CN1159288C - 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的蛋白质修饰剂为具有四个游离羧基基团的化合物，其通式如右式：R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4，m为1或2；其制备方法：先分别制备氨基酸二乙酯盐酸盐和脂肪酸二酰氯或对苯二甲酰氯。氨基酸二乙酯盐酸盐与三乙胺混配后，在冰浴下与脂肪酸二酰氯或对苯二甲酰氯反应得到脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯，该物质经脱保护基和酸化处理得到本发明的蛋白质修饰剂；该蛋白质修饰剂可用于修饰蛋白质，特别是在血液代用品的开发中用于修饰血红蛋白。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质化学领域，特别涉及蛋白质修饰剂及其制备方法和用途。
背景技术
蛋白质是一类重要的生物大分子，它是生命活动的主要承担者。蛋白质的生物活性不仅决定于其特定的化学结构，而且还决定于其特定的空间结构。
蛋白质的化学修饰是指用化学及生物化学的手段来造成蛋白质分子化学结构的改变。蛋白质的化学修饰不仅是研究蛋白质结构与功能关系的一种重要手段，也是定向改造蛋白质性质的一种有力工具。
许多医用蛋白或功能蛋白由于种种原因(异体蛋白，毒性反应，循环半寿期短)不能应用于人体。化学修饰就是解决此类问题的一个良好途径。
血液对于人体的重要性毋庸絮言，血液的最重要的生物学功能是通过血红蛋白实现的。将从血液中获得的血红蛋白用于医疗的想法在100多年前已经存在。首次报告使用血红蛋白作为红细胞替代物是在1898年，Von Stark用血红蛋白治疗一个贫血病人。尽管做了许多尝试，结果存在着：(1)血红蛋白很快从肾脏排泄出去，(2)肾毒性，(3)血压升高等现象；经人们研究发现：快速从肾脏排除是由于血红蛋白分子太小，肾毒性是由于血红蛋白进入血液后分解成二聚体，二聚体具有肾毒性；血压升高则是因为”血管活性”效应。血红蛋白由于有上述缺陷，因而不能直接用作血液替代品。一个解决的办法就是对血红蛋白进行化学修饰。这方面的研究在60-70年代作出了几个非常重要的发现。然而，真正努力开发用于人体的修饰血红蛋白是由于受到公众对于捐献血液中存在的HIV和丙肝及其它病毒的关注在80年代才开始的。与RBCs相比，修饰的血红蛋白有许多不可比拟的优点，使得其作为血液替代物在80-90年代得到了空前的发展：
(1)与RBCs不同，修饰的血红蛋白可用巴氏灭菌法、超过滤法及化学手段消毒，从而将引起爱滋病、丙肝及其他疾病的病原体灭活。
(2)修饰的血红蛋白不具有带有血型抗原的细胞膜，在使用前不需要血型测定和交叉配血。在紧急情况下(战争、灾害、意外事故)可进行快速输血。
(3)来源广：除使用人血外，还可利用基因工程产品和动物血液作为血红蛋白的来源。
(4)贮存时间长：修饰的血红蛋白可贮存一年以上；捐献的血液只能贮存一个月
(5)修饰的血红蛋白对医学上的一些病症有治疗作用。
目前化学修饰血红蛋白的发展状况
(1)化学修饰血红蛋白的目的：通过研究人们已经弄清Von Stark所发现的几种毒副作用的原因，肾毒性是由于自由的血红蛋白进入血液后能够分裂成两个αβ二聚体，二聚体对肾脏有毒；快速排泄是由于自由的血红蛋白分子较小，可通过细胞吞噬作用和肾脏排泄等途径将其从循环中除去；血压升高是由于四聚体血红蛋白透过血管内皮细胞层与血管松弛激素NO结合，NO的减少引起血管紧张，血压升高。因而化学修饰血红蛋白有以下几个目的：
a.通过引入别构调节物来修饰2，3-DPG结合位点，使之具有良好的P50
b.通过交联使之不解聚
c.通过交联及偶联使分子增大，增加循环半寿期
d.最新的研究还有通过偶联抗氧化酶解决血红蛋白氧化问题的报道。
化学修饰血红蛋白的现状
化学修饰血红蛋白发展至今日，按其产物的特点和修饰剂的不同可分为以下几个类型：
1 聚合血红蛋白PolyHb
(1)用戊二醛交联的聚合人血红蛋白需要向2，3-DPG“袋”中添加磷酸吡哆醛来其提高P50。这种血红蛋白具有合适的P50(28-30mmHg)，其血红蛋白浓度为10g/dl和很低的渗透压(20Torr)，因此可以很高剂量输入人体。临床试验中没有观察到诸如血管收缩之类的不正常现象，目前已经进行第三期临床试验。
(2) 用戊二醛交联的聚合牛血红蛋白正在研究中。与人的血红蛋白不同，牛血红蛋白的P50受氯化物的控制，因此不需要2，3-DPG。含有不超过5％交联四聚体的PHB已经进行了第二期临床试验
(3)用O-Raffinose(氧化棉籽糖)交联的聚合人血红蛋白。用一种由氧化棉籽糖衍生的二醛作用于人血红蛋白可形成一种63％的PolyHb和37％的交联四聚体(tetramer)的混合物。这种混合物具有很好的P50，而且由于β-β间的共价结合，因此不解聚，增加了循环半寿期，且无抗原性，已经进行二期临床试验。
以上几种方法的不足之处是聚合物的分子量分布范围不易控制和反应位点不确定。
2.交联的四聚体血红蛋白
(1)化合物bis-(N-maleimido-methyl)ether即双-(氮甲基马来酰亚胺)醚只对血红蛋白进行分子内交联，这种方法形成了交联四聚体，阻止了血红蛋白分裂成二聚体，这种交联为β-β交联。
(2)化合物双(3，5-二溴水扬酸)富马酸酯能够交联血红蛋白分子的两个α亚基，并修饰2，3-DPG位点，该法制造了一种具有高P50的交联四聚体，X射线衍射确认该四聚体具有统一的结构，其希尔系数为2.2，P50为28Torr，该制剂已经进行三期临床试验13。
(3)bis-(3，5-dibromosalisyl)sebacate在α-β间产生交联，此种交联物能够控制血管活性
(4)Trimesoyl tris-(methyl phosphate)与血红蛋白形成α-β-β三点交联，该产物聚有很好的P50和协同性。
(5)重组人血红蛋白-Somatogen：重组人血红蛋白可通过基因工程E.Coli产生，该产品通过将两个α亚基融合防止四聚体血红蛋白分裂成二聚体。而且，由于氨基酸替代物的引入改变了氧亲和性，导致了较高的P50。这种两个亚基融合的血红蛋白已经过一期和二期临床试验。
以上几种四聚体血红蛋白在应用上的缺点是循环半寿期短(8-10小时)并具有血管活性。
3.与高分子偶联的血红蛋白(conjugated Hb)
血红蛋白还可以与大分子偶联，增大其分子大小。这些大分子诸如右旋糖苷、聚氧乙烯、聚乙二醇、白蛋白、羟乙基淀粉、菊糖和长链脂肪酸等。所有这些偶联物都有效地延长了循环半寿期。其中聚氧乙烯偶联物和聚乙二醇偶联物已经进行二期临床试验。Yoji Iwashita报道的吡哆醛化的血红蛋白的POE偶联物具有较长的循环半寿期(狗44小时)和较好的P50(20mmHg)，毒性小，无抗原性。但该种物质在制备过程中，P50与循环半寿期形成了一对矛盾，即随着修饰度的增加，半寿期也增加，但P50减小，只是在一个合适的修饰度下才能产生上述的半寿期和P50。因此，控制其修饰度就成为这种产品的关键。
怎样的分子量或分子量分布是交联的血红蛋白更适合作为血液代用品尚在研究之中。但对交联物的分子量或分子量分布进行控制是非常重要的。反过来讲，对于血红蛋白的交联过程进行控制，使其能够产生单一分子量或可控分子量分布的血红蛋白产品是非常重要的。在这方面R.H.Kluger做了大量的工作，其中他在1998年发表的专利(WO 98/31708)中作了尤其漂亮的工作，获得了非常好的结果。他合成的修饰剂及其活化形式的结构如下
修饰原理示意简图如下：
Kluger发明的修饰剂具有四个化学官能团(活化后具有四个反应位点)每两个官能团形成一对，这两对官能团由中间相对刚性的部分隔开，它们分别与这个中间部分以酰胺键连接，其化学长度在一个适当的范围。根据Kluger的专利，一旦每一对活化的官能团与血红蛋白分子形成分子内交联，则形成了双四聚体血红蛋白，这时修饰剂分子已经没有剩余的反应位点，这样就基本上排除了形成更高分子量的修饰产物。
Kluger的发明有效的克服了上述几种修饰的血红蛋白的缺点，但也仍然有其不足，这种不足主要存在以下几个方面：
1.引入过多苯环，容易造成产物抗原性增加。而且，修饰剂在人体内分解后，能产生毒性分子。
2.活化过程如下，太繁琐，且所用试剂昂贵，不利于实用
3.修饰剂部分不能在人体内降解
发明内容
本发明的目的旨在提供一种修饰效果优良，能克服现有修饰剂诸多缺点的蛋白质修饰剂；本发明的另一目的在于提供该蛋白质修饰剂的制备方法；本发明的再一目的是将该蛋白质修饰剂应用于蛋白质的修饰，特别是对血红蛋白进行修饰而提供一种用于人体的血液代用品。
本发明的实施方案如下：
本发明提供的蛋白质修饰剂，其特征在于，该蛋白质修饰剂为具有四个游离羧基基团的化合物，其化学通式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n＝1、3或4，m＝1或2；
该蛋白质修饰剂为下列化合物：
(1)Asp-HNOC-(CH2)3-CONH-Asp
(2)Asp-HNOC-(CH2)4-CONH-Asp
(3)Glu-HNOC-CH2-CONH-Glu
(4)Glu-HNOC-(CH2)3-CONH-Glu
(5)Glu-HNOC-(CH2)4-CONH-Glu
(6)Glu-HNOC-Ph-CONH-Glu
(7)Asp-HNOC-Ph-CONH-Asp。
本发明提供蛋白质修饰剂的制备方法，其工艺步骤如下：
1.制备氨基酸二乙酯盐酸盐：
将L-谷氨酸或L-天冬氨酸与无水乙醇以1∶5～10的摩尔比在搅拌条
件下通入氯化氢气体至饱和，氨基酸逐渐溶解，将此溶液放置过夜，然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢，加入无水乙醚，析出氨基酸二乙酯盐酸盐结晶，经过滤，洗涤，干燥得到氨基酸二乙酯盐酸盐白色晶体；其化学反应式为：
m为1或2；
2.制备酰二氯：
将脂肪二酸或对苯二甲酸与氯化亚砜以1∶1.4摩尔比混合，缓慢加热回流直至无酸性气体放出，然后减压蒸馏除去过量的氯化亚砜，得到淡黄色液态脂肪酸二酰二氯或对苯二甲酰氯；其化学反应式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4；
3、制备脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯：将步骤1)制备的氨基酸二乙酯盐酸盐晶体和三乙胺以1∶2摩尔比混配，溶于氯仿中，冰浴条件下缓慢滴入步骤2)中制得的脂肪酸酰二氯或对苯二甲酰氯，搅拌反应1-2个小时，然后在室温下继续反应6-8小时，再分别用蒸馏水和饱和的碳酸氢钠溶液洗涤2-3遍，将洗涤后的有机相无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，减压抽干氯仿，得到脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯；其化学反应式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4，m为1或2；
4、脱除脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯中的羟基保护基：将步骤3)得到的脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯溶于甲醇中，再加入两倍过量的1N的NaOH溶液，室温搅拌反应4-6个小时；其化学反应式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4，m为1或2；
5.酸化处理：将步骤4.得到的脱保护溶液用盐酸调pH值到7.0，然后减压蒸馏除去甲醇和水，在过滤除去析出的氯化钠固体，然后再用盐酸将剩余溶液的pH值调至微酸性，静置后析出晶体，经洗涤、干燥得本发明的蛋白质修饰剂晶体。
本发明提供的蛋白质修饰剂应用于修饰蛋白质，特别是在开发血液代用品中用于修饰血红蛋白。
本发明具有以下特点：
1.本发明利用天然酸性氨基酸：谷氨酸和天冬氨酸代替Kluger修饰剂中
解决修饰剂潜在的毒性问题和抗原性问题；
2.在对修饰剂进行活化时用NHS代替DBS，解决修饰剂活化困难及试剂昂贵问题；
3.本发明提供的蛋白质修饰剂可在人体内生物降解；
4.本发明提供的蛋白质修饰剂对蛋白质具有良好修饰效果，并可控制修饰蛋白质的分子量分布。
附图说明
附图1为本发明制备方法的步骤1所得产物薄层层析检测结果；
附图2为本发明制备方法的步骤3所得产物的红外光谱检测图谱；
附图3为本发明的蛋白质修饰剂的红外光谱检测图谱；
附图4为用本发明的蛋白质修饰剂修饰血红蛋白的凝胶过滤检测图；
A-血红蛋白的洗脱曲线，B-修饰后的血红蛋白的洗脱曲线。
实施方式
实施例1：以谷氨酸和己二酸为起始原料制备一种蛋白质修饰剂，其制备步骤为：
1制备氨基酸二乙酸酯盐酸盐：将30g L-谷氨酸加入5倍过量的无水乙醇中，在搅拌条件下通入氯化氢气体至饱和，谷氨酸逐渐溶解，将此溶液放置过夜，然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢，然后加入无水乙醚使结晶析出，经过滤，洗涤，干燥得到谷氨酸二乙酯盐酸盐白色晶体；
对所得产物进行薄板层析鉴定其结果见图1；经测试所得产物熔点为107C，理论值为：107～109C。证明产物很纯。
2制备己二酰二氯：取己二酸30克加入50毫升氯化亚砜中，缓慢加热回流直至无酸性气体放出，然后减压蒸馏除去过量的氯化亚砜，得到淡黄色液态己二酰二氯；
3制备己二酰二谷氨酸四乙酯：取步骤1制得的谷氨酸二乙酯盐酸盐晶体9.6克溶于30毫升氯仿，加入三乙胺11.2毫升，冰浴条件下缓慢滴入3.6克步骤2制得的己二酰二氯，搅拌反应一个小时.然后在室温下继续反应6个小时，再分别用蒸馏水和饱和的碳酸氢钠溶液洗涤2～3遍，将洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠.减压抽干氯仿得到己二酰二谷氨酸四乙酯产物，产物红外光谱分析鉴定结果见图2，其红外光谱与理论预测相同；
4脱除己二酰二谷氨酸四乙酯中羧基保护基：将步骤3制得的己二酰二谷氨酸四乙酯5.18克溶于40毫升甲醇中，再加入90毫升1N NaOH溶液，室温搅拌反应4个小时；
5酸化处理：将步骤4的脱保护溶液用盐酸调pH值到7.0，然后减压蒸馏除去甲醇和水，再过滤除去析出的氯化钠固体，然后再用盐酸将剩余溶液的pH调至微酸性，静置后析出晶体，洗涤，干燥制得 本实施例的蛋白质修饰剂己二酰二谷氨酸晶体。
红外光谱分析鉴定结果见图3；对所得晶体进行元素分析结果如下：
微量有机元素分析报告
仪器型号Elementar Vario EL(Germany)
| 样品名称 | 百分含量 | |||
| N | C | H | O | |
| Hexglu | 6.528 | 46.90 | 6.151 | |
| 6.433 | 46.88 | 6.162 | ||
计算值：C∶N∶O＝8.3∶1∶5.4
分子式：C16H14O10N2
理论值：C∶N∶O 16∶2∶10＝8∶1∶5
制备活化酯：取本实施例制得的己二酰二谷氨酸晶体0.5克溶于10毫升二甲亚砜中，加入DCC 1.13克半小时后再加入NHS 1.1克，室温下密闭反应24小时，过滤除去DCU，向滤液中加入足量的异丙醇析出活化酯的晶体；
修饰血红蛋白：取100毫克牛血红蛋白溶于10毫升0.1MpH9.0的硼酸缓冲液中，加入上述活化酯使其与血红蛋白的摩尔比为20∶1.反应16小时后，取100微升反应液，凝胶过滤分析交联产物的分子量分布情况，层析柱为Pharmacia Superdex200分析柱(10mm×30cm)；洗脱液为：0.15摩尔氯化钠溶液；洗脱速度为0.25毫升/分钟。
修饰结果见图4，由图4说明该修饰剂对血红蛋白的修饰控制了修饰血红蛋白的分子量分布。
实施例2：以天冬氨酸和戊二酸为起始原料的一种修饰剂的合成过程及活化修饰过程。
1.天冬氨酸二乙酯盐酸盐的制备：将25g L-天冬氨酸加入8倍过量的无水乙醇中在搅拌条件下通入氯化氢气体至饱和，谷氨酸逐渐溶解。将此溶液放置过夜，然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢，加入无水乙醚使天冬氨酸二乙酯盐酸盐结晶析出，过滤，洗涤，干燥得到天冬氨酸二乙酯盐酸盐白色晶体；
2.制备戊二酰二氯：取戊二酸30克加入50毫升氯化亚砜中，缓慢加热回流直至无酸性气体放出，然后减压蒸馏除去过量的氯化亚砜，得到淡黄色液态戊二酰二氯；
3.戊二酰二谷氨酸四乙酯的制备：取天冬氨酸二乙酯盐酸盐晶体8.6克溶于35毫升氯仿，加入三乙胺10.2毫升，冰浴条件下缓慢滴入3.6克戊二酰二氯，搅拌反应一个小时，然后在室温下继续反应6个小时，再分别用蒸馏水和饱和的碳酸氢钠溶液洗涤2～3遍，将洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，减压抽干氯仿得到戊二酰二谷氨酸四乙酯；
4.脱除羧基保护基：将戊二酰二天冬氨酸四乙酯4.58克溶于40毫升甲醇中，再加入90毫升1N NaOH溶液，室温搅拌反应4个小时；
5.酸化处理：将上步的脱保护溶液用盐酸调溶液pH值到7.0，然后减压蒸馏除去甲醇和水，再过滤除去析出的氯化钠固体，然后再用盐酸将剩余溶液的pH调至微酸性，静置后有晶体析出，洗涤，干燥得戊二酰二天冬氨酸晶体；其化学式为C14H10O10N2；
活化酯的制备：取戊二酰二天冬氨酸晶体0.5克溶于10毫升二甲亚砜中，加入DCC1.13克半小时后再加入NHS 1.1克，室温下密闭反应24小时，过滤除去DCU，向滤液中加入足量的异丙醇析出活化酯的晶体；
修饰血红蛋白：取100毫克牛血红蛋白溶于10毫升0.1MpH9.0的硼酸缓冲液中，加入上步制得的活化酯使其与血红蛋白的摩尔比为20∶1，反应16小时后，取100微升反应液，凝胶过滤分析交联产物的分子量分布情况，层析柱为PharmaciaSuperdex200分析柱(10mm×30cm)；洗脱液为：0.15摩尔氯化钠溶液；洗脱速度为0.25毫升/分钟。
实施例3：以谷氨酸和对苯二甲酸为起始原料的一种修饰剂的合成过程及活化修饰过程
1.制备谷氨酸二乙酸酯盐酸盐：将30g L-谷氨酸加入10倍过量的无水乙醇中在搅拌条件下通入氯化氢气体至饱和，谷氨酸逐渐溶解，将此溶液放置过夜，然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢，加入无水乙醚使谷氨酸二乙酯盐酸盐结晶析出，过滤，洗涤，干燥得到谷氨酸二乙酸酯盐酸盐白色晶体；
2.制备对苯二甲酰氯：取对苯二甲酸30克加入100毫升氯化亚砜中，缓慢加热回流直至无酸性气体放出，然后减压蒸馏除去过量的氯化亚砜；
3.制备对苯二甲酰二谷氨酸四乙酯：取上述制得的谷氨酸二乙酯盐酸盐晶体9.6克溶于30毫升氯仿，加入三乙胺14毫升，冰浴条件下缓慢滴入3.6克步骤2制得的对苯二甲酰二氯，搅拌反应一个小时，然后在室温下继续反应6个小时，再分别用蒸馏水和饱和的碳酸氢钠溶液洗涤2～3遍，将洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，减压抽干氯仿得到产物；
4.脱除对苯二甲酰二谷氨酸四乙酯羧基保护基：将上步产物5.18克溶于40毫升二氧六环中，再加入90毫升1N NaOH溶液，室温搅拌反应4个小时；
5.酸化处理：将上步的脱保护溶液用盐酸调溶液pH值到7.0，然后减压蒸馏除去甲醇和水，再过滤除去析出的氯化钠固体，然后再用盐酸将剩余溶液的pH调至微酸性，静置后有晶体析出，洗涤，干燥得对苯二甲酰二谷氨酸晶体；
制备活化酯：取对苯二甲酰二谷氨酸晶体0.5克溶于10毫升二氧六环中，加入DCC 1.03克半小时后再加入NHS 0.73克，室温下密闭反应24小时，过滤除去DCU，向滤液中加入足量的异丙醇析出活化酯的晶体。
修饰血红蛋白：取100毫克牛血红蛋白溶于10毫升0.1MpH9.0的硼酸缓冲液中，加入上步制得的活化酯使其与血红蛋白的摩尔比为20∶1，反应16小时后，取100微升反应液，凝胶过滤分析交联产物的分子量分布情况，层析柱为PharmaciaSuperdex200分析柱(10mm×30cm)；洗脱液为：0.15摩尔氯化钠溶液；洗脱速度为0.25毫升/分钟。
实施例4：以天冬氨酸和对苯二甲酸为起始原料的修饰剂的合成过程及活化修饰过程同实施例3；所得修饰剂为：Asp-HNOC-Ph-CONH-Asp。
实施例5：以谷氨酸和戊二酸为起始原料的修饰剂的合成过程及活化修饰过程同实施例1；所得蛋白质修饰剂为：Glu-HNOC-(CH2)3-CONH-Glu。
实施例6：以天冬氨酸和己二酸为起始原料的修饰剂的合成过程及活化修饰过程同实施例1；所得蛋白质修饰剂为：Asp-HNOC-(CH2)4-CONH-Asp。
实施例7：以谷氨酸和丙二酸为起始原料的修饰剂的合成过程及活化修饰过程同实施例1；所得蛋白质修饰剂为：Glu-HNOC-CH2-CONH-Glu。
Claims (5)
1、一种蛋白质修饰剂，其特征在于，该蛋白质修饰剂为具有四个游离羧基基团的化合物，其化学通式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4，m为1或2。
2、按权利要求1所述的蛋白质修饰剂，其特征在于，该蛋白质修饰剂为下列化合物：(1)Asp-HNOC-(CH2)3-CONH-Asp
(2)Asp-HNOC-(CH2)4-CONH-Asp
(3)Glu-HNOC-CH2-CONH-Glu
(4)Glu-HNOC-(CH2)3-CONH-Glu
(5)Glu-HNOC-(CH2)4-CONH-Glu
(6)Glu-HNOC-Ph-CONH-Glu
(7)Asp-HNOC-Ph-CONH-Asp。
3、一种权利要求1所述蛋白质修饰剂的制备方法，其工艺步骤如下：
1)制备氨基酸二乙酯盐酸盐：
将L-谷氨酸或L-天冬氨酸与无水乙醇以1∶5～10的摩尔比混配，在搅拌条件下通入氯化氢气体至饱和，氨基酸逐渐溶解，将此溶液放置过夜，然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢，再加入无水乙醚，析出氨基酸二乙酯盐酸盐结晶，经过滤，洗涤，干燥得到氨基酸二乙酯盐酸盐白色晶体，其化学反应式为：
m为1或2；
2)制备酰二氯：
将脂肪二酸或对苯二甲酸与氯化亚砜以1∶1.4摩尔比混合，缓慢加热回流直至无酸性气体放出，然后减压蒸馏除去过量的氯化亚砜，得到淡黄色液态脂肪酸二酰二氯或对苯二甲酰氯；其化学反应式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4；
3)制备脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯：将步骤1)制备的氨基酸二乙酯盐酸盐晶体和三乙胺以1∶2摩尔比混配，溶于氯仿中，冰浴条件下缓慢滴入步骤2)中制得的脂肪酸酰二氯或对苯二甲酰氯，搅拌反应1-2个小时，然后在室温下继续反应6-8小时，再分别用蒸馏水和饱和的碳酸氢钠溶液洗涤2-3遍，将洗涤后的有机相无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，减压抽干氯仿，得到脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯；其化学反应式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4，m为1或2；
4)脱除脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯中的羟基保护基：将步骤3)得到的脂肪酸二酰胺氨基酸四乙酯或对苯二甲酰胺氨基酸四乙酯溶于甲醇中，再加入两倍过量的1N的NaOH溶液，室温搅拌反应4-6个小时；其化学反应式为：
R为-(CH2)n-或苯基，其中n为1、3或4，m为1或2；
5)酸化处理：将步骤4)得到的脱保护溶液用盐酸调pH值到7.0，然后减压蒸馏除去甲醇和水，在过滤除去析出的氯化钠固体，然后再用盐酸将剩余溶液的pH值调至微酸性，静置后析出晶体，经洗涤、干燥得本发明的蛋白质修饰剂晶体。
4、权利要求1所述的蛋白质修饰剂应用于修饰蛋白质。
5、权利要求1所述的蛋白质修饰剂在制备血液代用品生产中用于修饰血红蛋白。
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