CN106581690B - 肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段hpma聚合物给药系统及其制备方法 - Google Patents
肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段hpma聚合物给药系统及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统,该给药系统为HPMA聚合物、组织蛋白酶B底物GFLG和小分子药物吉西他滨的偶联物。该两亲性嵌段偶合物自组装形成的纳米载药系统具有酶响应性降解及药物释放能力,吉西他滨通过偶联到可降解两亲性嵌段HPMA聚合物骨架的方式进行递送,该体系分子量相对较高并且可以在肿瘤部位有效聚集,具有良好的生物相容性和抗肿瘤效应,同时,近红外荧光探针Cy5.5的引入赋予了该体系自我示踪的能力。
Description
技术领域
本发明属于医药生物高分子材料技术领域,涉及一种纳米给药系统,具体涉及一种肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统。
背景技术
临床乳腺癌的治疗面临多方面的挑战,通过使用在体内持续时间更长、具有更高肿瘤特异性以及更低副作用的药物递送系统有望进一步改善乳腺癌的治疗方式。抗肿瘤药物吉西他滨(GEM)进入体循环后,在体内易被代谢为非活性尿嘧啶中间体(2’-脱氧-2’-2’-双氟胞嘧啶核苷[dFdU])而被快速清除,故其稳定性需进一步改善。为了解决治疗使所面临的挑战,纳米载药系统利用实体瘤组织特有的增强渗透滞留效应(EPR)效应将药物被动靶向递送至肿瘤部位,很好的改善了临床静脉注射小分子化疗药物带来的毒副作用。
在众多的纳米载药系统(包括无机纳米粒子、脂质体、胶束和聚合物)中,聚合物-药物偶联物凭借其递送过程中的稳定性和低系统毒性而具有良好的应用潜力。在聚合物-药物偶联物递送系统中,基于N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)的聚合物凭借其独特的优势,例如良好的生物相容性、合成的灵活性、非免疫原性以及行之有效的共轭化学结构而受到广泛关注。水溶性差的药物可以通过功能型共价键偶联至HPMA聚合物上,该共价键的存在保证了循环过程中的稳定,而在肿瘤特殊微环境下可以快速断裂,并释放药物。目前,许多HPMA聚合物-药物偶联物已在进行临床或临床前期研究。其中,第一个进入临床研究的是一种直链型HPMA聚合物-阿霉素(DOX)偶联物。相关研究指出,相比于小分子药物来说,这一系统的毒副作用大大降低。然而,第一代HPMA聚合物偶联物的分子量较小,并不足以使EPR效应得到完全地发挥,这也进一步导致了抗肿瘤效果不能达到理想的程度。一方面,高分子量的药物载体具有长循环特性,可以有效避免肾排泄;另一方面,具有不可降解骨架的高分子量偶联物会聚集在正常组织从而降低生物相容性。因此,新型HPMA载药系统的设计需要同时考量清除与长循环问题。
申请号为CN201410568780.X的发明专利,公开了一种负载吉西他滨的PEG化肽类树状大分子靶向给药系统,该给药系统通过GFLG将吉西他滨和PEG化肽类树状大分子相连接后形成功能化树状大分子,具有良好的生物相容性。但肽类树状大分子的制备需要逐步合成以及繁琐的纯化过程,不利于工业化放大。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种刺激响应型可生物降解两亲性嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物自组装纳米给药系统,该两亲性嵌段偶合物自组装形成的纳米载药系统具有酶响应性降解及药物释放能力。吉西他滨通过偶联到可降解两亲性嵌段HPMA聚合物骨架的方式进行递送,该体系分子量相对较高并且可以在肿瘤部位有效聚集,具有良好的生物相容性和抗肿瘤效应,同时,近红外荧光探针Cy5.5的引入赋予了该体系自我示踪的能力。
本发明的技术方案如下:
一种肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统,该给药系统为HPMA聚合物、组织蛋白酶B底物GFLG和小分子药物吉西他滨的偶联物,具体结构如下:
其中:m=0-4;
n=1,2,3……;
o=1,2,3……;
本发明设计并表征了具有较高分子量、可生物降解的基于两亲性嵌段HPMA聚合物-GEM偶合物的纳米体系,通过在主链中引入可生物降解基团可以构建出同时具有生物可降解性和高分子量的HPMA聚合物,将其作为环境刺激响应型药物递送系统用于乳腺癌治疗,以期实现更好的抗肿瘤效果及生物安全性。通过两步RAFT聚合反应,形成两亲性嵌段聚合物主链,并通过新型链转移剂在主链中心引入酶敏感短肽GFLG。小分子药物吉西他滨通过GFLG偶联,其整体作为疏水嵌段。该两亲性嵌段HPMA共聚物可自组装形成致密的纳米粒子。
该给药系统的平均分子量为80-110KDa。肾阈值约为50KDa,该分子量在肿瘤微环境下,降解为分子量低于50kDa的片段,能兼顾抗肿瘤效果及生物安全性,保证降解后能够被清除出体内。
优选地,其中,m=0-4,n=270-320,o=5-12。m值很小,o与m的比例即是疏水片段与亲水片段的比例,该比例使给药系统具有自组装行为,从而保证纳米粒子递送过程中的稳定性。
本发明为了构建出同时具有生物可降解性和高分子量的HPMA聚合物,成功合成了一种酶响应的功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA。这一新型链转移剂被用来介导第一步可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合),将HPMA和一种叠氮修饰的功能化单体聚合成为亲水性HPMA共聚物,随后将这一两端均为硫代苯甲酸酯基团的聚合物作为大分子链转移剂,再次通过RAFT聚合与疏水性单体MA-GFLG-GEM一起制备得到一种两亲性HPMA聚合物-吉西他滨偶联物。最后,通过炔基-叠氮基点击反应,将炔基修饰的近红外荧光探针Cy5.5引入该偶联物,实现该系统体内的自我示踪。
本发明两亲性嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物自组装纳米给药系统的制备方法,当m=0时,包括以下步骤:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
合成路线如下:
1)氮气氛下,Boc-GFLG-OH、HBTU和HOBt溶解于DMF,0℃下搅拌10分钟后加入DIPEA,所得体系在0℃下再反应30分钟后加入N-Boc-乙二胺,室温反应得Boc-GFLG-NHBoc;
2)冰浴下将Boc-GFLG-NHBoc溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液,室温反应脱去Boc保护基团,将乙醚中所得的沉淀物于氮气氛下溶于DMF,0℃加入DIPEA,得A体系;将4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和HATU溶于DMF,并加入至A体系中,反应得CTA-GFLG-CTA;
B、两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的合成
1)分别称取HPMA和CTA-GFLG-CTA并加入密闭体系,抽换氩气后,加入含有VA044的去离子水和甲醇的混合溶液,冰浴下鼓氩气30分钟,再将该体系密闭避光反应;液氮淬灭反应,将反应液滴加至丙酮中,HPMA共聚物以沉淀形式析出,并通过二次沉淀纯化;
优选地,去离子水与甲醇以4:1的体积比混合得到B步骤1)中的混合溶液。
进一步优选地,所述混合溶液中含11μmol/L的引发剂VA044,其含量与所加入单体投料比及溶剂体系均影响聚合物分子量。
2)将得到的HPMA共聚物和MA-GFLG-GEM加入密闭体系,抽换氩气后,冰浴下加入含VA044的DMSO/H2O混合溶剂,随后鼓氩气30分钟后避光反应;液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮,析出目标产物HPMA共聚物-GEM偶联物。
优选地,所述B步骤2)中DMSO与H2O以2:1的体积比混合得到所述混合溶剂。
进一步优选地,所述混合溶剂中含7μmol/L的引发剂VA044,其含量与所加入单体投料比及溶剂体系均影响聚合物分子量。
本发明不同于常规的链转移剂合成所用的固态合成法,该功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成采用液态合成法,利于放大生产;与此同时,GFLG的引入保证了聚合物的高分子量及最终的有效清除。
本发明两亲性嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物自组装纳米给药系统的另一种制备方法,当m不为0时,包括以下步骤:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
1)氮气氛下,Boc-GFLG-OH、HBTU和HOBt溶解于DMF,0℃下搅拌10分钟后加入DIPEA,所得体系在0℃下再反应30分钟后加入N-Boc-乙二胺,室温反应得Boc-GFLG-NHBoc;
2)冰浴下将Boc-GFLG-NHBoc溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液,室温反应脱去Boc保护基团,将乙醚中所得的沉淀物于氮气氛下溶于DMF,0℃加入DIPEA,得A体系;将4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和HATU溶于DMF,并加入至A体系中,反应得CTA-GFLG-CTA;
B、两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的合成
1)分别称取HPMA、MA-CH2CH2-N3和CTA-GFLG-CTA并加入密闭体系,抽换氩气后,加入含有VA044的去离子水和甲醇的混合溶液,冰浴下鼓氩气30分钟,再将该体系密闭避光反应;液氮淬灭反应,将反应液滴加至丙酮中,HPMA共聚物以沉淀形式析出,并通过二次沉淀纯化;
2)将得到的HPMA共聚物和MA-GFLG-GEM加入密闭体系,抽换氩气后,冰浴下加入含VA044的DMSO/H2O混合溶剂。随后鼓氩气30分钟后避光反应;液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮,析出HPMA共聚物-GEM偶联物;
优选地,去离子水与甲醇以4:1的体积比混合得到B步骤1)中的混合溶液。
进一步优选地,所述混合溶液中含11μmol/L的引发剂VA044,其含量与所加入单体投料比及溶剂体系均影响聚合物分子量。
优选地,所述B步骤2)中DMSO与H2O以2:1的体积比混合得到所述混合溶剂。
进一步优选地,所述混合溶剂中含7μmol/L的引发剂VA044,其含量与所加入单体投料比及溶剂体系均影响聚合物分子量。
如果要引入Cy5.5,继续以下步骤:
3)氩气氛下,将带有叠氮基团的HPMA共聚物-GEM偶联物、五水硫酸铜、炔基修饰的Cy5.5和抗坏血酸钠加入DMSO/H2O混合溶液中避光反应,得到终产物。
本发明的优势在于:
1、本发明设计、制备并表征了具有较高分子量、可生物降解的两亲性HPMA聚合物-GEM偶合物自组装形成纳米体系作为环境刺激响应型药物递送系统用于乳腺癌治疗。聚合物主链由亲水和疏水嵌段构成,并在主链中心引入酶敏感短肽GFLG。与此同时,GFLG-GEM片段通过聚合形成疏水嵌段。GEM通过可降解两亲性嵌段HPMA聚合物-GEM偶联物的方式自组装形成纳米粒子来进行递送,该体系分子量相对较高,可以在循环过程中维持稳定且在肿瘤部位有效聚集,具有良好的生物相容性和抗肿瘤效应。
2、本发明成功合成了一种酶响应的功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA。这一新型链转移剂被用来介导第一步可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合),将HPMA和一种叠氮修饰的功能化单体聚合成为亲水性HPMA共聚物,随后将这一两端均为硫代苯甲酸酯基团的聚合物作为大分子链转移剂,再次通过RAFT聚合与疏水性单体MA-GFLG-GEM一起制备得到一种两亲性HPMA聚合物-吉西他滨偶联物。最后,通过炔基-叠氮基点击反应,将炔基修饰的近红外荧光探针Cy5.5引入该偶联物,实现该系统体内的自我示踪。
3、本发明的制备方法仅通过两步RAFT聚合反应便能制得两亲性HPMA聚合物骨架,使得亲水和疏水嵌段构成聚合物主链,新型链转移剂的使用在主链中心引入酶敏感短肽GFLG,其制备纯化过程简便,大大节省了成本,利于工业化放大。此外,通过高效的点击反应,引入可用于自我示踪的近红外荧光探针Cy5.5,实现了系统在体内分布情况的实时监测,有效反映体内分布的实际情况,利于进一步的临床实验。
4、本发明中,通过两步RAFT聚合与此同时,聚合物骨架中引入了Cy5.5作为荧光探针,能够本发明所制备的两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的自组装纳米系统可以得到较好的抗肿瘤效果,很好的解决了临床用药GEM的循环不稳定性及系统毒性问题。一系列体内外实验表明,这一分子量为90KDa的通过自组装形成的载药系统表面带负电,能够有效避免调理素作用;其纳米尺寸使得所形成的纳米粒子能够通过EPR效应实现肿瘤位点的被动靶向聚集,为更好的抗肿瘤效果和更低的毒副作用提供可能;酶敏感短肽GFLG的存在赋予了系统循环过程中的稳定性及肿瘤微环境下的药物快速释放和同时产生的载体自身的降解清除;所形成的纳米粒子经内吞入胞,所释放的药物能够发挥抑制肿瘤部位血管新生和肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡的作用;与此同时,递送系统对于正常组织器官无明显损伤。良好的抗肿瘤效果与生物相容性使得这一两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物在乳腺癌治疗应用中具有广阔的前景。
附图说明
图1为本发明HPMA聚合物-吉西他滨偶联物的合成路线图。
图2为HPMA聚合物(A)和HPMA聚合物-吉西他滨偶联物(B)的1H NMR谱图。
图3为由DLS和SEM所表征的聚合物纳米载体的形貌、粒径及zeta电位。
图4为酶响应性药物释放曲线;两亲性嵌段HPMA-GEM偶合物(MW 96kDa,PDI1.15)的SEC结果及降解片段(MW46kDa)示意图。
图5为体外细胞实验结果。(A)GEM和聚合物纳米载药体系对乳腺癌细胞4T1的抗肿瘤能力;HPMA聚合物载体本身对4T1细胞(B)和3T3细胞(C)的影响;共聚焦结果图片(D);细胞凋亡结果(E)。
图6为离体荧光成像分析结果图。
图7为HPMA聚合物-吉西他滨偶联物抗肿瘤效果。
图8为治疗后荷瘤小鼠各主要脏器的组织学分析图。
图9为治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织的免疫组化分析图。
图10为中间体Boc-GFLG-Boc高分辨质谱图。
图11为链转移剂CTA-GFLG-CTA高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
实施例1
肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统,该给药系统为HPMA聚合物、组织蛋白酶B底物GFLG和小分子药物吉西他滨的偶联物,具体结构如下:
其中:m=0-4;
n=270-320;
o=5-12;
实施例2
本实施例在实施例1的基础上:
该给药系统的平均聚合度为m=0,n=260,o=5。
该给药系统的平均分子量为80KDa。
实施例3
本实施例在实施例1的基础上:
R:-N3。
该给药系统的平均聚合度为m=0.4,n=280,o=7。
该给药系统的平均分子量为90KDa。
实施例4
本实施例在实施例1的基础上:
该给药系统的平均聚合度为m=1,n=300,o=10。
该给药系统的平均分子量为110KDa。
本发明两亲性嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物自组装纳米给药系统的制备方法,合成路线如图1所示。
实施例5
本实施例为实施例2的制备方法,包括以下步骤:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
1)氮气氛下,Boc-GFLG-OH、HBTU和HOBt溶解于DMF,0℃下搅拌10分钟后加入DIPEA,所得体系在0℃下再反应30分钟后加入N-Boc-乙二胺,室温反应得Boc-GFLG-NHBoc;
2)冰浴下将Boc-GFLG-NHBoc溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液,室温反应脱去Boc保护基团,将乙醚中所得的沉淀物于氮气氛下溶于DMF,0℃加入DIPEA,得A体系;将4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和HATU溶于DMF,并加入至A体系中,反应得CTA-GFLG-CTA;
B、两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的合成
1)分别称取HPMA和CTA-GFLG-CTA并加入密闭体系,抽换氩气后,加入含有VA044的去离子水和甲醇的混合溶液,冰浴下鼓氩气30分钟,再将该体系密闭避光反应;液氮淬灭反应,将反应液滴加至丙酮中,HPMA共聚物以沉淀形式析出,并通过二次沉淀纯化;
2)将得到的HPMA共聚物和MA-GFLG-GEM加入密闭体系,抽换氩气后,冰浴下加入含VA044的DMSO/H2O混合溶剂,随后鼓氩气30分钟后避光反应;液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮,析出目标产物HPMA共聚物-GEM偶联物。实施例6
本实施例为实施例3的制备方法,包括以下步骤:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
同实施例5。
B、两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的合成
1)分别称取HPMA、MA-CH2CH2-N3和CTA-GFLG-CTA并加入密闭体系,抽换氩气后,加入含有VA044的去离子水和甲醇(4:1,v/v)的混合溶液,冰浴下鼓氩气30分钟,再将该体系密闭避光反应;液氮淬灭反应,将反应液滴加至丙酮中,HPMA共聚物以沉淀形式析出,并通过二次沉淀纯化;
2)将得到的HPMA共聚物和MA-GFLG-GEM加入密闭体系,抽换氩气后,冰浴下加入含VA044的DMSO/H2O(2:1,v/v)混合溶剂。随后鼓氩气30分钟后避光反应;液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮,析出HPMA共聚物-GEM偶联物。
实施例7
本实施例为实施例4的制备方法,包括以下步骤:
在实施例6的基础上,
所述B步骤1)的混合溶液中含11μmol/L的引发剂VA044。
所述B步骤2)的混合溶剂中含7μmol/L的引发剂VA044。
引入Cy5.5:氩气氛下,将HPMA共聚物-GEM偶联物、CuSO4·5H2O、alkynyl-Cy5.5和抗坏血酸钠加入到DMSO/H2O混合溶剂,使用透析袋在EDTA-Na2水溶液中透析,分离后得到Cy5.5标记的目标产物。
实施例8
刺激响应型可生物降解两亲性嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物的制备方法:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
1)氮气氛下,Boc-GFLG-OH(1.97g,6mmol)、HBTU(2.46g,6.5mmol)、HOBt(800mg,6.5mmol)溶解于40mL DMF,冰浴下搅拌10分钟,加入N-Boc-乙二胺(1.6g,10mmol),继续反应30分钟后转入室温反应24小时。反应完全后,250mL乙酸乙酯和100mL饱和碳酸氢钠萃取分液,有机相依次用NaHCO3aq.(satd.)、1M HCl aq.及NaCl aq.(satd.)洗涤三次,无水MgSO4干燥后浓缩,粗产品用柱层析法分离(乙酸乙酯/正己烷=1:1)得白色固体Boc-GFLG-NHBoc(3.31g,5.22mmol),收率87%。1H NMR(400MHz,d6-DMSO,δin ppm):0.83-0.89(dd,6H,-CH(CH3)2);1.28(s,18H,C(CH3)3),1.26-1.48(m,3H,-CH2CH(CH3)2);2.78-3.08(m,6H,NHCH2CH2NH and CHCH2C6H5);3.45-3.67(m,4H,NHCH2CONH and NHCH2CONH);4.25-4.26(m,1H,COCH(i-Bu)NH);4.54(s,1H,COCH(Bn)NH);6.47-6.82(m,1H,NH);6.93(m,1H,NH);7.17-7.22(m,5H,Pn-H);7.78(m,1H,NH);7.88-7.90(m,1H,NH);8.04(m,1H,NH);8.19-8.20(m,1H,NH)。13C NMR(100MHz,d6-DMSO,δin ppm):21.72,23.04,24.13,27.93,28.27,37.50,38.79,40.53,42.09,43.17,51.46,53.69,77.79,78.11,126.29,128.05,129.32,137.59,155.67,155.79,168.77,169.34,171.21,172.11.LC-MS(ES+):m/z635.3[M-Boc+H]+;657.3[M+Na]+。MALDI-HRMS:m/z 657.3558[M+Na]+;673.3278[M+K]+。
2)冰浴下将Boc-GFLG-NHBoc(634mg,1mmol)溶于二氯甲烷/三氟乙酸(体积比1:1,20mL),恢复至室温反应8小时,旋蒸移除溶剂。加入无水乙醚搅拌20分钟,出现沉淀物。沉淀物经乙醚洗涤2次,干燥后投下一步反应。
3)氮气氛下,将沉淀物溶于25mL DMF,所得溶液冰浴下预冷后加入DIPEA(0.35mL,2mmol)。4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(840mg,3mmol)和HATU(1.14g,3mmol)溶于20mL DMF,冰浴下搅拌10分钟后加入上述体系中,所得混合溶液在冰浴下反应30分钟并在室温反应4小时。反应完全后,旋蒸除去溶剂,残留物先用柱层析分离(硅胶;乙酸乙酯),所得粗产品再次柱层析纯化(乙酸乙酯/正己烷=1:1~2:1),得到红色固体产物CTA-GFLG-CTA(680mg,0.71mmol),收率71%。1H NMR(400MHz,d6-DMSO,δin ppm):0.74-0.87(m,6H,CH(CH3)2);1.23-3.11(m,23H,CH3-C(R)-CN),CH3-C(R)-CN),NHCOCH2CH2C(R)-CN,NHCOCH2CH2C(R)-CN,CHCH2C6H5,-CH2CH(CH3)2and NHCH2CH2NH);3.62-3.75(m,4H,NHCH2CONH and NHCH2CONH);4.17-4.26(m,1H,COCH(i-Bu)NH);4.53(s,1H,COCH(Bn)NH);7.80and8.02-8.27(m,6H,NH,NH,NH,NH,NH,NH);7.17-7.23(m,5H,CH2-Ph-H);7.49-7.52(m,4H,C(S)Ph-Hm and C(S)Ph-Hm);7.67-7.71(m,2H,C(S)Ph-Hp and C(S)Ph-Hp);7.89-7.91(m,4H,C(S)Ph-Ho and C(S)Ph-Ho)。13C NMR(100MHz,d6-DMSO,δin ppm):21.35,21.66,23.05,23.15,23.87,24.11,30.34,30.63,33.20,33.33,37.3437.73,38.27,39.93,40.14,42.11,46.28,46.32,51.37,51.48,53.85,54.13,118.72,126.41,128.06,129.00,129.21,129.25,133.61,137.32,137.71,144.12,168.76,168.83,168.93,170.25,170.54,171.19,172.16,172.29,223.72.LC-MS(ES+):m/z 479.2[(M+2H)/2]2+;957.3[M+H]+and 979.2[M+Na]+。MALDI-HRMS:m/z 979.3113[M+Na]+;995.2825[M+K]+。
B、嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物纳米系统(block HPMA copolymer-GEMconjugate-based nanoparticles)的制备
1)称取HPMA(2.4g,16.7mmol)、MA-CH2CH2-N3(137mg,0.5mmol)、CTA-GFLG-CTA(15.2mg,15.8μmol)于25mL圆底烧瓶中,抽换氩气三次,将含有VA044(3.4mg,11μmol)的去离子水/甲醇(4:1,10mL)混合溶液加入体系。冰浴下,通氩气鼓泡30分钟。再将该密闭体系转移至45℃油浴下避光反应9小时。液氮淬灭反应,将反应液缓慢滴加至200mL丙酮中,聚合物以沉淀形式析出。将沉淀物溶于少量甲醇,并再次加入丙酮中(重复两次)进行纯化。真空干燥后得到1.28g淡粉色产物(MW=80kDa,PDI 1.05)。
2)将得到的聚合物(400mg)和MA-GFLG-GEM(296mg,0.3mmol)加入25mL圆底烧瓶中,抽换氩气3次,冰浴下缓慢加入10mL含VA044(2.26mg,7μmol)的DMSO/H2O(2:1)混合溶剂。随后氩气鼓泡30分钟。通气结束后,将反应体系转移至46℃条件下避光搅拌28小时。液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮析出目标聚合物HPMA聚合物-吉西他滨偶联物(671mg;MW=90kDa,PDI 1.20)。
3)氩气氛下,将azido-HPMA-copolymers(450mg)、CuSO4·5H2O(23mg,0.09mmol)、alkynyl-Cy5.5(1mg)和抗坏血酸钠(36mg,0.18mmol)中加入20mL DMSO/H2O(1:1,v/v)。该体系避光搅拌6小时,并在空气中继续搅拌20分钟后使用透析袋(MW阈值为2kDa)在1mMEDTA-Na2水溶液中透析。透析后的溶液通过排阻色谱法分离,流动相为含30%乙腈的醋酸钠缓冲溶液(pH 6.5)。收集目标组分,避光条件下透析并冷冻干燥,得到最终产物嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物(425mg;MW 90Kda,PDI 1.15)。
聚合物MW和PDI由排阻色谱法测量,HPLC测得其载药量为4.3%,UV-vis测得其Cy5.5含量为0.52%。终产物能在磷酸缓冲液中(pH 7.4)自组装形成纳米粒子,并通过SEM和DLS来表征。
提高基于HPMA聚合物偶联物的纳米给药系统的抗肿瘤性能可以通过一定范围内(<300KDa)增加它们的MW和优化纳米尺寸,实现EPR效应的充分利用来达成。除此之外,生物安全性也依赖于MW,因为肾小球阈值约为50kDa。分子量约为100kDa的可生物降解嵌段HPMA聚合物-药物偶联物可以很好的兼顾这两个问题。基于此,本发明设计了一种两亲性嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物。首先,HPMA、叠氮修饰的功能化单体(azido monomer)、具有酶响应功能的短肽GFLG修饰的链转移剂CTA(CTA-GFLG-CTA)与链引发剂VA044通过RAFT聚合制备得到HPMA聚合物前体(80kDa,PDI 1.05),其末端均带有硫代苯甲酸酯基团。这一亲水性HPMA聚合物作为大分子链转移剂(macroCTA)来介导疏水单体MA-GFLG-GEM进行第二步聚合反应。得到的带有叠氮基功能基团的两亲性嵌段HPMA聚合物与炔基修饰的Cy5.5(alkyne-Cy5.5)通过点击反应用进行偶联。值得注意的是,所得产物需要通过加入适量EDTA透析来除去会造成毒性的微量铜。标记有Cy5.5的偶联物可以通过体积排阻色谱法及透析法纯化;与此同时,一些小分子,包括过量单体、Cy5.5和副产物也可以轻易地除去,从而获得具有可控PDI(PDI=1.1)的两亲性嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物(90kDa)。最终的嵌段偶联物骨架仅通过两步RAFT聚合获得,有望实现大规模目标产物合成。同时,GEM通过短肽GFLG偶联至聚合物载体,能在递送过程中保持稳定而不被代谢。
表1共聚物氨基酸含量,相关氨基酸含量通过重量百分比来表示
其中,聚合物之间的差异通过核磁谱图分析(图2)、氨基酸含量分析(表1)来确认。新的链转移剂CTA-GFLG-CTA的正确性及纯度通过1H NMR、13C NMR、HRMS及LC-MS来表征。各步聚合物MW和PDI由排阻色谱法测量,HPLC测得终产物载药量为4.3%,UV-vis测得其Cy5.5含量为0.52%。
实施例9
HPMA的合成
-5℃条件下,将甲基丙烯酰氯(14.53mL,0.15mol)溶于乙腈(60mL,含少量4-甲氧基苯酚阻聚剂)中,剧烈搅拌下缓慢滴加(超过30min)到异丙醇胺(24.35ml,0.316mol)的乙腈(90mL)溶液中。滴加完毕后,溶液在10~20℃条件下继续反应30min。反应结束后,过滤除去生成的固体副产物,并用20mL冰乙腈洗涤滤饼。滤液在27℃减压浓缩至约50mL,重结晶得到白色晶体状粗产物。收集粗产物并于丙酮中再次重结晶,过滤后真空干燥,得到白色晶体,产率67%。
实施例10
MA-CH2CH2-N3的合成
2-叠氮乙胺(NH2-CH2CH2-N3)按文献报道方法合成(J.Am.Chem.Soc.,2015,137(18),pp 6000–6010)。
室温下,向2-叠氮乙胺(8.6g,0.1mol)的二氯甲烷(100mL)溶液中,加入三乙胺(30.4g,0.3mol)和少量对甲氧基苯酚(100mg)。然后在冰浴下,慢慢滴加MACl(12.5g,0.12mol),温度维持在0~5℃。滴加完后,慢慢回到室温,反应5小时,点板确认反应完全,并有大量固体产生。过滤收集母液,蒸干,粗产品经柱层析分离,得到9.4g产品,收率61%。
实施例11
MA-GFLG-GEM偶联物的合成
参见发明专利CN201410568780.X。
本发明对Cy5.5标定的两亲性嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物给药系统进行实验检测:
统计学分析
实验组之间的差异通过Student’s t-test来评价其统计学意义,P值<0.05表明有统计学意义。
一、尺寸、形貌及Zeta电位
在PBS溶液中(pH=7.4),聚合物可自组装形成纳米级药物递送系统,DLS和SEM(图3A–B)证明其形成了纳米粒(~100nm)。自组装行为是由嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物自身介导的,其第一驱动力为亲水和疏水嵌段平衡引发的界面能最小化。同时,GFLG-GEM片段包含了多个不同的化学成分,其产生的π-π堆叠、偶极作用与氢键作用等作为次级驱动力也推动了自组装行为。本发明所构建的约为100nm的纳米体系可以利用EPR效应实现肿瘤部位的有效聚集,从而获得高效的抗肿瘤活性。
偶联物自组装形成的纳米体系的Zeta电位为-8mV(图3C),表明该体系在体内循环中可以保持稳定。其表面负电性是中性HPMA聚合物和负电性GFLG-GEM片段的综合作用结果。表面正电性的纳米粒在循环中会很快地被清除,而负电性和中性纳米给药系统可以有效减少或避免与血清蛋白的吸附作用及巨噬细胞的吞噬作用,这有助于延长循环时间和提高肿瘤部位聚集,达到更好的抗肿瘤效果。结果表明,这一可自组装、表面带负电荷且粒径约为100nm的聚合物纳米粒有望成为有效的药物递送系统。
二、体外释放及降解实验
在pH 5.4,37℃木瓜蛋白酶存在(木瓜蛋白酶可用于模拟组织蛋白酶B作用)的缓冲液条件下孵育偶联物形成的纳米粒子,并在预先设定好的时间(0.5h、1h、2h、3h、5h、8h、12h、24h、36h)通过RP-HPLC检测药物释放量。同时,通过在pH=7.4和pH=5.4且不含酶的条件下孵育偶联物来分别模拟血液循环环境及进一步验证系统的酶响应性。
为了考察聚合物降解情况,37℃条件下,将GEM偶联物(6mg)与含木瓜蛋白酶(2.4μM)的McIlvaine's缓冲液(1mL,50mM柠檬酸盐/0.1M磷酸盐,2mM EDTA,pH 5.4)共同孵育6小时。取出降解后的溶液并通过SEC进行分析,考察高分子量HPMA载体是否可以降解为小分子片段。
如图4A所示,纳米载药装置可以快速、有效地释放药物。在模拟肿瘤细胞条件下孵育0.5小时后,约80%的药物从载体上释放下来。3小时后,几乎100%的药物实现释放。这表明,一旦肿瘤细胞摄取了载药系统后,快速释放的药物就可以发挥作用,有效地杀死肿瘤细胞。然而,如果药物提前释放会对正常组织器官造成毒性。图4A表明,pH 7.4和pH 5.4无酶条件下,GEM从载体中释放较慢,36小时内,分别仅为约21%和9%。因此,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子对木瓜蛋白酶有高度特异性,且在生理pH 7.4条件稳定。以上数据表明,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子能具有作为酶响应性药物递送系统的潜力。
接下来,本发明通过将分子量为90kDa的聚合物在37℃、pH 6.0且含有木瓜蛋白酶的条件下孵育,并以此来评价其降解能力。孵育6小时后,嵌段聚合物可降解为小分子片段(46kDa,图4B),该小分子的分子量低于肾排泄阈值(MW<50kDa)。这一结果表明基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子的可生物降解性,这也保证了在其递送作用完成后能够安全排出体外,达到良好的生物相容性。
三、细胞系、细胞培养及实验动物
在本实验中所使用的4T1细胞系和3T3细胞系均从中科院细胞库(中国,上海)购买获得。4T1细胞系利用含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素/链霉素)的RPMI 1640培养基培养,3T3细胞系则利用含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养基培养;整个实验实验过程中,细胞均在潮湿的含5%CO2/95%空气的培养箱中培养。
关于动物实验,选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(体重约为20±2g)作为模型。将从成都达硕生物科技公司购买的小鼠随机分配,并喂养在恒温以及有规律模拟昼夜的无菌室中。在经过一周以上的适应期后,严格按照国家相关政策与法规以及动物伦理委员会的相关规定对小鼠进行试验。
3.1相关细胞实验
1、体外毒性试验评价:将4T1细胞悬液按密度5×103cells/well接种于96孔板上。孵育24小时后弃去培养基,分别加入一系列含有不同浓度的材料和自由药GEM培养基,每组浓度设置5个平行样,另取5个不含细胞的孔加入等体积培养基作为空白对照组。孵育36小时后,移去培养基并用PBS洗涤三次,加入含10%CCK-8的无血清RPMI 1640培养基(100μL/孔)并孵育3小时。利用酶标仪(Thermo Fisher SCIENTIFIC)测定每个孔在450nm处的吸光度,计算细胞存活率。半数抑制浓度(IC50)通过Graphpad Prism 5软件拟合计算得到。体外安全性实验通过空白材料分别与3T3和4T1细胞按毒性试验评价相同方法进行。
2、细胞吞噬试验:由于材料连接了近红外荧光染料Cy5.5,其在4T1细胞系中的入胞情况可以通过激光共聚焦显微镜(CLSM,Leica TCP SP5)来进行观测。将4T1细胞悬液(1×104cells/mL)接种于35×12mm的玻底皿中,孵育24小时后将细胞的培养基更换成含有特定浓度的聚合物的RPMI 1640培养基,继续在培养箱中孵育。在特定的时间点取出相应的玻底皿,移去培养基,用PBS溶液清洗三次后,利用LysoTracker染色45分钟。移去染色试剂,并用PBS清洗3次后采用CLSM观察拍照。
3、细胞凋亡实验:将4T1细胞种在6孔板中,每孔密度为1.5×105,孵育24小时使其贴壁。清洗干净后,以PBS作为对照组,将细胞与自由GEM及材料(0.4μg/mL GEM)共孵育24h。收集细胞,用Annexin V-FITC凋亡测试盒按说明书处理后经细胞流式仪检测,结果通过WinMDI 2.9软件处理。
GEM和负载GEM的纳米系统抑制4T1乳腺癌肿瘤细胞的能力通过体外CCK-8试验进行研究。肿瘤细胞与一系列浓度的自由药和载药系统作用48小时,细胞存活率(图5A)表明,纳米载药系统具有潜在的细胞生长抑制能力(IC50=0.86μg/mL),是自由药GEM(0.31μg/mL)的2.77倍。这是由于自由药通过自由扩散进入细胞,能够很快地在作用部位发挥作用;而偶联物形成的纳米粒子作为大分子需要内吞作用进入细胞,并在溶酶体内释放药物,药物进入细胞核内发挥作用,孵育同等时间下发挥作用的药物剂量相对较低。因为药物在富含组织蛋白酶B的条件下能够很快释放,一旦纳米体系进入细胞,药物可以很快地发挥作用,诱导4T1肿瘤细胞凋亡。因此,当药物通过酶敏感键GFLG偶联至聚合物载体时,其抗肿瘤活性能够得以有效保持,且不负载药物的聚合物在研究浓度范围内(5-313μg/mL)对4T1肿瘤细胞和3T3小鼠成纤维细胞均无明显毒性(图5B和C),表明HPMA聚合物本身是安全、有效的,且载药系统对肿瘤细胞的杀伤作用是释放后的抗肿瘤药物造成的。共聚焦结果显示,纳米粒子能够入胞并进一步发挥作用。凋亡结果也表明纳米粒子与自由药物吉西他滨类似,能够有效诱导凋亡。
3.2、离体荧光成像实验
采用Maestro in vivo imaging system(CRi,U.S.)对BALB/c荷瘤小鼠进行主要脏器和肿瘤的离体荧光成像实验,评价嵌段HPMA聚合物-吉西他滨偶联物纳米给药系统在体内的分布情况。将荷瘤小鼠随机分为2组,每组7只,分别通过尾静脉注入200μL生理盐水或纳米给药系统的生理盐水溶液(1.0nmol Cy5.5/荷瘤小鼠)。注射后6h、12h、18h和36h,将小鼠肿瘤及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)剖离,用于荧光成像。
为了评价基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子的体内分布情况,采用非入侵性近红外荧光成像技术进行研究。图6A-D展示了一系列(注射后6小时,12小时,18小时和36小时)4T1荷瘤雌性小鼠的离体主要器官和肿瘤的成像情况;图6E为半定量数据分析。研究过程中,生理盐水组的主要器官和肿瘤均无荧光信号,而纳米载药系统组的信号主要集中在肾脏、肝脏和肿瘤。注射12小时后肿瘤部位信号最强。18小时后仍有中等强度信号。除此之外,直到36小时,纳米载药系统组仍有较强的信号强度,表明HPMA聚合物-吉西他滨偶联物纳米给药系统可以在肿瘤部位聚集并滞留,有助于实现更好的抗肿瘤效果。其他脏器的荧光信号可能是纳米载药系统的体内循环动力学行为所产生的。因此,纳米载药系统可以通过EPR效应在肿瘤部位快速聚集,并长时间持续以到达抑制肿瘤生长的效果。
3.3、体内抗肿瘤实验
利用异种移植的雌性BALB/c小鼠4T1肿瘤模型来研究聚合物的体内抗肿瘤效果。收集4T1细胞,将每5×105个细胞悬浮于80μL PBS中并通过皮下注射在每只小鼠相同的部位。经过1到2周后,在小鼠该部位生成实体瘤并达到约50-100mm3的体积。肿瘤体积按照如下公式计算:肿瘤体积V(mm3)=1/2×长(mm)×宽(mm)×宽(mm)。将小鼠按照每组7只随机分配成三组并进行标记,然后通过尾静脉注射向小鼠注射200μL不同组分的药剂,分别是GEM、聚合物纳米粒子以及作为对照组的生理盐水,其中注射给药量均为5mg/kg GEM,每六天注射一次共3次。每两天检测一次小鼠的肿瘤体重与体重,并将第一天测定的肿瘤体积与小鼠体重分别设定为100%。在治疗的第21天,对所有小鼠实施安乐死,将肿瘤剥离并称重,然后按照抑瘤率公式计算抑瘤率(TGI)。抑瘤率计算公式:TGI=(1-(治疗组平均瘤重)/(对照组平均瘤重))×100%。通过肿瘤组织的免疫组化分析进一步的研究肿瘤的新生血管、增殖与细胞凋亡情况。心肝脾肺肾等组织器官也被分离并固定然后用与组织学检测分析。
图7通过相对肿瘤体积变化曲线(A)、肿瘤重量(B)、抑瘤率(C)及体重变化情况(D)表明了纳米粒子的抗肿瘤效果及其生物安全性。GEM有一个次优的抗肿瘤效果(图7A),而纳米载药体系组则显著抑制了肿瘤的生长。21天实验结束时,相比于使用自由药GEM的治疗方案,HPMA聚合物-吉西他滨偶联物纳米给药系统有更为明显的抗肿瘤效果,表现出显著性差异(图7A,p<0.0001相比于生理盐水;p<0.001相比于自由药GEM)。相比于自由药GEM,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子抗肿瘤效果明显增强,这可能归因于其表面负电荷(图3C),适当的纳米尺寸(图3A-B),体内循环中的稳定性(图4A),EPR效应所致的肿瘤部位聚集和长时间滞留(图6)、快速地肿瘤细胞溶酶体内释放(图5)以及GEM未发挥作用前代谢程度的降低。
以上数据均表明该纳米给药系统是可生物降解和刺激响应性的,并能有效发挥抗肿瘤效果。对比生理盐水组和GEM组,治疗结束时纳米载药系统组小鼠体重并没有减轻。值得注意的是,只有纳米载药组在每次给药后体重会有所下降,但之后通常很快就会恢复,这一点差异可能是由于自由药GEM在循环中会转换为非活性代谢产物,从而实际作用的GEM浓度降低所致。
四、组织学分析与免疫组化分析
将固定后的组织用自来水冲洗过夜,然后用全自动脱水机各级乙醇脱水、二甲苯透明、两次浸蜡。使用包埋机进行常规石蜡包埋,轮转式切片机将石蜡块切成5μm的石蜡片用于苏木精-伊红(H&E)染色。最后镜检,将所用标本照像。
Ki-67、CD31蛋白基因表达检测过程如下:1)载玻片防脱片处理;2)切片常规脱蜡;3)室温灭活内源性过氧化物酶;4)热修复抗原;5)滴加山羊血清封闭液;6)滴加稀释的一抗;7)滴加生物素化山羊抗鼠/兔IgG二抗;8)滴加辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白试剂;9)DAB显色;10)苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。
TUNEL检测过程如下:1)载玻片防脱片处理;2)切片常规脱蜡;3)胰蛋白酶K工作液处理组织,并用PBS漂洗;4)制备TUNEL反应混合液,并将该反应液滴于标本上,加盖玻片于暗湿盒中反应后用PBS漂洗;5)玻片干后加3号液于标本上,加封口膜于暗湿盒中反应后用PBS漂洗;6)加DAB显色剂作用后用PBS漂洗,苏木素轻度复染,冲洗、脱水、透明、封片。
为了研究抗肿瘤活性和基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子的肿瘤抑制机制,所有治疗小鼠在21天后,将主要器官(心、肝、脾、肺、肾)及肿瘤剥离并固定于4%多聚甲醛固定液中,分别进行H&E组织病理学检测与Ki-67、CD-31和TUNEL免疫组化分析。H&E染色切片分析(图8)显示生理盐水组和自由药GEM组在肝脏血管周围存在肿瘤细胞的弥散性转移区域,表明肝脏有多焦点转移病灶。相反,纳米给药系统治疗组并没有出明显的转移病灶。同时,在生理盐水组和自由药GEM组的肺部也观察到明显的转移现象,纳米给药体系组依然没有明显的转移区域。
因此,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子能够有效抑制肿瘤转移。除此之外,H&E切片分析还显示对于主要器官来说,聚合物载药系统组并没有明显的组织或细胞损伤(例如变性和坏死),进一步表明该递送系统具有良好的生物安全性。
对于实体瘤来说,其生长、侵润、转移过程都伴随着血管新生。将治疗小鼠的肿瘤剥离,通过IHC研究其抗肿瘤效果,采用CD31作为血管标记物标记血管内皮细胞,以肿瘤血管密度(MVD)来反映治疗效果。图8表明,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子治疗组的平均MVD明显低于对照生理盐水组(p<0.001)和GEM治疗组(p<0.05),表明纳米载药体系治疗组肿瘤部位存在更少的血管新生现象。因此,聚合物纳米载药系统可以抑制血管新生,具有抗肿瘤活性并且可以抑制肿瘤生长。这也与肿瘤生长抑制(TGI)结果一致。
Ki-67(细胞核蛋白),作为一种肿瘤细胞增殖标记物被用来标记细胞增殖周期G1,G2和S期的增值细胞。在本研究中,与体内抗肿瘤实验结果一致,在基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子治疗组中,表达Ki-67的肿瘤细胞有着非常显著的减少(p<0.0001;图9B4),表明相比于自由药GEM,聚合物纳米载药治疗组的肿瘤细胞增值活性更低,反映出纳米粒子具有更好的抗肿瘤活性,这也与增强的TGI效果一致。
为了验证治疗组是否会诱导肿瘤细胞凋亡,本发明还进行了TUNEL试验。图9C1-C4表明,聚合物纳米载药治疗组可诱导最大程度的凋亡,实现约83%的细胞凋亡(p<0.0001相比于对照生理盐水组,p<0.01相比于GEM治疗组),对照生理盐水组和GEM治疗组肿瘤分别仅达到了约12%和57%的细胞凋亡率。因此,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子可以更加有效地诱导肿瘤细胞凋亡。
这些结果表明,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子可以有效地抑制肿瘤部位血管新生和肿瘤细胞增殖,显著的诱导肿瘤细胞凋亡,从而提高抗肿瘤效果。在其作用过程中,表面呈负电性的偶联物系统相比于自由药GEM可以减少血浆清除率;同时,两亲性嵌段聚合物可以自组装形成纳米尺寸的结构,实现长循环和高的肿瘤被动靶向作用。其次,药物通过肿瘤细胞溶酶体中过表达的组织蛋白酶B的作用底物GFLG四肽序列偶联至聚合物骨架,共价键的存在保证了小分子药物在递送过程中能够稳定存在。与此同时,肿瘤部位长时间滞留和快速地细胞内药物释放提高了抗肿瘤活性。此外,嵌段聚合物可以降解为小分子片段(MW<50kDa)并被体内安全清除。以上所述的因素均有助于基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子兼具优异的抗肿瘤效应与良好的生物安全性。
综上所述,本发明设计、合成并表征了一种基于两亲性嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子,并将其作为分子量较高的可生物降解的纳米给药系统应用于治疗乳腺癌:
(1)DLS和SEM研究结果指出该体系可以依靠HPMA共聚物-GEM偶联物自身两亲性特征及其他非共价驱动力自组装形成表面带负电且结构规整、粒径大小合适的纳米粒。
(2)与木瓜蛋白酶缓冲液共孵育的体外药物释放及降解研究指出,这一分子量较高的偶联物可以在酶作用下降解为分子量较低的产物(MW<50kDa),经由肾脏清除从而保证生物安全性;GEM通过酶敏感键GFLG偶联至HPMA聚合物可以保证循环体系中的稳定性,而在肿瘤细胞富含组织蛋白酶B的条件下迅速释放药物,有效优化了抗肿瘤药物吉西他滨的提前释放和代谢失活问题,提高了实际作用于肿瘤部位的药物浓度。
(3)体外细胞实验发现,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子可以在细胞内吞后有效抑制4T1乳腺癌细胞的生长,其半数抑制浓度IC50是自由药GEM的约2.77倍,一旦该纳米载药系统达到肿瘤部位,即可快速释放药物发挥抗肿瘤效果,且通过GFLG链接至HPMA聚合物并不会影响药物的效果。载体本身对4T1乳腺癌细胞和3T3小鼠成纤维细胞的体外毒性实验的结果进一步证明,HPMA载体材料本身并没有明显的细胞毒性,抗肿瘤效果是释放的抗肿瘤药物所发挥的作用。凋亡结果也表明这一载药系统有着和自由药物类似的诱导凋亡能力。
(4)观察体内分布情况发现,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子可以在肿瘤部位聚集并滞留;甚至到36小时后,仍然可在肿瘤部位观察到明显的荧光信号,表明该纳米给药系统能在肿瘤部位长效聚集,有助于提升抗肿瘤活性。
(5)荷瘤小鼠治疗过程的相对肿瘤体积变化情况、体重变化曲线以及治疗结束后的肿瘤重量和抑瘤率数据均说明,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子相比于saline和GEM对照组来说,具有更好的体内抗肿瘤效果。nanoparticles治疗组小鼠肿瘤生长受到明显抑制,治疗后肿瘤重量与saline和GEM治疗组也具有统计学显著性差异;相比于GEM组30%的抑瘤率,nanoparticles治疗组的抑瘤率提高到了约60%。组织切片分析表明基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子具有抑制肿瘤肝脏和肺部部分转移的能力;同时不会对主要脏器造成明显的损伤。免疫组织化研究结果与体内抗肿瘤结果一致,nanoparticles治疗组可明显抑制肿瘤部位血管新生和肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。因此,基于嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的纳米粒子不仅具有良好的抗肿瘤效果,而且具有较好的生物安全性,在乳腺癌治疗应用中具有广阔的前景。
本发明的主要试剂如下:
试剂N,N-二甲基甲酰胺加入无水CaH2干燥24h后,重蒸,减压收集中间馏分。二氯甲烷加入氢化钙过夜,常压蒸馏,弃去前馏分,收集中间馏分,密封置干燥器暂时保存。现蒸现用,存储不超2周。
其他试剂未特别说明时为分析纯,未进一步纯化处理,直接使用。
本发明的主要仪器如下:
磁力加热搅拌器(德国IKA公司)
BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)
真空干燥箱(上海一恒科技有限公司,DZF-6050型)
电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司,DHG-9140型)
离心机5418(Eppendorfa公司)
排阻色谱(GE Healthcare公司)
高分辨超导核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司,BrukerAV II-400MHz)
液相色谱质谱联用仪(美国ABI公司,API3000LC-MS/MS)
质谱仪(瑞士Bruker公司,Bruker Daltonics Bio TOF mass spectrometer)
Lambda650紫外光谱仪(美国Perkin-Elmer)
纳米粒度及电位分析仪(英国Malvern公司,DTS software version 3.32)
高效液相色谱仪(美国Agilent,1260LC,Zorbax C8column4.6×150mm)
激光共聚焦显微镜(德国Leica,TCS SP5)
pH计FE20(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)
小动物活体成像系统(美国CRI公司)
流式细胞仪(BD公司)
Claims (9)
1.肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统,其特征在于,该给药系统为HPMA聚合物、组织蛋白酶B底物GFLG和小分子药物吉西他滨的偶联物,具体结构如下:
其中:m=0-4;
n=270-320;
o=5-12;
2.根据权利要求1所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统,其特征在于,该给药系统的平均分子量为80-110kDa。
3.根据权利要求1所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,当m=0时,包括以下步骤:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
1)氮气氛下,Boc-GFLG-OH、HBTU和HOBt溶解于DMF,0℃下搅拌10分钟后加入DIPEA,所得体系在0℃下再反应30分钟后加入N-Boc-乙二胺,室温反应得Boc-GFLG-NHBoc;
2)冰浴下将Boc-GFLG-NHBoc溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液,室温反应脱去Boc保护基团,将乙醚中所得的沉淀物于氮气氛下溶于DMF,0℃加入DIPEA,得A体系;将4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和HATU溶于DMF,并加入至A体系中,反应得CTA-GFLG-CTA;
B、两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的合成
1)分别称取HPMA和CTA-GFLG-CTA并加入密闭体系,抽换氩气后,加入含有VA044的去离子水和甲醇的混合溶液,冰浴下鼓氩气30分钟,再将该体系密闭避光反应;液氮淬灭反应,将反应液滴加至丙酮中,HPMA共聚物以沉淀形式析出,并通过二次沉淀纯化;
2)将得到的HPMA共聚物和MA-GFLG-GEM加入密闭体系,抽换氩气后,冰浴下加入含VA044的DMSO/H2O混合溶剂,随后鼓氩气30分钟后避光反应;液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮,析出目标产物HPMA共聚物-GEM偶联物。
4.根据权利要求1所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,当m不为0时,包括以下步骤:
A、功能化链转移剂CTA-GFLG-CTA的合成
1)氮气氛下,Boc-GFLG-OH、HBTU和HOBt溶解于DMF,0℃下搅拌10分钟后加入DIPEA,所得体系在0℃下再反应30分钟后加入N-Boc-乙二胺,室温反应得Boc-GFLG-NHBoc;
2)冰浴下将Boc-GFLG-NHBoc溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合液,室温反应脱去Boc保护基团,将乙醚中所得的沉淀物于氮气氛下溶于DMF,0℃加入DIPEA,得A体系;将4-氰基戊酸二硫代苯甲酸和HATU溶于DMF,并加入至A体系中,反应得CTA-GFLG-CTA;
B、两亲性可降解嵌段HPMA共聚物-GEM偶联物的合成
1)分别称取HPMA、MA-CH2CH2-N3和CTA-GFLG-CTA并加入密闭体系,抽换氩气后,加入含有VA044的去离子水和甲醇的混合溶液,冰浴下鼓氩气30分钟,再将该体系密闭避光反应;液氮淬灭反应,将反应液滴加至丙酮中,HPMA共聚物以沉淀形式析出,并通过二次沉淀纯化;
2)将得到的HPMA共聚物和MA-GFLG-GEM加入密闭体系,抽换氩气后,冰浴下加入含VA044的DMSO/H2O混合溶剂,随后鼓氩气30分钟后避光反应;液氮淬灭反应,将反应液加入丙酮,析出HPMA共聚物-GEM偶联物;
如果要引入Cy5.5,继续以下步骤:
3)氩气氛下,将带有叠氮基团的HPMA共聚物-GEM偶联物、五水硫酸铜、炔基修饰的Cy5.5和抗坏血酸钠加入DMSO/H2O混合溶液中避光反应,得到终产物。
5.根据权利要求3或者4所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,去离子水与甲醇以4:1的体积比混合得到B步骤1)中的混合溶液。
6.根据权利要求5所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,所述混合溶液中含11μmol/L的引发剂VA044。
7.根据权利要求3或者4所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,所述B步骤2)中DMSO与H2O以2:1的体积比混合得到所述混合溶剂。
8.根据权利要求4所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,所述B步骤3)中DMSO与H2O以1:1的体积比混合得到所述混合溶剂。
9.根据权利要求7所述肿瘤微环境刺激可降解的两亲性嵌段HPMA聚合物给药系统的制备方法,其特征在于,所述混合溶剂中含7μmol/L的引发剂VA044。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102264396A (zh) * | 2008-10-07 | 2011-11-30 | 瑞沙恩医药公司 | Hpma-多西他赛或吉西他滨缀合物及其用途 |
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CN102264396A (zh) * | 2008-10-07 | 2011-11-30 | 瑞沙恩医药公司 | Hpma-多西他赛或吉西他滨缀合物及其用途 |
CN102686243A (zh) * | 2009-10-13 | 2012-09-19 | 瑞沙恩医药公司 | 用于抗癌剂递送的聚合物系统 |
WO2011112482A2 (en) * | 2010-03-08 | 2011-09-15 | University Of Utah Research Foundation | Polymeric drug delivery conjugates and methods of making and using thereof |
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Non-Patent Citations (2)
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Biodegradable multiblock poly(N-2-hydroxyopropyl)methacrylamide gemcitabine and paclitaxel conjugates for ovarian cancer cell combination treatment;Nate Larson,et al.;《International Journal of Pharmaceutics》;20130701;第454卷;435-443 |
Simultaneous delivery of doxorubicin and gemcitabine to tumors in vivo using prototypic polymeric drug carriers;Twan Lammers,et al.;《Biomaterials》;20091231;第30卷;3466-3475 |
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