CN105451743A - 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物 - Google Patents

用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN105451743A
CN105451743A CN201480044362.9A CN201480044362A CN105451743A CN 105451743 A CN105451743 A CN 105451743A CN 201480044362 A CN201480044362 A CN 201480044362A CN 105451743 A CN105451743 A CN 105451743A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymer
peg
rgd
polyamines
amine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480044362.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105451743B (zh
Inventor
承为军
S·黄
A·M·埃尔米达
D·B·罗泽玛
A·V·布罗金
J·C·卡尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Arrowhead Research Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arrowhead Research Corp filed Critical Arrowhead Research Corp
Publication of CN105451743A publication Critical patent/CN105451743A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105451743B publication Critical patent/CN105451743B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3535—Nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)

Abstract

本发明关于用于在活体中递送RNA干扰(RNAi)触发子至整联蛋白阳性肿瘤细胞的组合物。该组合物包含RGD配体靶向的经酶可裂解的二肽-酰胺基苄基-碳酸酯掩蔽剂可逆修饰的两亲性膜活性多胺。修饰掩蔽该聚合物的膜活性，同时可逆性提供生理反应性。该可逆修饰的多胺(动力学聚偶联物或偶联物)进一步共价连接至RNAi触发子。

Description

用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物
背景技术
细胞的复杂膜系统高度限制RNAi触发子及其他实质上细胞膜不可渗透化合物至活细胞中的递送。反义RNAi及基因疗法中所用的药物是相对较大的亲水性聚合物且通常高度带负电。该两种物理特性严重限制其横跨细胞膜的直接扩散。出于此原因，RNAi触发子递送的主要障碍是RNAi触发子横跨细胞膜递送至细胞胞质或核。
已研发多种转染试剂，其实现在活体外相当有效地递送多核苷酸至细胞。然而，使用该相同转染试剂在活体中递送多核苷酸是复杂的且因活体中毒性、不利血清相互作用及较差靶向使得无效。在活体外充分工作的转染试剂、阳离子聚合物及脂质通常形成大的阳离子静电粒子且使细胞膜去稳定。活体外转染试剂的正电荷通过电荷-电荷(静电)相互作用有利于与核酸缔合，由此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷亦有益于载剂非特异性结合至细胞及膜融合、去稳定或破坏。膜的去稳定有利于实质上细胞膜不可渗透多核苷酸横跨细胞膜递送。尽管该性质有利于在活体外核酸转移，但其在活体中引起毒性及无效靶向。阳离子电荷引起与血清组分相互作用，其引起多核苷酸-转染试剂相互作用去稳定、较差生物利用度及较差靶向。可在活体外有效的转染试剂的膜活性经常在活体中导致毒性。
对于活体中递送，载剂(核酸及相关递送试剂)应较小，直径小于100nm且优选小于50nm。甚至仍可用更小复合物，小于20nm或小于10nm。大于100nm的递送载剂在活体中至除血管细胞外的细胞的通路极少。通过静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓缩物或血清组分时往往聚集或分开。此外，活体中递送载剂上的阳离子电荷导致不利血清相互作用及因此较差生物利用度。有趣的是，高负电荷亦可因干扰靶向所需的相互作用、即靶向配体结合至细胞受体而抑制靶向活体中递送。因此，活体中分布及靶向期望几乎中性的载剂。在未小心调控情况下，在活体中使用时，膜破坏或去稳定活性是有毒的。利用核酸递送平衡载剂毒性在活体外较在活体中更易于实现。
Rozema等人(美国专利公开20080152661、20110207799、20120165393及20120172412)研发适于在活体中递送多核苷酸的偶联物。该偶联物的特征在于使用可逆的生理上不稳定的掩蔽可逆调控膜活性多胺的膜破坏活性。使用不带电半乳糖或胆固醇作为靶向配体，Rozema等人已显示使用该偶联物在活体中递送多核苷酸至肝细胞。使该偶联物适于将RNAi触发子靶向癌细胞可提供对抗癌症的另一治疗法。
整联蛋白是一组介导细胞黏附的细胞表面糖蛋白。整联蛋白是由α及β多肽亚单元构成的异源二聚体。目前，已鉴别11个不同α亚单元及6个不同β亚单元。各个α亚单元与各个β亚单元组合以形成不同整联蛋白。已显示αvβ3整联蛋白(玻连蛋白受体)在肿瘤转移、实体瘤生长(赘瘤形成)及肿瘤血管发生中起作用。整联蛋白αvβ3在血管发生中起重要作用。其在肿瘤内皮细胞上以及在一些肿瘤细胞上表现。Seftor等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.89(1992)1557-1561)(例如)已显示αvβ3整联蛋白在黑色素瘤细胞侵袭中的作用。Brooks等人(Cell,第79卷(1994)1157-1164)证实全身性投与αvβ3拮抗剂引起各种组织学不同的人类肿瘤明显消退。
整联蛋白αvβ3的肿瘤细胞表现与各种肿瘤类型中的疾病进展相关。αvβ3整联蛋白在人类肿瘤活检试样的血管上而非正常组织中的血管上广泛表现。在乳癌中，αvβ3整联蛋白的过表现与骨转移相关且因应骨桥蛋白诱导增加的肿瘤生长及侵袭。在胶质母细胞瘤中，αvβ3整联蛋白在肿瘤的侵袭缘处过表现且纤连蛋白的含量增加，此与增强的细胞运动性及细胞凋亡抗性相关。在胰脏肿瘤中，αvβ3整联蛋白的增加表现与MMP-2的增加活化及淋巴结转移相关。在前列腺癌细胞中，由于整联蛋白与附接及迁移过程之间的关联，αvβ3整联蛋白的表现引起转移至骨，该过程涉及层黏连蛋白、纤连蛋白及骨桥蛋白。
αvβ3整联蛋白结合至多种含有Arg-Gly-Asp(RGD)的基质大分子。RGD肽序列连接至各种其他化合物以提供αvβ3整联蛋白结合。因此，已检查RGD肽用于将化合物靶向αvβ3整联蛋白阳性肿瘤。然而，许多RGD肽除对RGD依赖性整联蛋白的亲和力相对较低外亦相对无选择性。举例而言，结合至αvβ3的大部分RGD肽亦结合至αvβ5、αvβ1及αIIbβ3整联蛋白。
发明内容
阐述用于在活体中递送RNAi触发子至哺乳动物的肿瘤细胞的组合物，其包含：共价连接至RNAi触发子的整联蛋白靶向的可逆掩蔽的膜活性多胺。所述组合物递送RNAi触发子至肿瘤细胞，其中RNAi触发子与细胞的内源RNA干扰途径相互作用以抑制靶基因的表现。
本发明的特征在于用于在活体中递送RNA干扰(RNAi)触发子至肿瘤细胞的组合物，其包含：经掩蔽的两亲性膜活性多胺(递送聚合物)及RNAi触发子，其中RNAi触发子共价连接至递送聚合物。递送聚合物包含通过用一种或多种RGD二肽掩蔽剂及视情况的一种或多种PEG二肽掩蔽剂可逆修饰聚合物胺使得至少50％或至少80％聚合物胺经修饰而掩蔽的两亲性膜活性多胺。递送聚合物与RNAi触发子的共价附接的优选键是在生理上不稳定的连接。在一个实施方式中，此键垂直于二肽掩蔽剂键。向哺乳动物给予医药上可接受的载剂或稀释剂中的递送偶联物。
在优选实施方式中，阐述包含共价连接至以下的两亲性膜活性多胺的组合物：a)通过二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯可逆生理上不稳定的键共价连接至复数个RGD配体及空间稳定剂；及b)通过一个或多个不稳定共价键共价连接至一个或多个RNAi触发子。在一个实施方式中，二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯垂直于不稳定共价键。向哺乳动物给予医药上可接受的载剂或稀释剂中的RNAi触发子-聚合物偶联物。
在优选实施方式中，可逆掩蔽的膜活性多胺(递送聚合物)包含：通过多胺的胺与RGD掩蔽剂及空间稳定剂掩蔽剂反应可逆修饰的两亲性膜活性多胺。聚合物胺与掩蔽剂的反应可逆修饰胺以形成可逆的生理上不稳定的共价键。若修饰基团的裂解储存胺，则胺经可逆修饰。膜活性多胺的可逆修饰可逆抑制膜活性多胺的膜活性、抑制多胺与血清组分的相互作用，从而提供增加的循环性质，并在活体中将多胺靶向肿瘤细胞。在掩蔽状态中，经可逆掩蔽的膜活性多胺不呈现膜破坏性活性。膜活性多胺的膜活性抑制和/或活体中靶向需要修饰>50％聚合物胺。可需要用掩蔽剂可逆修饰超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％或超过90％多胺上的胺以形成最佳递送聚合物。
本发明的递送聚合物的经修饰聚合物胺是由以下表示：
多胺
其中R4包含RGD配体或空间稳定剂且R1及R2是氨基酸侧链。R1优选是疏水性氨基酸的侧基。优选疏水性氨基酸是丙胺酸。于中性pH下，R2优选是亲水性不带电氨基酸的侧链。优选亲水性不带电氨基酸是瓜胺酸。活体内在二肽之后在氨基酸与酰胺基苄基之间酶裂解自聚合物移除R4且起始消除反应，在该消除反应中酰胺基苄基-胺基甲酸酯经历自发重排而引起聚合物胺再生。
递送聚合物进一步共价连接至RNAi触发子。在一个实施方式中，RNAi触发子通过生理上不稳定的键连接至递送聚合物。在优选实施方式中，连接RNAi触发子至递送聚合物的不稳定键垂直于连接掩蔽剂至多胺的不稳定键。因此，本发明的偶联物包含：RNAi触发子，其共价连接至具有由以下表示的一般形式的可逆经修饰的两亲性膜活性多胺：
(式1)，
其中N包含RNAi触发子，L2是可逆的生理上不稳定的键，例如A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯，P包含两亲性膜活性多胺，R包含RGD配体，各自是如本文中所定义，PEG包含聚乙二醇或其他空间稳定剂，L1是生理上不稳定的连接体，y是大于0的整数且z是大于零(0)的整数，其中y及z的和的值大于多胺P上存在的胺的数目(如测定为未经修饰的膜活性多胺中的胺的数目)的50％。
本发明的化合物通常可使用有机或医药化学领域技术人员已知的方法获得。在结合附图采用时，自以下详细说明将明了本发明的其他目标、特征及优势。
在优选实施方式中，聚合物修饰-L2-R及-L2-PEG具有一般形式：
R-A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-(式2a)
且
PEG-A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-(式2b)。
其中A1A2是二肽，A1是氨基酸，且A2是氨基酸。RGD配体可通过连接体(例如PEG连接体)连接至二肽。优选空间稳定剂是聚乙二醇(PEG)。A1优选是疏水性氨基酸。A2优选是亲水性不带电氨基酸。A1及A2优选通过酰胺键连接。优选酰胺基苄基是对-酰胺基苄基。胺基甲酸酯通过碳酸酯与聚合物胺反应形成。优选碳酸酯是活化胺反应性碳酸酯。A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯键稳定直至二肽通过内源蛋白酶在活体中裂解，由此自多胺裂解空间稳定剂或RGD配体。在二肽之后(在A2与酰胺基苄基之间)酶裂解后，酰胺基苄基-胺基甲酸酯经历自发重排而引起聚合物胺再生。
在一个实施方式中，使用有助于RGD配体附接至二肽及掩蔽剂的溶解性的连接体将RGD配体连接至二肽。优选掩蔽剂具有一般形式：RGD配体-PEG1-二芳基腙-PEG2-二肽-酰胺基苄基-碳酸酯。每一组分皆可使用本领域标准方法(例如酰胺键的形成)连接。二芳基腙可通过HyNic(肼基-烟酰胺)基团与芳基醛反应形成。PEG1包含(CH2-CH2-O)n且PEG2包含(CH2-CH2-O)n。n及m独立地是大于或等于4的整数且n+m的和是12至48。PEG基团有助于RGD配体的溶解及呈递，从而改良经修饰多胺的肿瘤靶向。惊人地，二芳基腙亦改良经修饰多胺的活体中功能。在一个实施方式中，首先使芳基醛-PEG2-二肽-酰胺基苄基-碳酸酯与多胺反应以形成芳基醛-PEG2-二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺。随后使此化合物与RGD配体-PEG1-HyNic反应以形成：RGD配体-PEG1-二芳基腙-PEG2-二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺。
附图说明
图1.显示(A)二肽掩蔽剂或(B)连接至多胺的二肽掩蔽剂的结构的图解说明：R1及R2是氨基酸的R基团，R4包含RGD配体或空间稳定剂，-X-是-NH-、-O-或-CH2-，-Y-是-NH-或-O-，-R5是在2、4或6位处且是-CH2-O-C(O)-O-Z，其中Z是碳酸酯，且-R6在2、3、4、5或6位的每一者处独立地是氢、烷基或卤化物，由R5占据的位置除外。
图2.显示各种PEG二肽掩蔽剂的结构的图解说明：(A)PEG-GlyGly-PABC-PNP、(B)PEG-AsnGly-PABC-PNP、(C)PEG-PheLys-PABC-PNP、(D)PEG-ValCit-PABC-PNP、(E)PEG-AlaAsn-PABC-PNP及(F)PEG-PheLys(CH3)2-PABC-PNP。
图3.显示使用二肽掩蔽剂可逆修饰多胺的图解说明：R包含RGD配体或PEG，AA是二肽(具有或无保护基团)，R3是胺反应性碳酸酯，且多胺是两亲性膜活性多胺。
图4.显示消除反应的图解说明，其中酰胺基苄基-胺基甲酸酯经历引起聚合物胺再生的自发重排：AA(A1A2)是二肽，且R4包含RGD配体或空间稳定剂。
图5.显示PEG二肽掩蔽剂的合成的图解说明：R包含PEG，且A1及A2是氨基酸(经保护或未经保护)。
图6.显示(A)二肽的NHS酯、(B)Fmoc保护的衍生物的氨基酸H-Asn(DMCP)-OH及H-Lys(MMT)-OH及(C)Fmoc-A1A2-OH的形成的图解说明：A、A1及A2是氨基酸。
图7.显示(A)Fmoc-AA-PABA及Fmoc-A-PABA的形成及(B)H-Lys(CH3)2-PABA与Fmoc-Phe-NHS的偶合的图解说明。
图8.显示H-A1A2-PABA及H-A1-PABA的形成的图解说明。
图9.显示PEGn-A1A2-PABA的形成的图解说明。
图10显示(A)及(B)PEG-AA-PABC-PNP的形成的图解说明。
图11显示丙烯酸N-Boc-乙基乙氧基酯及甲基丙烯酸丙酯的RAFT共聚的图解说明。
图12显示利用迭氮基-PEG-胺的末端聚合物修饰的图解说明。
图13.显示由RGD掩蔽剂的一个示例(RGD配体-PEG1-二胺-二芳基腙-PEG2-二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺)修饰的多胺的图解说明。将未由明确指示为单元的部分(即RGD配体、PEG1等)的原子视为连接原子且可将其视为至任一侧的标记单元的一部分。
具体实施方式
本发明提供用于在活体中递送RNA干扰(RNAi)触发子至表现肿瘤细胞的整联蛋白的偶联物及方法。所述偶联物包含共价连接至欲递送的RNAi触发子的整联蛋白靶向的可逆经修饰的膜活性多胺。整联蛋白靶向是由本文所述RGD配体提供。膜活性多胺的可逆修饰是由本文所述RNA配体及空间稳定剂肽酶可裂解的掩蔽剂提供。肽酶可裂解的键在不存在蛋白酶下对水解稳定，且提供储存及活体中循环中的延长稳定性。改良(较长)的循环半衰期有利于拓宽组织(例如肿瘤组织)中的RGD配体介导的累积的机会窗。RNAi触发子在活体中的递送可用于基因表现的治疗性抑制(敲除)。
本发明包括具有一般结构的偶联物递送系统：
其中N是RNAi触发子，L1是生理上不稳定的键，P是两亲性膜活性多胺，M1包含通过二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯键(RGD掩蔽剂)连接至P的RGD配体，且M2包含通过二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯键(PEG掩蔽剂)连接至P的空间稳定剂。Y及z各自是大于0的整数，前提是y+z的值具有多胺P上的一级胺的数目(通过在不存在任何掩蔽剂下P上的胺的量所测定)的大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的值。在其未经修饰状态中，P是膜活性多胺。递送聚合物M1 y-P-M2 z无膜活性。通过M1及M2的附接的P一级胺的可逆修饰可逆抑制或灭活P的膜活性。应注意，一些小的两亲性膜活性多胺(例如蜂毒肽)含有少至3至5个一级胺。胺的百分比的改变意欲反映聚合物群体中的胺的百分比的改变。在M1及M2裂解后，多胺的胺再生，从而将P恢复成其未经修饰的膜活性状态。
对于肿瘤递送，y具有等于聚合物P上的一级胺的数目的2-20％的值。更佳地，y具有等于聚合物P上的一级胺的数目的2-10％的值。因此，z具有等于聚合物P上的一级胺的数目的80-98％的值。y(RGD):z(空间稳定剂)的比率优选是约1-12:50且更佳约1:20。
在掩蔽状态中，可逆经掩蔽的膜活性多胺不呈现膜破坏性活性。可需要用二肽掩蔽剂可逆修饰超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％或超过90％的多胺上的胺以形成抑制膜活性并提供细胞靶向功能，即形成可逆经掩蔽的膜活性聚合物(递送聚合物)。
在一个实施方式中，RNAi触发子通过生理上不稳定的共价键连接至本发明的递送聚合物。通过使用生理上不稳定的键，RNAi触发子可自聚合物裂解，从而释放RNAi触发子以致力于与细胞组分的功能相互作用。
掩蔽是通过期望掩蔽剂可逆附接至膜活性多胺以形成可逆经掩蔽的膜活性聚合物(即递送聚合物)完成。除抑制膜活性外，掩蔽剂亦屏蔽聚合物免于非特异性相互作用、降低血清相互作用、增加循环时间和/或提供细胞特异性相互作用，即靶向。
掩蔽剂的基本特征在于在聚集物中，其抑制聚合物的膜活性。掩蔽剂可屏蔽聚合物免于非特异性相互作用(降低血清相互作用、增加循环时间)。膜活性多胺在未经修饰(未经掩蔽)状态中具有膜活性且在经修饰(掩蔽)状态中无膜活性(灭活)。足够数目的掩蔽剂连接至聚合物以实现期望灭活程度。使用适当聚合物活性分析直接测定通过掩蔽剂附接的聚合物的期望修饰程度。举例而言，若在给定分析中，聚合物具有膜活性，则足够含量的掩蔽剂连接至聚合物以实现该分析中的膜活性的足够抑制程度。掩蔽需要修饰聚合物群体上的一级胺的≥50％、≥60％、≥70％、≥80％或≥90％，通过在不存在任何掩蔽剂下聚合物上的一级胺的量所测定。期望经掩蔽的聚合物保留水性溶解性。
RGD掩蔽剂的基本特征在于在聚集物中，将递送聚合物靶向αvβ3整联蛋白阳性肿瘤细胞。足够数目的掩蔽剂连接至聚合物以实现肿瘤细胞靶向。靶向可需要修饰聚合物群体上的一级胺的约2％至约20％、约2％至约10％或约3％至约6％，通过在不存在任何掩蔽剂下聚合物上的一级胺的数目所测定。
在一个实施方式中，适于修饰多胺的形成整联蛋白靶向的递送聚合物的RGD掩蔽剂包含：共价连接至二肽-酰胺基苄基-碳酸酯(RGD二肽掩蔽剂)的RGD配体。类似地，适于修饰多胺以形成整联蛋白靶向的递送聚合物的空间稳定剂二肽掩蔽剂包含：共价连接至二肽-酰胺基苄基-碳酸酯的空间稳定剂。掩蔽剂具有一般形式：
(R或PEG)-A1A2-酰胺基苄基-碳酸酯.
其中R包含RGD配体，PEG包含其他空间稳定剂的聚乙二醇，A1A2是含有第一氨基酸A1及第二氨基酸A2的二肽，且碳酸酯是活化胺反应性碳酸酯。掩蔽剂碳酸酯与聚合物胺反应产生胺基甲酸酯键。在碳酸酯与聚合物胺反应之前或在形成胺基甲酸酯键之后，RNA配体或空间稳定剂可附接至二肽。掩蔽剂稳定连接至聚合物直至二肽通过内源性蛋白酶在活体中裂解，由此自多胺裂解RGD配体或空间稳定剂。在二肽后的酶裂解(A2与酰胺基苄基之间)后，酰胺基苄基-胺基甲酸酯经历自发重排而引起聚合物胺再生。RGD配体可通过连接体(例如PEG连接体)连接至二肽。优选空间稳定剂掩蔽剂不带电。优选不带电空间稳定剂是聚乙二醇(PEG)。优选二肽由通过酰胺键连接至亲水性不带电氨基酸(A2)的疏水性氨基酸(A1)组成。优选酰胺基苄基是对-酰胺基苄基。优选碳酸酯是活化胺反应性碳酸酯。
适于形成本发明的整联蛋白靶向的递送聚合物的掩蔽剂具有一般结构：
其中R4包含RGD配体或空间稳定剂，R3包含胺反应性碳酸酯部分，且R1及R2是氨基酸侧链。R1优选是疏水性氨基酸的侧基。优选疏水性氨基酸是丙胺酸。R2优选是亲水性不带电氨基酸的侧链。优选亲水性不带电氨基酸是瓜胺酸。优选活化碳酸酯是对-硝基酚。然而，容易地用本领域已知的其他胺反应性碳酸酯替代对-硝基酚。活化碳酸酯与胺的反应通过如由以下表示的肽酶可裂解的二肽-酰胺基苄基胺基甲酸酯键将RGD配体或空间稳定剂连接至膜活性多胺：
多胺
其中R4、R1及R2如上文所述。在二肽之后在氨基酸与酰胺基苄基之间酶裂解自聚合物移除R4且触发消除反应，在该消除反应中酰胺基苄基-胺基甲酸酯经历自发重排而引起聚合物胺再生。
在另一实施方式中，通过首先用具有以下一般结构的二肽-酰胺基苄基-碳酸酯可逆修饰胺实现RGD配体通过可逆的生理上不稳定的键附接至多胺：
(式3)
其中R7包含适于与含有RGD配体的部分反应且胺反应性较R3的碳酸酯小的反应基团。R1、R2及R3如上文所定义。在一个实施方式中，R7进一步包含PEG连接部分(本文中亦称作PEG2)。已发现在二肽与反应基团之间插入PEG连接部分可改良装配RGD掩蔽剂的溶解性及活体中功能。优选PEG连接部分是(CH2-CH2-O)4-44。在用含有反应基团(R7)的二肽-酰胺基苄基-碳酸酯修饰聚合物胺后，含有RGD配体的部分通过与反应基团R7反应共价连接。适于连接二肽及含有RGD配体的部分的示例性反应基团部分包括(但不限于)HyNic及醛(包括芳基醛)、”点击”(click)化学交联剂(某些迭氮化物及炔烃)。式3的示例性分子是碳酸(4-甲酰基苯甲醛)-PEG-Ala-Cit-ara-胺基苄基酯。
二肽掩蔽剂的二肽(本文中表示为A1A2(或AA))是通过酰胺键连接的氨基酸的二聚物。氨基酸(包括α及β氨基酸)已为生物学及化学所熟知且是含有胺基团、羧酸基团及在不同氨基酸之间变化的侧链的分子。优选氨基酸是具有通式H2NCHRCOOH的Lα-氨基酸，其中R(式3的R1及R2)是有机取代基或侧基。优选Lα氨基酸是不带电的天然氨基酸。在优选二肽中，A1是疏水性氨基酸且A2是不带电亲水性氨基酸。优选疏水性氨基酸是苯丙胺酸、缬胺酸、异白胺酸、白胺酸、丙胺酸或色胺酸。优选不带电亲水性氨基酸是天冬酰胺、麸酰胺酸或瓜胺酸。更佳的疏水性氨基酸是丙胺酸或苯丙胺酸。更佳的不带电亲水性氨基酸是瓜胺酸。尽管二肽优选，但可在A1与R之间插入其他氨基酸。亦可通过消除氨基酸A1使用单一氨基酸代替二肽。本发明中所用的任何天然氨基酸在本文中由其常见缩写提及。
在优选实施方式中，两亲性膜活性多胺通过与所述二肽-酰胺基苄基-碳酸酯掩蔽剂反应以产生膜非活性递送聚合物经可逆修饰。二肽掩蔽剂屏蔽聚合物免于非特异性相互作用、增加循环时间、增强特异性相互作用、抑制毒性或改变聚合物的电荷。
本发明的经可逆掩蔽的聚合物包含结构：
多胺
其中：
X是-NH-、-O-或-CH2-
Y是-NH-或-O-
R1优选是-(CH2)k-苯基(k是1、2、3、4、5、6；k＝1苯丙胺酸)、-CH-(CH3)2(缬胺酸)、-CH2-CH-(CH3)2(白胺酸)、-CH(CH3)-CH2-CH3(异白胺酸)、-CH3(丙胺酸)或
(色胺酸)；
R2优选是氢(甘胺酸)、-(CH2)3-NH-C(O)-NH2(瓜胺酸)、-CH2-C(O)-NH2(天冬酰胺)、-(CH2)2-C(O)-NH2(麸酰胺酸)、-(CH2)4-N-(CH3)2(离胺酸(CH3)2)、-(CH2)k-C(O)-NH2；(k是1、2、3、4、5、6)、-CH2-C(O)-NR'R”(天冬胺酸酰胺)、-(CH2)2-C(O)-NR'R”(麸胺酸酰胺)、-CH2-C(O)-OR'(天冬胺酸酯)或-(CH2)2-C(O)-OR'(麸胺酸酯)，其中R'及R”是烷基
R4包含RGD配体或聚乙二醇；且
多胺是两亲性膜活性多胺。
尽管上述结构指示连接至聚合物的单一二肽掩蔽剂，但本发明实践中，50％至100％聚合物胺由二肽掩蔽剂修饰。
在优选实施方式中，本发明的经可逆掩蔽的聚合物包含结构：
多胺
其中R1、R2、R4及多胺是如上文所述。
本发明的经可逆掩蔽的聚合物可通过使本发明的二肽掩蔽剂与聚合物上的胺反应形成。本发明的二肽掩蔽剂具有结构：
其中：
X、Y、R1、R2及R4是如上文所述
R5是在2、4或6位处且是-CH2-O-C(O)-O-Z，其中Z是
-卤化物、
且
R6在2、3、4、5或6位的每一处独立地是氢、烷基、-(CH2)n-CH3(其中n＝0-4)、-(CH2)-(CH3)2或卤化物，由R5占据的位置除外。
在优选实施方式中，X是-NH-，Y是-NH-，R4包含RGD配体或PEG基团，R5是在4位处，且R6是氢，如下文所示：
(式4)。
在另一实施方式中，式4的R4是R8-(O-CH2-CH2)s-O-Y1-，其中：R8是氢、甲基或乙基；且s是1至150的整数，且Y1是本领域适于将PEG基团连接至二肽的连接体。适宜连接体Y1包括(但不限于)：-(CH2)1-3-C(O)-、-Y2-NH-C(O)-(CH2)2-C(O)-(其中Y2是-(CH2)3-)及-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-(p是1至20的整数)。
如本文所用，RGD配体包含大小<1500kDa的两性离子RGD肽或RGD模拟物，其结合至αv/β3(αvβ3或αvβ3)整联蛋白(对其具有亲和力)。
如本文所用，RGD肽包含精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸盐三肽。RGD肽可在RGD序列的胺基或羧基末端进一步包含其他氨基酸。若存在其他氨基酸，则连续肽序列构成RGD肽。RGD肽可在构象上受限。构象限制通常是通过肽的环化(例通过在RGD序列的胺基及羧基末端添加半胱胺酸氨基酸及在半胱胺酸硫醇之间形成二硫键)完成。优选限制的RGD肽包含氨基酸序列：Xn1CmXn2CXn3RGDXn4CXn5CmXn6(SEQID1)，其中X是天然氨基酸，m是零(0)或一(1)，且n1-n6独立地是0、1、2或3。若存在(n＝1、2或3)，则每一X处的一个或多个氨基酸独立于其他位置处的氨基酸的选择。在一个实施方式中，m、n1、n2及n5各自是一(1)，且n3、n4及n6各自是零(0)。在另一实施方式中，m是一(1)，Xn1是丙胺酸，Xn2是天冬胺酸盐，Xn5是苯丙胺酸，且n3、n4及n6各自是零(0)(ACDCRGDCFC,SEQID2)。RGD肽可具有连接至RGD氨基酸序列的非肽组分。举例而言，肽的胺基末端可经酰化或连接体可附接至肽的羧基末端。在另一实施方式中，m是一(1)，Xn1是酰化丙胺酸，Xn2是天冬胺酸盐，Xn5是苯丙胺酸，n3、n4及n6各自是零(0)。
如本文所用，RGD模拟物是除RDG肽外的非肽合成分子，其生物模拟RGD肽、整联蛋白结合蛋白的整联蛋白结合RGD部分或αvβ3整联蛋白结合RGD基元的活性决定簇。RGD模拟物可含有一个或两个通过酰胺键连接的天然氨基酸。RGD模拟物可为经修饰的肽，含有非标准氨基酸或非标准氨基酸侧链。RGD模拟物可具有由以下机构表示肽主链：
其中n是整数。
在一个实施方式中，RGD配体包含通过酰胺键连接至甘胺酸-天冬胺酸盐二肽的胍基团。本发明的胍基团具有由以下表示的结构：
其中R9及R10独立地是氢或烷基且可通过连接以形成环，且R11是连接胍基团至甘胺酸-天冬胺酸盐二肽的连接体。胍基团包括上文表示的结构及其共振结构二者。优选连接体是：
-(C1RR)-(C2RR)-(C3RR)-或-(C1RR)-(C2RR)-(C3RR)-(C4RR')-,
其中：a)每一R皆独立地是可选的且(若存在)独立地是氢、烷基或芳基，b)R'是氢、烷基、芳基或NH2，且c)C1、C2及C3可通过单键、单键及双键或芳族键连接。
尽管于本体提供的结构RGD配体结构中未明确显示，但众所周知且了解，胍基团于中性或几乎中性pH(pH6.5-7.5)下带正电：
类似地，尽管本文提供的RGD配体结构中未明确显示，但众所周知且了解，氨基酸天冬胺酸于中性或几乎中性pH(pH6.5-7.5)下带负电：
发现附接至RGD配体的天冬胺酸盐氨基酸的苯氧基可改良在活体中将多胺靶向肿瘤细胞。优选RGD配体包含胍-甘胺酸-天冬胺酸盐-4-胺基苯氧基化合物。优选胍-甘胺酸-天冬胺酸盐-4-胺基苯氧基化合物包含由以下表示的结构：
胍
其中R13是：
优选胍是
及其共振结构。
在另一实施方式中，含有RGD配体的部分包含由以下表示的结构：
其中：
R14是
且
A包含连接体。连接体将RGD模拟物连接至另一分子(例如二肽酰胺基苄基-碳酸酯)，提供增加溶解性，或提供共价键至另一分子的方式。
在一个实施方式中，连接体A包含：
其中
n是0、1、2或3；
Y不存在或是
Z不存在，是
m是0、1、2、3或4，且
PEG(图13中的PEG1)是(CH2-CH2-O)4-44，且
R12包含能够与R7反应以形成共价键的反应基团。
单独组分、PEG、反应基团等中的每一者皆可使用本领域容易获得的方法(包括但不限于酰胺键的形成)组合(共价连接)。在一个实施方式中，反应基团R12可通过二胺(例如离胺酸)连接至PEG。离胺酸的羧基可附接至固体载体以有助于RGD配体的合成。随后使用末端及ε-胺以连接PEG基团及反应基团。反应基团R12经选择以易于与式3的反应基团R7反应以形成共价键。适于与R12及R7一起使用的反应基团对可选自包含以下的对：迭氮化物及膦、迭氮化物及炔烃、硝酮及炔烃、四嗪及辛烷、四嗪及环丙烯、四嗪及异腈、二-烯及烯烃、醛及肼、醛及胺基氧基、醛及酰肼、酮及肼、酮及胺基氧基及酮及酰肼。优选反应基团是：
在优选实施方式中，含有RGD配体的部分包含由以下表示的结构：
其中：R14、n、Y、Z、m、PEG及R12各自是如上文所定义。
反应基团R12可用于将RGD配体附接至可逆的生理上不稳定的连接体(例如二肽连接体)以产生RGD掩蔽剂。在一个实施方式中，RGD掩蔽剂包含由以下表示的结构：
其中R14是如上文所定义的含有胍的部分，A'包含含有PEG的连接体，R1优选是疏水性氨基酸的侧基，R2优选是亲水性不带电氨基酸的侧链(于中性pH下)，且R3是胺反应性碳酸酯。在一个实施方式中，连接体A'包含具有4-48个乙氧基单元的PEG基团。在另一实施方式中，连接体A'包含具有4-44个伸乙基单元的第一PEG(PEG1)基团及具有4-44个伸乙基的第二PEG(PEG2)基团，该PEG基团由二酰基肼或其他键化学结构隔开。在一个实施方式中，二酰基腙通过二胺(例如离胺酸)连接至第一PEG基团。二芳基腙可通过HyNic(肼基-烟酰胺)基团与芳基醛反应形成。
在另一实施方式中，连接体A'包含通过以下物质的反应形成的键：迭氮化物与膦、迭氮化物与炔烃、硝酮与炔烃、四嗪与辛烯、四嗪与环丙烯、四嗪与异腈、二-烯与烯烃、醛与肼、醛与胺基氧基、醛与酰肼、酮与肼、酮与胺基氧基或酮与酰肼。
膜活性多胺通过RGD掩蔽剂的附接的修饰产生可逆经修饰的多胺。在一个实施方式中，通过RGD掩蔽剂修饰的膜活性多胺包含由以下表示的结构：
多胺
其中R14、R1、R2及A'是如上文所定义。在一个实施方式中，在二肽连接至两亲性膜活性多胺后，RGD附接至二肽。在一个实施方式中，首先使芳基醛-PEG2-二肽-酰胺基苄基-碳酸酯与多胺反应以形成芳基醛-PEG2-二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺。随后使此化合物与RGD配体-PEG1-二胺-HyNic反应以形成：RGD配体-PEG1-二胺-二芳基腙-PEG2-二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-多胺(参见图13)。
本文所用术语肽具有本领域常见含义：由肽(酰胺)键(即在一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的胺基反应时形成的共价化学键)连接的Lα氨基酸单体的短链。
本文所用词组天然氨基酸具有本领域常见含义。本文所用词组标准氨基酸具有本领域常见含义：直接由遗传密码中的三联密码子编码的天然Lα氨基酸。适于与本发明一起使用的膜活性聚合物的非限制性示例已先前阐述于美国专利公开案US20080152661、US20090023890、US20080287630、US20110207799、US20130121954及US20130317079(其每一者皆以引用方式并入本文中)中。适宜两亲性膜活性多胺可为小的肽，例如蜂毒肽。
使用本文所述肽酶可裂解的连接体可逆修饰聚合物胺。若修饰基团的裂解引起胺再生，则胺经可逆修饰。掩蔽剂的活化碳酸酯与聚合物胺的反应通过肽酶可裂解的二肽-酰胺基苄基胺基甲酸酯键将RGD配体或空间稳定剂连接至聚合物，如图3中所示。
可在RGD配体及二肽掩蔽剂的合成及结合期间使用保护基团。若存在，可在修饰两亲性膜活性多胺之前或之后移除保护基团。
利用二肽掩蔽剂可逆修饰足够百分比的聚合物胺会抑制膜活性多胺的膜活性。二肽-酰胺基苄基-胺基甲酸酯键易受蛋白酶(或肽酶)裂解影响。在存在蛋白酶下，苯胺键经裂解，从而产生直接经历1,6消除反应以释放游离聚合物的中间体(图4)。在消除反应后，游离聚合物未经修饰且保存膜活性。
在存在过量掩蔽剂下，膜活性多胺可结合至掩蔽剂。在给予递送聚合物之前可自结合的递送聚合物移除过量掩蔽剂。
如本文所用，”空间稳定剂”是非离子性亲水性聚合物(天然、合成或非天然)，相对于不含空间稳定剂的聚合物，其防止或抑制其附接的聚合物的分子内或分子间相互作用。空间稳定剂妨碍其附接的聚合物进行静电相互作用。静电相互作用是由于正电荷与负电荷之间的吸引力，两种或更多种物质的非共价缔合。空间稳定剂可抑制与血液组分的相互作用，且因此抑制网状内皮组织系统的调理、吞噬及摄取。因此，空间稳定剂可增加其附接的分子的循环时间。空间稳定剂亦可抑制聚合物聚集。优选空间稳定剂是聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。如本文所用，优选PEG可具有约1-500个或2-25个乙二醇单体。如本文所用，优选PEG亦可具有约85-20,000道尔顿(Da)、约85-1000Da的平均分子量。如本文所用，在水溶液中，相对于不含空间稳定剂的聚合物，空间稳定剂防止或抑制其附接的聚合物的分子内或分子间相互作用。
“配体”增强其附接的偶联物的药物动力学或生物分布性质以改良偶联物的细胞-或组织-特异性分布及细胞特异性摄取。配体增强分子与靶细胞的缔合。因此，配体可增强其附接的偶联物的药物动力学或生物分布性质以改良偶联物的细胞分布及细胞摄取。配体与细胞或细胞受体的结合可起始内吞作用。配体可为单价、二价、三价、四价或具有更高价。
如本文所用，膜活性多胺能够破坏质膜或溶酶体/内吞膜。此膜活性是RNAi触发子的细胞递送的基本特征。然而，在活体中给予聚合物时，膜活性导致毒性。多胺亦易于在活体中与许多阴离子组分相互作用，从而导致不期望的生物分布。因此，多胺的膜活性的可逆掩蔽是活体中使用所必需。
在一个实施方式中，膜活性多胺包含：通过含胺单体及含有疏水性基团的单体的无规聚合形成的两亲性聚合物。含胺单体含有侧接一级胺基团。疏水性单体含有侧接疏水性基团。疏水性基团可为具有1至6个碳原子的低碳数疏水性基团或具有超过6个碳原子的高碳数疏水性基团。优选疏水性基团可选自包含以下的列表：丙基、丁基、异丙基及异丁基。胺基团对疏水性基团的比率经选择以形成具有膜破坏活性的水溶性聚合物，优选≥1个胺单体/疏水性单体。在一个实施方式中，聚合物将具有50-80％胺单体且更佳55-75％胺单体。疏水性基团可选自由以下组成的群：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可为直链、具支链或环状。疏水性基团优选是仅含有碳及氢原子的烃。然而，可允许维持疏水性的取代或杂原子，包括(例如)氟。
“两亲性”或两性分子性聚合物已众所周知且在本领域公认且具有亲水性(极性、水溶性)及疏水性(非极性、亲脂性、水不溶性)基团或部分。
“水性基团”在定性方面指示化学部分偏好水。通常，该化学基团具有水溶性，且在水下是氢键供体或受体。水性基团可带电或不带电。带电可带正电(阴离子)或带负电(阳离子)或二者(两性离子)。水性基团的示例包括以下化学部分：碳水化合物、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、酰胺、烷氧基酰胺、羧酸、硫及羟基。
“疏水性基团”在定性方面指示化学部分避水。通常，该化学基团无水溶性，且往往不形成氢键。亲脂性基团溶解于脂肪、油、脂质及非极性溶剂中且具有极小或无形成氢键的能力。含有两(2)个或更多个碳原子的烃、某些经取代烃、胆固醇及胆固醇衍生物是疏水性基团及化合物的示例。
疏水性基团优选是仅含有碳及氢原子的烃。然而，可允许维持疏水性炔包括(例如氟)的非极性取代或非极性杂原子。该术语包括脂族基团、芳族基团、酰基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可为直链、具支链或环状。术语疏水性基团亦包括：固醇、类固醇、胆固醇及类固醇及胆固醇衍生物。
如本文所用，关于两亲性聚合物，部分定义为在一个共价键断裂且由氢置换时衍生的分子。举例而言，在丁基胺中，碳与氮键之间的断裂及用氢置换产生氨(亲水性)及丁烷(疏水性)。若1,4-二胺基丁烷在氮-碳键处裂解且经氢置换，则所得分子再次为氨(2×)及丁烷。然而，由于疏水性部分的形成需要两个键断裂，故认为1,4,-二胺基丁烷并无两亲性。
如本文所用，表面活性聚合物降低水的表面张力和/或与其他相的界面张力，且因此，于液体/气体界面处积极被吸附。表面活性的性质通常是由于物质的分子具有两亲性或两性分子性的事实。
如本文所用，”膜活性”聚合物是表面活性、两亲性聚合物，其能够诱导对生物膜的以下效应中的一或多者：容许不透膜分子进入细胞或横跨膜的膜改变或破坏、膜中的孔形成、膜的分裂或膜的破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包含脂质双层。膜的改变或破坏可通过在至少一个以下分析中的聚合物的活性在功能上定义：红血球裂解(溶血)、脂质体泄漏、脂质体融合、细胞融合、细胞裂解及内涵体释放。可引起细胞膜裂解的膜活性聚合物亦称作溶膜聚合物。将优先引起质膜上的内涵体或溶酶体破坏的聚合物视为内涵体裂解性。膜活性聚合物对细胞膜的效应可为瞬时的。膜活性对膜具有亲和力且引起双层结构变性或变形。膜活性聚合物可为合成或非天然两亲性聚合物。
如本文所用，膜活性聚合物不同于一类称作细胞渗透肽的聚合物或由化合物(例如衍生自HIVTAT蛋白质的富含精胺酸的肽、控制触角的基因肽、VP22肽、细胞穿透肽(transportan)、富含精胺酸的人工肽、小的富含胍的人工聚合物及诸如此类)表示的聚合物。尽管细胞穿透化合物似乎将一些分子横跨膜自脂质双层的一侧输送至脂质双层的另一侧而明显地无需内吞作用且未破坏膜的完整性，但尚未了解其机制。
RNAi触发子至细胞的递送是由破坏质膜或内部囊泡膜(例如内涵体或溶酶体)或使其去稳定(包括在膜中形成孔，或破坏内涵体或溶酶体囊泡，从而允许囊泡的内容物释放至细胞胞质中)的膜活性聚合物介导。
本发明的两亲性膜活性多胺共聚物是两种或更多种单体物质的共聚产物。在一个实施方式中，本发明的两亲性膜活性杂聚物具有一般结构：
-(A)a-(B)b-
其中，A含有侧接一级胺官能基且B含有侧接疏水性基团。a及b是>0的整数。聚合物可为无规、嵌段或交替聚合物。可允许纳入其他单体。
如本文所用，“内涵体裂解性聚合物(endosomolytic)”是响应内涵体特异性环境因素(例如裂解性酶的存在)能够引起内涵体破坏或裂解或可自细胞内部膜包覆的囊泡(例如内涵体或溶酶体)释放正常细胞膜不可渗透化合物(例如RNAi触发子)的聚合物。内涵体裂解性聚合物经历其内涵体中的物理-化学性质变化。此变化可为由于电荷、疏水性或亲水性变化的聚合物的溶解性或与其他化合物或膜相互作用的能力的改变。将本发明的可逆经掩蔽的膜活性多胺视为内涵体裂解性聚合物。
如本文所用，“蜂毒肽”是在蜜蜂毒液中天然存在的小的两亲性膜活性肽(美国专利公开案20120165393)。蜂毒肽可自生物来源分离或其可为合成的。合成聚合物通过化学制程“由人”调配或制造且并非由天然生物制程生成。如本文所用，蜂毒肽涵盖蜂毒肽家族的可在(例如)以下物种的毒液中发现的天然蜜蜂毒液肽：西方蜜蜂(Apismellifera)、东方蜜蜂(Apiscerana)、额斑黄胡蜂(Vespulamaculifrons)、大胡蜂(Vespamagnifica)、墨胸胡蜂(Vespavelutinanigrithorax)、长脚蜂属(Polistessp.)HQL-2001、小蜜蜂(Apisflorae)、大蜜蜂(Apisdorsata)、中华蜜蜂(Apisceranacerana)、亚非马蜂(Polisteshebraeus)。如本文所用，蜂毒肽亦涵盖具有与天然蜂毒肽相同或类似的氨基酸序列的合成肽。特定而言，蜂毒肽氨基酸序列涵盖示于表1中的那些。合成蜂毒肽可含有天然L形式氨基酸或对映异构D形式氨基酸(逆转型)。然而，蜂毒肽应含有基本上所有L形式或所有D形式氨基酸，但可具有附于胺基或羧基末端的相对立构中心的氨基酸。蜂毒肽氨基酸序列亦可反转(反转型)。反转型蜂毒肽可具有L形式氨基酸或D形式氨基酸(逆反转)。两个蜂毒肽亦可共价连接以形成蜂毒肽二聚物。蜂毒肽可具有除掩蔽剂外的附接至胺基末端或羧基末端的修饰基团，其增强组织靶向或有利于在活体中循环。
键或”连接体”是两个原子之间通过一个或多个共价键将一个目标化学基团或片段连接至另一目标化学基团或片段的连接。举例而言，键可将掩蔽剂、多核苷酸或RNAi触发子连接至聚合物。不稳定键含有不稳定键。键可视情况包括增加两个结合原子之间的距离的间隔体。间隔体可进一步为键增加挠性和/或长度。间隔体可包括(但不限于)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其各自可含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸及糖。间隔体基团已为本领域熟知且前述列表并不意欲限制本发明的范畴。
“不稳定键”是除了至氢原子的共价键外的共价键，其能够在不使同一分子中的其他共价键断裂或裂解的条件下选择性断裂或裂解。更特定而言，不稳定键是在适当条件下较同一分子中的其他非不稳定共价键不稳定(热力学)或更快速断裂(动力学)的共价键。分子内的不稳定键的裂解可引起形成两个分子。对于本领域技术人员，通常以键裂解的半衰期(t1/2)(键裂解一半所需的时间)论述键的裂解或不稳定性。因此，不稳定键涵盖可较分子中的其他键更快速地选择性裂解的键。
如本文所用，“生理上不稳定的键”是在哺乳动物体内通常遇到的条件或类似于在哺乳动物体内遇到的那些条件下可裂解的不稳定键。生理上不稳定的键基团经选择，使得在某些生理条件中存在时，其经历化学转变(例如，裂解)。
如本文所用，细胞生理上不稳定的键是在哺乳动物细胞内条件下可裂解的不稳定键。哺乳动物细胞内条件包括化学条件，例如哺乳动物细胞中发现或类似于哺乳动物细胞中遇到的那些pH、温度、氧化或还原条件或试剂及盐浓度。哺乳动物细胞内条件亦包括存在通常在哺乳动物细胞中存在的酶活性，例如来自蛋白水解或水解酶。细胞生理上不稳定的键亦可响应医药上可接受的外源试剂的给予而裂解。
术语“多核苷酸”或核酸或多核酸是本领域称作含有至少两个核苷酸的聚合物的术语。核苷酸是多核苷酸聚合物的单体单元。具有小于120个单体单元的多核苷酸经常称作寡核苷酸。天然核酸具有脱氧核糖-或核糖-磷酸酯主链。非天然或合成多核苷酸是在活体外或在无细胞的系统中聚合的多核苷酸且含有相同或类似碱基但可含有除天然核糖或脱氧核糖-磷酸酯主链外的类型的主链。可使用本领域任何已知技术合成多核苷酸。本领域已知的多核苷酸主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、磷二酰胺、吗啉基及天然核酸的磷酸酯主链的其他变体。碱基包括嘌呤及嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、阿糖胞苷、尿嘧啶、次黄嘌呤及天然类似物。嘌呤及嘧啶的合成衍生物包括(但不限于)在核苷酸上放置新反应基团(例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯及烷基卤)的修饰。术语碱基涵盖DNA及RNA的已知碱基类似物中的任一者。多核苷酸可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成核苷酸或任何适宜组合。多核苷酸可在活体外聚合物，其可重组，含有嵌合序列或该基团的衍生物。多核苷酸可在5'端、3'端或5'及3'端处包括末端帽部分。帽部分可为(但不限于)倒置脱氧无碱基部分、倒置脱氧胸苷部分、胸苷部分或3'甘油基修饰。
RNAi触发子通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表现。RNAi触发子包含双链RNA或RNA样结构，其通常含有15至50个碱基对且优选18至25个碱基对且具有与细胞内的表现靶基因中的编码序列相同(完美互补)或几乎相同(实质上互补)的核碱基序列。RNAi触发子包括(但不限于)：短的干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链(meroduplex)及切酶底物(dicersubstrates)(美国专利第8,084,599号、第8,349,809号及第8,513,207号)。
RNAi触发子包含至少两个彼此部分、实质上或完全互补的序列。在一个实施方式中，两个RNAi触发子序列包含含有第一序列的有义链及包含第二序列的反义链。在另一实施方式中，两个RNAi触发子序列包含两条一起包含第一序列的有义链及包含第二序列的反义链，其中有义链及反义链一起形成部分双链(表2及4)。有义链可通过连接体分子(例如多核苷酸连接体或非核苷酸连接体)连接至反义链。
反义链包含与由靶基因编码的mRNA的一部分互补的核苷酸序列，且互补区的长度最佳小于30个核苷酸。RNAi触发子有义链包含与AATmRNA的至少一部分具有至少90％一致性的序列。RNAi触发子在递送至表现靶基因的细胞后会抑制该靶基因在活体外或在活体中的表现。
RNAi触发子分子可包括天然核苷酸或可包括至少一种经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物。本发明的RNAi触发子有义及反义链可通过本领域充分确立的方法合成和/或修饰。RNAi触发子分子核苷或核苷酸碱基可由含有磷酸酯(天然)或含有非磷酸酯(非天然)的共价核苷间键来连接，即RNAi触发子分子可具有天然或非天然寡核苷酸主链。在另一实施方式中，RNAi触发子在核苷酸碱基之间含有非标准(非磷酸酯)键。
经修饰的核苷酸包括(但不限于)：2'修饰、2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-胺基核苷酸、2'-烷基核苷酸、末端3'至3'键、倒置脱氧胸苷、包含5'-硫代磷酸酯基团、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯基团的核苷酸；包含非天然碱基的核苷酸、锁定核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸、非锁定核苷酸(本文中表示为NUNA)、吗啉基核苷酸及无碱基核苷酸。不必均匀修饰给定化合物中的所有位置。相反，可在单一RNAi触发子化合物中或甚至在其单一核苷酸中纳入一个以上修饰。核糖2'修饰可与经修饰的核苷键组合。
RNAi触发子分子亦可包含突出部分，即通常未配对的悬垂核苷酸，其并不直接参与通常由本文中定义的有义链及反义链的对的核心序列形成的双螺旋结构。
RNAi触发子可含有1至5个独立地在有义链及反义链中的每一者上的碱基的3'和/或5'突出部分。在一个实施方式中，有义链及反义链二者皆含有3'及5'突出部分。在一个实施方式中，一条链碱基的一个或多个3'突出部分核苷酸与另一链的一个或多个5'突出部分核苷酸配对。在另一实施方式中，一条链碱基的一个或多个3'突出部分核苷酸与另一链的一个或多个5'突出部分核苷酸配对。RNAi触发子的有义及反义链可含有或可不含有相同数目的核苷酸碱基。反义及有义链可形成双螺旋，其中仅5'端具有钝端，仅3'端具有钝端，5'及3'端皆是钝端，或5'端及3'端皆不为钝端。在另一实施方式中，突出部分中的一个或多个核苷酸含有硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、脱氧核苷酸倒置(3'至3'连接)的核苷酸或是经修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
已知miRNA序列的列表可参见由研究机构(例如尤其WellcomeTrustSangerInstitute、PennCenterforBioinformatics、MemorialSloanKetteringCancerCenter及EuropeanMoleculeBiologyLaboratory)维持的数据库。已知有效的siRNA序列及同源结合位点亦在有关文献中重复表示。通过本领域已知的技术容易地设计并产生RNAi分子。另外，存在增加发现有效的特定序列基元的机会的计算工具(Pei等人2006,Reynolds等人2004，Khvorova等人2003,Schwarz等人2003，Ui-Tei等人2004，Heale等人2005，Chalk等人2004，Amarzguioui等人2004)。
RNAi触发子调节由基因编码的RNA的表现。由于多个基因可彼此共享一定程度的序列同源性，故RNAi触发子可经设计以靶向一类具有足够序列同源性的基因。因此，RNAi触发子可含有与在不同基因靶标中共享或对于特定基因靶标独特的序列具有互补性的序列。因此，RNAi触发子可经设计以靶向若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，从而靶向基因家族(例如，不同基因异型体、剪切变体、突变体基因等)中的若干基因。在另一实施方式中，RNAi触发子可经设计以靶向对单一基因的特定RNA序列独特的序列。
术语“互补性”是指通过传统Watson-Crick或其他非传统类型，多核苷酸与另一多核苷酸序列形成氢键的能力。在提及本发明的多核苷酸分子时，多核苷酸分子与其靶标(效应子结合位点)或互补序列的结合自由能足以容许进行多核苷酸的有关功能，例如，酶mRNA裂解或转译抑制。核酸分子的结合自由能的测定已为本领域所熟知(Frier等人1986，Turner等人1987)。互补性％指示可与第二多核苷酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的第一多核苷酸分子中的连续链中的碱基的％(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％及100％互补)。完美互补意指多核苷酸序列的连续链中的所有碱基将与第二多核苷酸序列中的相同数目的连续碱基氢键结合。
抑制、下调或敲除基因表现意指，基因的表达(如通过自基因转录的RNA的含量或自RNA转译的多肽、蛋白质或蛋白质亚单元的含量所测)降低低于在不存在本发明的RNAi触发子-偶联物下所观察的表达。利用由本发明组合物递送的RNAi触发子的基因表现的抑制、下调或敲除优选低于在存在对照无活性核酸(即具有混杂序列或灭活错配的核酸)下或在不存在RNAi触发子与经掩蔽聚合物结合下观察到的含量。
RNAi触发子与递送聚合物的键
在一个实施方式中，RNAi触发子通过生理上不稳定的键或连接体连接至递送聚合物。生理上不稳定的连接体经选择，使得其在某些生理条件中存在时经历化学转换(例如，裂解)，(例如，细胞胞质的还原环境中的二硫键裂解)。通过生理上不稳定的键的裂解的触发子自聚合物的释放有利于触发子与适当细胞组分的相互作用用于活化。
RNAi触发子-聚合物偶联物是通过将触发子共价连接至聚合物形成。该聚合物经聚合或修饰，使得其含有反应基团A。RNAi触发子亦经聚合或修饰，使得其含有反应基团B。反应基团A及B经选择，使得其可使用本领域已知的方法通过可逆共价键连接。
RNAi触发子与聚合物的结合可在存在过量聚合物下实施。由于RNAi触发子及聚合物在结合期间可带相反电荷，故过量聚合物的存在可减少或消除偶联物的聚集。或者，可使用过量载剂聚合物(例如聚阳离子)。可在向动物或细胞培养物给予偶联物之前自结合聚合物移除过量聚合物。或者，可向动物或细胞培养物共给予过量聚合物与偶联物。
活体给予
在药理学及毒性学中，给予路径是使药物、流体、毒物或其他物质与身体接触的途径。一般而言，给予药物及核酸用于治疗哺乳动物的方法已为本领域所熟知且可适于本发明组合物的给予。本发明化合物可通过任何适宜路径(最佳非经肠)在近似适于该路径的制剂中给予。因此，本发明化合物可通过注射(例如静脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)给予。因此，本发明亦提供包含医药上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物。
非经肠给予路径包括使用注射器及针或导管的血管内(静脉内、动脉内)、肌内、实质内、皮内、皮下、皮肤下、肿瘤内、腹膜内、鞘内、硬膜下、硬膜外及淋巴管内注射。本文中的血管内意指在称作连接体内的组织或器官的血管的管状结构内。在管状结构的腔内，体液流至身体部分或自其流出。体液的示例包括血液、脑脊髓液(CSF)、淋巴液或胆汁。血管的示例包括动脉、小动脉、毛细血管、微静脉、血窦、静脉、淋巴管、胆管及唾液管或其他外分泌腺。血管内路径包括通过血管(例如动脉或静脉)递送。血液循环系统提供医药的全身性扩散。
在医药上可接受的载剂溶液中注射期望组合物。医药上可接受的是指自药理学/毒性学角度来看对哺乳动物可接受的那些性质和/或物质。词组医药上可接受的是指在给予哺乳动物时生理上可耐受且通常不产生过敏或其他不利或毒性反应的分子实体、组合物及性质。优选地，本文所用术语医药上可接受的意指已获得联邦或州政府管理机构批准或已列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他公认药典中可用于动物(且更具体而言用于人类)中。
该载剂亦可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过灭菌程序(见上文)及通过包括各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及诸如此类)二者可确保防止微生物存在。该组合物中亦可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠及诸如此类。另外，可通过引入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射医药形式的长效吸收。
治疗效应
RNAi触发子可出于研究目的进行递送或以产生治疗上的细胞变化。RNAi触发子的活体中递送可用于研究试剂且用于多种治疗、诊断、靶验证、基因组发现、遗传改造及药物基因组应用。已揭示RNAi触发子递送引起抑制肝细胞中的内源基因表现。在递送RNAi触发子后量测的报告(标记)基因表现的程度指示在递送其他RNAi触发子后基因的类似表达程度的合理预期。由本领域技术人员认为有益的治疗程度因疾病不同而不同。举例而言，血友病A及B分别是因缺乏X连接的凝血因子VIII及IX引起。其临床过程大大受因子VIII或IX的正常血清含量的百分比影响：<2％，严重；2-5％，中等；且5-30％，轻度。因此，严重患者中的循环因子的正常含量自1％增加至2％可视为有益。大于6％的含量防止自发流血而非继发于手术或损伤的那些。类似地，基因的抑制无需100％以提供治疗益处。基因疗法技术人员将基于标记基因结构的足够程度合理地预期对疾病具有特异性的基因的有益表达程度。在血友病实例中，若标记基因经表达以产生与因子VIII的正常含量的2体积％相当的含量的蛋白质，则可合理地预期编码因子VIII的基因亦可以类似程度表达。因此，报告基因或标记基因用作一般细胞内蛋白质的表达的有用范例。
本发明医药组合物中的活性成份的实际剂量可变以便获得可有效实现对特定患者有期望治疗反应的量的活性成份、组合物及给予模式，而对患者无毒。所选剂量量取决于各种药物动力学因素，包括本发明所用特定组合物的活性、给予路径、给予时间、所用特定化合物的排泄速率、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、身体状况、一般健康状况及先前病史及医学领域熟知的类似因素。
如本文所用，在活体中意指在有机体内部发生且更特定而言与部分或死亡者相反，在全活多细胞有机体(动物)(例如哺乳动物)的活组织中或其上实施的过程。
如本文所用，“医药组合物”包括本发明偶联物、医药载剂或稀释剂及调配所需的任何其他基质或试剂。
如本文所用，“医药载剂”包括任何及所有生理上相容的溶剂、分散介质、涂布剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗及吸收延迟剂及诸如此类。优选地，载剂适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、脊柱或表皮给予(例如，通过注射或输注)。
实施例
实施例1.PEG蛋白酶(肽酶)可裂解掩蔽剂的合成.除NaHCO3水溶液中的氨基酸的偶合及硅基去保护外的所有反应都是在无水条件下使用新鲜无水溶剂实施。管柱纯化是在硅胶上使用指定洗脱剂进行。质谱(MS)使用电喷雾离子化获得。
在PEGPEG-AA-PABC-PNP的活性碳酸对-硝基苯基-对-酰基酰胺基苄基酯衍生物的制备中，利用PEG的NHS酯或酰化二肽基-对-酰基胺基苯甲醇前体的胺基末端。在以下步骤中，将苄基羟基转化成碳酸对-硝基苯基酯，之后自氨基酸移除保护基团。在一些应用中，在对硝基酚(PNP)-碳酸酯用于修饰某些聚合物时，在聚合物修饰之前移除保护基团(参见图5)。
合成始于H-A1A2-PABA(表2)衍生物的制备。该加合物是利用由Dubowchik等人(2002)所述的合成方案进行一些修饰来获得。Fmoc保护的氨基酸、Fmoc-A1-OH是通过在二环己基碳化二亚胺(DCC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的反应中转化成N-羟基琥珀酰亚胺酯、Fmoc-A1-NHS来活化。在添加的NaHCO3水溶液存在下使该反应性NHS-酯与经保护的氨基酸A2偶合以保持胺基具有反应性。对于1e及1f(表2)的制备，使用市售五氟苯基酯(OPfp)替代NHS酯进行偶合。
Fmoc二肽1a-h的合成.
a)AA的NHS酯是自各别氨基酸与NHS及DCC制得且未经额外纯化即使用(图5A)。
对于Fmoc-Ala-NHS，向Fmoc-Ala-OH(412mg,1.32mmol)及NHS(160mg,1.38mmol)于DCM(13ml)中的冰冷溶液中添加DCC(286mg,1.38mmol)，搅拌30分钟，且随后于20℃下搅拌16h(小时)。过滤出固体二环己基脲(DCU)并在真空中移除溶剂。
对于Fmoc-Asn(DMCP)-NHS，向Fmoc-Asn(DMCP)-OH(298mg,0.68mmol)及NHS(83mg,0.72mmol)于DCM(13ml)中的冰冷溶液中添加DCC(148mg,0.72mmol)，搅拌30分钟，且随后于20℃下搅拌16h。过滤出固体DCU并在真空中移除溶剂。
对于Fmoc-Gly-NHS，于0℃下将Fmoc-Gly-OH(891mg,3mmol)及NHS(380mg,3.3mmol)在THF(10ml)中搅拌5分钟并用THF(5ml)中的DCC溶液(650mg,3.15mmol)处理。在30分钟内移除冷却浴并将反应混合物于20℃下搅拌10h。过滤出固体DCU，用THF洗涤并在旋转蒸发器上移除溶剂。将产物称重并溶解于DME中以制得0.2mM溶液。
对于Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS，向Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-OH(487mg,1mmol)及NHS(127mg,1.1mmol)于THF(5ml)中的冰冷溶液中添加DCC(217mg,1.05mmol)，搅拌15分钟且随后于20℃下搅拌10h。如针对Fmoc-Gly-NHS所述进行处理。
对于Fmoc-Phe-NHS，向Fmoc-Phe-OH(2.11g,5.45mmol)及NHS(664mg,5.77mmol)于DCM(50ml)中的冰冷溶液中添加DCC(1.181g,5.72mmol)，搅拌30分钟，且随后于20℃下搅拌10h。过滤出固体DCU并在真空中移除溶剂。
对于Fmoc-Val-NHS，向Fmoc-Val-OH(339mg,1mmol)及NHS(127mg,1.1mmol)于DCM(13ml)中的冰冷溶液中添加DCC(227mg,1.1mmol)，搅拌30分钟，且随后于20℃下搅拌16h。过滤出固体DCU并在真空中移除溶剂。
b)氨基酸H-Asn(DMCP)-OH及H-Lys(MMT)-OH从有用的Fmoc保护的衍生物制得(参见图5B)。
H-Asn(DMCP)-OH.将Fmoc-Asn(DMCP)-OH(576mg,1.32mmol)在DMF(9ml)中与Et3N(3.7ml,26.4mmol)一起搅拌15h。于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物与醚(30ml)一起研磨三次并在真空中干燥。产率，271mg(96％)。MS:643.6[3M+1]+；451.3[2M+Na]+；429.5[2M+1]+；236.7[M+Na]+；215.3[M+1]+；132.8[M-DMCP+1]+。
H-Lys(MMT)-OH.将Fmoc-Lys(MMT)-OH(4.902g,7.65mmol)于DMF(100ml)中与Et3N(32ml，30当量，229.4mmol)一起搅拌10h。于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物与醚一起研磨两次并在真空中干燥。产率，3.1g(97％)。MS(负模式):455,453.3[M+Cl]-；417.8[M-1]-。
c)Fmoc-A1A2-OH的合成.(图5C.)对于Fmoc-GlyGly-OH1a，将甘胺酸(75mg,1mmol)及NaHCO3(100mg,1.2mmol)溶解于H2O(10ml)及二甲氧基乙烷(DME)(5ml)中。添加DME中的Fmoc-Gly-NHS溶液(5ml,1mmol)。添加THF(2.5ml)，对混合物进行超音波处理以使其均匀并搅拌20h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物，用H2O中的EtOAc及5％KHCO3溶液处理残余物。将产物用EtOAc萃取四次，于pH＝3下用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩并在真空中干燥。产率，321mg(90％)。MS:775.0[2M+2Na]+；377.4[M+Na]+；355.1[M+1]+。
对于Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-OH1b，将甘胺酸(75mg,1mmol)及NaHCO3(84mg,1mmol)溶解于H2O(2ml)、THF(4ml)与DME(5ml)的混合物中。添加DME中的Fmoc-Glu(O-2PhiPr)-NHS溶液(5ml,1mmol)并搅拌10h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物，添加20ml0.1MMES缓冲液(pH＝5)，之后添加EtOAc(25ml)。将反应混合物在冰上搅拌并用5％KHSO4溶液酸化至pH＝5。将产物用EtOAc萃取四次，于pH＝5下用盐水冲洗，干燥(Na2SO4)，浓缩并在真空中干燥。产率，528mg(96％)。MS:567[M+Na]+；562[M+NH4]+；545.0[M+1]+；427.1[M-2PhiPr]+。
对于Fmoc-Asn(DMCP)Gly-OH1c，自Fmoc-Asn(DMCP)-NHS及H-Gly-OH如上文针对1b所述制得。产率，96％。MS:987.4[2M+1]+；516.3[M+Na]+；494.4[M+1]+；412.2[M-DMCP+1]+。
对于Fmoc-PheLys(MMT)-OH1d，自Fmoc-Phe-NHS及H-Lys(MMT)-OH如上文针对1b所述制得。产率，94％。MS:788.5[M+1]+,273.1[M-MMT+1]+。
对于Fmoc-PheCit-OH1e：
i)向含有L-瓜胺酸(1.80g,10.26mmol)及NaHCO3(0.86g,10.26mmol)于H2O(40ml)及THF(20ml)的混合物中的溶液中添加DME(40ml)中的Fmoc-Phe-NHS(4.96g,10.26mmol)。将反应物搅拌15h。过滤来自活化的残余DCC并在旋转蒸发器上移除有机溶剂。向残余物中添加H2O(100ml)及iPrOH(10ml)。将悬浮液用5％KHSO4酸化至pH＝3，将产物用EtOAc:iPrOH＝9:1溶液(3×,500ml)萃取，用盐水:iPrOH＝9:1的混合物(2×,50ml)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，并用油泵干燥。与醚一起研磨，从而得到纯产物1e。产率，3.84g(68％)。MS:545.6[M+Na]+；528.5[M-H2O]+；306.3[M-Fmoc+H2O]+。
ii)向H-Cit-OH(184mg,1.05mmol)及NaHCO3(88.2mg,1.05mmol)于H2O(2.6ml)中的溶液中添加Fmoc-Phe-OPfp(553mg,1mmol)于THF(5ml)中的溶液。添加THF(2ml)以使得溶液均匀并搅拌10h。在旋转蒸发器上移除THF，将残余物用H2O(10ml)及iPrOH(1ml)稀释并用3％HCl酸化至pH＝1。将产物用EtOAc:iPrOH＝9:1溶液萃取5次，用盐水:iPrOH＝9:1的混合物冲洗，干燥(Na2SO4)并在真空中浓缩。与醚一起研磨，从而得到313mg纯产物1e(57％)。
Fmoc-AlaCit-OH1f自Fmoc-Ala-NHS及H-Cit-OH如上文针对1e-(a)所述制得。产率，77％。MS:959.8[2M+Na]+；938.1[2M+1]+；491.4[M+Na]+；469.9[M+1]+。
粗制Fmoc-ValCit-OH1g自Fmoc-Val-NHS及H-Cit-OH如上文针对1b所述制得。通过与醚一起研磨进行最终纯化。总产量，76％。MS:1060.3[2M+3Na]+；1015.7[2M+Na]+；519.7[M+Na]+；497.9[M+1]+。
Fmoc-Ala-Asn(DMCP)-OH1h自Fmoc-Ala-NHS及H-Asn(DMCP)-OH如上文针对1b所述制得。产率，95％。MS:530.2[M+Na]+；508.2[M+1]+；426.0[M-DMCP+1]+。
与对胺基苄醇的偶合、Fmoc-AA-PABA及Fmoc-A-PABA2a-m的制备.
使产物1a-h与对胺基苄醇(PABA)在2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)存在下偶合以形成2a-h。亦制备仅一个氨基酸附接至PABA部分的4种代表性3j-l(图7A)。
对于Fmoc-GlyGly-PABA2a，将1a(318mg,0.9mmol)及PABA(220mg,1.8mmol)于DCM(17ml)及MeOH(6ml)中的溶液与EEDQ(444mg,1.8mmol)一起搅拌10h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物，将残余物与Et2O一起研磨并过滤出产物并在真空中干燥。产率，348mg(84％)。
对于Fmoc-Glu(O-2PhiPr)Gly-PABA2b，将1b(524mg,0.96mmol)及PABA(142mg,1.55mmol)于DCM(10ml)中的溶液与EEDQ(357mg,1.44mmol)一起搅拌10h。如上文针对2a所述进行处理。产率，462mg(74％)。
Fmoc-Asn(DMCP)Gly-PABA2c如上文针对2a所述制得。产率，64％。MS:621.5[M+22]+；599.3[M+1]+。
Fmoc-PheLys(MMT)-PABA2d如上文针对2b所述制得。产率，70％。
对于Fmoc-PheCit-PABA2e，将1e(5.98g,10.97mmol)及PABA(2.70g,21.95mmol)于DCM(150ml)及MeOH(50ml)中的溶液用EEDQ(5.43g,21.95mmol)处理并搅拌15h。如上文针对2a所述进行处理。产率，6.14g(86％)。MS:650.7[M+1]+；527.3[M-PABA+1]+。
对于Fmoc-AlaCit-PABA2f，将1f(2.89g,6.17mmol)及PABA(1.52g,12.34mmol)于DCM(45ml)及MeOH(15ml)中的溶液用EEDQ(3.05g,12.34mmol)处理并搅拌15h。如上文针对2a所述进行处理。产率，4.56g(74％)。MS(ES,负模式):307.4[M-263.6-1]-；349.9[M-Fmoc-1]-；610,608.4[M+HCl-1]-。
Fmoc-ValCit-PABA2g如上文针对2b所述制得。(98％)。
Fmoc-AlaAsn(DMCP)-PABA2h如上文针对2a所述制得。产率，59％。MS:613.2[M+1]+；531.4[M-DMCP+1]+；408.2[M-205+1]+。
对于Fmoc-Lys(CH3)2-PABA2i，将Fmoc-Lys(CH3)2-OH.HCl盐(433mg,1mmol)及PABA(246mg,2mmol)溶解于DCM(10ml)及MeOH(1.5ml)中，冷却至5℃并添加EEDQ(495mg,2mmol)。移除冷却浴且将反应混合物于RT(室温)下搅拌10h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物，将残余物与Et2O一起研磨，并过滤出粗产物。将其重新溶解于DCM(2ml)及MeOH(1ml)的混合物中并通过逐滴至Et2O(40ml)中再次沉淀。过滤产物并在真空中干燥。产率，448mg(83％)。
对于Fmoc-Leu-PABA2j，将Fmoc-Leu-OH(353mg,1mmol),EEDQ(495mg,2mmol)及PABA(222mg,1.8mmol)于DCM(10ml)中的溶液搅拌10h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物，将残余物溶解于Et2O(40ml)中，在干冰上冷藏2h并通过离心分离固体。在管柱上纯化所得粗物质，洗脱剂梯度为CHCl3中的MeOH(1-2％)。产率，444mg(97％)。MS:459.4[M+1]+。
Fmoc-Asn(DMCP)-PABA2k如针对2j所述制得。在处理中，代替管柱纯化，在移除DCM后，将残余物与Et2O一起研磨，冷藏至0℃并过滤出粗产物。将此处理再重复一次，之后在真空中干燥。产率，77％。MS:542.5[M+1]+。
对于Fmoc-Cit-PABA2l，将Fmoc-Cit-OH(345.7mg,0.87mmol)及PABA(214mg,1.74mmol)于DCM(10ml)及MeOH(4ml)中的溶液用EEDQ(430mg,1.74mmol)处理并搅拌15h。将固体产物与醚一起研磨三次，并将产物过滤并干燥。产率，288mg(67％)。MS:502.3[M+1]+；485.5[M-H2O+1]+；263[M-Fmoc-H2O+1]+；179.0[M-306+1]+；120.2[M-365.3+1]+。
产物2m是使用不同方案制得：H-Lys(CH3)2-PABA衍生物3与Fmoc-Phe-NHS偶合(图7B)。
对于Fmoc-PheLys(CH3)-PABA2m，通过与Et3N(3.5ml)一起在DMF(11ml)中搅拌10h使Fmoc-Lys(CH3)2-PABA(2i)(448mg,0.83mmol)的Fmoc去保护。于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物以获得粗产物3i。将此产物溶解于DMF(7ml)中，添加Fmoc-Phe-NHS(482mg,0.996mmol)，之后添加DIEA(0.42ml,2.2mmol)并将混合物搅拌10h。于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除具有DIEA的溶剂以获得粗制2m，其未经额外纯化即使用。MS:549.4[M+1]+。
H-AA-PABA3a-h、m及H-A-PABA3j-l的制备(图7).
如上文针对3i所述将Fmoc-衍生物2a-h、j-l用DMF中的Et3N处理，之后在真空中浓缩并干燥。将粗产物溶解于DMF中以制得0.1M溶液且其未经额外纯化即使用。
表2.H-A1A2-PABA(1-3)的中间体
A1 A2
1、2、3a Gly Gly
1、2、3b Glu(2PhiPr) Gly
1、2、3c Asn(DMCP) Gly
1、2、3d Phe Lys(MMT)
1、2、3e Phe Cit
1、2、3f Ala Cit
1、2、3g Val Cit
1、2、3h Ala Asn(DMCP)
1、2、3i Lys(CH3)2
1、2、3j Leu -
1、2、3k Asn(DMCP) -
1、2、3l Cit -
2、3m Phe Lys(CH3)2
蛋白酶可裂解的PEG-掩蔽试剂的制备.
将H-AA-PABA3b、e、g、h、j、k-m中的任一者的胺基用PEG-酸的NHS酯(DIEA，DMF，5-10h)酰化，以产生22a-k。随后将产物22a-k中的羟基转化成碳酸对-硝基苯基酯((PNP)2CO、二噁烷或THF，40℃至60℃，10h)以产生23a-k。对于23a、d、g，通过用TFA水溶液(TFA/H2O＝3:1，5℃，2-3h)处理移除Asn及Glu的保护基团以获得期望产物24a-c。
PEGn-AA-PABA22a-k的制备(图9).
产物22a(n＝11，AA＝GluGly)，将3b于DMF中的0.1M溶液(3.5ml,0.35mmol)与PEG11-NHS酯(240mg,0.35mmol)及DIEA(0.061ml,0.35mmol)一起搅拌10h。于40℃/油泵下在旋转蒸发器上移除所有挥发物并在管柱上纯化产物，洗脱剂：CHCl3:MeOH:AcOH＝38:2:1。产率，274mg(78％)MS:1015.6[M+NH4]+,998.7[M+1]+。
产物22b(n＝11，AA＝PheCit)。向3e(0.88mmol)及DIEA(167μl,0.96mmol)于DMF(3ml)中的溶液中添加PEG11-NHS酯(0.80mmol)于DMF(3ml)中的溶液。将混合物搅拌16h，过滤并于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将粗制物自CHCl3:MeOH(5ml)在Et2O(45ml)中沉淀并在管柱上纯化，洗脱剂梯度为CHCl3中的MeOH(10-16％)。产率，420mg(53％)。MS:1015.9[M+H2O]+；998.8[M+1]+；981.1[M-H2O]+。
产物22c(n＝11，AA＝ValCit)。产物22f是自粗制3g(自300mg0.5mmol2g获得)、PEG11-NHS酯(298mg,0.435mmol)及DIEA(0.09ml,0.522mmol)如针对22a所述制得。于40℃/油泵下在旋转蒸发器上浓缩后，将产物悬浮于MeOH:DCM＝1:1混合物(6ml)中，超音波处理，过滤并沉淀至Et2O(50ml)中。分离固体并再次重复该程序。在真空中移除残余溶剂。产率，283mg(60％)。MS:951.5[M+1]+。
产物22d(n＝11，AA＝AlaAsn(DMCP))。向3h(0.56mmol)及DIEA(116μl,0.67mmol)于DMF(3ml)中的溶液中添加PEG11-NHS酯(0.56mmol)于DMF(3ml)中的溶液。将混合物搅拌16h，过滤并于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物溶解于CHCl3:MeOH＝1:1混合物(5ml)中并沉淀至冷藏(0℃)的Et2O(45ml)中。在管柱上纯化固体，洗脱剂梯度为DCM中的MeOH(3-14％)。产率，261mg(49％)。MS:983.7[M+Na]+；979.1[M+NH4]+；961.8[M+1]+；943.9[M-H2O+1]+。
产物22e(n＝11，AA＝PheLys(Me2))。产物22e是如针对22a所述制得。使用HPLC管柱NucleodurC-18,250×4.6进行纯化，洗脱剂ACN-H2O(0.1％TFA)自15％增加至30％。MS:998.1[M+1]+。在Dowex1×8树脂上使分离的产物脱盐，洗脱剂是H2O。产率，40％。
产物22f(n＝11,AA＝Leu)。产物22f是如针对22a所述制得且在管柱上纯化，洗脱剂：CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH＝9:7:2:0.04。产率，48％。MS:824.9[M+NH4]+。
产物22g(n＝11,AA＝Asn(DMCP)。将粗制3k(自419mg、0.77mmol2k获得)、Peg11NHS酯(200mg,0.292mmol)及DIEA(0.06ml,0.35mmol)在DCM(5ml)中搅拌10h。在旋转蒸发器上移除溶剂并在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOHAcOH＝4.5:3.5:1:0.02。产率，254mg(37％)。MS:891.1[M+1]+。
产物22h(n＝11AA＝Cit)。向3l(0.50mmol)及DIEA(104μl,0.60mmol)于DMF(2.5ml)中的溶液中添加PEG11-NHS酯(0.50mmol)于DMF(2.5ml)中溶液。将混合物搅拌16h，过滤并于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物溶解于CHCl3:MeOH＝1:1混合物(5ml)中并沉淀至Et2O(45ml)中。再重复沉淀两次且产物未经额外纯化即使用。产率，340mg(80％)。MS:869.4[M+NH4]+；851.9[M+1]+。
产物22i(n＝23，AA＝PheCit)。向3e(0.72mmol)及DIEA(130μl,0.74mmol)于DMF(3ml)中的溶液中添加PEG23-NHS酯(0.60mmol)于DMF(3ml)中的溶液。将混合物搅拌16h，过滤并于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物溶解于CHCl3:MeOH＝1:1混合物(5ml)中并沉淀至Et2O(45ml)中。在管柱上纯化固体产物，洗脱剂梯度为CHCl3中的MeOH(7-12％)。产率，487mg(53％)。MS:1555.2[M+Na]+；1544.7[M+NH4]+；1527.7[M+1]+。
产物22j(具有平均MW1000的PEG。AA＝PheCit)。将mPEG-1000-醇(Fluka)(0.173g,0.173mmol)、碳酸N,N-二琥珀酰亚胺基酯(62mg,0.242mmol)及TEA(0.101ml,0.726mmol)的混合物于MeCN(1ml)中搅拌16h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物并将粗制残余物溶解于CHCl3(10ml)中。将有机层用H2O(1ml,pH＝5)、随后盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，以得到PEG-1000-NHS碳酸酯。将此产物与3e(0.121mmol)及DIEA(30μl,0.173mmol)一起在DMF(1ml)中搅拌16h，过滤并于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物溶解于CHCl3:MeOH＝1:1混合物(5ml)中并沉淀至Et2O(45ml)中。再重复沉淀两次且产物未经额外纯化即使用。产率，134mg(79％)。
产物22k(n＝23，AA＝ValCit)。向3g(1.0mmol)及DIEA(183μl,1.04mmol)于DMF(4ml)中的溶液中添加PEG23-NHS酯(0.87mmol)于DMF(4ml)中的溶液。将混合物搅拌16h，过滤并于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物溶解于CHCl3:MeOH＝1:1混合物(5ml)中并沉淀至Et2O(45ml)中。再重复沉淀两次且产物未经额外纯化即使用。产率，1.0g(77％)。MS:1496.1[M+NH4]+；1479.3[M+1]+。
PEG-AA-PABC-PNP23a-k(图10A)
对于产物23a(n＝11，AA＝Glu(2PhiPr)Gly)，将DCM(15ml)中的产物22a(274mg,0.274mmol)在黑暗中与(PNP)2CO(418mg,1.372mmol)及DIEA(0.143ml,0.823mmol)一起搅拌15h。在旋转蒸发器上移除溶剂且在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3中的4％MeOH、0.2％AcOH。产率，260mg(81％)。MS:1180.7[M+NH4]+。
对于产物23b(n＝11，AA＝PheCit)，将22b(419mg,0.42mmol)、(PNP)2CO(766mg,2.52mmol)及DIEA(263μl,1.52mmol)于二噁烷(4ml)中的溶液在黑暗中于50℃下搅拌15h且在旋转蒸发器上移除所有挥发物。通过于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上DMF的两个连续蒸发移除残余DIEA并在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH(4.5:5:0.5)，之后CHCl3:MeOH(9:1)。产率，390mg(80％)。MS:1181.2[M+NH4]+,1164.2[M+1]+。
对于产物23c(n＝11，AA＝ValCit)，将22c(273mg,0.287mmol)、(PNP)2CO(874mg,2.88mmol)及DIEA(0.3ml,1.72mmol)于1,4-二噁烷(22ml)中的溶液在黑暗中于50℃下搅拌24h。于40℃/油泵下在旋转蒸发器上移除溶剂且在管柱上纯化产物，洗脱剂：CHCl3:EtOAc:MeOH＝16:3:1，之后CHCl3中的12-15％MeOH。产率，163mg(51％)。MS:1116.0[M+1]+。
产物23d(n＝11，AA＝AlaAsn(DMCP))是如23b的制备中所述制得。在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH(9:2:1)。产率，77％。MS:1144.0[M+NH4]+；1127.3[M+1]+。
产物23e(n＝11,AA＝PheLys(Me)2)是如针对23a所述制得且在管柱上纯化，洗脱剂：CHCl3中的10％MeOH、0.2％AcOH。产率，63％。MS:1163.1[M+1]+。
产物23f(n＝11，AA＝Leu)是如针对23c所述仅使用5当量(PNP)2CO及3当量DIEA施加热24h制得。在管柱上纯化产物，洗脱剂梯度为CHCl3中的MeOH(7-12％)。产率，75％。MS:972[M+1]+。
产物23g(n＝11，AA＝Asn(DMCP))是如针对23f所述制得且粗产物未经额外纯化即用于下一步骤。MS:1073.4[M+18]+。
对于产物23h(n＝11，AA＝Cit)，将22h(340mg,0.40mmol)、(PNP)2CO(608mg,2.00mmol)及DIEA(208μl,1.20mmol)于DCM(4ml)中的溶液在黑暗中于30℃下搅拌15h且在旋转蒸发器上移除所有挥发物。通过于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上DMF的两个连续蒸发移除残余DIEA并在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH(7:2.5:0.5)，之后CHCl3中的MeOH(8-14％)的梯度。产率，390mg(80％)。MS:1034.3[M+NH4]+；1016.9[M+1]+。
产物23i(n＝23，AA＝PheCit)是如23b的制备中所述制得且在管柱上纯化，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH(4.5:5:0.5)，之后CHCl3中的MeOH(6-12％)的梯度。产率，86％。MS:1711.4[M+NH4]+；1694.4[M+1]+。
产物23j(PEG1000KAA＝PheCit)是如23b的制备中所述制得且在管柱上纯化，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH(4.5:5:0.5)，之后CHCl3中的MeOH(6-12％)的梯度。产率，72％。
产物23k(n＝23,AA＝ValCit)是如23b的制备中所述制得，且利用HPLC纯化产物。管柱：Luna(Phenomenex)5u，C-8,100A。移动相：ACN-H2O(F3CO2H0.01％)，ACN梯度30-37％，31分钟。产率：530mg(48％)。MS:1666.4[M+Na]+；1644.2[M+1]+。
PEG-AA-PABC-PNP24a-c，AA去保护(图10B)。
产物24a(n＝11，AA＝GluGly)。将产物23a(250mg,0.215mmol)在CHCl3的3％TFA溶液(16ml)中搅拌35分钟，在旋转蒸发器上浓缩且在真空中干燥。产率，224mg(100％)。MS:1062.6[M+NH4]+；1045.9[M+1]+。
产物24b(n＝11，AA＝AlaAsn-PABC-PNP)。将化合物23d在TFA:DCM(3:1)的混合物中搅拌1.5h并于20℃下在旋转蒸发器上移除所有挥发物。在管柱上纯化产物，洗脱剂梯度为CHCl3中的MeOH(6-12％)。产率，30％。MS:1066.7[M+Na]+,1062.0[M+NH4]+；1045.2[M+1]+。
产物24c(n＝11，AA＝Asn)。将具有23g(160mg,0.143mmol)的反应烧瓶冷藏至0℃并添加TFA:H2O(9:1)的冷混合物(12.5ml)。将混合物搅拌1.5h并用冷H2O(50ml)稀释。于20℃下继续搅拌20分钟。过滤出沉淀并用H2O冲洗。于40℃下在旋转蒸发器上移除所有挥发物并在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH＝4.5:3.5:1.2:0.02。产率，43mg(30％)。MS:974.0[M+1]+。
表3.用于偶联物制备的最终PEG-L-A1A2-PABC.
实施例2.RGD配体的合成.
A.RGD-PEG-硫酸酯：
1.RGD模拟物编号1-PEG8-硫酸酯，MW982.1。
2.RGD模拟物编号2-PEG8-硫酸酯，MW1022.2。
3.RGD模拟物编号3-PEG8-硫酸酯，MW1080.2。
4.RGD模拟物编号3-PEG12-硫酸酯，MW1212.4。
B.RGD-HyNic：
1.RGD模拟物编号1-PEG12-HyNic，MW1272。
2.RGD模拟物编号1a-HyNic，MW802.8。
3.RGD模拟物编号1b-HyNic，MW830.9(RGD)。
C.RGE-PEG12-HyNic(对照).MW1282.
D.RGD肽-HyNic：RGD4C,[NH2-ACDCRGDCFCG-Lys(e-6-HyNic)；SEQID5]，MW1407.83。
实施例3.两亲性膜活性多胺的可逆修饰.蛋白酶可裂解掩蔽剂至含胺聚合物的键-胺基甲酸对-酰基酰胺基苄基酯键的形成.
A.RGD-PEG-硫酸酯.
于RT下将Cy3标记的聚合物与SPDP-PEG24-FCit-对-硝基酚以期望比率在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中合并1h。随后于RT下使SPDP-PEG24-FCit修饰的聚合物与PEG12-FCit以1:8的重量比(聚合物:PEG12-FCit)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后使用sephadexG-50离心管纯化经修饰的聚合物。
SPDP-PEG24-FCit(n＝23)
PEG12-FCit(n＝11)
于RT下利用羟基胺以1:5的摩尔比(RGD-PEG-硫酸酯模拟物:羟基胺)在PBS(pH7.4)中使RGD-PEG-硫酸酯模拟物去酰化2h。
于RT下将经修饰的聚合物与去酰化RGD-PEG-硫酸酯模拟物以1:1的重量比(聚合物:RGD)在PBS(pH7.4)中合并最少4h以形成聚合物RGD偶联物。使用sephadexG-50离心管纯化聚合物-RGD偶联物。
通过使用吡啶2-硫酮的8.08×103M-1cm-1的消光是数量测343nm处的聚合物-RGD偶联物的吸光度定量结合效率。
(*在sephadexG-50纯化之前)
将聚合物-RGD偶联物用等渗葡萄糖溶液稀释至期望浓度。
B.RGD-PEG-HyNic.
于RT下将Cy3标记的聚合物与醛-PEG12/24-TFP(QuantaBiodesign编号10082)以期望比率在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中合并1h。随后于RT下使醛-PEG12/24-TFP修饰的聚合物与PEG12-FCit以1:8的重量比(聚合物:PEG12-FCit)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后使用sephadexG-50离心管纯化经修饰的聚合物。
醛-PEG24-TFP(n＝12或24)
于RT下将经修饰的聚合物与RGD-HyNic模拟物以1:0.7的重量比(聚合物:RGD)在50mMMES(pH5.0)缓冲液中合并最少4h以形成聚合物RGD偶联物。使用sephadexG-50离心管纯化聚合物-RGD偶联物。
通过使用双-芳基腙键的2.9×101M-1cm-1的消光系数量测354nm处的聚合物-RGD偶联物的吸光度定量结合效率。
将聚合物-RGD偶联物用等渗葡萄糖溶液稀释至期望浓度。
实施例4.用PEG蛋白酶可裂解掩蔽剂修饰多胺.使对-酰基酰胺基苄醇衍生物的活化(胺反应性)碳酸酯与两亲性膜活性多胺的胺基在H2O中于pH>8下反应，以产生胺基甲酸对-酰基酰胺基苄基酯。
R1包含PEG，
R2是两亲性膜活性多胺，
AA是二肽(经保护或未经保护)，且
Z是胺反应性碳酸酯。
向×mg聚合物中添加等渗葡萄糖中的12×mgHEPES游离碱。向缓冲聚合物溶液添加DMF中的2×至16×mg200mg/ml二肽掩蔽剂。在一些应用中，用2×mg二肽掩蔽剂修饰聚合物，之后附接siRNA。随后用6×至8×mg二肽掩蔽剂进一步修饰聚合物-siRNA偶联物。
实施例5.偶联物调配.
A.使用RGD-PEG-硫酸酯及PEG-二肽掩蔽剂的siRNA递送偶联物的形成.
于RT下使指示聚合物与SMPT以1:0.015的重量比(聚合物:SMPT)在5mMHEPES(pH8.0缓冲液)中反应1h。
随后于RT下使SMPT修饰的聚合物与SPDP-PEG24-FCit以期望比率反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与PEG12-FCit以1:2的重量比(聚合物:PEG12-FCit)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与SATA-siRNA以1:0.2的重量比(聚合物:SATA-siRNA)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应过夜以附接siRNA。接下来，于RT下使经修饰的聚合物与PEG12-FCit以1:6的重量比(聚合物:PEG12-FCit)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。使用sephadexG-50离心管纯化所得偶联物。
通过于RT下与经修饰的聚合物以1:1的重量比(聚合物:RGD-PEG-硫醇)在PBS(pH7.4)中反应最少4h将去酰化RGD-PEG-硫酸酯结合至经修饰的聚合物以形成RGD-偶联物。使用sephadexG-50离心管纯化偶联物。如上文所述测定RGD靶向配体结合效率且发现为3.5及21个RGD配体/42K未经修饰的聚合物。
B.使用RGD-PEG-HyNic及PEG-二肽掩蔽剂的siRNA递送偶联物的形成.
1)方案1.于RT下使指示聚合物与SMPT以1:0.015的重量比(聚合物:SMPT)在5mMHEPES(pH8.0缓冲液)中反应1h。
随后于RT下使SMPT修饰的聚合物与醛-PEG-二肽掩蔽剂(醛-PEG12-FCit或醛-PEG24-ACit)以期望比率反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与PEG12-二肽掩蔽剂(PEG12-FCit、PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1:2的重量比(聚合物:PEG)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与SATA-siRNA以1:0.2的重量比(聚合物:SATA-siRNA)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应过夜以附接siRNA。接下来，于RT下使经修饰的聚合物与蛋白酶可裂解PEG(PEG12-FCit或PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1:6的重量比(聚合物:PEG)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。使用sephadexG-50离心管纯化所得偶联物。
通过于RT下与经修饰的聚合物以1:0.7的重量比(聚合物:RGD-HyNic模拟物)在50mMMES(pH5.0缓冲液)中反应最少4h将RGD-HyNic(实施例2B)附接至经修饰的聚合物以形成全递送偶联物。使用sephadexG-50离心管纯化偶联物。如上文所述测定RGD配体附接效率。
2)方案2.于RT下使指示聚合物与SMPT以1:0.015的重量比(聚合物:SMPT)在5mMHEPES(pH8.0缓冲液)中反应1h。
随后于RT下使SMPT修饰的聚合物与醛-PEG-二肽掩蔽剂(醛-PEG24-ACit)以1:0.5的重量比(聚合物:PEG)及与PEG-二肽掩蔽剂(PEG12-FCit、PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1:2的重量比(聚合物:PEG)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与SATA-siRNA以1:0.2的重量比(聚合物:SATA-siRNA)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应过夜以附接siRNA。接下来，于RT下使经修饰的聚合物与蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-FCit或PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1:6的重量比(聚合物:PEG)在100mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。
通过于RT下与经修饰的聚合物以1:0.7的重量比(聚合物:RGD-HyNic)在69mM盐酸溶液(HCl)中反应过夜将RGD-HyNic(实施例2B)附接至经修饰的聚合物以形成全偶联物。如上文所述测定RGD配体附接效率。
3)方案3.于RT下使指示聚合物与SMPT以1:0.015的重量比(聚合物:SMPT)在5mMHEPES(pH8.0缓冲液)中反应1h。
随后于RT下使SMPT修饰的聚合物与醛-PEG-二肽掩蔽剂(醛-PEG24-ACit)以1:0.5的重量比(聚合物:PEG)及与PEG-二肽掩蔽剂(PEG12-FCit、PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1:2的重量比(聚合物:PEG)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与SATA-siRNA以1:0.2的重量比(聚合物:SATA-siRNA)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应过夜以附接siRNA。接下来，于RT下使经修饰的聚合物与蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-FCit或PEG12-ACit或PEG24-ACit)以1:6的重量比(聚合物:PEG)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。
通过于RT下与经修饰的聚合物以1:0.7的重量比(聚合物:RGD-HyNic模拟物)在100mMMES游离酸溶液中反应过夜将RGD-HyNic(实施例2B)附接至经修饰的聚合物以形成全递送偶联物。如上文所述测定RGD靶向配体结合效率。
4)方案4.于RT下使指示聚合物与迭氮基-PEG4-NHS以1:0.015的重量比(聚合物:迭氮基)在5mMHEPES(pH8.0缓冲液)中反应1h。
随后于RT下使迭氮基修饰的聚合物与醛-PEG-二肽掩蔽剂(醛-PEG24-ACit)以1:0.5的重量比(聚合物:PEG)及与PEG-二肽掩蔽剂(PEG12-ACit)以1:2的重量比(聚合物:PEG)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与炔烃-siRNA以1:0.2的重量比(聚合物:炔烃-siRNA)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应过夜以附接siRNA。接下来，于RT下使经修饰的聚合物与蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-ACit)以1:6的重量比(聚合物:PEG)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。
通过于RT下与经修饰的聚合物以1:0.7的重量比(聚合物:RGD-HyNic模拟物)在100mM乙酸钠-乙酸缓冲液溶液(pH5.0)中反应过夜将RGD-HyNic(实施例2B)附接至经修饰的聚合物以形成全递送偶联物。如上文所述测定RGD靶向配体结合效率。
5)方案5.于RT下使单迭氮化物-聚合物与醛-PEG-二肽掩蔽剂(醛-PEG24-ACit)以1:0.5的重量比(聚合物:PEG)及与PEG-二肽掩蔽剂(PEG12-ACit)以1:2的重量比(聚合物:PEG)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。随后于RT下使经修饰的聚合物与炔烃-siRNA以1:0.2的重量比(聚合物:炔烃-siRNA)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应过夜以附接siRNA。接下来，于RT下使经修饰的聚合物与蛋白酶可裂解-PEG(PEG12-ACit)以1:6的重量比(聚合物:PEG)在50mMHEPES(pH9.0缓冲液)中反应1h。
通过于RT下与经修饰的聚合物以1:0.7的重量比(聚合物:RGD-HyNic模拟物)在100mM乙酸钠-乙酸缓冲液溶液(pH5.0)中反应过夜将RGD-HyNic(实施例2B)附接至经修饰的聚合物以形成全递送偶联物。如上文所述测定RGD靶向配体结合效率。
实施例6.活体外细胞结合.将肿瘤细胞以50,000/ml以2ml接种至6孔板中的盖玻片上24h。向细胞中逐滴添加5μg/mlCy3标记的RGD-PEG-硫酸酯或Cy3标记的RGD-PEG-HyNic(方案1-5)修饰的聚合物(50μl0.2mg/ml，RGD-PEG，RGD编号1)并将细胞于37℃下培育24h。将细胞用PBS洗涤2次并固定于10％福尔马林(formalin)中溶液或30分钟。在固定后，将细胞用PBS洗涤2次。
将细胞分别用AlexaFluor488鬼笔环肽(phalloidin)(2单元/ml)及ToPro-3碘化物(0.2μM)染色20分钟以对肌动蛋白及核进行染色；之后用PBS洗涤2次。用Vectashield封固剂将盖玻片安装至载玻片且随后利用ZeissLSM710雷射扫描共焦显微镜捕获荧光信号。通过细胞内Cy3荧光的存在测定RDG修饰的多胺的细胞摄取。各种类型的肿瘤细胞中的Cy3信号强度概述于下表4中(5：最高；1：最低)。
表4.RDG修饰的多胺的肿瘤细胞摄取
细胞系 来源 RGD-聚合物内化
A498 肾癌 5
ACHN 肾癌 5
CAKI-2 肾癌 5
769-P 肾癌 5
786-O 肾癌 3
A375 黑色素瘤 3
U87MG 胶质母细胞瘤 3
PANC-1 胰脏癌 4
H460 肺癌 3
H661 肺癌 3
H1573 肺癌 4
H2126 肺癌 3
HT29 结肠癌 3
HCT116 结肠癌 2
HepG2 肝癌 3
Hep3B 肝癌 1
MCF7 乳腺癌 2
SK-BR3 乳腺癌 2
DU145 前列腺癌 1
PC3 前列腺癌 1
LNCaP 前列腺癌 1
MDA-PCa-2b 前列腺癌 1
KB 口腔癌 1
CAL27 舌癌 2
SCC9 舌癌 1
Detroit562 咽癌 2
OVCAR3 卵巢癌 1
SKOV3 卵巢癌 2
A2780 卵巢癌 2
实施例7.活体中肿瘤追踪.通过尾静脉给予将100-200μg(200μl0.5mg/ml或1mg/ml)等渗葡萄糖中的Cy3标记的RGD(硫醇-RGD编号1)/PEG修饰的Lau1005-116C-1(54％乙基乙氧基胺丙烯酸酯/46％丙烯酸丁酯RAFT共聚物，部分1，104k保护的MW，76k去保护的MW，1.2PDI)注射至具有人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠中。注射后4h，将动物处死并收获肿瘤。通过在10％福尔马林溶液培育最少4h固定全肿瘤。随后将肿瘤浸没至30％蔗糖溶液中过夜或直至平衡为止。将饱和肿瘤在液氮中急速冷冻，并在载玻片(VWRsuperfrost加上微小载玻片)上冰冻切片成7μm切片。随后于RT下将切片用AlexaFluor488鬼笔环肽(2单元/ml)及ToPro-3碘化物(0.2μM)染色20分钟。在染色后，将切片用PBS洗涤2次并在顶部使用Vectashield封固剂安装盖玻片并利用ZeissLSM710雷射扫描雷射共焦显微镜观察。获取代表性影像以图解说明Cy3荧光的组织及细胞分布。在A498肿瘤模型中，RGD修饰的聚合物深度渗透至肿瘤组织中并进入肿瘤细胞，此与肿瘤植入的位置(皮下、肝或肾)无关。对照聚合物(无RGD(仅PEG)或RGE修饰)主要保留于脉管系统中，而不进入肿瘤细胞。在肝植入的HepG2肿瘤模型中，观察到强RGD-偶联物渗透至肿瘤组织中。
实施例8.活体中肿瘤mRNA敲除.通过尾静脉给予将等渗葡萄糖(500μg；300μl1.67mg/ml)中的RGD-靶向偶联物注射至具有人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠中。注射后72h，处死动物并收获肿瘤。使肿瘤组织在三重试剂(Trireagent)(MolecularResearchCenter)中均质化以分离总RNA。通过使用定量RT-PCR测定相对mRNA敲除。
实施例9.原位肾细胞癌(RCC)肿瘤小鼠模型.使A498细胞(ATCC)在补充有10％FBS(Invitrogen)的MEM(Invitrogen)中生长。使786-ORCC细胞(ATCC)在1×MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen)及补充有10％FBS的RPMI(Invitrogen)中生长。收集细胞，计数并与基质胶基质HC(BDBiosciences，30体积％)在冰上混合。
将雌性无胸腺裸小鼠用约3％异氟烷麻醉并放置于右侧卧位处。在左肋中切开小的(0.5-1cm)纵向腹部切口。使用润湿棉签，自腹膜抬出左肾并轻柔稳定。在即将注射之前，向1.0ml注射器填充细胞/基质胶混合物并将27号针导管附接至注射器尖端。随后将填充注射器附接至注射器泵(HarvardApparatus，PHD2000型)并预处理以移除空气。在尾极附近的肾小囊正下方插入附接至注射器的27-号针导管的尖端且随后将针的尖端沿囊小心地向颅前进3-4mm。使用注射器泵将10μl含有约200,000个细胞的2.5:1(vol:vol)细胞/基质胶混合物的等份试样缓慢注射至肾实质内。将针留在肾中15-20秒以确保注射完成。随后自肾移除针并将棉签放置在注射位点上30秒以防止细胞泄漏或流血。随后将肾轻柔地放回腹部中并闭合腹壁。植入后三(3)周，通过安乐死后可视检查及量测评价肿瘤进展。对于大多数研究而言，在肿瘤量测通常是约4-8mm时，在植入后5至6周使用肿瘤小鼠。
实施例10.皮下(SQ)肿瘤.对于SQ肿瘤植入，通过将小鼠放置于具有3％异氟烷的诱导室中诱导麻醉。在麻醉后，将小鼠放置于布帘上并通过头锥体补充3％异氟烷麻醉。将小鼠定位于其侧面(右侧或左侧)并向相对肋中实施注射。在即将注射之前，向1.0ml注射器填充细胞/基质胶混合物并将27号针导管附接至注射器尖端。随后将填充注射器附接至注射器泵(HarvardApparatus，PHD2000型)并预处理以移除空气。在皮肤层正下方肋中插入针并以250μl/分钟的速率注射细胞(10μl或20μl)。在注射后，移除针并将小鼠放置于由放置于笼下方的水夹套加热垫供热的回收笼中。在动物重新获得正常活性程度后，使其返回至其圈养槽。
实施例11.肝肿瘤模型.将HepG2细胞与2个表达载体(pMIR85人类胎盘分泌的碱性磷酸酶(SEAP)载体及pMIR3新霉素/卡那霉素(kanamycin)抗性基因载体)共转染，以形成具有稳定SEAP表达的细胞系。使细胞在补充有10％FBS及300μg/mlG418的DMEM中生长。使HT-29结肠癌细胞在补充有10％FBS的McCoy的5A培养基中生长。对于肿瘤植入，收集细胞，计数并与基质胶(BDBiosciences，40体积％)混合。将无胸腺裸小鼠用约3％异氟烷麻醉并放置于胸骨侧卧位处。在剑状软骨正下方切开小的(1-2cm)中线腹部切口。使用润湿棉签，轻柔地自腹部取出左肝叶。使左肝叶轻柔地收缩并将注射器针插入左叶中部。在即将注射之前，向1.0ml注射器填充细胞/基质胶混合物并将27号针导管附接至注射器尖端。随后将填充注射器附接至注射器泵(HarvardApparatus，PHD2000型)并预处理以移除空气。在肝囊正下方约0.5cm斜向下插入注射器针。使用注射器泵将10μl含有100,000个细胞的细胞/基质胶混合物注射至肝中。将针留在肝中15-20秒以确保注射完成。随后自肝移除针并将棉签放置在注射位点上以防止细胞泄漏或流血。基质胶/细胞混合物形成在移除针后可见且不消失的团块。随后将肝叶轻柔地放回腹部中并闭合腹壁。对于HepG2肿瘤小鼠，在肿瘤植入后每周收集一次血清并使其经受SEAP分析以监测肿瘤生长。对于大多数研究而言，在基于SEAP值预测肿瘤量测通常为约4-8mm时，在植入后4至5周使用肿瘤小鼠。对于HT-29肿瘤小鼠而言，基于历史观察，在肿瘤通常达到4-8mm长及宽时，在植入后5至6周使用肿瘤小鼠。
实施例12.定量实时PCR分析.在定量PCR的制备中，遵循制造商的方案自三重试剂(MolecularResearchCenter,Cincinnati,OH)中均质化的组织试样分离总RNA。使用高容量cDNA逆转录套组(LifeTechnologies)逆转录约500ngRNA。对于人类(肿瘤)Aha1表现，在一式三份双重反应中使用TaqManGeneExpressionMasterMix(LifeTechnologies)或VeriQuestProbeMasterMix(Affymetrix)来使用对人类Aha1(分析ID：Hs00201602_m1)及CycA(部分编号：4326316E)的预制造的TaqMan基因表现分析。对于人类(肿瘤)EG5表现，在一式三份双重反应中使用TaqManGeneExpressionMasterMix(LifeTechnologies)或VeriQuestProbeMasterMix(Affymetrix)来使用对人类EG5(分析ID：Hs00189698_m1)及CycA(部分编号：4326316E)的预制造的TaqMan基因表现分析。通过使用7500Fast或StepOnePlus实时PCR系统(LifeTechnologies)实施定量PCR。使用ΔΔCT方法以计算相对基因表现。
实施例13.活体中肾细胞癌肿瘤基因的敲除.通过使用RGD模拟物编号1-PEG-硫酸酯或RGD模拟物编号1-PEG-HyNic形成RGD靶向的siRNA递送偶联物。利用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG24-FCit(利用RGD模拟物编号1-PEG-HyNic使用1号方案)或SPDP-PEG24-FCit(利用RGD-PEG-硫酸酯)及100μgAha1siRNA修饰500μgLau41648-106聚合物。如所述生成具有肾RCC肿瘤的小鼠且用Aha1偶联物的单一尾静脉注射处理。注射后72h使小鼠无痛致死且遵循制造商的建议使用Trizol试剂自肾肿瘤制备总RNA。与仅用递送缓冲液处理的小鼠相比，通过如所述RT-qPCR测定相对Aha1mRNA含量。无靶向配体或RGE对照配体调配的偶联物呈现基因表现降低25-35％。RGD靶向的偶联物呈现肿瘤Aha1表现的50-70％基因减少(n＝3或4)。
表5.在用单一剂量的Aha1siRNA偶联物处理后小鼠中的原位肾RCC肿瘤中的相对肿瘤Aha1mRNA含量.
处理 肿瘤中的相对人类Aha1mRNA含量(％)
递送缓冲液(IG) 100±14
无配体-偶联物 64±2
HyNic-RGE模拟物编号1-偶联物 75±5
硫醇-RGD模拟物编号1-偶联物 31±436 -->
HyNic-RGD模拟物编号1-偶联物 42±8
HyNic-RGD4C-偶联物(CS Bio) 52±14
用非靶向偶联物(无配体或RGE模拟物(阴性对照配体))处理的动物中的基因敲除可能是通过增强的渗透及滞留(EPR)效应的肿瘤中的偶联物被动累积的结果(Torchilin,2011)。偶联物的长血清稳定性及循环容许通过EPR肿瘤大量累积。尽管如此，与被动靶向的偶联物相比，RGD靶向的偶联物呈现基因表现额外降低20-40％。
实施例14.活体中肾细胞癌肿瘤基因的敲除.使用RGD模拟物编号1-PEG及1号方案形成RGD模拟物编号1靶向的siRNA递送偶联物。用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG24-FCit及100μgAha1siRNA修饰500μgLau41648-106聚合物。使用RGD模拟物编号1-PEG-HyNic作为该试样的靶向配体。如所述生成含有转移性(皮下)及原位肾RCC肿瘤的小鼠且用Aha1偶联物的单一尾静脉注射处理。注射后72h使小鼠无痛致死且遵循制造商的建议使用Trizol试剂自肾肿瘤制备总RNA。通过如上文所述RT-qPCR测定肿瘤植入位点处的相对人类(肿瘤)Aha1mRNA含量且将其正规化至仅注射递送缓冲液的小鼠。RGD靶向的偶联物呈现肿瘤Aha1表现的基因减少40-50％(n＝3或4)。
表6.在用单一剂量的Aha1siRNA偶联物处理后小鼠中的原位肾或转移性皮下RCC肿瘤中的相对肿瘤Aha1mRNA含量.
处理 肿瘤 相对肿瘤Aha1mRNA含量(％)
递送缓冲液 肾 100±7
HyNic-RGD模拟物编号1-偶联物 肾 49±14
递送缓冲液 皮下 100±6
HyNic-RGD模拟物编号1-偶联物 皮下 59±3
实施例15.RDG靶向的siRNA递送偶联物将siRNA递送至多种肿瘤类型。侵袭肝的癌症包括源自肝组织的癌症(例如肝细胞癌，HCC)及源自其他组织(例如结肠、肺、肾或乳房)的转移性癌症。将已知在活体外表现αvβ3整联蛋白且结合至RGD-偶联物的各种癌细胞类型植入肝中。使用RGD模拟物编号1-HyNic或RDG模拟物编号1-PEG-硫酸酯形成RGD靶向的siRNA递送偶联物。用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG24-FCit(1号或5号方案)或8×PEG12-FCit-/0.5×SPDP-PEG24-FCit(使用RGD-PEG-硫酸酯方案)及100μgAha1siRNA修饰500μgLau41648-106聚合物。随后用单一剂量的Aha1siRNA递送偶联物通过尾静脉注射给予来处理具有肿瘤的小鼠。注射后72h使小鼠无痛致死且遵循制造商的建议使用Trizol试剂自肝肿瘤制备总RNA。对于每一肿瘤类型，将肿瘤Aha1mRNA含量正规化至仅服用递送缓冲液的小鼠中的肿瘤。RGD靶向的偶联物呈现肿瘤Aha1基因表现降低50-60％(n＝3或4)。
表7.在用单一剂量的Aha1siRNA偶联物处理后小鼠中的各种肝肿瘤中的相对肿瘤Aha1mRNA含量.
实施例16.利用不同聚合物种类的RGD-偶联物调配.
聚合物Emi1034-68C-1
聚合物Emi1034-81F-1
聚合物LH1073-20C-1
使用RGD模拟物编号1b及2号方案形成RGD模拟物编号1靶向的siRNA递送偶联物，用8×PEG12ACit/0.5×醛-PEG24-ACit及80μgAha1siRNA修饰400μgEmi1034-68C-1、Emi1034-81F-1或LH1073-20C-1聚合物。使用RGD模拟物编号1b作为该调配物的靶向配体。随后用单一剂量的通过尾静脉注射给予的Aha1偶联物处理具有原位RCC肿瘤的小鼠。注射后72h使小鼠无痛致死且遵循制造商的建议使用Trizol试剂自肝肿瘤制备总RNA。将肿瘤Aha1mRNA含量正规化至仅服用递送缓冲液的小鼠中的肿瘤。
表8.在用单一剂量的Aha1siRNA偶联物处理后小鼠中的原位肾RCC肿瘤中的相对肿瘤Aha1mRNA含量.
实施例17.具有ACit或FCit二肽掩蔽试剂的RGD-偶联物调配物.使用RGD模拟物编号1b及2号方案形成RGD模拟物编号1靶向的siRNA递送偶联物。用8×PEG12-FCit/0.5×醛-PEG12-FCit(对FCit二肽掩蔽的递送偶联物)或8×PEG12-ACit/0.5×醛-PEG24-ACit(对于ACit二肽掩蔽的递送偶联物)及80μgAha1siRNA修饰400μgEmi1034-68C-1聚合物。使用RGD模拟物编号1b-HyNic作为该调配物的靶向配体。随后用单一剂量的通过尾静脉注射给予的Aha1siRNA递送偶联物处理具有原位RCC肿瘤的小鼠。注射后72h使小鼠无痛致死且遵循制造商的建议使用Trizol试剂自肝肿瘤制备总RNA。将肿瘤Aha1mRNA含量正规化至仅服用递送缓冲液的小鼠中的肿瘤。ACit或FCitsiRNA递送偶联物之间的基因敲除功效无明显差异。对于ACit或FCit偶联物，RGD靶向的偶联物分别呈现肿瘤Aha1基因表达降低51％或53％(n＝3)。
表9.在用单一剂量的Aha1siRNA偶联物处理后小鼠中的原位肾RCC肿瘤中的相对肿瘤Aha1mRNA含量.
实施例18.siRNA.siRNA具有以下序列：
AhaIsiRNA：
有义：(NH2C6)GfgAfuGfaAfgUfgGfaGfaUfuAfgUf(invdT)(SEQID3)
反义：pdAsCfuAfaUfcUfcCfaCfuUfcAfuCfcdTsdT(SEQID4)
p＝磷酸酯
核苷酸之前的d＝2'-脱氧
s＝硫代磷酸酯键
核苷酸之后的f＝2'-F取代
小写字＝2'-O-CH3取代
在固体相上通过常规亚磷酰胺化学在作为固体载体的Oligopilot100(GEHealthcare,Freiburg,Germany)或Mermade12(Bioautomation,PlanoTexas)及可控孔玻璃(CPG)上实施RNA合成。
实施例19.炔烃二硫键有义链RNA偶联物的合成.于-80℃下使用EtOH中的乙酸钠(0.3M)沉淀5'C-6胺基修饰的粗制有义链RNA(3.4mg,506nmol)，冻干，并溶解于300μL0.2MNaHCO3(pH8-9)中。将二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺基(二苯并环辛炔-S-S-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(DBCO-NHS)，项目号761532Aldrich)(2.86mg,5060nmol)溶解于286μLDMF中并添加至RNA溶液中。将反应混合物充分混合并使其于RT下进行2h。使用RP-HPLC监测反应。在反应完成后，将反应混合物干燥并使用RP-HPLC纯化。以45％产率(229nmol)制备RNA偶联物。通过RP-HPLC测定RNA偶联物的纯度(纯度：96.6％)并通过MALDI-TOF/TOF确认身份(计算的质量7164.0；观察的质量：7164.8)。
实施例20.4-(Fmoc-4-胺基苯氧基)丁酸的合成.
A.3的合成：将对-硝基-酚(2)(7.5g,53.9mmol)与4-溴丁酸乙基酯(8.45ml,5.9mmol)及K2CO3(7.5g,5.4mmol)在DMF(75ml)中合并并于100℃下搅拌2h。移除DMF并将粗制物稀释于2NNaOH与甲醇的3:1混合物的混合物中并于RT下搅拌4h。用6MHCl酸化反应混合物。收集白色沉淀(10.9g，90％产率)。[1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:12.165(bs,1H)δ:8.175(AA’,J＝Hz,2H)δ:7.120(AA’,J＝Hz,2H),δ:4.122(t,J＝6.8Hz,2H),δ:2.379(t,J＝6.8Hz,2H),δ:1.975(p,J＝6.8Hz,2H)]
B.4的合成：将3(37.1g,mmol)与甲酸铵(35g,mmol)一起溶解于MeOH(1L)中并添加10％Pd/C(Degussa型)(3.5g)。将混合物于65℃下回流过夜。用硅藻土过滤反应物，以产生红褐色固体(30.5g，95％产率)。[1H-NMR(400MHz,DMSO),δ:6.609(AA’,J＝Hz,2H)δ:6.470(AA’,J＝Hz,2H),δ:3.790(t,J＝6.8Hz,2H),δ:2.288(t,J＝7.2Hz,2H),δ:1.832(p,J＝7.2Hz,2H)]
C.4-(Fmoc-4-胺基苯氧基)丁酸(1)的合成：将4(5.1g,26mmol)溶解于饱和碳酸氢钠水溶液与THF的6:4混合物(300ml)中以制备白色浆液。添加Fmoc-OSu(8.82g,26.1mmol)并将反应物搅拌4h。移除丙酮，酸化反应物并收集米色沉淀并在1NHCl中研磨，以产生9.6g产物(88％产率，分子量389.40066)。[1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:9.508(bs,1Hz),δ:7.885(d,J＝7.6,2Hz,2H),δ:7.727(d,J＝6.8Hz,2H),δ:7.389-7.32(bm,7H),δ:7.328(dd,J＝6.8,6.4Hz,2H),δ:6.828(d,J＝7.6Hz,2H),δ:4.435(d,J＝6.0Hz,2H),δ:4.275(t,J＝6.4Hz,1H),δ:3.897(t,J＝6.0Hz,2H),δ:2.335(t,J＝7.2Hz,2H),δ:1.885(p,J＝7.2Hz)]
所用试剂：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇(MeOH)、H2O(HPLC级)、丙酮、对-硝基酚、4-溴丁酸乙基酯、碳酸钾、Pd/C(Degussa型)是自SigmaAldrich购得且原样使用。Fmoc-OSu是自Novabiochem购得。
实施例21.胍基-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-HyNic-Boc的合成.
Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH
2
A.Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH(2).将Fmoc-Gly-OH(CAS29022-11-5)(1.57g,5.28mmol)溶解于THF(30ml)中并设置在冰水浴中搅拌。向溶液中添加NHS(0.668g,5.81mmol)及DCC(1.2g,5.81mmol)，搅拌5分钟，并移除冰浴。将反应混合物于20℃下搅拌16h，冷却至0℃并保持1h，随后过滤，浓缩并在真空中干燥。将粗产物溶解于THF(20ml)中并添加至H-Asp(2-PhiPr)-OH(CAS200336-86-3)(1.328g,5.28mmol)及NaHCO3(600mg,7.14mmol)于H2O(30ml)中的溶液。添加1,2-二甲氧基乙烷(DME,30ml)以使溶液均匀并搅拌16h。在旋转蒸发器上移除THF及DME，将残余物用H2O(150ml)稀释并用3％HCl酸化至pH＝3，以产生Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-OH(2)。将产物用EtOAc萃取5次，用盐水冲洗，干燥(Na2SO4)并在真空中浓缩并干燥。产率，2.54g。粗产物用于下一步骤，假定100％产率。
B.Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-BAPOA-Boc(3).将二肽2(1.168g,2.2mmol)溶解于DCM(20ml)中并设置在冰水浴中搅拌。向溶液中添加NHS(291mg,2.53mmol)及DCC(522mg,2.53mmol)，于0℃下搅拌5分钟且随后于20℃下搅拌16h。将反应混合物在冰浴上冷却1h，过滤并在真空中浓缩并干燥。将所得NHS衍生物溶解于DCM(15ml)中并添加至4-[3-(Boc-胺基)丙-1-基氧基]-苯胺(APOA-Boc,644mg,2.42mmol)(Quelever、Frederic.及KrausOrganic&BiomolecularChemistry,1(10),1676-1683；2003)及TEA(175μl,1.25mmol)的溶液。将反应物于20℃下搅拌3h并添加1,4-二噁烷(10ml)。在真空中移除所有挥发物。将残余物溶解于EtOAc(200ml)中，用5％KHSO4(2×40ml)、水(1×40ml)、浓碳酸氢钠溶液(1×40ml)及盐水(1×40ml)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，随后在真空中浓缩并干燥。产率，1.714g。粗产物，Fmoc-Gly-Asp(O-2PhiPr)-BAPOA-Boc(3)用于下一步骤中，假定100％产率。
C.Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOAHCl盐(4).将化合物3(800mg,1.02mmol)用HCl于二噁烷(4M,22ml)中的冰冷溶液处理并于0℃下搅拌45分钟。移除冷却浴并浓缩悬浮液。将残余物悬浮于CHCl3(2.5ml)中，添加二乙醚(45ml)，且分离固体。将4-[3-(胺基)丙-1-基氧基]-苯胺(APOA)衍生物的HCl盐的再沉淀程序重复两次且在真空中干燥产物。产率：557mg(92％)。
D.Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-NH-Boc(5)。于0℃下向含有Boc-Peg12-CO2H(QuantaBiodesignLimited10761,803mg,1.12mmol)于DCM(8ml)中的溶液中添加NHS(193mg,1.68mmol)，之后添加DCC(346mg,1.68mmol)。移除冷却并继续搅拌24h。将反应混合物冷藏至-20℃，过滤并浓缩。将NHS衍生物用化合物4(667mg,1.12mmol)及DIEA(154μl,0.89mmol)于DMF(14ml)中的溶液处理，搅拌16h，过滤并浓缩。通过急骤SiO2层析用DCM:MeOH:乙酸(92.5:7:0.5)洗脱纯化所得粗制残余物。产率：575mg(41％)。
E.Fmoc-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-NH2(6).将化合物5(140mg,0.11mmol)用TFA(3ml)及H2O(1ml)处理。将混合物搅拌20分钟，用冷H2O稀释并在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将残余物与Et2O一起研磨3次，在真空中干燥且未经进一步纯化即使用。产率：115mg(90％)。
F.H2N-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-HyNic-Boc(7).向含有6(105mg,0.091mmol)及DIEA(31μl,0.18mmol)于DCM(3ml)中的溶液中添加Boc-HyNic-NHS(Abrams,M.J.、Juweid,M.、Tenkate,C.I.、Schwartz,D.A.、Hauser,M.M.、Gaul,F.E.、Fuccello,A.J.、Rubin,R.H.、Strauss,H.W.、Fischmann,A.J.J.Nucl.Med.31,2022-2028,1990)。(35mg,0.10mmol)。
Boc-HyNic-NHS
将混合物搅拌16小时，用MeOH中的乙胺(30μl,2.0M)处理，并搅拌额外3h(以骤冷过量未反应的Boc-HyNic-NHS)。在旋转蒸发器上移除所有挥发物。将粗制残余物溶解于DMF(3ml)中，随后用TEA(400μl)处理并搅拌16h。在旋转蒸发器上利用油泵真空移除所有挥发物。利用制备型HPLC使用ThermoAquasilC18管柱(5u，)用ACN(0.1％甲酸)于H2O(0.1％甲酸)中的梯度(18-43％)经30分钟洗脱纯化粗产物。产率：36mg(34％)。
G.3-胍基苯甲酸-NHS酯(1).向3-胍基苯甲酸(1g,4.65mmol；Chandrakumar,N.等人，美国专利5,773,646)于DMF(25ml)中的搅拌溶液中添加NHS(589mg,5.12mmol)，搅拌5分钟，随后向反应混合物中添加DCC(1.056g,5.12mmol)。继续搅拌2h，随后将反应混合物冷却至-20℃并保持30分钟，过滤出产物，用冷DMF洗涤，且在真空中使用油泵干燥。产率：1.283g(100％)。
8，RGD模拟物编号1-PEG-HyNic，n＝12
H.胍基-Gly-Asp(OH)-APOA-PEG12-HyNic-Boc(8).将含有7(36mg,0.031mmol)及NaHCO3(13mg,0.155mmol)的H2O(1ml)及THF(0.9ml)的混合物用3-胍基苯甲酸的NHS酯(1)(19.5mg,0.071mmol)处理并搅拌22h。随后用H2O稀释混合物并在旋转蒸发器上移除THF。于pH＝3(1％HCl)下将残余物悬浮于水(3ml)中并过滤出固体杂质。在真空中浓缩产物，将粗制残余物用H2O(0.8ml)、丙酮(0.8ml)及TFA(1.8ml)的混合物处理并搅拌40分钟。在完成后，将溶液用丙酮(2ml)稀释并在旋转蒸发器上移除所有挥发物。利用制备型HPLC使用ThermoAquasilC18管柱用ACN(0.1％甲酸)于H2O(0.1％甲酸)中的梯度(18-43％)经30分钟洗脱纯化所得粗产物。产率：34mg(89％)。
实施例22.RGD配体的固体相合成.
二甲基甲酰胺(DMF)、六氢吡啶、二氯甲烷(DCM)、二乙醚(Et2O)、H2O(HPLC级)、乙腈(ACN)(HPLC级)、三乙胺(TEA)、F3CCO2H(TFA)及三异丙基硅烷(TIPS)。PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基-六氟磷酸鏻盐)购自OakwoodProducts公司。Rink酰胺MBHA树脂、Fmoc-Gly-OH及Fmoc-Asp(tBu)-OH购自Novabiochem。使用本领域的标准技术合成4-(N-Fmoc对-胺基苯氧基)-丁酸及二-boc间-胍基苯甲酸。烧结的聚丙烯注射器是自Torviq购得。溶剂A是H2O:F3CCO2H100:0.1v/v。溶剂B是CH3CN:F3CCO2H100:0.1v/v。Fmoc-Lys(HyNic)-OH如前文所述合成。
Fmoc-Lys(HyNic)-OH
二-boc-间-胍基苯甲酸
A.肽合成.将Rink酰胺MBHA树脂放置于烧结的聚丙烯注射器中并在使用之前在DCM中搅动2h。使用以下标准固体相肽合成。通过将10ml(/1mmol树脂)六氢吡啶:DMF溶液(20:80v/v)浸泡20分钟实施Fmoc去保护。通过将树脂用4当量Fmoc-氨基酸、4当量PyBOP及10当量以0.1M浓度于DMF中的DMF中的三乙胺浸泡40分钟实施酰胺偶合。
将Fmoc-Lys(HyNic)-OH、4-(N-Fmoc对-胺基苯氧基)-丁酸、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH及Fmoc-3-胺基苯甲酸依序偶合至树脂上。使用MALDI-TOF分析检查酰胺偶合的进展。实施4-(N-Fmoc对-胺基苯氧基)-丁酸的Fmoc去保护40分钟以确保完全Fmoc-去保护。将Fmoc-Asp(tBu)-OH残余物双倍偶合以确保在Fmoc-天冬胺酸与4-(胺基苯氧基)-丁酸残余物的胺基部分之间的酰胺形成。在TFA:H2O:TIPS:丙酮(92.5:2.5:2.5:2.5v/v/v/v)溶液中实施树脂的裂解2h。使用吹入空气以将TFA溶液减少至约10体积％，且将肽沉淀至Et2O中。将沉淀重新溶解于A:B(1:1v/v)溶剂混合物中并使用反相HPLC纯化。
B.肽纯化.在配备有PhenomenexGeminiC18(250×21.2mm，5μm粒子)管柱的制备级ShimadzuHPLC上使用10-30％B溶剂梯度经20分钟实施纯化(至>90％均匀性)。经50分钟使用10-60％B梯度在配备有WatersxBridgeC18(4.6×250mm，5μm粒子)管柱的分析型ShimadzuHPLC上评定纯度。冻干HPLC部分，从而产生TFA盐形式的纯化肽。
实施例23.
A.PEG12/24-FCit-PABOC-PNP的合成.
1)二肽前体的制备：
a)Fmoc-FCit-OH
向H-Cit-OH(Sigma-AldrichC7629)(184mg,1.05mmol)及NaHCO3(88.2mg,1.05mmol)于H2O(2.6ml)中的溶液中添加Fmoc-Phe-OPfp(EMDNovaBiochem852226)(553mg,1mmol)于THF(5ml)中的溶液。添加THF(2ml)以使得溶液均匀并搅拌10h。在旋转蒸发器上移除THF，将残余物用H2O(10ml)及iPrOH(1ml)稀释并用3％HCl酸化至pH＝1。将产物用9:1EtOAc:iPrOH溶液萃取5次，用盐水:iPrOH的9:1混合物冲洗，干燥(Na2SO4)并在真空中浓缩并干燥。与醚一起研磨，从而得到313mg纯产物(57％)。可使用类似条件制备Fmoc-ACit-OH。
b)Fmoc-FCit-PAB-OH
将Fmoc-FCit-OH(5.98g,10.97mmol)及PABA(2.70g,21.95mmol)于DCM(150ml)及MeOH(50ml)中的溶液用EEDQ(5.43g,21.95mmol)处理并于20℃下搅拌15h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物，将残余物与Et2O一起研磨，且过滤出产物并在真空中干燥。产率，6.14g(86％)。可使用类似条件制备Fmoc-ACit-PAB-OH。
c)H2N-FCit-PAB-OH(相同条件用于制备H2N-A-Cit-PAB-OH)
通过与Et3N(3.5ml)在DMF(11ml)中一起搅拌10h使Fmoc-FCit-PAB-OH(0.83mmol)去保护。于40℃/油泵真空下在旋转蒸发器上移除所有挥发物以获得粗产物，其未经额外纯化即使用。
B.PEG12-FCit-PABC-PNP的制备.(FCit＝苯丙胺酸-瓜胺酸)
QuantaBiodesign产物编号：10262
QuantaBiodesign产物编号：10304
1.PEG12-FCit-PAB-OH
向H2N-FCit-PAB-OH(0.88mmol)及DIEA(167μl,0.96mmol)于DMF(3ml)中的溶液中添加PEG12-NHS(QuantaBiodesign10262)或PEG24-NHS(QuantaBiodesign10304)(0.8mmol)于DMF(3ml)中的溶液。将混合物搅拌16h，过滤并浓缩。将粗制物自CHCl3:MeOH(1:1,5ml)沉淀至Et2O(45ml)中并未经额外纯化即使用。产率：420mg(53％)。
ii)PEG12-FCit-PABC-PNP
将含有PEG12/24-FCit-PAB-OH(419mg,0.42mmol)、(PNP)2CO(Sigma-Aldrich161691)(766mg,2.52mmol)及DIEA(263μl,1.52mmol)于二噁烷(4ml)中的溶液在黑暗中于50℃下搅拌15h。在旋转蒸发器上移除所有挥发物并通过自DMF蒸发移除残余DIEA。在管柱上纯化产物，洗脱剂CHCl3:EtOAc:MeOH＝4.5:5:0.5，之后CHCl3中的MeOH(12-15％)的梯度。产率：390mg(80％)。
实施例24.两亲性膜活性多胺合成.
A.丙烯酸N-Boc-乙基乙氧基酯及甲基丙烯酸丙酯的RAFT共聚(图11).对于其他膜活性聚合物，A亦可为经保护的乙基、丙基或丁基胺基的丙烯酸酯。B可为高碳酸疏水性(10-24个碳原子，显示C18)丙烯酸酯、低碳数疏水性(1-6个碳原子，显示C4)丙烯酸酯或低碳酸、高碳数疏水性丙烯酸酯的组合。
由胺丙烯酸酯/C3甲基丙烯酸酯组成的共聚物是如下合成。称重单体及RAFT试剂并以指示比率置入乙酸丁酯中。添加AIBN(偶氮双-异丁腈)并于RT下使氮鼓泡通过反应物1h。随后于80℃下将反应混合物放置至油浴中15h。随后用己烷沉淀聚合物，且使用DCM/己烷溶剂系统进一步分步沉淀(参见下文)。随后在减压下干燥聚合物。于RT下将聚合物用乙酸中的7ml2MHCl去保护30分钟。30分钟后，向反应混合物中添加15ml水，并将混合物转移至3.5kDaMWCO透析管道中。将聚合物利用NaCl透析过夜且随后利用dH2O再透析一天。随后通过冻干移除水，并将聚合物溶解于dH2O中。
B.丙烯酸N-Boc-乙基乙氧基酯及甲基丙烯酸丙酯的无规共聚.如下合成由胺丙烯酸酯/Cn甲基丙烯酸酯组成的共聚物。称重单体，以指示比率置入二噁烷中。添加AIBN(偶氮双-异丁腈)并于RT下使氮鼓泡通过反应物1h。随后于60℃下将反应混合物放置于油浴中3h。随后在减压下干燥聚合物。通过GPC纯化聚合物。其后，于RT下将聚合物部分用乙酸中的7ml2MHCl去保护30分钟。30分钟后，向反应混合物中添加15ml水，并将混合物转移至3.5kDaMWCO透析管道中。将聚合物利用NaCl透析过夜且随后利用dH2O再透析一天。随后通过冻干移除水，并将聚合物溶解于dH2O中。
C.水溶性、两亲性、膜活性聚(乙烯基醚)多胺三元聚合物的合成.在氮气层下在无水二氯甲烷中向炉干燥的圆底烧瓶中添加Xmol％胺保护的乙烯基醚(例如，2-乙烯基氧基乙基邻苯二甲酰亚胺)。向此溶液中添加Ymol％低碳数疏水性基团(例如，丙基、丁基)乙烯基醚及视情况Zmol％高碳数疏水性基团(例如，十二烷基、十八烷基)乙烯基醚(图1)。将溶液放置于-50℃至-78℃浴中，并使2-乙烯基氧基乙基邻苯二甲酰亚胺沉淀。向此溶液中添加10mol％BF3·(OCH2CH3)2并使反应于-50℃至-78℃下进行2-3h。通过添加甲醇溶液中的氢氧化铵终止聚合。在减压下使聚合物干燥且随后放入1,4-二噁烷/甲醇(2/1)中。添加20mol当量肼/邻苯二甲酰亚胺以自胺移除保护基团。将溶液回流3h且随后在减压下干燥。将所得固体溶解于0.5mol/LHCl中并回流15-分钟以形成聚合物的盐酸盐，用蒸馏水稀释并再回流一小时。随后将溶液用NaOH中和，冷却至RT，转移至分子纤维素管道，利用蒸馏水透析并冻干。可使用尺寸排除或其他层析进一步纯化聚合物。根据标准程序使用管柱(包括分析型尺寸排除层析及多角光散射尺寸排除层析(SEC-MALS))估计聚合物的分子量。
D.聚合物Ant-41658-111：
1)单体合成.2,2'-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN，基团起始剂)、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰基硫基)戊酸(CPCPA、RAFT试剂)及乙酸丁酯购自SigmaAldrich。过滤甲基丙烯酸丙酯单体(AlfaAesar)以移除抑制剂。
在配备有搅拌棒的2L圆底烧瓶中，将2-(2-胺基乙氧基)乙醇(21.1g,202.9mmol,SigmaAldrich)溶解于350ml二氯甲烷中。在单独1L烧瓶中，将BOC酐(36.6g,169.1mmol)溶解于660ml二氯甲烷中。2L圆底烧瓶装配有加料漏斗且经6h向烧瓶中添加BOC酐溶液。将反应物搅拌过夜。在2L分离漏斗中，将产物各自用300ml10％柠檬酸、10％K2CO3、饱和NaHCO3及饱和NaCl洗涤。将产物BOC保护的2-(2-胺基乙氧基)乙醇经Na2SO4干燥，重力过滤，并使用旋转蒸发及高真空蒸发DCM。
在配备有搅拌棒且用氩冲洗的500ml圆底烧瓶中，添加BOC保护的2-(2-胺基乙氧基)乙醇(27.836g,135.8mmol)，之后添加240ml无水二氯甲烷。添加二异丙基乙基胺(35.5ml,203.7mmol)，并将系统放置于干冰/丙酮浴中。使用10ml二氯甲烷稀释丙烯酰氯(12.1ml,149.4mmol)，并逐滴添加至氩冲洗的系统中。将系统保持于氩下并使其达到RT并搅拌过夜。将产物各自用100mldH2O、10％柠檬酸、10％K2CO3、饱和NaHCO3及饱和NaCl洗涤。将产物丙烯酸BOC-胺基乙基乙氧基酯(BAEEA)经Na2SO4干燥，重力过滤，并使用旋转蒸发蒸发DCM。通过使用7.5cm直径管柱的管柱层析在29cm二氧化硅上纯化产物。所用溶剂系统是己烷中的30％乙酸乙酯。Rf：0.30。收集各部分并使用旋转蒸发及高真空移除溶剂。以74％产率获得BAEEA。将BAEEA储存于冷冻器中。
BAEEA
2)聚合:制备AIBN(1.00mg/ml)及RAFT试剂(4-氰基-4(苯基硫代甲酰基硫基)戊酸(CPCPA),10.0mg/ml)于乙酸丁酯中的溶液。单体摩尔进料比是75BAEEA:25甲基丙烯酸丙酯(CAS:2210-28-8)与0.108CPCPARAFT试剂及0.016AIBN触媒(总共0.00562mol)。
向具有搅拌棒的20ml玻璃小瓶中添加BAEEA(1.09g,4.21mmol)(A)、甲基丙烯酸丙酯(.180g,1.41mmol)(B)、CPCPA溶液(.170ml,.00609mmol)(C)、AIBN溶液(.150ml,.000915mmol)及乙酸丁酯(5.68ml)。将小瓶用橡胶帽密封并使用长注射器针与第二短注射器针作为出口使溶液用氮鼓泡1h。移除注射器针并使用油浴将系统加热至80℃并保持15h。使溶液冷却至RT并转移至50ml离心管，之后向溶液中添加己烷(35ml)。将溶液以4,400rpm离心2分钟。小心地倾倒上清液层并用己烷冲洗底部(固体或凝胶状)层。随后将底层重新溶解于DCM(7ml)中，沉淀于己烷(35ml)中并再离心一次。倾倒上清液并用己烷冲洗底层，之后将聚合物在减压下干燥若干小时。通过MALS获得分子量：73,000(PDI1.7)；使用H1NMR获得聚合物组合物：69:31胺:烷基。
分步沉淀.将干燥的沉淀产物溶解于DCM(100mg/ml)中。添加己烷直至恰好达到浊点之后(约20ml)。离心所得乳状溶液。将底层(占聚合物的约60％的稠液体)萃取并完全沉淀至己烷中。通过进一步添加己烷亦完全沉淀剩余上部溶液。将两个部分离心，其后，将聚合物分离并在真空下干燥。部分1：Mw87,000(PDI1.5)；部分2：Mw52,000(PDI1.5-1.6)。
MALS分析.将约10mg聚合物溶解于0.5ml89.8％二氯甲烷、10％四氢呋喃、0.2％三乙胺中。使用附接至使用Jordi5μ7.8×300混合床LSDVB管柱的ShimadzuProminenceHPLC的WyattHelosII多角光散射检测器量测分子量及多分散性(PDI)。粗制聚合物：MW：73,000(PDI1.7)，部分1：MW87,000(PDI:1.5)，部分2：MW52,000(PDI1.5-1.6)
使纯化BOC保护的聚合物与乙酸(7ml)中的2MHCl反应0.5h以移除BOC保护基团并产生胺。向反应物中添加15mldH2O，将溶液转移至3500MW截止值纤维素管道中，利用高盐透析24h，随后利用dH2O透析18h。将内容物冻干，随后以20mg/ml的浓度溶解于DIH2O中。于2℃至8℃下储存聚合物溶液。
E.聚合物Lau24B是如上文制得，只是单体进料比是72.5BAEEA:27.5甲基丙烯酸丙酯。
F.Ant-129-1基本上是如上文所述制得，只是使用以下单体：
及
表10.Ant-129-1聚合物合成反应物.
对于N-Boc-胺基-丙基-丙烯酸酯(BAPA)，在配备有搅拌棒且用氩冲洗的500ml圆底烧瓶中，添加3-(BOC-胺基)1-丙醇(TCI)(135.8mmol)，之后添加240ml无水二氯甲烷。添加二异丙基乙基胺(203.7mmol)，并将系统放置于干冰/丙酮浴中。使用10ml二氯甲烷稀释丙烯酰氯(149.4mmol)，并逐滴添加至氩冲洗的系统中。将系统保持于氩下并使其达到RT并搅拌过夜。将产物各自用100mldH2O、10％柠檬酸、10％K2CO3、饱和NaHCO3及饱和NaCl洗涤。将产物丙烯酸BOC-胺基丙基酯(BAPA)经Na2SO4干燥，重力过滤，并使用旋转蒸发蒸发DCM。通过使用7.5cm直径管柱的管柱层析在29cm二氧化硅上纯化产物。所用溶剂系统是己烷中的30％乙酸乙酯。Rf：0.30。收集各部分并使用旋转蒸发及高真空移除溶剂。以74％产率获得BAPA。将BAPA储存于冷冻器中。
G.聚合物Lau41648-106.基于总单体摩尔，单体摩尔进料比是80BAEEA:20甲基丙烯酸丙酯(CAS:2210-28-8)及3％AIBN触媒。向具有搅拌棒的50ml玻璃管中添加BAEEA(6.53g,25.2mmol)(A)、甲基丙烯酸丙酯(0.808g,6.3mmol)(B)、AIBN(0.155g,0.945mmol)及二噁烷(34.5ml)。化合物A及B是如上文实施例16Ai中所述制得。一式三份设置反应。使用长吸管使每一溶液用氮鼓泡1h。移除吸管并小心地封盖每一管。随后使用油浴将每一溶液于60℃下加热3h。使每一溶液冷却至RT并在圆底中合并。在减压下干燥粗制聚合物。通过MALS获得的分子量：55,000(PDI2.1)；使用H1NMR获得的聚合物组合物：74:26胺:烷基。
Lau41648-106
GPC分级分离.将干燥的粗制聚合物以50mg/ml放入75％二氯甲烷、25％四氢呋喃及0.2％三乙胺中。随后将聚合物在JordiGelDVB104 -500mm/22mm管柱上使用5ml/分钟的流速及10ml注射物分级分离。自15-17分钟收集较早部分，且自17-19分钟收集较晚部分。部分15-17：Mw138,000(PDI1.1)；部分17-19：Mw64,000(PDI1.2)。
MALS分析.将约10mg聚合物溶解于0.5ml89.8％二氯甲烷、10％四氢呋喃、0.2％三乙胺中。使用附接至使用Jordi5μ7.8×300混合床LSDVB管柱的ShimadzuProminenceHPLC的WyattHelosII多角光散射检测器量测分子量及多分散性(PDI)。粗制聚合物：MW：55,000(PDI2.1)，部分15-17：MW138,000(PDI:1.1)，部分17-19：MW64,000(PDI1.2)。
使纯化BOC保护的聚合物与乙酸(7ml)中的2MHCl反应0.5h以移除BOC保护基团并产生胺。向反应物中添加15mldH2O，将溶液转移至3500MW截止值纤维素管道中，利用高盐透析24h，随后利用dH2O透析18h。将内容物冻干，随后以20mg/ml的浓度溶解于DIH2O中。于2℃至8℃下储存聚合物溶液。
H.聚合物DW1360.胺/丁基/十八烷基聚(乙烯基醚)三元聚合物是自2-乙烯基氧基乙基邻苯二甲酰亚胺(5g,23.02mmol)、丁基乙烯基醚(0.665g,6.58mmol)及十八烷基乙烯基醚(0.488g,1.64mmol)单体合成。在氩气层下在36ml无水二氯甲烷中向含有磁力搅拌棒的200ml炉干燥的圆底烧瓶中添加2-乙烯基氧基乙基邻苯二甲酰亚胺。向此溶液中添加丁基乙烯基醚及正十八烷基乙烯基醚。将单体于RT(RT)下完全溶解以获得澄清的均匀溶液。随后将含有澄清溶液的反应容器放置于通过向ACS级变性醇及乙二醇的1:1溶液中添加干冰生成的-50℃浴中且容许形成邻苯二甲酰亚胺单体的可视沉淀。在冷却约1.5分钟后，添加BF3·(OCH2CH3)2(0.058g,0.411mmol)以起始聚合反应。在聚合起始后，邻苯二甲酰亚胺单体溶解。使反应于-50℃下进行3h。通过添加甲醇中的5ml1％氢氧化铵停止聚合。随后通过旋转蒸发移除溶剂。
随后将聚合物溶解于30ml1,4-二噁烷/甲醇(2/1)中。向此溶液中添加肼(0.147g,46mmol)并将混合物加热回流3h。随后通过旋转蒸发移除溶剂且随后将所得固体置入20ml0.5mol/LHCl中并回流15分钟，用20ml蒸馏水洗涤，并再回流1小时。随后将此溶液用NaOH中和，冷却至RT，转移至3,500分子量纤维素管道，利用蒸馏水透析24h(2×20L)并冻干。
I.聚合物Emi1034-68C.单体摩尔进料比是52.5BAEAA:47.5丙烯酸丙酯(CAS:925-60-0)及6.66:1比率的CTA(CPCPA)对起始剂(AIBN)。向具有搅拌棒的40ml玻璃小瓶中添加BAEAA(2.6851g,10.35mmol)、丙烯酸丙酯(1.0742g,9.41mmol)、CPCPA(.0105g,0.0375mmol)、AIBN(0.000924g,0.00563mmol)及乙酸丁酯(15.9ml)。使用隔膜盖中的长的皮下针使溶液用氮鼓泡1h。移除针并使用油浴将溶液于80℃下加热16h。使每一溶液冷却至RT。使用己烷(约8×体积)沉淀出粗制聚合物并离心。倾倒溶剂并将聚合物用己烷冲洗并溶解于DCM中。再次用己烷(约8×体积)沉淀溶解的聚合物。离心后，倾倒溶剂并在减压下干燥聚合物。通过MALS获得的分子量：59,640(PDI1.328)；使用H1NMR获得聚合物组合物：55.4:44.6胺:烷基。
分步沉淀.在50ml离心管中，使用超音波处理将试样以25mg试样/ml溶剂溶解于60％庚烷/40％二噁烷中。将试样涡旋10秒并使其静置4h。自顶部移液出溶剂且将沉淀出的聚合物用己烷冲洗两次。使用高真空干燥试样。
MALS分析.将少量聚合物以10mg/ml溶解于75％DCM、20％THF及5％ACN中。使用附接至使用Phenogel5μLinear(2)7.8×300管柱的ShimadzuProminenceHPLC的WyattHelosII多角光散射检测器量测分子量及多分散性(PDI)。粗制聚合物：MW：59,640(PDI1.328)，部分1：MW80,540(PDI:1.120)。
Boc-去保护.使纯化BOC保护的聚合物与乙酸(7ml)中的2MHCl反应0.5h以移除BOC保护基团并产生胺。向反应物中添加15mldH2O，将溶液转移至3500MW截止值纤维素管道中，利用高盐透析24h，随后利用dH2O透析18h。将内容物冻干，随后以20mg/ml的浓度溶解于DIH2O中。于2℃至8℃下储存聚合物溶液。
J.聚合物Emi1034-81F.单体摩尔进料比是65BAEAA:35丙烯酸丁酯(CAS:141-32-2)及6.66:1比率的CTA(CPCPA)对起始剂(AIBN)。向具有搅拌棒的20ml玻璃小瓶中添加BAEAA(0.9876g,3.809mmol)、丙烯酸丁酯(0.2607g,2.034mmol)、CPCPA(0.0035g,0.0125mmol)、AIBN(0.000308g,0.00188mmol)及乙酸丁酯(5.3ml)。使用隔膜盖中的长的皮下针使溶液用氮鼓泡1h。移除针并使用油浴将溶液于80℃下加热16h。使每一溶液冷却至RT。使用己烷(约8×体积)沉淀出粗制聚合物并离心。倾倒溶剂并将聚合物用己烷冲洗并溶解于DCM中。再次用己烷(约8×体积)沉淀溶解的聚合物。离心后，倾倒溶剂并在减压下干燥聚合物。通过MALS获得的分子量：63,260(PDI1.318)；使用H1NMR获得的聚合物组合物：68.7:31.3胺:烷基。
分步沉淀.在50ml离心管中，使用超音波处理将试样以25mg试样/ml溶剂溶解于60％庚烷/40％二噁烷中。将试样涡旋10秒并使其静置4h。自顶部移液出溶剂且将沉淀出的聚合物用己烷冲洗两次。使用高真空干燥试样。
MALS分析.将少量聚合物以10mg/ml溶解于75％DCM、20％THF及5％ACN中。使用附接至使用Phenogel5μLinear(2)7.8×300管柱的ShimadzuProminenceHPLC的WyattHelosII多角光散射检测器量测分子量及多分散性(PDI)。粗制聚合物：MW：63,260(PDI1.318)，部分1：MW65,990(PDI:1.246)。
Boc-去保护.使纯化BOC保护的聚合物与乙酸(7ml)中的2MHCl反应0.5h以移除BOC保护基团并产生胺。向反应物中添加15mldH2O，将溶液转移至3500MW截止值纤维素管道中，利用高盐透析24h，随后利用dH2O透析18h。将内容物冻干，随后以20mg/ml的浓度溶解于DIH2O中。于2℃至8℃下储存聚合物溶液。
K.聚合物LH1073-20C-1：单体进料比是55BAPVE(Boc-胺基丙基乙烯基酯)：45丁酸乙烯基酯(CAS:123-20-6)及10:1比率的链转移剂(MDPD)对起始剂(AIBN)。向具有搅拌棒的20ml玻璃小瓶中添加BAPVE(0.8g,3.72mmol)、MDPD(9.26mg,0.0229mmol)、AIBN(0.21mg,0.00229mmol)及乙酸丁酯(0.5ml)。使用隔膜盖中的长的皮下针使溶液用氮鼓泡1h。类似地使过量丁酸乙烯基酯的单独小瓶脱气。移除针/氮并利用Hamilton注射器向反应溶液中添加丁酸乙烯基酯(0.35g,3.04mmol)。将溶液于80℃下搅拌4h且随后冷却至RT。将所得黏稠溶液溶解于5mlDCM中并通过添加40ml己烷沉淀出聚合物。离心后，倾倒上部溶剂并将聚合物用5ml己烷冲洗。将经冲洗的聚合物重新溶解于5mlDCM中，并用40ml己烷再次沉淀，离心，并倾倒上部溶剂。随后在高真空下干燥聚合物。通过MALS获得的分子量：42,230(PDI1.205)；使用H1NMR获得的聚合物组合物：57.5:42.5胺:烷基。
分步沉淀：在50ml离心管中，将聚合物溶解于10mlDCM中并添加足够己烷以使溶液越过浊点(约30ml)。将浑浊混合物离心，从而形成两个液体层。移除更黏稠的底层，用5mlDCM稀释并用40ml己烷完全沉淀，以产生部分1。在对部分进行离心后，倾倒溶剂并在减压下干燥聚合物。通过MALS获得的分子量：61,350(PDI1.205)。
MALS分析：将少量聚合物以10mg/ml溶解于75％DCM、20％THF及5％ACN中。使用附接至具有Phenogel5uLinear(2)7.8×300管柱的ShimadzuProminenceHPLC的WyattHelosII多角光散射检测器量测分子量及多分散性(PDI)。参见上述分子量。
Boc-去保护：使分级分离的BOC保护的聚合物与乙酸(5ml)中的2NHCl反应并搅拌1h以移除BOC基团并产生胺。将溶液用水(30ml)稀释并利用NaCl水溶液及随后去离子水经2天透析(3500MWCO纤维素管道)。将内容物冻干，且随后以20mg/ml的浓度溶解于DI水中。在2℃至8℃下储存聚合物。
L.蜂毒肽.所有蜂毒肽皆是使用本领域的标准肽合成技术制得。适宜蜂毒肽可为全L-形式氨基酸、全D-形式氨基酸(逆转型)。独立于L或D形式，蜂毒肽序列可逆转(逆转型)。
实施例25.具有迭氮基-PEG-胺的末端聚合物修饰.在配备有隔膜盖及搅拌棒的40ml振荡小瓶中，将聚合物(Emi1034-68C种类，1g，0.0143mmol)溶解于20ml无水二氯甲烷(Sigma)中。在搅拌下向烧瓶中添加五氟苯酚(Sigma,26.3mg,0.143mmol)及N,N’-二环己基碳化二亚胺(Sigma,29.5mg,0.143mmol)。使用N2气体管线及用于排气的针，将系统用N2吹扫约10分钟。将反应物于RT下搅拌过夜。向烧瓶中添加额外五氟苯酚(Sigma,26.3mg,0.143mmol)及N,N’-二环己基碳化二亚胺(Sigma,29.5mg,0.143mmol)，将系统用N2气体吹扫，并将反应物于RT下搅拌3h。使聚合物与己烷(约10×体积，Sigma)一起沉淀，离心，并倾倒溶剂。将聚合物溶解于最少二氯甲烷中，与己烷(约10×体积)一起沉淀，离心，并倾倒溶剂。将聚合物溶解于最少乙酸乙酯(Sigma)中，与己烷(约10×体积)一起沉淀，离心，并倾倒溶剂。在高真空下干燥聚合物沉淀直至固体达到恒定重量为止。
在配备有隔膜盖及搅拌棒的40ml振荡小瓶中，将前一步骤的聚合物(Emi1034-68C种类，1g，0.0143mmol)溶解于20ml无水二氯甲烷中。在搅拌下向烧瓶中添加迭氮基PEG4胺(PurePeg,37.5mg,0.143mmol)及N,N-二异丙基乙基胺(Sigma,20.3mg,0.157mmol)。将系统用N2气体吹扫约10分钟，且将反应物于RT下搅拌过夜。向烧瓶中添加额外迭氮基PEG4胺(PurePeg,37.5mg,0.143mmol)及N,N-二异丙基乙基胺(Sigma,20.3mg,0.157mmol)，将系统用N2气体吹扫，并将反应物于RT下搅拌3h。使聚合物与己烷(约10×体积)一起沉淀，离心，并倾倒溶剂。将聚合物溶解于最少二氯甲烷中，与己烷(约10×体积)一起沉淀，离心，并倾倒溶剂。在高真空下干燥聚合物沉淀直至固体达到恒定重量为止(图12)。

Claims (20)

1.一种用于在活体中递送RNAi触发子至整联蛋白阳性肿瘤细胞的化合物，其包含由以下表示的结构：
R-A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-P
其中，R包含RGD配体，A1是疏水性氨基酸，A2是经由酰胺键连接至A1的亲水性不带电氨基酸，其中该亲水性不带电氨基酸于中性pH下不带电，且P包含膜活性多胺。
2.如权利要求1所述的化合物，其中A1选自由以下组成的群：丙胺酸、苯丙胺酸、缬胺酸、白胺酸、异白胺酸及色胺酸。
3.如权利要求1至2中任一项所述的化合物，其中A2选自由以下组成的群：瓜胺酸、甘胺酸、苏胺酸、天冬酰胺及麸酰胺酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中该整联蛋白是αvβ3整联蛋白。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中该R-A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯-P具有由以下表示的结构：
其中R4包含RGD配体，R1是疏水性氨基酸的侧基，R2是亲水性不带电氨基酸的侧基且多胺是该膜活性多胺P。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中该RGD配体包含RGD模拟物。
7.如权利要求6所述的化合物，其中该RGD模拟物包含经由酰胺键连接至甘胺酸-天冬胺酸盐二肽的胍基团。
8.如权利要求7所述的化合物，其中该RGD模拟物包含由以下表示的结构：
9.如权利要求8所述的化合物，其中该胍选自
及其共振结构，及
及其共振结构。
10.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中R包含：
RGD模拟物-PEG1-二芳基腙-PEG2
其中：
PEG1包含(CH2-CH2-O)n，
PEG2包含(CH2-CH2-O)m，
n及m独立地是大于或等于4的整数，
n+m的和是12至48，且
RGD模拟物由以下表示的结构组成：
其中R14选自由以下组成的群：
及其共振结构，及
及其共振结构。
11.如权利要求1至10中任一项所述的化合物，其进一步包含经由可逆的生理上不稳定的共价键连接至该膜活性多胺的聚乙二醇。
12.如权利要求1至11中任一项所述的化合物，其中该RNAi触发子共价连接至该膜活性多胺。
13.如权利要求12所述的化合物，其中该化合物具有由以下表示的结构：
其中N是该RNAi触发子，L1是生理上不稳定的键，PEG包含聚乙二醇，L2是A1A2-酰胺基苄基-胺基甲酸酯，y是大于0的整数，z是大于0的整数，且y及z的和的值大于膜活性多胺P上存在的胺的数目的50％，通过未经修饰的膜活性多胺上的胺的数目所测定。
14.如权利要求13所述的化合物，其中P-L2-R包含：
R-PEG′-二芳基腙-PEG″-AA-酰胺基苄基胺基甲酸酯-多胺
其中：
R具有由以下表示的结构：
PEG′具有由以下表示的结构：
其中n＝4-44，
二芳基腙具有由以下表示的结构：
PEG″具有由以下表示的结构：
其中m是4-44，且
AA-酰胺基苄基胺基甲酸酯-多胺具有由以下表示的结构：
其中多胺是该膜活性多胺P。
15.一种可逆修饰膜活性多胺以形成用于在活体中递送RNAi触发子至整联蛋白阳性肿瘤细胞的化合物的方法，其包含：
a)通过使该多胺上的一个或多个胺与一种或多种各自具有由以下表示的结构的第一化合物反应可逆修饰该一个或多个胺：
其中R3包含能够与该胺反应以形成胺基甲酸酯的胺反应性碳酸酯部分，R7包含胺反应性较该胺反应性碳酸酯小的第一反应基团，R1是疏水性氨基酸的侧基，R2是亲水性不带电氨基酸的侧链，及
b)使R7与具有由以下表示的结构的第二化合物反应：
其中R14选自由以下组成的群：
及
且A包含具有4至44个连接至第二反应基团的乙氧基单元的聚乙二醇，该第二反应基团能够与R7的该第一反应基团反应以形成共价键。
16.如权利要求15所述的方法，其中R7进一步包含具有4至44个乙氧基单元的聚乙二醇基团。
17.如权利要求15或16所述的方法，其包含通过使该多胺上的一个或多个胺与一种或多种各自具有由以下表示的结构的化合物反应进一步可逆修饰该一个或多个胺：
PEG-A1A2-酰胺基苄基-碳酸酯
PEG包含聚乙二醇，A1是疏水性氨基酸，A2是经由酰胺键连接至A1的亲水性不带电氨基酸，其中该亲水性不带电氨基酸于中性pH下不带电。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中该多胺上80％或更多数目的胺经可逆修饰且该经修饰的多胺无膜活性。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中RNAi触发子分子通过生理上不稳定的键共价连接至该多胺。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中该整联蛋白是αvβ3整联蛋白。
CN201480044362.9A 2013-08-07 2014-08-06 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物 Active CN105451743B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361863056P 2013-08-07 2013-08-07
US61/863,056 2013-08-07
PCT/US2014/049851 WO2015021092A1 (en) 2013-08-07 2014-08-06 Polyconjugates for delivery of rnai triggers to tumor cells in vivo

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105451743A true CN105451743A (zh) 2016-03-30
CN105451743B CN105451743B (zh) 2019-11-19

Family

ID=52449177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480044362.9A Active CN105451743B (zh) 2013-08-07 2014-08-06 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9487556B2 (zh)
EP (1) EP3030244B1 (zh)
JP (1) JP6433001B2 (zh)
KR (1) KR20160035081A (zh)
CN (1) CN105451743B (zh)
AU (1) AU2014306021B2 (zh)
CA (1) CA2919088A1 (zh)
EA (1) EA201690051A1 (zh)
HK (1) HK1220397A1 (zh)
IL (1) IL243941B (zh)
MX (1) MX2016001006A (zh)
SG (1) SG11201600379TA (zh)
TW (1) TWI685347B (zh)
WO (1) WO2015021092A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110240551A (zh) * 2019-06-25 2019-09-17 成都郑源生化科技有限公司 Fmoc-β-Ala-Gly-OH的制备方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105451743B (zh) * 2013-08-07 2019-11-19 箭头研究公司 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物
CA2979703A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of factor xii
JP6773677B2 (ja) 2015-03-17 2020-10-21 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 改善されたジスルフィド含有アルキン連結剤
CN108064156B (zh) 2015-05-29 2022-02-01 箭头药业股份有限公司 抑制Hif2α基因表达的组合物及方法
MX2017014638A (es) 2015-05-29 2018-01-23 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes enlazantes tetrapeptidicos escindibles biologicamente.
BR112018013504B1 (pt) * 2015-12-29 2022-08-09 Galderma S.A. Método para desacetilação pelo menos parcial de glicosaminoglicano compreendendo grupos acetila, glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado, uso de hidroxilamina para desacetilação pelo menos parcial de glicosaminoglicano e método para preparar produto de hidrogel
EP3252082A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-06 Galderma S.A. Method for deacetylation of biopolymers
PT3623390T (pt) * 2016-05-31 2023-10-27 Galderma Sa Reticulador de hidrato de carbono
JP2021522269A (ja) 2018-04-27 2021-08-30 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド インテグリン標的化リガンドとその使用
CA3160575A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Johan Olsson High molecular weight esthetic compositions
CN113004515B (zh) * 2021-03-02 2023-02-24 厦门大学附属中山医院 一种仿透明质酸聚氨基酸衍生物、其制备方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090257952A1 (en) * 2006-10-04 2009-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered Integrin Binding Peptides
US20120165393A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-28 Arrowhead Madison Inc. Peptide-Based In Vivo siRNA Delivery System

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6028223A (en) * 1995-08-30 2000-02-22 G. D. Searle & Co. Meta-guanidine, urea, thiourea or azacyclic amino benzoic acid compounds and derivatives thereof
WO1997036862A1 (en) 1996-03-29 1997-10-09 G.D. Searle & Co. META-SUBSTITUTED PHENYLENE DERIVATIVES AND THEIR USE AS ALPHAvBETA3 INTEGRIN ANTAGONISTS OR INHIBITORS
CA2265484C (en) * 1996-09-10 2008-12-02 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
DE69802329D1 (de) 1997-04-07 2001-12-13 Cfpi Nufarm Gennevilliers Verfahren zur Herstellung von 3,4 disubstituirten Dinitroanilinen
US8137695B2 (en) 2006-08-18 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
WO2003034995A2 (en) * 2001-10-22 2003-05-01 The Scripps Research Institute Integrin targeting compounds
JP2004261024A (ja) * 2003-02-28 2004-09-24 Japan Science & Technology Agency ペプチド修飾多糖類を用いる遺伝子治療剤
WO2004090108A2 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals Irna conjugates
CA2559955C (en) 2004-03-15 2016-02-16 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
EP1817324A2 (en) * 2004-11-04 2007-08-15 Raul Andino Syntheses of polyamine conjugates of small interfering rnas (si-rnas) and conjugates formed thereby
MX2007012766A (es) * 2005-04-12 2008-10-01 Intradigm Corp Composición y métodos de terapéuticos de arni para el tratamiento de cáncer y otras enfermedades de neovascularización.
US8017109B2 (en) 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
CA2662520A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
JP5855463B2 (ja) 2008-12-18 2016-02-09 ダイセルナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＤｉｃｅｒｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 遺伝子発現の特異的阻害のための拡張ｄｉｃｅｒ基質薬剤および方法
US20100249214A1 (en) 2009-02-11 2010-09-30 Dicerna Pharmaceuticals Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
SG183374A1 (en) 2010-02-24 2012-09-27 Arrowhead Res Corp Compositions for targeted delivery of sirna
CA3131967A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 F. Hoffman-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
KR20130136494A (ko) * 2010-12-29 2013-12-12 애로우헤드 리서치 코오포레이션 효소 민감성 결합을 갖는 Ｉｎ Ｖｉｖｏ 폴리뉴클레오티드 전달 컨쥬게이트
US8932572B2 (en) 2011-08-26 2015-01-13 Arrowhead Madison Inc. Poly(vinyl ester) polymers for in vivo nucleic acid delivery
MX2014008404A (es) 2012-01-27 2014-08-22 Hoffmann La Roche Quitosan enlazado covalentamente con antagonista de la integrina de molecula pequeña para suministro dirigido.
KR20150009952A (ko) * 2012-01-27 2015-01-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 알파-v-베타-3 발현 세포로의 표적화 전달을 위한 인테그린 안타고니스트 접합체
KR20150001710A (ko) 2012-04-18 2015-01-06 애로우헤드 리서치 코오포레이션 Ｉｎ Ｖｉｖｏ 핵산 전달용 폴리(아크릴레이트) 고분자
CN105451743B (zh) * 2013-08-07 2019-11-19 箭头研究公司 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090257952A1 (en) * 2006-10-04 2009-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered Integrin Binding Peptides
US20120165393A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-28 Arrowhead Madison Inc. Peptide-Based In Vivo siRNA Delivery System

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTINE I WOODDELL, ET AL.: "Hepatocyte-targeted RNAi Therapeutics for the Treatment of Chronic Hepatitis B Virus Infection", 《MOLECULAR THERAPY》 *
YANHUA WU, ET AL.: "Proapoptotic Function of Integrin β3 in Human Hepatocellular", 《CLIN CANCER RES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110240551A (zh) * 2019-06-25 2019-09-17 成都郑源生化科技有限公司 Fmoc-β-Ala-Gly-OH的制备方法
CN110240551B (zh) * 2019-06-25 2022-02-11 成都郑源生化科技有限公司 Fmoc-β-Ala-Gly-OH的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2919088A1 (en) 2015-02-12
EP3030244A1 (en) 2016-06-15
EP3030244B1 (en) 2021-04-21
HK1220397A1 (zh) 2017-05-05
TW201601742A (zh) 2016-01-16
IL243941A0 (en) 2016-04-21
JP6433001B2 (ja) 2018-12-05
KR20160035081A (ko) 2016-03-30
MX2016001006A (es) 2016-04-19
EP3030244A4 (en) 2017-06-28
SG11201600379TA (en) 2016-02-26
CN105451743B (zh) 2019-11-19
JP2016535058A (ja) 2016-11-10
US20170022497A1 (en) 2017-01-26
US20150045573A1 (en) 2015-02-12
EA201690051A1 (ru) 2016-06-30
US9487556B2 (en) 2016-11-08
US20190062748A1 (en) 2019-02-28
AU2014306021A1 (en) 2016-01-28
TWI685347B (zh) 2020-02-21
WO2015021092A1 (en) 2015-02-12
IL243941B (en) 2019-06-30
AU2014306021B2 (en) 2018-12-13
AU2014306021A2 (en) 2016-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105451743B (zh) 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物
CN103491982B (zh) 具有酶敏感性连接的多核苷酸体内递送偶联物
Minko et al. Molecular targeting of drug delivery systems to cancer
US8426554B2 (en) In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages
Zhang et al. Functionalized cell nucleus-penetrating peptide combined with doxorubicin for synergistic treatment of glioma
JP2010526091A (ja) 癌の処置のための生物学的な標的基の改変
US9415114B2 (en) Conformations of divergent peptides with mineral binding affinity
WO2018192550A1 (zh) 多臂靶向抗癌偶联物
Yamada et al. Biological evaluation of paclitaxel-peptide conjugates as a model for MMP2-targeted drug delivery
HU228860B1 (en) Dolastatin-15 derivatives in combination with taxanes
CN111087465A (zh) 一种针对密蛋白6的抗体偶联药物及应用
US20230348671A1 (en) Polyethylene glycol conjugate drug synergist, and preparation method therefor, and use thereof
US20180318388A1 (en) Compositions and methods for sensitizing low responsive tummors to cancer therapy
CN107854693A (zh) 整合素受体靶向的抗癌偶联物
US11833204B2 (en) Visible light-activatable nanoparticles for cancer immunotherapy and use thereof
US9982011B2 (en) Legumain activated doxorubicin derivative as well as preparation method and application thereof
CN107459558B (zh) 2,4-二氨基-6-蝶啶基甲基甲氨基苯甲酰-Glu-肽,其合成,活性和应用
WO2003059394A2 (fr) Compositions pour la vectorisation d&#39;oligonucleotides a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisatin pour le traitement des maladies du systeme nerveux central
JP2007074989A (ja) ヒトがん細胞の浸潤および転移を阻害するペプチド、それをコードするポリヌクレオチドおよびそれらを含有する薬剤

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1220397

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant