JP2004261024A - ペプチド修飾多糖類を用いる遺伝子治療剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】遺伝子が関与する各種の疾患に対してアンチセンス医薬を適用する場合に有効なオリゴヌクレオチドを、安全でトランスフェクション効果の高い新しいタイプのキャリアーと複合体化し、遺伝子治療剤として提供することにある。
【解決手段】細胞膜に対して親和性を有し、かつトランスフェクション効果の高いペプチド鎖を修飾基として多糖類に導入することにより、新規なキャリアーが得られる。これを、対象とする疾患の遺伝子配列に実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体化したものを治療薬として用いると、疾患の抑制率が高く、かつ毒性の少ない結果が得られる。
【選択図】 図４
【解決手段】細胞膜に対して親和性を有し、かつトランスフェクション効果の高いペプチド鎖を修飾基として多糖類に導入することにより、新規なキャリアーが得られる。これを、対象とする疾患の遺伝子配列に実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体化したものを治療薬として用いると、疾患の抑制率が高く、かつ毒性の少ない結果が得られる。
【選択図】 図４
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患の原因遺伝子およびウイルス遺伝子のｍＲＮＡと配列特異的に対合し、それらの作用を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療効果を、より高く発現させるための試薬を提供することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の増殖などの機能はいろいろな機構により制御されている。最も重要な制御因子に、サイトカインと呼ばれるレセプター特異的な蛋白質がある。その蛋白質は特異的な膜結合受容体に結合し、細胞内にシグナルを伝達して、遺伝子の発現を制御することで、細胞の多くの機能を調節する。
【０００３】
アンチセンス療法は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド（一般的にはｍＲＮＡ）の核酸機能の制御因子としての使用に関連している。アンチセンスオリゴヌクレオチド、即ち標的とされているセンス核酸の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、核酸の機能を調節するために、多くの異なった方法で機能することができる。標的核酸がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を妨害、またはリボソームの結合もしくは転位を阻害することによって構能してもよい。標的核酸がＤＮＡであれば、ｍＲＮＡへの転写を妨害してもよい。配列特異的アンチセンス機構によるｍＲＮＡの産生、及び／または機能を阻害することに加えて、あるオリゴヌクレオチド、特にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、部分的に非配列特異的機構に帰する作用も示すことがありうる。
そのような機構は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの抗ウイルス作用としての影響のいくつかを説明するものとして、報告されている。
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ５２： ３６５−３８４（１９９１） ： Ｍａｊｕｍｄａｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８， １３４０（１９８９）
【０００４】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、アンチセンス療法が盛んに研究されており、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告されつつある。既に開発段階に入っている医薬品の候補として、次のようなものが挙げられ、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなど多岐に及んでいる。
ている。
【０００５】
開発中の主なアンチセンス医薬（対象疾患；物質名・商品名；対象遺伝子等）癌；Ｏｎｃｏｍｙｃ−ＮＧ；ｃ−ｍｙｃ、
大腸癌、固形癌；ＧＥＭ２３１；ＰＫＡ−ＲＩα、
固形癌；ＭＧ９８；ＤＮＡメチル・トランスフェラーゼ、
肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、乳癌、脳腫瘍、悪性黒色腫；ＩＳＩＳ３５２１；ＰＫＣ−α、
乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌；ＩＳＩＳ５１３２；ｃ−ｒａｆ、
肺癌、直腸癌、膵臓癌；ＩＳＩＳ２５０３；Ｈ−ｒａｓ、
腎臓癌；ＧＴＩ２０４０；リボヌクレオチド還元酵素、
固形癌、放射線療法に耐性の癌；ＬＥ−ＡＯＮ；ｃ−ｒａｆ、
固形癌、リンパ腫；ＩＮＸ−３２８０；ｃ−ｍｙｃ、
固形癌、リンパ腫；ＧＴＩ２５０１；リボヌクレオチド還元酵素、
悪性黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、大腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病；Ｇｅｎｅｓｅｎｓｅ；細胞死抑制遺伝子ＢＣＬ−２、
白血病；ＩＮＸ３００１；ｃ−ｍｙｂ
冠動脈手術後の再狭窄防止；Ｒｅｓｔｅｎ−ＮＧ；ｃ−ｍｙｃ、
血管再狭窄抑制；デコイ；Ｅ２Ｆ、
アンチセンス経口薬、クローン病、リウマチ、乾癬；ＩＳＩＳ１０４８３８；腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α、
クローン病、リウマチ、乾癬、腎移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎；ＩＳＩＳ２３０２；細胞接着因子ＩＣＡＭ−１、
サイトメガロウイルス性網膜炎（エイズ患者）；Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（欧米で認可済）；ＣＭＶ、
ＨＩＶ（エイズウイルス）；ＧＥＭ９２；ＨＩＶ、
ＨＩＶ（エイズウイルス）；ＨＧＴＶ４３；ＨＩＶ、
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ＩＳＩＳ１４８０３； ＨＣＶ、
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ；ＨＣＶ、
喘息；ＥＰＩ２０１０；アデノシンＡ１受容体、
薬物代謝酵素；ＡＶＩ−４５５７；Ｐ４５０、
【非特許文献２】横山勇生他， 日経バイオビジネス， ２００２年， １月号， ｐ４０；大津敬他， 実験医学， １８， Ｎｏ．１２（増刊）， １７２（２０００）
【０００６】
オリゴヌクレオチドを用いる治療方法の開発は、現在広く行われている。治療薬としてのオリゴヌレオチドの正確な作用機構の決定は困難であるが、多数の機構が提案されており、これらの異なる機構のいずれかまたはすべてが協調して作用し所望の結果を生じると考えられている。作用機構の一つはアンチセンスに基づいている。一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体等の標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。標的核酸の特異的な配列とのハイブリッド形成により、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡの蛋白質コード化機能を中断する。配列特異的アンチセンス機構に加え、ある修飾されたオリゴヌクレオチドは非配列特異的機構を介して核酸の機能を阻害することが可能である。いくつかの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果と同じ塩基をランダム化された順序で含む「対照」オリゴヌクレオチドのそれとの比較の結果、対照オリゴヌクレオチドもまた蛋白質生産の阻害を示す。このような非配列特異的機構の正確な機構は未知であるが、これらの効果は対照オリゴヌクレオチドによる他の必須遺伝子の偶然阻害に起因すると考えられている。
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｋａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｐ．２２９−２４１
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを実際に医薬として使用する場合、前記配列特異性の他にも、実際的な問題が幾つか挙げられる。まず、血清、細胞、組織由来のヌクレアーゼに耐性があること。次に、無毒性で、製造コストが安価であること。標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること。細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること。高い特異性と親和性をもって高次構造を有するＲＮＡ分子の標的領域へ侵入すること。そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなどである。
【非特許文献４】横山和尚， 医学の歩み， １８４， Ｎｏ．３， ２２５（１９９８）
【０００８】
以上のような実際的な要求を満たすため、多角的な工夫が行なわれている。アンチセンスヌクレオチドは、一般に、疾患原因遺伝子およびウイルス遺伝子のｍＲＮＡと配列特異的にハイブリッド形成することにより、ｍＲＮＡの転写、翻訳を阻害するものであり、ＲＮＡとＤＮＡがある。その中で、医薬用にはＤＮＡの方が多く用いられている。天然型の核酸を適用する以外に、人工的に修飾した、修飾オリゴヌクレオチドが多く開発されている。生理学的安定性の改良で代表的なものに、ホスホジエステル結合の酸素の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート型のオリゴヌクレオチドがある。そのほか、ボラノホスフェート、ホスホロセレネート、アミデート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドやメチルホスホロエート（Ｍ−オリゴ）、ペプチド核酸型の修飾化合物（ＰＮＡ）も知られている。
【０００９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸を治療薬として使用する場合、細胞内への導入効率をあげるため、一般に、遺伝子キャリアーが併用される。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因して、これらのｉｎ ｖｉｖｏにおける使用は制限されている。
【非特許文献５】Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０， ９２６−９３２（１９９３）
【非特許文献６】Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７， ４５５−４６０（１９９２）
【非特許文献７】Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０， ４０４−４１０（１９９５）
【００１０】
そこで、天然由来の遺伝子キャリアーの代替物として、ウイルス系よりも取り扱いが簡単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率良く集中させることが可能な人工材料の非ウイルスキャリアーの使用か提示された。
【非特許文献８】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｌｌａｎｄ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒ． Ｒｅｌ．， ３９， ３５７−３７２（１９９６）
【００１１】
現在、非ウイルス性の人工キャリアーとしてよく検討されているのはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。多数の異なった付着細胞および浮遊細胞ライン中では、３次元的分岐構造のカチオンポリマーであるＰＥＩは、ある場合には平均以上のトランスフェクション率を引き起こす結果になった。
【非特許文献９】Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ３， １０７４−１０８０（１９９６）
【００１２】
例えば３Ｔ３繊維芽細胞の９５％形質転換がｉｎ ｖｉｔｒｏで達成された。Ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子のマウス脳中へのＰＥＩ仲介伝達では、ニューロンおよびグリア細胞中のリポーター遺伝子およびＢｃ１２遺伝子の長期発現が起こる結果になり、アデノウイルスによる遺伝子伝達の場合と同じ程度のものであった。
【非特許文献１０】Ａｂｄａｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ７， １９４７−１９５４（１９９６）
【００１３】
また、ＰＥＩと同様、窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などが遺伝子キャリー、トランスフェクション剤、薬物担体などという名称で、最近、多数の特許が出願されるようになってきた。
【００１４】
しかしながら、ＰＥＩのようなカチオン性ポリマーの安全性についてはほとんど確認されていないのが現状である。カチオン性を付与するには、通常、アミノ基の存在が不可欠であるが、アミノ基を有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性が考えられる。事実、今まで検討されたいかなるカチオン性ポリマーも未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
【非特許文献１１】医薬品添加物辞典
【非特許文献１２】日本医薬品添加剤協会縄集、薬事日報社
【００１５】
しかるに、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β−１，３−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
【非特許文献１３】Ｔｈｅｒｅｓａ Ｍ． ＭｃＩｎｔｉｒｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ａ． Ｂｒａｎｔ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， ６９０９（１９９８）
【００１６】
さらに、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約２０年の使用実績がある。
【非特許文献１４】清水， 陳， 荷見， 増淵， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ， ４， １３９０（１９９０）；長谷川， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ８， ２２５（１９９２）
【００１７】
このようなβ−１，３−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲイトを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが知られている。この先行技術には、天然のβ−１，３−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−１，３−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−１，３−グルカン／生体材料のコンジュゲイトを製造する方法が述ベられている。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４８００
【００１８】
また、最近、本発明者らにより、β−１，３−グルカンまたはβ−１，３−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、各種の核酸と新しいタイブの複合体を形成することが見出された。
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ００／０２２２８
【非特許文献１５】櫻井， 新海， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２， ４５２０（２０００）；木村， 甲元， 櫻井， 新海， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １２４２（２０００）
【００１９】
もともと天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、主に、水素結合を介して形成されると考えられる。
【非特許文献１６】櫻井和朗， 井口律子， 木村太郎， 甲元一也， 水雅美， 新海征治， Ｐｏｌｙｍ． Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ Ｊｐｎ．， ４９， ４０５４（２０００）
【００２０】
天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、ケースによってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類に各種官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も開発されている。さらに、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜の透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされていた。
【特許文献３】［ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５］
【００２１】
β−１，３−結合を有する多糖は、β−１，３−グルカンが代表的なもので、シゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナンまたはラミナランなどが属し、これらが本発明に使用される。これらの多糖は、分子量が数百から数十万の広範囲にわたるポリマーとして得られるが、本発明の基剤としては、分子量２０００以上のものが適する。
【００２２】
上記の多糖類は、天然のままでも遺伝子キャリアーに使用できるが、通常、そのままでは、トランスフェクション効果が必ずしも十分ではないため、適当な化学修飾を行う必要がある。核酸と結合性のある官能基としては、アミノ基で代表されるカチオン性官能基、アミノ酸官能基、インターカレーター性官能基などの導入法が提示されている。
【特許文献４】［ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８］
【００２３】
また、最近の研究成果として、特定のアミノ酸配列を含むペプチドが細胞膜に対して親和性を示すことが知られている。例えば、細胞の表面に存在する接着蛋白にインテグリンがあるが、この蛋白は、細胞外マトリックスに対する細胞の接着をつかさどる受容体であり、この細胞機能調節作用が注目されている。この膜タンパク質のスーパーファミリーであるインテグリンは細胞の接着や加入に重要な役割を果たしており、インテグリン結合に有効と認められているペプチドとしてＲＧＤ配列（配列番号１）が知られている。これは、アミノ酸残基の配列がアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）となっている、多くのペプチドがインテグリン結合リガンドに保存されていることに由来する。そして、ＲＧＤを含む配列のペプチドを、既知のカチオン性キャリアーに導入することによって、遺伝子のトランスフェクション効果を上げる試みが、文献に現れている。ちなみに、以下のインテグリン結合性ペプチドのアミノ酸残基の配列が特許に例示されている。
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧＧ［Ｋ］１６（配列番号１４）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧ［Ｋ］１６（配列番号１５）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣ［Ｋ］１６（配列番号１６）
［Ｋ］１６ＧＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号１７）
ＣＲＧＤＭＦＧＣ（配列番号１８）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣ（配列番号１９）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧ（配列番号２０）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号２１）
ＧＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号２２）
ＧＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＡ（配列番号２３）
【特許文献５】特表２００２−５０２２４３
【００２４】
また、次の配列はＲＧＤを含まないが、上記の例と同様に、インテグリン結合性のペプチド鎖であり、本発明の多糖系遺伝子キャリアーの修飾基として効果的に導入することができる。
ＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＡ（配列番号２４）、
ＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧ（配列番号２５）、
ＣＲＲＥＴＴＡＷＡＣ（配列番号２６）、
ＧＡＣＱＩＤＳＰＣＡ（配列番号２７）、
ＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧＫＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧ（配列番号２８）
【００２５】
さらに、次に例示する配列は細胞膜透過性をもつペプチドとして知られているものである。
ウイルス由来のもの：
ＨＩＶ−１ Ｔａｔペプチド４８−６０番目のＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３）、
ＨＩＶ−１ Ｒｅｖペプチド３４−５０番目のＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号４）、
ＦＨＶ（ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ）Ｃｏａｔペプチド３５−４９番目のＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号５）、
ＢＭＷ（ｂｏｒｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ） Ｇａｇペプチド７−２５番目のＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号６）、
ＨＴＬＶ−ＩＩ（ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ） Ｒｅｘペプチド４−１６番目のＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号７）、
ＣＣＭＶ（ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ） Ｇａｇペプチド７−２５番目のＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ（配列番号８）、
ファージ由来のもの：
Ｐ２２（Ｐ２２ファージ） Ｎ−ペプチド１４−３０番目のＮＡＫＴＲＲＲＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ（配列番号９）、λ（ラムダファージ） Ｎ−ペプチド１−２２番目のＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号１０）、
φ（ファイファージ） ２１Ｎ−ペプチド１２−２９番目のＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ（配列番号１１）、
その他のもの：
酵母ＰＲＰ６−ペプチド１２９−１４４番目のＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ配列番号１２）、
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ） Ａｎｔペプチド（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ：転写因子）４３−５８番目のＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１３、４８−５６番目が特に重要）、
オリゴアルギニン ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２、８個が最も重要、直鎖または分岐）
【非特許文献１７】二木史朗， 蛋白質・核酸・酵素， ４７， １４１５−１４１９（２００２）
【非特許文献１８】Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆａｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ６６４−６６８ （１９９４）
【非特許文献１９】Ｄａｎｉｅｌｅ Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， １８１８８−１８１９３ （１９９６）
【非特許文献２０】Ｄａｎｉｅｌｅ Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８， ８４−８７ （１９９８）
【非特許文献２１】Ｓｈｉｒｏｈ Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１， ７９２５−７９３０ （２００２）
【非特許文献２２】Ｓｈｉｒｏｈ Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５８３６−５８４０ （２００１）
【００２６】
それらと一部に重複するものもあるが、核局在化タンパク質またはペプチド、融合誘導ペプチドまたはタンパク質、レセプター−リガンドペプチドまたはタンパク質、輸送ペプチドまたはタンパク質、ウイルス性ペプチドまたはタンパク質として分類されている多くのアミノ酸配列、標的化物質と記載されているペプチドまたはタンパク質の中のアミノ酸配列、および核酸の凝縮レベルで作用する化合物などが文献に例示されている。
【特許文献５】特表２００１−５１７９３９
【特許文献６】特表２００２−５１８３１３
【特許文献７】特表平１１−５００４３１
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、遺伝子が関与する各種の疾患に対してアンチセンス医薬を適用する場合に有効なオリゴヌクレオチドを、安全でトランスフェクション効果の高い新しいタイプのキャリアーと複合体化し、遺伝子治療剤として提供することにある。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
細胞膜に対して親和性を有し、かつトランスフェクション効果の高いペプチド鎖を修飾基として多糖類に導入することにより、新規なキャリアーが得られる。これを、対象とする疾患の遺伝子配列に実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体化したものを治療薬として用いると、疾患の抑制率が高く、かつ毒性の少ない結果が得られる。
【００２９】
本発明は、アンチセンスＤＮＡを用いる遺伝子治療の分野に適用され、疾患の治療効果が高く、かつ安全で実用性に富む試薬を提供するものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明で、糖の修飾剤として用いるペプチド鎖の種類は、細胞の表面と親和性を有するアミノ酸配列を持つものであれば、特に限定されるものではない。上記の背景技術において例示したものから選択することができる。
【００３１】
ペプチド鎖による多糖の化学修飾において、ペプチド鎖には対象となる糖への結合性官能基を有していることが必要である。結合性官能基およびスペーサーには特に制約はないが、マイケル付加反応によりマレインイミド基へ共有結合として固定化できるチオールを有するシステインを含むペプチド鎖は、好適な例である。糖の側鎖に対するペプチドの導入率（置換率）に関しては、ペプチドの種類などにより一概には言えないが、約０．１％以上とするのが治療効果の点で望ましい。
【００３２】
ペプチド修飾多糖類を天然または非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体化し、遺伝子治療剤として調製する方法は、ペプチド修飾のない多糖の場合と基本的に同じで、本発明者らによる先行出願特許に、詳細に開示されている方法で可能である。
【特許文献８】ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５
【特許文献９】ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８
【００３３】
生成する複合体は、通常、水溶液として得られるので、限外ろ過法などの比較的簡単な方法で必要な純度に精製された後、治療向けに効果的に使用される。治療剤としての調製法、キャラクタリゼーションおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における投与の方法と細胞増殖抑制の評価は、実施例において詳細に例示する。なお、生成した複合体は、ペプチド修飾多糖類の２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖から成る、主として水素結合に因る３重螺旋構造を有している。
【００３４】
【実施例】
実施例１
β−１ ， ３−グルカン（シゾフィラン： ＳＰＧ ）の調製 ３重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ． Ｆｒｉｅｓ（ＡＴＣＣ ４４２００）を、最小培地を用いて７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量４５万の３重螺旋シゾフィランを得た。
【非特許文献２３】Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｇ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆ． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｃ． Ｃａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌ． ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒ． ３８（１）２５３−２５４（１９９７）
【非特許文献２４】Ｋｅｎｇｏ Ｔａｂａｔａ， Ｗａｔａｒｕ Ｉｔｏ， Ｔａｋｅｍａｓａ Ｋｏｊｉｍａ， Ｓｈｏｚｏ Ｋａｗａｂａｔａ ａｎｄ Ａｋｉｒａ Ｍｉｓａｋｉ， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ８９， １２１−１３５（１９８１）
【００３５】
実施例２
結合性官能基を含むペプチドの合成 ペプチド鎖によるシゾフィランの化学修飾において、ペプチド鎖にはシゾフィランへの結合性官能基を有していることが必要である。結合性官能基およびスペーサーには特に制約はないが、ここでは、例としてマイケル付加反応によりマレインイミド基へ共有結合として固定化できるチオールを有するシステインを含むペプチド鎖の合成を以下に示す。
【００３６】
ペプチドの配列としては、細胞膜に対する親和性が高いことが知られているアルギニンオリゴマーの８量体を合成し、そのペプチドをＲ８と表記する（配列番号２）。また、細胞接着因子が認識することが知られているアルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列（ＲＧＤ：配列番号１）のペプチドをそれぞれ合成した。ペプチドの詳細な配列は図１に示す通りで、Ｎ末端にシステインを導入している。
【００３７】
ペプチド鎖はＦｍｏｃ法に従って合成し、精製はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にて行った（精製条件：日立Ｌ−７１００、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ社製）、溶離液はアセトニトリル／蒸留水（共に０．１ｖｏｌ％のトリフルオロ酢酸を含む）＝ ５／９５を４０分かけて２０／８０にグラジエントした）。
【非特許文献２５】固相合成ハンドブック，メルク株式会社
【００３８】
同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（マトリックス支援イオン化−飛行時間型質量分析計）にて行い、結果を表１に示した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例３
ペプチド修飾多糖の合成 実施例２にて合成した、ペプチド鎖を多糖（シゾフィラン）へ導入するために図２に示す合成スキームに従って、本発明に従うペプチド修飾多糖を合成した。反応は、過ヨウ素酸酸化、還元的アミノ化、スペーサーの導入、ペプチドの導入反応の４段階からなる。ペプチドの導入率は過ヨウ素酸酸化反応により制御することが可能である。２〜４段階目では反応の進行を元素分析により評価した。結果は実施例４に示す。
【００４１】
まず、実施例１で調製したシゾフィラン３００ｍｇを水３００ｍｌに溶解させ、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（９．８７ｍｇ：シゾフィランの側鎖に対して０．１等量（１０％））を加え、遮光下４℃で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、白色固体１を得た。得られた固体１１００ｍｇを極性有機溶媒であるジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと表記）１０ｍｌ、２８％アンモニア水溶液１０ｍｌに溶解させ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇ（大過剰）を加え、室温で４日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、白色固体２を得た。この固体２をＤＭＳＯ １０ｍｌに溶解させ、３−マレインイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１００ｍｇ（大過剰）を加え、窒素気流下、室温で２４時間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、白色固体３を得た。この固体３をＤＭＳＯ ５ｍｌに溶解させた。また、実施例１にて得られたシステインを含むペプチド鎖（約５０ｍｇ）を蒸留水に溶解させ、先のＤＭＳＯ溶液と混合し、その溶液を室温で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、ペプチド修飾多糖（シゾフィラン）を得た。
【００４２】
実施例４
ペプチド修飾多糖のキャラクタリゼーション 実施例３にて得られた、ペプチド修飾多糖（ここではシゾフィラン）のキャラクタリゼーション（各反応後の導入率の窒素元素分析による評価、分子量）を行った。表２には実施例３の各素反応における窒素の元素分析を基にした官能基の導入率（ペプチド修飾率）の変化を示している。また、分子量はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により評価したところ、ペプチドの修飾前後において分子量の大きな変化は起こらないことを確認している。なお、以下の各修飾多糖はＲ８（０．３）−ＳＰＧというようにペプチド鎖の構造表記と共にかっこ内にそのペプチド鎖の導入率を示す表記であらわす。
【００４３】
【表２】
【００４４】
実施例５
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ とアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＤＮＡ ）との複合体（遺伝子治療剤）の調製 実施例３で合成され、実施例４で特性化されたペプチド修飾率が０．３および０．５％のＲ８−ＳＰＧ（Ｒ８（０．３）−ＳＰＧおよびＲ８（０．５）−ＳＰＧ）、１．０および１．３％のＲＧＤ−ＳＰＧ（ＲＧＤ（１．０）−ＳＰＧおよびＲＧＤ（１．３）−ＳＰＧ）をそれぞれＤＭＳＯに溶解させ、濃度を１９．８ ｍｇ／ｍｌに調整し、この溶液１μｌ、純水３μｌ、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）１μｌと、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５μｌを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌原遺伝子として報告されているｃ−ｍｙｂ遺伝子ならびにｃ−ｒａｆ遺伝子のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列： ５’−ＧＴＧ ＣＣＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＣＧ ＧＧＣ−３’ならびに５’−ＴＣＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＴ−３’ の各３‘末端に４０のｄＡをつけたシークエンス（配列番号２９ならびに配列番号３０）を適用した。
【非特許文献２６】Ｂａｒｂａｒａ Ｍａｊｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８３， ９６３６（１９８６）
【非特許文献２７】Ａｌａｎ Ｍ． Ｇｅｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｂｒｕｎｏ Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， １３０３（１９８８）］
【非特許文献２８】Ｂｒｅｔｔ Ｐ． Ｍｏｎｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２， ６６８（１９９６）
【００４６】
実際に使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（固相合成品）は、３’末端に４０のｄＡをつけたシークエンスのｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下ＡＳ−ｃ−ｍｙｂと表記）とｃ−ｒａｆホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下ＡＳ−ｃ−ｒａｆと表記）である。
【００４７】
実施例６
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体形成のゲル電気泳動法による確認 アンチセンスオリゴヌクレオチドは負に帯電したリン酸基が正電荷方向に電気泳動する。さらにゲルマトリックスの網目の隙間を泳動するためアンチセンスオリゴヌクレオチドがペプチド修飾多糖類と複合体を形成することにより分子量が大きくなるほど移動度は減少する。そこで、アンチセンスオリゴヌクレオチドにＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧを添加して実施例５に記載の方法で複合体を形成させた後、ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ （ｐＨ ７．０）、５ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＤＭＳＯ）中で２％アガロースゲル用いて２Ｖ／ｃｍで１時間電気泳動させ、Ｇｅｌ Ｓｔａｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｔａｉｎ（ＢＭＡ）で染色後、トランスイルミネーター下でその移動度を評価した。
図３に例示したアガロースゲル電気泳動の結果によると、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの添加に伴って、アンチセンスオリゴヌクレオチドの移動度は減少しており、複合体の形成が確認された。
【００４８】
実施例７
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ と複合体を形成させたヒト ｃ−ｍｙｂ ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ ）によるヒト由来黒色腫瘍細胞 Ａ３７５ の増殖抑制の効果
９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）に懸濁した２×１０３個のヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５（ＡＴＣＣより入手）を播種しＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂおよび実施例５で調製したＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。その結果を図４に示した。
図４に例示したように、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、２０から３０％程度細胞の生存率が低下している。また、同じ条件でＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧのみを投与してもＡ３７５細胞の生存率にはほとんど影響を与えていない。
【００４９】
実施例８および比較例１
ペプチド修飾多糖類と複合体を形成させた、ヒト ｃ−ｍｙｂ ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ ）およびヒト ｃ−ｍｙｂ ホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド（ Ｓ−ｃ−ｍｙｂ ）によるヒト由来大腸癌細胞 ｃｏｌｏ２０５ の増殖抑制 ９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）に懸濁した２×１０３個のヒト由来大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣより入手）を播種しＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂおよび実施例５で調製したＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。
【００５０】
また、比較例としてＡＳ−ｃ−ｍｙｂの代わりにヒトｃ−ｍｙｂの配列の一部でありアンチセンス効果（治療効果を示さない）のないヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド［Ａｌａｎ Ｍ． Ｇｅｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｂｒｕｎｏ Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， １３０３（１９８８）］に記載のセンス配列ＣＡＣ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＣＧの３‘末端に４０のｄＡをつけたシークエンス（配列番号３１： 以下Ｓ ｃ−ｍｙｂと表記）を上記と同様の方法で、ヒト由来大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０５の増殖抑制の効果を評価した。この結果を図５に例示した。
【００５１】
図５左のように、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、１５から２５％程度細胞の生存率が低下している。一方、図５右に示すように、Ｓ−ｃ−ｍｙｂ単独投与区およびＲ８−ＳＰＧまたはＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体投与区では細胞の生存率はほとんど低下せず、治療効果のないオリゴヌクレオチドとの複合体形成物は、治療効果が無いことが示された。
【００５２】
実施例９
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ と複合体を形成させたヒト ｃ−ｒａｆ ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＡＳ−ｃ−ｒａｆ ）によるヒト由来肺癌細胞 Ａ５４９ の増殖抑制の効果 ９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁した２×１０３個のヒト由来肺癌細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣより入手）を播種しＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ−ｃ−ｒａｆおよび実施例５で調製したＡＳ−ｃ−ｒａｆとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。その結果を図６に示した。
【００５３】
図６に例示したように、ＡＳ−ｃ−ｒａｆ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｒａｆとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、１８から２６％程度細胞の生存率が低下している。また、同じ条件でＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧのみを投与してもＡ５４９細胞の生存率にはほとんど影響を与えていない。
【００５４】
【発明の効果】
本発明は、遺伝子治療における新規な治療用薬剤を提供し、その調製法を開示するものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドＲ８およびＲＧＤのアミノ酸配列を示す。
【図２】ペプチド修飾多糖（Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧ）の合成スキーム例を示す。
【図３】本発明に従う遺伝子治療剤の、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体化を示すアガロースゲル電気泳動パターンを示している。
【図４】本発明に従う遺伝子治療剤の、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖抑制試験の結果を示す。
【図５】
本発明に従う遺伝子治療剤の、ペプチド修飾多糖類とヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ）との複合体使用によるヒト由来大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０５の増殖抑制試験の結果を図の左側に、および治療効果を示さないヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド（Ｓ−ｃ−ｍｙｂ）との複合体使用による結果を右側に示す。
【図６】本発明に従う遺伝子治療剤の、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト由来肺癌細胞Ａ５４９の増殖抑制試験の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患の原因遺伝子およびウイルス遺伝子のｍＲＮＡと配列特異的に対合し、それらの作用を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療効果を、より高く発現させるための試薬を提供することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の増殖などの機能はいろいろな機構により制御されている。最も重要な制御因子に、サイトカインと呼ばれるレセプター特異的な蛋白質がある。その蛋白質は特異的な膜結合受容体に結合し、細胞内にシグナルを伝達して、遺伝子の発現を制御することで、細胞の多くの機能を調節する。
【０００３】
アンチセンス療法は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド（一般的にはｍＲＮＡ）の核酸機能の制御因子としての使用に関連している。アンチセンスオリゴヌクレオチド、即ち標的とされているセンス核酸の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、核酸の機能を調節するために、多くの異なった方法で機能することができる。標的核酸がｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳を妨害、またはリボソームの結合もしくは転位を阻害することによって構能してもよい。標的核酸がＤＮＡであれば、ｍＲＮＡへの転写を妨害してもよい。配列特異的アンチセンス機構によるｍＲＮＡの産生、及び／または機能を阻害することに加えて、あるオリゴヌクレオチド、特にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、部分的に非配列特異的機構に帰する作用も示すことがありうる。
そのような機構は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの抗ウイルス作用としての影響のいくつかを説明するものとして、報告されている。
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ５２： ３６５−３８４（１９９１） ： Ｍａｊｕｍｄａｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８， １３４０（１９８９）
【０００４】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、アンチセンス療法が盛んに研究されており、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告されつつある。既に開発段階に入っている医薬品の候補として、次のようなものが挙げられ、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなど多岐に及んでいる。
ている。
【０００５】
開発中の主なアンチセンス医薬（対象疾患；物質名・商品名；対象遺伝子等）癌；Ｏｎｃｏｍｙｃ−ＮＧ；ｃ−ｍｙｃ、
大腸癌、固形癌；ＧＥＭ２３１；ＰＫＡ−ＲＩα、
固形癌；ＭＧ９８；ＤＮＡメチル・トランスフェラーゼ、
肺癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、乳癌、脳腫瘍、悪性黒色腫；ＩＳＩＳ３５２１；ＰＫＣ−α、
乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌；ＩＳＩＳ５１３２；ｃ−ｒａｆ、
肺癌、直腸癌、膵臓癌；ＩＳＩＳ２５０３；Ｈ−ｒａｓ、
腎臓癌；ＧＴＩ２０４０；リボヌクレオチド還元酵素、
固形癌、放射線療法に耐性の癌；ＬＥ−ＡＯＮ；ｃ−ｒａｆ、
固形癌、リンパ腫；ＩＮＸ−３２８０；ｃ−ｍｙｃ、
固形癌、リンパ腫；ＧＴＩ２５０１；リボヌクレオチド還元酵素、
悪性黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、大腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病；Ｇｅｎｅｓｅｎｓｅ；細胞死抑制遺伝子ＢＣＬ−２、
白血病；ＩＮＸ３００１；ｃ−ｍｙｂ
冠動脈手術後の再狭窄防止；Ｒｅｓｔｅｎ−ＮＧ；ｃ−ｍｙｃ、
血管再狭窄抑制；デコイ；Ｅ２Ｆ、
アンチセンス経口薬、クローン病、リウマチ、乾癬；ＩＳＩＳ１０４８３８；腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α、
クローン病、リウマチ、乾癬、腎移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎；ＩＳＩＳ２３０２；細胞接着因子ＩＣＡＭ−１、
サイトメガロウイルス性網膜炎（エイズ患者）；Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（欧米で認可済）；ＣＭＶ、
ＨＩＶ（エイズウイルス）；ＧＥＭ９２；ＨＩＶ、
ＨＩＶ（エイズウイルス）；ＨＧＴＶ４３；ＨＩＶ、
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ＩＳＩＳ１４８０３； ＨＣＶ、
ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）；ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ；ＨＣＶ、
喘息；ＥＰＩ２０１０；アデノシンＡ１受容体、
薬物代謝酵素；ＡＶＩ−４５５７；Ｐ４５０、
【非特許文献２】横山勇生他， 日経バイオビジネス， ２００２年， １月号， ｐ４０；大津敬他， 実験医学， １８， Ｎｏ．１２（増刊）， １７２（２０００）
【０００６】
オリゴヌクレオチドを用いる治療方法の開発は、現在広く行われている。治療薬としてのオリゴヌレオチドの正確な作用機構の決定は困難であるが、多数の機構が提案されており、これらの異なる機構のいずれかまたはすべてが協調して作用し所望の結果を生じると考えられている。作用機構の一つはアンチセンスに基づいている。一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体等の標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。標的核酸の特異的な配列とのハイブリッド形成により、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡの蛋白質コード化機能を中断する。配列特異的アンチセンス機構に加え、ある修飾されたオリゴヌクレオチドは非配列特異的機構を介して核酸の機能を阻害することが可能である。いくつかの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果と同じ塩基をランダム化された順序で含む「対照」オリゴヌクレオチドのそれとの比較の結果、対照オリゴヌクレオチドもまた蛋白質生産の阻害を示す。このような非配列特異的機構の正確な機構は未知であるが、これらの効果は対照オリゴヌクレオチドによる他の必須遺伝子の偶然阻害に起因すると考えられている。
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｋａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｐ．２２９−２４１
【０００７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを実際に医薬として使用する場合、前記配列特異性の他にも、実際的な問題が幾つか挙げられる。まず、血清、細胞、組織由来のヌクレアーゼに耐性があること。次に、無毒性で、製造コストが安価であること。標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること。細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること。高い特異性と親和性をもって高次構造を有するＲＮＡ分子の標的領域へ侵入すること。そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなどである。
【非特許文献４】横山和尚， 医学の歩み， １８４， Ｎｏ．３， ２２５（１９９８）
【０００８】
以上のような実際的な要求を満たすため、多角的な工夫が行なわれている。アンチセンスヌクレオチドは、一般に、疾患原因遺伝子およびウイルス遺伝子のｍＲＮＡと配列特異的にハイブリッド形成することにより、ｍＲＮＡの転写、翻訳を阻害するものであり、ＲＮＡとＤＮＡがある。その中で、医薬用にはＤＮＡの方が多く用いられている。天然型の核酸を適用する以外に、人工的に修飾した、修飾オリゴヌクレオチドが多く開発されている。生理学的安定性の改良で代表的なものに、ホスホジエステル結合の酸素の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート型のオリゴヌクレオチドがある。そのほか、ボラノホスフェート、ホスホロセレネート、アミデート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドやメチルホスホロエート（Ｍ−オリゴ）、ペプチド核酸型の修飾化合物（ＰＮＡ）も知られている。
【０００９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸を治療薬として使用する場合、細胞内への導入効率をあげるため、一般に、遺伝子キャリアーが併用される。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因して、これらのｉｎ ｖｉｖｏにおける使用は制限されている。
【非特許文献５】Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６０， ９２６−９３２（１９９３）
【非特許文献６】Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７， ４５５−４６０（１９９２）
【非特許文献７】Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０， ４０４−４１０（１９９５）
【００１０】
そこで、天然由来の遺伝子キャリアーの代替物として、ウイルス系よりも取り扱いが簡単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率良く集中させることが可能な人工材料の非ウイルスキャリアーの使用か提示された。
【非特許文献８】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｌｌａｎｄ， Ｊ． Ｃｏｎｔｒ． Ｒｅｌ．， ３９， ３５７−３７２（１９９６）
【００１１】
現在、非ウイルス性の人工キャリアーとしてよく検討されているのはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。多数の異なった付着細胞および浮遊細胞ライン中では、３次元的分岐構造のカチオンポリマーであるＰＥＩは、ある場合には平均以上のトランスフェクション率を引き起こす結果になった。
【非特許文献９】Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ３， １０７４−１０８０（１９９６）
【００１２】
例えば３Ｔ３繊維芽細胞の９５％形質転換がｉｎ ｖｉｔｒｏで達成された。Ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子のマウス脳中へのＰＥＩ仲介伝達では、ニューロンおよびグリア細胞中のリポーター遺伝子およびＢｃ１２遺伝子の長期発現が起こる結果になり、アデノウイルスによる遺伝子伝達の場合と同じ程度のものであった。
【非特許文献１０】Ａｂｄａｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ７， １９４７−１９５４（１９９６）
【００１３】
また、ＰＥＩと同様、窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などが遺伝子キャリー、トランスフェクション剤、薬物担体などという名称で、最近、多数の特許が出願されるようになってきた。
【００１４】
しかしながら、ＰＥＩのようなカチオン性ポリマーの安全性についてはほとんど確認されていないのが現状である。カチオン性を付与するには、通常、アミノ基の存在が不可欠であるが、アミノ基を有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性が考えられる。事実、今まで検討されたいかなるカチオン性ポリマーも未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
【非特許文献１１】医薬品添加物辞典
【非特許文献１２】日本医薬品添加剤協会縄集、薬事日報社
【００１５】
しかるに、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β−１，３−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
【非特許文献１３】Ｔｈｅｒｅｓａ Ｍ． ＭｃＩｎｔｉｒｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ａ． Ｂｒａｎｔ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２０， ６９０９（１９９８）
【００１６】
さらに、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約２０年の使用実績がある。
【非特許文献１４】清水， 陳， 荷見， 増淵， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ， ４， １３９０（１９９０）；長谷川， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ８， ２２５（１９９２）
【００１７】
このようなβ−１，３−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲイトを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが知られている。この先行技術には、天然のβ−１，３−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−１，３−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−１，３−グルカン／生体材料のコンジュゲイトを製造する方法が述ベられている。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４８００
【００１８】
また、最近、本発明者らにより、β−１，３−グルカンまたはβ−１，３−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、各種の核酸と新しいタイブの複合体を形成することが見出された。
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ００／０２２２８
【非特許文献１５】櫻井， 新海， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２２， ４５２０（２０００）；木村， 甲元， 櫻井， 新海， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １２４２（２０００）
【００１９】
もともと天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、主に、水素結合を介して形成されると考えられる。
【非特許文献１６】櫻井和朗， 井口律子， 木村太郎， 甲元一也， 水雅美， 新海征治， Ｐｏｌｙｍ． Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ Ｊｐｎ．， ４９， ４０５４（２０００）
【００２０】
天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、ケースによってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類に各種官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も開発されている。さらに、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜の透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされていた。
【特許文献３】［ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５］
【００２１】
β−１，３−結合を有する多糖は、β−１，３−グルカンが代表的なもので、シゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナンまたはラミナランなどが属し、これらが本発明に使用される。これらの多糖は、分子量が数百から数十万の広範囲にわたるポリマーとして得られるが、本発明の基剤としては、分子量２０００以上のものが適する。
【００２２】
上記の多糖類は、天然のままでも遺伝子キャリアーに使用できるが、通常、そのままでは、トランスフェクション効果が必ずしも十分ではないため、適当な化学修飾を行う必要がある。核酸と結合性のある官能基としては、アミノ基で代表されるカチオン性官能基、アミノ酸官能基、インターカレーター性官能基などの導入法が提示されている。
【特許文献４】［ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８］
【００２３】
また、最近の研究成果として、特定のアミノ酸配列を含むペプチドが細胞膜に対して親和性を示すことが知られている。例えば、細胞の表面に存在する接着蛋白にインテグリンがあるが、この蛋白は、細胞外マトリックスに対する細胞の接着をつかさどる受容体であり、この細胞機能調節作用が注目されている。この膜タンパク質のスーパーファミリーであるインテグリンは細胞の接着や加入に重要な役割を果たしており、インテグリン結合に有効と認められているペプチドとしてＲＧＤ配列（配列番号１）が知られている。これは、アミノ酸残基の配列がアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）となっている、多くのペプチドがインテグリン結合リガンドに保存されていることに由来する。そして、ＲＧＤを含む配列のペプチドを、既知のカチオン性キャリアーに導入することによって、遺伝子のトランスフェクション効果を上げる試みが、文献に現れている。ちなみに、以下のインテグリン結合性ペプチドのアミノ酸残基の配列が特許に例示されている。
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧＧ［Ｋ］１６（配列番号１４）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧ［Ｋ］１６（配列番号１５）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣ［Ｋ］１６（配列番号１６）
［Ｋ］１６ＧＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号１７）
ＣＲＧＤＭＦＧＣ（配列番号１８）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣ（配列番号１９）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＧ（配列番号２０）
ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号２１）
ＧＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（配列番号２２）
ＧＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＡ（配列番号２３）
【特許文献５】特表２００２−５０２２４３
【００２４】
また、次の配列はＲＧＤを含まないが、上記の例と同様に、インテグリン結合性のペプチド鎖であり、本発明の多糖系遺伝子キャリアーの修飾基として効果的に導入することができる。
ＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＡ（配列番号２４）、
ＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧ（配列番号２５）、
ＣＲＲＥＴＴＡＷＡＣ（配列番号２６）、
ＧＡＣＱＩＤＳＰＣＡ（配列番号２７）、
ＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧＫＧＡＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧ（配列番号２８）
【００２５】
さらに、次に例示する配列は細胞膜透過性をもつペプチドとして知られているものである。
ウイルス由来のもの：
ＨＩＶ−１ Ｔａｔペプチド４８−６０番目のＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３）、
ＨＩＶ−１ Ｒｅｖペプチド３４−５０番目のＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号４）、
ＦＨＶ（ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ）Ｃｏａｔペプチド３５−４９番目のＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号５）、
ＢＭＷ（ｂｏｒｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ） Ｇａｇペプチド７−２５番目のＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号６）、
ＨＴＬＶ−ＩＩ（ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ） Ｒｅｘペプチド４−１６番目のＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号７）、
ＣＣＭＶ（ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ） Ｇａｇペプチド７−２５番目のＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ（配列番号８）、
ファージ由来のもの：
Ｐ２２（Ｐ２２ファージ） Ｎ−ペプチド１４−３０番目のＮＡＫＴＲＲＲＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ（配列番号９）、λ（ラムダファージ） Ｎ−ペプチド１−２２番目のＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号１０）、
φ（ファイファージ） ２１Ｎ−ペプチド１２−２９番目のＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ（配列番号１１）、
その他のもの：
酵母ＰＲＰ６−ペプチド１２９−１４４番目のＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ配列番号１２）、
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ） Ａｎｔペプチド（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ：転写因子）４３−５８番目のＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１３、４８−５６番目が特に重要）、
オリゴアルギニン ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２、８個が最も重要、直鎖または分岐）
【非特許文献１７】二木史朗， 蛋白質・核酸・酵素， ４７， １４１５−１４１９（２００２）
【非特許文献１８】Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆａｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１， ６６４−６６８ （１９９４）
【非特許文献１９】Ｄａｎｉｅｌｅ Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， １８１８８−１８１９３ （１９９６）
【非特許文献２０】Ｄａｎｉｅｌｅ Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８， ８４−８７ （１９９８）
【非特許文献２１】Ｓｈｉｒｏｈ Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１， ７９２５−７９３０ （２００２）
【非特許文献２２】Ｓｈｉｒｏｈ Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５８３６−５８４０ （２００１）
【００２６】
それらと一部に重複するものもあるが、核局在化タンパク質またはペプチド、融合誘導ペプチドまたはタンパク質、レセプター−リガンドペプチドまたはタンパク質、輸送ペプチドまたはタンパク質、ウイルス性ペプチドまたはタンパク質として分類されている多くのアミノ酸配列、標的化物質と記載されているペプチドまたはタンパク質の中のアミノ酸配列、および核酸の凝縮レベルで作用する化合物などが文献に例示されている。
【特許文献５】特表２００１−５１７９３９
【特許文献６】特表２００２−５１８３１３
【特許文献７】特表平１１−５００４３１
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、遺伝子が関与する各種の疾患に対してアンチセンス医薬を適用する場合に有効なオリゴヌクレオチドを、安全でトランスフェクション効果の高い新しいタイプのキャリアーと複合体化し、遺伝子治療剤として提供することにある。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
細胞膜に対して親和性を有し、かつトランスフェクション効果の高いペプチド鎖を修飾基として多糖類に導入することにより、新規なキャリアーが得られる。これを、対象とする疾患の遺伝子配列に実質的に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体化したものを治療薬として用いると、疾患の抑制率が高く、かつ毒性の少ない結果が得られる。
【００２９】
本発明は、アンチセンスＤＮＡを用いる遺伝子治療の分野に適用され、疾患の治療効果が高く、かつ安全で実用性に富む試薬を提供するものである。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明で、糖の修飾剤として用いるペプチド鎖の種類は、細胞の表面と親和性を有するアミノ酸配列を持つものであれば、特に限定されるものではない。上記の背景技術において例示したものから選択することができる。
【００３１】
ペプチド鎖による多糖の化学修飾において、ペプチド鎖には対象となる糖への結合性官能基を有していることが必要である。結合性官能基およびスペーサーには特に制約はないが、マイケル付加反応によりマレインイミド基へ共有結合として固定化できるチオールを有するシステインを含むペプチド鎖は、好適な例である。糖の側鎖に対するペプチドの導入率（置換率）に関しては、ペプチドの種類などにより一概には言えないが、約０．１％以上とするのが治療効果の点で望ましい。
【００３２】
ペプチド修飾多糖類を天然または非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドと複合体化し、遺伝子治療剤として調製する方法は、ペプチド修飾のない多糖の場合と基本的に同じで、本発明者らによる先行出願特許に、詳細に開示されている方法で可能である。
【特許文献８】ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５
【特許文献９】ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８
【００３３】
生成する複合体は、通常、水溶液として得られるので、限外ろ過法などの比較的簡単な方法で必要な純度に精製された後、治療向けに効果的に使用される。治療剤としての調製法、キャラクタリゼーションおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における投与の方法と細胞増殖抑制の評価は、実施例において詳細に例示する。なお、生成した複合体は、ペプチド修飾多糖類の２本鎖とアンチセンスオリゴヌクレオチドの１本鎖から成る、主として水素結合に因る３重螺旋構造を有している。
【００３４】
【実施例】
実施例１
β−１ ， ３−グルカン（シゾフィラン： ＳＰＧ ）の調製 ３重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ． Ｆｒｉｅｓ（ＡＴＣＣ ４４２００）を、最小培地を用いて７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量４５万の３重螺旋シゾフィランを得た。
【非特許文献２３】Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｇ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆ． Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｃ． Ｃａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌ． ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒ． ３８（１）２５３−２５４（１９９７）
【非特許文献２４】Ｋｅｎｇｏ Ｔａｂａｔａ， Ｗａｔａｒｕ Ｉｔｏ， Ｔａｋｅｍａｓａ Ｋｏｊｉｍａ， Ｓｈｏｚｏ Ｋａｗａｂａｔａ ａｎｄ Ａｋｉｒａ Ｍｉｓａｋｉ， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ８９， １２１−１３５（１９８１）
【００３５】
実施例２
結合性官能基を含むペプチドの合成 ペプチド鎖によるシゾフィランの化学修飾において、ペプチド鎖にはシゾフィランへの結合性官能基を有していることが必要である。結合性官能基およびスペーサーには特に制約はないが、ここでは、例としてマイケル付加反応によりマレインイミド基へ共有結合として固定化できるチオールを有するシステインを含むペプチド鎖の合成を以下に示す。
【００３６】
ペプチドの配列としては、細胞膜に対する親和性が高いことが知られているアルギニンオリゴマーの８量体を合成し、そのペプチドをＲ８と表記する（配列番号２）。また、細胞接着因子が認識することが知られているアルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列（ＲＧＤ：配列番号１）のペプチドをそれぞれ合成した。ペプチドの詳細な配列は図１に示す通りで、Ｎ末端にシステインを導入している。
【００３７】
ペプチド鎖はＦｍｏｃ法に従って合成し、精製はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にて行った（精製条件：日立Ｌ−７１００、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ社製）、溶離液はアセトニトリル／蒸留水（共に０．１ｖｏｌ％のトリフルオロ酢酸を含む）＝ ５／９５を４０分かけて２０／８０にグラジエントした）。
【非特許文献２５】固相合成ハンドブック，メルク株式会社
【００３８】
同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（マトリックス支援イオン化−飛行時間型質量分析計）にて行い、結果を表１に示した。
【００３９】
【表１】
実施例３
ペプチド修飾多糖の合成 実施例２にて合成した、ペプチド鎖を多糖（シゾフィラン）へ導入するために図２に示す合成スキームに従って、本発明に従うペプチド修飾多糖を合成した。反応は、過ヨウ素酸酸化、還元的アミノ化、スペーサーの導入、ペプチドの導入反応の４段階からなる。ペプチドの導入率は過ヨウ素酸酸化反応により制御することが可能である。２〜４段階目では反応の進行を元素分析により評価した。結果は実施例４に示す。
【００４１】
まず、実施例１で調製したシゾフィラン３００ｍｇを水３００ｍｌに溶解させ、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（９．８７ｍｇ：シゾフィランの側鎖に対して０．１等量（１０％））を加え、遮光下４℃で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、白色固体１を得た。得られた固体１１００ｍｇを極性有機溶媒であるジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと表記）１０ｍｌ、２８％アンモニア水溶液１０ｍｌに溶解させ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム２００ｍｇ（大過剰）を加え、室温で４日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、白色固体２を得た。この固体２をＤＭＳＯ １０ｍｌに溶解させ、３−マレインイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１００ｍｇ（大過剰）を加え、窒素気流下、室温で２４時間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、白色固体３を得た。この固体３をＤＭＳＯ ５ｍｌに溶解させた。また、実施例１にて得られたシステインを含むペプチド鎖（約５０ｍｇ）を蒸留水に溶解させ、先のＤＭＳＯ溶液と混合し、その溶液を室温で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界１２０００）で透析後、凍結乾燥し、ペプチド修飾多糖（シゾフィラン）を得た。
【００４２】
実施例４
ペプチド修飾多糖のキャラクタリゼーション 実施例３にて得られた、ペプチド修飾多糖（ここではシゾフィラン）のキャラクタリゼーション（各反応後の導入率の窒素元素分析による評価、分子量）を行った。表２には実施例３の各素反応における窒素の元素分析を基にした官能基の導入率（ペプチド修飾率）の変化を示している。また、分子量はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により評価したところ、ペプチドの修飾前後において分子量の大きな変化は起こらないことを確認している。なお、以下の各修飾多糖はＲ８（０．３）−ＳＰＧというようにペプチド鎖の構造表記と共にかっこ内にそのペプチド鎖の導入率を示す表記であらわす。
【００４３】
【表２】
実施例５
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ とアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＤＮＡ ）との複合体（遺伝子治療剤）の調製 実施例３で合成され、実施例４で特性化されたペプチド修飾率が０．３および０．５％のＲ８−ＳＰＧ（Ｒ８（０．３）−ＳＰＧおよびＲ８（０．５）−ＳＰＧ）、１．０および１．３％のＲＧＤ−ＳＰＧ（ＲＧＤ（１．０）−ＳＰＧおよびＲＧＤ（１．３）−ＳＰＧ）をそれぞれＤＭＳＯに溶解させ、濃度を１９．８ ｍｇ／ｍｌに調整し、この溶液１μｌ、純水３μｌ、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）１μｌと、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５μｌを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌原遺伝子として報告されているｃ−ｍｙｂ遺伝子ならびにｃ−ｒａｆ遺伝子のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列： ５’−ＧＴＧ ＣＣＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＣＧ ＧＧＣ−３’ならびに５’−ＴＣＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＴ−３’ の各３‘末端に４０のｄＡをつけたシークエンス（配列番号２９ならびに配列番号３０）を適用した。
【非特許文献２６】Ｂａｒｂａｒａ Ｍａｊｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８３， ９６３６（１９８６）
【非特許文献２７】Ａｌａｎ Ｍ． Ｇｅｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｂｒｕｎｏ Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， １３０３（１９８８）］
【非特許文献２８】Ｂｒｅｔｔ Ｐ． Ｍｏｎｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２， ６６８（１９９６）
【００４６】
実際に使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（固相合成品）は、３’末端に４０のｄＡをつけたシークエンスのｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下ＡＳ−ｃ−ｍｙｂと表記）とｃ−ｒａｆホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下ＡＳ−ｃ−ｒａｆと表記）である。
【００４７】
実施例６
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体形成のゲル電気泳動法による確認 アンチセンスオリゴヌクレオチドは負に帯電したリン酸基が正電荷方向に電気泳動する。さらにゲルマトリックスの網目の隙間を泳動するためアンチセンスオリゴヌクレオチドがペプチド修飾多糖類と複合体を形成することにより分子量が大きくなるほど移動度は減少する。そこで、アンチセンスオリゴヌクレオチドにＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧを添加して実施例５に記載の方法で複合体を形成させた後、ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ （ｐＨ ７．０）、５ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＤＭＳＯ）中で２％アガロースゲル用いて２Ｖ／ｃｍで１時間電気泳動させ、Ｇｅｌ Ｓｔａｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｔａｉｎ（ＢＭＡ）で染色後、トランスイルミネーター下でその移動度を評価した。
図３に例示したアガロースゲル電気泳動の結果によると、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの添加に伴って、アンチセンスオリゴヌクレオチドの移動度は減少しており、複合体の形成が確認された。
【００４８】
実施例７
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ と複合体を形成させたヒト ｃ−ｍｙｂ ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ ）によるヒト由来黒色腫瘍細胞 Ａ３７５ の増殖抑制の効果
９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）に懸濁した２×１０３個のヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５（ＡＴＣＣより入手）を播種しＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂおよび実施例５で調製したＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。その結果を図４に示した。
図４に例示したように、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、２０から３０％程度細胞の生存率が低下している。また、同じ条件でＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧのみを投与してもＡ３７５細胞の生存率にはほとんど影響を与えていない。
【００４９】
実施例８および比較例１
ペプチド修飾多糖類と複合体を形成させた、ヒト ｃ−ｍｙｂ ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ ）およびヒト ｃ−ｍｙｂ ホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド（ Ｓ−ｃ−ｍｙｂ ）によるヒト由来大腸癌細胞 ｃｏｌｏ２０５ の増殖抑制 ９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）に懸濁した２×１０３個のヒト由来大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣより入手）を播種しＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂおよび実施例５で調製したＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。
【００５０】
また、比較例としてＡＳ−ｃ−ｍｙｂの代わりにヒトｃ−ｍｙｂの配列の一部でありアンチセンス効果（治療効果を示さない）のないヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド［Ａｌａｎ Ｍ． Ｇｅｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｂｒｕｎｏ Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， １３０３（１９８８）］に記載のセンス配列ＣＡＣ ＧＧＣ ＣＣＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＣＧの３‘末端に４０のｄＡをつけたシークエンス（配列番号３１： 以下Ｓ ｃ−ｍｙｂと表記）を上記と同様の方法で、ヒト由来大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０５の増殖抑制の効果を評価した。この結果を図５に例示した。
【００５１】
図５左のように、ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｍｙｂとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、１５から２５％程度細胞の生存率が低下している。一方、図５右に示すように、Ｓ−ｃ−ｍｙｂ単独投与区およびＲ８−ＳＰＧまたはＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体投与区では細胞の生存率はほとんど低下せず、治療効果のないオリゴヌクレオチドとの複合体形成物は、治療効果が無いことが示された。
【００５２】
実施例９
Ｒ８−ＳＰＧ および ＲＧＤ−ＳＰＧ と複合体を形成させたヒト ｃ−ｒａｆ ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ ＡＳ−ｃ−ｒａｆ ）によるヒト由来肺癌細胞 Ａ５４９ の増殖抑制の効果 ９６穴プレートに１００μｌの１０％仔牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に懸濁した２×１０３個のヒト由来肺癌細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣより入手）を播種しＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で一晩前培養後に、ＡＳ−ｃ−ｒａｆおよび実施例５で調製したＡＳ−ｃ−ｒａｆとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとの複合体を限外ろ過膜（排除限界３０００：ミリポア）でろ過してＤＭＳＯを除去し濃度を再調整したものを添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間培養後、細胞数をＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。ＡＳ ｃ−ｍｙｂ無添加の穴の細胞数を生存率１００％として細胞増殖を評価した。その結果を図６に示した。
【００５３】
図６に例示したように、ＡＳ−ｃ−ｒａｆ単独投与よりもＡＳ−ｃ−ｒａｆとＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、１８から２６％程度細胞の生存率が低下している。また、同じ条件でＲ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧのみを投与してもＡ５４９細胞の生存率にはほとんど影響を与えていない。
【００５４】
【発明の効果】
本発明は、遺伝子治療における新規な治療用薬剤を提供し、その調製法を開示するものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドＲ８およびＲＧＤのアミノ酸配列を示す。
【図２】ペプチド修飾多糖（Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧ）の合成スキーム例を示す。
【図３】本発明に従う遺伝子治療剤の、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体化を示すアガロースゲル電気泳動パターンを示している。
【図４】本発明に従う遺伝子治療剤の、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト由来黒色腫瘍細胞Ａ３７５の増殖抑制試験の結果を示す。
【図５】
本発明に従う遺伝子治療剤の、ペプチド修飾多糖類とヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ｃ−ｍｙｂ）との複合体使用によるヒト由来大腸癌細胞ｃｏｌｏ２０５の増殖抑制試験の結果を図の左側に、および治療効果を示さないヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド（Ｓ−ｃ−ｍｙｂ）との複合体使用による結果を右側に示す。
【図６】本発明に従う遺伝子治療剤の、Ｒ８−ＳＰＧおよびＲＧＤ−ＳＰＧとヒトｃ−ｍｙｂホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト由来肺癌細胞Ａ５４９の増殖抑制試験の結果を示す。
Claims (14)
- ペプチド鎖を側鎖に導入した多糖類と、核酸との複合体。
- ペプチド鎖が、細胞表層と親和性をもつアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１の複合体。
- ペプチド鎖がインテグリン結合性ペプチドのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２の複合体。
- アミノ酸配列がのＲＧＤ（配列番号１）を含むことを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
- ペプチド鎖が細胞膜透過性を持つペプチドのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２の複合体。
- ペプチド鎖が２個以上の塩基性アミノ酸を含む配列であることを特徴とする請求項５の複合体。
- ペプチド鎖がアルギニンを２個以上、好ましくは８個（配列番号２）、直鎖状連続もしくは分岐鎖の末端に含むことを特徴とする請求項６の複合体。
- 多糖類がβ−１，３−グルカンもしくはβ−１，３−キシランを主成分とするものであることを特徴とする請求項１〜７の複合体。
- β−１，３−グルカンがシゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナン又はラミナランから選ばれたものであることを特徴とする請求項８の複合体。
- 核酸が天然型もしくは非天然型のアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜９の複合体。
- 非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドが、核酸のリン酸基部分にある酸素原子の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１０の複合体。
- 複合体が、多糖の２本鎖とヌクレオチドの１本鎖から、主に水素結合を介して生成した３重螺旋構造をとることを特徴とする請求項１〜１１の複合体。
- 多糖の分子量が２０００以上であることを特徴とする請求項１〜１２の複合体。
- アミノ酸配列が、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号４）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号５）、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ（配列番号６）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ（配列番号７）、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲ（配列番号８）、ＮＡＫＴＲＲＲＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲ（配列番号９）、ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号１０）、ＴＡＫＴＲＹＫＡＲＲＡＥＬＩＡＥＲＲ（配列番号１１）、ＴＲＲＮＫＲＮＲＩＱＥＱＬＮＲＫ（配列番号１２）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１３）から選択された配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の複合体。
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