.，NaHCO3aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤.有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体Boc-GFLG-OMe。ESI-MSm/z529[(M+Na)⁺]产率：70.3％。

实施例24

本发明实施例10中，Boc(12)-G3-Cbz(12)的合成方法

1.在氮气保护下，Boc-Lys(Boc)-OH(3.523g，10.17mmol)，HOBT(3.865g，10.17mmol)，HBTU(3.856g，10.17mmol)，DIPEA(7.1mL，40.68mmol)溶解在50mL无水DMF当中，并在0℃搅拌30min。2.42g三(2-胺乙基)胺逐滴加入后该体系在室温下搅拌24h。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO₃aq.(satd.)，1MHClaq.，NaHCO₃aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤.有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为1代赖氨酸树状大分子(G1)。¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ＝1.15-1.75(m，CH₂-LysandCH₃-Boc)，.40(m，NCH₂CH₂NHCO)，2.80(m，CH2NH-Lys)，3.08(m，NCH₂CH₂NHCO)，1773.78-4.0(m，COCH(R)NH)，6.70(s，NHCO)，7.61(s，NHCO)；MALDI-TOFMS：178m/z1153.75[(M+Na)⁺，C₅₄H₁₀₂N₁₀O₁₅Na]产率：87.5％

2.在氮气保护下，1代赖氨酸树状大分子(2.26g，2mmol)首先溶解在20mL无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂当中(1∶1，V/V)，该混合体系在0℃下搅拌24h。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在50mL无水DMF当中。DIPEA(4.89mL，28mmol)，Boc-Lys(Boc)-OH(2.42，7mmol)，HBTU(2.65g，7mmol)，HOBT(0.945g，7mmol)依次加入体系并在氮气保护下以及0℃下搅拌1h，而后在室温下搅拌24h。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3aq.(satd.)，1MHClaq.、NaHCO3aq.(satd.)，NaClaq.(satd.)洗涤。有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为2代赖氨酸树状大分子(G2)。¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ＝1.15-1.80(m，CH₂-LysandCH₃-Boc)，2.42(m，NCH₂CH₂NHCO)，2.80-3.15(m，CH₂NH-LysandNCH2CH2NHCO)，3.80-4.22(m，COCH(R)NH)，6.40(s，NHCO)，6.78(s，NHCO)，6.90(s，NHCO)，7.78(s，NHCO)；MALDI-TOFMS：2522.64[(M+Na)⁺，C₁₂₀H₂₂₂N₂₂O₃₃Na].产率：73％

3.在氮气保护下，2代赖氨酸树状大分子(2.0g，0.8mmol)首先溶解在20mL无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂当中(1∶1，V/V)，该混合体系在0℃下搅拌24h。通过减压蒸馏将溶剂除去，加入无水乙醚，析出白色沉淀。析出物真空干燥0.5小时并溶解在50mL无水DMF当中。DIPEA(7.9mL，60mmol)，Cbz-Lys(Boc)-OH(4.256，11.2mmol)，HBTU(4.244g，11.2mmol)，HOBT(1.512g，11.2mmol)依次加入体系并在氮气保护下以及0℃下搅拌1h，而后在室温下搅拌24h。反应结束后将反应体系加入500mL乙酸乙酯当中，并依次用NaHCO3aq.(satd.)，1MHClaq.、NaHCO3aq.(satd.)、NaClaq.(satd.)洗涤。有机相用无水MgSO4干燥，并用减压蒸馏出去溶剂。残留物在乙酸乙酯/乙醚的混合溶剂中重结晶得到白色固体为3代赖氨酸树状大分子(G3)。MALDI-TOFMS：m/z5668[(M+Na)⁺，C₂₈₈H₄₃₈N₄₆O₆₉]产率：68％

本发明合成方法的原料来源：Boc-Gly-OH，H-Phe-OMe盐酸盐，Boc-Leu-OH，H-Gly-OMe盐酸盐，Boc-Lys(Boc)-OH，Cbz-Lys(Boc)-OH均从上海吉尔生化有限公司购进；三(2-胺乙基)从TCI化学品公司购进。

实施例25

本发明对树状大分子-阿霉素偶联体1进行了以下实验检测：

一、尺寸，形貌及Zeta电位

本发明利用ZetasizerNanoZS(MalvernInstruments，Worcestershire，UK)对纳米颗粒的流体动力学尺寸和Zeta电位进行了表征。PEG化树状大分子-阿霉素偶联物溶解在10mL重蒸水中以得到100μg/mL的水溶液。将该水溶液滴在铜网上，分散几分钟后，多余的溶剂用滤纸拭去并在室温下自然晾干以制得TEM样品。将基于PEG化树状大分子-阿霉素偶联体的纳米颗粒水溶液(100μg/mL)直接滴在硅片上并在室温下自然晾干，并通过FE-SEM进一步对其尺寸进行表征。

动态光散射(DLS)结果表明PEG化树状大分子-阿霉素偶联物可以在水中聚集成122nm的纳米颗粒(图3)。这种自组装行为的驱动力来自于PEG链段的亲水性与树状大分子疏水性之间的平衡。另外，体系当中所含有的阿霉素也为整个体系的自组装行为提供了π-π堆叠，偶极作用和氢键作用等驱动力纳米颗粒表面的负电荷，可以降低纳米颗粒与血清蛋白之间强烈作用，从而减少巨噬细胞对于纳米颗粒吞噬，延长其在体内的循环时间。因此，这一体系在肿瘤组织当中能够获得更好地聚集，从而显示出较好的抗肿瘤效果。

利用SEM，TEM对纳米颗粒的形貌进行了进一步的表征，结果表明纳米颗粒的尺寸在100nm左右(图3)。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-阿霉素偶联体的纳米颗粒拥有90～122nm的尺寸，这一特征使其能够充分利用EPR效应而在肿瘤组织聚集，同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

二、肿瘤细胞系，细胞培养及动物实验

4T1细胞系从中国科学院上海细胞库购入，并以RPMI1640为培养基，以10％(v/v)的热失活胎牛血清及1％青霉素和链霉素混合物为补充剂，在5％二氧化碳/95％空气的气氛和37℃的条件下进行培养。

选取雌性BALB/c小鼠(20±2g，6-8周)作为肿瘤模型。所用动物从四川大学华西动物繁殖中心购进，随机分组并在光暗规律交替的恒温房间中饲养。

通过皮下注射建立4T1肿瘤模型评价体内抗癌效率。通过以下步骤给雌性BALB/c小鼠接种4T1细胞悬液以建立肿瘤模型。

注射前，接种部位去除皮毛并用药用碘酒擦拭。将5×10⁵个4T1细胞分散50μL的PBS中，并通过皮下注射的方式注射进入小鼠已预先处理的部位。实体瘤经过1-2周的生长后体积达到50-100mm³，然后将长有肿瘤的小鼠随机分为三个平行实验组：生理盐水组(对照)，阿霉素组(4mg阿霉素/kg小鼠)，树状大分子-阿霉素组(1mg阿霉素/kg小鼠)。从第一天到第十三天每隔四天通过尾静脉注射200μL相应的生理盐水或者药物。每隔两天对肿瘤尺寸和小鼠重量进行测量。肿瘤体积通过下列公式进行计算：肿瘤体积(mm³)＝1/2×长(mm)×宽²(mm²)。所有动物在第十五天处死，切除肿瘤以用作免疫组化的研究，借以评价肿瘤组织的血管生成，细胞凋亡以及细胞增殖的情况。

结果如图3所示，树状大分子-阿霉素偶联物在较低的给药剂量的情况下却显示出了与游离阿霉素相类似的效果，表明树状大分子-阿霉素偶联物体系有着比游离阿霉素更好的抗肿瘤应用前景。根据体重变化曲线(图4)，树状大分子-阿霉素偶联物有着相较于自有阿霉素更好的生物安全性和更低的系统毒性。

三、体内血管生成和免疫组化研究

免疫组化实验(IHC)采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶的方法进行。Theparaffin-embedded石蜡包埋的肿瘤组织去石蜡以及再水化后，在4℃下与第一抗体培养过夜。在室温下，再与生物素化羊抗兔抗体培养30分钟。最后通过MoticImagesAdvancedsoftware对免疫组化的结果进行检测。在37℃下，将去石蜡和再水化的肿瘤切片与蛋白酶K培养15分钟，用PBS清洗两次，然后用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL实验，根据使用说明得出细胞凋亡情况。阳性TUNEL染色可以通过光学显微镜观测到，最终的细胞凋亡系数是由凋亡细胞数与整体细胞数的比例得出。

光密度分析(图5)结果表明用树状大分子-阿霉素偶联物实验组的肿瘤部位血管密度远远少于生理盐水组，且优于阿霉素组。以上结果表明，就抑制血管生成而言，低剂量的树状大分子-阿霉素偶联物纳米颗粒的治疗效果是与高剂量的自由药物相当甚至更优的。

免疫组化染色剂Ki-67可以针对处于G1，G2，以及S阶段的活性增殖细胞进行染色，从而被广泛用于药物对细胞增殖抑制作用的评价。如图6所示，树状大分子-阿霉素偶联物组的平均结合光密度(IOD)明显低于生理盐水组。同时，我们采用TUNEL的方法对肿瘤细胞的凋亡水平(图7)进行了评价，就细胞的凋亡水平而言，阿霉素自由药物的效果与生理盐水组是相当的，但树状大分子-阿霉素组与之相比却有着明显的优势。

根据免疫组化的结果可以发现，低剂量树状大分子-阿霉素偶联物纳米颗粒的抗肿瘤效果与高剂量自由阿霉素是相当的。同时，由于不同于大多数以干扰DNA合成和细胞分化的抗癌药物，树状大分子-阿霉素偶联物纳米颗粒更倾向于提高肿瘤细胞的凋亡水平。这种药物运输系统通过EPR效应以及改变药物动力学性质而获得了较之自由药物更长的循环时间和更高的肿瘤组织聚集程度。值得注意的是由于阿霉素是通过GFLG短肽与树状大分子共价连接，获得了更好的稳定性，使其可以缓慢释放出药物并在肿瘤部位有效聚集，从而显著影响肿瘤组织微环境以及通过提高肿瘤细胞的凋亡水平达到调节肿瘤生长的效果。由于降低细胞凋亡水平对肿瘤的生长有着决定性的作用，所以尽管低剂量的治疗策略可能会提高药物的耐药性，但其依然能够达到与高剂量自由阿霉素相当的治疗效果。

由于本发明给药系统所发挥抗肿瘤效果的基础在于其亲疏水性质所导致的纳米颗粒尺寸以及酶敏感键GFLG所提供的特异性断裂，因此只要具体结构的改变不涉及到这两个基础性质，对于给药系统的最终抗肿瘤效果便不会有太大的变化，即不会从有效果变为无效果。因此从偶联体1的体内生物数据即可直接推测出本类型的给药系统均具有可预见的抗肿瘤效果和生物安全性。

实施例26

本发明对树状大分子-吉西他滨偶联体7进行了以下实验检测：

一、尺寸，形貌及Zeta电位

本发明利用ZetasizerNanoZS(MalvernInstruments，Worcestershire，UK)对纳米颗粒的流体动力学尺寸和Zeta电位进行了表征。PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物溶解在10mL重蒸水中以得到100μg/mL的水溶液。将该水溶液滴在铜网上，分散几分钟后，多余的溶剂用滤纸拭去并在室温下自然晾干以制得TEM样品。将基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体的纳米颗粒水溶液(100μg/mL)直接滴在硅片上并在室温下自然晾干，并通过FE-SEM进一步对其尺寸进行表征。

动态光散射(DLS)结果(图8)表明PEG化树状大分子-吉西他滨偶联物可以在水中聚集成109.2nm的纳米颗粒。这种自组装行为的驱动力来自于PEG链段的亲水性与树状大分子疏水性之间的平衡。另外，体系当中所含有的吉西他滨也为整个体系的自组装行为提供了π-π堆叠，偶极作用和氢键作用等驱动力纳米颗粒表面的负电荷，可以降低纳米颗粒与血清蛋白之间强烈作用，从而减少巨噬细胞对于纳米颗粒吞噬，延长其在体内的循环时间。因此，这一体系在肿瘤组织当中能够获得更好地聚集，从而显示出较好的抗肿瘤效果。

利用TEM对纳米颗粒的形貌进行了进一步的表征，结果表明纳米颗粒的尺寸在100nm左右(图9)。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体的纳米颗粒拥有90～110nm的尺寸，这一特征使其能够充分利用EPR效应而在肿瘤组织聚集，同时又可以有效延长其在体内的循环时间，从而有望展现出良好的抗肿瘤效果。

利用DLS和TEM对偶联体11的纳米颗粒的形貌进行表征，DLS结果表明纳米颗粒的尺寸为129.5nm，TEM结果表明纳米颗粒的尺寸在110nm左右。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体11的纳米颗粒拥有100～130nm的尺寸。

利用DLS和TEM对偶联体12的纳米颗粒的形貌进行表征，DLS结果表明纳米颗粒的尺寸为82.5nm，TEM结果表明纳米颗粒的尺寸在90nm左右。综合DLS的结果，基于PEG化树状大分子-吉西他滨偶联体12的纳米颗粒拥有80～100nm的尺寸。

二、细胞系培养及体外抗肿瘤细胞效果

TC-1细胞系从中国科学院上海细胞库购入，并以RPMI1640为培养基，以10％(v/v)的热失活胎牛血清及1％青霉素和链霉素混合物为补充剂，在5％二氧化碳/95％空气的气氛和37℃的条件下进行培养。

取对数生长期以上的TC-1细胞，用0.05％胰蛋白酶消化后细胞记数，用新鲜培养液配制成1×105/ml，96，孔板各孔加100uL，置于37℃，5％CO2培养箱内培养。纯化的PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物以及吉西他滨样品用PBS溶解，过滤除菌。24h后加等倍稀释的不同浓度的PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物或者吉西他滨样品(20uL/孔)，同一浓度设5个复孔，阴性对照孔加20uL培养基。继续培养48h后，每孔加100uLCCK-8溶液，置室温2h后，用WellscanMK全自动酶标仪测450nm处吸光度值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[对照孔D(450)-实验孔D(570)]/对照孔D(570)×100％，通过计算细胞生长的抑制百分率，用Orign6.0软件计算出PEG化3代树状大分子-吉西他滨偶联物和吉西他滨的IC50(半数抑制浓度)分别为1.52ug/mL，0.04ug/mL，结果见图10。

Claims (8)

1.基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：给药系统为PEG化肽类树状大分子、靶向功能性因子GFLG与抗肿瘤治疗因子的偶联物，结构如下：

其中，A为PEG化3~5代肽类树状大分子，树状大分子的末端氨基与基团L连接；

L为：；

R为GFLG与治疗因子的偶联物，GFLG的末端氨基与基团L连接；

先在治疗因子与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，得偶联物A，备用；再将作为载体的肽类树状大分子炔基化，在树状大分子上引入三苯甲硫基，得到炔基三苯甲硫基树状大分子，脱去三苯甲基后，与所述的偶联物A发生偶联反应，得到炔基化树状大分子与治疗因子的偶联物，最后经PEG化得成品。

2.根据权利要求1所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：所述的肽类树状大分子为赖氨酸或者谷氨酸的肽类树状大分子。

3.根据权利要求1所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：所述的治疗因子为能与GFLG发生偶联的药物。

4.根据权利要求1所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：所述PEG化肽类树状大分子给药系统的颗粒粒径为80~130nm。

5.根据权利要求1所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：本发明的制备方法具体操作步骤如下：

AMA-GFLG-治疗因子偶联物的制备

在治疗因子与GFLG的偶联物上引入甲基乙烯基，得偶联物A，备用；

B炔基化树状大分子的合成

以Boc与Cbz基团保护的树状大分子为原料，在氢气氛围下与Pb/C反应，反应结束后，将反应产物溶解在DMF当中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、己炔酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基化树状大分子；

C炔基三苯甲硫基树状大分子的合成

炔基化树状大分子溶解在无水二氯甲烷与三氟乙酸的混合溶剂中，体系在氮气保护下反应，将反应产物溶解在无水DMF中，体系中加入N，N-二异丙基乙胺、3-三苯甲硫基丙酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑，在氮气保护下反应，反应所得产物为炔基三苯甲硫基树状大分子；

D炔基化树状大分子-治疗因子偶联物的合成

炔基三苯甲硫基树状大分子溶解在无水二氯甲烷/三氟乙酸中，体系在氮气保护下反应；当溶液转为黄绿色后，体系加入三乙基硅烷，反应结束后，将反应产物溶解在无水DMF当中，溶液中加入偶联物A、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，在氮气保护下避光反应，反应所得产物为炔基化树状大分子-治疗因子偶联物；

EPEG化树状大分子

在氮气气氛下，将炔基化树状大分子-治疗因子偶联物、CuSO₄·5H₂O、N₃-mPEG、抗坏血酸钠加入到DMF和H₂O的混合溶剂当中，反应体系避光反应，反应结束后，产物经提纯、透析、冻干，得到PEG化树状大分子-治疗因子偶联物。

6.根据权利要求5所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：所述的B和C步骤，体系在氮气保护下反应结束后，溶液用乙酸乙酯稀释，并依次用NaHCO₃、HCl、NaHCO₃、NaCl洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，并用减压蒸馏除去溶剂，残留物经重结晶，得到产物。

7.根据权利要求5所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：所述的D步骤，溶液中加入偶联物A、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯后，在氮气保护及室温下避光反应0.1~90小时。

8.根据权利要求5所述的基于GFLG的PEG化肽类树状大分子给药系统的制备方法，其特征在于：所述的D步骤，反应结束后，反应液逐滴加入到乙酸乙酯当中，析出物通过离心、提纯、干燥，得到炔基化树状大分子-治疗因子偶联物。