KR20170071485A - Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법 - Google Patents

Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170071485A
KR20170071485A KR1020177008924A KR20177008924A KR20170071485A KR 20170071485 A KR20170071485 A KR 20170071485A KR 1020177008924 A KR1020177008924 A KR 1020177008924A KR 20177008924 A KR20177008924 A KR 20177008924A KR 20170071485 A KR20170071485 A KR 20170071485A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
reagent
group
leaving group
moiety
buffer
Prior art date
Application number
KR1020177008924A
Other languages
English (en)
Inventor
안토니 고드윈
조지 바데스쿠
매튜 버드
페니 브라이언트
데이비드 모리스
마크 프리게리오
Original Assignee
폴리테릭스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB201418186A external-priority patent/GB201418186D0/en
Priority claimed from GBGB1418986.4A external-priority patent/GB201418986D0/en
Priority claimed from GB1418984.9A external-priority patent/GB2531715A/en
Priority claimed from GBGB1418989.8A external-priority patent/GB201418989D0/en
Priority claimed from GBGB1509037.6A external-priority patent/GB201509037D0/en
Application filed by 폴리테릭스 리미티드 filed Critical 폴리테릭스 리미티드
Priority to KR1020237038415A priority Critical patent/KR20230158134A/ko
Publication of KR20170071485A publication Critical patent/KR20170071485A/ko

Links

Images

Classifications

    • A61K47/48715—
    • A61K47/48384—
    • A61K47/48507—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 적어도 하나의 친핵체와 반응할 수 있는 신규 컨쥬게이트(접합) 형성 시약에 관한 것으로, 상기 친핵체와의 반응시 손실되는 하나 이상의 이탈기를 포함하며, 여기서 이탈기는 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하고(여기서 n은 6 이상의 수), 또한 본 발명은 상기 시약을 사용하여 제조된 펩티드 또는 단백질을 함유하는 접합체의 신규 제조방법에 관한 것이다.

Description

PEG의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법{PROCESS FOR THE CONJUGATION OF A PEPTIDE OR PROTEIN WITH A REAGENT COMPRISING A LEAVING GROUP INCLUDING A PORTION OF PEG}
본 발명은 신규한 단백질 및 펩타이드의 접합 방법 및 신규한 접합 시약에 관한 것이다.
최근 많은 연구가 광범위한 응용을 위하여 펩타이드 및 단백질에 대한 다양한 종류의 페이로드, 예를 들어 진단, 치료 및 표지 제제의 접합에 집중되어왔다. 상기 단백질 또는 펩타이드 자체가 치료학적 성질을 가질 수 있고 및/또는 결합 단백질일 수 있다.
펩티드 및 단백질은 치료제로서 잠재적인 용도를 가지며, 접합은 그의 특성을개선시키는 한 방법이다. 예를 들어, 수용성의 합성 중합체, 특히 폴리알킬렌 글리콜이 치료학적으로 활성인 펩티드 또는 단백질을 접합시키는데 널리 사용된다. 이들 치료 접합체는 순환시간을 연장 시키고 제거율을 감소시키고, 전신 독성을 감소시키고, 몇몇 경우에 증가된 임상 효능을 나타내는 것으로 약물 동력학을 유리하게 변경시키는 것으로 나타났다. 폴리에틸렌 글리콜, PEG를 단백질에 공유 결합시키는 방법은 일반적으로 "PEG 화(PEGylation)"로 알려져 있다.
결합 단백질, 특정 항체 또는 항체 단편은 종종 접합된다. 표적 세포 및분자 표면의 특정 마커에 대한 결합 단백질의 특이성은 진단 물질 또는 치료 물질로서 또는 진단 물질 및 치료 물질을 포함할 수 있는 페이로드의 운반체로서 광범위하게 사용되었다. 형광 물질, 방사성 동위원소 및 효소와 같은 표지 및 리포터 그룹에 접합된 단백질은 표지 및 이미징분야에서 사용되며 항체-약물 접합체 (ADC)를 생산하는 세포독성 약물 및 화학 요법 약물과의 결합은 특정 제제 또는 화학 요법 치료와 관련된 부작용을 현저히 줄여 주며, 정상적인 건강한 조직에 미치는 영향을 최소화한다. 이러한 접합체는 여러 질병 영역, 특히 암에서 광범위하게 잠재적인 치료에 적용된다.
단백질 및 펩타이드를 접합시키는 많은 방법이 문헌에 보고되어 있다. 예를 들어, WO 95/13312는 설폰 부분을 통한 접합법을 기술한다. 아마 가장 일반적으로 사용되는 공정은 말레이미드(maleimides)를 기반으로하는 접합 시약(conjugating reagent)의 사용을 포함한다. 이러한 시약은 많은 공보, 예를 들어 WO 2004/060965에 기술되어있다. 보다 균일한 생성물을 유도하는 대안적인 접근법은 문헌 [Liberatore et al, Bioconj. Chem 1990, 1, 36-50, 및 del Rosario 등, Bioconj. Chem. 1990, 1, 51-59]에 기술되어 있으며 항체를 포함하여 단백질의 이황화 결합을 교차 가교에 사용할 수 있는 시약의 사용을 기술하고 있다. WO 2005/007197에는 단백질의 다이설파이드 결합으로부터 유도된 두개의 황 원자와 접합하는 능력을 갖는 신규한 접합 시약을 사용하여 신규한 티오에테르 접합제를 제공하는 폴리머에 단백질을 접합시키는 방법이 기술되어 있지만, WO 2009/047500에는 단백질에 부착된 폴리히스티딘 태그에 결합하는 동일한 접합 시약을 포함한다. WO 2010/010324는 단백질에서 단일 친핵체에 결합할 수 있는 단일 작용성 시약의 용도를 기재하고 있다. WO 2013/190292, WO 2014/064424, WO 2014/184564 및 WO 2014/064423은 다양한 접합 시약을 사용하는 접합 방법을 기술하고있다.
대부분의 접합 공정의 공통적인 특징은 접합 반응이 접합 시약 내에 존재하는 이탈기의 손실 및 생성된 부분과 단백질에 존재하는 친핵체와의 반응을 포함한다는 것이다. 보고된 이탈기는 -SR, -OR, -SO2R, -OSO2R, -N+R3, -N+HR2, 및 -N+H2R, 여기서 R은 알킬 또는 아릴이고, 및 할로겐 유형의 기들을 포함한다.
[Marculescuetal., Chem. Commun. 2014, 50, 7139-7142]에는 다양한 이탈기를 함유하는 아릴옥시 말레이미드 접합 시약이개시되어있다. 다른 이탈기 중에서, MeO-(CH2CH2O)2-CH2CH2-를 포함하는 기가개시되어있다. 같은 구조가 2014년 8월 University College London의 Christine Marculescu 박사 학위 논문 "단백질 변형을위한 새로운 말레이미드 시약의개발"에 발표되었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 에틸렌 글리콜로부터 유도된 반복 단위의 정의된 수를 포함하는 신규한 이탈기에 의해 공지된 접합 시약에서 공지된 이탈기를 대체함으로써 개선된 결과를 얻을 수 있음을 발견했다.
WO 95/13312 WO 2004/060965 WO 2005/007197 WO 2009/047500 WO 2010/010324 WO 2013/190292 WO 2014/064424 WO 2014/184564 WO 2014/064423
Liberatore et al, Bioconj. Chem 1990, 1, 36-50, and del Rosario et al, Bioconj. Chem. 1990, 1, 51-59 Marculescu et al, Chem. Commun. 2014, 50, 7139-7142
본 발명의 목적은 신규한 접합 시약(conjugating reagent)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 접합 시약(conjugating reagent)의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 접합 시약(conjugating reagent)과 반응시키는 단계를 포함하는 펩티드 또는 단백질의 접합 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 접합 방법으로 제조되는 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명은 펩타이드 또는 단백질을, 상기 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 하나 이상의 친핵체와 반응할 수 있는 접합 시약과 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 시약은 하나 이상의 이탈기를 상기 친핵체와의 반응시 상실한다. 상기 이탈기는 n이 6 이상의 수인 부분 -(CH2CH2O)n-를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
펩타이드 또는 단백질에 존재하는 적어도 하나의 친핵체와 반응할 수 있는 접합 시약(상기 친핵체와의 반응시 손실되는 하나 이상의 이탈기를 함유함)은 상기 이탈기가 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하고, n은 6 이상의 수이고, 신규하며, 따라서 본 발명은 그와 같은 접합 시약 자체를 제공한다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명은 펩티드 또는 단백질을 상기 펩타이드 또는 단백질에서 2개의 친핵체와 반응할 수 있는 접합 시약과 반응시키는 것을 포함하는 펩타이드 또는 단백질의 접합 방법을 제공하며, 상기 시약은 상기 접합 시약 내에 2개의 부착점을 갖고 n1이 2 이상의 수인 -(CH2CH2O)n1- 부분을 포함하는, 상기 친핵체와의 반응시 소실되는 이탈기를 포함한다. 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 2개의 친핵체와 반응할 수 있는 시약(상기 친핵체와의 반응시 상실되는 이탈기를 함유하고, 상기 이탈기는 상기 접합 시약 내에 2개의 부착점을 가지며, -(CH2CH2O)n1-부분을 포함한다(여기서, n1은 2 이상의 수이다))은 신규하며, 따라서 본 발명은 그와 같은 접합 시약 자체를 제공한다.
이 명세서 전체에서 펩타이드와 단백질은 편의상 "단백질"이라고 합쳐 언급되며, "단백질"에 대한 언급은 단백질과 펩타이드 모두에 대하여 나타내는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 본 발명만의 신규한 이탈기를 포함하는 접합체로부터 종래 기술 대비 우수한 접합 방법을 제공하는 유용한 효과를 확인한 바, 접합 시약, 이의 제조방법, 상기 접합시약을 사용한 접합 방법 및 상기 접합 방법으로 제조되는 접합체를 제공한다.
도 1은 실시예 17의 결과를 도시한다.
도 2는 실시예 18의 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 19의 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 20의 결과를 나타낸다.
도 5, 도 6 및 도 7은 각각 실시예 21의 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 22의 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 25의 결과를 나타낸다.
도 10은 2시간의 반응시간 후 실시예 49의 결과를 나타낸다.
도 11은 반응시간 4시간 후의 실시예 49의 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이탈기 (Leaving groups)
본 발명은 적어도 하나의 이탈기를 포함하는 접합 시약을 단백질에 존재하는 적어도 하나의 친핵체와 반응시키는 경우, 반복 단위 -(CH2CH2O)n-를 포함하는 작용기를 의미하며, 여기에서 n은 최소 6이고 또는 n1이 2 이상인 경우, 공지된 이탈기에 비해개선된 이탈기로서 작용하고, n이 6 이상인 경우, 반복되는 -(CH2CH2O)- 단위가 보다 적은 유사한 이탈기에 비해 작용한다. 신규 이탈기는 예를 들어 -(CH2CH2O)n-R1을 포함할 수 있으며, 여기서 R1은 캡핑기이다. 여기서 매우 넓은 범위의 캡핑기가 사용될 수 있다. R1은 예를 들어 수소 원자, 알킬기, 특히 C1-4 알킬기, 특히 메틸기, 또는 임의로 치환된 아릴기, 예를 들어 임의로 치환된 페닐기, 예를 들어 톨릴기일 수 있다. 선택적으로, 캡핑기는 카르복시기 또는 아민기와 같은 관능기를 포함할 수 있다. 이러한 캡핑기는 예를 들어 화학식 -CH2CH2CO2H 또는 -CH2CH2NH2를 가질 수 있으며, -(CH2CH2O)n- 사슬의 말단 단위를 작용화시킴으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 캡핑기에 의해 종결되기보다는 -(CH2CH2O)n- 또는 -(CH2CH2O)n1- 기는 상기 접합 시약 내에 2개의 부착 점을 가질 수 있고, 이로부터 화학적으로 2개의 이탈기의 등가물이 존재하도록 두개의 친핵체와 반응할 수 있다.
이탈기의 -(CH2CH2O)n- 또는 -(CH2CH2O)n1- 부분은 PEG, 폴리에틸렌 글리콜을 기초로 한다. PEG는 직쇄 또는 측쇄일 수 있고, 임의의 방식으로도 유도되거나 작용화될 수 있다. n은 6 이상의 수, 예를 들어 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 이상이다. 예를 들어, n은 6 내지 9일 수 있다. n1은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 이상과 같은 2 이상의 수이다. 예를 들어, n1은 적어도 4일 수 있다. 또는 n1은 5 이상, 예를 들어 5 내지 9일 수 있고; 또는 n1은 6 이상, 예를 들어 6 내지 9 일 수 있다. n 또는 n1에 특별한 상한은 없다. n 또는 n1은 예를 들어 150 이하, 예를 들어 120 이하, 예를 들어 100 이하일 수 있다. 예를 들어, n은 6 또는 7 내지 150, 예를 들어 6 또는 7 내지 120일 수 있으며, n1은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 내지 150일 수 있다. 예를 들어 4, 5, 6 또는 7 예를 들어 4, 5, 6 또는 7 내지 120일 수 있다. 이탈기의 PEG 부분 -(CH2CH2O)n- 또는 -(CH2CH2O)n1-은 예를 들어 1 내지 5kDa의분자량을 가질 수 있고; 예를 들어 1kDa, 2kDa, 3kDa, 4kDa 또는 5kDa 일 수 있다. 이탈기는 원한다면 하나 이상의 스페이서에 의해분리된 2개 이상의 부분 -(CH2CH2O)n- 또는 -(CH2CH2O)n1-을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 접합 시약 중의 이탈기는 적절하게는 -P, -OP, -SO2P, -OSO2P, 또는 -N+PR2R3의 식으로, 여기서 P는 부분 -(CH2CH2O)n-를 포함하는 기이고 R2 및 R3은 독립적으로 수소 원자, C1-4 알킬기 또는 기(group) P를 나타낸다. 이탈기 -N+PR2R3 기는 -NPR2 기의 양성자화 또는 4차화에 의해 제조될 수 있다. R2 및 R3은 각각 C1-4 알킬기, 특히 메틸기, 또는 특히 수소 원자를 나타내는 것이 바람직하다. 다르게는, 접합 시약은 화학식 -S-P-S-의 기를 포함할 수 있으며; -O-P-O-; -SO2-P-SO2-; -OSO2-P-OSO2-; 및 -N+R2R3-P-N+R2R3- (여기서, P는 부분 -(CH2CH2O)n- 또는 -(CH2CH2O)n1-를 포함하는 기임). 상기와 같이, 이탈기 -N+R2R3-P-N+R2R3-는 기 -NPR2-P-NR2의 양성자화 또는 4차화에 의해 제조될 수 있다. 이러한 유형의 특정 기는 -S-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-S-, -O-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-O-; -SO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-SO2-; -OSO2-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-OSO2-; 또는 -N+R2R3-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-N+R2R3-, 또는 n보다는 n1을 포함하는 상응하는 기를 포함한다. 이들은 또한 다음 유형의 기를 포함할 수 있다:
Figure pct00001
,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
또는 n보다는 n1을 포함하는 대응하는 기이며, 여기서 -(CH2CH2O)n- 또는 -(CH2CH2O)n1- 기는 임의의 적합한 연결기, 예를 들어 알킬렌기에 의해 운반된다. 이들 2가 기는 2개의 친핵체와 반응할 수 있는 2개의 이탈기와 화학적으로 등가이다.
2개 이상의 P 기가 존재하는 경우, 각각의 P는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게 이탈기는 화학식 -OSO2P-OSO2-, 예를 들어 -SO2-(CH2CH2O)n1-CH2-CH2-SO2-, 또는 특히 -SO2P이다.
P는 예를 들어 T가 링커인 화학식 -T-(CH2.CH2O)n-의 기를 포함할 수 있다. P는 예를 들어 화학식 -T-(CH2.CH2O)n-OR1을 가질 수 있다. T는 예를 들어 직접 결합, 알킬기, 예를 들어 C1-4 알킬기 또는 임의로 치환된 아릴 기, 특히 임의로 치환된 페닐 기일 수 있다. 접합 시약의 제조가 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 PEG의 사용을 포함하기 때문에 C1-4 알킬기인 링커 T의 존재가 종종 편리하며, 이들은 종종 그룹 T를 발생시키는 기에 의해 종결된다.
접합 시약(Conjugating reagents)
페이로드를 단백질에 접합 시키는데 사용될 수 있는 많은 접합 시약이 알려져있고, 본 발명의 신규한 접합 시약은 이들이 함유하는 이탈기(들)의 성질에서 상기 공지된 시약과 상이하다. 본 발명에 따른 접합 시약은 본 발명에 따른 신규 이탈기 중 하나 이상을 포함해야 하고, 2개 이상의 이탈기를 포함할 수 있다. 2개 이상의 신규한 이탈기가 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 하나의 이탈기는 본 발명에 따른 신규한 이탈기일 수 있지만, 다른 이탈기는 통상적인 이탈기일 수 있다. 본 발명에 따른 2종 이상의 신규 이탈기가 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 이들은 각각의 이탈기에 n이 상이한 것으로 함유할 수 있다. 대안적으로, 전술한 바와 같이, 접합 시약은 2개의 이탈기와 화학적으로 등가물의 단일기를 함유할 수 있고, 이는 2개의 친핵체와 반응할 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시 양태에서, 접합 시약은 본 발명에 따른 2개의 이탈기를 함유하거나, 2개의 이탈기와 화학적으로 동일한 단일기를 함유하고 2개의 친핵체와 반응할 수 있고, 상기 시약은 2개 단백질 또는 펩티드의 디설파이드 결합의 환원에 의해 형성된 티올기일 수 있다. 이러한 시약의 사용은 효과적으로 단백질 또는 펩타이드의 디설파이드 결합을 브리징(bridging)함으로써 접합체를 생성한다.
시약의 하나의 기(group)는 스미스 (Smith) 등의 문헌 [J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1960-1965] 및 [Schumaker et al, Bioconj. Chem., 2011, 22, 132-136.]에서개시된 바와 같이, 비스-할로- 또는 비스-싸이오-말레이미드 및 이의 유도체에 기초한다. 이러한 시약은 하기 관능기를 포함한다:
Figure pct00006
여기서, 적어도 하나, 바람직하게는 각각 L은 본 발명에 따른 이탈기이다. 말레이미드 고리의 질소 원자는 예를 들어, 진단, 치료 또는 표지 작용제, 또는 진단, 치료 또는 표지 제제용 결합제, 예를 들어 하기 언급된 화학식 D-Q- 중 하나의 결합제를 함유할 수 있다. 이러한 시약은 단백질 또는 펩타이드에서 디설파이드 결합을 연결시킬 수 있다.
유사하게, 단일 이탈기 L을 함유하는 말레이미드가 사용될 수 있다:
Figure pct00007
또한, 말레이미드 고리의 질소 원자는 페이로드, 예를 들어 하기 언급된 화학식 D-Q- 중 하나를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에서, 접합 시약은 하기 작용기를 함유한다:
Figure pct00008
상기 (I)에서, W는 전자 끄는 기(전자 구인성 작용기(electron-withdrawing group)), 예를 들어 케토기, 에스테르기 -O-CO-, 설폰기 -SO2- 또는 시아노기를 나타내고; A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내고; B는 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내고; 각각의 L은 독립적으로 이탈기를 나타내며, 이들 중 하나 이상, 바람직하게는 둘 모두가 본 발명에 따른 신규한 이탈기이어야 하거나 또는 둘 모두가 함께 하나의 본 발명에 따른 이탈기를 나타낸다. 통상적인 이탈기를 사용하는 유형의 시약은 Bioconj. Chem 1990 (1), 36-50, Bioconj. Chem 1990 (1), 51-59 및 J. Am. Chem. Soc. 110, 5211-5212에개시되고 있다. 이러한 기들을 함유하는 시약이 단백질과 반응할 때, 제1 이탈기 L은 손실되어 다음과 같은 관능 그룹을 함유하는 접합 시약을 원위치로 형성한다:
Figure pct00009
상기 (I')에서, m은 0 내지 4이고, 이는 제1 친핵체와 반응한다. 두 번째 이탈기 L은 손실되고 두 번째 친핵체와의 반응이 일어난다. 작용기 I을 함유하는 시약을 출발 물질로서 사용하는 것의 대안으로서, 작용기 (I')을 함유하는 시약을 출발 물질로서 사용할 수 있다.
바람직하게는 W는 케토기를 나타낸다. 바람직하게는, A는 -CH2-를 나타내고, B는 결합을 나타낸다.
특히 바람직한 화학식 (I) 및 (I')의 작용기는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
예를 들어, 상기 작용기는 하기 화학식의 하나일 수 있다:
Figure pct00012
또는
Figure pct00013
접합 시약의 또 다른 그룹은 하기 작용기를 함유한다:
~W-CR4R4 '-CR4.L.L' (II)
상기 (II)에서, W는 전술한 정의 및 바람직한 정의와 같고,
R4는 수소 원자 또는 C1-4 알킬기를 나타내고, R4'는 수소 원자를 나타내고, L은 각각 독립적으로 이탈기를 나타내며, 이들 중 적어도 하나는 바람직하게는 둘 모두가 본 발명에 따른 이탈기를 나타내는 경우; 또는
R4는 수소 원자 또는 C1-4 알킬기를 나타내고, L은 본 발명에 따른 이탈기를 나타내고, R4'및 L'는 함께 결합을 나타낸다.
작용기 (I), (I')또는 (II)를 함유하는 시약은 단백질 또는 펩타이드에서 디설파이드 결합을 가교할 수 있다.
접합 시약의 또 다른 그룹은 작용기를 포함한다:
~ W-(CH=CH)p-(CH2)2-L (III)
상기 (III)에서, W는 전술된 정의 및 바람직한 정의를 갖고, p는 0 또는 1 내지 4의 정수, 바람직하게는 0을 나타낸다. 이 유형의 특히 바람직한 시약은 다음과 같은 작용기를 포함한다:
-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIa)
여기서, Ar은 임의로 치환된 아릴, 특히 페닐기를 나타낸다.
본 발명에 따른 접합 시약은 단백질과의 반응하기 위한 하나 이상의 작용기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 시약은분자의 한쪽 말단에 화학식 (I) 또는 (I')의 관능기 그룹, 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 신규 이탈기를 함유하는 임의의 다른 관능 그룹 및 하나 이상의 추가 관능 그룹을 함유할 수 있으며, 본 발명에 따른 신규 이탈기 또는분자 내의 다른 곳에서 단백질 또는 임의의 다른분자와 컨쥬게이트할 수 있는 통상적인 관능기 그룹이다. 이러한 구조는 예를 들어 Belcheva 등, J. Biomater. Sci Polymer Edn. 9 (3), 207-226에 기재되어 있으며, 다중 단백질을 함유하는 접합체의 합성에 유용하다.
본 발명의 신규한 접합 시약은 공지된 방법과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG에 기초하고 적절한 작용기를 갖는분자는 통상의 이탈기가 도입되는 것과 동일한 방식으로 접합 시약에 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노 또는 티올 - 말단 PEG는 만니히 반응을 이용하여 카르보닐기를 함유하는 화합물에 도입될 수 있다. 구체적인 반응은하기 실시예에 예시되어있다.
페이로드
접합 시약은 예를 들어 진단, 치료 또는 표지 제 또는 진단, 치료 또는 표지 제제 용 결합제를 탑재할 수 있다. 이 경우, 화학식 I / I'의 단위를 함유하는 시약은 화학식 (Ic) 또는 (Ic')를 가질 수 있거나, W는 시아노기, (Id) 또는 (Id ')를 나타낼 수 있다:
Figure pct00014
Q는 연결기를 나타내고, D는 페이로드, 바람직하게 진단, 치료 또는 표지 제 또는 진단, 치료 또는 표지 제의 결합제를 나타낸다. 바람직하게는 D-Q-는 약물 또는 중합체 또는 약물 및 중합체 모두를 포함한다. 약물이 존재하는 경우, 예를 들어 세포 독성 약물 일 수 있고, 중합체가 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다.
D가 진단, 치료제 또는 표지 제에 대한 결합제를 나타내는 경우, 바람직한 구조는 당연히 궁극적으로 원하는 제품의 진단, 치료 또는 표지 제제의 구조에 의존할 것이다. 예를 들어, 진단적, 치료적 또는 표지 화제와 반응할 수 있는 임의의 작용 그룹이 존재할 수 있다. 예를 들어, -CO2H 또는 이의 반응성 유도체, -NH2 또는 -OH와 같은 관능 그룹이 존재할 수 있다. 카르복시산 기의 활성화된 유도체는 당 업계에 잘 알려져있다. 예를 들어, 카르복실 산은 H- 히드록시 숙신이미드 에스테르 또는 산 할라이드와 같은 활성화된 에스테르의 사용을 통해 활성화될 수 있다. 하나의 바람직한 실시 양태에서, Q는 임의로 치환된 페닐 그룹이고, D는 진단, 치료 또는 표지 제, 예를 들어 -CO2H, -NH2 또는 -OH 그룹에 대한 결합제이다.
임의의 적합한 연결기 Q가 사용될 수 있다. 한 구현 예에서, Q는 예를 들어 직접 결합, 알킬렌기(바람직하게는 C1-10 알킬렌기), 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로 아릴기일 수 있으며, 이들 중 임의의 기는 하나 또는 그 이상의 산소 원자, 황 원자, -NR 기(여기서 R은 수소 원자 또는 알킬(바람직하게 C1-6 알킬), 아릴 (바람직하게는 페닐) 또는 알킬-아릴 (바람직하게는 C1-6 알킬-아릴)), 케토기, -O-CO-기, -CO-O- 기, -O-CO-O- 기, -O-CO-NR-, -NR-CO-O-, -CO-NR- 및/또는 -NR.CO- 기로 종결될 수 있다. 이러한 아릴 및 헤테로 아릴기 Q는 본 발명의 하나의 바람직한 구현 예를 형성한다. 적절한 아릴기는 페닐 및 나프틸기를 포함하고, 적합한 헤테로 아릴기는 피리딘, 피롤, 퓨란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함한다. 특히 적합한 연결기 Q는 헤테로 아릴 또는 특히 아릴기, 특히 페닐기이다. D가 결합기인 경우, 이들은 예를 들어 전술한 바와 같이 -CO2H, -NH2 또는 -OH기를 함유할 수 있다. D가 진단적, 치료적 또는 표지 화제인 경우, 이들은 D 그룹에 대한 연결기, 예를 들어 -NR.CO- 또는 -CO.NR- 기, 또는 -NH.CO 또는 -CO.NH- 기이거나, 이를 포함한다.
D가 결합기를 포함하는 특정 D-Q- 기는 다음을 포함한다:
Figure pct00015
또는
Figure pct00016
D는 예를 들어 -CO2H, -NH2 또는 -OH와 같은 결합기를 나타내고, 각각의 m 및 q는 1 내지 6의 정수, 예를 들어 2 또는 3을 나타내고, 페닐 고리는 비치환 또는 치환될 수 있다. 예를 들어 하기 언급된 임의의 치환기에 의해 치환될 수 있다.
임의로 치환된 아릴, 특히 페닐 또는 헤테로 아릴기 상에 존재할 수 있는 치환기는 예를 들어 알킬(바람직하게는 C1-4 알킬, 특히 메틸이되, 이는 OH 또는 CO2H로 선택적으로 치환될 수 있다), -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR.CO2R, -NO, -NHOH, -NR.OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR.COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐, 예를 들어 불소 또는 염소, -C≡CR, -C=CR2, 및 -C=CHR이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 수소 원자 또는 알킬(바람직하게는 C1-6 알킬), 아릴(바람직하게는 페닐) 또는 알킬 - 아릴(바람직하게는 C1-6 알킬-페닐)을 나타낸다. 전자 끌기 치환체의 존재가 특히 바람직하다. 바람직한 치환체는 예를 들어 CN, NO2, -OR, -OCOR, -SR, -NHCOR, -NR.COR, -NHOH 및 -NR.COR을 포함한다.
또 다른 실시 양태에서, 링커 Q는분해 가능한 그룹을 함유할 수 있으며, 즉, 생리 학적 조건하에서분해되는 그룹을 함유할 수 있으며, 궁극적으로 결합될 단백질로부터 D를분리한다. 다르게는, Q는 생리 학적 조건하에서 절단될 수 없는 링커일 수 있다. 링커가 생리적 조건하에서분해되면, 바람직하게는 세포 내 조건하에서 절단 가능하다. 표적이 세포 내인 경우, 바람직하게는 링커는 세포 외 조건에 실질적으로 민감하지 않다(즉, 충분한 양의 치료제를 세포 내 표적으로 전달하는 것이 방해되지 않도록).
Q가분해성 그룹을 함유하는 경우, 이는 일반적으로 가수분해 조건에 민감하며, 예를 들어 특정 pH 값 (예 : 산성 조건)에서분해되는 그룹 일 수 있다. 가수분해/산성 조건은 예를 들어 엔도 좀 또는 리소좀에서 발견될 수 있다. 산성 조건하에서 가수분해되기 쉬운 그룹의 예는 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아조산 아미드, 오르토 에스테르 및 케탈을 포함한다. 가수분해 조건에 민감한 그룹의 예는 다음과 같다:
Figure pct00017
및
Figure pct00018
.
바람직한 구현 예에서, 링커는 하기 화학식이거나 또는 이를 포함한다:
Figure pct00019
.
예를 들어, 다음과 같거나 포함될 수 있다.
Figure pct00020
.
링커 Q는 또한 환원 조건하에서분해되기 쉽다. 예를 들어, 티올과 같은 생물학적 환원제에 노출되면분해될 수 있는 디설파이드기를 포함할 수 있다. 이황화물 기의 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00021
및
Figure pct00022
R, R ', R "및 R"'는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-4 알킬이다. 바람직한 실시 양태에서, 링커는 다음이거나 또는 다음을 포함한다:
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
.
예를 들어, 다음일 수 있거나, 또는 다음을 포함한다:
Figure pct00025
또는
Figure pct00026
.
링커 Q는 또한 효소분해에 민감한 그룹, 예를 들어 프로테아제 (예를 들어, 리소좀 또는 엔도 솜 프로테아제) 또는 펩티다아제에 의해 절단되기 쉬운 그룹을 함유할 수 있다. 예를 들어, 이는 적어도 하나, 예를 들어 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티딜기를 함유할 수 있다 (예를 들어, Phe-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Ala, Val- -Lys). 예를 들어, 이는 1 내지 5개, 예를 들어 2 내지 4개 아미노산을 갖는 아미노산 사슬일 수 있거나, 포함할 수 있다. 효소분해에 영향을 받기 쉬운 그룹의 또 다른 예는 다음과 같다.
Figure pct00027
,
AA는 Val-Cit와 같은 프로테아제 특이적 아미노산 서열을 나타낸다.
바람직한 구현 예에서, 링커 Q는 다음과 같다 :
Figure pct00028
예를 들어, 다음이거나 또는 다음을 포함한다:
Figure pct00029
.
링커 Q는 단일 그룹 D 또는 하나 이상의 그룹 D를 지닐 수 있다. 다수의 그룹 D는 예를 들어 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 유사한 잔기를 혼입시킬 수 있는분지 링커 Q의 사용에 의해 혼입될 수 있다. 이것은 다음과 같은분기 요소를 도입한다:
Figure pct00030
b는 1, 2 또는 3이고, b = 1은 아스파르테이트이고 b = 2는 글루타메이트이고, b = 3은 하나의 바람직한 구현 예이다. 상기 화학식의 각각의 아실 잔기는 그룹 D에 결합될 수 있다. 상기분지 화기는 CO, CH2 그룹을 포함할 수 있으며, 따라서:
Figure pct00031
원한다면, 아스파테이트 또는 글루타메이트 또는 유사한 잔기를 추가의 아스파테이트 및/또는 글루타메이트 및/또는 유사한 잔기와 결합시킬 수 있다:
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
등.
상기 링커는 모두 예를 들어 아미드 결합을 통해 중합체에 결합될 수 있다. 중합체는 아래에서 논의됩니다.
화학식 I / I'의 단위를 포함하는 바람직한 시약은 다음을 포함한다:
Figure pct00034
또는
Figure pct00035
Q와 D는 위에 주어진 의미를 갖는다.
이러한 유형의 특히 바람직한 시약은 하기 화학식을 갖는다 :
Figure pct00036
또는
Figure pct00037
Ar은 임의로 치환된 아릴, 특히 페닐 그룹을 나타내며, 예를 들어 상기 열거된 것들 중 하나이다. 예를 들어, 시약 또는 시약의 전구체는 다음 화학식의 것일 수 있다:
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
D는 -CO2H, -NH2 또는 -OH 기, 특히 -CO2H 기이고, m 및 q는 각각 1 내지 6의 정수, 예를 들어 2 또는 3이다. 바람직하게는 m 및 q 중 하나는 2이고, 다른 하나는 3이다.
상기 시약은 임의의 바람직한 적재물을 운반하도록 작용 화될 수 있다. 예를 들면, 식 (Ig) / (Ig '), 식 (Ih) / (Ih')의 카르복시산 기 또는 식 (Ii) / (Ii ')의 히드록시기에 나타낸 NH2 기, 상기 화학식 Ij에서 상응하는 그룹 D는 페이로드를 부착하기 위해 임의의 적합한 그룹과 반응하여 NH2 그룹 또는 카르복실 산 그룹이 추가 그룹 DQ-의 일부가되는 화합물을 제공할 수 있으며; 상기 (If), (Ig), (Ig '), (Ih), (Ih'), (Ii), (Ii ') 또는 (Ij)의 아릴 / 페닐기는 페이로드를 부착하는데 사용될 수 있는 부가적인 반응성 그룹을 보유한다.
적재물을 운반하는 다른 바람직한 접합 시약은 다음의 식을 갖는다 :
D-Q-W-CR2R2 '-CR2.L.L' (IIa) 또는
D-Q-(CH=CH)p-(CH2)2-L (IIIa)
예를 들어,
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIb)
여기서 다양한 치환체는 상기 주어진 의미 및 바람직한 의미를 갖는다.
D 또는 Q가 중합체를 포함하는 경우, 접합 시약은 WO 99/45964, WO 2005/007197 또는 WO 2010/100430에 기재되어있는 기본 구조를 갖는 시약 중 하나 일 수 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. 바람직하게는, 중합체 - 함유 시약은 상기 기재된 바와 같은 화학식 I의 작용기를 함유하고 하기 화학식 Ii의 화합물이다 :
Figure pct00045
X 및 X '중 하나는 중합체를 나타내고, 다른 하나는 수소 원자를 나타내고;
Q는 연결기를 나타내고;
W는 전자 끄는 기, 예를 들어 케토 기, 에스테르 기 OCO- 또는 설폰 기 SO2를 나타내고; 또는 X '가 중합체를 나타내는 경우, X-Q-W는 함께 전자 끄는 기, 예를 들어 시아노기를 나타낼 수 있고;
A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내고;
B는 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내고; 및
각각의 L은 독립적으로 본 발명에 따른 이탈기를 나타내거나, 또는 두 L은 함께 본 발명에 따른 이탈기를 나타낸다.
관련 접합 시약은하기 화학식 Ii '또는 IIa를 갖는다 :
Figure pct00046
X, X ', Q, W, A 및 L은 일반 식 Ii에 대해 주어진 의미를 갖고, m은 0 내지 4를 나타내고; 또는
X-Q-W-CR4R4'-CR4.L.L' (IIa)
X, Q 및 W는 화학식 Ii에 대해 주어진 의미를 가지며,
R4는 수소 원자 또는 C1-4 알킬기를 나타내고, R4'는 수소 원자를 나타내고, L은 각각 독립적으로 이탈기를 나타내며, 이들 중 적어도 하나는 바람직하게는 둘 모두가 본 발명에 따른 이탈기를 나타내는 경우; 또는
R4는 수소 원자 또는 C1-4 알킬기를 나타내고, L은 본 발명에 따른 이탈기를 나타내고, R4'및 L'는 함께 결합을 나타낸다.
화학식 Ii, Ii '및 IIa의 다양한 치환체에 대한 바람직한 의미는 상기 주어진 바와 같다. 화학식 Ii 및 화학식 IIi에서, 바람직하게는 X는 중합체를 나타내고, X'는 수소 원자를 나타낸다. 중합체 X에 대한 결합은 가수분해 적으로 불안정한 결합 또는 불안정한 결합에 의한 것일 수 있다.
특히 바람직한 중합체 접합 시약은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00047
또는
Figure pct00048
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 바람직한 시약의 또 다른 그룹은 WO 2010/010324에 기재된 것들에 기초한다. 이들 시약은 일반 식을 갖는다:
X-[Q-W-(CH=CH)p-(CH2)2-L]q (IIIc)
X, Q, W 및 L은 상기 주어진 의미 및 바람직한 의미를 갖는다. p는 0 또는 1 내지 4의 정수, 바람직하게는 0을 나타내고; q는 1 내지 8의 정수, 바람직하게는 1을 나타낸다. 화학식 IIIc의 특히 바람직한 시약은하기 화학식을 갖는다 :
X-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIId)
상기 화학식의 바람직한 실시 양태에서, 링커 Q 또는 중합체 X 중 어느 하나가 페이로드, 예를 들어 진단, 치료제 또는 표지 제를 혼입시킬 수 있다. 특히 유용한 것은 링커 Q 또는 중합체 X가 약물분자를 포함하는 상기 화학식의 시약이다 : 이들 시약은 예를 들어 항체 - 약물 접합체의 합성에 사용될 수 있다.
진단, 치료 또는 표지 제 또는 진단, 치료제 또는 표지 제에 대한 결합제와 같은 임의의 바람직한 페이로드(payload)가 본 발명에 따른 접합 시약에 포함될 수 있다. 하나 이상의 약물분자, 예를 들어 세포 독성 제 또는 독소가 포함되는 것이 바람직하다. 아우리스타틴 및 메이탄시노이드는 전형적인 세포 독성 약물이다. 약물 접합체, 특히 항체 약물 접합체가 약물의 다중 복제물을 포함하는 것이 종종 바람직하다. 표지 제(imaging agents를 포함하는 것으로 이해되어야 함)는 예를 들어 방사성 핵종, 형광 제제 (예 : 5-디메틸 아미노 나프탈렌-1-(N- (2-아미노에틸))설폰아미드-단실 에틸렌디아민, 오레곤 그린® 488 카다베린(카탈로그 넘버 O-10465, Molecular Probes), 단실 카다베린, N-(2-아미노에틸)-4-아미노-3,6-디설포-1,8-나프탈이미드, 디포타슘 염(루시퍼 옐로우(lucifer yellow)), 또는 로다민 B 에틸렌디아민(카탈로그 번호 L-2424, Molecular Probes), 또는 티올 유도체 형광 프로브, 예를 들어 BODIPY® FL L-시스틴(카탈로그 번호 B-20340, Molecular Probes)을 포함할 수 있다. 결합제는 예를 들어 킬레이트 화제, 예를 들어 데스페리독신 또는 비오틴을 포함할 수 있으며, 이들은 임의의 다른 원하는 잔기, 예를 들어 상기 언급된 것 중 하나와 결합하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 전술한 바와 같은 반응성 그룹 일 수 있다.
본 발명의 동시 계류중인 출원 GB 1418984는 링커(연결기)를 통해 메이탄신 함유 페이로드에 부착된 단백질, 펩타이드 및/또는 중합체, 이러한 컨쥬게이트(접합체)를 형성하는데 유용한 접합 시약 및 페이로드로서 사용하기 위한 메이탄신 함유 화합물을 포함하는 컨쥬게이트(접합체)를 제공한다. 메이탄신 함유 페이로드 및 화합물은 비분해성 가교 결합기를 통해 서로 연결된 적어도 2개의 메이탄신 부분으로 구성된다. 이들 메이탄신은 본 발명에서 페이로드로서 사용될 수 있고, 시약은 본 발명의 한 측면을 형성한다. 우리의 동시 계류중인 출원은 다음을 개시한다:
본 발명은 제1 측면에서 적어도 2개의 메이탄신 부분(D)이 가교기(Bd)를 통해 서로 연결된 메이탄신 - 함유 화합물을 제공한다. 브리징 그룹(Bd)은 생리적 조건하에서는분해되지 않다. 유리하게는, 가교기(Bd)는 3개 이상의 사슬 탄소 원자를 가지며, 선택적으로 3개의 사슬 탄소 원자 이외에 폴리(에틸렌 글리콜) 스페이서를 함유한다. 유리하게는, 2개의 헤테로 원자가 브리징 그룹에서 서로 인접하지 않는다. 브리징기는 -C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-이고, 여기서, b는 1, 2 또는 3이고, R1은 수소 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택됨) X는 임의의 그룹이다. 2개의 메이탄신 부분이 존재하는 제1 측면의 메이탄신 함유 화합물은 하기 화학식 (I)로 나타낼 수 있다:
D-Bd-D (I)
두 번째 측면에서, 본 발명은 중합체와 반응할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 및/또는 작용기와 반응할 수 있는 관능기를 함유하고, 관능기(들) 하나 이상의 링커를 포함하며, 상기 접합 시약은 비분해성 가교기를 통해 서로 연결된 적어도 2개의 메이탄신 부분으로 이루어진 메이탄신 함유 페이로드를 포함하며, 단, 상기 접합 시약이 펩타이드 또는 단백질에서의 반응과 관련하여, 펩티드 또는 단백질에서 반응할 수 있는 관능기에 페이로드를 부착시키는 링커는분해 가능하다. 접합 시약이 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 하나 이상의 친핵체와 반응할 수 있는 작용기를 함유할 때, 상기 작용기는 상기 친핵체와의 반응시 손실되는 적어도 하나의 이탈기를 포함하고, 상기 메이탄신 함유 페이로드는 적어도 비분해성 가교기를 통해 서로 연결된 2개의 메이탄신 부분은 유리하게는분해성 링커를 통해 펩티드 또는 단백질에 존재하는 하나 이상의 친핵체와 반응할 수 있는 작용기에 부착된다. 접합 시약은 펩티드 또는 단백질에 존재하는 적어도 하나의 친핵체와 반응할 수 있는 작용기를 선택적으로 포함하며, 상기 작용기는 상기 친핵체와의 반응시 손실되는 하나 이상의 이탈기를 유리하게 포함하며, 상기 접합 시약은 적어도 2개의 메이탄신 부분, 특히 2개의 메이탄신 부분이 비분해성 가교기를 통해 서로 연결된 메이탄신 함유 페이로드를 포함하고, 페이로드는 존재하는 하나 이상의 친핵체와 반응할 수 있는 작용기에 부착된다 링커, 특히분해 가능한 링커를 통한 펩타이드 또는 단백질. 링커는 가교 그룹을 파트너 또는 표적에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드에 연결 시키는데 적합하다. 바람직하게는, 메이탄신 함유 페이로드(D2Bd)의 가교기(Bd)는 생리 학적 조건하에서 파괴되는분해 가능한 그룹을 포함하는분해 가능한 링커 (Lkd)에 연결된다.분해 가능한 그룹은 예를 들어 가수분해 조건, 특히 산성 조건에 민감할 수 있다. 환원 조건하에서분해되기 쉽다; 또는 효소분해에 취약할 수 있다.
2개의 메이탄신 부분이 존재하는 제2 양태의 메이탄신 함유 접합 시약은 하기 화학식 (II)로 나타낼 수 있다:
D2Bd-Lk-F (II)
D2Bd는 비분해성 가교기를 통해 서로 연결된 2개의 메이탄신 부분으로 이루어진 메이탄신 함유 페이로드를 나타내며, Lk는 링커, 특히분해 가능한 링커 (Lkd)이고, F는 a와 반응할 수 있는 작용기를 나타낸다 펩타이드 또는 단백질 및/또는 중합체와 반응할 수 있는 작용기를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드, 단백질 및/또는 중합체를 본 발명의 제2 요지의 접합 시약과 반응시키는 것을 포함하는, 펩타이드, 단백질 및/또는 중합체의 접합 방법을 제공한다. 접합 시약이 펩타이드 또는 중합체와 반응할 때, 상기 접합 시약은 상기 펩티드 또는 단백질에 존재하는 하나 이상의 친핵체와 유리하게 반응할 수 있고, 상기 시약은 상기 친핵체와의 반응시 손실되는 하나 이상의 이탈기를 유리하게 포함한다.
본 발명은 또한 메이탄신 함유 페이로드에 링커를 통해 부착된 단백질, 펩타이드 및/또는 폴리머를 포함하는 컨쥬게이트(접합체)를 제공하며, 상기 메이탄신 함유 페이로드는 상기 메이탄신 함유 페이로드를 통해 서로 연결된 적어도 2개의 메이탄신 부분 비분해성 브리징 그룹을 포함한다. 접합체가 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 경우, 단백질 또는 펩티드에 탑재 물을 부착시키는 링커는 유리하게분해될 수 있다. 본 발명의 제3 양태의 접합체는, 예를 들어, 예를 들어 링커 (Lk), 특히분해 가능한 링커 (Lkd)를 통해 단백질 또는 펩타이드에 연결된 메이탄신 함유 약물 부분 (D2Bd)을 포함할 수 있다 Abb)를 포함하며, 상기 메이탄신 함유 약물 부분 (D2Bd)은 비분해성 가교기(Bd)를 통해 서로 연결된 적어도 2개의 메이탄신 부분 (D)을 포함한다. 2개의 메이탄신 부분 (D)이 존재하는 본 발명의 제3 양태의 메이탄신 함유 접합체는 하기 화학식 (III)으로 나타낼 수 있다:
D2Bd-Lk-Ab (III)
링커 (Lk)는 브리징 그룹을 통해 서로 연결된 적어도 2개의 메이탄신 부분 (D)을 포함하는 메이탄신 함유 약물 부분 (D2Bd)을분리하는 생리 학적 조건하에분해되는분해 가능한 그룹을 포함하는분해 가능한 링커 (Lkd) (Bd)를 파트너 또는 표적에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드 (Ab)로부터분리한다.분해 가능한 그룹은 예를 들어 가수분해 조건, 특히 산성 조건에 민감할 수 있다. 환원 조건하에서분해되기 쉽다; 또는 효소분해에 취약할 수 있다. 비분해성 가교기 (Bd)는분해성 링커의분해성 기가 절단되는 조건과 동일한 조건하에서 절단되기 쉬운 기들을 포함하지 않는다.
본 발명의 제1 양태의 메이탄신 함유 화합물은, 예를 들어, 적어도 2개의 메이탄신 부분 (D), 특히 2개의 메이탄신 부분을 포함하거나, 브리징 그룹 (Bd)을 통해 서로 연결된 적어도 2개의 메이탄신 부분 3 이상의 사슬 탄소 원자, 특히 7 이상의 사슬 탄소 원자 및 사슬 탄소 원자 이외의 임의의 폴리(에틸렌 글리콜) 단위를 포함하며, 단 2개의 헤테로 원자는 브리징 그룹에서 서로 인접하지 않으며 단, 브리징 기는 -C(O)-CH(NR1X)-(CH2)b-C(O)-(여기서, b는 1, 2 또는 3이고, R1은 수소 및 C1 내지 C6 알킬로부터 선택됨) 부분 및 X는 임의의 모든 그룹이다. 임의로, 가교기는 0 내지 8개의 카르보닐기, 특히 2 내지 8개의 카르보닐기를 포함한다. 브리징 그룹은 임의로 0 내지 4개의 불포화 탄소 - 탄소 이중 결합을 포함하며; 및/또는 사슬 내의 0 내지 4개의 C3 내지 C10 아릴 또는 헤테로 아릴기이다. 선택적으로, 사슬은 0 내지 11, 특히 2 내지 11의 N, O 및 S로부터 선택된 사슬 헤테로 원자가 산재되어 있으나, 2개의 헤테로 원자는 서로 인접하지 않는다. 유리하게는, 가교기의 사슬 탄소 원자가 아민, 카복시, 알킨, 아지드, 하이드록실 또는 티올로부터 선택된 펜던트 연결기로 치환된다. 유리하게는 가교기는 쇄 내에 적어도 하나의 아미드 결합을 포함한다.
본 발명의 사용은 매우 광범위한 페이로드의 효율적인 접합을 가능하게 한다. 알려진 기술을 사용하여 얻은 수율은 일부 탑재량에서는 낮을 수 있다. 예를 들어, PEG를 함유하지 않는 탑재 물에 대한 단백질의 접합은 낮을 수 있고, 본 발명의 사용은 보다 높은 수율을 제공할 수 있다. 또한, 접합은 공지된 기술을 사용하는 경우보다 훨씬 더 신속하게, 따라서보다 효과적으로 발생할 수 있다.
접합 시약에 존재하는 중합체
전술한 바와 같이, 접합 시약은 올리고머 또는 폴리머(본원에서 편의상 "중합체"로 합쳐 지칭 됨), 특히 수용성의 합성 중합체, 특히 폴리 알킬렌 글리콜을 단백질에 접합시키는데 사용될 수 있다. 환언하면, 페이로드(예를 들어, 상기 일반 식에서의 D 또는 X)는 중합체 일 수도 있고, 또는 중합체를 포함할 수도 있다. 중합체는 예를 들어 폴리 알킬렌 글리콜, 폴리 비닐 피롤리 돈, 폴리 아크릴레이트, 예컨대 폴리 아크릴로일모르폴린, 폴리 메타크릴레이트, 폴리 옥사졸린, 폴리 비닐알콜, 폴리 아크릴아미드 또는 폴리 메타크릴아미드, 예를 들어 폴리 카르복시 메타크릴아미드 또는 HPMA 공중합체 일 수 있다. 또한, 중합체는 효소 또는 가수분해에 영향을 받기 쉬운 중합체 일 수 있다. 이러한 중합체는 예를 들어 폴리에스테르, 폴리 아세탈, 폴리 (오르토 에스테르), 폴리 카보네이트, 폴리 (이미노카보네이트) 및 폴리 아미드(예: 폴리 아미노산)를 포함한다. 중합체는 단일 중합체, 랜덤 공중합체 또는 블록 공중합체와 같은 구조적으로 한정된 공중합체 일 수 있으며, 예를 들어 2개 이상의 알킬렌 옥사이드로부터 유도된 블록 공중 합체 또는 폴리 (알킬렌 옥사이드) 및 폴리 에스테르, 폴리 아세탈, 폴리 (오르토 에스테르) 또는 폴리(아미노산) 일 수 있다. 사용될 수 있는 다작용성 중합체는 디비닐 에테르 - 말레산 무수물 및 스티렌 - 말레산 무수물의 공중합체를 포함한다.
예를 들어, 키틴, 덱스트란, 덱스트린, 키토산, 전분, 셀룰로오스, 글리코겐, 폴리 (시알릴산), 히알루론산 및 이들의 유도체와 같은 다당류를 사용할 수 도있다. 단백질은 중합체로서 사용될 수 있다. 이는 제2 단백질, 예를 들어 효소 또는 다른 활성 단백질, 또는 바이오 티닐화된분자에 결합할 수 있는 아비딘과 같은 스캐폴딩 단백질의 제1 단백질, 예를 들어 항체 또는 항체 단편에 접합을 허용한다. 또한, 촉매 서열을 함유하는 펩타이드, 예를 들어, 글리코실 전이 효소의 O- 글리칸 수용체 부위가 사용되면, 이후의 효소 반응을 위한 기질 또는 표적을 혼입시킬 수 있다. 당질 또는 아미노산과 같은 천연 모노머 및 에틸렌 옥사이드 또는 메타크릴 산과 같은 합성 모노머로부터 유도된 하이브리드 폴리머와 같이 폴리 글루타민산과 같은 폴리머도 사용될 수 있다.
중합체가 폴리 알킬렌 글리콜인 경우, 이는 바람직하게는 C2 및/또는 C3 단위를 함유하는 것이고, 특히 폴리에틸렌 글리콜이다. 중합체, 특히 폴리 알킬렌 글리콜은 단일 선형 사슬을 함유할 수 있거나, 사슬 또는 사슬의 많은 사슬로 구성된분지 형태를 가질 수 있다. 소위 플루로닉스(Pluronics)는 PEG 블록 공중 합체의 중요한 부류이다. 이들은 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드 블록으로부터 유도된다. 치환되거나 캡핑된 폴리 알킬렌 글리콜, 예를 들어 메톡시 폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다.
중합체는 예를 들어, WO 2004/113394에 기술된 방법에 의해 제조된 빗 중합체(comb polymer) 일 수 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 인용된다. 예를 들어, 중합체는 하기 화학식을 갖는 빗 중합체(comb polymer) 일 수 있다:
(E)e-(F)f-(G)g
여기서:
존재하는 경우, E는 F에서 정의된 것과 같은 하나 이상의 올레핀계 불포화 단량체의 부가 중합에 의해 수득될 수 있으며;
F는 선형,분지형 또는 별 모양이고, 치환 또는 비치환되고, 올레핀계 불포화 잔기를 갖는 다수의 단량체의 부가 중합에 의해 수득될 수 있다;
G는 존재하는 경우, F에서 정의된 것과 같은 하나 이상의 올레핀계 불포화 단량체의 부가 중합에 의해 얻을 수 있으며;
e 및 g는 0 내지 500의 정수이고;
f는 0 내지 1000의 정수이고;
D, E 및 F 중 적어도 하나가 존재한다.
단백질에 접합시키기 위한 중합체는 임의로 원하는 방식으로 유도체화 되거나 관능화 될 수 있다. 하나의 바람직한 실시 양태에서, 중합체는 예를 들어, 진단 제, 치료제 또는 표지제, 예를 들어 전술한 것 중 하나, 또는 진단제, 치료제 또는 표지제와 결합할 수 있는 결합제를 운반한다. 반응성 그룹(기 또는 작용기)은 중합체 말단 또는 말단 그룹에서 또는 펜던트 링커를 통해 중합체 사슬을 따라 연결될 수 있으며; 이러한 경우, 중합체는 예를 들어 폴리 아크릴 아미드, 폴리 메타크릴 아미드, 폴리 아크릴레이트, 폴리 메타크릴레이트 또는 말레산 무수물 공중합체이다. 하나 이상의 생물학적분자를 포함하는 다중 접합체(multimeric conjugate)는 시너지 효과와 부가적인 이점을 가져올 수 있다. 필요하다면, 중합체는 통상적인 방법을 사용하여 고체 지지체에 결합될 수 있다.
물론, 중합체의 최적분자량은 의도된 용도에 의존할 것이다. 장쇄 중합체가 사용될 수 있으며, 예를 들어 수 평균분자량은 약 75,000 이하, 예를 들어 50,000, 40,000 또는 30,000 g/몰 이하일 수 있다. 예를 들어, 수 평균분자량은 500 g/mole 내지 약 75,000g/mole의 범위 일 수 있다. 그러나, 예를 들어 2개 미만의 반복 단위, 예를 들어 2 내지 50 반복 단위를 갖는 이산된 PEG 사슬로 이루어진 매우 작은 올리고머는 일부 용도에 유용하며 본 발명의 하나의 바람직한 구현 예에 존재한다. 예를 들어, 중합체는 2 내지 48, 예를 들어 2 내지 36, 예를 들어 2 내지 24 단위를 함유할 수 있다. 12, 20, 24, 36, 40 또는 48 반복 단위를 갖는 직쇄 또는분지 화된 PEG가 예를 들어 사용될 수 있다. 접합될 단백질이 순환을 떠나 조직을 관통하도록 의도될 때, 예를 들어 악성 종양, 감염 또는자가 면역 질환에 의해 유발된 염증의 치료에 사용되거나 또는 외상에 의해 의도될 때,보다 낮은분자량의 중합체를 30,000 g / mole 범위. 중합체 - 단백질 접합체가 순환 중에 유지되도록 의도되는 적용에 대해, 예를 들어 20,000 - 75,000 g / 몰 범위의 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
사용되는 중합체는 접합체가 의도된 용도를 위해 용매 매질에서 용해될 수 있도록 선택되어야 한다. 생물학적 적용, 특히 진단 용도 및 포유류에 대한 임상적 치료학적 투여를위한 적용에있어서, 접합체는 수성 매질에 가용 일 것이다.
바람직하게는 중합체는 합성 중합체이고, 바람직하게는 수용성 중합체이다. 수용성 폴리에틸렌 글리콜의 사용은 많은 용도에 특히 바람직하다.
본 발명의 동시 계류중인 출원 GB 1418986은 특정 구조의 PEG- 함유 링커의 용도에 관한 것이며, 이들은 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 출원은 다음을 개시한다:
본 발명은 단백질 또는 펩타이드와 치료학적, 진단적 또는 표지제제의 컨쥬 게이트(접합체)를 제공하며, 상기 접합체는 단백질 또는 펩티드 결합 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분을 함유한다; 상기 단백질 또는 펩티드 결합 부분은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00049
상기 식에서, Pr은 단백질 또는 펩타이드를 나타내고, Nu는 단백질 또는 펩티드에 존재하거나 부착된 친핵체를 나타내고, A 및 B는 각각 독립적으로 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 쇄를 나타내며, W'는 전자 끄는 기 또는 이의 환원에 의해 수득된 것이고, 상기 폴리에틸렌 글리콜 부분은 화학식 CH2CH2OR(여기서, R은 수소 원자, 알킬기, 예를 들어 C1-4 알킬기, 특히 메틸기를 나타냄)의 말단 또는 말단기를 갖는 펜던트 폴리에틸렌 글리콜 쇄(사슬)이거나, 또는 임의적으로 치환된 아릴 그룹, 특히 페닐 그룹, 특히 비치환된 페닐 그룹이다.
본 발명은 또한 단백질 또는 펩타이드와 반응할 수 있고 치료제, 진단제 또는 표지제 및 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함하는 접합 시약을 제공한다. 상기 접합 시약은 하기 화학식의 그룹을 포함한다:
Figure pct00050
또는
Figure pct00051
.
여기서, W는 전자 끄는 기를 나타내고, A 및 B는 상기에 주어진 의미를 가지며, m은 0 내지 4이고, 각각의 L은 독립적으로 이탈기를 나타내고; 상기 폴리에틸렌 글리콜 부분은 화학식 CH2CH2OR(여기서, R은 수소 원자, 알킬기, 예를 들어 C1-4 알킬기, 특히 메틸기를 나타냄)의 말단 또는 말단기를 갖는 펜던트 폴리에틸렌 글리콜 쇄이거나, 또는 임의적으로 치환된 아릴 그룹, 특히 페닐 그룹, 특히 비치환된 페닐 그룹이다.
본 발명은 또한 단백질 또는 펩타이드를 본 발명에 따른 접합 시약과 반응시키는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 접합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 컨쥬 게이트(접합체)는 다음 식으로개략적으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00052
D는 치료학적, 진단적 또는 표지 제를 나타내고, F'는 화학식 I의 기를 나타내고, PEG는 화학식 -CH2CH2OR의 말단 또는 말단기를 갖는 펜던트 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 나타낸다.
본 발명의 시약은 하기 식으로 개략적으로 나타낼 수 있다:
Figure pct00053
D는 치료학적, 진단적 또는 표지 제를 나타내고, F는 화학식 II 또는 II'의 기를 나타내고, PEG는 화학식 -CH2CH2OR의 말단 또는 말단기를 갖는 펜던트 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 나타낸다. 작용기 F는 후술하는 바와 같이 단백질 또는 펩타이드에 존재하는 2개의 친핵체와 반응할 수 있다.
본 발명의 컨쥬 게이트(접합체) 및 시약의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분은 화학식 CH2CH2OR(여기서, R은 수소 원자를 나타냄), 알킬기, 예를 들어 C1-4 알킬기를 나타내는 측쇄 말단 그룹을 갖는 펜던트 PEG 사슬이거나 특히 메틸기, 또는 임의로 치환된 아릴기, 특히 페닐기, 특히 비치환 페닐기 이다. 바람직하게는, R은 메틸기 또는 수소 원자이다.
PEG 부분의 전체 크기는 당연히 의도된 용도에 좌우될 것이다. 일부 용도에있어서, 고분자량 PEG가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 수 평균분자량은 약 75,000 이하, 예를 들어 50,000, 40,000 또는 30,000 g/몰 이하일 수 있다. 예를 들어, 수 평균분자량은 500 g/몰 내지 약 75,000의 범위 일 수 있다. 그러나, 보다 작은 PEG 부분이 일부 용도에 바람직할 수 있다.
하나의 바람직한 구체 예에서, PEG 부분의 PEG는 모두 펜던트 PEG 사슬 내에 존재한다. 또 다른 실시 양태에서, PEG는 또한분자의 주쇄에 존재할 수 있으며, 이는 하기에서 보다 상세히 논의된다.
PEG 부분과 마찬가지로 펜던트 PEG 사슬의 크기는 의도된 용도에 따라 달라진다. 일부 용도에 있어서, 고분자량 펜던트 PEG 사슬이 사용될 수 있으며, 예를 들어 수 평균분자량은 약 75,000 이하, 예를 들어 50,000, 40,000 또는 30,000 g/몰 이하일 수 있다. 예를 들어, 수 평균분자량은 500 g/몰 내지 약 75,000의 범위 일 수 있다. 그러나 많은 응용분야에서 더 작은 펜던트 PEG 사슬이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 PEG 사슬은 3,000 g/몰 이하의분자량을 가질 수 있다. 그러나, 예를 들어 2개 미만의 반복 단위, 예를 들어 2 내지 50 반복 단위를 갖는 이산된 PEG 사슬로 이루어진 매우 작은 올리고머는 일부 용도에 유용하며, 하나의 바람직한 구현 예에서 상기 PEG 사슬로서 존재한다. 본 발명 펜던트 PEG 사슬은 직쇄 또는분지쇄 일 수 있다. PEG 사슬, 예를 들어, 12, 20, 24, 36, 40 또는 48 반복 단위를 갖는 직쇄 또는분지쇄가 사용될 수 있다.
접합 공정
본 발명에 따른 이탈기를 함유하는 접합 시약은 단백질 또는 펩타이드와 반응하여 접합체를 형성할 수 있으며, 이러한 반응은 본 발명의 추가 양태를 형성한다. 본 발명의이 양태의 바람직한 실시 양태에서, 상기 기재된 구조 I, I', II 또는 III 중 하나를 갖는 접합 시약(모든 바람직한 하위 구조를 포함함)을 단백질 또는 펩타이드와 반응시켜 접합체를 형성한다. 이들 시약 중 하나를 사용하는 접합 공정의 직접 생성물은 전자 끄는 기(전자 흡인 그룹) W를 함유하는 접합체이다. 그러나, 상기 접합 공정은 적합한 조건하에서 가역적이다. 예를 들어 단백질의 신속한 방출이 요구되는 경우와 같은 경우에는 바람직할 수 있지만 다른 응용에서는 단백질의 빠른 방출이 바람직하지 않을 수 있다. 그러므로 전자 흡인 부분 (W)의 환원에 의해 컨쥬 게이트(접합체)를 안정화시켜 단백질의 방출을 방지하는 잔기를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 상기 기술된 공정은 컨쥬 게이트(접합체)에서 전자 흡인기 W를 환원시키는 추가적인 임의의 단계를 포함할 수 있다. 환원제로서 보로하이드라이드, 예를 들어 나트륨보로하이드라이드, 나트륨시아노보로하이드라이드, 포타슘보로하이드라이드 또는 나트륨트리아세톡시보로하이드라이드의 사용이 특히 바람직하다. 사용될 수 있는 다른 환원제는 예를 들어 염화주석 (II), 알루미늄 알콕사이드와 같은 알콕시드 및 리튬 알루미늄 하이드라이드를 포함한다.
따라서, 예를 들어, 케토기를 함유하는 잔기 W는 CH(OH)기를 함유하는 잔기로 환원될 수 있고; 에테르 기 CH.OR는 하이드록시 기와 에테르 화제의 반응에 의해 수득 될 수 있고; 하이드록시 기와 아실화제의 반응에 의해 에스테르 그룹 CH.O.C(O)R을 수득할 수 있다; 아민기 CH.NH2, CH.NHR 또는 CHNR2는 환원성 아민화에 의해 케톤으로부터 제조될 수 있다; 또는 아미드 CH.NHC(O)R 또는 CH.N(C(O)R)2는 아민의 아실화에 의해 형성될 수 있다. 설폰은 술폭시드, 술피드 또는 티올에테르로 환원될 수 있다. 시아노기는 아민기로 환원될 수 있다.
상기 기재된 화학식 I 또는 II의 접합 시약의 주요 특징은 α 메틸렌 이탈기 및 이중 결합이 마이클 활성화 부분으로서 작용하는 전자 흡인 기능과 교차 접합한다는 것이다. 이탈기이 직접 치환보다 교차 - 작용성 시약에서 제거되기 쉽고 전자 흡인 그룹이 마이클 반응에 적합한 활성화 부분인 경우 연속적인분자 내 비스 - 알킬화는 연속적인 마이클 및 역 마이클 반응에 의해 발생할 수 있다. 이탈 부분은 첫 번째 알킬화가 일어날 때까지 노출되지 않은 잠복 컨쥬게이트 이중 결합을 마스크하여 화학식 I'의 시약을 제공하고 순차적 및 상호 작용성 마이클 및 역 마이클 반응으로부터 비스 알킬화 결과를 마스킹하는 역할을 한다. 교차 작용성 알킬화제는 이중 결합에 또는 이탈기 및 전자 흡인 그룹 사이에 접합된 다중 결합을 함유할 수 있다.
단백질과의 결합이 단백질 내의 디설파이드 결합으로부터 유래된 2개의 황 원자를 통해 이루어지는 경우, 환원된 생성물이 구조 I 또는 II 중 하나를 갖는 시약과 반응하여 그 자리에서 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 공정을 수행할 수 있다. 바람직하게는 접합체 시약이 도입되기 전에 이황화물 결합이 환원되고 임의의 과량의 환원제가 예를 들어 완충액 교환에 의해 제거된다. 이황화물은 예를 들어 디티오트레이톨, 메르캅토에탄올 또는 트리스-카르복시에틸포스핀으로 통상적 인 방법을 사용하여 환원될 수 있다.
컨쥬게이션(접합) 반응은 공지된 컨쥬게이션 방법과 유사한 조건하에 수행될 수 있으며, 상기 언급된 선행 기술에 개시된 조건을 포함한다. 예를 들어, 구조 I, I'또는 II 중 하나를 갖는 접합 시약을 사용하는 경우, 본 발명에 따른 접합 반응은 WO 2005/007197, WO 2009/047500, WO 2014/064423호 및 WO 2014/064424호에 기재되어 있다. 상기 공정은 예를 들어 모든 반응물이 용해되는 용매 또는 용매 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 수성 반응 매질에서 중합체 접합 시약과 직접 반응할 수 있다. 이 반응 매질은 또한 친핵체의 pH 요건에 따라 완충될 수 있다. 반응에 대한 최적 pH는 일반적으로 4.5 이상, 전형적으로 약 5.0 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 6.0 내지 7.5이다. 최적의 반응 조건은 물론 사용된 특정 반응물에 의존할 것이다.
3-40℃ 사이의 반응 온도는 수성 반응 매질을 사용할 때 일반적으로 적합하다. 유기 매질(예: THF, 에틸 아세테이트, 아세톤)에서 수행되는 반응은 일반적으로 최대 주변 온도에서 수행됩니다. 바람직한 일 구체 예에서, 반응은 유기 용매의 비율, 예를 들어 20 중량% 이하의 유기 용매, 전형적으로 5 내지 20 중량%의 유기 용매를 함유할 수 있는 수성 완충액 중에서 수행된다.
단백질은 화학양론적 당량 또는 약간 과량의 접합 시약을 사용하여 효과적으로 접합될 수 있다. 그러나, 과량의 접합 시약으로 접합 반응을 수행하는 것도 가능하며, 이는 일부 단백질에 바람직할 수 있다. 과량의 시약은 컨쥬 게이트(접합체)의 순차적 정제 동안 이온 교환 또는 HPLC 크로마토 그래피와 같은 통상적인 수단에 의해 쉽게 제거될 수 있다.
물론, 하나 이상의 접합 시약이 단백질에 접합될 수 있으며, 여기서 단백질은 충분한 부착 점을 포함한다. 예를 들어, 2개의 상이한 다이설파이드 결합을 함유하는 단백질 또는 하나의 다이설파이드 결합을 함유하고 또한 폴리 히스티딘 태그를 갖는 단백질에서, 단백질 1분자당 2분자의 반응물을 접합시키는 것이 가능하다.
단백질
친핵성 기를 함유하는 임의의 원하는 펩타이드 또는 단백질은 본 발명의 방법을 사용하여 접합될 수 있다. 적합한 단백질은 예를 들어 펩타이드, 폴리 펩타이드, 항체, 항체 단편, 효소, 사이토 카인, 케모카인, 수용체, 혈액 인자, 펩타이드 호르몬, 독소, 전사 단백질 또는 다 합체 단백질을 포함한다.
다음은 본 발명을 이용하여 접합될 수 있는 특정 단백질을 제공한다. 효소는 탄수화물 특이적 효소, 단백질분해 효소 등, 예를 들어 미국 특허 제 4,179,337 호에개시된 산화 환원 효소, 트랜스퍼라제, 가수분해 효소, 리아제, 이소머라제 및 리가제를 포함한다. 관심의 특정 효소는 아스파라기나제, 아데노신 디아미나제, 수퍼옥시드 디스머타제(superoxide dismutase), 카탈라아제, 키모트립신, 리파아제, 우리카아제, 빌리루빈 산화효소(oxidase), 포도당 산화효소, 글루커로니다제(glucuronidase), 글루코코비다제(glucocorbidase), 글루코코브로시다제(glucocorbrosidase), 글루커로니다제(glucuronidase) 및 글루타미나제(glutaminase)를 포함한다.
혈액 단백질은 알부민, 트랜스퍼린, VII 인자, VIII 인자 또는 IX 인자, 본 윌프랜드 인자(von Willebrand factor), 인슐린, ACTH, 글루카겐, 소마토스타틴, 소마토트로핀(somatotropin), 티모신(thymosin), 부갑상선 호르몬, 색소 호르몬, 소마토메딘(somatomedins), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 루테니징(luteinizing) 호르몬, 히포타라믹(hypothalamic) 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴, 인터루킨, 인터페론, 예를 들어 IFN-a 또는 IFN-J3, 콜로니 자극 인자, 헤모글로빈, 사이토카인, 10 항체, 항체 단편, 코리오닉고나도트로핀(chorionicgonadotropin), 난포 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬 및 조직 플라스미노겐 활성제를 포함한다.
여타 관련 단백질은 드레보그(Dreborg) 등의 문헌 [Crit. Therap 목사. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315-365]에 개시된 알레지 항원 단백질로, 폴리(알킬렌옥사이드)와 같은 중합체와 컨쥬게이션될 때 감소된 알레르기 성질을 가지며 결과적으로 내성 유도제로서 사용하기에 적합하다. 개시된 알레르겐은 래그 위드 항원 E, 꿀벌 독, 진드기 알레르겐 등이 있다.
IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이들의 단편과 같은 면역 글로불린과 마찬가지로, 면역 글로불린, 오발 부민, 리파아제, 글루코스레브로시다아제, 렉틴, 조직 플라스미노겐 활성제 및 글라이코실화인터류킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자가 중요하다.
특히 중요한 것은 수용체 및 리간드 결합 단백질 및 진단 및 치료 목적으로 임상 의학에 사용되는 항체 및 항체 단편이다. 결합 단백질 / 항체는 진단, 치료 또는 표지 제제, 예를 들어 방사성 동위 원소 또는 세포 독성 / 항 감염 제와 접합될 수 있다. 약물이 세포 독성 약물, 예를 들어 아우리스타틴 또는 메이탄시노이드인 항체 - 약물 접합체의 제조에 본 발명을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
단백질은 원하는 경우 유도체화 되거나 관능화 될 수 있다. 특히, 접합 전에, 단백질, 예를 들어 천연 단백질은 다양한 차단기와 반응하여 그 위에 민감한 그룹을 보호할 수 있다; 또는 본 발명의 방법을 사용하거나 대안적인 방법을 사용하여 하나 이상의 중합체 또는 다른분자와 미리 접합시킬 수 있다. 본 발명의 일 구체 예에서, 이는 본 발명에 따른 접합 시약에 의해 표적화 될 수 있는 폴리히스티딘 태그를 함유한다.
접합 시약이 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 2개의 친핵체와 반응할 수 있는 본 발명의 측면에서, 시약은 하기 항목에서 정의된 바와 같을 수 있다.
1. 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 2개의 친핵체와 반응할 수 있고, 상기 친핵체와의 반응시 상실되는 이탈기를 함유하고, 상기 이탈기는 상기 접합 시약 내에서 2개의 부착 점을 가지며, n1이 2 이상의 수인 -(CH2CH2O)n1 부분을 포함한다.
2. n1이 2 내지 5 또는 5 내지 9인 제1항에 정의된 접합 시약.
3. 부분 (CH2CH2O) n1-가 5kDa 이하의분자량을 갖는 제1항 또는 제2항에 정의된 접합 시약.
4. 상기 이탈기가 화학식 -SPS-, -OPO-, -SO2-P-SO2-, -OSO2P-OSO2- 또는 -N+R2R3-P-N+R2R3- 인 상기 1 내지 3항 및 하기 제5항 내지 10항 중 어느 한 항에 정의된 시약이도, 여기서, P는 부분 -(CH2CH2O)n1-을 포함하는 그룹이고, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-4 알킬 그룹 또는 그룹 P를 나타낸다.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이탈기는 -S-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-S-, -O-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-O-, -SO2-(CH2CH2O)-(CH2CH2)nSO2-, -OSO2-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-OSO2-, -N+R2R3-(CH2CH2O)n1-(CH2CH2)-N+R2R3- 또는 하기 그룹 중 하나이되,
Figure pct00054
,
Figure pct00055
,
Figure pct00056
,
Figure pct00057
,
Figure pct00058
여기서, R1은 캡핑 기이고, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-4 알킬기를 나타낸다.
6. 상기 이탈기가 -SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-인 제5항에서 정의된 시약이되, 제5항에 있어서, R1이 수소 원자, C1-4 알킬기, 임의 치환된 아릴기, 또는 화학식 -CH2CH2CO2H 또는 -CH2CH2NH2의 기를 나타내는 것인 시약.
8. 진단, 치료 또는 표지 제 또는 진단 제, 치료제 또는 표지 제제 용 결합제인 페이로드를 운반하는, 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 시약.
9. 관능기 I, I', II 또는 III을 함유하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 시약:
Figure pct00059
W는 전자 흡인 성기를 나타내고; A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬을 나타내고; B는 결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 쇄를 나타내고; 두 L은 함께 -(CH2CH2O)n1- 부분을 포함하는 이탈기를 나타내며, 여기서 n1은 2 이상의 수이고; 또는
~ W-CR4R4'-CR4.L.L '(II)
W는 일반 식 I에 주어진 의미를 갖고, (ⅰ) 각각의 R4는 수소 원자 또는 C1-4 알킬기를 나타내고, R4'는 수소 원자를 나타내고, L 및 L'는 함께 이탈기를 나타내며 (CH2CH2O)n1- 부분(여기서, n은 2 이상의 수이다)를 나타낸다.
10. 제9항에 정의된 바와 같은 화학식을 갖는 시약:
Figure pct00060
또는
D-Q-W-CR2R2'-CR2.L.L' (IIa)
Q는 연결기를 나타내고, D는 진단, 치료 또는 표지 제 또는 진단, 치료 또는 표지 제의 결합제 인 페이로드를 나타낸다.
11. 제10항에 정의된 바와 같은 기능성 그룹을 함유하는 시약 :
Figure pct00061
.
12. 제11항에 정의된 바와 같은 하기 화학식을 가지는 시약:
Figure pct00062
Q는 연결기를 나타내고, D는 진단, 치료 또는 표지 제 또는 진단, 치료 또는 표지 제의 결합제 인 페이로드를 나타낸다.
13. D-Q가 약물 또는 중합체, 또는 약물 및 중합체 모두를 포함하는 10 또는 12항에 정의된 시약.
14. 약물이 존재한다면 세포 독성 약물이고 존재하는 경우 중합체는 폴리에틸렌 글리콜인 제13항에 정의된 시약.
이하, 하기 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1 : 7개의 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기를 포함하는 접합 시약 2의 합성.
단계 1 : 화합물 1 의 합성.
Figure pct00063
디메틸 포름 아미드 (DMF, 70 mL) 중 4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) 메틸] 아세틸] 벤조산 (1.50 g, Nature Protocols, 2006, 1 (54), 2241-2252) α- 메톡시 -ω- 메르캅토 헵타 (에틸렌 글리콜) (3.20 g, Iris Biotech) 및 트리 에틸 아민 (2.50 mL)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 19시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (2.4 mL) 중에 용해 시키고, 완충액 A((v / v):물:5% 아세토 니트릴:0.05 % 트리 플루오로 아세트산) 및 완충액 B((v / v) : 아세토 니트릴: 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v))로 용출시키는 역상 C18-칼럼크로마토그래피를 수행하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 티오 - 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] - 벤조산 화합물 1을 진한 맑은 무색 오일로 수득하였다(1.77 g, 66 %).
m / z [M + H +] 901.
단계 2: 시약 2 의 합성.
Figure pct00064
실온에서 메탄올:물 (18 mL, 9 : 1 v / v) 중 상기 화합물 1 (1.32 g)의 교반된 용액에 Oxone(등록 상표) (2.70 g)을 첨가하였다. 2.5시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하고 물을 아세토나이트릴(2 x 15 mL)로 공비적으로 제거하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄(3 x 10 mL)에 용해시키고, 황산 마그네슘 칼럼을 통해 여과하고, 디클로로메탄(2 x 7 mL)으로 세척하였다. 용리액 및 세척액을 합하고 휘발성 물질을 진공하에 제거하여 진하고 투명한 담황색 오일(1.29 g, 92 %)을 수득하였다. 잔류물 (700 mg)의 일부를 물:아세토니트릴 (1.50 mL, 3 : 1 v / v)에 용해시키고, 완충액 A((v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하여, 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 술 포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산 시약 2를 무색의 오일(524 mg, 68 %)로 수득하였다.
m / z [M + H +] 965.
실시예 2: 7개의 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 10 kDa PEG를 포함하는 PEG 화 시약 3 의 합성.
Figure pct00065
DMF(600 μL) 중 상기 시약 2(14 mg)의 교반된 용액을 아르곤분위기하에 0℃로 냉각시키고, 1 [비스 (디메틸 아미노) 메틸렌] -1H-1,2,3- 트리아졸로 [4,5 -b] 피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(HATU) (5.5 mg) 및 N-메틸모르폴린(NMM)(1.5 μL)을 첨가하였다. 용액을 디클로로메탄(600 μL) 중 10 kDa H2N-PEG-OMe(132 mg)의 용액이 첨가될 때 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 추가의 HATU (5.5 mg) 및 NMM (1.5 μL)을 첨가하기 전에 0℃에서 5분 동안 교반하였다. 반응 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온시켰다. 22시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 및 아세토니트릴(v / v, 1/1, 2.0 ㎖)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 비스 - mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (10kDa) OMe 시약 3을 백색분말로서 수득하였다(72mg, 53 %).
1H NMR (600 MHz, MeOH-d4) 3.35 (6H), 3.36 (3H), 3.40 (4H), 3.46-3.59 (10H), 3.56-3.70 (1065H, m, PEG), 3.71-3.77 , 3.85-3.91 (4H), 4.76 (1H), 8.00 (2H), 8.18 (2H).
실시예 3: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 로다 민 B 염료를 포함하는 형광 접합 시약 4의 합성
Figure pct00066
시약 2 (38mg) 및 리사민로다민 B 에틸렌디아민(20mg, Invitrogen)을 1.5mL의 무수 DMF에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. HATU(15 mg)를 첨가하고 용액을 2분 동안 교반한 후 NMM (8.7 μL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 조 반응물을 고 진공하에 3시간 동안 부분적으로 농축 한 다음, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v): 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 보라색 고체(43 mg, 69 %)로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아마이드 - 로다민 B 시약 4를 수득하였다.
m / z [M + H] + (1549, 80 %), [M + 2H] 2+ (783,100 %). 1H NMR (600 MHz, MeOH-d4) 1.45 (9H, s), 2.40-2.45 (8H, m), 3.40-3.46 (2H, m), 3.52-3.66 (m, PEG 및 CH2-Ts), 4.27 (1H, q), 8.01 (2H, d), 8.08 (1H, dd), 8.15 (2H, d), 8.66 (1H, d).
실시예 4: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 5의 합성.
Figure pct00067
하기 구조를 가지는 val-cit-PAB-MMAE 염의 TFA염에:
Figure pct00068
(25.0 mg), DMF (1.5 mL) 중 시약 2 (15.6 mg)의 용액을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, HATU(6.1 mg) 및 NMM(1.8 μL)의분취량을 매 20분 마다 첨가하여 총 5회 첨가하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 2시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 및 아세토니트릴 (v / v, 1/1, 0.6 mL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트 산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 백색분말로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -val-cit-PAB-MMAE 시약 5 (22.4 mg, 68 %)를 얻었다.
m / z [M + 2H2 +] 1035
실시예 5: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 6의 합성
Figure pct00069
단계 1: 화합물 7 의 합성
Figure pct00070
DMF(4 ㎖) 중의 HATU(394 ㎎) 및 DMF(4 ㎖) 중 NMM(114 ㎕)의 스톡 용액을 제조하였다. 시약 2(250mg)의 DMF(10mL) 용액에 H2N-dPEG- (24u) - (CO2tBu) (405mg)을 첨가하였다. 혼합물을 DMF(5 mL)로 희석하고, 실온에서 5분 동안 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, HATU(1 mL) 및 NMM(1 mL)의분액을 매 10분 마다 첨가하여 총 4회 첨가하였다. 40분 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 2.5시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물(2 mL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 생성물을 단리하였다. 이어 세척하고, 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 비스 -mPEG (7u)- 3- 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 부틸 에스테르 화합물 7을 를 698.46 Da로서 수득하였다(422 mg, 76%).
m / z [M- (tBu) + 3H3 +]
단계 2: 화합물 8 의 합성
Figure pct00071
시약 7(382 mg)을 포름산(5 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 불활성 질소 대기하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 포름산을 동결 건조에 의해 제거하였다. 생성된 고체를 물 (1 mL)에 용해 시키고, 생성물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 단리하였다. 세척하고, 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 비스 -mPEG (7u) - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) 산 화합물 (8)을 백색 고체 698.33 Da로서 수득하였다(194 mg, 53 %).
m / z [M + 3H3 +]
단계 3: 시약 6 의 합성
시약 8 (15mg)을 DMF (0.2mL)에 용해 시키고 DMF (0.2mL) 중의 val-cit-PAB-MMAE.TFA 염 (11mg)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 교반하였다. HATU (2.7mg) 및 NMM (0.7mg)을 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. HATU (2.7 ㎎) 및 NMM (0.4 ㎎)의 추가량을 20분 마다 첨가하여 총 5회 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 1시간 40분 후, 반응물을 16시간 동안 -20℃로 냉각시켰다. 반응 용액을 물 (0.4 mL)로 종결시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴: 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피를 수행하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조 시켜 제거하여 무색 투명한 오일로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - val -PAB-MMAE 시약 6을 수득하였다( 7.9 ㎎, 34 %).
m / z [M + 2H] 2 + 1599.98
실시예 6: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 메이탄 시 노이드 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 9의 합성
Figure pct00072
하기 구조를 가지는 val-ala-PAB-AHX-DM1의 교반된 용액에:
Figure pct00073
(5.2 mg)의 무수 DMF (400 μL) 용액에 시약 2 (6 mg)를 첨가하고 0℃에서 5분간 교반하였다. HATU (2.62 mg) 및 NMM (0.44 mg)을 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 20분 후, 추가량의 HATU (2.62 mg) 및 NMM (0.44 mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 2.5시간 후, 반응물을 16시간 동안 -20℃로 냉각시켰다. 반응액을 진공하에 농축시킨 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색의 오일로서 bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 - val라 -AAB-AHX-DM1 시약 9를 얻었다(6.5 mg, 74 %).
m / z [M + H +] 2030
실시예 7: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 메이탄시노이드 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 10의 합성
Figure pct00074
무수 DMF (400 μL) 중 val-ala-PAB-AHX-DM1(5.0 mg)의 교반된 용액에 시약 8(13 mg)을 첨가하고 0℃에서 5분 동안 교반하였다. HATU(2.62 mg) 및 NMM(0.44 mg)을 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 20분 후, 추가량의 HATU (2.62 mg) 및 NMM (0.44 mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 2.5시간 후, 반응물을 16시간 동안 -20℃로 냉각시켰다. 반응액을 진공하에 농축시킨 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 진한 황색 오일로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 알알 -PAB-AHX-DM1 시약 10을 얻었다(5.6 mg, 41 %).
m / z [M-OH + H] 2+ 1571.5.
실시예 8: 2 반복 단위, 12 반복 단위, 1 kDa , 2 kDa 또는 5 kDa 중합체 에틸렌 글리콜 이탈기 및 메이탄 시 노이드 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 12, 13, 14 및 15의 합성.
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
메이탄사노이드 시약 비스 -mPEG (12u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 알라 -PAB-AHX-DM112, 비스 -mPEG (1kDa) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) (2 kDa) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 알알 -PAB-AHX-DM113 및 비스 -mPEG (5 kDa) 설폰 - 프로판일 - 벤즈아미드 티올 2- (2- 메톡시에톡시) 에탄티올, 알파 - 메톡시 - 오메가 -3,5- 디메틸 -1,2- 디아미노 -2,4- 디메틸 -2- 메톡시 -α-D- 글루탐산을 사용하여 실시예 7의 시약 10에 대해 기재 한 것과 유사한 방식으로, 알파 - 메톡시 - 오메가 - 메르캅토폴리 (에틸렌 글리콜 1 kDa), 알파 - 메톡시 - 오메가 - 메르캅토폴리 (에틸렌 글리콜 2 kDa) 및 알파 - 메톡시 - 오메가 - 메르캅토폴리 (에틸렌 글리콜 5 kDa) )를 실시예 1에서 화합물 1의 합성을 위해 각각 α- 메톡시 -ω- 메르캅토 헵타 (에틸렌 글리콜) 대신에 사용하였다.
실시예 9: 2 반복 단위, 12 반복 단위, 1 kDa , 2 kDa 또는 5 kDa 중합체 에틸렌 글리콜 방출 기 및 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 17, 18, 19 및 20의 합성.
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
아우리스타틴 시약 MPEG-비스 (12U) 설폰 - 프로파노 - 벤즈아미드-PEG (24U) -val-CIT-PAB-17 MMAE, MPEG-비스 (1 kDa의) 설폰 - 프로파노 - 벤즈아미드-PEG (24U) -val - 시트르산 PAB-18 MMAE, MPEG-비스 (2- kDa의) 설폰 - 프로파노 - 벤즈아미드-PEG (24U) -val-CIT-PAB-19 MMAE와 MPEG-비스 (5 kDa의) 설폰 - 프로파노 - 벤즈아미드-PEG (24U) - val은--PAB-20 CIT 티올을 2- (2- 메톡시에톡시) 에탄 티올을 사용하여 실시예 5에 시약 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 MMAE 합성 알파 - 오메가 메머캅토 도데 (에틸렌 글리콜), α- - 메톡시, 오메가 캅토폴리 (에틸렌 글리콜 1 kDa 이상) 알파 - 오메가 - 메머캅토, 폴리 (에틸렌 글리콜 kDa의 2) 알파 - 오메가 - 메머캅토, 폴리 (에틸렌 글리콜 kDa의 5)를 각각 사용하였고, 이는 실시예 1의 화합물 1의 합성에 알파 - 메톡시 -오메가 머캅 헵타 (에틸렌 글리콜)을 대체한 것이다.
실시예 10: 메이탄시 노이드 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 21의 합성
Figure pct00083
단계 1: 화합물 22 의 합성
Figure pct00084
DMF (2 mL) 중의 Fmoc-L-Glu- (OtBu) -OH (36 mg)의 용액을 아르곤분위기하에 0℃로 냉각시키고 (벤조트리아졸 -1- 일옥시) 트리스 - (디메틸 아미노) 포스 포늄 헥사플루오로포스페이트 BOP) (41 mg)을 첨가한 후, NH2-PEG (24u) -OMe (100 mg) 및 N, N- 디이소프로필 에틸아민 (19 μL)을 첨가하였다. 용액을 실온으로 가온시키고, 22시간 후 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 (1 mL)에 용해시키고 디클로로메탄 : 메탄올 (100 : 0 v / v 내지 80:20 v / v)로 용출시키는 순상 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하여 Fmoc-L-Glu- [OtBu] - [PEG (24u) -OMe]을 무색의 오일로서 수득하였다 (84 mg, 67 %). 아르곤 대기하에 DMF (2 mL) 중 화합물 Fmoc-L-Glu- [OtBu] - [PEG (24u) -OMe] (74 mg)의 용액에 피페리딘 (49 μL)을 첨가하고, 실온에서 22시간 동안 교반한 후 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 헥산 (3 × 0.7 mL)으로 처리하였다. 유기 용매로 분리시키고, 생성된 잔류물을 진공하에 건조시켜 L-Glu- [OtBu] - [PEG (24u) -OMe] 화합물 22를 백색 고체로서 수득하였다 (61 mg, 97 %).
m / z [M + H] + (1097, 10 %), [M + 2H] 2+ (1035, 100 %).
단계 2: 화합물 23 의 합성
Figure pct00085
DMF (550 μL) 중 화합물 22 (26.6 mg)의 용액을 HATU (10.5 mg)가 첨가된 아르곤 대기 하에서 0℃로 냉각시키고, 용액을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 여기에 DMF (550 μL) 중 시약 2 (32 mg)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 5분 동안 교반한 후 NMM (2.9 μL) 및 HATU (10.5 mg)를 첨가하였다. 반응 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온시키고, 추가로 3.5시간 동안 교반하였다. 이시간 후, 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 및 아세토 니트릴 (v / v, 1/1 1.2 ml)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 무색의 오일로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- [OtBu] - [PEG (24u) ㎎, 55 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.83-4.71 (1H, m), 4.58 (1H, dd), 3.92-3.83 (6H, m) , 3.78-3.56 (140H, m), 3.57-3.51 (6H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.41 (2H, t), 2.24-2.13 (1H, m), 2.10-1.98 (1H, m), 1.45 (9H, s); m / z [M + Na] + (2243,50 %), [M + H] + (2221,40 %), [M + Na + 2H] 3+ (747,100 %).
아르곤분위기 하에서 디클로로메탄 (2 mL) 중의 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- [OtBu] - [PEG (24u) -OMe] (30 mg)의 용액을 0℃ 트리 플루오로 아세트산 (500 μL)을 첨가하고, 생성된 용액을 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 추가로 1시간 동안 교반하였다. 2시간 후, 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 및 아세토 니트릴 (v / v, 1/1, 0.6 mL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 무색의 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- [OH] - [PEG (24u) -OMe] 화합물 23 오일 (20 mg, 68 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) 8.19 (2H, d), 8.04 (2H, d), 4.81-4.72 (1H, m), 4.59 (1H, dd), 3.92-3.84 (6H, m) 3.67 - 3.50 (146H, m), 3.40 (4H, dd), 3.36 (3H, s), 3.35 (6H, s), 2.48 (2H, t), 2.26-2.15 (1H, m), 2.15-2.03 1H, m); m / z [M + H] + (2165, 55 %), [M + 2H] 2+ (1083,60 %), [M + 2H + Na] 3+ (729, 100 %).
단계 3: 시약 21 의 합성
DMF (600 μL) 중 화합물 23 (15.0 mg)의 용액을 아르곤 대기 하에서 0℃로 냉각시켰다. HATU (2.9mg)를 첨가하고, 용액을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 여기에 실온에서 0.5시간 동안 교반한 DMF (600 μL) 중 val-ala-PAB-AHX-DM1 (9.2 mg)과 NMM (0.8 μL)의 용액을 첨가하였다. 5분 후, 추가량의 HATU (2.9 mg) 및 NMM (0.8 μL)을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 3시간 후, 추가량의 HATU (0.7 mg)를 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 추가로 2시간 후, 반응물을 -20℃에서 16시간 동안 저장하였다. 반응액을 진공 농축시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피를 수행하고, 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- [val-ala-PAB-AHX-DM1] - [PEG (24u) 화합물 21을 무색 투명한 오일로서 수득하였다(14.3 mg, 64 %).
1H NMR (600 MHz, MeOH-∂4) (선택된 특성 신호) 5.69 (1H, dd), 6.59 (1H, dd), 6.68 (1H, s), 6.69 (1H, d), 7.10 ), 7.28 (2H, d), 7.57 (2H, d), 8.01 (2H, d), 8.16 (2H, d); m / z [M-AHX-DM1] + (2422, 40 %).
실시예 11A : 7개의 반복 단위 중합체 이탈기 및 메이탄시 노이드 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 24의 합성
Figure pct00086
DMF (500 ㎕) 중의 화합물 23 (12.4 mg)의 용액을 아르곤 대기 하에서 0℃로 냉각시켰다. HATU (2.4 mg)를 첨가하고, 용액을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 여기에 DMF (500 μL) 중 val-cit-AHX-DM1 (화합물 47 대신 6.49 mg의 AHX-DM1과 6.4 mg의 화합물을 사용하여 화합물 50과 유사한 방식으로 제조)과 NMM (0.7 μL)의 용액을 넣었다. 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 5분 후, 추가량의 HATU (1.2 mg) 및 NMM (0.4 μL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 2시간 후, 추가 양의 HATU (1.2 mg) 및 NMM (0.4 μL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 추가의 1시간 후, 반응 용액을 진공하에 농축시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v): 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- [val-cit-AHX-DM1] - [PEG (24u) 24를 투명한 무색 오일로서 수득하였다(9.6 mg, 53 %).
[M-H2O] 2+ (1575, 40 %), [M-H2O] 3+ (1050,100 %), 1036 [M-NHCO- H2O] 3+.
실시예 11B : 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 25의 합성
Figure pct00087
시약 25는 화합물 23 및 val-cit-PAB-MMAE TFA 염으로부터 실시예 11A의 시약 24와 유사한 방식으로 합성되었다. Bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- [val-cit-PAB-MMAE] - [PEG (24u) -OMe] 25를 무색의 오일로서 단리 하였다.
m / z [M + H] + (3270, 12 %), [M + 2H] 2+ (1636,50 %), [M + 3H] 3+ (1091,100 %).
실시예 12 : 7개의 반복 단위 중합체 에틸렌 글리콜 이탈기 및 데스 페리 독 세민을 포함하는 이미징 및 킬레이트 용도 용 접합 시약 27의 합성
Figure pct00088
단계 1: 화합물 28 의 합성
Figure pct00089
실온에서 아르곤 대기하에 DMF (2 mL) 중의 21- (Boc- 아미노) -4,7,10,13,16,19- 헥사옥사헨이코산 (50 mg, 시그마 - 알드리치)의 용액에 벤조트리아졸 -1- 일옥시) 트리스 - (디메틸 아미노) 포스 포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP) (73mg)를 첨가하고, 용액을 0.5시간 동안 교반하였다. 여기에 실온에서 0.5시간 동안 교반한 DMF (2 mL) 중 메실레이트 (87 mg, Sigma-Aldrich) 및 N, N-디아이소프로필에틸아민 (29 μL)의 용액을 첨가하였다. 24시간 후, 반응 용액을 진공에서 농축시킨 다음, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (100 : 0 v / v 내지 50:50 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 직접 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 백색 고체(50 mg, 46 %)로서 BocNH-PEG (6u) - 데스테리독신 화합물 28을 수득하였다.
m / z [M + Na] + (1019), 50 %), [M + H] + (997,95 %), [M + 2H] 2+ (499,100 %); 1H NMR (600 MHz, MeOH-δ4) 1.28-1.38 (7H, m), 1.43 (9H, s), 1.49-1.55 (6H, m), 1.60-1.67 (5H, m), 2.09 (3H, s) , 2.41-2.47 (6H, m), 2.76 (4H, t), 3.14-3.19 (6H, m), 3.21 (2H, t), 3.50 (2H, t), 3.57-3.65 (27H, m), 3.70 -3.73 (2H, t).
단계 2: 화합물 29 의 합성
Figure pct00090
아르곤분위기하에 화합물 28 (49 mg)의 디클로로메탄 (DCM) (3 mL) 용액을 0℃로 냉각시키고 트리 플루오로 아세트산 (TFA) (750 μL)을 첨가하였다. 용액을 실온으로 가온시켰다. 1시간 후, 톨루엔 (2 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (2 mL)에 용해시키고, 수성 용매를 동결 건조시켜 임의의 잔류 TFA를 제거하고 NH2-PEG (6u ) - 데스페리독세인 화합물 29를 백색 고체 (44 mg, 정량적 수율)로서 수득하고, 이것을 임의의 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
m / z [M + H] + (897, 100 %), [M + 2H] 2 + (449, 100 %).
단계 3: 시약 27 의 합성
DMF (750 ㎕) 중 시약 2 (17 mg)의 용액을 아르곤 대기 하에서 0℃로 냉각시키고, HATU (8.0 mg)를 첨가하고 용액을 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 여기에 DMF (750 ㎕) 중 화합물 29 (23 mg) 및 NMM (2.1 μL)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 추가량의 시약 2, HATU 및 NMM을 4시간에 걸쳐 첨가하였다. 추가의 15시간 후, 반응 용액을 진공에서 농축시킨 다음, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 50:50 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색의 오일로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (6u) - 데스옥시독소 시약 27 (20.6 mg, 49 %)을 수득하였다.
m / z [M + H] + (1844,95 %), [M + 2H] 2+ (922,100 %), [M + 3H] 3+ (615,100 %).
실시예 13 (비교) : 토실 이탈기 및 데스 페리 독 세민을 포함하는 이미징 및 킬레이트 용도 용 접합 시약 30의 합성
Figure pct00091
DMF (2.5 mL) 중 화합물 29 (43 mg)의 용액에 NMM (6 μL)을 첨가하고, 용액을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 여기에 DMF 중 공지된 4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) 메틸] 아세틸] 벤조산 (29 ㎎, Nature Protocols, 2006, 1 (54), 2241-2252) (700 μL)을 첨가하였다. 추가의 NMM을 1시간, 2시간, 19시간, 23시간 및 25시간 (총 15.6μL) 후에 반응 혼합물에 첨가하였다. 26시간 후, 반응 용액을 진공에서 농축시킨 다음, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피 하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색의 오일로서 비스 - 톨릴술 폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 PEG (6u) - 데스옥시옥사민 시약 30을 수득하였다(19 mg, 29 %).
m / z [M + H] + (1379, 98 %), [M + 2H] 2+ (690,100 %); 1H NMR (600 MHz, MeOH-δ4) 1.28-1.36 (7H, m), 1.48-1.55 (6H, m), 1.59-1.65 (5H, m), 2.09 (3H, s), 2.40-2.46 (6H, (1H, m), 2.50 (6H, s), 2.74-2.78 (4H, m), 3.14-3.17 (5H, m), 3.55-3.61 (23H, m), 3.62-3.70 (12H, m), 3.75-3.80 (2H, m), 4.09-4.14 (1H, m), 7.44 (4H, d), 7.55 (2H, d), 7.62 (4H, d), 7.82 (2H, d)
실시예 14: 헥사PEG - 디설폰 이탈기 및 메이탄시 노이드 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 31의 합성
Figure pct00092
단계 1: 화합물 32 의 합성
Figure pct00093
DMF (40 mL) 중의 4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) 메틸] 아세틸] 벤조산 (542 mg, Nature Protocols, 2006, 1 (54), 2241-2252) 헥사(에틸렌 글리콜) 디티 올 (400 μL) 및 Cs2CO3 (2.4 g)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 40시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (4 mL) 중에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 헥사PEG- 디티오 에테르 프로파노일 - 벤조산 화합물 32를 백색 고체로서 수득하였다(180 mg, 33.1 %).
m / z [M + Na +] 525. 1HNMR ( CDCl3) 2.72-2.78 (4H, m, CH2-S), 2.95-3.04 (4H, m), 3.65-3.72 (18H, m, PEG), 4.76 (1H, m), 8.11 (2H, d ), 8.21 (2H, d).
단계 2: 화합물 33 의 합성
Figure pct00094
헥사PEG- 디설폰 프로파노일 - 벤조산 화합물 33은 화합물 1 대신 화합물 32를 사용하여 실시예 1의 시약 2에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 합성하였다.
단계 3: 화합물 34 의 합성
Figure pct00095
화합물 2 대신 화합물 33을 사용하여 실시예 5의 화합물 7에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 헥사PEG- 디설폰 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 부틸 에스테르 화합물 34를 합성하였다.
단계 4: 화합물 35 의 합성
Figure pct00096
화합물 7 대신 화합물 34를 사용하여 실시예 5의 화합물 8에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 헥사PEG- 디설폰 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 산성 화합물 35를 합성하였다.
단계 5: 시약 31 의 합성
메이탄사노이드 시약인 hexaPEG- 디설폰 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 알라 -PAB-AHX-DM1 31을 화합물 8 대신 화합물 35를 사용하여 실시예 7의 시약 10에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 합성하였다.
실시예 15 (비교) : 토실 이탈기 및 로다 민 B 염료를 포함하는 접합 시약 (36)
Figure pct00097
단계 1: 화합물 37 의 합성
Figure pct00098
실시예 5의 시약 8에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로, 4- (2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) 메틸] 아세틸] 벤즈아미드 -PEG (12u) - 산 화합물 37은 시약 2 대신에 공지된 4-[2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) 메틸] 아세틸] 벤조산 (Nature Protocols, 2006, 1 (54), 2241-2252)을 사용하여 합성하였다.
단계 2: 시약 36 의 합성
4-[2,2-비스[(p- 톨릴설포닐) - 메틸] 아세틸] 벤즈아미드 -PEG (12u) - 로다 민 B 시약 (36)을 실시예 3의 시약 4에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 시약 2 대신에 화합물 37을 사용하여 제조하였다.
실시예 16: 7 반복 단위 중합체 이탈기 , 아릴 이탈기 및 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 38의 합성
Figure pct00099
단계 1: 화합물 39 의 합성
Figure pct00100
디메틸 포름 아미드 (DMF (200 ㎖) 중의 공지된 4- [2,2- 비스 [(p- 톨일 술 포닐) 메틸] 아세틸] 벤조산 (200 ㎎, Nature Protocols, 2006, 1 (54), 2241-2252) , 8 mL)에 알파 - 메톡시 - 오메가 - 메르캅토헵타 (142 mg) 및 NMM (264 μL)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 19시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 아세토 니트릴 (800 μL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 투명한 무색 오일의 모노 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 - 모노 - (토실 메틸) 프로파노일산) 벤조산 화합물 39 (132 mg, 47 %)을 수득하였다.
m / z [M + H +] 701.1.
단계 2: 시약 40 의 합성
Figure pct00101
실온에서 화합물 39 (116 mg)의 메탄올 : 물 (5 mL, 9 : 1 v / v)의 교반된 용액에 옥손(305 mg)을 첨가하였다. 75분 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하고 아세토 니트릴(3 x 15 mL)로 물을 공비 적으로 제거하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄(3 x 10 mL)에 용해시키고, 황산 마그네슘 칼럼을 통해 여과하고, 디클로로메탄 (2 x 7 mL)으로 세척하였다. 용리액과 세척액을 합하고 휘발성 물질을 진공에서 제거하여 진한 투명한 담황색 오일을 얻었다. 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (800 μL, 1 : 4 v / v)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 정제하고, 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 4- (3 - ((2- 헵타 (에틸렌 글리콜) 메톡시 에틸) 설포닐) -2- (토실 메틸) 프로파노일) 벤조산 화합물 40을 투명한 무색 오일 (103 mg, 78 %)로 수득하였다.
m / z [M + H +] 733.2.
단계 3: 시약 38 의 합성
Val-cit-PAB-MMAE.TFA 염 (25.0mg)에 DMF (1.5mL) 중 시약 40 (11.8mg)의 용액을 첨가하고 실온에서 5분 동안 불활성 대기하에 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 HATU (6.1 mg) 및 NMM (1.8 μL)의분취 량을 5시간에 걸쳐 총 5회 첨가하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 6시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 물 및 아세토 니트릴 (v / v, 1 : 0.6, 0.6 mL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v ) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 역상 C18-컬럼크로마토그래피 하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 모노 -mPEG (7u) 설폰 - 모노 - (토실 메틸 프로파노일 - 벤즈아미드 -) - val-cit-PAB-MMAE 시약 38을 밝은 백색분말로서 수득하였다(13.0 mg, 44 %).
m / z [M + 2H2 +] 919.3.
실시예 17: 시약 3을 사용한 환원된 Fab 다이 설파이드 결합에서의 PEG 화 및 공지된 PEG 화 시약 4- [2,2- 비스 [(p- 톨일 술 포닐) 메틸 ] 아세틸] 벤즈아 미드 -PEG (10 kDa ) - OMe 41 Nature Protocols, 2006, 1 (54), 2241-2252)
Figure pct00102
Fab (5.71 mg, trastuzumab의 papain 소화에 의해 생성된 PBS 중 2.33 mg / mL)의 인터체인 디설파이드는 0.5 μM 디티오트레티올(dithiothreitol, DTT) 수용액 50 μL를 첨가하고 22℃에서 1시간 동안 항온 처리하여 감소시켰다. 이어서, 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 평형화된 PD10 컬럼을 사용하여 환원제를 제거하고, 환원된 Fab을 동일한 완충액으로 1.24 mg / mL로 추가 희석하였다. 시약 3 및 41을 10 ㎎ / ㎖의 초순수에 독립적으로 용해시키고 1.5 몰 당량의 PEG 시약에서 Fab 로의분리된 용액에 첨가하여 Fab에 첨가하였다. PEG 화 반응을 22℃에서 진행시켰고, 그 후 샘플을 2 및 4시간 후에 SDS-PAGE분석을 위해 취하였다.
PEG 화된 Fab 로의 전환율은 ImageQuantTM 시스템 (GE Healthcare)을 사용하여 SDS-PAGE 밴드 밀도에 기초하여 추정하였다. 결과는 PEGylation 시약 3 (검정색 막대) 대 시약 41 (흰색 막대)의 결합 정도를 Fab에 비교하는 그림 1에 나와 있다. 시약 3과의 반응은 각각 2시간 및 4시간에서 PEG 화 Fab 로의 63 % 및 83 % 전환을 나타냈다. 시약 41의 경우 전환율은 각각 2시간 및 4시간에서 35 % 및 51 %였다. 이 데이터는 시약 3이 더 빨리 반응하여 시약 41보다 짧은시간 내에 더 많은 양의 PEGylated Fab을 생성 함을 보여줍니다.
실시예 18 : 시약 3을 이용한 인터페론 - 알파 다이 설파이드 결합에서의 PEG 화 및 공지된 PEG 화 시약 41과의 비교
인산염 완충 식염수 (PBS)로 인터페론 α-2a (IFN) (4mL, 0.93mg / mL, 20mM 트리스 pH 8.0, ~ 100mM NaCl, 프로테아제 억제제, 1mM EDTA, 10 % 글리세롤) Zeba ™ 스핀 5 mL 컬럼을 사용하여 pH 7.4. IFN은 DTT (25 mM)로 22℃에서 30분 처리하여 감소되었다. pH 7.4의 PBS로 평형화된 PD10 탈염 컬럼을 사용하여 환원제를 제거하였다. 시약 3과 41 (IFN 황화물 당 1.5 당량)을 4℃에서 IFN (0.7 mg / mL)에 접합시켰다. 반응 혼합물의 샘플을 1시간, 2시간 및 4시간 배양 한 후 SDS-PAGE로분석 하였다. PEG 화 IFN으로의 전환율은 ImageQuant ™ 시스템 (GE Healthcare)을 사용하여 SDS-PAGE 밴드 밀도에 기초하여 추정하였다. 결과는 중합체 에틸렌 글리콜 이탈기를 갖는 형광 시약 4 및 중합체 이탈기가없는 유사한 시약 41의 접합 효율을 비교하는도 2에 도시된다. 시약 41에 대한 동등한 시점과 비교하여 시약 3은 더 빨리 반응하고 더 많은 양의 IFN-PEG (10 kDa) -OMe (약 35 kDa에 상응하는 밴드)를 생성했다.
실시예 19 : 중합체 성 에틸렌 글리콜 이탈기를 갖는 형광 시약 4와 중합체 이탈기가없는 유사한 시약 36의 접합 효율의 비교
실시예 17에 기술된 것과 유사한 접합 방법을 사용하여, 접합 전에 접합 제 4 및 36을 각각 1.53 mg / mL 및 1.67 mg / mL로 100 % MeCN에개별적으로 용해시켰다. Fab 용액 (1.24 mg / mL, PBS 중 0.475 mL)에 1.5 당량에 해당하는 시약 4 또는 시약 36 (18 μL)을가 하였다. 22℃에서 22시간 동안 반응을 진행시키고 반응 동안 SDS-PAGE분석을 위해 샘플을 채취했다. 이미지 퀀트 (ImageQuant ™) 시스템 (GE 헬스 케어 (GE Healthcare))을 사용하여 로다 민 - 결합된 Fab 로의 전환율을 SDS-PAGE 밴드 밀도에 기초하여 추정 하였다. 결과를도 3에 나타내 었으며, 시약 4 (흑색 바) 및 시약 36 (흰색 바)을 사용하여 로다 민 접합 Fab 로의 전환을 1.5 당량의 시약으로 비교 하였다. 시약 4는 각 시점에서 접합된 Fab 로의 높은 전환율을 나타냈다.
실시예 20 : 유사한 시약 42 (4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐 ) - 메틸 ] 아세틸] 벤즈아미드 -Val-cit- PAB와의 중합체 성 에틸렌 글리콜 이탈기들을 갖는 세포 독성 시약 5의 항체 컨쥬 게이션의 비교 - MMAE )이 중합체 이탈기가 결여되어있다.
시약 42 는 WO2014064423에 기술된 바와 같이 합성되었다.
시약 5 및 42 모두 WO2014064423에 기재된 실시예와 유사한 방법을 사용하여 항체 트라스트 주맙에 접합시켰다. 간단히 말하면, trastuzumab (5.2 mg / mL)을 40℃에서 1시간 동안 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)으로 환원시켰다. 항체 5와 42를 DMF에 1.6 mM의 최종 농도로 용해시켜 항체와 1.5-mole 당량의 시약 중 5개 또는 42개 사이의 이황화물 결합을 수행했다. 항체 용액을 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 4.21 mg / mL로 희석시켰다. 시약 5 및 42를 첨가하여 항체의분취 량을 나누었다. 반응 중 최종 항체 농도는 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 4 mg / mL로 조정했다. 각 용액을 부드럽게 혼합하고 22℃에서 22시간 동안 배양했다. 16 및 22시간에분취 액을 취하여 N- 아세틸 -L- 시스테인 (20 당량의 시약)으로 22℃에서 1시간 처리 한 다음 HIC로분석 하였다. 약물 대 항체 비 (DAR)가 4 인 생성물의 % 전환율은 HIC 크로마토 그램으로부터 280 nm에서 측정된 흡광도 피크의 % 면적에 기초하여 결정하였으며 결과는도 4에 도시되어 있으며, 시약 5 (검은 막대) 및 42 (흰 막대) 항체. 도 4의 결과는 22시간 후에 DAR4 컨쥬 게이트의 6 %가 시약 42로 생성되는 반면, 시약 5는 22시간 후에 78 %의 DAR4 컨쥬 게이트가 생성되었음을 보여준다.
실시예 21 중합체 성 이탈기가없는 유사한 시약 42, 43 및 44와 함께 중합체 성 에틸렌 글리콜 이탈기를 갖는 모든 세포 독성 시약 5, 6 및 10의 항체 접합의 비교
시약 43은 WO2014064423에 기술된 바와 같이 합성되었고 시약 44는 WO2014064424에 기술된 바와 같이 합성되었다.
(a) 세포 독성 시약 43 (4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) 메틸] 아세틸] 벤즈아미드 -PEG (24u) - val-cit-PAB-MMAE)와 시약 5 .
항체 (5 ㎎ 스케일)와의 세포 독성 시약 43의 접합에 사용된 반응 조건은하기의 차이점을 제외하고는 실시예 20에서 상기 한 바와 동일 하였다 :
시약 43 및 5를 3.2 mM MeCN 용액으로 제조 하였다. 0.5, 1, 2, 4 및 22시간 후에 반응 용액의분취 량을 취하고 N- 아세틸 -L- 시스테인 (22℃에서 1시간)으로 처리하여 급냉시키고 HIC로분석 하였다. 이러한 접합 반응의 결과를도 5에 나타내 었는데, 이는 시약 5 및 시약 43에 대한 접합 속도 (평균 DAR)를 22시간 이상 비교하는시간 경과분석 인 것이다. 도 5에서, 생성물 형성 속도는 시약 43보다 시약 5가 훨씬 더 빠르다는 것을 알 수 있다. DIC 4 종을 HIC를 사용하여 각 반응 혼합물로부터 정제하고 SDS-PAGE로분석 하였다. SDS-PAGE분석으로부터, 각 샘플에 대해 존재하는 절반의 항체 종의 %를 염색된 겔의 ImageQuant ™분석에 의해 측정하였고, 결과를 표 1에 나타내었고, 시약 43으로부터 제조된 접합체는 절반의 항체 이는 시약 5에서 생성된 복합체가 유의 적으로 더 무거운 사슬 간 공유 결합을 가지며 비공 액 항체의 구조와 더 닮았다는 것을 나타낸다.
샘플 SDS-PAGE분석 (H + L 사슬 종)에 의해 존재하는 절반의 항체 종의 %
트라스투주맙- 5 접합 27%
트라스투주맙- 43 접합 47%
(b) 세포 독성 시약 44 (4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) - 메틸] 아세틸] 벤즈아미드 -PEG (24u) - 알라 -PAB-AHX-DM1)의 항체 접합의 비교 및 시약 10.
항체 (3.8 mg 스케일)와의 세포 독성 시약 44의 접합에 사용된 반응 조건은 실시예 20에 대해 전술 한 것과 동일 하였다. 반응 용액의분취 액을 16 및 22시간 후에 취하고 N- 아세틸 -L - 시스테인. 각분취 액을 HIC로분석하고 DAR 4 생성물로의 전환율을 측정 하였다. 결과는 항체에 대한 시약 10 (검정색 막대) 및 44 (흰색 막대)의 접합의 비교 인도 6에 도시되어있다. 시약 10은 16시간과 22시간 후에 더 많은 DAR 4 생성물을 제공한다는 것을 알 수 있다.
(c) 세포 독성 시약 43 (4- [2,2- 비스 [(p- 톨릴설포닐) - 메틸] 아세틸] 벤즈아미드 -PEG (24u) - val-cit-PAB-MMAE)와 시약 6 .
항체 (1 mg 스케일)와의 세포 독성 시약 6의 접합에 사용된 반응 조건은하기 차이점을 제외하고는 실시예 20에 대해 상기 한 것과 유사 하였다 : 시약 6은 3.2 mM MeCN 용액으로서 제조되었고 반응 중 MeCN 농도는 5 %. 반응 용액의분액을 4시간 후에 취하고 N- 아세틸 -L- 시스테인으로 처리하여 급냉시키고분석 HIC로분석하고 존재하는 DAR4 생성물의 %를 측정 하였다. 결과는 항체에 대한 시약 6 (검정색 막대) 및 43 (흰색 막대)의 접합의 비교 인 그림 7에 나와 있다. 시약 6 (검은 색 막대)은 시약 43 (흰색 막대)보다 4시간 후에 현저히 많은 DAR 4 생성물을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 22 : 중합체 성 이탈기가없는 유사 시약 44와 중합체 성 에틸렌 글리콜 이탈기를 갖는 세포 독성 시약 12의 항체 접합의 비교
항체 (1 mg 스케일)와의 세포 독성 시약 12의 접합에 사용된 반응 조건은 실시예 20에 대해 전술 한 것과 동일 하였다. 반응 용액의분취 액을 4시간 후에 취하고, N- 아세틸 -L- 아스 코르 빈산으로 처리하여 켄칭시키고, 시스테인에 의해분석되고 HIC에 의해분석된다. 결과는 항체에 대한 시약 44 (백색 막대) 및 12 (검정 막대)의 접합의 비교 인도 8에 도시된다. 도 8에서, 시약 (12)은 시약 (44)과 비교하여 4시간 후에 DAR4 생성물의 상당히 높은 수율을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 23 : 중합체 성 이탈기가없는 유사한 시약 44를 갖는 중합체 성 에틸렌 글리콜 이탈기를 갖는 세포 독성 시약 14, 15 및 31의 항체 접합의 비교.
항체 (1 mg 스케일)와의 세포 독성 시약 14, 15 및 31의 접합에 사용된 반응 조건은 실시예 20에 대해 전술 한 것과 동일 하였다. 반응 용액의분취 액을 4시간 후에 취하고 N- 아세틸 -L- 시스테인. 각분취 액을 HIC에 의해분석하고 존재하는 DAR4 생성물의 %를 측정 하였다. 시약 14, 15, 31 및 44와의 접합 결과를 표 2에 나타내 었으며, 시약 14, 15 및 31은 4시간 후에 시약 44와 비교하여 DAR 4 생성물의 2 배 이상의 양을 나타냈다.
표 2 : 반응 4시간 후의 항체에 대한 시약 14, 15, 31 및 44의 접합의 비교.
항체에 접합용으로 사용된 시약 4h 후, % DAR 4 생성
44 9
14 24
15 23
31 28
실시예 24 : 항체 약물 접합체의 제조
항체 약 접합체는 WO2014064423 및 WO2014064424에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 시약 21, 24 및 25로부터 제조되었다. 간단히 말하면, 항체 (trastuzumab 또는 brentuximab)는 40℃에서 1시간 동안 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀을 사용하여 감소시켰다. 이어서, 반응기를 아세토 니트릴 또는 DMF 중의 1.6 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써, 사슬 간 다이 설파이드 결합 당 1.5 몰 당량의 시약으로 항체를 접합시켰다. 항체 용액을 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 4.21 mg / mL로 희석시켰다. 시약을 항체에 첨가하고, 반응 중의 최종 항체 농도를 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 4 mg / mL로 조정 하였다. 각 용액을 부드럽게 혼합하고 22℃에서 배양했다. 항체 약 접합체 생성물을 각 접합체에 대한 소수성 상호 작용 크로마토 그래피로 정제하였다.
실시예 25 : pH 6.6 및 7.9에서 시약 3을 사용하는 히스티딘 태깅된 인터페론 - 알파의 PEG 화
시약 3과 함께 8- 히스티딘 태그를 갖는 인터페론 α-2a (IFN)의 접합은 pH 6.6 또는 pH 7.9에서 2.5 mg / mL로 수행되었고, 아세트산 나트륨 pH 5.3 또는 인산 나트륨 pH 8.0과 인산 나트륨 pH 7.4. 1, 1.5 및 2 당량의 시약 3. IFN 당 사용되었다. 생성된 반응 혼합물을 22시간 동안 22시간 동안 4시간 동안 잠정분석 하였다. 반응 혼합물을 SDS-PAGE로분석하고 그 결과를도 9에 나타내었다.도 9에서, 레인 M은 Novex Protein Standards를 나타내고; 레인 1은 pH 5.4에서 IFN을 나타내고; 레인 2는 pH 8.0에서 IFN을 나타내고; 레인 3 내지 5는 1, 1.5 및 2 당량으로부터의 컨쥬 게이트(접합체)된 생성물을 나타낸다. 시약 3, pH 6.6에서 4시간; 레인 6은 1.5 당량의 접합 생성물을 나타낸다. 시약 3, 4시간, pH 7.9; 레인 7-9는 1, 1.5 및 2 당량으로부터의 컨쥬 게이트(접합체)된 생성물을 나타낸다. 시약 3을 각각 pH 6.6에서 22시간; 레인 10은 1.5 당량의 컨쥬 게이트(접합체)된 생성물을 나타낸다. 시약 3을 각각 pH 7.9에서 22시간에 처리 하였다.
실시예 26 : 디설파이드 브리징 시약 45의 합성
Figure pct00103
단계 1: 화합물 46 의 합성
Figure pct00104
하기 화학식의 아미노 헥산 산 메이탄신 (AHX-DM1) · TFA 염 (29.4mg)의 교반 용액에 :
Figure pct00105
(400 ㎕) 중의 DMF (200 ㎕) 중의 4- (N-Boc- 아미노) -1,6- 헵탄 이산 비스 - 펜타 플루오로 페닐 에스테르 (10.2 mg)의 용액을 첨가하였다. N, N- 디이소프로필 에틸 아민 (DIPEA) (13.5 μL)을 첨가하기 전에 용액을 0℃로 냉각시켰다. 용액을 실온으로 가온시키고 18.5시간 동안 교반하였다. 반응액을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 동결 건조에 의해 용매를 제거하여 백색 고체로서 4- (N-boc- 아미노) -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX-DM1 화합물 46 (정량적 수율을 가정, 29.7 mg)을 수득하였다 [M + 2 (H2O) -NHCO] 2+ 844 (100 %), [M + H] + 1767.
단계 2: 세포독성 페이로드 47 의 합성
Figure pct00106
화합물 46 (정량적 수율 가정, 29.7mg)을 포름산 (700μL)에 용해시키고, 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하고 잔류물을 완충액 A에 용해시켜 트리 플루오로 아세트산 염으로 전환시켰다 : 완충액 B 50:50 v / v % 혼합물 (1.5 mL, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산). 용액을 실온에서 5분간 교반한 후, 동결 건조에 의해 용매를 제거하였다. 상기 공정을 반복하여 4- (아미노) -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX-DM1 화합물 (47)을회백색 고체로서 수득하였다 (18.0 mg, 2 단계에 걸쳐 60 %) m / z [M + 2H- H2O) -NHCO)] 2+ 794 (100 %), [M + H] + 1667.
단계 3: 화합물 48 의 합성
Figure pct00107
화합물 48을 특허 (EP 0 624 377 A2)에 기재된 절차에 따라 합성하여 이전에보고된 것과 일치하는분광학 데이터를 갖는 백색 고체를 수득하였다.
단계 4: 화합물 49 의 합성
Figure pct00108
DMF (500 μL) 중의 화합물 48 (20.0 mg) 및 DMF (400 μL) 중 HATU (40.0 mg)의 저장 용액을 제조 하였다. DMF (700 μL) 중 화합물 47 (14.0 mg)의 교반된 용액에 화합물 48 스톡 용액 (126.9 μL) 및 HATU 스톡 용액 (77.8 μL)의분취 량을 첨가하였다. DIPEA (4.11 ㎕)를 첨가하기 전에 반응 용액을 0℃로 냉각시켰다. 용액을 0℃에서 50분 동안 교반한 후, 화합물 48 원액 (126.9 μL), HATU 원액 (77.8 μL) 및 DIPEA (4.11 μL)의 추가분취 액을 첨가하였다. 용액을 0℃에서 40분 동안 교반하였다. 반응액을 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v)으로 용출시키는 역상 C18- ~ 0 : 100 v / v). 동결 건조에 의해 용매를 제거하여 4- (Fmoc-val-cit- 아미도) -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX-DM1 화합물 49 (정량적 수율을 가정 함, 16.9 mg)을회백색 고체로서 수득하였다. M + 2H-2 (H2O)] 2+ 1055 (100 %).
단계 5: 화합물 50 의 합성
Figure pct00109
DMF (500 ㎕) 중의 화합물 49 (정량적 수율 가정시, 16.9 mg)의 교반된 용액에 피페리딘 (3.04 ㎕)을 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피 산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 동결 건조에 의해 용매를 제거하여 4- (val-cit- 아미도) -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX-DM1 화합물 50을회백색 고체로서 수득하였다 (8.8 mg, 2 단계에 걸쳐 55 %) m / M + 2H] 2 + 962 (100 %).
단계 6: 세포 독성 유핵 생물을 포함하는 다이 설파이드 브리징 시약 45의 합성.
DMF (100 ㎕) 중 화합물 8 (13.5 mg), DMF (200 ㎕) 중 HATU (10.0 mg) 및 DMF (94.2 μL) 중 NMM (5.83 μL)의 스톡 용액을 제조 하였다. DMF (80 μL) 중 50 (1.8 mg)의 교반된 용액에 화합물 23 저장 용액 (16.5 μL) 및 HATU 스톡 용액 (20.2 μL)의분취 량을 첨가하였다. 반응 용액을 0℃로 냉각시킨 후분취 량의 NMM 스톡 용액 (5 μL)을 첨가하였다. 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온시켰다. 3.5시간 후, 반응액을 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 동결 건조에 의해 용매를 제거하여 고체 (1.5 mg, 42 %)로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -Val-cit- 아미도) -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX- / z [M + 4H-2 (H2O)] 4+ 992 (100 %), [M + 3H-2 (H2O)] 3+ 1321, [M + 2H-2 (H2O)] 2+ 1982.
실시예 27 : 세포 독성 하중을 포함하는 다이 설파이드 가교 반응 시약 ( 51)의 합성.
Figure pct00110
단계 1: 시약 51 의 합성
DMF (94.2 μL) 중 DMF (200 μL) 및 NMM (5.83 μL) 중의 HATU (10 mg)의 원액을 제조 하였다. DMF (254 μL) 중 화합물 50 (3.6 mg)의 용액에 화합물 23 (5.4 mg)을 교반하면서 용해시켰다. 교반된 용액에 HATU 스톡 용액 (40 μL)의분액을 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각시킨 후 NMM 스톡 용액 (10 μL)의분액을 첨가하였다. 50분 후, HATU 스톡 용액 (6.67 μL) 및 NMM 스톡 용액 (1.67 μL)의 추가분취 량을 첨가하였다. 반응 용액을 0℃에서 추가로 20분 동안 교반하고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 동결 건조에 의해 용매를 제거하여 시약 51을회백색 고체 (3.8 mg, 53 %) m / z [M + 4H- (H2O) -NHCO] 4+ 1003 (100 %), [M + 2 (H2O) -NHCO] 3 + 1331, [M + 2H-2 (H2O)] 2+ 2017.
실시예 28 : 세포 독성 페이로드 ( 47)를 포함하는 다이 설파이드 가교제 (56)의 합성.
Figure pct00111
단계 1: 화합물 57 의 합성
Figure pct00112
DMF (200 ㎕) 중의 하이드 록시 벤조트리아졸 (HOBt, 6.6 mg)의 저장 용액을 제조 하였다. DMF (500 ㎕) 중의 세포 독성 가반 하중 47 (10 mg)의 교반된 용액에 Fmoc-val-ala-PAB-PNP (3.7 ㎎) 및 HOBt 스톡 용액 (2 ㎕)의분액을 첨가하였다. DIPEA (2.14 μL)를 첨가하기 전에 반응 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 반응 용액을 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의한 정제 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 동결 건조하여 용매를 제거하여 Fmoc-val-ala-PAB- 아미도 -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX-DM1 시약 57을 얻었다.
단계 2: 화합물 58 의 합성
Figure pct00113
화합물 49 대신 화합물 57을 사용하여 화합물 50에 대해 기재 한 것과 유사한 방식으로 비스 - 메이탄시 노이드 화합물 아민 - val - 알라 -PAB- 아미도 -1,6- 헵탄 디아 미드 비스 -AHX-DM1 화합물 58을 합성하였다.
3 단계 : 시약 56 합성.
비스 - 메이탄시 노이드 시약 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -Glu- [NH-PEG (24u) -OMe] - [발라라 -PAB- 아미도 -1,6- 헵탄 디아미드 비스 -AHX-DM1] 56을 화합물 50 대신 화합물 58을 사용하여 시약 51에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 합성하였다.
실시예 29 : 세포 독성 탑재체 AHX -DM1을 포함하는 다이 설파이드 가교 결합제 ( 59)의 합성.
Figure pct00114
무수 DMF (400 μL) 중 val-cit-AHX-DM1 (5.0 mg)의 교반된 용액에 시약 8 (13 mg)을 첨가하고 0℃에서 5분 동안 교반하였다. HATU (2.62 mg) 및 NMM (0.44 mg)을 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 20분 후, 추가량의 HATU (2.62 mg) 및 NMM (0.44 mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 2.5시간 후, 반응물을 16시간 동안 -20℃로 냉각시켰다. 반응액을 진공하에 농축시킨 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 %로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 진한 황색 오일로서 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 구연산 -AHX-DM1 시약 59을 수득하였다 (5.6 mg, 41 %) m / z [M-OH + H] 2 + 1571.5.
실시예 30 : 다이 설파이드 가교제를 사용하는 항체 약물 접합체 60의 제조 45; (disulfide bridging reagent) (51) 및 항체 약물 컨쥬 게이트(접합체) ( 62)를 사용하는 항체 약물 접합체 (61)
항체 약물 접합체는 WO2014064423 및 WO2014064424에 기재된 것과 유사한 방법으로 제조 하였다. 간단히 말하면, 항체 (trastuzumab 또는 brentuximab)는 40℃에서 1시간 동안 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀을 사용하여 감소시켰다. 이어서, 항 - 사슬 디설파이드 결합 당 1.5 몰 당량의 시약 (즉, 45, 51 또는 56)과의 접합은 아세토 니트릴 또는 DMF 중 1.6 mM의 최종 농도로 시약을 용해시킴으로써 수행되었다. 항체 용액을 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 4.21 mg / mL로 희석시켰다. 시약을 항체에 첨가하고, 반응 중의 최종 항체 농도를 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 7.5로 4 mg / mL로 조정 하였다. 각 용액을 부드럽게 혼합하고 22℃에서 배양했다. 항체 약물 접합체 생성물을 각 접합체에 대한 소수성 상호 작용 크로마토 그래피로 정제하여 항체 비 (DAR)에 대해 정의된 약물을 갖는 생성물을 수득하였다. 시약 45, 51 및 56에 대한 DAR4 생성물로의 전환율은 HIC에 의해 결정된 바와 같이 각각 30 %, 65 % 및 40 %이었다.
실시예 31: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 플루오르 화 아릴 링커를 포함하는 PEG 접합 시약 (63)의 합성.
Figure pct00115
단계 1: 화합물 64 의 합성
Figure pct00116
4- 아세틸 -2- 플루오로 벤조산 (200 mg) 및 4- 메틸 벤젠 티올 (272 mg)의 혼합물에 포름 알데히드 (37 % 용액) (144 μL), 피페리딘 (14.4 μL) 및 피페리딘 히드로 클로라이드 (134 mg) )를 무수 에탄올 (1.5 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 2.5시간 동안 환류하에 가열하고, 그시간 동안 추가의 포름 알데히드 (37 % 용액) (144 ㎕)를 첨가하였다 (1.5시간 후). 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. 추가량의 포름 알데히드 (37 % 용액) (288 μL) 및 피페리딘 (14.4 μL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 환류하에 추가로 8시간 동안 가열 하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (800 μL, 1 : 3 v / v) 중에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 비스 - (메틸 벤젠 설파이드 프로파노일) -2- 플루오로 - 벤조산 화합물 64를 담황색 결정 (196.0 mg, 39 %) m / z [M + H] + 454.20 Da; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 2.35 (6H, s, OMe), 3.20-3.30 (4H, m, CH2), 3.70-3.80 (1H, m, CH), 7.10 (4H, d, Ar- 7.15 (4H, d, Ar-H), 7.20 (1H, s, Ar-H), 7.35 (1H, d, Ar-H), 7.90 (1H, t, Ar-).
단계 2: 화합물 65 의 합성
Figure pct00117
실온에서 메탄올 : 물 (2.0 mL, 9 : 1 v / v) 중 화합물 64 (75 mg)의 교반된 용액에 Oxone® (304 mg, Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 2시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 (3 x 5.0 mL)에 용해시키고, 황산 마그네슘 칼럼을 통해 여과하고, 디클로로메탄 (2 x 5 mL)으로 세척 하였다. 용리액 및 세척액을 합하고 휘발성 물질을 진공하에 제거하여 비스 - (토실 프로파노일) -2- 플루오로 - 벤조산 화합물 65를 백색분말로서 수득하였다 (84.0 mg, 98 %) m / z [M + H] + 519.15 Da.
단계 3: 화합물 66 의 합성
Figure pct00118
DMF (2.0 mL) 중 화합물 65 (75 mg)의 용액에 Et3N (240 μL, Acros Organics) 및 MeO-PEG- (7u) -SH (154 mg, Iris Biotech)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 6시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (2.0 mL, 1 : 1 v / v) 중에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 비스 - mPEG (7u) - 설파이드 - 프로파노일 -2- 플루오로 - 벤조산 화합물 67을 무색의 오일로서 수득하였다 (101 mg, 78 %) m / z [ M + H] + 919.45Da.
단계 4: 화합물 67 의 합성
Figure pct00119
실온에서 메탄올 : 물 (2.0 mL, 9 : 1 v / v) 중 화합물 66 (80 mg)의 교반된 용액에 Oxone® (160 mg, Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 3시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 (3 x 4 mL)에 용해시키고, 황산 마그네슘 칼럼을 통해 여과하고, 디클로로메탄 (2 x 5 mL)으로 세척 하였다. 용리액 및 세척액을 합하고 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 오일을 물에 용해시키고 동결 건조시켜 비스 - mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 -2- 플루오로 - 벤조산 화합물 67을 투명한 무색 오일로서 수득하였다 (82mg, 95 %) m / z [M + H] + 983.26Da.
단계 5 : 화합물 63의 합성 :
DMF (200 μL) 중 HATU (40.0 mg, Novabiochem) 및 DMF (200 μL) 중 NMM (11.8 μL, Acros Organics)의 원액을 제조 하였다. 화합물 67 (25.0mg)의 DMF (800μL) 용액에 H2N-PEG (24u) -OMe (23.4mg, Iris Biotech)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. HATU의분취 량 (40.0 μL)과 NMM (40.0 μL)을 10분마다 3회 첨가하여 HATU (80.0 μL)와 NMM (80.0 μL)의 나머지분량을 30분에가 하였다. 60분 후에, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (1.0 mL) 중에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색의 오일로서 비스 -mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 -2- 플루오로 - 벤즈아미드 -PEG (24u) 시약 63을 수득하였다 (17.5 mg, 40 %) m / z [M + 3H] 3+ 684.94Da.
실시예 32: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 아미노 이탈기를 포함하는 PEG 접합 시약 68의 합성.
Figure pct00120
단계 1: 화합물 69 의 합성
Figure pct00121
DMF (1.6 mL) 중의 HATU (632 mg, Novabiochem) 및 DMF (1.6 mL) 중 NMM (183 μL, Acros Organics)의 스톡 용액을 제조 하였다. 4- (3- 토실 -2- (토실 메틸) 프로파노일) 벤조산 (199 mg, BioVectra)의 DMF (4.0 mL) 용액에 H2N-PEG (24u) -CO2tBu (400.0 mg, Iris Biotech)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. HATU (320 μL) 및 NMM (320 μL)의분취 량을 매 10분마다 첨가하여 총 5회 첨가하였다. 120분 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (2.0 mL, 1 : 3 v / v) 중에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 투명한 오렌지색 오일 (184 mg, 33 %)로서 비스 - (토실 프로파노일) - 벤즈아미드 -PEG (24u) -t- 부틸 에스테르 화합물 (69) [M + Na + H] 2+ 853.43Da, [M- (tBu) + 2H] 2+ 814.83Da.
단계 2: 화합물 68 의 합성
DMF (500 ㎕) 중 69 (32 mg)의 용액에 무수 탄산나트륨 (24.1 mg, Fisher Scientific) 및 MeO-PEG- (7u) -NH2 (19 mg, Iris Biotech)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 18시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (1.0 mL) 중에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색의 오일로서 비스 -mPEG (7u) - 아미노 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -PEG (24u) - 부틸 에스테르 시약 68을 수득하였다 (15.0 mg, 38 % ) m / z [M + 2H] 2+ 1026.09Da, [M + 3H] 3+ 665.45Da.
실시예 33 : 말레이 미드 단위, 7개의 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기를 포함하는 접합 시약 70의 합성
Figure pct00122
단계 1: 화합물 71 의 합성
Figure pct00123
(300 mg, Sigma Aldrich)을 아세트산 (4.0 mL, Fisher Scientific)에 용해시키고, 여기에 CO2tBu-PEG- (24u) -NH2 (705 mg, 아이리스 바이오 테크 (Iris Biotech))를 첨가하였다 .3,4- 디브로 모 퓨란 -2,5- 디온 ). 반응물을 불활성 질소 대기하에 75℃에서 교반하였다. 3시간 후, 반응물을 실온에서 교반하고, 21시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 및 아세토 니트릴 (v / v, 1/1, 4.0 mL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 정제시켰다 v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 디브로 모 - 말레이 미드 -PEG (24u) -t- 부틸 에스테르 화합물 71을회백색의 불투명 한 고체로서 수득하였다 (427 mg, 51 %) m / z [MH- tBu)] 2+ 692.68 Da.
단계 2: 화합물 70 의 합성
DMF (1.5 ㎖) 중 화합물 71 (250 ㎎)의 용액에 알파 - 메톡시 - 오메가 - 메르캅토 헵타 (에틸렌 글리콜) (186 ㎎, Iris Biotech) 및 트리 에틸 아민 (145 ㎕)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 신속하게 침전된 트리 에틸 아민 브롬화 수소 산염을 DMF (1.0 mL)와 함께 반응 혼합물에 재용 해시키고 30분 후에 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 포름산 (3 mL, Sigma Aldrich)에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 30분 후 트리 플루오로 아세트산 (50 μL, Acros Organics)을 첨가하고 60분 후에 트리 플루오로 아세트산 (300 μL)을 더 첨가하였다. 100분 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (1.5 mL)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 왁스 성 황색 고체로서 비스 -mPEG (7u) - 말레이 미드 -PEG (24u) - 산 시약 70 (146 mg, 43 %)을 얻었다. MH3] 3+ 646.28Da.
실시예 34: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 72의 합성
Figure pct00124
단계 1: 화합물 73 의 합성
Figure pct00125
디메틸 포름 아미드 (DMF, 5.0 mL) 중의 4- (3- 토실 프로파노일) 벤조산 (99 mg, Bioconjugate Chem.20014, (25) 460-469)의 교반된 용액에 알파 - 메톡시 -ω- 메르캅토 헵타 글리콜) (170 mg, Iris Biotech) 및 트리 에틸 아민 (250 μL)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 추가분량의 트리 에틸 아민 (120 μL)을 4시간 후에 반응 혼합물에 첨가하였다. 95.0시간 후에 휘발성 물질을 진공하에 제거하고 생성된 잔류물을 물 / 아세토 니트릴 (2 mL, 1 : 1 v / v)에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v) 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 mPEG (7u) - 설파이드 - 프로파노일 - 벤조산 화합물 73을 백색 고체로서 수득하였다 (200 mg, 126 %, 잔류 용매 포함) m / z [M + H] + (533).
단계 2: 화합물 74 의 합성
Figure pct00126
메탄올 : 물 (5.5 mL, 9 : 1 v / v) 중의 실온에서 73 (200 mg)의 교반된 용액에 Oxone (등록 상표) (320 mg)을 첨가하였다. 4.5시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 (4 x 3 mL)에 용해시키고, 황산 마그네슘 칼럼을 통해 여과하고, 디클로로메탄 (2 x 3 mL)으로 세척 하였다. 용리액과 세척액을 합하고 휘발성 물질을 진공에서 제거하여 진한 투명한 오일을 얻었다. 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (1.0 mL, 4 : 1 v / v)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 정제하고, 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 - 벤조산 시약 74를 백색 고체로서 수득하였다 (90 mg, 60 %) m / z [M + H] + (565).
단계 3: 화합물 72 의 합성
무수 DMF (500 μL) 중 val-cit-PAB-MMAE (30 mg)의 교반된 용액에 화합물 73 (11 mg)을 첨가하고 0℃에서 5분 동안 교반하였다. HATU (9.95 mg) 및 NMM (4.26 μL)을 연속적으로 첨가하고, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 0.5시간 후 및 2시간 후에 추가량의 HATU 및 NMM을 첨가하고, 2.0시간 후에 반응 용액을 진공에서 농축시킨 다음 완충액 A (v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여회백색 고체 (15.0 mg, 46 %)로서 mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -Val-cit-PAB- m / z [M + H] + (1671).
실시예 35 : 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 푸란 링커를 포함하는 접합 시약 75의 합성.
Figure pct00127
단계 1: 시약 76 의 합성
Figure pct00128
DMF (3.0 mL) 중의 N, N- 디메틸 메틸렌 이미 다듐 요오다 이드 (407 mg)의 현탁액에 5- 아세틸 퓨란 -2- 카르복실 산 (169 mg)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 125℃로 가열하고 불활성 대기하에 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물 (1.0 mL)의 일부에 mPEG- (7u) -SH (325 mg) 및 Et3N (363 μL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 90분 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (1.0 mL) 중에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 담황색 오일의 비스 -mPEG (7u) - 설파이드 - 프로파노일 - 푸란 -2- 카복실산 시약 76 (119 mg, 36 %)을 수득하였다. 수율은 사용된 초기 반응 혼합물의 1/3 부분을 기준으로 계산됩니다. 1H NMR (400 MHz, DMSO) 2.60-2.70 (4H, m, CH2), 2.80-2.90 (4H, m, CH2), 3.24 (6H, s, OMe), 3.40-3.60 (m, PEG) 3.95 (1H, m, CH), 7.36 (1H, d, Ar-H), 7.69 (1H, d, Ar-H).
단계 2: 시약 77 의 합성
Figure pct00129
76 (30.0 mg)의 메탄올 : 물 (1.0 mL, 9 : 1 v / v) 용액에 Oxone® (62.1 mg, Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 120분 동안 교반하였다. 조 반응 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 (3 x 5.0 mL)에 용해시키고, 황산 마그네슘 칼럼을 통해 여과하고, 디클로로메탄 (2 x 5.0 mL)으로 세척 하였다. 용리액 및 세척액을 합하고 휘발성 물질을 진공에서 제거하여 투명한 무색 오일의 비스 -mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 - 푸란 -2- 카복실산 시약 77 (31.0 mg, 97 %)을 수득하였다. m / z [M + H] + 955.28Da.
3 단계 : 시약 75의 합성
DMF (200 μL) 중의 HATU (51.5 mg) 및 DMF (200 μL) 중의 NMM (15.0 μL)의 저장 용액을 제조 하였다. H2N-PEG (24u) -OMe의 DMF (500μL) 용액에 비스 -mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 - 푸란 -2- 카르복실 산 77 (31.0mg)의 DMF (500μL) 29.5 mg, Iris Biotech). 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다.시간 0분, 10분, 30분에 HATU (40 μL) 및 NMM (40 μL)의분취 량을 첨가하고, 90분에 HATU (80 μL) 및 NMM (80 μL)을 첨가하였다. 120분 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (1.0 mL, 1 : 1 v / v)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색의 오일로서 비스 -mPEG (7u) - 설폰 - 프로파노일 - 푸란 -2 아미드 -PEG (24u) -OMe 시약 75를 수득하였다 (9.6 mg, 18 %). m / z [M + 2H] 2+ 1012.76Da.
실시예 36: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 설파이드 이탈기를 포함하는 접합 시약 ( 78)의 합성.
Figure pct00130
DMF (8.0 mL) 중 1- (4- 하이드 록시 페닐) -3- 토 실 -2- (토실 메틸) 프로판 -1- 온 (400 mg)의 용액에 Et3N (708 μL, Acros Organics) 및 MeO-PEG - (7u) -SH (905 mg, Iris Biotech). 반응물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 48시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (2.0 mL, 1 : 1 v / v) 중에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 79을 투명한 무색 오일 (322 mg, 43 %) m / z [M + H] + 873.49 Da로서 수득하였다.
실시예 37: 7개의 반복 단위 에틸렌 글리콜 설폰 이탈기를 포함하는 접합 시약 79의 합성
Figure pct00131
실온에서 메탄올 : 물 (500 μL, 9 : 1 v / v) 중 화합물 78 (20.0 mg)의 교반된 용액에 Oxone (등록 상표) (42.2 mg, Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 3시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (800 μL, 1 : 1 v / v) 중에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 79을 투명한 무색 오일 (19.5 mg, 91 %) m / z [M + H] + 936.86 Da로서 수득하였다.
실시예 38: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 설폰 이탈기 및 페놀 에스테르 링커를 포함하는 접합 시약 80의 합성
Figure pct00132
단계 1: 화합물 81 의 합성
Figure pct00133
DMF (400 μL) 중 mPEG (24u) -COOH (38.4 mg, Iris Biotech) 용액에 HATU (26.1 mg) 및 DIPEA (12.0 μL)를 첨가하였다. 반응물을 불활성 질소 대기하에 실온에서 5.0분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 DMF (100 μL)에 용해된 화합물 79 (20.0 mg)을 첨가하였다. 반응물을 불활성 질소 대기하에 실온에서 추가로 42시간 동안 교반하였다. 42시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (800 μL)에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 화합물 81을 투명한 무색 오일 (15.4 mg, 34 %) m / z [M + 2H-mPEG (7u) 단편] 2+ 824.34 Da로서 수득하였다.
단계 2; 화합물 80 의 합성
실온에서 화합물 81 (14.0 mg)의 메탄올 : 물 (500 μL, 9 : 1 v / v)의 교반된 용액에 Oxone (등록 상표) (13.1 mg, Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 230분 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (1.0 mL) 중에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 80을 투명한 무색 오일 (12.7 mg, 88 %) m / z [M + 3H] 3+ 679.16 Da로서 수득하였다.
실시예 39 : 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 설폰 이탈기 , 비 방향족 링커 및 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 82의 합성.
Figure pct00134
단계 1: 화합물 83 의 합성
실온에서 메탄올 (50.0 mL) 중의 3- 브로 모 -2- (브로 모 메틸) 프로피온산 (1.32 g, Alfa Aesar)의 교반된 용액에분쇄된 수산화 나트륨 펠릿 (428 mg, Fisher Scientific)을 첨가하였다. 고체가 용해될 때까지 혼합물을 가열 하였다. 벤젠 설 핀산의 나트륨 염 (1.76g, 시그마 알드리치)을 첨가하고, 반응 혼합물을 불활성 질소 대기 하에서 환류시켰다. 4.0시간 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 불활성 질소 대기하에 밤새 교반하였다. 20시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 0.5 M 수산화 나트륨 (30 mL)에 용해시키고, 디에틸 에테르 (3 x 10.0 mL)로 세척 하였다. 수성분획을 37 % 염산으로 산성화시키고 백색 침전물을 수득하였다. 침전물을 부 흐너 (Buchner) 여과로 수집하고, 보유 물을 증류수 (3 x 20.0 mL)로 세척하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 화합물 83을 백색분말로서 수득하였다 (632 mg, 32 %) m / z [M + H ] + 369.08Da; [M + Na] + 391.04 Da.
단계 2: 화합물 84 의 합성
Figure pct00136
실온에서 디메틸 포름 아미드 (2.0 mL) 중 화합물 83 (111 mg)의 교반된 용액에 알파 - 메톡시 - 오메가 - 메르캅토 헵타 (에틸렌 글리콜) (428 mg, 아이리스 바이오 테크) 및 트리 에틸 아민 (251 μL)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 20시간 후, 조 반응 혼합물을 물 (1.0 mL)로 희석하고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 정제시켰다 : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 84를 투명한 무색 오일 (154 mg, 64 %) m / z [M-PEG- (7u)] + 473.05 Da로서 수득하였다.
단계 3: 화합물 85 의 합성
Figure pct00137
실온에서 메탄올 : 물 (1.5 mL, 9 : 1 v / v) 중의 비스 -mPEG (7u) - 설파이드 - 프로판 산 (65.0 mg)의 교반된 용액에 Oxone (등록 상표) (151 mg, Sigma-Aldrich) . 3.0시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (800 μL)에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 85를 투명한 무색 오일 (41.7 mg, 59 %) m / z [M + H] + 860.91 Da로서 수득하였다.
단계 4: 화합물 82 의 합성
DMF (200 μL) 중의 HATU (26.4 mg) 및 DMF (200 μL) 중의 NMM (7.6 μL)의 저장 용액을 제조 하였다. 화합물 83 (12.0 mg)의 DMF (200 μL) 용액을 NH2-Val-Cit-PAB-MMAE (21.5 mg, Concortis)의 DMF (400 μL) 용액에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. HATU (80 μL) 및 NMM (80 μL)의분취 량을 0분 및 40분에 첨가하여 총 2회 첨가하였다. 180분 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 : 아세토 니트릴 (1.0 mL, 1 : 1 v / v)에 용해시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18- / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 시약 82를 백색분말로서 수득하였다 (13.6 mg, 50 %). m / z [M + 2H] 2+ 983.45Da.
실시예 40: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 설폰 이탈기 및 비 - 방향족 링커를 포함하는 접합 시약 ( 86)의 합성
Figure pct00138
단계 1: 화합물 87 의 합성
Figure pct00139
실온에서 톨루엔 (250 μL) 중 화합물 84 (15.0 mg)의 교반된 용액에 mPEG- (23u) -OH (19.7 mg, Iris Biotech), 트리 페닐 포스 핀 (5.43 mg, 시그마 알드리치) 및 아조 디카 르 복실 산디이소프로필 μL, 시그마 알드리치). 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 30분 후, 추가의 트리 페닐 포스 핀 (5.43 mg, 시그마 알드리치) 및 디아이소프로필 아조 다이 카복실 레이트 (4.10 μL, 시그마 알드리치)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 1.0시간 후, 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (700 μL)에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색 왁스 (18.5 mg, 54 %) m / z [M-PEG- (7u)] + 750.19 Da로서 화합물 87을 수득하였다.
단계 2 : 화합물 86의 합성.
실온에서 메탄올 : 물 (1.0 mL, 9 : 1 v / v) 중 화합물 87 (14.5 mg)의 교반된 용액에 Oxone (등록 상표) (14.7 mg, Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 3.0시간 후, 반응 혼합물을 면직물 (1.5 cm 플러그)을 통해 여과 하였다. 조 생성물을 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. ~ 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 86을 투명한 무색 왁스 (7.1 mg, 47 %) m / z [M + 3H] 3+ 629.91 Da로서 수득하였다.
실시예 41: 7개의 반복 단위 에틸렌 글리콜 설폰 이탈기 및 폴리 에틸렌 글 리콜 스페이서를 포함하는 2 작용 성 접합 시약 88의 합성.
Figure pct00140
DMF (2.0 mL) 중의 HATU (448 mg) 및 DMF (2.0 mL) 중의 NMM (129 μL)의 저장 용액을 제조 하였다. 아미노 - PEG- (11u) - 아민 (64.1 mg, Iris Biotech)의 DMF (500 μL) 용액을 4- [2,2- 비스 [α-methoxy-omega- 설포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산 (250 mg)을 수득하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다.시간 0분에 HATU (800 μL) 및 NMM (800 μL)의분취 량을 첨가하고 50분에 HATU (200 μL) 및 NMM (200 μL)의분취 량을 첨가하여 총 2회 첨가하였다. 2.0시간 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 물 (1.0 mL) 중에 용해시키고 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 (98 : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 무색 투명한 오일 (200 mg, 69 %)로서 시약 88을 수득하였다. m / z [M + H] 2+ 1219.5Da [M + 2H] 3+ 813.35Da, [M + 3H] 4+ 610.28Da.
실시예 42: 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 설폰 이탈기 및 설폰산 측쇄를 포함하는 접합 시약 89의 합성
Figure pct00141
디메틸 포름 아미드 (500 μL) 중의 3- (N- (3- 설포 프로필) -4- (3- 토실 -2- (토 실 메틸) 프로파노일) 벤즈 아미도) 프로판 산 (Click Chemistry Tools LLC, 20.0 mg) 실온에서 알파 메톡시 - 오메가 - 메르캅토 헵타 (에틸렌 글리콜) (30.2 ㎎, Iris Biotech) 및 트리 에틸 아민 (23.6 ㎕)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 3.5시간 후, 조 중간 생성물을 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 % : 2 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하였다.
생성된 투명한 무색 잔류물을 메탄올 : 물 (750 μL, 9 : 1 v / v)에 용해시키고 용액을 Oxone (52.1 mg, Sigma-Aldrich)에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 불활성 질소 대기하에 교반하였다. 4.5시간 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (98 : 2)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제하였다. v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 89를 투명한 무색 오일 (4.71 mg, 14 %) m / z [M + H] 2+ 579.67 Da, [M + H2O] 2 + 588.17Da.
실시예 43 : 접합 시약 63, 68 및 70을 사용하여 환원된 Fab 다이 설파이드 결합에서 PEG 화.
파파인 소화에 의해 생성된 트라스트 주맙의 Fab에 1 M DTT 스톡 용액 (25 μL, 최종 농도 10 mM)을 첨가하고, 환원 혼합물을 볼텍스를 사용하여 간단히 혼합하고 22℃에서 1시간 동안 배양 하였다. 20 mM 인산 나트륨 완충액 pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA로 평형화된 PD10 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 환원제를 제거하였다. 환원된 Fab를 동일한 완충액으로 1.2 mg / mL로 추가 희석하였다. 시약 63, 68 및 70을 독립적으로 0.719 mM의 아세토 니트릴에 용해시키고, 환원된 Fab 용액 (Fab 당 1.5 당 시약)에 첨가하였다. PEG 화 반응을 22℃에서 진행시키고, 22시간 후에 HIC HPLC분석을 위해 샘플을 취 하였다. 각 반응 혼합물의 HIC HPLC분석은 시약 63, 68 및 70에 대한 PEG 화 Fab 로의 전환율이 각각 95 %, 90 % 및 90 %임을 나타냈다.
실시예 44 : 부분적으로 감소된 트라 스투 주맙에 대한 시약 72의 컨쥬 게이션 .
20 mM 인산 나트륨, pH 7.5 (20 mM EDTA, 150 mM NaCl) 중 Trastuzumab (3.5 mg, 5.2 mg / mL)을 40℃에서 15분간 가온시켰다. trastuzumab에 2.08 mM TCEP (28 μL)를 첨가하고 생성된 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 배양했다. 1시간 후, TCEP 처리된 trastuzumab은 22℃로 냉각되었다. 트 라스트 주맙 용액 (3.2mg, 0.64mL, 5.0mg / mL)의 일부를 20mM 인산 나트륨, pH 7.5 (20mM EDTA, 150mM NaCl) (0.12mL)로 희석시켰다. 3개의 바이알에 희석된 단클론 항체 용액 (1 mg, 238 μL)을 넣었다. 시약 72 용액 (3.2 mM)을 DMF에서 제조 하였다. 시약 용액 (12.5 μL, mAb 당 6.0 eq)을 별도의 바이알에 넣고 반응물을 혼합 한 다음 22℃에서 배양했다. 22시간 후, 반응 샘플을 HIC분석 전에 N- 아세틸 -L- 시스테인 (20 당량의 시약)으로 켄칭시켰다. HIC HPLC분석은 시약 72와 컨쥬 게이트된 Trastuzumab의 평균 DAR이 4.5임을 보여 주었다.
실시예 45 : 시약 82 및 86을 트라스트 주브 ( trastuzumab )에 컨쥬 게이트시켰다 .
두 시약 82와 86을 동일한 프로토콜을 사용하여 항체 트라 스투 주맙에 접합시켰다. 간단히 말해, 완충액 (20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 8.4) 중 트라 스투 주맙 (5.2 mg / mL)을 TCEP (6 당량)로 40℃에서 1시간 동안 환원시켰다. 이어서, 인터 체인 사슬 디설파이드 결합 당 1.5 몰 당량의 시약 82 또는 86과 항체의 컨쥬 게이션을 40℃에서 수행 하였다. 이는 아세토 니트릴 (각 반응에서 5 % v / v 아세토 니트릴) 중 시약 82 또는 시약 86을 첨가함으로써 달성되었다. 항체 용액을 20 mM 인산 나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, pH 8.4로 4.0 mg / mL로 희석하였다. 각 용액을 부드럽게 섞어서 40℃에서 22시간 동안 배양했다. 22시간 후, 반응물을 N- 아세틸 -L- 시스테인 (20 당량의 시약)으로 22℃에서 1시간 동안 처리 하였다. 이어서, 반응을분석 용 HIC로분석 하였다. 시약 82 및 86을 사용하는 생성물로의 전환율은 HIC 크로마토 그램으로부터 280 nm에서 측정된 흡광도 피크의 면적 %에 기초하여 결정되었다. 시약 82 및 86의 경우, 생성물 값에 대한 % 전환율은 각각 100 % 및 50 %였다.
실시예 46 : 접합 시약 75, 79 및 80 및 시약 89를 사용하여 감소된 Fab 다이 설파이드 결합에서 PEG 화.
시약 75, 79, 80 및 89를 실시예 43 내의 접합 시약 63, 68 및 70에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 Fabtrast에 접합시켰다. 22시간의 접합 반응 후, 샘플을 환원 및 비 환원하에 SDS-PAGE로분석 하였다 정황. 인스턴트 블루 (PEG)로 염색된 겔을 사용하여 ImageQuant ™ LAS 4010 시스템 (GE 헬스 케어)을 사용하여 밴드 밀도 측정으로부터 각각의 시약과 PEG 화 Fabtrast의 % 전환율을 평가 하였다. 시약 75, 79, 80 및 89의 경우, 전환율 %는 각각 90 %, 20 %, 75 % 및 40 %였다.
실시예 47 : 각각 3 또는 5 반복 단위 중합체 에틸렌 글리콜 이탈기 및 아우리스타틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 90 (비교) 및 91 (비교)의 합성
Figure pct00142
Figure pct00143
Auristatin 시약 인 bis-mPEG (3u) sulfone-propanoyl-benzamide-val-cit-PAB-MMAE 90과 bis-mPEG (5u) sulfone-propanoyl-benzamide-val-cit-PAB-MMAE 91을 - 메톡시 - 오메가 대신에 각각 2- [2- (2- 메톡시에톡시)에톡시] - 에탄 티올 및 2,5,8,11,14- 펜타 옥사 헥사데칸 -16- 티올을 사용하여, 실시예 4의 시약 5에 대해 기술된 - 메르캅토 헵타 (에틸렌 글리콜)를 사용하여 실시예 1의 화합물 1을 합성하였다.
실시예 48 : 단일 7 반복 단위 에틸렌 글리콜 이탈기 및 24 단위 PEG를 포함하는 PEG 화 시약 92의 합성.
Figure pct00144
Nature Protocols (2006, 1, 2241)에 따라 모노 -mPEG (7u) 설폰 - (메틸 - 아크릴로 일) - 벤즈아미드 -L-Glu- [OH] - [PEG (24u) -2252)으로부터 실시예 10의 화합물 23을 사용하였다.
실시예 49 : 중합체 성 에틸렌 글리콜 이탈기를 갖는 세포 독성 시약 90 (비교), 91 (비교) 및 5의 항체 접합의 비교.
DMF 대신에 접합 반응에서 용매로서 1.25 % v / v MeCN을 사용하여, 세포 독성 시약 90, 91 및 5를 트라스트 주맙 (1 mg 스케일)과 접합 시키는데 사용된 반응 조건은 실시예 20에서 상기 한 것과 동일 하였다. 반응 용액의분취 액을 2 및 4시간 후에 취하고 각각을 N- 아세틸 -L- 시스테인으로 처리하여 켄칭시켰다. 각분취 량을 HIC로분석하고 % DAR 생성물 프로파일을 결정 하였다. 시약 90, 91 및 5와의 접합 결과를 표 3 및도 10 (2시간) 및 11 (4시간)에 나타내었다. 본 발명에 따른 시약을 사용할 때 얻어진 결과는 비교 시약을 사용하여 얻은 결과에 비해 현저하게 향상되는데, 이는 생성물의 균질성이 훨씬 더 높다는 것이고, 생성물은 주로 목적하는 DAR4 컨쥬 게이트(접합체)이다.
표 3 : 2시간 및 4시간 반응 후 항체에 대한 시약 90, 91 및 5의 접합의 비교.
항체에 접합용으로 사용된 시약 2시간 후, % DAR 생성 4시간 후, % DAR 생성
0 1 2 3 4 >4 0 1 2 3 4 >4
90 8.3 14.4 13.9 26.0 33.5 4.0 5.2 8.9 10.8 22.6 48.0 4.6
91 7.9 13.3 12.7 25.8 35.5 4.8 4.7 8.6 9.7 23.2 48.5 5.4
5 6.3 4.0 4.8 10.2 60.0 14.7 0.0 2.6 4.2 11.6 72.8 8.8
실시예 50 : 시약 92를 사용하여 환원된 Fab 다이 설파이드 결합에서의 PEG 화.
시약 92를 실시예 17에 기재된 것과 동일한 조건을 사용하여 환원된 Fab에 접합시켰다.이어서, 반응을 SDS-PAGE로분석하고 주요 생성물 인 PEG 화 Fab를분자량 단백질 표준에 대해 49 kDa에서 관찰 하였다.
실시예 51 : 아우리스타틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 93의 합성
Figure pct00145
단계 1: 화합물 94 의 합성
Figure pct00146
Boc-L-Glu (135 mg) 및 (벤조트리아졸 -1- 일옥시) 트리스 - (디메틸 아미노) 포스 포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP) (724 mg)를 무수 DMF (4 mL)에 용해시키고, 0℃에서 질소 1.25시간 동안 대기. 이 용액을 DMF (3 mL) 중 H2N-PEG (12u) -Me (685 mg) 및 NMM (180 μL)의 용액에 첨가하였다. 그 다음, 용액을 N2하에 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, 용액을 0-4℃에서 질소 대기하에 4.5시간 동안 교반하였다. 추가 BOP (241 mg) 및 NMM (60 μL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 4시간 동안 24시간 동안 방치 하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v)로 용리하면서 용리되는 역상 C18- 플래시 크로마토 그래피로 정제하였다 : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (100 : 0 v / v 내지 65:35 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하였다. 상기 물질을 에틸 아세테이트 : 메탄올 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v)로 용출시키는 순상 플래쉬 크로마토 그래피로 재 정제하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 Boc-Glu- [PEG (12u) -Me] 2 화합물 94를 무색의 오일 (450mg)로 수득하였다. m / z [M + H] + (1331, 100 %), [M + 2H] 2+ (665, 100 %).
단계 2: 화합물 95 의 합성
Figure pct00147
화합물 94 (450mg)를 DCM (25mL)에 용해시키고, 여기에 TFA (2.5mL)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 그 후, 휘발 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 잔류물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 60:40 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 투명한 무색 검 (320mg)으로서 Glu- [HN-PEG (12u) -Me] 2TFA 화합물 95를 얻었다. m / z [M + Na] 1+ (1253.0, 10 %) [M + H] 2+ (616.8, 100 %).
단계 3: 화합물 96 의 합성
Figure pct00148
무수 DMF (2 mL) 중 Fmoc-L-Glu- (OtBu) -OH (36 mg)의 교반된 용액에 HATU (37 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기하에 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, DMF (1 mL) 중 화합물 95 (103.5 mg) 및 NMM (19 μL)의 용액에 첨가하였다. 추가의 DMF (1 mL)를 첨가하였다. 교반된 반응물을 5시간에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하였다. 생성된 담황색 오일을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (0.1 % 포름산)으로 용출시키는 역상 C18- 100 : 0 v / v 내지 50:50 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 백색 페이스트로서 Fmoc-L-Glu- (OtBu) -Glu- [HN-PEG (12u) -Me] 2 화합물 96 (173mg) . m / z [M + 1] + (1638, 100 %) 및 [M + Na] + (1660, 57 %).
단계 4: 화합물 97 의 합성
Figure pct00149
무수 DMF (3.2 mL) 중의 화합물 96 (173 mg)의 교반된 용액에 피페리딘 (104 μL)을 첨가하였다. 용액을 아르곤하에 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하고, 잔류물을 헥산으로 반복적으로분쇄 하였다. 생성물을 진공하에 건조시켜 투명한 무색의 오일로서 L-Glu- (OtBu) -L-Glu- [HN-PEG (12u) -Me] 2 화합물 97 (152mg)을 수득하였다. [M + H] 1+ (1416.7, 85 %), [M + 2H] 2+ (708.5, 100 %), [M + Na] 1+ (1438.7, 30 %).
단계 5: 화합물 98 의 합성
Figure pct00150
무수 DMF (3 mL) 중 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 술 포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산 (114 mg)의 교반된 용액에 HATU (51 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반한 후, L-Glu (OtBu) -Glu- [HN-PEG (12u) -OMe] 2의 용액에 첨가하였다. (152 ㎎)의 DMF (2 ㎖) 용액에 첨가하고, 추가 DMF (1 ㎖),이어서 NMM (15 ㎕)로 세척 하였다. 반응 혼합물을 0-15℃에서 3.5시간 동안 교반한 후, 휘발 물질을 진공에서 제거하였다. 생성된 잔류물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (100 : 0 v / v 내지 55:45 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 Bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- (OtBu) -Glu- [HN-PEG (12u) -Me] 2 화합물 98 (161 mg)을 무색 투명한 오일로서 수득하였다. m / z [M + H] 1+ (2366.7, 100 %), [M + 2H] 2+ (1184.0, 80 %) [M + H2O] 3+ (795.5,100 %).
단계 6: 화합물 99 의 합성
Figure pct00151
무수 DCM (6 mL) 중 화합물 98 (58 mg)의 교반된 용액에 TFA (6 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 휘발 물질을 진공에서 제거하고 물 (25 mL)에 용해시키고 동결 건조시켜 Bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- (OH) -Glu- [HN-PEG (12u) - OMe] 2 화합물 99 (160.6mg)를 무색 투명한 오일로서 수득하였다. m / z [M + H] 1+ (2306.8, 90 %), [M + 2H] 2+ (1153.0, 100 %).
단계 7: 시약 93 의 합성
시약 93은 화합물 99 및 val-cit-PAB-MMAE TFA 염으로부터 실시예 11A의 시약 24와 유사한 방식으로 합성하였다. Bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -L-Glu- (val-cit-PAB-MMAE) -Glu- [HN-PEG (12u) -Me] 2 93을 무색 오일 (69 % . [M + 2H] 2+ (1706.2, 60 %), [M + 3H] 3+ (1137.2, 85 %), [M + H] 1+ (3410.4, 90 % 4+ (852.8, 70 %).
실시예 21에 기술된 바와 같이 16시간 동안 Brentuximab과 접합 시약 93의 컨쥬 게이션을 수행 하였다.분석 HIC의 결과는 DAR4 생성물로의 전환율이 67 %임을 보여줍니다.
실시예 52 : 아우리스타틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 100의 합성
Figure pct00152
시약 100은 화합물 23 대신에 화합물 20B 및 val-cit-AHX-DM1 대신에 val-cit-PAB-MMAE TFA 염을 사용하여 실시예 11A의 시약 24와 유사한 방식으로 합성하였다.
Figure pct00153
H2N-PEG (24u) 대신 H2N-PEG (12u) - 트리 (m-dPEG (24u))를 사용하여 실시예 10의 화합물 23과 유사한 방식으로 화합물 20B를 제조 하였다 .Bis-mPEG (7u) 설폰 - 벤즈아미드 -L-Glu- [val-cit-PAB-MMAE] - [PEG (12u) -tri (m-dPEG (24u))] 100을 무색 오일로서 단리시켰다 .m / z [M + 2H] 2+ (3166, 20 %), [M + 3H] 3+ (2111, 50 %), [M + 4H] 4+ (1583, 100 %)
접합 시약 100을 이용한 브 ux티시 맙의 접합은 실시예 21에 기술된 바와 같이 16시간 동안 수행되었다.분석적인 HIC 결과는 DAR4 생성물로의 전환율이 65 %임을 보여줍니다.
실시예 53 : 2 종의 아우리스타틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 101의 합성
Figure pct00154
단계 1: 화합물 102 의 합성
Figure pct00155
무수 DMF (18 mL) 중 Fmoc-L-Glu- (OtBu) -OH (2 g)의 교반된 용액에 HOBt (666 mg) 및 DIC (768 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. H-L-Glu- (OtBu) -OH (1.19 g) 및 DIPEA (2.46 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)로 희석시키고 묽은 HCl을 첨가하여 pH 2.0으로 산성화시켰다. 수성층을 EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하고, 유기상을 합하고 물 (2 x 50 mL) 및 포화 염수 용액 (1 x 50 mL)으로 세척 하였다. EtOAc 층을 Na2SO4상에서 2시간 동안 건조시킨 후회전 증발기상에서 농축시켰다. 생성물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (100 : 0)으로 용출시키는 역상 C18- v / v 내지 80:20 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조시켜 제거하여 화합물 Fmoc-L-Glu- (OtBu) -L-Glu- (OtBu) -OH 102 (875 mg)을 백색 고체로서 수득하였다. [M + Na] 1+ (633.1, 55 %), [2M + Na] + (1243.2, 55 %).
단계 2: 화합물 103 의 합성
Figure pct00156
무수 DMF (5 mL) 중 Fmoc-L-Glu- (OtBu) -L-Glu- (OtBu) -OH (510 mg) 및 NH2-PEG (24u) -OMe (1 g)의 교반된 용액에 및 N, N- 디이소프로필 에틸 아민 (44 μL) 및 HATU (48 mg). 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안,이어서 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용액을 2 mL의 진공에서 농축시키고, 잔류물을 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 및 완충액 B (v / v)로 용출시키는 역상 C18- 플래시 크로마토 그래피에 의해 정제시켰다 : 아세토 니트릴 : 0.1 % 포름산 (100 : 0 v / v 내지 83:17 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 백색 페이스트로서 Fmoc-Glu- (OtBu) -Glu- (OtBu) -PEG (24u) -OMe 화합물 103 644 mg)을 수득하였다. [M + Na] 1+ (1704.0, 30 %) 및 [M + 2H] 2+ (841.4, 55 %).
단계 3: 화합물 104 의 합성
Figure pct00157
무수 DMF (900 ㎕) 중 Fmoc-Glu- (OtBu) -Glu- (OtBu) -PEG (24u) -OMe (193 mg)의 교반된 용액에 피페리딘 (34 ㎕)을 첨가하고, h에서 실온으로 냉각시켰다. 용액을 진공하에 농축 건조시키고, 잔류물을 Et2O (2 x 2.5 mL)로분쇄 하였다. 생성물을 진공하에 건조시켜회백색 고체로서 H-L-Glu- (OtBu) -Glu- (OtBu) -PEG (24u) -OMe 화합물 104 (166 mg)을 수득하였다.
단계 4: 화합물 105 의 합성
Figure pct00158
시약 105를 화합물 104 및 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 술 포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산으로부터 실시예 10의 화합물 23과 유사한 방식으로 합성하였다. Bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -Glu- (OtBu) -Glu- (OtBu) -PEG (24u) -OMe105를 무색의 오일로서 단리 하였다. m / z [M + H] 1+ (2407.2, 25 %), [M + Na] 1+ (2429.4, 70 %).
단계 5: 화합물 106 의 합성
Figure pct00159
Bis-mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 -Glu- (OH) -Glu- (OH) -PEG (24u) -OMe 106을분리 하였다. 시약 106을 화합물 105로부터 실시예 10의 시약 23과 유사한 방식으로 합성하였다. 무색 오일로서 수득하였다. [M + Na] 1+ (2317.4, 10 %) 및 [M + 2Na] 2+ (1217.4, 100 %).
단계 6: 시약 101의 합성.
무수 DMF (1.5 mL) 중의 화합물 106 (28 mg), val-cit-PAB-MMAE TFA 염 (31 mg) 및 HATU (14 mg)의 교반된 용액에 N- 메틸 모르 폴린 (7 μL)을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 5시간 동안 교반하였다. 용액을 물 (1 mL)로 희석하고, 완충액 A (v / v) : 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.1 % TFA 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.1로 용출시키는 역상 C18- 플래시 크로마토 그래피 % TFA (100 : 0 v / v 내지 60:40 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 비스 -mPEG (7u) 설폰 - 프로파노일 - 벤즈아미드 - 비스 - [Glu- (val-cit-PAB-MMAE)] -PEG (24u) - OMe 화합물 101 (36 mg)을 백색 고체로서 수득하였다. m / z [M + 2H] 2+ (2252.7, 20 %), [M + 3H] 3+ (1501.6.7, 40 %) 및 [M + 4H] 4+ (1126.6,100 %).
실시예 21에 기술된 바와 같이, Brentuximab과 접합 시약 (101)의 컨쥬 게이션을 16시간 동안 수행 하였다.분석적인 HIC 결과는 DAR4 생성물로의 전환율이 56 %임을 보여준다.
실시예 54 : 2 종의 아우리스타 틴 세포 독성 페이로드를 포함하는 접합 시약 107의 합성.
Figure pct00160
단계 1: 화합물 108 의 합성
Figure pct00161
무수 DMF (6 mL) 중 Boc-L-Glu (OH) -OH (51.6 mg)의 교반된 용액에 BOP (277 mg)를 첨가하였다. 용액을 0℃에서 20분 동안 교반한 후 MeO-PEG (24) -NH2 (500mg)를 첨가한 후 NMM (69㎕)을 첨가하였다. 4시간 후, 추가량의 BOP (92 mg) 및 NMM (23 μL)을 첨가하였다. 추가로 2.5시간 후, 반응 혼합물을 18시간 동안 -20℃에서 저장 한 후, 진공에서 농축시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출시키는 역상 컬럼 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다 산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 백색 고체 (373 mg)를 수득하였다. 포름산 (6 mL)을 고체에 첨가하고 생성된 혼합물을 불활성 대기하에 60분 동안 교반한 후에 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 95 % 물 : 5 % 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (약 6 mL)에 용해시키고 밤새 동결 건조시켜 TFA ㆍ H2N-Glu (PEG (24) -OMe) -PEG (24) -OMe, 화합물 108 ,회백색 고체 (330 mg)로서 수득하였다. m / z [M + 2H] 2+ (1144, 5 %), [M + 3H] 3+ (763,35 %), [M + 4H] + (573,100 %).
단계 2: 화합물 109 의 합성
Figure pct00162
0℃에서 무수 DMF (18 mL) 중 Fmoc-Glu (OtBu) -OH (2 g)의 교반된 용액에 HOBt (666 mg) 및 DIC (768 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 2시간 후, Glu (OtBu) -OH (1.19 g) 및 DIPEA (2.46 mL)를 첨가하였다. 20시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴로 용출시키는 역상 컬럼 C18-컬럼크로마토그래피 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v) 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 Fmoc- (L-Glu (OtBu)) 2-OH, 화합물 109를 백색 고체 (1.03 g)로서 수득하였다. [M-tBu + H] + (554, 65 %), [M-2tBu + H (621) ] + (499, 100 %).
단계 4: 화합물 110 의 합성
Figure pct00163
무수 DMF (10 mL) 중 화합물 108 (330 mg)의 교반된 용액에 화합물 109 (100 mg)을 첨가하였다. 0℃에서, HATU (156mg) 및 NMM (45μL)을 첨가하고, 생성된 용액을 5분 동안 교반한 후 NMM (3㎕) 및 HATU (11mg)를 추가로 첨가하였다. 반응 용액을 추가로 20분 동안 교반한 후 실온으로 가온시킨 후, 교반을 추가로 4시간 동안 계속 하였다. 이시간 후, 추가 양의 HATU (51 mg) 및 NMM (15 μL)을 첨가하였다. 추가 1.5시간 후, 혼합물을 -20℃에서 18시간 동안 저장 한 후, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v)로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 Fmoc- (L-Glu (OtBu)) 2-L-Glu (PEG (24) -OMe) -PEG (24) (193mg)을 백색 고체로서 수득하였다. [M-tBu + 4H] 4+ (707, 100 %), [M-2tBu + 4H] 4+ (693, 85 % M + 5H] 5+ (577, 75 %).
단계 5: 화합물 111 의 합성
Figure pct00164
무수 DMF (1.5 mL) 중 111 (193 mg)의 교반된 용액에 피페리딘 (20 μL)을 첨가하였다. 90분 후, 추가량의 피페리딘 (13 ㎕)을 첨가하고 반응물을 추가 90분 동안 교반한 후, -20℃에서 18시간 동안 저장 하였다. 용매를 고 진공하에 제거하고, 생성된 잔류물을 헥산에서분쇄 하였다. 잔류물을 고 진공하에 30분 동안 추가로 건조시킨 후 완충액 A : 완충액 B (2 mL, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v))의 50:50 혼합물에 용해시켰다. TFA · H2N- (L-Glu (OtBu)) 2-L-Glu (PEG (24) -OMe) -PEG (24) -OMe, 화합물 111 (아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산) , 담황색 고체 (186 mg)로서 수득하였다. m / z [M + 3H] 3+ (887, 20 %), [M + 4H] 4+ (666,100 %), [M + 5H] 5+ (533, 30 %).
단계 6: 화합물 112 의 합성
Figure pct00165
무수 DMF (1.5 mL) 중의 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 술 포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산 (71 mg)의 교반된 용액을 HATU (28 mg) . 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기 하에서 30분 동안 교반하였다. 111 (186 mg)의 무수 DMF (2.5 mL) 용액을 첨가한 후, HATU (22.9 mg) 및 NMM (14.7 μL)을 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온시켰다.
3시간 후, 추가량의 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 설포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산 (18 mg), HATU (50.8 mg) 및 NMM (15 μL) 덧붙였다. 추가 1.5시간 후, 추가량의 4- [2,2- 비스 [α- 메톡시 -ω- 설포닐 헵타 (에틸렌 글리콜)] 아세틸] 벤조산 (9mg), HATU (51mg) 및 NMM )를 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가의 8시간 동안 교반하고, 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 %로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 2회 정제하였다. 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v 내지 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 화합물 (112)을 연 황색 오일로서 수득하였다 (정량적이라고 가정). [M-2Bu + 4H] 4+ (874,45 %), [M-2TBu + 4H] 4+ (902,60 % M-tBu + 5H] 5+ (711, 100 %).
단계 7: 화합물 113 의 합성
Figure pct00166
포름산 (2 mL)을 불활성 대기하에 112에 첨가하였다. 반응 혼합물을 60분 동안 교반한 후 진공에서 농축시켰다. 상기 물질을 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. ~ 0 : 100 v / v).
유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조시켜 113의 무색 오일 (28.1 mg)을 수득하였다. m / z [M + 3H] 3+ (1165, 5 %), [M + 4H] 4+ (874, 65 %), [M + 5H] 5+ (699,100 %).
단계 8: 시약 107 의 합성
무수 DMF (270 μL) 중의 화합물 113 (15 mg)의 교반된 용액에 HATU (4 mg)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기 하에서 20분 동안 교반하였다. 무수 DMF (300 μL) 중의 val-Cit-PAB-MMAE (12 mg)의 용액을 첨가한 다음, HATU (2.5 mg) 및 NMM (2 μL)을 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 4시간 20분 후, 추가량의 HATU (3.3 mg) 및 NMM (0.9 μL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -20℃에서 18시간 동안 저장하기 전에 2시간 더 교반하였다. RT로 가온되면, HATU (3.3 mg) 및 NMM (0.9 μL)을 교반된 용액에 첨가하였다. 4.5시간 후 추가 양의 HATU (1.6 mg)와 NMM (0.5 μL)을 첨가하고 반응물을 추가로 2.5시간 교반한 후 -20℃에서 18시간 동안 보관 하였다. 상기 물질을 완충액 A (v / v) : 물 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 및 완충액 B (v / v) : 아세토 니트릴 : 0.05 % 트리 플루오로 아세트산 (100 : 0 v / v)으로 용출시키는 역상 C18-컬럼크로마토그래피로 정제하였다. ~ 0 : 100 v / v). 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 용매를 동결 건조에 의해 제거하여 107을 백색 고체 (13.8 mg)로서 수득하였다. [M + 4H] 4+ (1426, 5 %), [M + 5H] 5+ (1141, 70 %), [M + 6H] 6+ (951,100 %), [M + 7+ (815, 20 %).
실시예 21에 기술된 바와 같이 17시간 동안 Brentuximab과 접합 시약 (107)의 컨쥬 게이션을 수행 하였다.분석적인 HIC의 결과는 DAR4 생성물로의 전환율이 61 %임을 보여준다.

Claims (22)

  1. 펩티드 또는 단백질에 존재하는 최소한 하나 이상의 친핵체와 반응할 수 있는 접합 시약(conjugating reagent)이되,
    상기 시약은 상기 친핵체와 반응 중에 잃는 최소한 하나의 이탈기(leaving group)를 포함하고, 상기 이탈기는 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하고, 여기서 n은 6 이상의 수인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  2. 제1항에 있어서,
    n은 6 내지 9인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 -(CH2CH2O)n- 부분은 최대 5kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이탈기는 -SP, -OP, -SO2P, -OSO2P, -N+PR2R3 이거나, 또는 -S-P-S-, -O-P-O-, -SO2-P-SO2-, -OSO2-P-OSO2-, 또는 -N+R2R3-P-N+R2R3- 의 작용기이되, 여기서 상기 P는 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하고, 각각의 R2 및 R3는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-4알킬기 또는 P인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  5. 제4항에 있어서,
    상기 이탈기는 -SO2P인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이탈기는 -(CH2CH2O)n-R1을 포함하고, 여기서 R1은 캡핑기(capping group)인 것을 특징으로 하거나; 또는
    상기 -(CH2CH2O)n- 기는 상기 시약에서 두 부분의 부착점(attachment)을 가지는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이탈기는 -S-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-S-, -O-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-O-, -SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-, -OSO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-OSO2-, 또는 -N+R2R3-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-N+R2R3-이거나, 또는 하기 화학식 작용기 중 하나인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent):
    Figure pct00167
    ,
    Figure pct00168
    ,
    Figure pct00169
    ,
    Figure pct00170
    , 또는
    Figure pct00171

    (여기서, 상기 R1은 캡핑기(capping group)이고, 각각의 R2 및 R3는 독립적으로 수소 원자 또는 C1-4알킬기이다).
  8. 제7항에 있어서,
    상기 이탈기(leaving group)는 -SO2-(CH2CH2O)n-(CH2CH2)-SO2-인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 R1은 수소 원자, C1- 4알킬기, 선택적으로 치환된 아릴기, 또는 -CH2CH2CO2H 또는 -CH2CH2NH2의 작용기인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약은 진단, 치료 또는 표지 제제 또는 진단, 치료 또는 표지 제제용 결합제인 페이로드를 운반하는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent):
    [화학식 1]
    Figure pct00172

    (상기 화학식 1에서,
    하나의 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고; 및 다른 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상인 이탈기이거나 또는 또 다른 구조의 이탈기이다)
    [화학식 2]
    Figure pct00173

    (상기 화학식 2에서,
    하나의 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이다)
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약은 하기 (I), (I'), (II) 또는 (III) 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent):
    Figure pct00174

    상기 (I)에서,
    W는 전자 구인성 작용기(electron-withdrawing group)이고;
    A는 C1-5 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고;
    B는 단일결합 또는 C1-4 알킬렌 또는 알케닐렌 사슬이고;
    하나의 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고, 다른 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상인 이탈기이거나 또는 또 다른 구조의 이탈기이거나, 또는 두개의 L은 함께 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고;

    Figure pct00175

    상기 (I')에서,
    W 및 A는 상기 (I)에서 정의한 바와 같고, m은 0 내지 4이고, 및 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고;

    ~W-CR4R4 '-CR4.L.L' (II)
    상기 (II)에서,
    W는 상기 (I)에서 정의한 바와 같고,
    (i) 각각의 R4는 수소 원자 또는 C1- 4알킬기이고, R4'는 수소 원자이고 및 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고, L'는 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상인 이탈기이거나 또는 또 다른 구조의 이탈기이거나, 또는 L 및 L'는 함께 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고; 또는
    (ii) 각각의 R4는 수소 원자 또는 C1- 4알킬기이고, L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이고, R4'와 L'는 함께 단일결합을 나타내고; 및

    ~ W- (CH = CH) p- (CH2) 2-L (III)
    상기 (III)에서,
    W는 상기 (I)에서 정의한 바와 같고,
    p는 0 또는 1 내지 4의 정수이고, 및 L은 -(CH2CH2O)n- 부분을 포함하는 이탈기이되, 상기 n은 6 이상이다.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 시약은 하기 화학식을 가지는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent):
    Figure pct00176

    , D-Q-W-CR2R2'-CR2.L.L' (IIa), 또는 D-Q-(CH=CH)p-(CH2)2-L (IIIa)
    (상기 화학식 (Ic), (Ic'), (IIa) 또는 (IIIa)에서,
    Q는 연결기를 나타내고, D는 진단, 치료 또는 표지 제제 또는 진단, 치료 또는 표지 제제용 결합제인 페이로드이다).
  14. 제12항에 있어서,
    상기 시약은 하기 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent):
    Figure pct00177
    ,
    Figure pct00178
    , 또는
    ~NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIa)
    (상기 (Ib), (Ib'), 또는 (IIIa)에서,
    Ar은 페닐기를 나타낸다).
  15. 제14항에 있어서,
    상기 시약은 하기 화학식을 가지는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent):
    Figure pct00179
    ,
    Figure pct00180
    , 또는
    D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH2)2-L (IIIb)
    (상기 (Ie), (Ie'), 또는 (IIIb)에서,
    Q는 연결기이고, D는 진단, 치료 또는 표지 제제 또는 진단, 치료 또는 표지 제제용 결합제인 페이로드(payload)이다).
  16. 제13항 또는 제15항에 있어서,
    상기 D-Q는 약물, 폴리머, 또는 약물 및 폴리머 둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  17. 제16항에 있어서,
    상기 약물이 존재하는 경우, 약물은 세포독성 약물이고,
    상기 폴리머가 존재하는 경우, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  18. 펩티드 또는 단백질에 존재하는 두개의 친핵체와 반응할 수 있는 접합 시약(conjugating reagent)이되,
    상기 시약은 상기 친핵체와 반응 중에 잃는 이탈기(leaving group)를 포함하고, 상기 이탈기는 상기 접합 시약내에 두 부착점을 가지고, 상기 이탈기는 -(CH2CH2O)n1- 부분을 포함하고, 여기서 n1은 2 이상의 수인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  19. 제18항에 있어서,
    상기 n1은 5 내지 9인 것을 특징으로 하는 접합 시약(conjugating reagent).
  20. 펩티드 또는 단백질을 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 접합 시약(conjugating reagent)과 반응시키는 단계를 포함하는 펩티드 또는 단백질의 접합 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 단백질은 수용체(receptor), 리간드 결합 단백질, 항체, 또는 항체 단편(fragment)인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 단백질의 접합 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 따른 접합 방법으로 제조되는 단백질 또는 펩티드 접합체.
KR1020177008924A 2014-10-14 2015-10-08 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법 KR20170071485A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237038415A KR20230158134A (ko) 2014-10-14 2015-10-08 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201418186A GB201418186D0 (en) 2014-10-14 2014-10-14 Novel conjugation process and reagents
GB1418186.1 2014-10-14
GB1418989.8 2014-10-24
GB1418986.4 2014-10-24
GBGB1418986.4A GB201418986D0 (en) 2014-10-24 2014-10-24 Novel conjugates and novel conjugating reagents
GB1418984.9A GB2531715A (en) 2014-10-24 2014-10-24 Novel drug conjugates
GBGB1418989.8A GB201418989D0 (en) 2014-10-24 2014-10-24 Novel conjugation process and reagents
GB1418984.9 2014-10-24
GB1509037.6 2015-05-27
GBGB1509037.6A GB201509037D0 (en) 2015-05-27 2015-05-27 Novel conjugation process and reagents
PCT/GB2015/052952 WO2016059377A1 (en) 2014-10-14 2015-10-08 Process for the conjugation of a peptide or protein with a reagent comprising a leaving group including a portion of peg

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237038415A Division KR20230158134A (ko) 2014-10-14 2015-10-08 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170071485A true KR20170071485A (ko) 2017-06-23

Family

ID=54337307

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237038415A KR20230158134A (ko) 2014-10-14 2015-10-08 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법
KR1020177008924A KR20170071485A (ko) 2014-10-14 2015-10-08 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237038415A KR20230158134A (ko) 2014-10-14 2015-10-08 Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10835616B2 (ko)
EP (1) EP3218009B1 (ko)
JP (1) JP2017534612A (ko)
KR (2) KR20230158134A (ko)
CN (1) CN106794259B (ko)
ES (1) ES2885854T3 (ko)
IL (1) IL250646A0 (ko)
SG (1) SG11201701384XA (ko)
WO (1) WO2016059377A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10098960B2 (en) 2015-04-03 2018-10-16 Ucl Business Plc Polymer conjugate
GB201608936D0 (en) 2016-05-20 2016-07-06 Polytherics Ltd Novel conjugates and novel conjugating reagents
ES2965349T3 (es) 2016-06-06 2024-04-12 Abzena Uk Ltd Anticuerpos, usos de los mismos y conjugados de los mismos
GB201615725D0 (en) 2016-09-15 2016-11-02 Polytherics Ltd Novel cytotoxic agents and conjugates thereof
CN107281498B (zh) * 2017-06-16 2021-02-12 四川大学华西医院 一种聚乙二醇修饰的铁离子螯合剂
CN107141468B (zh) * 2017-06-16 2019-04-12 四川大学华西医院 一种具有pH响应的长循环铁离子螯合剂
CN111542344A (zh) 2017-10-23 2020-08-14 马布林克生物科学公司 包含单分子量聚肌氨酸的配体-药物-缀合物
CA3160557A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Innate Pharma Treatment of cancer
WO2022112356A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Innate Pharma Treatment of cancer
WO2023227660A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Innate Pharma Nectin-4 binding agents

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
PT1411075E (pt) * 1998-03-12 2008-08-05 Nektar Therapeutics Al Corp Método para a preparação de conjugados de polímeros
WO2004060965A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
CN1898267B (zh) 2003-11-01 2012-05-23 默克专利股份有限公司 修饰的抗cd52抗体
US8367065B2 (en) 2006-09-15 2013-02-05 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Targeted polymeric prodrugs containing multifunctional linkers
RU2009114154A (ru) 2006-09-15 2010-10-20 Энзон Фармасьютикалз, Инк. (Us) Полимерные пролекарства с направленной доставкой, содержащие полифункциональные линкеры
EP2604284A1 (en) 2007-02-16 2013-06-19 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
WO2009047500A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Polytherics Limited Novel conjugated proteins and peptides
JP5622117B2 (ja) 2008-07-21 2014-11-12 ポリテリクスリミテッド 生体分子を接合するための新規な試薬及び方法
US9005598B2 (en) 2009-03-04 2015-04-14 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
GB0922354D0 (en) * 2009-12-21 2010-02-03 Polytherics Ltd Novel polymer conjugates
EP2260873B1 (en) 2009-06-08 2019-07-24 Biocompatibles UK Limited Pcylation of proteins
JP5954789B2 (ja) 2009-08-10 2016-07-20 ユーシーエル ビジネス パブリック リミテッド カンパニー 機能的分子の可逆的共有結合
CA2836927A1 (en) 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
EP2849790B1 (en) 2012-05-15 2019-04-10 Concortis Biosystems, Corp Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof
US9650331B2 (en) 2012-06-18 2017-05-16 Polytherics Limited Conjugation reagents
GB201210770D0 (en) 2012-06-18 2012-08-01 Polytherics Ltd Novel conjugation reagents
BR112014031613A2 (pt) 2012-06-19 2017-07-25 Polytherics Ltd processo para preparação de conjugados de anticorpos e conjugados de anticorpos
CA2878733C (en) 2012-07-12 2021-09-14 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Conjugates of cell binding molecules with cytotoxic agents
IN2015DN02349A (ko) * 2012-10-24 2015-08-28 Polytherics Ltd
NO2789793T3 (ko) 2012-10-24 2018-01-27
GB201308738D0 (en) 2013-05-15 2013-06-26 Polytherics Ltd Novel polymer conjugates
CA2921707C (en) * 2013-10-15 2023-03-28 Seattle Genetics, Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
US20160000933A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Andrei POLUKHTIN Conjugated biological molecules and their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
IL250646A0 (en) 2017-08-31
US20170304461A1 (en) 2017-10-26
SG11201701384XA (en) 2017-03-30
CN106794259A (zh) 2017-05-31
WO2016059377A1 (en) 2016-04-21
ES2885854T3 (es) 2021-12-15
EP3218009B1 (en) 2021-04-07
KR20230158134A (ko) 2023-11-17
EP3218009A1 (en) 2017-09-20
US10835616B2 (en) 2020-11-17
CN106794259B (zh) 2021-07-16
JP2017534612A (ja) 2017-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20170071485A (ko) Peg의 일부를 포함하는 이탈기를 포함하는 시약을 사용한, 펩티드 또는 단백질의 접합방법
US9415115B2 (en) Conjugated proteins and peptides
Liu et al. Site-selective protein modification with polymers for advanced biomedical applications
CN101820920B (zh) 新的缀合蛋白质和肽
CA2463072C (en) Thioester-terminated water soluble polymers and method of modifying the n-terminus of a polypeptide therewith
CA2824093C (en) Polymeric prodrug with a self-immolative linker
JP4961025B2 (ja) 非抗原性分枝ポリマーコンジュゲート
EP1909845B1 (en) N,n-bis-(2-hydroxyethyl) glycine amide as linker in polymer conjugated prodrugs
ES2404685T3 (es) Derivados heterobifuncionales de poli(etilenglicol) y métodos para su preparación
CN107073131B (zh) 缀合物和缀合试剂
CN104363926A (zh) 缀合试剂
JP4152187B2 (ja) 分岐型ポリアルキレングリコール類
KR100508369B1 (ko) 펩타이드 스페이서를 갖는 생체적합성 고분자
AU2011213827B2 (en) Polymeric prodrug with a self-immolative linker
JPWO2003000278A1 (ja) 軟膏剤
KR20220123421A (ko) 분자내 재배열 처리된 컨쥬게이트
GB2531715A (en) Novel drug conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X601 Decision of rejection after re-examination
A107 Divisional application of patent